JP2021050219A - ヒト無調ホモログ−１（ｈａｔｈ１）をコードするアデノウイルスベクター - Google Patents

Abstract

【課題】必要とするヒトの内耳において感覚細胞を発生させるための方法の提供。【解決手段】アデノウイルスベクターと薬学的に許容される担体とを含む組成物をヒトの内耳に投与するステップを含み、該アデノウイルスベクターが、（ａ）特定の血清型５型アデノウイルスゲノム、（ｂ）ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、（ｃ）ヒト無調ホモログ−１タンパク質をコードする特定の核酸配列、（ｄ）ヒトグリア線維性酸性タンパク質プロモーター、ならびに（ｅ）転写不活性スペーサーを含み、エレメント（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、アデノウイルスゲノムのＥ１領域においてアデノウイルスゲノムに対して３’から５’へ順に位置し、エレメント（ｅ）が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域において、Ｅ４ポリアデニル化配列とＥ４プロモーターの間に位置する、前記方法。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
この特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年１０月９日に出願
された米国仮特許出願第６２／０６１，７４８号の利益を主張する。

電子的に提出された資料の参照による組み入れ
本明細書と同時に提出され、以下のように識別されるコンピュータ可読のヌクレオチド
／アミノ酸配列リストが本明細書に全体として参照により組み入れられている：２０１５
年９月２５日に作成された「７２１７６７＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名称の１つの４９
，２４０バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。

世界の人口の大部分は、生涯に聴力のいくらかの低下または平衡障害を経験する可能性
が高い。米国の成人のおよそ１７パーセント（３６００万人）が、ある程度の難聴を報告
し、米国における１，０００人の子どもあたり約２〜３人が、生まれつき、耳が聞こえず
、または聴力が低下している（国立聴覚伝達障害研究所（National Institute on Deafne
ss and Other Communication Disorders）（ＮＩＤＣＤ）からの統計）。

聴覚および平衡の両方において、機械的刺激が、感覚有毛細胞によって神経信号へ変換
されるが、その感覚有毛細胞の損傷が、多くの型の難聴および平衡障害の原因である。例
えば、大きい雑音による機械的損傷は、蝸牛有毛細胞を、その有毛細胞がもはや信号を聴
神経へ伝達することができないレベルまで曲げる。哺乳類有毛細胞は、自然に再生されな
いため、有毛細胞が損傷したならば、永久的難聴が起こり得る。聴覚障害の主な原因であ
る音響外傷はさておき、難聴は、遺伝性症候群、細菌またはウイルス感染、処方薬の使用
、および老人性難聴（老齢に伴う難聴）によっても引き起こされ得る。同様に、平衡障害
、特に前庭障害は、感染、頭部傷害、薬剤使用、および年齢によって引き起こされ得る。

難聴についての最も一般的な処置は、補聴器および人工内耳を含む。世界中でおよそ１
８８，０００人の人々が人工内耳を受けており、それは、米国において大体、４１，５９
９人の成人と２５，５００人の子どもを含む（ＮＩＤＣＤ統計）。平衡障害についての処
置の選択肢には、平衡再訓練、抗めまいまたは嘔吐抑制薬物療法、および前庭リハビリテ
ーション療法が挙げられる。しかしながら、そのような治療は、その障害が進行性である
場合には、長期間にわたって必要とされる可能性が高く、平衡障害についての多くの治療
は、めまいの永久的な軽減をもたらさない。現在、耳における感覚有毛細胞の損失または
損傷を含む障害についての効果的な薬剤処置はない。

したがって、難聴および平衡障害などの感覚有毛細胞の破壊または損失に伴う障害を寛
解させることができる作用物質の必要性が依然としてある。この発明はそのような作用物
質を提供する。

本発明は、ＶＡ ＲＮＡ Ｉ領域において２塩基対が欠失していること、Ｅ１領域にお
ける内因性遺伝子を機能的欠損にするようにＥ１領域の１個または複数の内因性ヌクレオ
チドが欠失していること、Ｅ３領域の１個または複数の内因性ヌクレオチドが欠失してい
ること、およびＥ４領域における内因性遺伝子を機能的欠損にするようにＥ４領域の１個
または複数の内因性ヌクレオチドが欠失していることを例外とするが、右側の逆位末端反
復（ＩＴＲ）、Ｅ４領域ポリアデニル化配列、およびＥ４領域プロモーターが保持されて
いる、（ａ）血清型５型アデノウイルスゲノム、（ｂ）ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列
、（ｃ）ヒト無調ホモログ−１（Ｈａｔｈ１）タンパク質をコードし、配列番号１を含む
核酸配列、（ｄ）ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ならびに
（ｅ）転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）を含むアデノウイルスベクターを提供する。エレ
メント（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域においてアデ
ノウイルスゲノムに対して３’から５’へ順に位置し、エレメント（ｅ）は、アデノウイ
ルスゲノムのＥ４領域において、Ｅ４ポリアデニル化配列とＥ４プロモーターの間に位置
する。

本発明はまた、ヒトの内耳において感覚細胞を発生させるために前述のアデノウイルス
ベクターを利用する組成物および方法も提供する。

プラスミドｐＡｄＥ１（ＧＦＡＰ．Ｈａｔｈ１）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１）の概略的マップである。 アデノウイルスベクターＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄの概略的マップである。

本発明は、ヒト無調ホモログ−１（Ｈａｔｈ１）タンパク質をコードする核酸配列を含
む血清型５型アデノウイルスベクターを内耳へ送達することにより、感覚有毛細胞が発生
し得るという発見に、少なくとも一部、基礎を置いている。

本明細書で用いられる場合、用語「アデノウイルスベクター」は、アデノウイルスゲノ
ムが、アデノウイルスゲノムに対して非天然である核酸配列を収容するように操作されて
いる、アデノウイルスを指す。典型的には、アデノウイルスベクターは、非天然核酸配列
のアデノウイルスへの挿入を収容するようにアデノウイルスのアデノウイルスゲノムへ１
つまたは複数の突然変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を導入することにより作製
される。

アデノウイルスベクターについてのウイルスゲノムの供給源は、ヒト血清型５型アデノ
ウイルスである。ヒトアデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、
および３１型）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３
４、３５、および５０型）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、および６型）
、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２
〜３０、３２、３３、３６〜３９、および４２〜４８型）、サブグループＥ（例えば、血
清型４型）、サブグループＦ（例えば、血清型４０および４１型）、または未分類血清型
（例えば、血清型４９および５１型）として分類される。アデノウイルス血清型１〜５１
型（すなわち、Ａｄ１〜Ａｄ５１）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手でき
る。

本発明のアデノウイルスベクターは複製欠損である。複製欠損アデノウイルスベクター
は、アデノウイルスベクターが、典型的な宿主細胞、特に、アデノウイルスベクターに感
染させられるヒトにおける細胞において、複製しないための、例えば、１つまたは複数の
複製必須遺伝子機能または領域の欠損の結果として、複製に必要とされるアデノウイルス
ゲノムの１つまたは複数の遺伝子機能または領域の補完を必要とする。

本明細書で用いられる場合、遺伝子機能またはゲノム領域の欠損は、核酸配列が全部ま
たは一部、破壊され（例えば、欠失し）、それにより遺伝子またはゲノム領域を「機能的
欠損」にする、遺伝子の機能を消し去り、または損なうのに十分な（例えば、遺伝子産物
の機能が、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、または５０倍、低下する
ような）、アデノウイルスゲノムの遺伝子材料の破壊（例えば、欠失）として定義される
。遺伝子領域全体の欠失は、複製必須遺伝子機能の破壊に必要とされない場合が多い。し
かしながら、１つまたは複数の導入遺伝子のためのアデノウイルスゲノムにおける十分な
スペースを提供するために、１つまたは複数の遺伝子領域の大部分の除去が望ましい場合
がある。この点において、アデノウイルスベクターは、望ましくは、アデノウイルスゲノ
ムを含むが、ただし、内因性遺伝子またはゲノム領域を機能的欠損にするために１つまた
は複数の複製必須遺伝子またはゲノム領域の１つまたは複数の内因性ヌクレオチドが欠失
している。遺伝子材料の欠失が好ましいが、遺伝子材料の突然変異もまた、遺伝子機能を
破壊するのに適切である。複製必須遺伝子機能は、アデノウイルス複製（例えば、増殖）
に必要とされる遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ
２、およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５領域）
、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、およびウイル
ス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡ−１および／またはＶＡ−ＲＮＡ−２）によってコ
ードされている。

複製欠損アデノウイルスベクターは、好ましくは、アデノウイルスゲノムの少なくとも
一部を保持する。アデノウイルスベクターは、タンパク質コード領域および非タンパク質
コード領域を含むアデノウイルスゲノムの任意の部分を含み得る。アデノウイルスベクタ
ーは、例えば、初期領域遺伝子（すなわち、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、お
よび／またはＥ４領域）のいずれか１つによりコードされるタンパク質、またはウイルス
構造タンパク質をコードする後期領域遺伝子（すなわち、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およ
びＬ５領域）のいずれか１つによりコードされるタンパク質などの、任意の適切なアデノ
ウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。あるいは、アデノウイルスベクタ
ーは、初期領域もしくは後期領域遺伝子の、１つもしくは複数のプロモーター、転写終結
配列、もしくはポリアデニル化配列、または１つもしくは複数の逆位末端反復（ＩＴＲ）
配列を含む、アデノウイルスゲノムの非タンパク質コード領域を含み得る。一実施形態に
おいて、本発明のアデノウイルスベクターは、少なくとも右側の逆位末端反復（ＩＴＲ）
、Ｅ４領域ポリアデニル化配列、およびＥ４領域プロモーターを保持する。

