CN117642187A - 用于治疗听力损失的基因疗法构建体和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供可用于由STRC基因的基因突变所引起的听力损失的治疗和/或预防中的组合物和方法。本文所公开的组合物和方法使用慢病毒载体来促成将STRC递送至内耳中以分别在遭受听力损失之苦的患者中恢复STRC基因的活性、促进毛细胞存活、防止听力的进一步退化及/或恢复听力。

Description

用于治疗听力损失的基因疗法构建体和方法

相关申请的交叉引用

本申请主张2021年5月14日提交的美国临时申请号63/188,857的权益和优先权，该临时申请通过引用以其整体并入本文用于全部目的。

技术领域

本公开提供可用于治疗和/或预防听力损失的组合物和方法。更具体地，本公开提供可用于治疗和/或预防由STRC基因的基因突变所引起的听力损失的组合物和方法。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体并入本文。所述ASCII复本创建于2022年5月14日，命名为BN00002_0051_SL_ST25.txt，并且大小为56KB。

背景技术

听力损失是人类最常见的感官缺陷。根据世界卫生组织(WHO)发布的2018年致残性听力损失严重程度估计，全球有4.66亿人患有致残性听力损失(4.32亿成年人和3400万儿童)。到2030年，患有致残性听力损失的人数将增长至6.3亿，并且到2050年将超过9亿。患有致残性听力损失的人中有90％以上(4.2亿)居住在世界低收入地区(WHO全球听力损失盛行率估计，预防耳聋，WHO 2018)。

研究已经证明，超过50％的习语前聋是遗传性的。此类先天性听力损失和耳聋可能是传导性的、感音神经性的或两者结合的；综合征性的(与外耳或其他器官的畸形相关联或者与涉及其他器官系统的医学问题相关联)或非综合征性的(与外耳的可见异常或任何相关医学问题不相关联)；以及习语前的(在语言发育之前)或习语后的(在语言发育之后)。此外，研究已经显示，超过70％的先天性听力损失是非综合征性的。针对非综合征性耳聋的不同基因座被指定为DFN(针对DeaFNess(聋人))。基于遗传模式来命名基因座：DFNA(常染色体显性)、DFNB(常染色体隐性)和DFNX(X染色体连锁)。上述命名后面的数字反应基因定位和/或发现的顺序。在一般群体中，听力损失的盛行率随年龄而增加。这一改变反映了基因和环境的影响，以及环境触发与个体的遗传倾向之间的相互作用。

目前，针对那些患有致残性听力损失的人的治疗选项是听力辅助或人工耳蜗。人工耳蜗植入是一种常见的治疗方案，其相关医疗费用高，每位患者的终身费用超过1,000,000美元。人工耳蜗和听力辅助的终身费用对大多数人，并且特别是对于那些居住在低收入地区(患有致残性听力损失的人中大多数居住在那里)的人而言是令人望而却步的。遗憾的是，目前没有批准的治疗剂用于预防或治疗听力损失或耳聋。因此，亟需治疗性选项来提供针对听力损失的人工耳蜗和听力辅助的成本有效替代方案。

发明内容

本公开至少部分地基于以下发现：全长或接近全长的硬纤毛蛋白(Stereocilin)(STRC)可以在内耳特异性启动子(例如，小鼠或人Myo7A启动子)的控制下被并入慢病毒载体中以在内耳细胞中产生STRC的强劲表达，这能够拯救与STRC失能突变相关联的表型。本文的技术提供经由基因疗法来拯救哺乳动物(例如，人)的STRC失能突变的能力。本公开向罹患由STRC突变所致的疾患的患者提供用于恢复STRC功能的组合物和方法。

一方面，本公开提供一种慢病毒表达载体，其包括编码硬纤毛蛋白(STRC)的核酸序列或其一部分；和可操作地链接至所述核酸序列的启动子。

在实施方案中，慢病毒表达载体是第三代自灭活(SIN)慢病毒载体。在实施方案中，SIN慢病毒载体缺乏野生型慢病毒长末端重复序列(LTR)增强子和启动子元件。

在实施方案中，启动子选自由STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和Pou4f3启动子组成的组。在实施方案中，启动子是Myo7a。在实施方案中，启动子与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。任选地，Myo7a启动子进一步包括Myo7a增强子。任选地，Myo7a启动子进一步包括Myo7a增强子。在其中启动子与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的实施方案中，启动子可任选地进一步包括与SEQ ID NO:5为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的Myo7a增强子。

在实施方案中，核酸与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在实施方案中，核酸编码与SEQ ID NO:2为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。

一方面，本公开提供一种在治疗或预防听力损失的方法中使用的药物组合物，该药物组合物包含慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸，其中该核酸序列可操作地链接至与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸。

一方面，本公开提供一种细胞，其包含：慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列；和可操作地链接至该核酸的启动子。

在实施方案中，核酸与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在实施方案中，启动子选自由STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或Pou4f3启动子组成的组。

在实施方案中，启动子是Myo7a。在实施方案中，启动子与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在一些实施方案中，细胞是干细胞。在实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。

一方面，本公开提供一种用于治疗或预防听力损失的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药有效量的根据权利要求1所述的慢病毒载体的步骤。

在实施方案中，启动子选自由STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或Pou4f3启动子组成的组。在实施方案中，启动子是Myo7a。在实施方案中，启动子与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

在实施方案中，表达载体通过注射至所述受试者的内耳中来给药。

在实施方案中，注射方法选自由耳蜗造口术、圆窗膜、内淋巴囊、中阶、小管切开术、经由内淋巴囊的中阶、或其组合组成的组。

在实施方案中，受试者具有与听力损失相关联的一种或多种遗传风险因素。

在实施方案中，遗传风险因素中的一种选自由STRC基因中的突变组成的组。

在实施方案中，受试者不表现出听力损失的任何临床指标。

一方面，本公开提供一种转基因小鼠，其包括引起听力损失的突变/变异，所述突变/变异选自由人的STRC基因中的突变/变异组成的组。

本文公开一种表达载体，其包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列或与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列，其中该核酸序列可操作地链接至启动子。本文还公开一种在治疗或预防听力损失的方法中使用的药物组合物，该药物组合物包括表达载体，该表达载体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列，其中该核酸序列可操作地链接至启动子。在一些实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在一些实施方案中，表达载体选自慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、疫苗病毒载体或辅助者依赖性腺病毒载体。在一些实施方案中，载体是选自下列的慢病毒载体或腺相关病毒载体：AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或Anc80。在一些实施方案中，AAV载体可以是AAV50混合壳体，当与Anc80相比时，该混合壳体已经显示在成年动物的内毛细胞和外毛细胞中得到更好的转染。在一些实施方案中，启动子选自在早期发育时驱动可操作地链接的核酸的表达并且在整个生命期间维持表达的任何毛细胞启动子，例如，STRC启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、Myo7a启动子或Pou4f3启动子。在一些实施方案中，增强子可以是Barhl1增强子(见例如，Hou等人(2019)Cell 8(5):458)。内源性STRC启动子和增强子的示例显示在表1中。

表1

本文公开一种具有表达载体的细胞，所述表达载体包括SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列，其中该核酸序列可操作地链接至启动子。在一些实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列一致性。在一些实施方案中，细胞是干细胞。在一些实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。

本文公开一种用于治疗或预防听力损失的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药有效量的表达载体，所述表达载体包括SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列，其中该核酸序列可操作地链接至启动子。在一些实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。在一些实施方案中，表达载体选自慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、疫苗病毒载体、辅助者依赖性腺病毒载体。在一些实施方案中，载体是选自下列的慢病毒载体或腺相关病毒载体：AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、Anc80或AAV50。在一些实施方案中，启动子选自在早期发育时驱动可操作地链接的核酸序列的表达并且在整个生命期间维持表达的任何毛细胞启动子，例如，STRC启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、Myo7a启动子或Pou4f3启动子。在一些实施方案中，将表达载体例如通过注射给药至受试者的内耳中。一些实施方案中，递送方法选自耳蜗造口术、圆窗膜、小管切开术或其组合(见例如，Erin E.Leary Swan,等人,Inner Ear DrugDelivery for Auditory Applications；Adv Drug Deliv Rev.2008December 14；60(15):1583–1599)。在一些实施方案中，将表达载体经由内淋巴囊递送至中阶中(见例如，Colletti V,等人,Evidence of gadolinium distribution from the endolymphaticsac to the endolymphatic compartments of the human inner ear,AudiolNeurootol,2010；15(6):353-63；Marco Mandalà,MD,等人,Induced endolymphatic flowfrom the endolymphatic sac to the cochlea in Ménière's disease,Otolaryngology–Head and Neck Surgery(2010)143,673-679；Yamasoba T,等人,Innerear transgene expression after adenoviral vector inoculation in theendolymphatic sac,Hum Gene Ther.1999Mar 20；10(5):769-74)。在一些实施方案中，受试者具有与听力损失相关联的一种或多种遗传风险因素。在一些实施方案中，遗传风险因素中的一种是STRC基因中的突变。在一些实施方案中，STRC基因中的突变选自已知引起听力损失的任何一种或多种STRC突变(见例如，表4)。在一些实施方案中，受试者不表现出听力损失的任何临床指标。

在一些实施方案中，将本文所述的表达载体与包含其他核酸序列的一种或多种表达载体且/或与用于治疗听力损失的一种或多种其他活性药剂作为组合疗法给药。例如，组合疗法可包括具有SEQ ID NO:1的核酸序列的第一表达载体和具有核酸序列的第二表达载体，其中将两种表达载体作为组合疗法的一部分给药至受试者以治疗听力损失。

本文公开一种具有人STRC基因的转基因小鼠，该基因具有选自已知引起听力损失的任何一种或多种STRC突变的突变(见例如，表4)。

定义

“变化”意为增加或减少。“变化”可以少至1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％或40％、50％、60％，或甚至多至75％、80％、90％或100％。

“生物样品”意为来自生物体的任何组织、细胞、液体或其他材料。

“基本上一致”意为多肽或核酸分子表现出至少50％的与参考氨基酸序列(例如，本文所述氨基酸序列中的任何一个)或核酸序列(例如，本文所述核酸序列中的任何一个)的一致性。优选地，此序列在氨基酸水平上或核酸水平上具有与用于比对的序列的至少70％、更优选80％或85％、且更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％的一致性。

“融合蛋白”意为经工程化改造的多肽，其将从两种或更多种其他蛋白质提取的序列元件组合。

如本文所用，术语“转染”是指例如通过使用阳离子脂质媒介物和/或通过电穿孔或其他本领域公认的转染手段将核酸(一般是DNA或RNA)递送至细胞的细胞质或细胞核。

“转导”意为通过使用病毒递送(例如经由慢病毒递送载体/质粒)或其他本领域公认的转导手段将核酸(一般是DNA或RNA)递送至细胞的细胞质或细胞核。

如本文所用，术语“质粒”是指由旨在引导所靶向细胞的转化的遗传物质构成的经工程化改造的构建体。质粒由质粒主链组成。如本文所用，“质粒主链”含有与其他必要遗传元件定位且依序取向的多个遗传元件，使得核酸匣中的核酸可以被转录并且在必要时在经转染或转导的细胞中被转译。如本文所用，术语质粒可以是指源自质粒载体、粘粒、噬菌粒或噬菌体的核酸，例如DNA，编码特定基因的核酸的一个或多个片段可以插入或克隆到该质粒中。

如本文所用，“病毒载体”是通过将病毒基因组的一部分包括在载体内而物理上并入病毒颗粒中的载体，例如，封装信号，并且不仅仅是DNA或取自病毒核酸的一部分的定位基因。因此，尽管病毒基因组的一部分可以存在于本公开的质粒中，但该部分不导致该质粒并入病毒颗粒中，并且因此不能产生感染性病毒颗粒。

如本文所用，术语“载体”是指任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，其能够在与适当控制元件缔合时进行复制并且可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。

如本文所用，术语“整合载体”是指经由整合酶完成其整合或插入到核酸(例如，染色体)中的载体。“整合载体”的示例包括但不限于，逆转录病毒载体、转座子和腺相关病毒载体。

如本文所用，术语“整合的”是指被稳定地插入到宿主细胞基因组中(即，染色体中)的载体。

如本文所用，术语“外源性基因”是指在自然界不存在于宿主生物体或细胞中的基因或者被人工并入到宿主生物体或细胞中的基因。

术语“基因”是指一种核酸(例如，DNA或RNA)序列，其包含产生前体或多肽(例如，STRC)所必需的编码序列。该多肽可以由全长编码序列或由该编码序列的任何部分编码，只要该全长或片段的所希望活性或功能性质(例如，改善的毛细胞存活和毛细胞功能)保留即可。该术语还涵盖结构性基因的编码区并且包括定位在邻近5'和3'端两处的编码区的序列，该序列在每一端与编码区相距约1kb或更长，使得该基因对应于全长mRNA的长度。定位在编码区的5'并且存在于mRNA上的序列称为5'未转译序列。定位在编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列称为3'未转译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式两者。基因的基因组形式或克隆物含有被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是基因的链段，其转录为细胞核RNA(hnRNA)；内含子可含有调控元件诸如增强子。内含子从细胞核或初级转录物中去除或“剪接掉”；因此内含子在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。mRNA在转译期间起作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。

