CN110709060A

CN110709060A - 用于治疗听力丧失的基因治疗构建体和方法

Info

Publication number: CN110709060A
Application number: CN201880028001.3A
Authority: CN
Inventors: H·施特克尔; X·Z·刘; 陈正一; C·J·阿亚拉
Original assignee: Rescue Hearing Co Ltd
Current assignee: Rescue Hearing Co Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2020-01-17
Also published as: EP3595634B1; CA3054941A1; IL268912A; KR20190131052A; US20200248203A1; WO2018170402A1; BR112019019367A2; JP2020509786A; EP3595634A1; US20200114023A1; EP3595634A4

Abstract

本发明公开了可用于治疗和/或预防由TMPRSS3基因或LOXHD1基因的遗传突变所导致的听力丧失的组合物和方法。本文公开的组合物和方法使用腺相关病毒(AAV)载体基因递送TRMPSS3或LOXHD1至内耳以分别恢复TMPRSS3基因或LOXHD1基因的活性，促进毛细胞存活并恢复患有听力丧失的患者的听力。

Description

用于治疗听力丧失的基因治疗构建体和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年3月17日提交的美国临时申请No.62/472,790和2017年7月12日提交的美国临时申请No.62/531,522的权益，它们的内容均通过引用的方式整体并入本文。

技术领域

公开了用于治疗和/或预防由TMPRSS3基因或LOXHD1基因的遗传突变所引起的听力丧失和耳聋的组合物和方法。

背景技术

听力丧失是人类最常见的感觉缺陷。根据2012年世界卫生组织(WHO)发布的致残性听力丧失数量的估计，全世界有3.6亿人患有致残性听力丧失(3.28亿成人和3200万儿童)，那些人中有89％(或3.22亿)的人居住在低收入国家(WHO对听力丧失患病率的全球估计；Mortality and Burden of Diseases and Prevention of Blindness and Deafness(疾病的死亡率和负担以及失明和耳聋的预防)，WHO 2012)。

目前还没有用于预防或治疗听力丧失或耳聋的批准的治疗剂。目前对于那些具有致残性听力丧失的患者的治疗选择是人工耳蜗植入。人工耳蜗植入是一种与医疗费用有很大关系的常见手术，每位患者的终生费用超过1,000,000美元(Mohr PE等(2000).Thesocietal costs of severe to profound hearing loss in the United States；Int.JTechnol Assess Health Care；16(4):1120-35)。

目前对人工耳蜗植入物的需求超过了供应量。人工耳蜗植入装置的生产率为每年50,000个。根据目前的出生率以及新生儿致残性听力丧失的发生率和患病率，每年需要134,000个人工耳蜗植入物来为每个患病儿童提供1个人工耳蜗植入物。如果包括需要双侧(2)人工耳蜗植入物的患者，这个数字会增加。

对于大多数人，特别是对于那些生活在大多数患有致残性听力丧失的人所居住的发达国家之外的人来说，人工耳蜗植入物的终生成本是高昂的。需要提供代替人工耳蜗植入物的经济的治疗选择，特别是对于那些生活在发达国家之外的人。

超过50％的语前聋是遗传性的，即遗传性疾病(疾病控制和预防中心-听力丧失遗传学)。遗传性听力丧失和耳聋可以是传导性的、感觉神经性的，或两者都有；综合征性的(伴有外耳或其他器官的畸形或涉及其他器官系统的医学问题)或非综合征性的(没有伴有明显的外耳异常或任何相关的医学问题)；和语前(语言发展前)的或语后(语言发展后)的(Richard JH Smith,MD,A Eliot Shearer,Michael S Hildebrand,PhD,and Guy VanCamp,PhD,Deafnessand Hereditary Hearing Loss Overview,GeneReviews最初发布:1999年2月14日；最后修订:2014年1月9日。超过70％的遗传性听力丧失是非综合征性的。非综合征性耳聋的不同基因位点指定为DFN(耳聋(DeaFNess))。基于遗传方式命名基因位点：DFNA(常染色体显性)、DFNB(常染色体隐性)和DFNX(X连锁)。上述名称后面的数字反映了基因定位和/或发现的顺序。在一般人群中，听力丧失的患病率随着年龄的增长而增加。这一改变反映了遗传和环境的影响以及环境触发因素与个体遗传倾向之间的相互作用。

感觉神经性听力丧失(SNHL)是人类最常见的神经退行性疾病，目前尚无批准的药物干预。SNHL可以由遗传性疾病引起，也可以由例如声音创伤和耳毒性损伤引起。基因诊断已经证明，至少有100个基因导致非综合征性SNHL。遗传学和基因治疗技术的最新研究进展表明，通过基因治疗可以挽救许多隐性型耳聋(Akil等，2012；Askew等，2015)。使用腺相关病毒载体(AAV)已经实现了向内耳的长期基因递送(Shu，Tao，Wang，等，2016)。尽管在几年前首次描述了这些观察结果，但尚未转化到人体进行临床试验。该领域中用于转化研究的理想的疾病目标是隐性遗传性听力丧失，该隐性遗传性听力丧失影响内耳内确定的一组细胞并且发生在语言发展后。突变的患病率是另一个考虑因素。

如本文所述，通过仔细评估听力丧失的常见隐性病因的发生率并且考虑到基因的大小，研发出一种具有可实现性且相当常见的患者群体的基因治疗方法是可能的。例如，虽然不如其他突变基因常见，但TMPRSS3是一种相当常见的可引起听力丧失的基因，其严重性足以确定需要耳蜗植入。此外，具有TMPRSS3突变的患者可能对人工耳蜗植入无反应以及具有其他突变的患者(Shearer等，2017)。这提供了将靶向TMPRSS3基因或其他基因如LOXHD1作为独立治疗剂或与其他治疗剂和/或耳蜗植入相结合的治疗机会，以改善该病症的植入效果。表1(改编自(Miyagawa,Nishio,&Usami,2016))表明TMPRSS3突变可能是语后隐性听力丧失的最常见原因，其在耳蜗内的分布相当有限，并且由于基因的大小，可以尝试将其建立到现有的AAV载体中。

表1：176名成人人工耳蜗植入患者中不同突变的发病率

人类跨膜蛋白酶，丝氨酸3(TMPRSS3；也称为DFNB10、DFNB8、ECHOS1、TADG12；Acc:HGNC:11877)通过其与先天性(出生时存在)和儿童期发作的常染色体隐性耳聋的相关联性来鉴定。TMPRSS3基因突变与常染色体隐性非综合征性听力损伤类型DFNB8和10相关。TMPRSS3是编码丝氨酸蛋白酶的1646碱基对基因，并且与DFNA 8/10相关，可以占到进行人工耳蜗植入的听力丧失患者的1-5％(Weegerink等，2011)。该基因功能丧失的出现所引起的广谱听力表型取决于突变的位点。先天性和成人发作的进行性听力丧失均与该基因的丧失有关。

虽然DFNB10听力丧失的发作是语前的(先天性的)，但DFNB8听力丧失的发作是语后的(年龄10-12岁)。这种表型的差异反映了基因型的差异。DFNB8所引起的变体是剪接位点变体，表明低效剪接与正常蛋白质的减少量相关，该正常蛋白质足以预防语前耳聋但不足以预防最终的听力丧失。(参见Richard JH Smith,MD，等.(2014).Genes Known toCause Autosomal Recessive Nonsyndromic Hearing Impairment:Deafness andHereditary Hearing Loss Overview；GeneReviews)。