複製欠損アデノウイルスベクターは、増殖のためのアデノウイルスゲノムの１つまたは
複数の領域において１つまたは複数の複製必須遺伝子機能の欠損を引き起こすために任意
の適切な様式で改変することができる。アデノウイルスゲノムの１つまたは複数の領域の
１つまたは複数の複製必須遺伝子機能の欠損の補完とは、機能的に欠損した複製必須遺伝
子機能を提供するための外因性手段の使用を指す。そのような補完は、任意の適切な様式
で、例えば、破壊された複製必須遺伝子機能をコードする、補完する細胞および／または
外因性ＤＮＡ（例えば、ヘルパーアデノウイルス）を用いることにより、もたらすことが
できる。

アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域（すなわち、Ｅ１〜Ｅ４
領域）のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域（すなわち、Ｌ１〜Ｌ５領域）のみ、アデ
ノウイルスゲノムの初期領域および後期領域の両方、または全てのアデノウイルス遺伝子
（すなわち、高キャパシティアデノベクター（ＨＣ−Ａｄ））の１つまたは複数の複製必
須遺伝子機能が欠損し得る。Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976
(1998)；Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997)；およびKoc
hanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)参照。複製欠損アデノウイルス
ベクターの例は、米国特許第５，８３７，５１１号明細書；同第５，８５１，８０６号明
細書；同第５，９９４，１０６号明細書；同第６，１２７，１７５号明細書；同第６，４
８２，６１６号明細書；および同第７，１９５，８９６号明細書、ならびに国際特許出願
公開第１９９４／０２８１５２号パンフレット、同第１９９５／００２６９７号パンフレ
ット、同第１９９５／０１６７７２号パンフレット、同第１９９５／０３４６７１号パン
フレット、同第１９９６／０２２３７８号パンフレット、同第１９９７／０１２９８６号
パンフレット、同第１９９７／０２１８２６号パンフレット、および同第２００３／０２
２３１１号パンフレットに開示されている。

アデノウイルスゲノムの初期領域には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域が挙げられ
る。Ｅ１領域は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの小領域を含み、Ｅ１領域における複製必須遺伝子
機能の１つまたは複数の欠損には、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの小領域の一方または両方におけ
る複製必須遺伝子機能の１つまたは複数の欠損を挙げることができ、それにより、アデノ
ウイルスベクターが増殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するた
めに）、アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ小領域および／またはＥ１Ｂ小領域の補完を必要
とする。Ｅ２領域は、Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂの小領域を含み、Ｅ２領域における複製必須遺
伝子機能の１つまたは複数の欠損には、Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂの小領域の一方または両方に
おける複製必須遺伝子機能の１つまたは複数の欠損を挙げることができ、それにより、ア
デノウイルスベクターが増殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成す
るために）、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ小領域および／またはＥ２Ｂ小領域の補完を
必要とする。

Ｅ３領域はいかなる複製必須遺伝子機能も含まないため、Ｅ３領域の一部、または全部
の欠失は、アデノウイルスベクターが増殖するために（例えば、アデノウイルスベクター
粒子を形成するために）Ｅ３領域におけるいかなる遺伝子機能の補完も必要としない。本
発明に関して、Ｅ３領域は、ヒトアデノウイルス５のＥ３領域由来の１２．５Ｋタンパク
質（ＮＣＢＩ参照配列ＡＰ＿０００２１８）との高相同性を有するタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームから始まり、ヒトアデノウイルス５のＥ３領域由来の１
４．７Ｋタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列ＡＰ＿０００２２４．１）との高相同性を有する
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームで終わる領域として定義される。
Ｅ３領域は、全部もしくは一部、欠失し得、または全部もしくは一部、保持され得る。欠
失のサイズは、ゲノムが最適なゲノムパッケージングサイズに厳密に適合する、アデノウ
イルスベクターを保持するのに合わせて作製され得る。より大きい欠失は、アデノウイル
スゲノムにおいて、より大きい異種性核酸配列の挿入を収容する。本発明の一実施形態に
おいて、Ｅ３領域に存在するＬ４ポリアデニル化シグナル配列は保持される。

Ｅ４領域は、複数の内因性遺伝子をコードする複数のオープンリーディングフレーム（
ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ６、場合によってはＯＲＦ３を除くＥ４領域のオープンリーディ
ングフレームの全部の欠失を含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターが
増殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、Ｅ４領域に
おけるいかなる遺伝子機能の補完も必要としない。逆に、Ｅ４領域のＯＲＦ６、場合によ
ってはＯＲＦ３の破壊または欠失を有する（例えば、Ｅ４領域のＯＲＦ６および／または
ＯＲＦ３に基づいた複製必須遺伝子機能の欠損を有する）アデノウイルスベクターは、Ｅ
４領域のその他のオープンリーディングフレーム、または天然Ｅ４プロモーター、ポリア
デニル化配列、および／もしくは右側の逆位末端反復（ＩＴＲ）のいずれかの破壊または
欠失の有無に関わらず、アデノウイルスベクターが増殖するために（例えば、アデノウイ
ルスベクター粒子を形成するために）、Ｅ４領域（特に、Ｅ４領域のＯＲＦ６および／ま
たはＯＲＦ３）の補完を必要とする。

アデノウイルスゲノムの後期領域には、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５領域が挙
げられる。アデノウイルスベクターはまた、国際特許出願公開第２０００／０００６２８
号パンフレットに論じられているように、望まれる場合には、アデノウイルスベクターを
複製欠損にすることができる、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に突然変異を有し得る。

好ましくは、複製必須遺伝子機能の１つまたは複数の欠損を含有するアデノウイルスゲ
ノムの１つまたは複数の領域は、望ましくは、アデノウイルスゲノムの１つまたは複数の
初期領域、すなわち、Ｅ１、Ｅ２、および／またはＥ４領域であり、任意選択で、Ｅ３領
域の一部または全部の欠失を有してもよい。

一実施形態において、Ｅ１領域における内因性遺伝子を機能的欠損にし、かつＥ４領域
における内因性遺伝子を機能的欠損にするために、本発明のアデノウイルスベクターにお
いて、Ｅ１領域およびＥ４領域の１つまたは複数の内因性ヌクレオチドが欠失している（
Ｅ１／Ｅ４欠損型アデノウイルスベクターと表される）。本発明のアデノウイルスベクタ
ーは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠失を
含み得、好ましくは、Ｅ１領域の複製必須遺伝子機能の全部の欠失を含む。この点におい
て、本発明のアデノウイルスベクターのＥ１領域の欠失は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ内因性遺
伝子のプロモーターおよびコード領域の欠失を含み得る。Ｅ４領域の欠失は、望ましくは
、Ｅ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠失を含み得、好ましくは、Ｅ４領
域の複製必須遺伝子機能の全部の欠失を含む。この点において、本発明のアデノウイルス
ベクターのＥ４領域の欠失は、Ｅ４領域の内因性遺伝子の全部の欠失を含み得る。アデノ
ウイルスゲノムのＥ１領域およびＥ４領域の欠失に加えて、Ｅ３領域の１つまたは複数の
内因性ヌクレオチドが、本発明のアデノウイルスベクターにおいて欠失し得、好ましくは
、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの非必須Ｅ３領域の少なく
とも１つの遺伝子機能の欠失を含む（Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損型アデノウイルスベクターと
表される）。血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３、およびＥ４領域の欠失に加
えて、本発明のアデノウイルスベクターはまた、望ましくは、ウイルス関連ＲＮＡ（例え
ば、ＶＡ−ＲＮＡ−１および／またはＶＡ−ＲＮＡ−２）の１つの欠失を含む。好ましく
は、本発明のアデノウイルスベクターは、ＶＡ−ＲＮＡ−１領域の欠失を含む。ＶＡ−Ｒ
ＮＡ−１領域の欠失は、任意の適切なサイズでもよいが、望ましくは、１塩基対から１０
塩基対まで、好ましくは１塩基対から５塩基対まで、最も好ましくは１塩基対から３塩基
対まで、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲である。一実施形態にお
いて、アデノウイルスベクターのＶＡ ＲＮＡ １領域において２塩基対が欠失している
。

好ましい実施形態において、本発明の血清型５型アデノウイルスベクターのゲノムは、
Ｅ１領域ヌクレオチド３５６〜３５１０（両端を含む）の欠失、Ｅ３領域ヌクレオチド２
８，５９３〜３０，４７１（両端を含む）の欠失、Ｅ４領域ヌクレオチド３２，８２７〜
３５，５６３の欠失、ならびにＶＡ−ＲＮＡ−１領域ヌクレオチド１０，５９４および１
０５９５の欠失を含む。しかしながら、他の欠失が適切な場合がある。例えば、複製必須
Ｅ１遺伝子機能の欠損を生じさせるために、ヌクレオチド３５６〜３３２９、または３５
６〜３５１０を除去することができ、アデノウイルスゲノムのＥ３領域からヌクレオチド
２８，５９４〜３０，４６９を欠失させることができる。

本発明のアデノウイルスベクターは、転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）を含む。転写不
活性スペーサー配列は、単一の複製必須遺伝子機能が欠損したアデノウイルスベクター（
例えば、Ｅ１欠損型アデノウイルスベクター）によって達成される成長と類似した、補完
性細胞株における、複製欠損が多数重なったアデノウイルスベクター（例えば、Ｅ１／Ｅ
４欠損型アデノウイルスベクター）の成長を提供する。ＴＩＳ配列は、少なくとも約１５
ヌクレオチド長（例えば、約１５ヌクレオチド長から約１２，０００ヌクレオチド長の間
）、好ましくは約１００ヌクレオチド長〜約１０，０００ヌクレオチド長、より好ましく
は約５００ヌクレオチド長〜約８，０００ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約１，
５００ヌクレオチド長〜約６，０００ヌクレオチド長、最も好ましくは約２，０００長〜
約３，０００ヌクレオチド長、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲の
配列などの、望ましい長さである任意のヌクレオチド配列を含有し得る。ＴＩＳ配列は、
翻訳領域でも非翻訳領域でもよく、かつアデノウイルスゲノムに関して天然でも非天然で
もよいが、欠損領域に対して複製必須機能を回復させない。ＴＩＳはまた、発現カセット
を含有し得る。