如本文所用，术语“基因表达”是指通过基因的“转录”(即，经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，而对于蛋白质编码基因，则通过mRNA的“转译”转化为蛋白质。基因表达可以在该过程中的很多阶段进行调控。“上调”或“活化”是指增加基因表达产物(即，RNA或蛋白质)的产生的调控，而“下调”或“阻遏”是指减少产生的调控。牵涉到上调或下调中的分子(例如，转录因子)往往分别称为“活化因子”或“阻遏因子”。

在本文中，“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列的情况下，“氨基酸顺序”和类似术语诸如“多肽”或“蛋白质”并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关联的完整的天然氨基酸序列。

如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”、“DNA编码”、“RNA序列编码”和“RNA编码”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸或核糖核酸的链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此，DNA或RNA序列编码该氨基酸序列。

如本文所用，术语“变体”当参考蛋白质使用时是指由部分同源性核酸编码的蛋白质，使得该蛋白质的氨基酸序列变动。如本文所用，术语“变体”涵盖由具有不导致蛋白质功能改变的保守型和非保守型氨基酸替换的同源基因编码的蛋白质，以及由具有造成减少的(例如，无效突变)蛋白质功能或增加的蛋白质功能的氨基酸替换的同源基因编码的蛋白质。

如本文所用，术语“在可操作的组合中”、“以可操作的顺序”和“可操作地链接”是指核酸序列以这样的方式键联，使得产生能够引导给定基因的转录和/或所希望蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指氨基酸序列以这样的方式键联，使得产生功能性蛋白质。

如本文所用，术语“调控元件”是指一种遗传元件，其控制核酸序列表达的一些方面。例如，启动子是一种调控元件，其促进可操作地链接的编码区的转录的启动。其他调控元件是剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号、RNA输出元件、内部核糖体进入位点等。

真核细胞中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，这些序列与牵涉到转录中的细胞蛋白质特异性地相互作用(Maniatis等人,(1987)Science236:1237)。启动子和增强子元件已经从多种真核生物来源(包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞中的基因)以及病毒分离(类似的控制元件(即，启动子)也见于原核细胞中)。特定启动子和增强子的选择取决于待使用何种细胞类型来表达感兴趣的蛋白质。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他的则在有限的细胞类型子集中发挥作用(关于综述，见Voss等人,(1986)Trends Biochem.Sci.,11:287；和Maniatis等人，同上)。例如，SV40早期基因增强子在来自多种哺乳动物物种的多种细胞类型中非常活跃并且已经广泛用于蛋白质在哺乳动物细胞中的表达(Dijkema等人,(1985)EMBO J.4:761)。在广范围哺乳动物细胞类型中活跃的启动子/增强子元件的另两个示例是来自人延长因子1α基因的那些(Uetsuki等人,(1989)J.Biol.Chem.,264:5791；Kim等人,(1990)Gene 91:217；以及Mizushima and Nagata,(1990)Nuc.Acids.Res.,18:5322)以及劳斯肉瘤病毒(Gorman等人,(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)和人巨细胞病毒(Boshart等人,(1985)Cell 41:521)的长末端重复序列。

如本文所用，术语“启动子/增强子“表示DNA的链段，其含有能够提供启动子和增强子两种功能的序列(即，由启动子元件和增强子元件提供的功能，关于这些功能的讨论见上文)。例如，逆转录病毒的长末端重复序列含有启动子和增强子两种功能。增强子/启动子可以是“内源性的”或“外源性的”或“异源性的”。“内源性”启动子/增强子是天然地与基因组中的给定基因链接的启动子/增强子。“外源性”或“异源性”增强子/启动子是指通过基因操作(即，分子生物学技术诸如克隆和重组)与基因并置，使该基因的转录由所链接的增强子/启动子引导的增强子/启动子。

如本文所用，术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”是指一种DNA序列，其在连接至感兴趣的核苷酸序列时能够控制该感兴趣的核苷酸序列转录为mRNA。启动子典型地(但不一定)定位在感兴趣的核苷酸序列的5'(即，上游)，该启动子控制该感兴趣的核苷酸转录为mRNA，并且提供用于被RNA聚合酶特异性结合的位点和用于启动转录的其他转录因子。

启动子可以是组成型的或可调控的。术语“组成型的”当参考启动子使用时意为该启动子能够在不存在刺激(例如，热冲击、化学品等)的情况下引导经可操作地链接的核酸序列的转录。相比之下，“可调控的”启动子是能够在存在刺激(例如，热冲击、化学品等)的情况下引导经可操作地链接的核酸序列的一定水平的转录的启动子，该水平不同于该可操作地链接的核酸序列在不存在刺激的情况下的转录水平。本领域还已知某些启动子在这样的启动子的控制下赋予核酸序列表达组织特异性和/或时间/发育特异性。

如本文所用，术语“逆转录病毒”是指一种逆转录病毒颗粒，其能够进入细胞(即，该颗粒含有膜相关蛋白诸如包膜蛋白或病毒G糖蛋白，该蛋白质可结合至宿主细胞表面并且促进该病毒颗粒进入宿主细胞的细胞质中)并且将该逆转录病毒基因组(作为双链前病毒)整合到宿主细胞的基因组中。术语“逆转录病毒”涵盖肿瘤病毒亚科(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV，本文中也简写为“MLV”)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)和小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV))、泡沫病毒亚科和慢病毒亚科(例如，人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、马感染贫血病毒和山羊关节炎-脑炎病毒；见，例如，美国专利号5,994,136和6,013,516，其两者均通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“逆转录病毒载体”是指已经被修饰以表达感兴趣的基因的逆转录病毒。逆转录病毒载体可用于通过利用病毒感染过程而有效地将基因转移至宿主细胞中。克隆(即，使用分子生物学技术插入)到逆转录基因组中的外来的或异源性基因可以被有效地递送至宿主细胞，该宿主细胞易被该逆转录病毒感染。

如本文所用，术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒亚科家族(例如，人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、马感染贫血病毒和山羊关节炎-脑炎病毒)的逆转录病毒载体，其能够整合到非分裂细胞中(见，例如，美国专利号5,994,136和6,013,516，其两者均通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“腺相关病毒(AAV)载体”是指衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9等。AAV载体可具有整体或部分缺失的一个或多个AAV野生型基因(优选地，rep和/或cap基因)，但保留功能性侧翼ITR序列。

如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可由试管和细胞培养物组成但不限于此。术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)以及在天然环境中发生的过程或反应。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核细胞(例如，哺乳动物细胞、鸟细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)，无论其位于体外或体内。

术语“给药”是指将物质引入受试者体内。通常，可使用任何给药途径，包括例如肠胃外(例如，静脉内)、口服、外用、皮下、腹膜内、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻腔、引入到脑脊液中或吸入到体腔内。在一些实施方案中，给药是口服的。此外或作为另一种选择，在一些实施方案中，给药是肠胃外的。在一些实施方案中，给药是静脉内的。

“药物”意为任何小化合物(例如，小分子)、抗体、核酸分子或多肽或其片段或者细胞治疗剂诸如同种异体移植和/或CART细胞疗法。

“STRC核酸分子”意为编码STRC多肽的多核苷酸。示例性STRC核酸分子与下列序列(例如，NM_153700)(SEQ ID NO:1)为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：

>NM_153700

gccctgccctcacctggctatcccacacaggtgagaataaccagaactcacctccggtaccagtgttcacttggaaacatggctctcagcctctggcccctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgtcctttgcagtgactctggcccctactgggcctcattccctggaccctggtctctccttcctgaagtcattgctctccactctggaccaggctccccagggctccctgagccgctcacggttctttacattcctggccaacatttcttcttcctttgagcctgggagaatgggggaaggaccagtaggagagcccccacctctccagccgcctgctctgcggctccatgattttctagtgacactgagaggtagccccgactgggagccaatgctagggctgctaggggatatgctggcactgctgggacaggagcagactccccgagatttcctggtgcaccaggcaggggtgctgggtggacttgtggaggtgctgctgggagccttagttcctgggggcccccctaccccaactcggcccccatgcacccgtgatgggccgtctgactgtgtcctggctgctgactggttgccttctctgctgctgttgttagagggcacacgctggcaagctctggtgcaggtgcagcccagtgtggaccccaccaatgccacaggcctcgatgggagggaggcagctcctcactttttgcagggtctgttgggtttgcttaccccaacaggggagctaggctccaaggaggctctttggggcggtctgctacgcacagtgggggcccccctctatgctgcctttcaggaggggctgctccgtgtcactcactccctgcaggatgaggtcttctccattttggggcagccagagcctgataccaatgggcagtgccagggaggtaaccttcaacagctgctcttatggggcgtccggcacaacctttcctgggatgtccaggcgctgggctttctgtctggatcaccacccccaccccctgccctccttcactgcctgagcacgggcgtgcctctgcccagagcttctcagccgtcagcccacatcagcccacgccaacggcgagccatcactgtggaggccctctgtgagaaccacttaggcccagcaccaccctacagcatttccaacttctccatccacttgctctgccagcacaccaagcctgccactccacagccccatcccagcaccactgccatctgccagacagctgtgtggtatgcagtgtcctgggcaccaggtgcccaaggctggctacaggcctgccacgaccagtttcctgatgagtttttggatgcgatctgcagtaacctctccttttcagccctgtctggctccaaccgccgcctggtgaagcggctctgtgctggcctgctcccaccccctaccagctgccctgaaggcctgccccctgttcccctcaccccagacatcttttggggctgcttcttggagaatgagactctgtgggctgagcgactgtgtggggaggcaagtctacaggctgtgccccccagcaaccaggcttgggtccagcatgtgtgccagggccccaccccagatgtcactgcctccccaccatgccacattggaccctgtggggaacgctgcccggatgggggcagcttcctggtgatggtctgtgccaatgacaccatgtatgaggtcctggtgcccttctggccttggctagcaggccaatgcaggataagtcgtgggggcaatgacacttgcttcctagaagggctgctgggcccccttctgccctctctgccaccactgggaccatccccactctgtctgacccctggccccttcctccttggcatgctatcccagttgccacgctgtcagtcctctgtcccagctcttgctcaccccacacgcctacactatctcctccgcctgctgaccttcctcttgggtccaggggctgggggcgctgaggcccaggggatgctgggtcgggccctactgctctccagtctcccagacaactgctccttctgggatgcctttcgcccagagggccggcgcagtgtgctacggacgattggggaatacctggaacaagatgaggagcagccaaccccatcaggctttgaacccactgtcaaccccagctctggtataagcaagatggagctgctggcctgctttagtcctgtgctgtgggatctgctccagagggaaaagagtgtttgggccctgcagattctagtgcaggcgtacctgcatatgcccccagaaaacctccagcagctggtgctttcagcagagagggaggctgcacagggcttcctgacactcatgctgcaggggaagctgcaggggaagctgcaggtaccaccatccgaggagcaggccctgggtcgcctgacagccctgctgctccagcggtacccacgcctcacctcccagctcttcattgacctgtcaccactcatccctttcttggctgtctctgacctgatgcgcttcccaccatccctgttagccaacgacagtgtcctggctgccatccgggattacagcccaggaatgaggcctgaacagaaggaggctctggcaaagcgactgctggcccctgaactgtttggggaagtgcctgcctggccccaggagctgctgtgggcagtgctgcccctgctcccccacctccctctggagaactttttgcagctcagccctcaccagatccaggccctggaggatagctggccagcagcaggtctggggccagggcatgcccgccatgtgctgcgcagcctggtaaaccagagtgtccaggatggtgaggagcaggtacgcaggcttgggcccctcgcctgtttcctgagccctgaggagctgcagagcctagtgcccctgagtgatccaacggggccagtagaacgggggctgctggaatgtgcagccaatgggaccctcagcccagaaggacgggtggcatatgaacttctgggtgtgttgcgctcatctggaggagcggtgctgagcccccgggagctgcgggtctgggcccctctcttctctcagctgggcctccgcttccttcaggagctgtcagagccccagcttagagccatgcttcctgtcctgcagggaactagtgttacacctgctcaggctgtcctgctgcttggacggctccttcctaggcacgatctatccctggaggaactctgctccttgcaccttctgctaccaggcctcagcccccagacactccaggccatccctaggcgagtcctggtcggggcttgttcctgcctggcccctgaactgtcacgcctctcagcctgccagaccgcagcactgctgcagacctttcgggttaaagatggtgttaaaaatatgggtacaacaggtgctggtccagctgtgtgtatccctggtcagcctattcccaccacctggccagactgcctgcttcccctgctcccattaaagctgctacaactggattccttggctcttctggcaaatcgaagacgctactgggagctgccctggtctgagcagcaggcacagtttctctggaagaagatgcaagtacccaccaaccttaccctcaggaatctgcaggctctgggcaccctggcaggaggcatgtcctgtgagtttctgcagcagatcaactccatggtagacttccttgaagtggtgcacatgatctatcagctgcccactagagttcgagggagcctgagggcctgtatctgggcagagctacagcggaggatggcaatgccagaaccagaatggacaactgtagggccagaactgaacgggctggatagcaagctactcctggacttaccgatccagttgatggacagactatccaatgaatccattatgttggtggtggagctggtgcaaagagctccagagcagctgctggcactgacccccctccaccaggcagccctggcagagagggcactacaaaacctggctccaaaggagactccagtctcaggggaagtgctggagaccttaggccctttggttggattcctggggacagagagcacacgacagatccccctacagatcctgctgtcccatctcagtcagctgcaaggcttctgcctaggagagacatttgccacagagctgggatggctgctattgcaggagtctgttcttgggaaaccagagttgtggagccaggatgaagtagagcaagctggacgcctagtattcactctgtctactgaggcaatttccttgatccccagggaggccttgggtccagagaccctggagcggcttctagaaaagcagcagagctgggagcagagcagagttggacagctgtgtagggagccacagcttgctgccaagaaagcagccctggtagcaggggtggtgcgaccagctgctgaggatcttccagaacctgtgccaaattgtgcagatgtacgagggacattcccagcagcctggtctgcaacccagattgcagagatggagctctcagactttgaggactgcctgacattatttgcaggagacccaggacttgggcctgaggaactgcgggcagccatgggcaaagcaaaacagttgtggggtcccccccggggatttcgtcctgagcagatcctgcagcttggtaggctcttaataggtctaggagatcgggaactacaggagctgatcctagtggactggggagtgctgagcaccctggggcagatagatggctggagcaccactcagctccgcattgtggtctccagtttcctacggcagagtggtcggcatgtgagccacctggacttcgttcatctgacagcgctgggttatactctctgtggactgcggccagaggagctccagcacatcagcagttgggagttcagccaagcagctctcttcctcggcaccctgcatctccagtgctctgaggaacaactggaggttctggcccacctacttgtactgcctggtgggtttggcccaatcagtaactgggggcctgagatcttcactgaaattggcaccatagcagctgggatcccagacctggctctttcagcactgctgcggggacagatccagggcgttactcctcttgccatttctgtcatccctcctcctaaatttgctgtggtgtttagtcccatccaactatctagtctcaccagtgctcaggctgtggctgtcactcctgagcaaatggcctttctgagtcctgagcagcgacgagcagttgcatgggcccaacatgagggaaaggagagcccagaacagcaaggtcgaagtacagcctggggcctccaggactggtcacgaccttcctggtccctggtattgactatcagcttccttggccacctgctatgagcctgtctctacagtagaaggagattgtggggagagaaatcttaagtcataatgaataaagtgcaaacagaagtgcatcctgattattttcagaagctgatgaggaata