表2中描述了已知会导致听力丧失的染色体21上的TMPRSS3突变。

脂氧合酶同源结构域1基因(LOXHD1；也称为LH2D1、DFNB77、FLJ32670；OMIM：613072；Acc：HGNC：26521)编码完全由PLAT(多囊蛋白/脂氧合酶/α-毒素)结构域组成的高度保守的蛋白质，被认为参与将蛋白质靶向到质膜。小鼠研究表明，该基因在内耳的机械感觉毛细胞中表达，该基因的突变导致听觉缺陷，表明该基因对正常毛细胞的功能至关重要。对人类家族分离耳聋的筛查识别该基因中导致DFNB77的突变，所述DFNB77是一种进行式常染色体-隐性非综合征性听力丧失(ARNSHL)。或者，已经注意到该基因的剪接转录变体所编码的不同异构体。

LOXHD1的临床特征：

·常染色体隐性遗传

·听力丧失、感觉神经性的、双侧(低频率轻度听力丧失)

·导致在德系犹太家族中在7-10岁之间人工耳蜗植入的先天发作

·在成年期间的近亲的伊朗家族中，7-8岁的年龄发作发展至中等频率和高频率的中度到重度的丧失

证据表明，常染色体隐性遗传性非综合征性听力丧失-77(DFNB77)是由染色体18q21上LOXHD1基因(613072)的纯合突变所引起的。

通过原位杂交检测到在胚胎期13.5和16天发育中的小鼠内耳中有Loxhd1表达，但未在任何其他组织中发现。在出生后的第4天，在耳蜗和前庭毛细胞中检测到表达，其中在细胞核中浓度最高。Loxhd1逐渐定位于细胞质，并且在成人中，Loxhd1在毛细胞中沿着静纤毛的长度表达。

使用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变筛选，Grillet等(2009)开发了“samba”鼠系，在3周龄时听力受损，8周龄时耳聋。纯合的samba小鼠没有显示其他神经系统或前庭异常，杂合samba小鼠表现完全正常。纯合samba小鼠的立体细胞发育没有受到影响，但毛细胞功能受到干扰并且毛细胞最终退化。

Grillet等(2009)发现samba小鼠Loxhd1基因的突变，使PLAT结构域10的β-夹层结构不稳定。该突变不改变mRNA或蛋白质稳定性或Loxhd1蛋白沿着静纤毛长度的定位。但是，在出生后第21天，一些毛细胞显示出在顶端细胞表面出现融合的静纤毛和膜皱褶的形态缺陷。出生后第90天出现明显的退行性变化，包括毛细胞丧失和螺旋神经节神经元减少。Grillet等(2009)假设的螺旋神经节神经元的退化可能继发于毛细胞的功能和维持中的扰动。

表3中描述了已知会导致听力丧失的染色体18上的LOXHD1突变。

通过引用的方式整体并入本文的美国公开No.2013/0095071，描述了使用突变的酪氨酸腺相关病毒载体恢复与年龄相关的听力丧失的基因治疗方法，以递送X连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)至内耳的圆窗膜。但是，该公开没有考虑递送编码功能性TMPRSS3或LOXHD1的核酸序列以预防或延迟由TMPRSS3或LOXHD1基因的遗传突变引起的听力丧失或耳聋的发作或恢复，如本文所公开的。

此外，针对听力障碍用于开发临床基因疗法的现有技术中的一个重要缺陷是缺乏反映人类听力丧失的动物模型。许多可用于人类中成人发病的遗传性听力丧失的小鼠模型存在使得递送研究复杂化的先天性听力丧失。在听力形成之后很少有遗传性听力丧失发作的模型。新生小鼠中载体的递送导致与成年小鼠中的递送不同的转染模式(Shu,Tao,Li等,2016)。需要可以用于评估使用不同载体系统和基因靶标的听力挽救的新型动物模型。

目前还没有批准的用于预防或治疗听力丧失或耳聋的治疗方法，并且缺乏用于测试这种治疗的有效的临床前动物模型。本发明描述了组合物和方法，该组合物和方法用于将TMPRSS3或LOXHD1的病毒载体基因递送到内耳中以恢复突变的TMPRSS3或LOXHD1基因的活性，促进毛细胞存活和恢复患有听力丧失或耳聋的患者的听力，以及用于测试这些组合物和方法的基于细胞和基于动物的模型。

发明内容

本文公开了包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列的表达载体，或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列，其中核酸序列可操作地连接至启动子。本文还公开了用于治疗或预防听力丧失的方法中的药物组合物，该药物组合物包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列的表达载体，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列，其中核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，核酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，表达载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、辅助病毒依赖型腺病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是腺相关病毒载体，该腺相关病毒载体选自AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80。在一些实施方案中，腺相关病毒载体是AAV2或Anc80。在一些实施方案中，启动子选自任何毛细胞启动子，该毛细胞启动子驱动可操作连接的核酸在早期形成的表达并在整个生命过程中维持表达，例如，TMPRSS3启动子、人类巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、Myo7a启动子或Pou4f3启动子。

本文公开了具有表达载体的细胞，所述表达载体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列，其中核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，核酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞是诱导的多功能干细胞。

本文公开了用于治疗或预防听力丧失的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的表达载体，所述表达载体包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列，或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列，其中核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，核酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，表达载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、辅助病毒依赖型腺病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是腺相关病毒载体，该腺相关病毒载体选自AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80。在一些实施方案中，腺相关病毒载体是AAV2或Anc80。在一些实施方案中，启动子选自任何毛细胞启动子，该毛细胞启动子驱动可操作连接的核酸在早期形成的表达并在整个生命过程中维持表达，例如，TMPRSS3启动子、人类巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、Myo7a启动子或Pou4f3启动子。在一些实施方案中，将表达载体施用于受试者的内耳中，例如通过注射。在一些实施方案中，递送方法选自耳蜗造口术、圆窗膜、管道造口术或它们的任何组合(参见，Erin E.LearySwan，等(2008)Inner Ear Drug Delivery for Auditory Applications.Adv Drug DelivRev.60(15)：1583-1599)。在一些实施方案中，表达载体通过内淋巴囊递送到蜗管中(Colletti V，等(2010)Evidence of gadolinium distribution from theendolymphatic sac to the endolymphatic compartments of the human innerear.Audiol Neurootol.15(6):353-63；Marco Mandalà,MD,等.(2010)Inducedendolymphatic flow from the endolymphatic sac to the cochlea in Ménière'sdisease.Otolaryngology-Head and Neck Surgery.143,673-679；Yamasoba T,等(1999)Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in theendolymphatic sac.Hum Gene Ther.10(5):769-74)。在一些实施方案中，受试者具有一种或多种与听力丧失相关的遗传风险因子。在一些实施方案中，遗传风险因子之一是TMPRSS3基因中的突变。在一些实施方案中，TMPRSS3基因中的突变选自已知的引起听力丧失的任何一种或多种TMPRSS3突变(参见，例如，表2)。在一些实施方案中，遗传风险因子之一是LOXHD1基因中的突变。在一些实施方案中，LOXHD1基因中的突变选自已知的引起听力丧失的任何一种或多种LOXHD1突变(参见，例如，表3)。在一些实施方案中，受试者未表现出任何听力丧失的临床指标。