一実施形態において、転写不活性スペーサーは、ポリアデニル化配列、および／または
アデノウイルスベクターに関して非天然である遺伝子を含む。スペーサーエレメントは、
例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）、ポリオーマウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）
、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびウ
シパピローマウイルス（ＢＰＶ）のポリアデニル化配列などの、任意の適切なポリアデニ
ル化配列を含み得る。好ましくは、ＴＩＳ配列は、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリア
デニル化配列を含むことができる。ＴＩＳに含まれる適切な非天然遺伝子の例には、ｐＧ
ＵＳ、分泌性アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、および
ヒト抗トリプシンなどのマーカータンパク質をコードする核酸配列；治療的因子；Ｂ３−
１９Ｋ、Ｅ３−１４．７、ＩＣＰ４７、ｆａｓリガンド、およびＣＴＬＡ４などの潜在的
免疫調節因子；生物学的に不活性な配列（例えば、（ｉ）転写されて産物を産生すること
がなく、または（ｉｉ）欠陥の、もしくは生物学的に不活性な産物をコードする配列）；
ならびに他の無害な配列（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子）が挙げられるが、それ
らに限定されない。

好ましくは、ＴＩＳは、アデノウイルスゲノムに対して５’から３’へ順に、（ｉ）サ
ルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列および転写終結配
列、（ｉｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子をコードする核酸配列、ならびに（ｉｉｉ）ウ
シ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列および転写終
結配列を含む。アデノウイルスベクターにおける転写不活性スペーサーの使用は、例えば
、米国特許第５，８５１，８０６号明細書および国際特許出願公開第１９９７／０２１８
２６号パンフレットにさらに記載されている。

アデノウイルスゲノムの全部または一部、例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ３
、およびＥ４領域の１つまたは複数の内因性ヌクレオチドを除去することにより、結果と
して生じるアデノウイルスベクターは、外因性核酸配列の挿入断片を、アデノウイルスカ
プシドへパッケージングする能力を保持しながら、受け入れることができる。外因性核酸
配列は、その位置における挿入がアデノウイルスベクター粒子の形成を許容する限り、ア
デノウイルスゲノムにおいて任意の位置に挿入することができる。外因性核酸配列は、好
ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域、またはＥ４領域に位置する。

本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクター中に存
在しない遺伝子機能を提供する、補完する細胞株において産生することができるが、高力
価のウイルスベクターストックを作製するために適切なレベルでのウイルス増殖を必要と
される。そのような補完する細胞株は知られており、それには、（例えば、Graham et al
., J. Gen. Virol., 36: 59-72 (1977)に記載された）２９３細胞、（例えば、国際特許
出願公開第１９９７／０００３２６号パンフレット、ならびに米国特許第５，９９４，１
２８号明細書および同第６，０３３，９０８号明細書に記載された）ＰＥＲ．Ｃ６細胞、
および（例えば、国際特許出願公開第９５／３４６７１号パンフレットおよびBrough et
al, J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)に記載された）２９３−ＯＲＦ６細胞が挙げられ
るが、それらに限定されない。他の適切な補完する細胞株には、発現が宿主細胞において
ウイルス成長を阻害する導入遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを増殖するため
に作製されている細胞が挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００８／０２３３６
５０号明細書参照）。追加の適切な補完する細胞は、例えば、米国特許第６，６７７，１
５６号明細書および同第６，６８２，９２９号明細書、ならびに国際特許出願公開第２０
０３／０２０８７９号パンフレットに記載されている。場合によっては、細胞ゲノムは、
必ずしも、核酸配列の遺伝子産物が複製欠損アデノウイルスベクターの欠損の全部を補完
するという核酸配列を含む必要はない。複製欠損アデノウイルスベクターにおいて欠く１
つまたは複数の複製必須遺伝子機能が、ヘルパーウイルス、例えば、複製欠損アデノウイ
ルスベクターの複製に必要とされる１つまたは複数の必須遺伝子機能をトランスに供給す
るアデノウイルスベクターによって供給することができる。あるいは、本発明のアデノウ
イルスベクターは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターにおいて欠く１つまたは複
数の複製必須遺伝子機能を補完する非天然複製必須遺伝子を含み得る。例えば、Ｅ１／Ｅ
４欠損型アデノウイルスベクターは、異なるアデノウイルス（例えば、本発明のアデノウ
イルスベクターとは異なる血清型のアデノウイルス、または本発明のアデノウイルスベク
ターとは異なる種のアデノウイルス）から得られ、またはそれに由来するＥ４ ＯＲＦ６
をコードする核酸配列を含有するように操作することができる。

本発明のアデノウイルスベクターは、ヒト無調ホモログ−１（Ｈａｔｈ１）タンパク質
をコードする核酸配列を含む。Ｈａｔｈ１は、無調関連因子である。無調関連因子は、耳
において支持細胞を感覚有毛細胞へ分化転換する、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリック
ス（ｂＨＬＨ）ファミリーの転写因子のタンパク質である。そのタンパク質の塩基性ドメ
インは、ＤＮＡ結合およびタンパク質機能に関与する。無調関連因子は、様々な動物およ
び昆虫に見出され、それには、マウス（マウス無調ホモログ−１（Ｍａｔｈ１））、ニワ
トリ（ニワトリ無調ホモログ−１（Ｃａｔｈ１））、アフリカツメガエル（アフリカツメ
ガエル無調ホモログ−１（Ｘａｔｈ１））、およびヒト（ヒト無調ホモログ−１（Ｈａｔ
ｈ１））が挙げられる。Ｍａｔｈ１およびＨａｔｈ１のような無調関連タンパク質は、有
毛細胞発生に必須であることが示されており、耳において有毛細胞再生を刺激することが
できる（例えば、Groves et al., Annu. Rev. Neurosci., 36: 361-381 (2013)参照）。
Ｈａｔｈ１は、例えば、Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics, 5, 1207-1216 (1
996)；ならびに Mulvaney, J. and Dabdoub, A, J. Assoc. Res. Otolaryngol., 13(3):
281-289 (2012)において、さらに特徴づけられ、無調関連因子は、一般的に、国際特許出
願第００／７３７６４号パンフレットに記載されている。

Ｈａｔｈ１核酸およびアミノ酸配列は、例えば、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ
６１１４８（ＧＩ Ｎｏ．１５７５３５４）およびＡＡＢ４１３０５．１（ＧＩ Ｎｏ．
１５７５３５５）として公的に入手可能である。好ましくは、本発明のアデノウイルスベ
クターは、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする配列番号１を含む核酸配列を含む。

Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列は配列番号１を含むが、その核酸配列の多
くの改変および変異（例えば、突然変異）が、本発明に関して、可能であり、かつ適切で
ある。無調関連因子の機能は、そのタンパク質のヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬ
Ｈ）部分、特にＨＬＨドメインの塩基性領域に依存すると考えられている（Chienら, Pro
c. Natl. Acad. Sci., 93, 13239-13244 (1996)）。したがって、Ｈａｔｈ１タンパク質
をコードする核酸配列の任意の改変は、望ましくは、Ｈａｔｈ１タンパク質の機能が保持
または増強されるように、そのタンパク質の塩基性ドメインの外側に位置する。

Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列に加えて、本発明のアデノウイルスベクタ
ーは、好ましくは、宿主細胞において核酸配列の発現を提供する、プロモーター、エンハ
ンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、配列内リボソーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）などの発現制御配列を含む。例示的な発現制御配列は当技術分野において知られ
ており、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol.
185, Academic Press, San Diego, California (1990)に記載されている。理想的には、
Ｈａｔｈ１コード核酸配列は、プロモーターおよびポリアデニル化配列へ作動可能に連結
されている。プロモーターは、望ましくは、組織特異的プロモーター、すなわち、所定の
組織において優先的に活性化され、その結果として、それが活性化された組織において遺
伝子産物の発現を生じるプロモーターである。本発明のアデノウイルスベクターに用いら
れる組織特異的プロモーターは、Ｈａｔｈ１コード核酸配列が発現することになっている
標的組織または細胞型に基づいて選択することができる。本発明のアデノウイルスベクタ
ーに用いられる好ましい組織特異的プロモーターは、支持細胞または感覚有毛細胞に特異
的である。有毛細胞において特異的に活性化される組織特異的プロモーターには、例えば
、無調プロモーターまたはミオシンＶＩＩａプロモーターが挙げられる。支持細胞におい
て特異的に活性化される組織特異的プロモーターには、例えば、ｈｅｓ−１プロモーター
およびヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが挙げられる。好まし
い実施形態において、プロモーターは、配列番号２を含むヒトＧＦＡＰプロモーターであ
る。ヒトＧＦＡＰタンパク質は、中枢神経系のアストロサイト、非ミエリン形成シュワン
細胞、および他の選ばれた細胞型において主に発現する可溶性構造タンパク質である。内
耳の解剖学的形態内において、ＧＦＡＰ発現は、主に、その感覚器官の支持細胞（すなわ
ち、コルチ器官のダイテルス細胞および指骨細胞、管膨大部内に位置する細胞、ならびに
卵形嚢／球形嚢班における分水嶺外領域の支持細胞）に制限される。

本発明に用いることができる組織特異的プロモーターの他の例には、ＢＲＮ．３Ｃプロ
モーター、ＢＲＮ ３．１プロモーター、ＰＯＵ ＯＲＦ３因子プロモーター、ＢＲＫ１
プロモーター、ＢＲＫ３プロモーター、コーディンプロモーター、ノギンプロモーター、
ジャギド１プロモーター、ジャギド２プロモーター、およびノッチ１プロモーターが挙げ
られる。