“STRC多肽”意为与下列序列(例如NP_714544.1)(SEQ ID NO:2)至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽或其片段。

>NP_714544.1

MALSLWPLLLLLLLLLLLSFAVTLAPTGPHSLDPGLSFLKSLLSTLDQAPQGSLSRSRFFTFLANISSSFEPGRMGEGPVGEPPPLQPPALRLHDFLVTLRGSPDWEPMLGLLGDMLALLGQEQTPRDFLVHQAGVLGGLVEVLLGALVPGGPPTPTRPPCTRDGPSDCVLAADWLPSLLLLLEGTRWQALVQVQPSVDPTNATGLDGREAAPHFLQGLLGLLTPTGELGSKEALWGGLLRTVGAPLYAAFQEGLLRVTHSLQDEVFSILGQPEPDTNGQCQGGNLQQLLLWGVRHNLSWDVQALGFLSGSPPPPPALLHCLSTGVPLPRASQPSAHISPRQRRAITVEALCENHLGPAPPYSISNFSIHLLCQHTKPATPQPHPSTTAICQTAVWYAVSWAPGAQGWLQACHDQFPDEFLDAICSNLSFSALSGSNRRLVKRLCAGLLPPPTSCPEGLPPVPLTPDIFWGCFLENETLWAERLCGEASLQAVPPSNQAWVQHVCQGPTPDVTASPPCHIGPCGERCPDGGSFLVMVCANDTMYEVLVPFWPWLAGQCRISRGGNDTCFLEGLLGPLLPSLPPLGPSPLCLTPGPFLLGMLSQLPRCQSSVPALAHPTRLHYLLRLLTFLLGPGAGGAEAQGMLGRALLLSSLPDNCSFWDAFRPEGRRSVLRTIGEYLEQDEEQPTPSGFEPTVNPSSGISKMELLACFSPVLWDLLQREKSVWALQILVQAYLHMPPENLQQLVLSAEREAAQGFLTLMLQGKLQGKLQVPPSEEQALGRLTALLLQRYPRLTSQLFIDLSPLIPFLAVSDLMRFPPSLLANDSVLAAIRDYSPGMRPEQKEALAKRLLAPELFGEVPAWPQELLWAVLPLLPHLPLENFLQLSPHQIQALEDSWPAAGLGPGHARHVLRSLVNQSVQDGEEQVRRLGPLACFLSPEELQSLVPLSDPTGPVERGLLECAANGTLSPEGRVAYELLGVLRSSGGAVLSPRELRVWAPLFSQLGLRFLQELSEPQLRAMLPVLQGTSVTPAQAVLLLGRLLPRHDLSLEELCSLHLLLPGLSPQTLQAIPRRVLVGACSCLAPELSRLSACQTAALLQTFRVKDGVKNMGTTGAGPAVCIPGQPIPTTWPDCLLPLLPLKLLQLDSLALLANRRRYWELPWSEQQAQFLWKKMQVPTNLTLRNLQALGTLAGGMSCEFLQQINSMVDFLEVVHMIYQLPTRVRGSLRACIWAELQRRMAMPEPEWTTVGPELNGLDSKLLLDLPIQLMDRLSNESIMLVVELVQRAPEQLLALTPLHQAALAERALQNLAPKETPVSGEVLETLGPLVGFLGTESTRQIPLQILLSHLSQLQGFCLGETFATELGWLLLQESVLGKPELWSQDEVEQAGRLVFTLSTEAISLIPREALGPETLERLLEKQQSWEQSRVGQLCREPQLAAKKAALVAGVVRPAAEDLPEPVPNCADVRGTFPAAWSATQIAEMELSDFEDCLTLFAGDPGLGPEELRAAMGKAKQLWGPPRGFRPEQILQLGRLLIGLGDRELQELILVDWGVLSTLGQIDGWSTTQLRIVVSSFLRQSGRHVSHLDFVHLTALGYTLCGLRPEELQHISSWEFSQAALFLGTLHLQCSEEQLEVLAHLLVLPGGFGPISNWGPEIFTEIGTIAAGIPDLALSALLRGQIQGVTPLAISVIPPPKFAVVFSPIQLSSLTSAQAVAVTPEQMAFLSPEQRRAVAWAQHEGKESPEQQGRSTAWGLQDWSRPSWSLVLTISFLGHLL

“STRC基因组序列”意为编码STRC多肽的基因组多核苷酸。示例性STRC基因组序列与下列序列(例如，NC_000015.10)(SEQ ID NO:3)为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：

>NC_000015.10

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“人Myo7A启动子”意为编码人Myo7A启动子区域的多核苷酸。示例性Myo7A启动子核酸分子与下列序列(SEQ ID NO:4)为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：

>人_MYO7A_启动子_序列

ccaggcaggtaaggatcaggggtgataggggagagcaattactttgttcactgtatgcacccgcgggggcctgggagtccccatttgcaggtgggtagggcctccagcccacaccacccagacctaggcttccctcttctcaggatccaccacagggttaggggacaggaagcctgttctattctcaataaatcttacaaaattccaaaaagactttcctgtgtccctctgtccccctggggggaagggacaatggaggaatattccccaggcctgggcgactgtccgctggtcagagggaaggccccgctgcctgcccggtgcacctgtgagctgagattgtggggatcattcagtcattcctttattcagtagatctgtacggggctggctttgtgccaaggcctgccccgggcacctgggatgtggggaaccaggcatagcaatccctgctctgggacagtctacaaacgagcagcgagaacaaagacatactctggtcatgacagacactaccccgcacattactgatggggcagtgtgggcctgctgggttagagacggcctactccctgatctgtgcatgaagggctgggaagaggagatgggccttcggggcacaggaaggtgtggggggaccagagcggaggctgctgagggcagatgcaggcatctagggccaggaagctggtgtggtggtggggagaagcagggttgggatgactgaaagcagagtggacgactcaatgaaaaacgacttgggagacggggtgagtgcagtgtgagggcaaagtgaaccgagatgcctcgctttcttcatgggactgagaaatgggtattgcaaatcgtgtgatctgcttagcatagtgcctggttcatagcatggctgaacacaatgtagctgtcatcctggtgtttggaggccgccctgtcccccataacctgcccacctctctgccccattcccacagctcactgcattttgtccctgctgccagtcgtgtgccatgggctctcctgtgctcccccggggtctcatttccccatccgtgtagggctgacgccactggccccgcccagcctgggaggatggagaggggggacttgaggagtggccagtactgggtttcggcagcaggtgcaaatcccaggtggggactgtgttccagggactcctggactcctgttaggccagcaggctaaggggcagacggcatcctggggtcttcctgggacagggtcgtcgggtctgaggggacccaggccctagcagaagctgactcctgtcacggtcacttcccagcggtgctcagcccgcctgacggaagcagctgggcagtggggcctgtgaccagcaggcggcgctggcgagctatagcgcccctttgggcccccaccccaccttctgggcagcttccctgcagacaccccagttatgggggctagggacccaaaagagacatccttctgccacccagagctgccctggcgaggtgcactatggggccgccgacagctgcgtggctgccgagggcggaaaggagaaactgtcatgtcccgatagggccgcgcgaggtctccatcctcgacaacgctaataacaaagacgtgtgctcctctttgcttggttccccccactcctttaaatcacagatttcacttcagtttatctgtgtcgctgtcacacgtggggtggctcccagtcagctggtttggcaaagtttctggatgattacggaataacatgtgtccccaacccgcagagcaggttgtgggggcaatgttgcattgaccagcgtcagagaacacacatcagaggcaagggtgggtgtgcaggagggagaaggcgcagaaggcagggctttagctcagcactctccctcctgccatgctctgcctgaccgttccctctctgagtcccaaacagccaggtagaggaggaagaaatggggctgagaccccagcacatcagtgattaagtcaggatcaggtgcggtttcctgctcaggtgctgagacagcaggcggtgtcctgcaaacaacaggaggcacctgaagctagcctggggggcccacgcccaggtgcggtgcattcagcagcacagccagagacagaccccaatgaccccgcctccctgtcggcagccagtgctctgcacagagccctgagcagcctctggacattagtcccagccccagcacggcccgtcccccacgctgatgtcaccgcacccagaccttggaggccccctccggctccgcctcctgggagaaggctctggagtgaggaggggagggcagc

“人Myo7A增强子”意为编码Myo7A增强子区域(例如，内含子1增强子)的多核苷酸。示例性人Myo7A增强子核酸分子与下列序列(SEQ ID NO:5)为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：

>Myo7A_增强子

agtgctggctggacagctgctctgggcaggagagagagggagagacaagagacacacacagagagacggcgaggaagggaaagacccagagggacgcctagaacgagacttggagccagacagaggaagaggggacgtgtgtttgcagactggctgggcccgtgacccagcttcctgagtcctccgtgcaggtggcagctgtaccaggctggcaggtcactgagagtgggcagctgggccccaggtaaggatgggctgcccactgtcctgggcattgggaggggtttggatgtggaggagtcatggacttgagctacctctagagcctctgccccacagccacttgctcctgggactgggcttcctgccacccttgagggctcagccaccacagccactgaatgaaactgtcccgagcctgggaagatggatgtgtgtcccctggaggagggaagagccaaggagcatgttgtccatcgaatcttctctgagctggggctggggttagtggcatcctggggccaggggaatagacatgctgtggtggcagagagaagagtccgttctctctgtctcctttgctttctctctgacactctttatctccgtttttggataagtcacttccttcctctatgccccaaatatcccatctgtgaaatgggagtatgaagccccaacagccagggttgtagtggggaagaggtaaaatcaggtatagacatagaaatacaaatacagtctatgccccctgttgtcagttggaaaagaaattaacttgaaggtggtctagttctcatttttagaaatgaaatgtctgtctggtcattttaaaatgtggcccttaaatttcacgccctcaccactctcccccatcccttggagccccatgtctctagtgaaagcactggctctgcccccagccctcatggctcatgctggcatagggcgcctgctccacagcctgggcaccatcttcagacaagtgcccggtggcaactgcctgctggccctgttgaatccacatctccaccaggcatccagactagttcaggtctctggaaggactgtgggtttgctgtgtcccagagctccagggcaggggtcagggctcggatgtcgggcagtgtcatgggcagaggatcgaatgccccggcggctctgaatgggcccttgtgaaaaattgatgcgcattctaggagacaggttgggagccagaggggcctcataccagggtctgtaggctggggctgccttttaagctccttcctgaggccgtctctgggtctggccctgtgctggacaaggctggagacaaggcaatgtctcagaccctctcccattggccacatcctgccctggatcaactcgccaactttgggggcagaggtgggactgacccttaccctgacaacataatgcatatagtcaaaatgggataaaggggaatatagaggctcttggcagcttgggagtggtcagggaaggcttcctggaggaggtatcatctgaactgagccatgaaccataagtggaaattcactagtcaaaatttcaggtagaagggccagtgtgtgaaggccaggagatggcaagagctggcgtatttcaggaacagtgagtcactgaggatgtccaagtataagggtaggaaagggagtgagcagtgagagaaaagaccgaggcatcagcaggggccagattgtgctgggcctagcggggcgggcccgggcccgggcccaggcccaggtgcggtgcattcagcagcacagccagagacagaccccaatgaccctgcctccccgtcagcagccagtgctctgcacagagccatcctgagggcagtgggtgctcttgagaggtttcaggcagggtgtgctgtgagcaggtcatgcccagcccttgaccttctgctcagtcaggcttgtccttgtcacccacattcctggggcagtccctaagctgagtgccggagattaagtcctagtcctaaatttgctctggctagctgtgtgaccctgggcaagtcttggtccctctctgggcccctttgccgtaggtccctggtggggccagacttgctactttctaggagccctttgggaatctctgaatgacagtggctgagagaagaattcagctgctctgggcagtggtgctggtgacagtggctgaggctcaggtcacacaggctgggcagtggtcagagggagagaagccaaggagggttcccttgagggaggaggagctggggctttgggaggagcccaggtgaccccagccaggctcaaggcttccagggctggcctgcccagaagcatgacatggtctctctccctgcag