在一些实施方案中，本文所述的表达载体作为组合疗法与一种或多种包含其他核酸序列的表达载体和/或与一种或多种其他活性药剂一起施用治疗听力丧失。例如，组合疗法可以包括具有SEQ ID NO：1的核酸序列的第一表达载体和具有SEQ ID NO：2的核酸序列的第二表达载体，其中两种表达载体都被施用于受试者作为联合疗法的一部分以治疗听力丧失。

本文公开了具有突变的人类TMPRSS3基因的转基因小鼠，该突变选自已知的引起听力丧失的任何一种或多种TMPRSS3突变(参见，例如，表2)。本文公开了具有突变的人类LOXHD1基因的转基因小鼠，该突变选自已知的引起听力丧失的任何一种或多种LOXHD1突变(参见，例如，表3)。

附图说明

图1显示了编码野生型人类TMPRSS3的cDNA序列(GenBank登录号BC074847.2)；

图2显示了由图1中的cDNA编码的野生型人类TMPRSS3的氨基酸序列；

图3显示了编码野生型人类LOXHD1的cDNA序列(GenBank登录号AK057232.1)；

图4显示了由图3中的cDNA编码的野生型人类LOXHD1氨基酸序列；

图5显示成年小鼠耳蜗中的Tmprss3免疫组织化学(Fasquelle,L,Scot,H.S.,Lenoir,M,Wang,J.,Rebillard,G.,Gaboyard,S.,....Delprat,B.(2011).Tmprss3,atransmembrane serine protease deficient in human DFNB8/10deafness,is criticalfor cochlear hair cell survival at the onset of hearing.Journal of BiologicalChemistry,286(19),17383-17397)。

具体实施方式

在说明书结论的权利要求中特别指出并清楚地要求保护的内容被视为本发明的主题。结合附图，从本发明的以下详细描述中本发明的前述以及其它目标、特征和优点将变得明显。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括旨在实现临床结果所期望变化的各种活动。例如，如本文所用，术语“治疗(treat)”包括旨在实现或确实实现如本文所述的一种或多种听力丧失的临床指标或症状的可检测改善的任何活动。

由TMPRSS3突变或LOXHD1突变引起的听力丧失通常出现在两个群体中：(i)受试者出生时具有听力丧失的先天性群体和(ii)受试者在出生时没有可测量的听力丧失症状，但过了一段时间表现出进行性听力丧失的进行性群体。因此，在某些情况下，受试者可以具有TMPRSS3基因或LOXHD1基因的突变(例如，如在遗传诊断测试中检测到的)但尚未表现出听力丧失的临床指标或症状，因此在可以开始治疗性干预的期间提供窗口。因此，在一些实施方案中，本发明提供了在听力逐渐衰退期间进行治疗性干预的方法。可以在此时间段之前开始本发明的方法。本发明提供的治疗听力丧失的方法包括但不限于用于预防或延迟听力丧失的发作或听力丧失的临床指标或症状的进展。

如本文所使用的，术语“听力丧失”用于描述听到声音的能力降低，并且包括耳聋和完全不能听到声音。

如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所述的活性剂的量，其足以实现或有助于实现一种或多种期望的临床结果，例如在上面的“治疗”描述中所描述的那些。可以使用本领域已知的标准技术，例如剂量递增研究，确定任何个体病例中的合适的“有效”量。

如本文所用的术语“活性剂”是指分子(例如，本文所述的AAV载体)，其旨在用于本文所述的组合物和方法中，并且旨在是生物活性的，例如用于治疗听力丧失的目的。

如本文所用的术语“药物组合物”是指包含至少一种如本文所述的活性剂或两种或更多种活性剂的组合物，和一种或多种适合用于药物递送的其他组分，例如载体、稳定剂，稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂等。

本文可互换使用的术语“受试者”或“患者”包括哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)等。在本发明的一些实施方案中，受试者是人。

本发明可以基于对人或其他哺乳动物的研究来计算活性剂的剂量，以确定活性剂的功效和/或有效量。给药的剂量和频率或时间可以通过本领域已知的方法确定，并且可以取决于诸如活性剂的药物形式、给药途径、是否仅使用一种活性剂或多种活性剂(例如，当这种药剂与第二活性剂组合使用时，所需的第一活性剂的剂量可以更低)和患者特征，包括年龄、体重或存在影响药物代谢的任何医学条件的相关因素。

在一个实施方案中，可以施用单剂量。在另一个实施方案中，可以在一段时间内施用多剂量，例如，以指定的间隔施用，例如每天四次、每天两次、每天一次、每周一次、每月一次等。

听力丧失的临床特征。遗传性听力丧失和耳聋可以是传导性的、感觉神经性的，或两者的组合；综合征性的(伴有外耳或其他器官的畸形或涉及其他器官系统的医学问题)或非综合征性的(没有伴有明显的外耳异常或任何相关的医学问题)；语前(语言发展前)的或语后(语言发展后)的(Richard JH Smith,MD等(2104)Deafness and Hereditary HearingLoss Overview,GeneReviews)。

诊断/检测。必须将遗传型听力丧失与听力丧失的后天(非遗传性)原因区分开来。遗传型听力丧失通过耳科学的、听力学的和身体的检查、家族史、辅助测试(例如，颞骨的CT检查)和分子遗传学测试诊断。分子遗传学测试可能在多种类型的综合征性和非综合征性耳聋的诊断和遗传咨询中发挥重要作用。

用于检测听力丧失的选择测试：

1.畸变产物耳声发射(DPOAE)。畸变产物耳声发射(DPOAE)是指当被两个频比在1.1和1.3之间的纯音频率同时刺激耳蜗时产生的反应。最近关于DPOAE产生机制的研究强调了两个DPOAE响应中存在的重要组成部分，一个是由互调“畸变”产生的，一个是由“反射”产生的。

正常成年人耳中DPOAE的发生率为100％。来自左耳和右耳的响应通常是相关的(即，它们非常相似)。对于正常受试者，女性具有更高的DPOAE幅度。时效过程(Agingprocesses)通过降低DPOAE幅度和缩小DPOAE响应频谱(即较高频率的响应逐渐减小)对DPOAE响应产生影响。也可以利用临床研究中所使用的其他动物物种记录DPOAE，例如蜥蜴、小鼠、大鼠、豚鼠、灰鼠、鸡、狗和猴子。(耳声发射网站(Otoacoustic EmissionsWebsite))。

2.听力脑干反应(ABR)。听力脑干反应(ABR)测试提供关于内耳(耳蜗)和听力大脑通路的信息。该测试有时也被称为听力诱发电位(AEP)。所述测试可以用于检测儿童或其他对听力筛查的常规行为方法有困难时期的人。ABR也适用于表明大脑或大脑通路中某种听力丧失的有征兆、症状或疾病的人。所述测试用于人类和动物。ABR通过粘贴在头部上的电极来执行-类似于在心电图运行时放置在心脏周围的电极-记录响应声音的脑电波活动。在受测试的人安静地休息或睡觉时进行测试。没有响应是必要的。ABR也可用作新生儿听力筛查项目的筛查测试。当用作筛查测试时，仅检查一个强度或响度级别，婴儿通过或没有通过筛查。(美国语言听力协会网站(American Speech-Language-Hearing AssociationWebsite))。