タンパク質産生を最適化するために、Ｈａｔｈ１コード核酸配列はさらに、Ｈａｔｈ１
コード配列の下流にポリアデニル化配列を含む。任意の適切なポリアデニル化配列を用い
ることができ、それには、合成の最適化された配列、ならびにウシ成長ホルモン（ＢＧＨ
）、ポリオーマウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢ
Ｖ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）の
ポリアデニル化配列が挙げられる。ポリアデニル化配列は、好ましくは、サルウイルス４
０（ＳＶ４０）初期ＲＮＡ産物についてのポリアデニル化配列である、ＳＶ４０初期ポリ
アデニル化配列である（例えば、Carswell, S. and Alwine, J.C., Mol. Cell. Biol., 9
(10): 4248-4258 (1989)参照）。プロモーターおよびポリアデニル化配列に加えて、Ｈａ
ｔｈ１をコードする核酸配列は、望ましくは、その核酸配列が、それが導入される細胞に
おいて適切に発現するように正しく配置された適切な転写シグナル（および必要に応じて
、翻訳シグナル）の全部を含む。望ましい場合には、核酸配列はまた、ｍＲＮＡ産生を促
進するためにスプライス部位（すなわち、スプライス受容部位およびスプライス供与部位
）を組み入れることができる。

組織特異的プロモーター、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列、およびＳＶ４
０初期ポリアデニル化配列は、アデノウイルスベクターの産生が妨害されず、かつＨａｔ
ｈ１コード核酸配列が宿主細胞において効率的に発現する限り、任意の適切な配向で本発
明のアデノウイルスベクター内に位置することができる。一般的に、プロモーターは、Ｈ
ａｔｈ１コード核酸配列の上流に位置し、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列は、Ｈａｔｈ
１コード核酸配列の下流に位置する。一実施形態において、アデノウイルスベクターは、
以下のように、アデノウイルスゲノムに対して５’から３’へ順に前述のエレメントを含
み得る：組織特異的プロモーター（例えば、ヒトＧＦＡＰプロモーター）、Ｈａｔｈ１タ
ンパク質をコードする核酸配列、およびＳＶ４０初期ポリアデニル化配列。あるいは、ア
デノウイルスベクターは、以下のように、アデノウイルスゲノムに対して３’から５’へ
順に前述のエレメントを含み得る：ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、Ｈａｔｈ１タンパ
ク質をコードする核酸配列、および組織特異的プロモーター（例えば、ヒトＧＦＡＰプロ
モーター）。Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列、加えて、それに作動的に連結
された、組織特異的プロモーターおよびＳＶ４０初期ポリ（ａ）配列は、その位置におけ
る挿入がアデノウイルスベクター粒子の形成を許容する限り、アデノウイルスゲノムにお
いて任意の位置に挿入することができる。好ましくは、Ｈａｔｈ１コード核酸配列は、ア
デノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域に位置する。好ましい実施形態において、
アデノウイルスゲノムのＥ１領域が、アデノウイルスゲノムに対して３’から５’へ順に
、ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列、およ
びヒトＧＦＡＰプロモーターに置き換えられる。

本発明のアデノウイルスベクターは、例えば配列番号３の核酸配列を含み得る。

本発明は、本明細書に記載されたアデノウイルスベクター、およびそのための担体（例
えば、薬学的に許容される担体）を含む組成物を提供する。組成物は、望ましくは、担体
、好ましくは生理学的に（例えば、薬学的に）許容される担体、およびアデノウイルスベ
クターを含む、生理学的に許容される（例えば、薬学的に許容される）組成物である。本
発明に関する範囲内で、任意の適切な担体を用いることができ、そのような担体は、当技
術分野においてよく知られている。担体の選択は、一つには、組成物の特定の使用（例え
ば、動物への投与）、および組成物を投与するのに用いられる特定の方法により決定され
る。理想的には、複製欠損アデノウイルスベクターに関して、医薬組成物は、好ましくは
、複製可能なアデノウイルスを含まない。医薬組成物は、任意選択で、無菌でもよい。

適切な組成物には、抗酸化剤、バッファー、および静菌剤を含有することができる水性
および非水性等張性滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存
剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。組成物は、アンプルお
よびバイアルなどの単位用量または複数回用量の密閉容器において提供することができ、
使用直前の滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥
（lyophilized））状態で保存することができる。即席の溶液および懸濁液は、滅菌粉末
、顆粒、および錠剤から調製することができる。好ましくは、担体は、緩衝生理食塩水で
ある。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、投与前の損傷からアデノウイルスベ
クターを保護するように製剤化された組成物の一部である。例えば、組成物は、ガラス製
品、シリンジ、または針などの、アデノウイルスベクターを調製し、保存し、または投与
するために用いられるデバイスにおいて、アデノウイルスベクターの損失を低下させるよ
うに製剤化することができる。組成物は、アデノウイルスベクターの光感受性および／ま
たは温度感受性を減少させるように製剤化することができる。この目的を達成するために
、組成物は、好ましくは、例えば上記のものなどの、薬学的に許容される液体担体、およ
びポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、および
それらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤を含む。そのような組成物の使用
は、アデノウイルスベクターの保存可能期間を延ばし、それの投与を容易にする。アデノ
ウイルスベクター含有組成物のための製剤は、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号
明細書、米国特許第６，５１４，９４３号明細書、および国際特許出願公開第２０００／
０３４４４４号パンフレットにさらに記載されている。

組成物はまた、形質導入効率を増強するように製剤化することができる。加えて、当業
者は、アデノウイルスベクターが、他の治療剤または生物学的活性物質と共に組成物中に
存在し得ることを認識しているだろう。例えば、イブプロフェンまたはステロイドなどの
炎症を制御する因子は、アデノウイルスベクターのインビボ投与に伴う腫脹および炎症を
低減するために、組成物の一部でもよい。抗生物質、すなわち、殺菌剤および抗真菌剤は
、既存の感染を処置し、および／または遺伝子移入手順に伴う感染などの将来的な感染の
リスクを低下させるために存在し得る。

本発明はまた、必要とするヒトの内耳に感覚細胞を発生させる方法を提供する。この方
法は、本明細書に記載された本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物を投与するス
テップを含み、その際、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列が発現し、内耳にお
ける感覚細胞が発生する。本明細書で用いられる場合、用語「処置」、「処置すること」
などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。好ましくは、効
果は、治療的であり、すなわち、その効果が、疾患、および／または疾患に起因し得る有
害症状を部分的に、または完全に治癒させる。この目的を達成するために、本発明の方法
は、「治療有効量」の組成物をヒトに投与するステップを含む。「治療有効量」は、所望
の治療的結果を達成するのに、必要な投薬回数および期間において、有効な量を指す。治
療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応
答を誘発する本発明のアデノウイルスベクターの能力などの因子によって変わり得る。例
えば、本発明の組成物の治療有効量は、ヒトにおいて難聴または平衡障害を処置するレベ
ルでのＨａｔｈ１タンパク質の発現を生じる量である。

あるいは、薬理学的および／または生理学的効果は、予防的であり得、すなわち、その
効果は、疾患またはその症状を完全に、または部分的に防ぐ。この点において、本発明の
方法は、本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物の「予防有効量」を投与するステ
ップを含む。「予防有効量」は、所望の予防的結果（例えば、疾患発生の防止）を達成す
るのに、必要な投薬回数および期間において、有効な量を指す。治療的または予防的効力
は、処置された患者の定期的アセスメントによってモニターすることができる。

適切な用量および投与計画は、当業者に知られた通常の範囲発見技法によって決定する
ことができる。望ましくは、アデノウイルスベクターの単回用量は、アデノウイルスベク
ターの約１×１０^５個以上の粒子（粒子単位（ｐｕ）とも呼ばれる）、例えば、アデノウ
イルスベクターの約１×１０^６個以上の粒子、約１×１０^７個以上の粒子、約１×１０^８
個以上の粒子、約１×１０^９個以上の粒子、または約３×１０^８個以上の粒子を含む。代
替として、または追加として、アデノウイルスベクターの単回用量は、アデノウイルスベ
クターの約３×１０^１４個以下の粒子、例えば、アデノウイルスベクターの約１×１０^１
３個以下の粒子、約１×１０^１２個以下の粒子、約３×１０^１１個以下の粒子、約１×１
０^１１個以下の粒子、約１×１０^１０個以下の粒子、または約１×１０^９個以下の粒子を
含む。したがって、アデノウイルスベクターの単回用量は、前述の値のいずれか２つによ
って規定される範囲でのアデノウイルスベクターの粒子の量を含み得る。例えば、アデノ
ウイルスベクターの単回用量は、アデノウイルスベクターの１×１０^５〜１×１０^１４個
の粒子、１×１０^７〜１×１０^１２個の粒子、１×１０^８〜１×１０^１１個の粒子、３×
１０^８〜３×１０^１１個の粒子、１×１０^９〜１×１０^１２個の粒子、１×１０^９〜１×
１０^１１個の粒子、１×１０^９〜１×１０^１０個の粒子、または１×１０^１０〜１×１０
^１２個の粒子を含み得る。言い換えれば、アデノウイルスベクターの単回用量は、例えば
、アデノウイルスベクターの約１×１０^６ｐｕ、２×１０^６ｐｕ、４×１０^６ｐｕ、１×
１０^７ｐｕ、２×１０^７ｐｕ、４×１０^７ｐｕ、１×１０^８ｐｕ、２×１０^８ｐｕ、３×
１０^８ｐｕ、４×１０^８ｐｕ、１×１０^９ｐｕ、２×１０^９ｐｕ、３×１０^９ｐｕ、４×
１０^９ｐｕ、１×１０^１０ｐｕ、２×１０^１０ｐｕ、３×１０^１０ｐｕ、４×１０^１０ｐ
ｕ、１×１０^１１ｐｕ、２×１０^１１ｐｕ、３×１０^１１ｐｕ、４×１０^１１ｐｕ、１×
１０^１２ｐｕ、２×１０^１２ｐｕ、３×１０^１２ｐｕ、または４×１０^１２ｐｕを含み得
る。もちろん、他の投与経路は、治療的効果を達成するのにより少ない、またはより多い
用量を必要とする可能性がある。投薬量および投与経路の任意の必要な変更は、当技術分
野において公知の日常的技術を用いて、当業者により決定され得る。