“小鼠Myo7A启动子”意为编码小鼠Myo7A启动子区域的多核苷酸。示例性Myo7A启动子核酸分子与下列序列(SEQ ID NO:6)为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：

>小鼠_Myo7A_启动子

agagggatctgtctgtttcatttttcccgtaccccgcacccccccccacacacacacacacaagggtaaagacagagggcacaatgggtagctgacctctggtcagaaggatgagcaaggaaggccttgggaatcacagataaaagctggccttgctggttacctagtgagtcagagctcagctctgtggaatccttcaggttccctgtcagtgtggggctggctttgccgagctctgcccatctcaggccctggggacatgggggcacacagttcctgctctgcagcagccttccagcaactgaggaaaatgtacaaatcatgtctgatcgaagtactgcagtgtccttgataggcagtgtccctaggagctgactctcagtctctgagttcaagatctgtgccctgttctagtggagaggagagacttacatgcaggccacagacagaggtggcagagcagagatactgggaaggtgcggtagctagagctaggaatttatggccagggccacgggcagaagctgggttgggttgtggaaaacgaaatgatggaatacgacgatagattggatttggaggggcgagggtggtatgaacttaagaccagttctgcagtggttcagatgtggtgcccttaagaggctcaggtgccagaaaccagtgccccttctggatagggcagaaaacaggcagaacctggagaggtacggtggagcatgaggtggtaaggacacacaccatctcaggtggtttgttttgggggaaacaagcatggatttctaggtttctccgatcgggtgacctgcttagccgagtttgggtgctgaggaaatgtctccgttatggttctgagaccactttctcacccacccactgccttcccagcatgcacctcagccccaacgaagcacacctgccccagttgccgccttgtcgattgggctctggatgctccaacctgtgtctctcctactctgtgtaggctcatgctactcacctgactcataagtatcagtttcgtaggtgaaggctgcgttgggtgcaagtcaaccttggaccgtggtctcactgtggcaccctggtatgaggaagttgaccggcttttccttagtcttgtagcagttggctgtgcccagcaggtggcaccattgcaccattgattctccccactccatacccactatagattccaccccaccctattcccctccccaccttaacccacccacccccaccgaaaagcagctttcctgagtagatgtcccagctggcaagtgtgggcagaagaaggggccaggtctcaggaggaggaggaggaggaagaggaagaggagtcctccatcctccatcctcatctaccatgatgagtatttgtgtcctgttcattcccacccactcccttttttaaatcacacatttaaatcacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacaccgggtaagtctgtcctgcgtgaggtggctcctactcaggtggctttgcaaactgtctggataacagcacactcaagactcctaggacaggctgtgggggccagttgtagagcttgggggtggggtgcatcttggggagtcctggtttggatgttgtgtccagccaaggctccaggtattgcaaagcctgctcatctatgtggtctctagtagtgccctgacgagggaagctgggtgagcaggggaggctactgggaactgagacccagcaaaatcatgaggaagatgggacgtgatcaggtgtcctaaccatgcagagatggcaggtagtaacacatgtgacaagagaccctgaggtcctgatggttggccccaggcccgaggttcccactggccagcagtgccccctggagcttctatgccttgcatccctgctggttagctttacacagcaccttgggcaacctctagacgttagtcagcagccccagcacagcccgcccctcatgctgatgtcaccacatccagaccttcgaggcccccagggctccgcctcctgggagaaggcttt

如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如处于平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为处于所指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。

在某些实施方案中，除非另外指明或上下文明显另有意义，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落入所引用的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的区间内的值(但该数字将超过可能数值的100％时除外)。

除非上下文明确排除，否则本文提供的所有数值均以术语“约”修饰。

“对照”或“参考”意为对比的标准。选择并测试对照样品的方法在本领域技术人员的能力范围内。统计学显著性的确定处于本领域技术人员的能力范围内，例如，与构成阳性结果的平均值的标准偏差数。

如本文所用，术语“各自/每个”当参考多个项的集合体使用时，旨在鉴定该集合体中的个体项而不必指代该集合体中的每一项。如果明确披露或上下文另有明确规定，则可能出现例外情况。

如本文所用，术语“受试者”包括人和动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在很多实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是灵长动物，尤其是人。在一些实施方案中，受试者是家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；和家养动物，特别是宠物诸如狗和猫。在一些实施方案中(例如，特别是研究情境中)，受试哺乳动物将是例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长动物或猪，诸如近交系猪等。

如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“或”理解为包括性的。如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“一”或“该”理解为单数或复数。

本文中，范围可表示为“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。当此范围被表达时，另一方面包括所述一个特定值和/或至所述另一特定值。同样，当值被使用前缀“约”表达为近似值时，应理解，所述特定值形成另一方面。还应理解，每一个范围的两个端点明显各自与另一端点相关，并且独立于另一端点。也应理解，存在很多本文公开的值，并且每个值在本文中也公开为除了作为该值本身之外，也作为该特定值的“约”值。也应理解，贯穿本申请，数据以很多不同格式提供，并且该数据代表终点和起点以及该数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据的“15”，则应理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、以及等于10和15也视为公开，并且介于10到15之间的值也视为公开。也应理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则11、12、13和14也被公开。

本文提供的范围理解为是该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成组的任何数字、数字组合或子范围以及介于前述整数之间的全部十进制的中间值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的一个端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至50的嵌套子范围可包括一个方向上的1至10、1至20、1至30、和1至40，或另一个方向上的50至40、50至30、50至20、和50至10。

如本文所用，术语“治疗”和“处理”涵盖以临床结果的所希望改变为目标的多种活动。如本文所用，例如，术语“治疗”涵盖以实现听力损失的一个或多个临床指标的可检测改善为目标或确实实现该可检测改善的任何活动，如本文所述。

连接词“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含的或开放的，并且不排除另外的非引用的元件或方法步骤。相比之下，连接短语“由...组成”排除权利要求中未具体指明的任何元件、步骤或成分。连接短语“基本上由...组成”将权利要求的范畴限制为具体指明的材料或步骤“以及其他不在材料上影响所主张的本公开中所呈现的实施方案的基本特征和新颖特征的那些”。

下文所阐述的和权利要求书中所引用的实施方案可在上述定义方面进行理解。

从下述对其优选实施方案的描述以及从权利要求书可明了本公开的其他特征和优势。除非另做定义，否则本文使用的全部科技术语均具有本公开所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或测试本公开，但适合的方法和材料描述如下。本文所引的全部公布的外国专利和专利申请通过引用并入本文。本文所引的全部其它已出版参考文献、文档、手稿和科学演讲通过引用并入本文。在相互矛盾的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅做例示性说明而非试图限制。

一方面，本公开提供一种表达载体，其包括选自SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列组成的组的核酸序列，以及可操作地链接至所述核酸序列的启动子。

在一些实施方案中，表达载体是慢病毒载体。

在一些实施方案中，表达载体是腺相关病毒载体，诸如举例而言AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、Anc80或AAV50。

在一些实施方案中，启动子可以是STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、Barhl1启动子/增强子、或Pou4f3启动子。

一方面，本公开提供一种用于治疗或预防听力损失的方法中的药物组合物，该药物组合物包含表达载体，该表达载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列，其中该核酸序列可操作地链接至该核酸。

一方面，本公开提供一种包含表达载体的细胞，该表达载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列；以及可操作地链接至该核酸的启动子。

一方面，本公开提供一种用于治疗或预防听力损失的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药有效量的表达载体，该表达载体包含选自由SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1的核酸具有至少90％序列一致性的核酸序列组成的组的核酸序列；以及可操作地链接至该核酸的启动子。

在一些实施方案中，表达载体可以是慢病毒载体或腺相关病毒载体，诸如举例而言AAV2、AAV2/Anc80、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、Anc80或AAV50。

在一些实施方案中，启动子可以是STRC启动子、Myo 6启动子、Myo7a启动子、动力蛋白(prestin)启动子/增强子、Myo15启动子/增强子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、Barhl1启动子/增强子、或Pou4f3启动子。

在一些实施方案中，细胞是干细胞。在一些实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞。

在一些实施方案中，表达载体通过注射至所述受试者的内耳中来给药。在一些实施方案中，注射方法选自由耳蜗造口术、圆窗膜、内淋巴囊、中阶、小管切开术、经由内淋巴囊的中阶、或其组合组成的组。

在一些实施方案中，受试者具有与听力损失相关联的一种或多种遗传风险因素。

在一些实施方案中，遗传风险因素可以是STRC基因中的突变。

在一些实施方案中，受试者不表现出听力损失的任何临床指标。

一方面，本公开提供一种转基因小鼠，其包括引起听力损失的突变/变异，所述突变/变异选自由人的STRC基因中的突变/变异组成的组。

在说明书总结处，在权利要求书中特别指出并明确要求保护被视为本发明的主题。通过以下结合附图的详细描述，本发明的前述和其他目标、特征和优点将显而易见。

附图说明

图1显示硬纤毛蛋白(STRC)基因在染色体15上15q13-q21的定位。

图2显示STRC的mRNA转录图谱。

图3显示STRC假基因的mRNA转录图谱。

图4显示示例性LV-SIN慢病毒载体的线性载体图谱，其中GOI表示STRC基因。

图5显示示例性LV-ctrl慢病毒载体的线性载体图谱。

图6A至6D是一系列散点图，显示HEI-OC1细胞中的dTom表达。特别地，表达载体编码的dTomato报告物和STRC蛋白的HEI-OC1细胞的百分比。针对在在未转导的对照(NTC)和用LV-ctrl或LV-SIN在MOI 2下转导的细胞中的dTom表达，在进行细胞内染色后进行流式细胞术分析。所显示的群体使用SSC-A/FSC-A特性针对活细胞进行预门控，然后根据FSC-A/FSC-H特性针对单细胞进行门控。图6A显示针对NTC的数据。图6B显示在MOI 1.277下的dTom表达。图6C显示在MOI 3.278下的dTom表达。图6D显示在MOI 10.279下的dTom表达。

图7显示经由基因疗法构建体的示例性实施方案将示例性人STRC基因递送至小鼠内耳的荧光图像，其中将人巨细胞病毒启动子(hcmv-p)/STRC/dTom匣并入具有水泡性口炎病毒(VSV-g)蛋白的第三代假型慢病毒中。简而言之，STRC转录受hcmv-p控制，并且dTom标签促进对所表达的STRC蛋白的检测。检测到了到内毛细胞(箭头)和外毛细胞(星号)的强劲递送。

图8显示假型LV-hcmv-dTom在成年小鼠内耳中的分布。将1x 10^6PU递送至P30C57Bl/6小鼠的后半规管。dtom的表达可见于全部毛细胞中以及螺旋神经节中，表明这一载体靶向STRC中的突变所靶向的细胞的能力。

具体实施方式

本公开至少部分地基于以下发现：全长或接近全长的硬纤毛蛋白(STRC)基因可以在内耳特异性启动子(例如，小鼠或人Myo7A启动子)的控制下被并入慢病毒载体中以在内耳细胞中产生STRC的强劲表达。本文的技术提供经由基因疗法来拯救哺乳动物(例如，人)的STRC失能突变的能力。本公开向罹患由STRC突变所致的疾患的患者提供用于恢复STRC功能的组合物和方法。

概述

听力损失是人类最常见的感官缺陷。根据世界卫生组织(WHO)发布的2018年致残性听力损失严重程度估计，全球有4.66亿人患有致残性听力损失(4.32亿成年人和3400万儿童)。到2030年，患有致残性听力损失的人数将增长至6.3亿，并且到2050年将超过9亿。患有致残性听力损失的人中有90％以上(4.2亿)居住在世界低收入地区(WHO全球听力损失盛行率估计，预防耳聋，WHO 2018)。

超过50％的习语前聋是遗传性的(疾病控制和预防中心-听力损失遗传学)。先天性听力损失和耳聋可能是传导性的、感音神经性的或两者结合的；综合征性的(与外耳或其他器官的畸形相关联或者与涉及其他器官系统的医学问题相关联)或非综合征性的(与外耳的可见异常或任何相关医学问题不相关联)；以及习语前的(在语言发育之前)或习语后的(在语言发育之后)(Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview；GeneReviews；Richard JH Smith,MD,A Eliot Shearer,Michael S Hildebrand,PhD,and Guy VanCamp,PhD)。

听力受损是一种异质性疾患，大约每1000名新生儿中就有1名受影响。目前，42个基因和69个基因座(http://hereditaryhearingloss.org)牵涉到非综合征性常染色体隐性耳聋中(基因座标记DFNB)。在欧洲人中，20–40％的非综合征性听力损失(NSHL)是由于GJB2(MIM:121011)和GJB6(MIM:604418)中的突变，它们一起构成DFNB1基因座。除少数例外，常染色体隐性NSHL具有类似的表现，其中听力损失是重度到严重的，其中习语前发作初始候选基因方法将STRC(MIM:606440)分配至涵盖DFNB16基因座的染色体15q15.3。静纤毛(Stereocilia)形成纵向刚性和外毛细胞结构所必需的交联，并且在机械偏转时，静纤毛转导敏感通道打开以进行细胞去极化。来自若干小鼠组织的逆转录酶聚合酶链反应(RT PCR)显示强烈的、接近唯一性的在内耳中的表达，并且在敲除后，这些关键结构是不存在的(Vona,B et al.“DFNB16 is a frequent cause of congenital hearing impairment:implementation of STRC mutation analysis in routine diagnostics.”Clinicalgenetics vol.87,1(2015):49-55.doi:10.1111/cge.12332.)。