听力丧失的临床表现。描述了听力丧失的类型和发病：

类型

·传导性听力丧失是由外耳和/或中耳小骨的异常引起的。

·感觉神经性听力丧失是由内耳结构(即耳蜗)的功能障碍引起的。

·混合性听力丧失是传导性和感觉神经性听力丧失的组合。

·中枢听觉功能障碍是由第八脑神经、听觉脑干或大脑皮层水平的损伤或功能障碍引起的。

发病

·语前听力丧失存在于语言发展前。所有先天性(出生时存在)听力丧失都是语前的，但并非所有的语前听力丧失都是先天性的。

·语后听力丧失发生在正常语言发展之后。

(Richard JH Smith,MD,等；Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview；GeneReviews；最初发布：1999年2月14日；最后修订：2014年1月9日)

听力丧失的严重程度。听力以分贝(dB)测量。每个频率的阈值或0dB标志是指正常年轻人在50％的时间内感知到音调突发的水平。如果一个人的阈值在正常阈值的15dB范围内，则听力被认为是正常的。听力丧失的严重程度如表4所示。

听力损伤百分比。为了计算听力损伤百分比，从500Hz、1000Hz、2000Hz、3000Hz的纯音平均值中减去25dB。结果乘以1.5以获得耳朵的特定水平。通过将较好的耳朵加权为较差耳朵的五倍来确定损伤(参见表5)。由于说话语音约为50-60dB HL(听力水平)，因此基于纯音平均值计算功能损伤可能是误导性的。例如，45-dB的听力丧失在功能上远远超过30％的意义。不同的等级量表适用于幼儿，即使有限的听力丧失也对语言发展有很大的影响[Northern&Downs 2002]。

听力丧失的频率。听力丧失的频率指定为：

·低(<500Hz)

·中(501-2000Hz)

·高(>2000Hz)

基因治疗。基因治疗是指将DNA引入患者体内以治疗遗传性疾病。新DNA通常含有功能基因以纠正现有基因中致病突变的影响。用于实验或治疗目的的基因转移依赖于载体或载体系统以将遗传信息转运到靶细胞中。载体或载体系统被认为是基因转移反应的效率、特异性、宿主反应、药理学和寿命的主要决定因素。目前，实现基因转移的最有效和最高效的方法是通过使用基于已经产生复制缺陷的病毒的载体或载体系统(PCT公开号WO2015/054653；Methods of Predicting Ancestral Virus Sequences and UsesThereof)。

载体。迄今为止，腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、逆转录病毒、辅助病毒依赖型腺病毒和慢病毒都已经测试了耳蜗基因递送性。其中，最具潜力的是腺相关病毒(AAV)：它是非复制的，可以有效地将转基因转移到内耳，并且不会引起耳毒性。特别地，AAV可以有效地转染内毛细胞，如果人们希望通过毛细胞特异性突变来纠正遗传缺陷，这是关键特征。迄今为止，已经成功地使用了许多不同AAV亚型用于耳蜗基因递送，证明对柯蒂氏器(organ of Corti)几乎没有任何损伤。最近研究AAV血清型1、2、5、6和8的报告证明了在毛细胞、支持细胞、听觉神经和螺旋韧带中的成功基因表达，毛细胞是最有效的转导(Lawrence R.Lustig,MD and Omar Akil,PhD(2012)Cochlear Gene Therapy.Curr OpinNeurol.25(1):57-60)。美国专利申请号2013/0095071进一步描述了可以施用于内耳的AAV载体的实例，其通过引用的方式整体并入本文。

可以被校正的靶基因的大小受限于AAV的携带能力(Wu，Yang，&Colosi，2010)。出于翻译的目的，这限制了对那些遗传性障碍的潜在靶标，该遗传性障碍是由相对较小的基因(<4.6kB)引起的隐性听力丧失。作为开发基因治疗药物的初始方法，靶基因突变应该是相对常见的，并且在语言发展之后发生听力丧失。匹配这些特征，识别患有进行性听力丧失的患者，为他们的进行性丧失提供干预和停止或可能逆转的机会。内耳基因治疗试验已经在后天性耳聋的人中开始，因此许多安全性和递送问题正在得到解决(临床试验标识号NCT02132130)。基因检测可用性和准确性的提高将实现对从这些类型的干预措施中受益的患者的识别(Preciado等，2005)。

基因治疗的小鼠模型：通过基因治疗已经救治了一些不同隐性遗传性耳聋的小鼠模型。例子包括矫正VGLUT3、TLC1、旋转蛋白、clarin 1突变所引起的听力丧失(Akil等，2012；Askew等，2015；Chien等，2016；Geng等，2017；Isgrig等，2017)。所有这些模型都需要在听力成熟和内耳毛细胞退化之前将载体递送到新生小鼠内耳中。这表明，为了使用影响基因治疗策略救治听力，目标障碍在人类中应该至少是缓慢进展的，实现在听力丧失和靶细胞退化之前完成递送治疗。

TMPRSS3突变诱发听力丧失：与TMPRSS3(DFNA8/10)突变相关的听力丧失可以存在于多种不同的表型中。已经描述了先天性深度听力丧失以及成人发作进行性听力丧失(Weegerink等,2011)。目前，Tmprss3功能障碍的机制尚不清楚。已经开发了两种小鼠模型，以确定出生时的听力丧失，另一种是在稍晚的时间点但仍然在听力和小鼠成熟之前发作听力丧失。Fasquelle等人研究出了乙基-亚硝基脲诱导的突变小鼠，该小鼠在Tmprss3中携带蛋白质截短的无义突变。这证明了在出生后第12天(大约听力成熟时)的毛细胞损失和听力退化。另外，囊状毛细胞受到影响，并且观察到螺旋神经节细胞的延迟退化(Fasquelle等，2011)。从小鼠模型不清楚螺旋神经节的退化是否与柯蒂氏器退化或螺旋神经节中Tmprss3的功能障碍有关。大量研究已经评估了Tmprrss3在小鼠内耳中的分布，并且很大程度上证明了Tmprss3在毛细胞和螺旋神经节细胞中的存在(Fan,Zhu,Li,Ji,&Wang,2014；Fasquelle等,2011)。使用抗体抗-TMPRSS3(1：100,ab167160,Abcam,Cambridge,MA)的1个月大的C57B15小鼠中检测到小鼠Tmprss3的表达。在内毛细胞和外毛细胞，血管纹和约50％的螺旋神经节细胞中观察到标记(图5)。这表明Tmprss3功能的丧失可以额外导致脊柱功能的丧失，尽管在Fasquelle小鼠模型中没有观察到内耳蜗的潜在变化(Fasquelle等，2011)。