内耳の構造の内部空間は限られている。内耳構造へ直接投与される医薬組成物の体積は
、過剰な組成物を強いることは感覚上皮を損傷することになるので、注意深くモニターす
べきである。ヒト患者について、投与される体積は、好ましくは、組成物の約１μｌ〜約
５００μｌ（例えば、約１０μｌから約４００μｌまで）である。例えば、約１０μｌか
ら約２００μｌまで（例えば、約１５μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌ、
６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、１００μｌ、１２５μｌ、１５０μｌ、１７
５μｌ、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）の組成物を投与するこ
とができる。一実施形態において、内耳構造、例えば、蝸牛または半規管の全液体内容物
は、医薬組成物で置き換えられる。別の実施形態において、本発明の方法の発現ベクター
を含む医薬組成物が、内耳構造へ、機械的外傷が最小化されるように、ゆっくり放出され
る。

本発明の方法の一実施形態において、Ｈａｔｈ１をコードするアデノウイルスベクター
を含む組成物は、望ましくは、所定の処置期間の間、ヒトの内耳へ１回だけ投与される。
言い換えれば、本発明の方法は、単回用量の本発明のアデノウイルスベクターのヒトの内
耳への投与を含む。他の実施形態において、組成物を、ヒトの内耳へ２回以上（すなわち
、複数回）投与することが有利な場合がある。したがって、本発明は、ヒトの内耳への２
回以上の用量の本発明のアデノウイルスベクターの投与を提供する。例えば、本発明のア
デノウイルスベクターを含む組成物は、同じ耳へ少なくとも２回、投与することができる
。組成物が、ヒトの内耳へ複数回、投与される場合、組成物の最初およびその次の投与に
対するヒトの応答に依存して、各投与は、何日間、何週間、何カ月間、またはさらに何年
間、隔てられ得る。例えば、複数回投与は、約１週間〜約４週間（例えば、２週間または
３週間）、または約３０日間〜約９０日間（例えば、約４０日間、約５０日間、約６０日
間、約７０日間、約８０日間、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）
、隔てられ得る。しかしながら、組成物の複数回投与（例えば、３回、４回、５回、６回
、またはそれ以上の投与）は、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列が十分発現し
、かつ内耳における感覚細胞が発生する限り、任意の適切な日数（例えば、投薬間に２日
間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間、４２日間、４９日間
、５６日間、６３日間、７０日間、７７日間、８５日間、またはそれ以上）、月数（例え
ば、投薬間に１カ月間、３カ月間、６カ月間、または９カ月間）、または年数（例えば、
投薬間に１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、またはそれ以上）、隔てられ得る。

組成物は、望ましくは、難聴および平衡障害などの内耳における感覚有毛細胞の損失、
損傷、または欠如に伴う障害を処置するためにヒトに投与される。この点において、組成
物は、難聴もしくは平衡障害を患っているヒト、または難聴と平衡障害の両方を患ってい
るヒトに投与することができる。難聴は、細菌またはウイルス感染、遺伝、物理的傷害、
音響外傷などによるコルチ器官の有毛細胞の損傷によって引き起こされ得る。難聴は容易
に同定されるが、平衡障害は、他の病気に簡単に起因して、幅広い種類の合併症として現
れる。平衡障害の症状には、失見当識、めまい、回転性めまい、悪心、霧視、不器用、お
よび高頻度の転倒が挙げられる。本発明の方法によって処置される平衡障害は、好ましく
は、感覚有毛細胞の損傷または欠如による機械的刺激の神経インパルスへの機能障害性変
換を含む末梢前庭障害（すなわち、前庭器の妨害）を含む。実施形態において、組成物は
、重度〜最重度の両側性難聴を処置するためにヒトに投与される。

組成物は、当技術分野において知られた任意の適切な方法を用いて、ヒトの内耳に投与
することができる。ヒトにおける内耳は、２つの主要な部分：（ａ）聴覚専用の蝸牛、お
よび（ｂ）平衡専用の前庭系を含む通路の系である骨迷路で構成されている。組成物は望
ましくは、蝸牛もしくは前庭系に、または蝸牛と前庭系の両方に投与される。投与経路を
問わず、本発明のアデノウイルスベクターは、内耳の感覚上皮、例えば、蝸牛および／ま
たは前庭系の感覚上皮に到達しなければならない。したがって、最も直接的な投与経路は
、内耳の構造の内部へのアクセスを可能にする外科的手順を必要とする。蝸牛開窓術（co
chleostomy）による接種は、聴覚に関連した内耳の領域に直接的な発現ベクターの投与を
可能にする。蝸牛開窓術は、例えばKawamoto et al., Molecular Therapy, 4(6), 575-58
5 (2001)に記載されているようにアブミ骨動脈の下の耳嚢において、蝸牛壁に穴を開ける
こと、およびアデノウイルスベクターを含む組成物の放出を含む。内リンパコンパートメ
ントへの投与は、聴覚に関与する内耳の部位に組成物を投与するのに特に有用である。あ
るいは、組成物は、管開窓術（canalostomy）により半規管に投与することができる。管
開窓術は、前庭系および蝸牛における導入遺伝子発現を提供するが、蝸牛開窓術は、前庭
空間における効率的な形質導入として提供するものではない。蝸牛空間への直接的注射が
有毛細胞への機械的損傷を生じ得るため、管開窓術を用いると、蝸牛機能への損傷のリス
クは低下する（Kawamoto et al.、前記）。投与手順はまた、液体（例えば、人工的外リ
ンパ）の下で実施することができ、その液体は、アポトーシス阻害剤または抗炎症薬など
の、処置または投与手順の副作用を軽減するための因子を含むことができる。

内耳への別の直接的投与経路は、正円窓を通して、正円窓への注射かまたは局所的適用
のいずれかによる。正円窓を介しての投与は、アデノウイルスベクターを外リンパ空間へ
送達するのに特に好ましい。蝸牛および前庭のニューロンならびに蝸牛感覚上皮における
導入遺伝子発現が、正円窓を介しての発現ベクターの投与後に観察されている（Staecker
et al., Acta Otolaryngol, 121, 157-163 (2001)）。別の実施形態において、組成物は
、外リンパ空間へ組成物を送達するために、卵円窓を通しての迷路内（ＩＬ）注入により
内耳に投与することができる。ある特定の場合には、支持細胞のアデノウイルスベクター
への十分な曝露を確実にするために、複数回の適用を施し、および／または複数の経路を
用いること、例えば、管開窓術および蝸牛開窓術を用いることが、適切となり得る。本発
明の組成物の内耳への特に好ましい送達方法は、例えば、米国特許第７，３８７，６１４
号明細書に記載されている。

本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物は、スポンジ、網、機械的リザーバもし
くはポンプ、または機械的インプラントなどの、アデノウイルスベクターの制御放出また
は持続放出を可能にするデバイス中、またはデバイス上に存在することができる。例えば
、（Jero et al., Hum. Gene Ther., 12: 539-548 (2001)に記載されているように）アデ
ノウイルスベクターを含む組成物中に浸された生体適合性スポンジまたはゲルフォームを
、正円窓に隣接して置くことができ、その正円窓を通して、発現ベクターが浸透して、蝸
牛に達する。別の実施形態において、ミニ浸透圧ポンプを用いて、長期間（例えば、５〜
７日間）にわたってアデノウイルスベクターの持続放出を提供することができ、それによ
り、アデノウイルスベクターを含む低体積の組成物が投与されることを可能にし、そのこ
とは、内因性感覚細胞への機械的損傷を防ぐことができる。組成物はまた、例えば、ゼラ
チン、コンドロイチン硫酸、テレフタル酸ビス−２−ヒドロキシエチル（ＢＨＥＴ）など
のポリホスホエステル、または乳酸−グリコール酸共重合体を含む持続放出製剤（例えば
、米国特許第５，３７８，４７５号明細書参照）の形で投与することができる。

好ましくはないが、本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物は、非経口的に、筋
肉内に、静脈内に、または腹腔内に投与することができる。患者に非経口的に投与される
場合には、アデノウイルスベクターは、望ましくは、支持細胞などの感覚上皮細胞へ特異
的に向けられる。例えば、アデノウイルスベクターは、外因性有毛細胞の発生を促進して
、損傷した内因性有毛細胞に置き換わるように、瘢痕感覚上皮に向けることができる。ア
デノウイルスベクターは、突起（fiber）、ペントン、またはヘキソンの領域を除去する
こと、様々な天然または非天然のリガンドをコートタンパク質の部分へ挿入することなど
により、潜在的宿主細胞上の受容体に対する発現ベクターの結合特異性または認識を変化
させるように改変することができる。当業者は、非経口投与が、適切な宿主細胞へ発現ベ
クターを効果的に送達するために大量の用量または複数回の投与を必要とし得ることを認
識しているだろう。

一実施形態において、本発明の方法は、約２０μＬから９０μＬの間を含む単回用量の
（アデノウイルスベクターの５．０×１０^１１粒子（ｖｐ）／ｍＬの濃度での）本発明の
組成物をヒトへ迷路内（ＩＬ）注入によって投与することを含む。

一実施形態において、本発明の方法は、約２０μＬから９０μＬの間を含む単回用量の
（アデノウイルスベクターの５．０×１０^１１粒子（ｖｐ）／ｍＬの濃度での）本発明の
組成物をヒトへ、約１０μＬ／分から約２０μＬ／分の間の注入速度での迷路内（ＩＬ）
注入によって投与することを含む。