在混合性耳聋群体中，已经计算出STRC缺失频率>1％，并且STRC听力损失的发病率估计为1/16,000。越来越多的证据表明，DFNB16在包括NSHL的其他遗传异质病因中占很大比例。阻碍STRC筛查的诊断性实施的一个挑战是，在STRC下游不到100kb的区域中存在具有98.9％基因组和99.6％编码序列一致性的未处理假基因，该区域包含具有四个基因即HISPPD2A(MIM:610979)、CATSPER2(MIM:607249)、STRC和CKMT1A(MIM:613415)的链段重复。不同于CKMT1A，这些假基因具有使它们无活性的突变。STRC和CATSPER2的纯合子缺失导致耳聋不育综合征(DIS；MIM:611102)，其特征是男性和女性均患有耳聋且仅男性不育，因为CATSPER2是精子运动所需的。不仅在没有假基因包含的情况下生成准确的测序数据具有挑战性，而且在没有通常可靠的突变解释资源的情况下解释这些数据甚至更为困难，因为这些数据库也被假基因数据“污染”了(Vona,B et al.(2015))。

超过70％的先天性听力损失是非综合征性的。针对非综合征性耳聋的不同基因座被指定为DFN(DeaFNess(聋人))。基于遗传模式来命名基因座：DFNA(常染色体显性)、DFNB(常染色体隐性)和DFNX(X染色体连锁)。上述命名后面的数字反应基因定位和/或发现的顺序(Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview；GeneReviews；Richard JHSmith,MD,A Eliot Shearer,Michael S Hildebrand,PhD,and Guy Van Camp,PhD)。在一般群体中，听力损失的盛行率随年龄而增加。这一改变反映了基因和环境的影响，以及环境触发与个体的遗传倾向之间的相互作用。

感觉神经性听力损失(SNHL)是人类中最常见的神经退行性疾病，并且目前没有批准的药物干预。SNHL可以是由遗传疾患引起的，并且可以是通过损伤诸如声音创伤和耳毒性获得的。基因诊断已经证明，有至少100个基因引起非综合征性感觉神经性听力损失，其中基因中的大多数致病性改变是单核苷酸变异(SNV)或小插入/缺失(indel)。近年来，已经发现拷贝数变异(CNV)也在包括神经发育疾患在内的众多人类疾病中发挥重要作用。CNV(即，通过大约1kb或更多的基因的缺失、插入或复制进行的改变)被认为影响基因表达、表型改变和经由基因破坏的适应，其可能影响疾病特征。最近，CNV已经被识别为SNHL的主要原因。Shearer等人报导，在89个听力损失相关基因中的16个中鉴定出了CNV，其中STRC基因是SNHL4的最常见原因(Yokota,Yoh等人“Frequency and clinical features of hearingloss caused by STRC deletions.”Scientific reports vol.9,1 4408.13Mar.2019,doi:10.1038/s41598-019-40586-7)。

具有所检测的CNV的听力损失患者的临床特征通过对1,025名受试者(年龄范围，0至70岁；平均年龄，11.8岁)的研究来鉴定。当基于发病年龄而归类为先天性–6岁、7至18岁、成年(>18岁)或未知时，大多数具有致病性STRC缺失的受试者在青春期被诊断为SNHL。致病性纯合子STRC缺失在723例被归类为分离性常染色体阴性或散发性的14例中发现(1.94％)，并且在264例具有常染色体显性遗传的3例中发现(1.14％)。在19名受试者(1.85％)中鉴定出STRC的重复(3个拷贝)。尚不清楚3个STRC拷贝是否具有致病性或对表型有任何影响。此外，27名受试者被鉴定为具有ST9RC纯合子缺失，定义为载体缺失。在听力损失队列中，载体STRC缺失的频率为2.63％(27/1,025)，这与正常听力对照组中相同(2.63％,4/152)(Yokota,Yoh等人(2019))。

在该研究中被诊断为遗传性听力损失的受试者中，STRC中CNV的盛行率占所有受试者的5％(17/395)。此外，当基于听力水平而分类为轻度至中度或重度至严重时，在患有轻度至中度SNHL的受试者中，致病性STRC缺失的盛行率为12％(17/140)。因此，STRC中的CNV是轻度至中度SNHL的第二常见原因，仅次于GJB2中的SNVs。患有重度至严重或不对称SNHL的受试者无一在STRC中具有导致疾病的CNV(Yokota,Yoh等人(2019))。

遗传学和基因治疗技术的最新进展表明，通过基因疗法可以拯救许多隐性耳聋(Akil等人,2012；Askew等人,2015)。已经使用腺相关病毒载体(AAV)实现了到内耳的长期基因递送(Shu,Tao,Wang,等人,2016)。首个使用基因疗法(CGF166)逆转耳聋的人类临床试验于2014年6月启动，并于2019年12月完成(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02132130)。该试验评估atoh1在耳蜗支持细胞中过表达以诱导毛细胞再生的效应。该领域转化研究的另一个疾病靶点是隐性遗传性听力损失，它会影响内耳中的一组特定细胞。该突变在一般群体内的盛行率和正常细胞架构的维持是另外的考量因素。

目前没有批准的治疗剂用于预防或治疗听力损失或耳聋。目前，针对那些患有致残性听力损失的人的治疗选项是听力辅助或人工耳蜗。人工耳蜗植入是一种常见的方式，相关医疗费用高，每位患者的终身费用超过1,000,000美元(Mohr PE,等人(2000).Thesocietal costs of severe to profound hearing loss in the United States；Int JTechnol Assess Health Care；16(4):1120-35)。人工耳蜗和听力辅助的终身费用对大多数人，并且特别是对于那些居住在低收入地区(患有致残性听力损失的人中大多数居住在那里)的人而言是令人望而却步的。需要治疗性选项来提供人工耳蜗和听力辅助的成本有效的替代方案。

如本文所述，通过仔细评估听力损失的常见隐性原因的发生率并且考虑基因的尺寸和病毒载体技术的近期发展(即，携带能力)，可研发具有可及且相当普遍患者群体的基因疗法程序。例如，STRC是全球范围内先天性听力受损的主要原因，并且足够严重以致于需要终身使用听力辅助并且在重度病理中需要进行人工耳蜗移植。

STRC

STRC基因是已知的造成轻度至中度听力损失的耳聋相关基因，并且是DFNB16基因座处的染色体15q15.3中的大缺失的一部分。STRC基因是染色体15上的串联重复的一部分；第二拷贝是假基因。两个拷贝处于端粒到着丝粒取向，相距不到100kb。假基因被外显子20中的终止密码子中断(例如，n.t.4057C>T；a.a.Gln1353Stop)。

STRC含有29个外显子，涵盖大约19kb。STRC由1,809个氨基酸构成并且含有推定信号肽和数个疏水性链段，表明质膜定位。在信号肽切割后，STRC的预测分子量为194kD。

包括染色体15碱基对位置(负链)在内的STRC的外显子图谱显示在表2中。

表2

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所发现的对应于STRC基因的mRNA转录物显示在下表3中。在一些实施方案中，STRC基因包含Q7RTU9序列。

表3

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硬纤毛蛋白在内耳、神经系统和CD14+细胞中表达。在耳聋群体中，STRC缺失的发生率已经估计为在约1％与约5％之间(Yokota 2019)。STRC基因中的突变与DFNB16型常染色体隐性非综合征性听力受损相关联。DFNB16听力损失是先天性听力受损的主要贡献者。DFNB16听力损失的临床特征是(OMIM 603720)：

·常染色体隐性

·大多为先天性表现

·习语前发作

·听力损失是中度至严重

·影响高频率(例如，高频率恶化(high frequency sloping))和

·最可能随时间而稳定

STRC基因编码硬纤毛蛋白，这是一种见于内耳中的外毛细胞的静纤毛中的大的细胞外结构性蛋白质。它与水平顶部连接器和盖膜附着冠相关联，后两者对于静纤毛尖端的适当内聚和定位很重要(OMIM606440)。外毛细胞(OHC)束由被称为静纤毛的坚硬微绒毛构成并且参与对声波的机械感受。

在STRC缺陷小鼠中，OHC束尖端链接进行性地劣化并且彼此完全脱离连接。而且，最高的静纤毛的尖端无法嵌入盖膜中。STRC对于水平顶部连接器的形成至关重要，从而维持成熟OHC毛束的内聚性。(Verpy 2011)。

在混合性耳聋群体中，已经计算出STRC缺失频率>1％，并且STRC听力损失的发病率估计为1/16,000。越来越多的证据表明，DFNB16在包括非综合征性感觉神经性听力损失(NSHL)的其他遗传异质病因中占很大比例(Vona,2015)。

已知引起听力损失的在染色体15上的STRC变异/突变在表4中描述。

表4

表5列出了31名具有STRC突变的患者，显示了变体的名称、受影响的基因、蛋白质变化(如果有)、所导致的状况以及它们的临床意义。还提供了突变的定位、登记号和患者ID。

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通过引用以其整体并入本文的美国申请公开号2013/0095071描述用于恢复年龄相关性听力损失的基因疗法，该方法使用突变的酪氨酸腺相关病毒载体将凋亡蛋白的X染色体连锁抑制剂(XIAP)递送至内耳的圆窗膜。但是，该公开没有考虑如本文所公开的那样递送编码功能性STRC的核酸序列以阻止或延迟由STRC基因的基因突变引起的听力损失发作或恢复该听力损失。

此外，目前本领域中关于开发用于听力障碍的临床基因疗法的一个重要缺陷是缺乏反映人类听力损失的动物模型。许多可用于人类成年发病的遗传性听力损失的小鼠模型都存在先天性听力损失，这使得递送研究变得复杂。很少有模型在听力发育后出现遗传性听力损失。在新生小鼠中递送载体导致与在成年小鼠中递送不同的转染模式(Shu,Tao,Li,等人,2016)。对于可用于评估使用不同载体系统和基因靶标对听力的拯救的新颖动物模型存在需求。

目前没有批准的治疗性措施用于预防或治疗听力损失或耳聋，并且缺乏可用的临床前动物模型用于测试此类措施。本发明描述用于病毒载体基因递送的组合物和方法，其将STRC递送至内耳以在苦于听力损失或耳聋的患者中恢复突变的STRC基因的活性、促进毛细胞存活以及恢复听力，以及用于测试此类组合物和方法的基于细胞的和基于动物的模型。

由STRC突变引起的听力损失一般存在于两个群体中：(i)先天性群体，其中受试者带着听力损失出生，和(ii)进行性群体，其中受试者在出生时没有可测量的听力损失但随着时间推移表现出进行性听力损失。因此，在一些情况下，受试者可能具有STRC基因中的突变(例如，如在遗传诊断测试中所检测的)但不表现出听力损失的临床指标或症状，因此提供一个窗口，治疗性干预可以在该窗口期间启动。因此，在一些实施方案中，本发明提供用于在听力逐步衰退期间进行治疗性干预的方法。本发明的方法可以在该时间段之前开始。本发明所提供的治疗听力损失的方法包括但不限于，用于阻止或延迟听力损失发展或听力损失的临床指标或症状的进展的方法。

如本文所用，术语“听力损失”用来描述降低的听到声音的能力，并且包括耳聋和完全失去听到声音的能力。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指本文所述活性剂的量，其足以实现一种或多种所希望的临床结果(诸如上述说明书中“治疗”中所述的那些)或对朝向实现该临床结果有所贡献。在任何个体病例中的适当“有效”量可以使用本领域中已知的标准技术诸如剂量递增研究来确定。

如本文所用，术语“活性剂”是指一种分子(例如，如本文所用的Lenti或AAV源性载体)，其旨在用于本文所述的组合物和方法中并且其旨在对于例如治疗听力损失的目的具有生物活性。

如本文所用，术语“药物组合物”是指一种组合物，其包含至少一种如本文所述的活性剂或者两种或更多种活性剂的组合，以及一种或多种适用于在药物递送中使用的其他组分诸如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂等。

如本文中可互换使用，术语“受试者”或“患者”涵盖哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长动物、啮齿动物(诸如大鼠、小鼠和豚鼠)等。在本发明的一个实施方案中，受试者是人。

本发明的活性剂的剂量可基于在人或其他哺乳动物中执行以确定该活性剂功效和/或有效量的研究来计算。给药的剂量和频率或时机可以通过本领域已知的方法确定并且可能取决于多种因素诸如活性剂的药物形式、给药途径、是否仅使用一种活性剂或使用多种活性剂(例如，当第一活性剂与第二活性剂组合使用时，所需要的第一活性剂的剂量可能较低)和患者特征(包括年龄、体重或任何影响药物代谢的医学状况的存在)。

在一个实施方案中，可给药单一剂量。在另一实施方案中，多个剂量可历经一段时间给药，例如，以特定间隔给药，诸如每天四次、每天两次、每天一次、每周一次、每月一次等。

听力损失的临床特征。先天性听力损失和耳聋可能是传导性的、感音神经性的或两者结合的；综合征性的(与外耳或其他器官的畸形相关联或者与涉及其他器官系统的医学问题相关联)或非综合征性的(与外耳的可见异常或任何相关医学问题不相关联)；以及习语前的(在语言发育之前)或习语后的(在语言发育之后)。(Richard JH Smith,MD,等人；Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview；GeneReviews；最初发布：1999年2月14日；上次修订，2014年1月9日。)