Tmprss3基因型-表型研究表明了多种不同类型的听力丧失，从重度的先天性到成人的发作进行性听力丧失(Chung等，2014；Gao等，2017；Weegerink等，2011)。研究表明，由于Tmprss3突变所引起的听力丧失可能占成人人工耳蜗植入患者的2至5％(Jolly等，2012；Miyagawa，Nishio,&Usami,2016；Sloan-Heggen等,2016)。许多具有这些突变的患者具有明显的残余听力。这将使其成为潜在救治治疗的具有吸引力的目标，因为其将会有可以被治疗的细胞的底物。关于对突变患者进行人工耳蜗植入的成功性存在一些分歧的研究。相比于其他类型的遗传性耳聋，至少某些类型的由Tmprss3丧失引起的听力丧失可能不适合进行人工耳蜗植入(Shearer等,2017)。这可能与这种基因可以在毛细胞和高达50％的螺旋神经节细胞中表达有关(参见图5)。选择载体系统递送时需要考虑这些差异。载体将通过用强毛细胞嗜性和结合毛细胞和螺旋神经节细胞嗜性进行测试。新生儿和成人的内耳递送也表现出载体嗜性的差异(Shu,Tao,Li等,2016；Shu,Tao,Wang,等,2016a)。由于目标临床群体是具有成熟听力系统的人类，因此本文公开了小鼠模型，该小鼠在听力成熟后具有听力丧失的发作，所述模型可以用作疾病进展模型(参见实施例1)和对成人耳蜗救治治疗的递送模型(参见实施例2)。

用于递送至内耳的AAV血清型：已经证明了多种不同的用于转染内耳组织的AAV血清型(等,2017；Shu,Tao,Wang,等,2016b；Xia,Yin,&Wang,2012)。载体递送转基因的分布在新生儿和成年动物中存在明显不同，此外，在评估毛细胞转染时，外淋巴与内淋巴的递送存在差异(Kilpatrick等，2011；Wang等，2013)。在小鼠模型中，将载体递送至内淋巴会得到毛细胞转染的改善，但会使残余的听力丧失，这使得该方法难以模拟进行性听力丧失。可能地，在较大的动物或在人类中，载体可以被递送到内淋巴囊中而不会引起听力丧失，从而提高转染效率(Colletti等，2010)。出于计划研究的目的，递送到外淋巴将可以实现小鼠听力的评估。已显示AAV2向成年动物的毛细胞和螺旋神经节细胞的递送(Tao等，2017)。AAV2的另一个优点是它已经在人类基因治疗临床试验中保留了广泛记录和安全数据(Santiago-Ortiz&Schaffer，2016)。最近，各种研究表明，合成AAV(AAV2/Anc80)可以改善向毛细胞的递送，但可能无法实现与天然AAV2相当的螺旋神经节递送(Landegger等，2017；Suzuki，Hashimoto，Xiao，Vandenberghe，&Liberman，2017)。本发明提供了具有成人发作性听力丧失的小鼠模型，并比较AAV2或AAV2/Anc80的Tmprss3基因治疗是否能更好地救治听力和螺旋神经节的功能。

诱导多能干细胞(iPSC)。诱导多能干细胞(IPS或IPSC)是指产生自成人细胞如皮肤、肝脏、胃或其他成熟细胞的干细胞，通过引入可以重新编码细胞的基因，将其转化为具有胚胎干细胞所有特征的细胞。术语多能意味着细胞可以产生多种类型细胞的能力，包括形成身体器官、神经系统、皮肤、肌肉和骨骼的所有三种胚胎谱系。

CRISPR/Cas9基因编辑。本文描述的方法还考虑使用CRISPR/Cas9基因组编辑，通过编辑TMPRSS3或LOXHD1基因的突变来救治听力。该技术已用于两种遗传性听力丧失小鼠模型(Tmcl和Pmca2)中，并成功救治了听力(Askew,C等(2015)Tmc gene therapy restoresauditory function in deaf mice.Sci Transl Med.7(295):295ral08)。虽然该技术主要用于针对显性听力丧失，但它可以用于针对Tmprss3敲入小鼠模型中的隐性听力丧失从而恢复听力，并最终用于由TMPRSS3基因或LOXHD1基因突变所引起的听力丧失。在PCT公开号WO2016/069910、PCT公开号WO2015/048577和美国申请公开号2015/0291966中进一步描述了使用CRISPR/Cas9基因编辑来修复缺陷基因序列，它们每个都通过引用的方式整体并入本文。

实施例

实施例1-TMPRSS3突变的小鼠模型，其反映在患者中可见的出生后发作的进行性听力丧失

在小鼠中用CRISPR/Cas9系统靶向人类TMPRSS3[c.916G>A(p.AIa306Thr)]突变的突变：现有的小鼠模型完全敲除了TMPRSS3基因，该基因导致先天性听力丧失或出生后第12天听力发作时的毛细胞退化(Fasquelle等，2011)。该实施例描述了敲入人类TMPRSS3突变基因小鼠的生长进程。TMPRSS3中的c.916G>A(p.Ala306Thr)是在中国、德国、荷兰和韩国的不同种族的超过10个家族的耳聋患者中发现的最常见突变，表明该突变是DFNB8/DFNB10表型的主要原因(Chung等,2014；Elbracht等,2007；Gao等,2017；Weegerink等,2011)。如Harms等人先前研究中详细描述的CRISPR/Cas9技术将产生携带人类突变的小鼠模型(Harms等，2014)。简言之，引导RNA(gRNA)设计工具用于为感兴趣的基因和突变选择合适的gRNA，将选择具有最小预测的脱靶基因组位点编辑的gRNA，并由服务提供商合成，以及用于扩增感兴趣的基因组基因座和其他预测的脱靶基因组位点的引物。

一旦建立，将对小鼠进行基因分型，并使用ABR和DPOAE评估2周龄、4周龄和12周龄的听力丧失。随着听力丧失的延迟，ABR和DPOAE测试的比较可以证明Tmprss3功能的减少与否不对称地影响毛细胞或螺旋神经节功能。考虑到Shearer等人的观察，这将影响到用于临床开发的载体的选择(Shearer等，2017)。尽管不是人类中主要的表型，但小鼠的突变体已显示出囊状毛细胞的轻微退化。前庭系统和旋转棒测试的组织学评估将用于筛选平衡功能障碍。通过定量RT PCR确定突变体Tmprss3在耳蜗中的表达。将分析野生型小鼠和纯合子Tmprss3 c.916G>A的结果。将出生后3天和2周龄、4周龄和12周龄的耳蜗进行组织学和免疫组织化学分析以鉴定毛细胞损失的模式。基于组织学数据，将选择选定的时间点用于毛发细胞存活的整体分析，以确定是否存在毛细胞存活的基点到顶端的梯度。如果是指示的样本，也可以通过扫描电子显微镜进行评估，以评估立体纤毛束形态。将通过第7版的Graphpad Prism使用ANOVA进行重复测量对数据进行统计分析。每个时间点受评估的动物使用n＝10个突变体，n＝3个对照。

建立由[c.916G>A(p.Aia306Thr)]引起的听力丧失的时间过程将列出进行救治研究的时间点。如果成功，还将决定后期临床前安全性研究的时间过程。

如果靶向突变导致小鼠完全先天性听力丧失，则可以对小鼠设计诱导型敲除。由于人类表现出非常多变的表型，这也可以在小鼠中观察到，这使得统计分析变得困难。在救治实验中，可以使用对侧未被治疗的耳朵作为对照。或者，可以在人类iPSC模型中评估Tmprss3的作用(如实施例4中所述)。听力丧失的进展也可能发生延迟，在这种情况下，实验观察期将延长至6个月。