本発明の方法は、他の治療様式を含む処置計画の一部となり得る。例えば、本発明の方
法は、１つまたは複数の薬物または手術で処置された、処置されることになっている、ま
たは処置されるだろうヒトに実施することができる。加えて、本発明の方法は、血管内皮
成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｅ２
Ｆ、および細胞周期上方制御因子などの、内耳における支持細胞の増殖を誘導する増殖剤
と共に用いることができる。本発明の方法はまた、人工内耳（cochlear implant）などの
聴覚装置の埋め込みと共に実施することができる。

内耳における感覚細胞（例えば、有毛細胞）の発生は、当技術分野において知られた様
々な手段を用いて決定することができる。例えば、感覚有毛細胞は、走査電子顕微鏡によ
り、または（免疫化学法により検出される有毛細胞特異的タンパク質である）ミオシンＶ
ＩＩａの検出により、検出することができる。しかしながら、感覚有毛細胞の単なる存在
は、必ずしも、環境的刺激を認識するための機能システムを意味するわけではない。機能
的感覚細胞は、機械的刺激が、脳によって認識される神経インパルスへ変換されるように
、神経路へ作動可能に繋がれなければならない。したがって、有毛細胞発生の検出は、Ｈ
ａｔｈ１コード核酸配列の標的組織への発現の成功を決定するのに適切であるが、感覚細
胞の発生は、好ましくは、ヒト対象による知覚の向上をもたらす。この点において、対象
自覚の試験は、知覚の変化の指標である。

音を検出する対象の能力の変化は、聴覚学者によって一般的に実施されるトーンテスト
などの単純な聴覚検査の実施によってアセスメントすることができる。たいていの哺乳類
において、異なる周波数に対する反応は、知覚の変化を示す。ヒトにおいて、言語の理解
もまた適切である。例えば、対象が、話を理解することができないが、聴くことはできる
。知覚の変化は、言語を背景雑音から識別することなどの音刺激の異なる型を区別する能
力、および話を理解することにより、示される。語音聴取閾値検査および弁別試験がその
ような評価に有用である。

平衡、運動認知、および／または運動刺激に対する応答のタイミングの変化の評価もま
た、様々な技術を用いて達成することができる。前庭機能は、運動刺激に対する応答の大
きさ（利得）、または応答の開始のタイミング（位相）を比較することにより測定するこ
とができる。動物は、知覚の向上を評価するために強膜サーチコイルを用いて、前庭動眼
反射（ＶＯＲ）利得および位相について試験することができる。電気眼振検査（ＥＮＧ）
は、例えば、移動または点滅光、身体整復、半規管内部の流体運動などの刺激に応答した
眼球運動を記録する。回転椅子または動く歩道を用いた運動の間の平衡の評価もまた、こ
れに関して有用である。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、もちろん、多少なりともその範囲を限定
するものとは解釈されるべきではない。

この実施例は、本発明の血清型５型アデノウイルスベクターを作製する方法を示す。

Ｅ１、Ｅ３、およびＥ４領域の欠失を含み、かつＨａｔｈ１タンパク質をコードする血
清型５型アデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを、例えば、米国特許第６
，４７５，７５７号明細書に記載されたＡＤＦＡＳＴ（商標）プロトコールを用いて構築
した。ＡＤＦＡＳＴ（商標）手順を用いて、血清型５型アデノウイルスベクターゲノム全
体をコードするプラスミドを構築した。最終ベクターゲノムの単一の遺伝的クローンの単
離を、細菌における２つの連続的コロニー成長ステップにより達成した。このＡｄＦＡＳ
Ｔ（商標）プラスミドを、アデノウイルスベクター成長のために補完する哺乳類細胞への
導入におけるウイルスベクターへ変換した。その後、アデノウイルスベクターストックを
作製するために、連続継代による増殖を続いて実施した。Ｈａｔｈ１発現血清型５型アデ
ノウイルスベクターを構築するためのステップは、下記に要約されている。

プラスミドの構築
ｐＡｄ３５１１ｇｆａ２．ＨＡＴＨ１．ｓｖと表示されるプラスミドを、制限酵素で消
化し、ＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１発現カセットをゲル抽出した。Ｅ１、Ｅ３、およびＥ４領域
における欠失、ならびにＳＶ４０のポリ（Ａ）と転写終結配列、β−グルクロニダーゼ遺
伝子、およびウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨ）のポリ（Ａ）と転写終結配列を含有する
転写不活性スペーサーを有する血清型５型アデノウイルスゲノムを含む基本プラスミド（
ｐＡｄＥ１（ＢＮ）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１）と表示される）を直線化し、精製した
。ｐＡｄＥ１（ＢＮ）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１）プラスミドを、大腸菌（E. coli）
においてＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１発現カセットと相同組換えして、プラスミドｐＡｄＥ１（
ＧＦＡＰ．Ｈａｔｈ１）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１）を得た。

完全長アデノウイルスベクタープラスミドのクローン性を確実にするために、ｐＡｄＥ
１（ＧＦＡＰ．Ｈａｔｈ１）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１） ＡＤＦＡＳＴ（商標）プラ
スミドＤＮＡの一定分量を用いて、限界段階希釈によりＤＨ１０Ｂ大腸菌（E. coli）を
形質転換した。明確に規定され、かつ単離されたコロニーを、最少コロニーを含有する最
大希釈のプレートから選択した。ミニプレッププラスミドＤＮＡを調製し、ＲＦＬＰ分析
によりプラスミド完全性を確認するために、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＳｐｅＩで消化した。陽性
の対応するミニプレップＤＮＡを用いて、別の一連の限界希釈物を作製し、その後、それ
を用いてＤＨ１０Ｂ大腸菌（E. coli）を形質転換した。最少コロニーを含有するプレー
ト上の単一コロニーからの液体培養物の一定分量を用いて、ミニプレップＤＮＡを作製し
、それについて、ＡｐａＩを用いて、プラスミド完全性をさらに確認した。陽性クローン
の残りの液体培養物を用いて、ＬＢ−カナマイシンプレートに画線した。ＨＩＳＰＥＥＤ
（商標）プラスミドＭａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒ
ｌａｎｄｓ）によるＥｎｄｏＦｒｅｅ ＡＤＦＡＳＴ（商標）プラスミドＤＮＡの調製の
ために製造会社のプロトコールに従って、単一の細菌形質転換体を増殖した。生じたプラ
スミド調製物を、ＢｇｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＢａｍＨＩ
＋ＰａｃＩ制限酵素消化により確認した。ｐＡｄＥ１（ＧＦＡＰ．Ｈａｔｈ１）Ｅ３（１
０）Ｅ４（ＴＩＳ１）のマップは図１に示されている。その後、ｐＡｄＥ１（ＧＦＡＰ．
Ｈａｔｈ１）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ１）のＤＮＡ配列を決定した。

ベクター変換
１８μｇの内毒素を含まないｐＡｄＥ１（ＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１）Ｅ３（１０）Ｅ４（
ＴＩＳ１）を、ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを含む３００μＬ中で消化し、フェノー
ルクロロホルムイソアミルアルコール（ＰＣＩ）により精製した。簡単に述べれば、１０
０ｕＬのＰＣＩを制限反応物に加え、激しい反転により混合し、微量遠心管中、１３，０
００ＲＰＭで２分間、回転させ、上部の水相を新しいチューブに移した。３０μＬ（０．
１体積）の５Ｍ ＮａＣｌおよび８００μＬの無水エタノールの添加によりＤＮＡを沈殿
させ、氷上で１０分間、インキュベートし、その後、微量遠心管中、１３，０００ＲＰＭ
で１０分間、回転させ、上清をデカントした。ペレットを、５００μＬの７０％エタノー
ルで洗浄し、遠心分離し、上記のようにデカントし、ＤＮＡペレットを風乾した。ＤＮＡ
を３０μＬ ＴＥ中に再懸濁し、ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍでの吸光度によって決定した
。２９３−ＯＲＦ６細胞に、４μｇのＰａｃＩ消化および精製されたＤＮＡを、ＰＯＬＹ
ＦＥＣＴ（商標）試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
を用いて、トランスフェクションし、３７℃、５％ＣＯ_２で、３日間、インキュベートし
た。（３サイクルの凍結融解により生じた）トランスフェクション可溶化液を用いて連続
継代を開始し、高力価の可溶化液が生じた。ＰＣＲによる確認後、その高力価の可溶化液
を用いて、ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄアデノベクターを増加させた。

ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄアデノウイルスベクターの構築
ＧＶ５０１Ａ（そのマップは図２に示されている）およびＣＧＦ１６６とも呼ばれる、
アデノウイルスベクターＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄを構築するために、ＡＤＦＡ
ＳＴ（商標）プラスミドｐＡｄＥ１（ＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１）Ｅ３（１０）Ｅ４（ＴＩＳ
１）を、制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩで消化し、標準手順を用いて２９３−ＯＲＦ６
細胞へトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞由来のアデノベクタ
ー可溶化液を、５回、連続継代して、ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄ／ＧＶ５０１Ａ
可溶化液の力価および体積を増加させ、高力価（ＨＴ２）ストックを作製した。ＧＶ５０
１Ａトランスフェクションおよび構築に用いられる２９３−ＯＲＦ６細胞を、他の活性か
らの隔離を保証するために、アクセスを制限した細胞培養室において維持した。加えて、
ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄ／ＧＶ５０１Ａのトランスフェクション、連続継代、
および産生を、隔離およびアクセスの制限を維持する手順の下、隔離したウイルス培養室
において行った。ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄ／ＧＶ５０１Ａベクターの同定およ
び完全性を、ＨＴ２継代時点でＰＣＲ分析により確認した。その後、ＨＴ２可溶化液を用
いて、アデノベクターストック増量を生じさせた。