诊断/测试。听力损失的遗传形式应该与获得性听力损失(非遗传性)原因有所区别。听力损失的遗传形式通过耳科、听力学和体格检查、家族史、辅助测试(例如，颞骨CT检查)和分子遗传测试进行诊断。分子遗传测试可用于很多类型的综合征性和非综合征性耳聋，在诊断和遗传咨询中发挥着重要作用。

用来测量听力损失的所选测试：

1.变频耳音传射(DPOAE)。变频耳音传射(DPOAE)是当耳蜗同时被比率在1.1到1.3之间的两个纯音频率刺激时产生的响应。最近对DPOAE产生机制的研究强调了DPOAE反应中存在两个重要组分，一个由互调“失真”产生，另一个由“反射”产生。

在正常成年耳朵中，DPOAE的盛行率是100％。来自左耳和右耳的响应往往是相关的(换言之，它们非常类似)。对于正常受试者，女性具有更高振幅DPOAE。年龄增长过程通过降低DPOAE振幅和缩窄DPOAE响应谱(即，在较高频率下的响应逐渐减少)来对DPOAE响应产生影响。还可以记录临床研究中使用的其他动物物种诸如蜥蜴、小鼠、大鼠、豚鼠、龙猫、鸡、狗和猴子的DPOAE。(耳声发射网站)。

2.听觉脑干反应(ABR)。听觉脑干反应(ABR)测试给出关于内耳(耳蜗)和大脑听力通路的信息。这一测试有时也称为听觉诱发电位(AEP)。该测试可用于儿童或其他有听力筛查传统行为方法困难的人。ABR还可测量WAVE 1振幅，这是一种神经元活动的测量，包括螺旋神经节细胞中许多听觉神经纤维的同步放电(Verhulst,2016)。ABR也适用于有迹象、症状或抱怨的人，这些迹象、症状和抱怨表明大脑或大脑通路有某种类型的听力损失。该测试用于人和动物两者。ABR通过在头部粘贴电极—类似于心电图运行时放置在心脏周围的电极——并记录对声音的脑电波活动来进行。被测试的人静息或睡眠，同时进行测试。无需回应。ABR还可用作新生儿听力筛查程序中的筛查测试。当用作筛查测试时，仅检查一个强度或响度水平，并且婴儿要么通过该筛查要么不通过。(美国语言听力协会网站)。

听力损失的临床表现。听力损失通过类型和发作来描述：

类型

·传导性听力损失由外耳和/或中耳小骨的异常所引起。

.感觉神经性听力损失由内耳结构(即，耳蜗)的功能障碍所引起。

.混合性听力损失是传导性和感觉神经性听力损失的组合。

.中枢听觉功能障碍由第八颅神经、听觉脑干或大脑皮层水平的受损或功能障碍所引起。

发作

.习语前听力损失在语言发育之前存在。所有的先天性(在出生时存在)听力损失均为习语前听力损失，但并非所有的习语前听力损失都是先天性的。

.习语后听力损失在正常语言的发育后发生。

(Richard JH Smith,MD,等人；Deafness and Hereditary Hearing LossOverview；GeneReviews；最初发布：1999年2月14日；上次修订，2014年1月9日。)

听力损失的严重程度。听力以分贝(dB)进行测量。每个频率的阈值或0dB标志是指一种水平，在该水平，正常年轻成人在50％的时间感受到音调突发。如果个体的阈值在正常阈值的15dB内，则视为听力正常。听力损失的严重程度按表6中所示进行分级。

表6

听力受损的百分比。为了计算听力受损的百分比，从500Hz、1000Hz、2000Hz、3000Hz的纯音平均值减去25dB。结果乘以1.5以获得特定耳的水平。通过将较好耳加权为较差耳的五倍来确定受损，如表7中所示。因为对话语音大约为50-60dB HL(听力水平)，所以基于纯音平均值来计算功能受损可能会产生误导。例如，45-dB的听力损失在功能上比30％所暗示的要显著得多。不同的评分标准适用于幼儿，对他们来说，即使是有限的听力损失也会对语言发展产生巨大影响[Northern&Downs 2002]。

表7

听力损失的频率

听力损失的频率按下述进行分配：

·低(<500Hz)

·中(501-2000Hz)

·高(>2000Hz)

基因疗法

基因疗法是当将DNA引入患者体内时治疗遗传疾病。新DNA往往含有功能基因以矫正现有基因中的致病突变。为了实验性或治疗性目标而进行的基因转移依赖于载体或载体系统以将遗传信息运送至靶细胞中。载体或载体系统被视为基因转移反应的效率、特异性、宿主响应、药理学和持续时间的主要决定因素。目前，实现基因转移的最具效率和有效的途径是通过使用基于病毒的载体或载体系统，该病毒已被制作为复制缺陷性的(PCT公开号WO2015/054653；Methods of Predicting Ancestral Virus Sequences and UsesThereof)。

成年哺乳动物耳蜗的感觉细胞缺乏自我修复的能力；因此，目前的治疗策略依赖于声音放大(例如，听力辅助)、声音的更好传播(例如，中耳假体/活性物质移植)或直接神经元刺激(例如，人工耳蜗)来补偿对形成听觉神经并将声学信息传递到大脑的初级感觉毛细胞或螺旋神经节神经元的永久性损伤。尽管这些方法是变革性的，但它们对于恢复对现代生活至关重要的复杂人类听觉功能而言并不是最佳的。

治疗性基因转移至耳蜗已经被视为相对于现有标准治疗进一步改善，范围从年龄相关性和环境诱导的听力损失到遗传形式的耳聋诸如STRC。超过300个基因座已经与遗传性听力损失联系起来，其中对超过70种致病性基因有所描述(见，例如，Parker&Bitner-Glindzicz,2015,Arch.Dis.Childhood,100:271-8)。这些方法的治疗成功在很大程度上取决于将外源性基因构建体安全且有效地递送到耳蜗柯蒂氏器(organ of Corti(OC))的相关治疗细胞靶点。

传统的基于病毒或非病毒的基因转移方法可用于将核酸引入哺乳动物细胞或靶标组织诸如耳蜗中。此类方法可用于将核酸靶向系统的核酸编码组分给药至培养物中或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，载体的转录物)、裸核酸以及与递送媒介物诸如脂质体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有游离的或整合的基因组。核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹道技术、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、和DNA的药剂增强摄取。(见，例如，公开号JP2022/000041A；Systems,methods and compositions for targeted nucleic acid editing)。

载体

迄今，腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、疫苗病毒、逆转录病毒、辅助物依赖性腺病毒和慢病毒已全部针对耳蜗基因递送进行测试。其中，腺相关病毒(AAV)已经表明最具效力，但AAV的DNA封装能力有限，仅能封装长度小于4.7kb的基因。STRC基因的长度为5.5kb。将会测试两种不同的载体系统，一种基于慢病毒载体系统，而第二种基于双AAV载体系统。本文所公开的慢病毒载体系统具有最小的插入诱变风险，并且已被假型化以靶向毛细胞。已在耳中对本文所公开的慢病毒载体系统进行了针对安全性的测试，并且该载体系统显示对从基底到顶点的超过95％的毛细胞的一致性递送。

慢病毒载体

慢病毒属于逆转录病毒科的一属。它们在逆转录病毒中是独特的，因为它们能够感染有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞。它们可以将显著量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，使得它们是最具效率的基因递送载体之一。HIV、SIV和FIV全部是慢病毒的示例。慢病毒载体是源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括自灭活慢病毒载体。

第三代慢病毒载体系统引入了所谓的自灭活(SIN)载体。合适的第三代慢病毒载体是本领域中已知的并且可由技术人员制备和使用，并且描述在例如PCT/EP2021/084131中，该专利申请于2021年12月3日提交并且通过引用以其整体并入本文用于全部目的。

实现复制无能的最佳方法是建立剪接封装设计和由于3'LTR的U3区中的缺失所致的自灭活(SIN)。基因vif、vpr、vpu、nef和任选地tat应消除。具体地说，慢病毒系统的增强包括：5'LTR，其包含在U3位置处、重复序列区(R)和U5区的组成型活性异源启动子；5'UTR，其包含引物结合位点(PBS)、剪接供体位点(SD)、封装信号(ψ)、Rev响应元件、和任选存在的剪接受体(SA)位点；内部增强子/启动子区，其可操作地链接至运载物序列；RNA处理元件，其任选地包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(PRE)；以及3'LTR，其U3区、重复序列区(R)和U5区缺失(SIN)。

这些修饰针对在其表面上携带外来病毒包膜蛋白的能力而对慢病毒载体进行假型化。这些病毒表面糖蛋白通过与特定细胞受体相互作用以诱导膜融合来调节病毒进入宿主细胞内，并且使其可将运载物载荷(即，STRC)递送至受试者的内耳中。特异性增强使得其可以用病毒包膜糖蛋白将慢病毒载体假型化，该病毒包膜糖蛋白能够结合LDL受体或LDL-R家族成员诸如MARAV-G、COCV-G、VSV-G或VSV-G ts并且也能够结合SLC1A5受体、Pit1/2受体和PIRYV-G受体。

可根据本文技术使用的示例性慢病毒载体是PCT/EP2021/084131公开的首个慢病毒序列，部分地或作为整体。慢病毒载体还可包含与PCT/EP2021/084131中公开的首个慢病毒序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。它还可由PCT/EP2021/084131中公开的作为整体的首个慢病毒颗粒组成。替代性地，如果慢病毒载体用能够结合至LDL受体或LDL-R家族成员的野生型VSG、VSV-G或VSG衍生物假型化，并且如果该野生型VSV-G是源自印第安纳州VSV血清型的糖蛋白，那么该载体可具有与PCT/EP2021/084131中公开的任何慢病毒序列具有至少80％、优选地至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的氨基酸序列。为了在体内给药时实现更高的颗粒稳定性并且为了逃避宿主补体系统的潜在识别，可以替代性地使用热稳定和抗补体的VSV-G糖蛋白(VSV-G ts)，该糖蛋白能够结合至LDL-R或LDL-R家族成员。

慢病毒载体可以用COCV-G糖蛋白(即，源自Cocal病毒的糖蛋白)进行假型化。COCV-G能够结合至LDL受体。替代性地，用于将本发明的慢病毒载体假型化的能够结合至LDL受体的糖蛋白是MARAV-G。慢病毒载体还可以用能够结合SLC1A5受体的源自RD114糖蛋白(GP)的病毒包膜糖蛋白进行假型化。它也可以是能够结合SLC1A5受体的源自BaEV GP的糖蛋白。

慢病毒载体还可以用能够结合Pit1/2受体的病毒包膜糖蛋白进行假型化。Pit1和Pit2是钠依赖性磷酸转运蛋白，在磷酸转运中起到至关重要的作用以确保正常细胞功能。Pit1和Pit2还分别用作长臂猿白血病病毒(GALV)和鼠嗜双性白血病病毒(A-MuLV)的受体。因此，病毒包膜糖蛋白可源自GALV。GALV GP能够结合Pit1/2受体。替代性地，病毒糖蛋白可源自A-MuLV/Ampho。这种Ampho GP能够结合Pit1/2受体。它还可以用能够结合Pit1/2受体且源自10A1 MLV的糖蛋白进行假型化。

慢病毒载体还可以用能够结合Pit1/2受体且源自10A1 MLV的糖蛋白进行假型化。慢病毒载体可以替代性地用PIRYV-G进行假型化。因此，该糖蛋白能够介导进入PIRYV-G可进入的宿主细胞内。

在封装慢病毒载体的过程中，提供至少四种不同的表达质粒。慢病毒颗粒可以提供自编码如上所述的慢病毒载体基因组自身的载体质粒、编码Gag和Pol的封装质粒、编码Rev的质粒和编码本文提及的包膜糖蛋白中的至少一者的质粒。该载体质粒、Rev编码质粒和/或Env编码质粒可以是PCT/EP2021/084131中公开的核酸序列。

本文技术提供如PCT/EP2021/084131中所公开的第三代慢病毒载体，其包括编码硬纤毛蛋白基因(STRC)的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至能够驱动表达STRC的内耳细胞中的高水平STRC表达的启动子。在一些实施方案中，编码STRC的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，启动子可以是人Myo7a启动子或小鼠Myo7a启动子。在一些实施方案中，启动子可以与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，启动子可以与SEQ ID NO:4为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。本领域技术人员将了解，由SEQID NO:4或SEQ ID NO:6表示的Myo7a启动子序列可能需要截短以促进将启动子:STRC重组核酸并入到本文所公开的慢病毒载体的封装限制内的能力。特别地，本公开范畴内明确考虑，可以构建SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的各种衍生物，该衍生物包括特定启动子序列的5'端的缺失以促进将Myo7a:STRC重组核苷酸并入本文所述慢病毒载体中的能力，并入方式为允许将所得LV-SIN载体到病毒颗粒内的充分封装。