实施例2-评估通过TMPRSS3基因治疗是否可以将小鼠模型的听力丧失阻止或反转

已经提出了将基因递送到内耳的一系列载体。对于较小基因的长期递送，已经广泛研究了AAV载体并且证明是安全的以及可以递送至多种细胞。但是，即使是较高滴度的载体，AAV向外毛细胞的递送也表现出是不完整的。最近开发了一种合成的腺相关病毒载体AAV2/Anc80，其提供向内毛细胞和外毛细胞良好的递送。将测试两种不同的载体系统，一种基于Tmprss3功能在救治螺旋神经节中也是被需要的潜力。将在小鼠模型中使用这两种载体系统进行听力救治的比较。可能的结果包括使用AAV2/Anc80救治具有不良ABR的DPOAE，这表明除了毛细胞之外还需要治疗螺旋神经节。简而言之，基于实施例1的结果，在记录听力丧失发作前一至两周，载体将被送至后半规管进行管道造口术。使用微型泵注射对数倍差异的三种不同浓度的载体。根据实施例1中确定的时间点，动物的听力将用连续的ABR和DPOAE进行测试。在3至6个月龄的动物，将通过组织学、免疫组织化学和耳蜗的整体评估方法来评估毛细胞存活情况。对照将仅是用GFP表达载体处理的动物(AAV2.hCMV.GFP或AAV2/Anc80.hCMV.GFP)。如果老鼠另外证明具有任何前庭性的，他们也将通过前庭系统组织学和旋转棒测试进行评估。另外，Tmprss3治疗的毒性将通过用表达Tmprss3的两种载体转染野生型小鼠进行评估。将通过第7版的Graphpad Prism使用ANOVA进行重复测量对数据进行统计分析。将根据每个载体滴度的听力评估结果。每个时间点(2个载体，3个载体浓度；组织学和整体评估)受评估的动物使用n＝60个突变体，n＝3个对照。过表达研究将使用具有2种载体的n＝5只动物。

Tmprss3基因治疗有望阻止听力丧失的进展。在救治听力以及剂量效应的不同载体中可能存在差异。

如果发现听力救治不完整，可以设计不同的载体。可能需要通过使用不同强度的启动子或包括Tmprss3的调节区来优化Tmprss3的潜在表达。可能必须在非常早的时间点进行内耳的Tmprss3基因治疗。

评估AAV2 TMPRSS3递送系统：将由人类CMV(hCMV)启动子驱动的人类TMPRSS3(BC074847)基因克隆到AAV2载体系统中。通过氯化铯梯度纯化载体。通过pPCR(1.1×10¹³GC/ml)测定滴度。合成和纯化后，将载体以20μl的体积进行等分，在-80℃下，5％甘油中的PBS中储存。

开发用于TMPRSS3递送的测定系统：为了评估载体功能的效率，我们想要开发用于测定TMPSS3产品的系统。这也将用于后续评估具有不同启动子的载体设计以及载体的稳定性。使用不同的AAV血清型确实使细胞系在转染效率方面存在差异(Ellis等，2013)。根据与AAV2的转染能力对各种细胞系进行筛选。不幸的是，许多可用的常用的与AAV2转染的细胞系表达天然的TMPRSS3。筛选了多种人类癌细胞系，其已通过RNAseq证实不表达TMPRSS3。发现了原代少年鼻咽血管纤维瘤(JNA)细胞可以用于AAV2hcmv.gfp的转染。将细胞接种于补充有DMEM和10％热灭活的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的T-75烧瓶中，同时保持在37℃和5％CO₂中。培养液每48小时更换一次。当细胞达到P4并且有90-100％的汇合时，加入3ml 0.05％胰蛋白酶洗涤，吸出然后加入3ml胰蛋白酶以除去细胞。37℃孵育3-5分钟。用10％FBS/DMEM中和胰蛋白酶。将细胞溶液收集在15ml的锥形瓶中，在4度下，1200rpm旋转5分钟。然后将细胞悬浮于10ml 10％FBS/DMEM中并划板，贴壁生长24小时。通过将细胞接种至4孔室Millicell EZ载玻片(PEZGS0416，MilliporeSigma，Burlington，MA)上并在在500μL培养液加入浓度为2μl/ml的AAV2.hcmv.TMPRSS3的条件下进行细胞培养来进行AAV2-TMPRSS3的转导。24小时后更换细胞培养液，然后在转染后的每48小时更换细胞培养液直至将细胞进行分析。

AAV2-TMPRSS3转染细胞的免疫细胞化学：先用PBS洗涤转染的JNA细胞，然后在室温下，用4％的多聚甲醛PBS溶液固定10分钟。在室温下，将细胞用1％Triton-X100/1％牛血清白蛋白/10％正常血清阻滞和透化1小时。一抗(1：100，ab167160，Abcam，Cambridge，MA/1：50，GTX81644，GeneTex，Irvine，CA)在4℃温育过夜。第二天，用PBS冲洗细胞，然后用Alexa Fluor 488(1：500，Invitrogen，Carlsbad，CA)标记。用PBS进一步洗涤这些细胞，然后使用ProLong Gold抗褪色封固剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)和0.2μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行染色。

AAV/Anc80-TMPRSS3-IRES-GFP的构建。我们将人类TMPRSS3全长cDNA克隆到AAV/Anc80载体中，并用eGFP进行标记，因此可以通过GFP的表达追踪被病毒感染的细胞。我们已经获得了具有人类TMPRSS3的全长cDNA，并验证了序列。我们将使用AAV/Anc80载体进行克隆。在此之前，将人类ISL1基因克隆到同一个载体中，并分别通过耳蜗造口术和管道造口术将AAV/Anc80-ISL1-IRES-GFP注射到新生的和成年小鼠内耳中。AAV/Anc80有效地介导基因递送到新生儿和成人毛细胞中，而不引起毛细胞损伤或听力丧失。随着时间的推移，转基因进一步维持表达，这对于我们的目标是理想的，即在Tmprss3^-/-毛细胞中表达TMPRSS3基因促进恢复基因表达从而恢复听力(Shu等，2016；Tao等，2017)。

在将TMPRSS3克隆到AAV/Anc80-TMPRSS3-IRES-GFP载体中后，为了达到10¹²的病毒滴度，载体将被扩增和包装。我们将首次通过感染人类细胞来测试AAV/Anc80-TMPRSS3-IRES-GFP病毒。我们将用抗TMPRSS3抗体进行免疫标记并将其与GFP共定位，以检查TMPRSS3和GFP是否在同一细胞中表达。对于体内研究，我们将分别通过耳蜗造口术将载体注入野生型新生小鼠内耳中，通过管道造口术将载体注入成年小鼠内耳中来对载体进行测试。注射后两周，收获小鼠耳蜗以检查GFP信号是否集中于毛细胞。在我们之前的研究中，我们在100％内毛细胞中观察到GFP的大量表达，在95％以上的外毛细胞中观察到适量表达。因此，我们期望观察到与TMPRSS3基因相似的表达模式。

随后通过耳蜗造口术将AAV/Anc80-TMPRSS3-GFP注射到Tmprss3^-/-耳蜗中，一个月后进行听力研究。与未被注射的对照内耳相比，我们期望被注射的内耳具有更好的听力。如果Tmprss3^-/-小鼠患有严重的早发性听力丧失，效果将是显而易见的。如果Tmprss3^-/-中的听力丧失是进行性的延迟发作，我们可能会进行后期的听力救治，例如在2个月和3个月时。通过ABR和DPOAE进行听力研究。如果ABR和DPOAE在注射的耳朵中任何频率下的阈值都显显著降低，这就是Tmprss3^-/-小鼠中的AAV介导的听力救治标记物。我们将追踪听力救治的6个月的进展情况，以确定听力恢复是否是一直持续的。