Ｈａｔｈ１導入遺伝子発現アッセイ
ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄベクターを、マウス卵形嚢モデルにおけるＨＡＴＨ
１駆動性感覚細胞再生に基づいて、機能的導入遺伝子発現について認証した。この実験の
結果は、ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄベクターが、感覚細胞再生を誘導する能力が
あり、それゆえに、機能的ＨＡＴＨ１タンパク質を産生することを示した。加えて、Ａｄ
ＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄを、改変型Ｈａｔｈ１ ｍＲＮＡ発現アッセイを用いて、
Ｈａｔｈ１導入遺伝子ｍＲＮＡの発現について試験した。アッセイは、２９３細胞をＡｄ
ＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄに感染させ、感染から２４時間後、全ＲＮＡを単離するこ
とを含んだ。Ｈａｔｈ１特異的ｍＲＮＡ発現を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって測定
した。このアッセイの結果は、観察されたそのＲＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡのみのプライ
マーおよびプローブに基づいたＨａｔｈ１発現の証拠を示した。

この実施例の結果は、Ｅ１領域およびＥ４領域の１個または複数の内因性ヌクレオチド
が欠失しており、かつＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、ヒトＧＦＡＰプロモーターに作
動可能に連結されたＨａｔｈ１コード核酸配列、および転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）
を含む血清型５型アデノウイルスベクターの生成を確認している。

この実施例は、ヒトにおいて聴覚および前庭機能を向上させるために迷路内（ＩＬ）注
入により送達されたＣＧＦ１６６（ＡｄＧＦＡＰ．ＨＡＴＨ１．１１Ｄ）の安全性、耐容
性、および潜在能力を評価するために設計された臨床試験を記載する。

臨床治験は、重度〜最重度の両側性難聴を有し、手術をしない耳において無傷の前庭機
能を有する患者における、非盲検、単回用量、系列的コホートを利用する３パート試験で
ある。患者は、登録前に、非変動性の重度〜最重度両側性難聴を立証されていることが必
要とされる。最大４５人の患者が、この３パート、６つのコホートの治験に登録され得る
。

治験のパートＡは、２０μＬ ＣＧＦ１６６濃度（５．０×１０^１１個のウイルス粒子
（ｖｐ）／ｍＬ）の単回ＩＬ投与後の安全性および耐容性、ならびに潜在能力をアセスメ
ントすることになる。処置された各患者の後（処置後約４週間）、次の各患者に投薬する
前に、安全性データ審査が完了することができるように、患者登録はずらされる。

治験のパートＢは、４つのコホートの患者（ｎ＝３／コホート；合計１２人の患者）に
おいて同じＣＧＦ１６６濃度（５．０×１０^１１ｖｐ／ｍＬ）の最高４つの考え得る注入
体積（２０μＬから９０μＬｎ間）を評価するための体積漸増設計を含む。全ての用量体
積は、治験安全性データに基づいて変更を受けることになる。

次の各コホートは、前のコホートにおいて送達された体積が、安全審査委員会（Safety
Review Committee）（ＳＲＣ）によって決定される場合、安全で、かつ耐容性があると
みなされた後のみ、投薬される。加えて、各コホートにおける最初の患者のスケジューリ
ングおよび投薬は、各コホートにおいて残りの２人の患者を処置することの間に少なくと
も４週間の間隔を置くようにずらされる。

パートＢにおいて決定された、安全性および耐容性が最も高い体積が、パートＣの患者
におけるＩＬ注入に用いられる。合計２０人の患者が、本研究のパートＣに必要とされる
。パートＡおよびＢについて記載されたものと類似した安全性審査が、５人の被験者の１
ブロックが、最初の４週間の研究アセスメントを完了するたびに、行われる。

患者は、治験の全てのパート（Ａ〜Ｃ）において、プロトコールに必要な同じアセスメ
ントおよび来院スケジュールを受けることになる。試験のパートＣは、予備的安全性およ
び耐容性が、パートＡおよびＢにおける患者において、ＣＧＦ１６６および関連した送達
方法について確立された時点でのみ、開始する。

治験期間は、６３日のスクリーニング期間、続いて、１〜３日のベースラインアセスメ
ント期間および院内外科的投薬／手術後アセスメント期間（およそ６〜１４日間）、続い
て投薬後６カ月のアセスメント期間からなる。加えて、パートＡ〜Ｃにおける全ての投薬
された被験者は、別個の５年の安全性追跡調査治験に登録する機会に関して通知される。

スクリーニング期間の間、潜在的患者の適格性が、治験センターにおいて検証される。

潜在的患者は、健康診断、ＭＲＩ、既往歴／現病歴、および臨床検査に基づいて、プロ
トコールに必要な手術を受ける前に、計画された治療に対する適応度について評価される
。スクリーニング期間の間、潜在的患者はまた、処置前の、生活の質、聴覚、および前庭
機能の試験を受ける。

要求される検証およびアセスメントを完了するために、スクリーニング期間の間の少な
くとも２回の外来が見込まれる。全てのスクリーニングアセスメントが、１回の来院で完
了することができる場合には、それは認められる。患者および診療所のスケジュール、な
らびに再検証および可能性のある再検査の必要性の結果が出るまで、追加のスクリーニン
グ外来（すなわち、２回より多い来院）が許可される。

スクリーニングアセスメントに基づいて、一方の耳が治験対象耳として選択され、試験
によって要求される手術を受ける。治験対象耳の選択基準は以下を含む：（１）純音聴力
検査および音声認識スコアにより決定される場合のより重度の難聴を有する耳、ならびに
（２）両方の耳の難聴の重症度が等しい場合には、治験対象耳は、治験医師の好みによっ
て選択される。

スクリーニング来院を終了した時点で、適格患者は、ベースラインの来院および手術の
予定が決定される。

ベースライン（−３日目〜−１日目）
適格患者は、ベースライン（−３日目〜−１日目）において治験センターに戻り、手術
前の準備、および処置前の機能アセスメントを受ける。

１日目来院
１日目、治験対象患者は、プロトコールに必要なアセスメントを受け、内耳の前庭階外
リンパ空間への治験薬の送達のためのアブミ骨切除術を受ける。手術および治験薬注入の
完了時点において、治験対象患者は、外科センターの術後施設において回復し、手術後の
評価およびアセスメントを受ける。治験対象患者は、外科センターの入院棟か、または外
科センターに近い事前に決められた仮設住宅のいずれかに移動し得る。

２日目〜６日目の来院
治験対象患者は、手術後の次の５日間（２日目〜６日目）、経過観察され、プロトコー
ルに必要な安全性追跡評価を受ける。治験対象患者は、長期モニタリングを必要とする有
意な有害事象がない場合には、自宅へ退院する。患者は、１４日目の来院の終了まで、提
供された住宅に留まるという選択肢を有する。その後の来院の予定は、退院する前に治験
対象患者について決定される。

１４日目来院
治験対象患者は、治験センターに戻って、耳から外科用パッキングを取り除いてもらい
、治験により要求されるアセスメントも受ける。患者は、全ての治験により要求される評
価の終了時点に自宅または地元の民家へ退院する。患者は、次の予定された来院を教えて
もらう。

追跡調査および治験来院（４週間ごと）の終了
治験センターへの毎月の各来院の間、治験対象耳の術後回復が、モニターおよび評価さ
れる。治験対象患者はまた、各来院の間、治験により要求される安全性、生活の質、聴覚
、および前庭機能の試験を受ける。体内分布血液試料もまた各来院の間に収集される。免
疫原性試験のための試料は、血液ログの通りに収集される。術後６カ月目の来院の終了（
治験来院の終わり）時点において、長期のモニタリングを必要とする有意な有害事象がな
い場合には、治験対象患者は、治験を完了したとみなされ、自宅へ退院する。

全ての投薬された患者は、別個の延長／追跡調査治験に参加することが見込まれる。

安全性データ審査
パートＡにおける各患者（コホート１）に投薬する前、およびパートＢにおける２人の
残りの患者（コホート２〜５）に投薬する前に、全ての安全性および耐容性データの審査
、ならびに選択された聴覚および前庭機能データの審査を行う。審査用としてみなされる
データは、ＳＲＣ Ｃｈａｒｔｅｒに概要を示されているように、投薬後４週間まで入手
可能なデータである。安全性および耐容性は、そのコホートにおける残りの患者について
進めるために良好とアセスメントされなければならない。コホート２〜５について、残り
の２人の患者に投薬するという決定は、ＳＲＣによってなされる。著しい有害事象または
安全性の懸念が、計画された用量レベルの１つにおいて見出される場合には、次の計画さ
れる用量レベルは変更され得る。

１つのコホートの終了の後で、かつ次のコホートへ進む前に、全ての安全性および耐容
性データ、ならびに限定された聴覚および前庭データの審査は、ＣＧＦ１６６の投薬を受
け、かつ少なくとも４週間の治験アセスメントを完了している全ての患者について実施さ
れる。安全性および耐容性は、次のコホートへ進むために良好としてアセスメントされな
ければならない。この決定はＳＲＣによってなされる。著しい有害事象または安全性の懸
念が、計画された用量レベルの１つにおいて見出される場合には、次の計画される用量レ
ベルは変更され得る。

パートＣについて、上記の安全性審査は、５人の被験者それぞれが治験アセスメントの
最初の４週間を完了した時に、実施される。

所見
パートＡ、Ｂ、およびＣの下で２０〜４０μＬの本発明の組成物で処置された最初の患
者は、それぞれ、０〜３個の間の有害事象（全て、追跡調査の２〜６カ月間にわたって、
軽度〜中等度として分類された）を報告している。中等度として分類された全ての事象を
含む最も有害な事象は、本処置に関連するものではないと思われた。加えて、本組成物で
の処置後、検査値において臨床的に有意な変化はなかった。これらの結果は、本発明の組
成物が、ヒトに投与された場合、安全であることを示している。