Myo7a启动子已经得到表征，并且已知核心启动子(例如，SEQ ID NO:4)通过定位在Myo7a基因的第一内含子中的增强子得到正调控(见，例如，Street等人(2011)A DNAVariant within the MYO7APromoter Regulates YY1 Transcription Factor Bindingand Gene Expression Serving as a Potential Dominant DFNA11 Auditory GeneticModifier,JBC,286(17):15278-15286；Boeda等人(2001)A specific promoter of thesensory cells of the inner ear defined by trans-Genesis,Human MolecularGenetics,10(15):1581-1589)，并且该序列的人类版本由SEQ ID NO:5表示。在本公开的范畴内具体地考虑由SEQ ID NO:5表示的核酸序列的一些或全部部分可以与所公开的启动子序列组合使用，以促进STRC的转录激活。在一些实施方案中，增强子可以与SEQ ID NO:5为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6可以与SEQ ID NO:5的一部分或全部组合以创建启动子/增强子组合，该组合随后可以可操作地链接至STRC并且并入本文所公开的第三代慢病毒载体中。不受理论束缚，据信此类启动子/增强子组合可以进一步增加STRC的体内转录活性，从而改善本文所公开的LV-SIN载体拯救患有与STRC突变相关联疾患的患者的STRC^-表型的能力。

腺相关病毒载体

腺相关病毒(AAV)载体是用于治疗多种人类疾病的基因递送的领先平台。利用革命性的生物技术开发临床所希望的AAV壳体、优化基因组设计的最新进展对基因疗法领域的发展做出了重大贡献。AAV介导的基因替换、基因编辑和基因静默的临床前和临床成功已经帮助AAV变为理想治疗性载体的主要选择，其中两种基于AAV的治疗剂在欧洲或美国获得监管批准(见，例如，Wang,D.,Tai,P.W.L.&Gao,G.Adeno-associated virus vector as aplatform for gene therapy delivery.(2019)Nat Rev Drug Discov 18,358–378)。对AAV生物学的持续研究以及增加的对相关治疗性挑战和限制的了解将为未来的临床成功建立基础。

尽管腺相关病毒载体(AAV)介导的内耳基因疗法已经应用于遗传性听力损失的动物模型以改善声学功能，但在一些耳蜗细胞类型中的感染率较低。这部分地由于AAV的大尺寸，因为只有最大为4.6kb的小基因才能被有效地并入载体内而没有产生截短的蛋白质的风险。为了进行内耳基因疗法以有效地治疗听力损失，需要具有更高效率的病毒载体。

AAV介导的递送至内耳中的内耳基因疗法涉及精确且目标明确的策略。柯蒂氏器(OC)包括两类感觉毛细胞：内毛细胞(IHC)，其将声音所携带的机械信息转化为在神经元结构中传播的电信号；以及外毛细胞(OHC)，其用于放大并调谐耳蜗响应，这是复杂听力功能所需的过程。内耳中的其他潜在靶标包括螺旋神经节神经元、螺旋边缘的柱状细胞，它们对维持相邻的盖膜或支持细胞很重要，它们具有保护功能并且可以被触发以转分化为毛细胞，直到新生儿早期。

注射至充满高钾内淋巴液的耳蜗管可提供与毛细胞的直接抵及。然而，这种脆弱的液体环境的改变可能会破坏耳蜗内的电位，增加注射相关毒性的风险。通过椭圆或圆窗膜(RWM)，可以从中耳抵及耳蜗管、鼓阶和前庭阶周围的外淋巴填充空间。RWM是进入内耳中的唯一非骨开口，在很多动物模型中相对容易抵及，并且使用这一途径来给药病毒载体得到良好耐受。人体内的人工耳蜗替换通常依赖于通过RWM插入外科手术电极。

先天性耳聋小鼠模型中的听力的部分拯救是先前评估器官型耳蜗外植体和体内内耳注射中AAV血清型的研究的结果。在这些研究中，已经观察到，含有祖先AAV壳体蛋白的腺相关病毒(AAV)以高效率转导OHC。这一发现克服了使用传统AAV血清型的有限的成功研发耳蜗基因疗法的低转导率。含有祖先AAV壳体蛋白的AAV可以为将内耳基因递送至IHC和OHC以及一系列其他受到遗传性听力和平衡障碍损害的内耳细胞类型提供有价值的平台。除了提供高转导率之外，含有祖先AAV壳体蛋白的AAV在进行全身性注射时显示在小鼠和非人灵长动物中具有类似的安全性情形，并且在抗原上与循环AAV不同，在限制传统AAV载体功效的预先存在的免疫方面提供了潜在的益处。

本文所述的含有祖先AAV壳体蛋白的病毒可用于将多种核酸递送至内耳细胞。可递送至内耳细胞并且在内耳细胞中表达的代表性转基因包括但不限于，编码神经营养因子(例如，胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT3)或热休克蛋白(HSP)-70a)的转基因、免疫调节蛋白或抗肿瘤转录物。此外，可递送至内耳细胞并且在内耳细胞中表达的代表性转基因还包括但不限于，编码抗体或其片段的转基因、反义、静默或长非编码RNA物质、或基因组编码系统(例如，基因上经修饰的锌指核酸酶、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)或成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR))。再者，可递送至内耳细胞并且在内耳细胞中表达的代表性转基因包括本文呈现的核酸STRC，但还可包括ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP，任选地包括在如本文所公开的第三代慢病毒载体中。

诱导多能干细胞(iPSC)

诱导多能干细胞(IPS或IPSC)是一种干细胞，其从成年细胞诸如皮肤、肝、胃或其他成熟细胞通过引入基因来创建，该基因将该细胞重新编程并且将该细胞转化为具有胚胎干细胞的全部特征的细胞。术语多能性意味着细胞产生多种细胞类型的能力，包括形成身体器官、神经系统、皮肤、肌肉和骨骼的全部三种胚胎谱系。

自体诱导多能干细胞(iPSC)理论上构成了基于患者特异性细胞的器官修复策略的无限细胞来源。然而，它们的生成具有技术和制造方面的挑战，并且是一个漫长的过程，在概念上阻止了任何急性治疗模式。基于同种异体iPSC的疗法或基于胚胎干细胞的疗法在制造观点来看更容易，并且允许生成经充分筛查的、标准化的、高质量细胞产物。然而，因为它们的同种异体起源，此类细胞产物将会经历排异。随着细胞抗原性的降低或消除，可以产生普遍可接受的细胞产物。因为多能干细胞可以分化为三个胚层的任何细胞类型，干细胞疗法的潜在应用非常广泛。分化可以通过移植祖细胞而离体或在体内进行，该祖细胞在移植位点的器官环境中继续分化并且成熟。离体分化允许研究者或临床医生密切监测手术过程，并确保在移植前产生适当的细胞群。

然而，在大多数情况下，在临床移植治疗中避免使用未分化的多能干细胞，因为它们容易形成畸胎瘤。相反，此类疗法倾向于使用分化的细胞(例如，移植到心力衰竭患者心肌中的干细胞源性心肌细胞)。此类多能细胞或组织的临床应用将受益于“安全性特征”，该安全性特征在该细胞移植后控制细胞的生长和存活。

可使用多能干细胞(PSC)，因为它们迅速地繁殖并且分化为很多可能的细胞类型。PSC家族包括若干经由不同技术生成的成员并且具备不同的免疫原性特征。患者与源自PSC的经工程化改造的细胞或组织的相容性决定了免疫排异风险和对于免疫抑制的需求。

为了避免排异反应的问题，已经研发了用于产生患者特异性多能干细胞的不同技术。这些技术包括将体细胞核转移到去核卵母细胞中(体细胞核转移(SCNT)干细胞)，将体细胞与ESC融合(杂交细胞)，以及使用某些转录因子对体细胞进行重新编程(诱导PSC或iPSC)。然而，尽管染色体相同，但SCNT干细胞和iPSC可能分别与该细胞核或细胞供体具有免疫不相容性。SCNT干细胞携带从卵母细胞传代的线粒体DNA(mtDNA)。mtDNA编码蛋白可充当相关次要抗原并触发排异反应。与iPSC的重新编程和培养扩增相关的DNA和mtDNA突变以及遗传不稳定性也可以产生与免疫排异反应相关的次要抗原。这一障碍降低了使用SCNT干细胞或iPSC成功大规模工程化兼容患者特异性组织的可能性。

CRISPR/Cas9基因编辑

本文所述的方法还考虑使用CRISPR/Cas9(成簇规则间隔短回文重复序列和CRISPR相关蛋白)基因组编辑以通过编辑STRC基因突变来拯救听力。

这一技术已经用来在两种遗传性听力损失小鼠模型(Tmc1和Pmca2)中成功地拯救听力(Askew,C等人,Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice；SciTransl Med.2015Jul8；7(295):295ra108)。尽管该技术已主要用于靶向显性遗传听力损失，但其可经研发以靶向隐性遗传听力损失并且恢复STRC敲入小鼠模型的听力，并最终恢复患有由STRC基因中的突变所引起的听力损失的人类的听力。使用CRISPR/Cas9基因编辑来修复缺陷基因序列在PCT公开号WO 2016/069910、PCT公开号WO 2015/048577和美国申请公开号2015/0291966中进一步描述，这些文件各自通过引用以其整体并入本文。

技术人员能力范围内的传统分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术可根据本公开使用。此类技术在文献中完整地阐述并且在下述实施例中例示。本发明将在下列实施例中进一步描述，该实施例并不限制权利要求中所述主体的方法和组合物的范畴。

实施例

实施例1：STRC突变型小鼠模型的研发。

研发一种尽可能接近人类状况的小鼠模型对于初始临床研发而言很重要。敲除STRC小鼠模型可以从供应商获得，并且可以用于这些实施例中所述的实验中。此外，也已经使用CRISPR/Cas9技术生成了携带已知造成听力损失的人类突变的小鼠模型。STRC^-小鼠模型显示，人类突变引起小鼠的听力损失，这使得该模型对于评定下述基因疗法构建体而言是有价值的。

本公开提供用于本研究的携带人类突变的STRC^-小鼠模型。本文所公开的STRC敲入小鼠模型提供通过ABR、DPOAE和组织学来研究毛细胞存活和听力损失的能力。对小鼠的表征正在证实STRC^-小鼠是否表现出全谱的人STRC^-表型，包括：进行性听力损失、静纤毛尖端连接退化和静纤毛与盖膜分离，这将证明针对人类DFNB16的STRC小鼠模型的生成。

实施例2：用于基因疗法的慢病毒-STRC构建体的产生。

如图1所示，硬纤毛蛋白(STRC)基因定位在染色体15上位置15q13-q21处。图2显示STRC的mRNA转录图谱。图3显示STRC假基因的mRNA转录图谱。

使用新颖的第三代高容量慢病毒载体系统来在一个载体中递送大的5,515bpSTRC cDNA加上dTomato受体基因。简而言之，通过PCR使得如NCBI(NM_153700)中所示的人STRC cDNA序列(STRC)在侧翼具有5'Kozak保守序列和SgrAI/AgeI限制位点以及3'SalI限制位点。将STRC序列克隆到最先进的携带Myo7a启动子的第三代自灭活(SIN)慢病毒载体中，得到LV-SIN(如图4所示)。

图4显示一般第三代慢病毒载体的示意图，该载体包括感兴趣的基因(GOI)和启动子(PROM)，其中GOI是STRC并且启动子是Myo7a(例如，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6)。

仅表达dTomato受体的由SFFV启动子驱动的对照载体通过使用独特的AgeI和SalI限制位点将侧翼具有AgeI和SalI的dTomato序列插入到载体主链中来生成，生成pRRL.PPT.SF.dTomato.pre(LV-ctrl)，如图5所示。

为了建立针对STRC突变的基因治疗选项，为高容量第三代慢病毒载体配备天然STRC亚型的大的5,515bp cDNA序列。该载体携带自灭活(SIN)架构，缺少天然地存在于长末端重复序列(LTR)中的增强子和启动子元件。这一设计通过降低插入性诱变的风险来提高安全性，并允许使用所选择的内部启动子(例如，前蛋白、肌球蛋白6、肌球蛋白7、肌球蛋白15或hcmv启动子)来驱动转基因表达。这里，选择myo7a启动子来介导转基因匣的高水平且持续的细胞类型特异性表达。为了在体外和体内应用时促进病毒载体颗粒制剂的滴定和对被成功转导的细胞的鉴定，将STRC cDNA经由内部核糖体进入位点(IRES)链接至dTomato报告基因，以产生慢病毒载体LV-SIN；如图4所示。表达dTomato的对应物仅用作参考和对照(LV-ctrl)，并且显示在图5中。

尽管STRC cDNA的大小具有挑战性，但使用分裂封装系统进行的瞬时生产成功地生成了慢病毒颗粒。LV滴度在足以进行体外和体内应用的范围内。

实施例3：慢病毒STRC构建体在Otic细胞系和柯蒂氏器培养物中表达

LV-SIN驱动STRC表达的能力在HEI-OC1 Otic细胞系中进行初始测试。MYO7A和dTomato在耳蜗源性细胞系HEI-OC1的体外转导时成功地表达，该细胞系是可获得的用于研究目的的少数几种小鼠声学细胞系之一。HEI-OC 1细胞可用于研究药物活化的凋亡途径、自噬、衰老、细胞保护机制、炎症响应、细胞分化、药理学药物的遗传和表观遗传学效应等。根据本文的技术，HEI-OC1细胞可用于评定基因构建体在听觉细胞中的表达。重要的是，HEI-OC1细胞内源地表达压力素(外毛细胞的一种重要的运动蛋白)。就此而言，HEI-OC 1细胞用作可用的体外声学模型。

评估载体功能性和转导内耳细胞的能力，使用所建立的毛细胞样细胞系HEI-OC1针对其体外效能对LV-SINLV-SIN进行测试(Kalinec等人(2003)A cochlear cell line asan in vitro system for drug ototoxicity screening.Audiol.Neurotol.)。