在Tmprss3^-/-小鼠中，毛细胞最终将会死亡。通过AAV介导的基因递送，毛细胞功能的恢复可能会导致毛细胞随着时间的推移而存活，随着时间的推移毛细胞沿着耳蜗的长度生长将证实这一点。相比于未被注射的对照耳蜗，我们期望看到被注射的耳蜗中的毛细胞明显更多。根据听力结果和细胞存活的比较来确定用于救治治疗的最佳载体和最佳剂量。

实施例3-TMPRSS3

TMPRSS3突变小鼠模型的开发。尽可能接近地模拟人类病症的小鼠模型的开发是未来治疗的关键。敲除Tmprss3小鼠模型可从商业供应商获得并可用于这些实施例所描述的实验中，但是，如上所述，开发具有已知导致听力丧失的人类突变基因的小鼠模型将更具相关性。我们期望看到该模型可以显示在小鼠中人类的突变基因所引起的听力丧失机制与在人体内是相同的，这样对该模型用于治疗的研究才具有价值。产生转基因小鼠系的方法是本领域技术人员已知的在本领域所使用的常规方法。重要的是，通过CRISPR/Cas9技术的使用，产生小鼠模型的时间已大大缩短，从几年前的平均2年到现在的几个月。因此，生产小鼠模型所花费的时间不再是限制因素。在我们的研究中，我们提倡创建携带人类突变基因的TMPRSS3小鼠模型。在TMPRSS3敲除的小鼠中，小鼠的毛细胞死亡并且表现出严重的听力丧失。在创建Tmprss3敲入小鼠模型后，我们通过ABR和DPOAE的方法研究毛细胞的存活和听力丧失情况。如果小鼠模型表现出毛细胞损失的进行性听力丧失，则证明我们已经为人类的DFNB8开发出了Tmprss3小鼠模型。

生产用于基因治疗的AAV-TMPRSS3。我们将使用AAV介导的基因治疗来治疗Tmprss3突变小鼠。在该研究中，我们已经鉴定出了两种AAV载体(Anc80和AAV2)，但也可以测试其他表达载体，例如腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、辅助依赖性腺病毒载体、慢病毒载体或其他腺相关病毒载体，例如AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrhl0、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。Anc80和AAV2均具有将基因传递到哺乳动物新生儿毛细胞中的高效率，并且对正常听力没有不利的影响。此外，最近显示两者均可用于将基因递送到成年小鼠毛细胞中而不影响正常听力(Zinn,E.等,In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yieldsa Potent Gene Therapy Vector,Cell Rep.2015Aug 11；12(6):1056-68；和Askew,C.等,Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice,Sci TranslMed.2015Jul 8；7(295):295ra108)。我们将人类TMPRSS3 cDNA克隆到载体中产生AAV-TMPRSS3病毒。我们将进行研究以显示TMPRSS3是使用体外培养系统产生的。确认后，将AAV-TMPRSS3注射到新生野生型小鼠内耳中，通过内耳细胞分析和听力研究(ABR和DPOAE)显示它没有副作用。

AAV-TMPRSS3在听力恢复中的研究。我们将AAV-TMPRSS3注入新生Tmprss3敲入突变小鼠的内耳。对被注射的和注射AAV-GFP的对照小鼠进行包括听力测试、细胞和分子研究以及长期效果的分析。在细胞水平，我们将确定AAV-TMPRSS3是否在一个月龄时促进毛细胞存活。在注射AAV-GFP的对照突变体耳中，我们期望在此时间点看到毛细胞的损失。相反，我们期望看到AAV-TMPRSS3注射组毛细胞存活。我们将优化注射程序(耳蜗造口术、圆窗膜、管道造口术)和剂量，以实现更好听力恢复。重要的是，我们将在成年(1-6个月大)小鼠中进行注射并评估听力恢复。将成年注射结果与新生儿结果进行比较，将会告诉我们干预仍然有效的时间窗口。

实施例4-从患者诱导的多能干细胞(iPS)所产生的毛细胞的研究

该研究的一个重要方面是证明我们的策略适用于人类毛细胞。由于没有人类的颞骨可用于该研究，我们将使用患者的成纤维细胞以及对照家族成员的成纤维细胞来建立患者iPS细胞系。将最具频繁突变的患者身上收获成纤维细胞，并将建立iPS细胞系。iPS细胞系将分化为包括毛细胞的内耳细胞。使用培养系统，用AAV-TMPRSS3侵染源自iPS的毛细胞。通过片状钳夹研究感染的毛细胞的存活和毛细胞转导。相比于未被感染和未处理的对照毛细胞，我们期望看到毛细胞的存活和功能有所改善。该研究将实现对人类毛细胞中AAV-TMPRSS3感染效率和TMPRSS3基因表达情况的评估。这一成就证明了有缺陷的人类毛细胞可以通过AAV-TMPRSS3进行治疗，这使其成为未来临床研究的重要进展。

实施例5-LOXHD1

开发LOXHD1-突变小鼠模型。尽可能接近地模拟人类病症的小鼠模型的开发是未来治疗的关键。如上所述，敲除LOXHD1小鼠模型与开发已知的导致听力丧失的人类突变模型相关。我们期望看到该模型可以显示在小鼠中人类的突变基因所引起的听力丧失机制与在人体内是相同的，这样对该模型用于治疗的研究才具有价值。产生转基因小鼠系的方法是本领域技术人员已知的在本领域所使用的常规方法。重要的是，通过CRISPR/Cas9技术的使用，产生小鼠模型的时间已大大缩短，从几年前的平均2年到近日的几个月。因此，生产小鼠模型所花费的时间不再是限制因素。在我们的研究中，我们提倡创建携带人类突变基因的LOXHD1小鼠模型。在LOXHD1敲除的小鼠中，小鼠的毛细胞死亡并且表现出严重的听力丧失。在创建LOXHD1敲入小鼠模型后，我们通过ABR和DPOAE的方法研究毛细胞的存活和听力丧失情况。如果小鼠模型表现出毛细胞损失的进行性听力丧失，则证明我们已经为人类的DFNB77开发出了LOXHD1小鼠模型。

生产用于基因治疗的AAV-LOXHD1。我们将使用AAV介导的基因治疗来治疗LOXHD1突变小鼠。在该研究中，我们已经鉴定出了两种AAV载体(Anc80和AAV2)，但也可以测试其他表达载体，例如腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、辅助依赖性腺病毒载体、慢病毒载体或其他腺相关病毒载体，例如AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。Anc80和AAV2均具有将基因传递到哺乳动物新生儿毛细胞中的高效率，并且对正常听力没有不利的影响。此外，最近显示两者均可用于将基因递送到成年小鼠毛细胞中而不影响正常听力(Zinn,E.等,(2015)In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary LineageYields a Potent Gene Therapy Vector,Cell Rep.11；12(6):1056-68；和Askew,C.等,(2015)Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice,Sci TranslMed.7(295):295ra108)。我们将人类LOXHD1 cDNA克隆到载体中产生AAV-LOXHD1病毒。我们将进行研究以显示LOXHD1是使用体外培养系统产生的。证实之后，将AAV-LOXHD1注射到新生野生型小鼠内耳中，通过内耳细胞分析和听力研究(ABR和DPOAE)显示它没有副作用。