この実施例は、ヒトにおいて難聴を処置するための本発明のアデノウイルスベクターの
安全性および効力を評価するために設計された臨床プロトコールを記載する。

本明細書に引用された、刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、あた
かも各参考文献が、参照により組み入れられているように個々に、かつ具体的に示され、
かつ本明細書に全体として示されているかのように、同じ程度で参照により本明細書に組
み入れられている。

本発明を記載することに関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「１つ
の（a）」、および「１つの（an）」、および「その（the）」、および「少なくとも１つ
の」の使用、ならびに類似した指示物は、本明細書において他に指示がなく、または文脈
によって明らかに否定されることがない限り、その単数形と複数形の両方を網羅するよう
に解釈されるものとする。後に１つまたは複数の項目のリストが続く、用語「少なくとも
１つ」の使用（例えば、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」）は、本明細書において他に指
示がなく、または文脈によって明らかに否定されることがない限り、列挙された項目から
選択される１つの項目（ＡまたはＢ）、または列挙された項目のうちの２つ以上の任意の
組み合わせ（ＡおよびＢ）を意味するように解釈されるものとする。用語「含むこと（co
mprising）」、「有すること（having）」、「含むこと（including）」、および「含有
すること（containing）」は、他に規定がない限り、制約がない用語（すなわち、「挙げ
られるが、それらに限定されない」ことを意味する）として解釈されるものとする。本明
細書における値の範囲の列挙は、本明細書で他に指示がない限り、その範囲内に入るそれ
ぞれ別個の値を個々に参照する簡潔な方法としての役割を果たすことを単に意図され、そ
れぞれ別個の値が、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細
書へ組み入れられる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書において他に指示が
なく、または文脈によって明らかに否定されることがない限り、任意の適切な順序で実施
することができる。本明細書に提供されたありとあらゆる例、または例示的な言いまわし
（例えば、「などの（such as）」）の使用は、単に、本発明をより良く明らかにするこ
とを意図され、他に主張がない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細
書におけるいかなる言語も、任意の主張されていない要素を示す場合、本発明の実施に必
須であると解釈されるべきではない。

本発明を行うために本発明者らが知っている最良の様式を含め、本発明の好ましい実施
形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変更は、前述の説明を読
めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が、必要に応じてそのような変
更を採用することを予想しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載さ
れたものとは異なったように実施されることを意図している。したがって、この本発明は
、適用法によって認められているように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙さ
れた主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、ありとあらゆる変更における上記の
要素のいかなる組み合わせも、本明細書で他に指示がなく、または文脈によって明らかに
否定されることがない限り、本発明に包含される。

本発明を行うために本発明者らが知っている最良の様式を含め、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態の変更は、前述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が、必要に応じてそのような変更を採用することを予想しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なったように実施されることを意図している。したがって、この本発明は、適用法によって認められているように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、ありとあらゆる変更における上記の要素のいかなる組み合わせも、本明細書で他に指示がなく、または文脈によって明らかに否定されることがない限り、本発明に包含される。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］（ａ）ＶＡ ＲＮＡ Ｉ領域において２塩基対が欠失していること、Ｅ１領域における内因性遺伝子を機能的欠損にするようにＥ１領域の１個または複数の内因性ヌクレオチドが欠失していること、Ｅ３領域の１個または複数の内因性ヌクレオチドが欠失していること、およびＥ４領域における内因性遺伝子を機能的欠損にするようにＥ４領域の１個または複数の内因性ヌクレオチドが欠失していることを例外とするが、右側の逆位末端反復（ＩＴＲ）、Ｅ４領域ポリアデニル化配列、およびＥ４領域プロモーターが保持されている、血清型５型アデノウイルスゲノム、
（ｂ）ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、
（ｃ）ヒト無調ホモログ−１（Ｈａｔｈ１）タンパク質をコードし、配列番号１を含む核酸配列、
（ｄ）ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ならびに
（ｅ）転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）
を含むアデノウイルスベクターであって、エレメント（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、アデノウイルスゲノムのＥ１領域においてアデノウイルスゲノムに対して３’から５’へ順に位置し、エレメント（ｅ）が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域において、Ｅ４ポリアデニル化配列とＥ４プロモーターの間に位置する、前記アデノウイルスベクター。
［２］アデノウイルスゲノムが、内因性プロモーターならびにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子のコード領域を含まない、［１］に記載のアデノウイルスベクター。
［３］アデノウイルスゲノムが、血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ１領域の内因性ヌクレオチド３５６〜３５１０（両端を含む）を含まない、［２］に記載のアデノウイルスベクター。
［４］アデノウイルスゲノムが、血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ３領域の内因性ヌクレオチド２８，５９３〜３０，４７１（両端を含む）を含まない、［１］〜［３］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクター。
［５］アデノウイルスゲノムがＥ４領域コード配列のいずれも含まない、［１］〜［４］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクター。
［６］アデノウイルスゲノムが、血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ４領域の内因性ヌクレオチド３２，８２７〜３５，５６３（両端を含む）を含まない、［５］に記載のアデノウイルスベクター。
［７］ＶＡ ＲＮＡ １領域における２塩基対の欠失が、血清型５型アデノウイルスゲノムの内因性ヌクレオチド１０，５９４および１０，５９５の欠失である、［１］〜［６］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクター。
［８］ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが配列番号２を含む、［１］〜［７］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクター。
［９］転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）が、アデノウイルスゲノムに対して５’から３’へ順に、（ｉ）サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列および転写終結配列、（ｉｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子をコードする核酸配列、ならびに（ｉｉｉ）ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列および転写終結配列を含む、［１］〜［８］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクター。
［１０］配列番号３の核酸配列を含む、［１］〜［９］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクター。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか一つに記載のアデノウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
［１２］必要とするヒトの内耳に感覚細胞を発生させる方法であって、［１１］に記載の組成物を前記ヒトの内耳に投与するステップを含み、その際、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードする核酸配列が発現し、内耳における感覚細胞が発生する、前記方法。
［１３］前記組成物が、難聴を患っているヒトに投与される、［１２］に記載の方法。
［１４］前記組成物が、平衡障害を患っているヒトに投与される、［１２］に記載の方法。
［１５］前記組成物が、前記ヒトの内耳に１回、投与される、［１２］〜［１４］のいずれか一つに記載の方法。

Claims (15)

1. （ａ）ＶＡ ＲＮＡ Ｉ領域において２塩基対が欠失していること、Ｅ１領域における
   内因性遺伝子を機能的欠損にするようにＥ１領域の１個または複数の内因性ヌクレオチド
   が欠失していること、Ｅ３領域の１個または複数の内因性ヌクレオチドが欠失しているこ
   と、およびＥ４領域における内因性遺伝子を機能的欠損にするようにＥ４領域の１個また
   は複数の内因性ヌクレオチドが欠失していることを例外とするが、右側の逆位末端反復（
   ＩＴＲ）、Ｅ４領域ポリアデニル化配列、およびＥ４領域プロモーターが保持されている
   、血清型５型アデノウイルスゲノム、
   （ｂ）ＳＶ４０初期ポリアデニル化配列、
   （ｃ）ヒト無調ホモログ−１（Ｈａｔｈ１）タンパク質をコードし、配列番号１を含む核
   酸配列、
   （ｄ）ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ならびに
   （ｅ）転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）
   を含むアデノウイルスベクターであって、エレメント（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、
   アデノウイルスゲノムのＥ１領域においてアデノウイルスゲノムに対して３’から５’へ
   順に位置し、エレメント（ｅ）が、アデノウイルスゲノムのＥ４領域において、Ｅ４ポリ
   アデニル化配列とＥ４プロモーターの間に位置する、前記アデノウイルスベクター。
2. アデノウイルスゲノムが、内因性プロモーターならびにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子のコ
   ード領域を含まない、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
3. アデノウイルスゲノムが、血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ１領域の内因性ヌクレ
   オチド３５６〜３５１０（両端を含む）を含まない、請求項２に記載のアデノウイルスベ
   クター。
4. アデノウイルスゲノムが、血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ３領域の内因性ヌクレ
   オチド２８，５９３〜３０，４７１（両端を含む）を含まない、請求項１〜３のいずれか
   一項に記載のアデノウイルスベクター。
5. アデノウイルスゲノムがＥ４領域コード配列のいずれも含まない、請求項１〜４のいず
   れか一項に記載のアデノウイルスベクター。
6. アデノウイルスゲノムが、血清型５型アデノウイルスゲノムのＥ４領域の内因性ヌクレ
   オチド３２，８２７〜３５，５６３（両端を含む）を含まない、請求項５に記載のアデノ
   ウイルスベクター。
7. ＶＡ ＲＮＡ １領域における２塩基対の欠失が、血清型５型アデノウイルスゲノムの
   内因性ヌクレオチド１０，５９４および１０，５９５の欠失である、請求項１〜６のいず
   れか一項に記載のアデノウイルスベクター。
8. ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが配列番号２を含む、請求
   項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
9. 転写不活性スペーサー（ＴＩＳ）が、アデノウイルスゲノムに対して５’から３’へ順
   に、（ｉ）サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列およ
   び転写終結配列、（ｉｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子をコードする核酸配列、ならびに
   （ｉｉｉ）ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来のポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列
   および転写終結配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクタ
   ー。
10. 配列番号３の核酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベ
    クター。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターおよび薬学的に許容さ
    れる担体を含む組成物。
12. 必要とするヒトの内耳に感覚細胞を発生させる方法であって、請求項１１記載の組成物
    を前記ヒトの内耳に投与するステップを含み、その際、Ｈａｔｈ１タンパク質をコードす
    る核酸配列が発現し、内耳における感覚細胞が発生する、前記方法。
13. 前記組成物が、難聴を患っているヒトに投与される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記組成物が、平衡障害を患っているヒトに投与される、請求項１２に記載の方法。
15. 前記組成物が、前記ヒトの内耳に１回、投与される、請求項１２〜１４のいずれか一項
    に記載の方法。

Images