AAV-LOXHD1在听力恢复中的研究。我们将AAV-LOXHD1注入新生LOXHD1敲入突变小鼠的内耳。对被注射的和注射AAV-GFP的对照小鼠进行包括听力测试、细胞和分子研究以及长期效果的分析。在细胞水平，我们将确定AAV-LOXHD1是否在一个月龄时促进毛细胞存活。在注射AAV-GFP的对照突变体耳中，我们期望在此时间点看到毛细胞的损失。相反，我们期望看到AAV-LOXHD1注射组毛细胞存活。我们将优化注射程序(耳蜗造口术、圆窗膜、管道造口术)和剂量，以实现更好听力恢复。重要的是，我们将在成年(1-6个月大)小鼠中进行注射并评估听力恢复。将成年注射结果与新生儿结果进行比较，将会告诉我们干预仍然有效的时间窗口。

通过患者诱导的多能干细胞(iPS)所产生的毛细胞研究。该研究的一个重要方面是证明我们的策略适用于人类毛细胞。由于没有人类的颞骨可用于该研究，我们将使用患者的成纤维细胞以及对照家族成员的成纤维细胞来建立患者iPS细胞系。将最具频繁突变的患者身上收获成纤维细胞，并将建立iPS细胞系。iPS细胞系将分化为包括毛细胞的内耳细胞。使用培养系统，用AAV-LOXHD1侵染源自iPS的毛细胞。通过片状钳夹研究感染毛细胞的存活和毛细胞转导。相比于未被感染和未处理的对照毛细胞，我们期望看到毛细胞的存活和功能有所改善。该研究将实现对人类毛细胞中AAV-LOXHD1感染效率和LOXHD1基因表达情况的评估。这一成就证明了有缺陷的人类毛细胞可以通过AAV-LOXHD1进行治疗，这使其成为未来临床研究的重要进展。

实施例6-示例性方法

ABR测量：使用智能听力系统智能EP程序(IHS，迈阿密，FL，美国)记录ABR阈值。如上所述将动物麻醉并在加热垫(37℃)上保温。针电极放置在顶点(+)，左耳后面(-)和另一个耳朵(地面)后面。使用高频换能器，音频突发以4、8、16和32kHz呈现，持续时间为500μs。使用总增益值为100K，设置100Hz和15kHz的高通和低通滤波器进行记录。在90dB SPL时至少扫描128次。SPL减少10dB步长。在阈值水平附近，在每个频率上执行使用多达1024个的5dB SPL步长。阈值定义为SPL，在该SPL处，可以在2次或更多次重复记录中识别至少一个波。在第一次手术前测量术前阈值，并在处死动物前测量最终术后阈值。我们在每次载体递送之前和最终载体递送后的第三天对小鼠进行测试。

DPOAE测量：为了评估OHC的功能损伤，使用上述IHS程序在两侧记录畸变产物耳声发射(DPOAE)和输入/输出功能(I/O功能)。使用IHS高频换能器测量畸变产物的2kHz至32kHz的纯音。将Etymotic 10B+探针插入外耳道。LI水平设置为65dB L2水平设置为55dB。使用以F2-F1比率1.22扫描16次获得频率。I/O功能以16kHz的频率获取。以5dB步长，从65dBSPL到31dB SPL设置九个刺激水平。在每次载体递送之前和最终载体递送后的第三天对小鼠进行测试。

将表达AAV的TMPRSS3递送至内耳：所有程序均由相应的动物保护和使用委员会审查和批准。用i.p.注射氯胺酮(150mg/kg)、利多卡因(6mg/kg)和乙酰丙嗪(2mg/kg)在0.9％氯化钠中的混合液以麻醉成年小鼠。将载体递送至后半规管。制作背侧耳后切口，暴露后侧或外侧半规管。使用微钻，创建了一个管道造口术，暴露外淋巴部位。随后使用具有0.1μl刻度的Hamilton微量注射器和36号针头注入0.5μl载体。用骨蜡密封管道造口术，使动物恢复。

旋转棒(RR)训练和小鼠测试方案：将小鼠放在RR旋转棒(ENV-575M，MedAssociated Inc.，乔治亚洲，美国)上进行训练，一次一只，程序初始化转速为4-40rpm。当鼠标在第一个插槽中下降/跳跃/停止并旋转时，它们被拾取并放入连续的插槽中，不停止程序。治疗后，将小鼠置于RR上，每个槽中一只小鼠，启动程序。当鼠标脱落时，拾起小鼠并放置在动物房单元中等待其他小鼠完成该程序。

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已经描述了本发明的一个或多个实施方案。然而，应该理解，在不违背本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他相关实施方案在以下权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种表达载体，其包含：

核酸序列，该核酸序列选自由SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列、SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列组成的组；和

可操作地连接至核酸序列的启动子。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其中所述腺相关病毒载体选自由AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80组成的组。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述启动子选自由TMPRSS3启动子、Myo7a启动子、人类巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和Pou4f3启动子组成的组。

5.一种用于治疗或预防听力丧失的方法的药物组合物，所述药物组合物包含表达载体，该表达载体包含核酸序列，该核酸序列选自由SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列、SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列组成的组；和可操作地连接至核酸序列的启动子。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述表达载体是腺相关病毒载体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述腺相关病毒载体选自由AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80组成的组。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述启动子选自：TMPRSS3启动子、Myo7a启动子、人类巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和Pou4f3启动子组成的组。

9.一种用表达载体转染的细胞，该表达载体包含核酸序列，该核酸序列选自由SEQ IDNO:1、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列、SEQ ID NO:3或与SEQID NO:3的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列组成的组；和可操作地连接至核酸序列的启动子。

10.根据权利要求9所述的细胞，其中所述表达载体是腺相关病毒载体。

11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述腺相关病毒载体选自由AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80。

12.根据权利要求9所述的细胞，其中所述启动子选自由TMPRSS3启动子、Myo7a启动子、人类巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和Pou4f3启动子组成的组。

13.根据权利要求9所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。

14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述干细胞是诱导的多能干细胞。

15.一种治疗或预防听力丧失的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的表达载体，该表达载体包含核酸序列，该核酸序列选自由SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列、SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3的核酸具有至少90％序列同一性的核酸序列组成的组；和可操作地连接至核酸序列的启动子。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述表达载体是腺相关病毒载体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述腺相关病毒载体选自由AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80组成的组。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述启动子选自由TMPRSS3启动子、Myo7a启动子、人类巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和Pou4f3启动子组成的组。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述表达载体通过注射到受试者的内耳中施用。

20.根据权利要求19所述的方法，其中注射方法选自由耳蜗造口术、圆窗膜、内淋巴囊、蜗管、管道造口术、经内淋巴囊的蜗管，或它们的任何组合组成的组。

21.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者具有与听力丧失相关的一种或多种遗传风险因子。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述遗传风险因子之一选自由TMPRSS3基因突变或LOXHD1基因突变组成的组。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者未表现出任何听力丧失的临床表现。

24.一种包含引起听力丧失的突变的转基因小鼠，该突变选自由人类LOXHD1基因突变或人类TMPRSS3基因突变组成的组。