在转导前一天，将HEI-OC1细胞以3x10⁴每孔接种在24孔板中。收获三个孔进行计数以确定在转导时间点的细胞数，并且基于载体的滴度来计算病毒载体上清液的体积，以施加所定义的感染复数(MOI)，即，所定义的每个接种细胞的颗粒数。转导程序遵循如滴定下所述的相同方案。表达载体编码的dTomato受体蛋白的细胞的百分比通过流式细胞术进行评定，如滴定下所述。

使用胰蛋白酶辅助分离来收获细胞，并且通过以400xg离心5分钟来沉淀。将沉淀物重新悬浮在500μL固定缓冲液(Cat#420801,BioLegend,San Diego,CA,USA)中，并将细胞在室温孵育20分钟。将样品再次沉淀并且用1mL FACS缓冲液洗涤，然后进行三次在1x细胞内染色Perm洗涤缓冲液(Cat#421002,BioLegend)中重新悬浮和以400xg离心5分钟的循环。与一级抗体多克隆兔抗肌球蛋白VIIA(Catalog#25-6790,Proteus BioSciences Inc.,Ramona,CA,USA)一起以1:300稀释度在1x细胞内染色Perm洗涤缓冲液中在室温孵育20分钟，然后用1x细胞内染色Perm洗涤缓冲液洗涤两次。与二级抗体Alexa488AffiniPure驴抗兔IgG(H+L)(Catalog#711-545-152,Jackson ImmunoResearch EuropeLtd,Ely,UK)一起以1:800稀释度在1x细胞内染色Perm洗涤缓冲液中在室温在黑暗中孵育20分钟。用1x细胞内染色Perm洗涤缓冲液洗涤两次后，将细胞沉淀物重新悬浮在FACS缓冲液中，在CytoFLEX S流式细胞仪上处理并且使用CytExpert软件进行分析。

在以不同感染复数(MOI)转导(即，施加所定义的每个接种细胞的病毒载体颗粒数)后，在全部所测试的MOI，通过流式细胞分析在LV-SINLV-SIN与LV-ctrl之间没有观察到被成功转导的dTomato阳性细胞百分比方面的显著差异。图6A至6D是一系列散点图，显示HEI-OC1细胞中的dTom表达。特别地，表达载体编码的dTomato报告物和STRC蛋白的HEI-OC1细胞的百分比。针对在未转导的对照(NTC)和用LV-ctrl或LV-SIN在一系列不同MOI下转导的细胞中的dTom表达，在进行细胞内染色后进行流式细胞术分析。所显示的群体使用SSC-A/FSC-A特性针对活细胞进行预门控，然后根据FSC-A/FSC-H特性针对单细胞进行门控。图6A显示针对NTC的数据。图6B显示在MOI 1.277下的dTom表达。图6C显示在MOI 3.278下的dTom表达。图6D显示在MOI 10.279下的dTom表达。这证实编码大STRC cDNA的慢病毒载体的转导效率与较小载体相当。

经由免疫荧光显微镜或流式细胞术进行的可视化表明了非转导HEI-OC1细胞中的低水平内源性STRC表达，并且没有关于dTomato的信号(图6A至6D)。总之，尽管STRC转基因的尺寸很大，但可以产生完全功能的LV载体颗粒，该颗粒在耳靶细胞中成功转移和表达STRC。

实施例4：慢病毒STRC构建体在小鼠的内耳中表达

已经证实STRC可通过LV-STRC递送并且自其表达，研究了STRC在体内被适当地表达的能力。使用氯胺酮(150mg/kg)、利多卡因(6mg/kg)和乙酰丙嗪(2mg/kg)在氯化钠0.9％中的混合物的腹膜内(IP)注射，将16日龄的成年C57BL/6小鼠麻醉。制作耳后背侧切口，暴露后半规管。使用微钻孔创建小管切开术，暴露外淋巴管空间。然后，使用具有0.1μL刻度和36号针的Hamilton微量注射器注射1μL载体。用骨蜡将小管切开术密封，并且使动物复苏。

如上所述，将LV-SIN注射到野生型小鼠的内耳中，以评定LV-STRC驱动人STRC的体内表达的能力。如图7所示，STRC(如通过dTom表达所可视化的)在小鼠的内耳中强劲地表达。特别地，在内毛细胞(箭头)和外毛细胞(星号)中观察到了强劲表达。在对野生型小鼠没有不良影响的情况下，STRC的成功包装和有效体内递送的特征表明，LV-SIN是STRC相关遗传疾病的体内基因治疗的合适候选者。

图8显示假型LV-hcmv-dTom在成年小鼠内耳中的分布。将1x 10^6PU递送至P30C57Bl/6小鼠的后半规管。dTom的表达可见于全部毛细胞中以及螺旋神经节中，表明这一载体靶向STRC中的突变所靶向的细胞的能力。

实施例5：LV-SIN在恢复听力中的研究。

将LV-SIN注射到新生STRC^-突变小鼠内耳中。对用LV-GFP/dTom进行注射的经注射小鼠和对照小鼠进行分析，该分析可包括听力测试、细胞和分子研究以及长期效应。LV-SIN可以在细胞水平进行评定以确定其是否促进一月龄时的毛细胞存活。在用LV-GFP/dTom注射的对照突变耳中，预期在这一时间点将存在毛细胞的损失。相比之下，预期经LV-SIN注射的毛细胞将会存活。用于更好听力恢复的注射程序(耳蜗造口术、圆窗膜、小管切开术)和剂量。重要的是，可在成年(1至6月龄)小鼠中进行注射以评定听力恢复的可能性。成年注射结果将与新生小鼠结果进行比较，这提供关于其中干预仍然有效的时间窗的信息。

实施例6：对源自患者诱导多能干细胞(iPS)细胞的毛细胞的研究。

该研究的一个重要方面是证明本文所公开的技术对于人毛细胞可能是有效的。由于没有获得可用于该研究的人颞骨，使用患者成纤维细胞以及对照家族成员的成纤维细胞来从患者iPS细胞建立iPS细胞系。从具有最频繁突变的患者收获成纤维细胞，并且建立iPS细胞系。iPS细胞系分化为包括毛细胞在内的内耳细胞。使用培养系统，将LV-SIN用于感染iPS源性毛细胞。通过膜片钳技术针对存活和毛细胞转导对被感染的毛细胞进行研究。预期看见相对于未感染和未处理的对照毛细胞改善的毛细胞存活和毛细胞功能。该研究提供机会来评估LENTI-STRC感染在人毛细胞中的效率和STRC基因的表达。这一成就证明了LV-SIN可以治疗有缺陷的人毛细胞，这使其成为未来临床研究的重要一步。

序列表

<110> 援救听觉股份有限公司

<120> 用于治疗听力损失的基因疗法构建体和方法

<130> BN00002.0052

<150> US 63/188,857

<151> 2021-05-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5515

<212> DNA

<213> 人类

<400> 1

gccctgccct cacctggcta tcccacacag gtgagaataa ccagaactca cctccggtac 60

cagtgttcac ttggaaacat ggctctcagc ctctggcccc tgctgctgct gctgctgctg 120

ctgctgctgc tgtcctttgc agtgactctg gcccctactg ggcctcattc cctggaccct 180

ggtctctcct tcctgaagtc attgctctcc actctggacc aggctcccca gggctccctg 240

agccgctcac ggttctttac attcctggcc aacatttctt cttcctttga gcctgggaga 300

atgggggaag gaccagtagg agagccccca cctctccagc cgcctgctct gcggctccat 360

gattttctag tgacactgag aggtagcccc gactgggagc caatgctagg gctgctaggg 420

gatatgctgg cactgctggg acaggagcag actccccgag atttcctggt gcaccaggca 480

ggggtgctgg gtggacttgt ggaggtgctg ctgggagcct tagttcctgg gggcccccct 540

accccaactc ggcccccatg cacccgtgat gggccgtctg actgtgtcct ggctgctgac 600

tggttgcctt ctctgctgct gttgttagag ggcacacgct ggcaagctct ggtgcaggtg 660

cagcccagtg tggaccccac caatgccaca ggcctcgatg ggagggaggc agctcctcac 720

tttttgcagg gtctgttggg tttgcttacc ccaacagggg agctaggctc caaggaggct 780

ctttggggcg gtctgctacg cacagtgggg gcccccctct atgctgcctt tcaggagggg 840

ctgctccgtg tcactcactc cctgcaggat gaggtcttct ccattttggg gcagccagag 900

cctgatacca atgggcagtg ccagggaggt aaccttcaac agctgctctt atggggcgtc 960

cggcacaacc tttcctggga tgtccaggcg ctgggctttc tgtctggatc accaccccca 1020

ccccctgccc tccttcactg cctgagcacg ggcgtgcctc tgcccagagc ttctcagccg 1080

tcagcccaca tcagcccacg ccaacggcga gccatcactg tggaggccct ctgtgagaac 1140

cacttaggcc cagcaccacc ctacagcatt tccaacttct ccatccactt gctctgccag 1200

cacaccaagc ctgccactcc acagccccat cccagcacca ctgccatctg ccagacagct 1260

gtgtggtatg cagtgtcctg ggcaccaggt gcccaaggct ggctacaggc ctgccacgac 1320

cagtttcctg atgagttttt ggatgcgatc tgcagtaacc tctccttttc agccctgtct 1380

ggctccaacc gccgcctggt gaagcggctc tgtgctggcc tgctcccacc ccctaccagc 1440

tgccctgaag gcctgccccc tgttcccctc accccagaca tcttttgggg ctgcttcttg 1500

gagaatgaga ctctgtgggc tgagcgactg tgtggggagg caagtctaca ggctgtgccc 1560

cccagcaacc aggcttgggt ccagcatgtg tgccagggcc ccaccccaga tgtcactgcc 1620

tccccaccat gccacattgg accctgtggg gaacgctgcc cggatggggg cagcttcctg 1680

gtgatggtct gtgccaatga caccatgtat gaggtcctgg tgcccttctg gccttggcta 1740

gcaggccaat gcaggataag tcgtgggggc aatgacactt gcttcctaga agggctgctg 1800

ggcccccttc tgccctctct gccaccactg ggaccatccc cactctgtct gacccctggc 1860

cccttcctcc ttggcatgct atcccagttg ccacgctgtc agtcctctgt cccagctctt 1920

gctcacccca cacgcctaca ctatctcctc cgcctgctga ccttcctctt gggtccaggg 1980

gctgggggcg ctgaggccca ggggatgctg ggtcgggccc tactgctctc cagtctccca 2040

gacaactgct ccttctggga tgcctttcgc ccagagggcc ggcgcagtgt gctacggacg 2100

attggggaat acctggaaca agatgaggag cagccaaccc catcaggctt tgaacccact 2160

gtcaacccca gctctggtat aagcaagatg gagctgctgg cctgctttag tcctgtgctg 2220

tgggatctgc tccagaggga aaagagtgtt tgggccctgc agattctagt gcaggcgtac 2280

ctgcatatgc ccccagaaaa cctccagcag ctggtgcttt cagcagagag ggaggctgca 2340

cagggcttcc tgacactcat gctgcagggg aagctgcagg ggaagctgca ggtaccacca 2400

tccgaggagc aggccctggg tcgcctgaca gccctgctgc tccagcggta cccacgcctc 2460

acctcccagc tcttcattga cctgtcacca ctcatccctt tcttggctgt ctctgacctg 2520

atgcgcttcc caccatccct gttagccaac gacagtgtcc tggctgccat ccgggattac 2580

agcccaggaa tgaggcctga acagaaggag gctctggcaa agcgactgct ggcccctgaa 2640

ctgtttgggg aagtgcctgc ctggccccag gagctgctgt gggcagtgct gcccctgctc 2700

ccccacctcc ctctggagaa ctttttgcag ctcagccctc accagatcca ggccctggag 2760

gatagctggc cagcagcagg tctggggcca gggcatgccc gccatgtgct gcgcagcctg 2820

gtaaaccaga gtgtccagga tggtgaggag caggtacgca ggcttgggcc cctcgcctgt 2880

ttcctgagcc ctgaggagct gcagagccta gtgcccctga gtgatccaac ggggccagta 2940

gaacgggggc tgctggaatg tgcagccaat gggaccctca gcccagaagg acgggtggca 3000

tatgaacttc tgggtgtgtt gcgctcatct ggaggagcgg tgctgagccc ccgggagctg 3060

cgggtctggg cccctctctt ctctcagctg ggcctccgct tccttcagga gctgtcagag 3120

ccccagctta gagccatgct tcctgtcctg cagggaacta gtgttacacc tgctcaggct 3180

gtcctgctgc ttggacggct ccttcctagg cacgatctat ccctggagga actctgctcc 3240

ttgcaccttc tgctaccagg cctcagcccc cagacactcc aggccatccc taggcgagtc 3300

ctggtcgggg cttgttcctg cctggcccct gaactgtcac gcctctcagc ctgccagacc 3360

gcagcactgc tgcagacctt tcgggttaaa gatggtgtta aaaatatggg tacaacaggt 3420

gctggtccag ctgtgtgtat ccctggtcag cctattccca ccacctggcc agactgcctg 3480

cttcccctgc tcccattaaa gctgctacaa ctggattcct tggctcttct ggcaaatcga 3540

agacgctact gggagctgcc ctggtctgag cagcaggcac agtttctctg gaagaagatg 3600

caagtaccca ccaaccttac cctcaggaat ctgcaggctc tgggcaccct ggcaggaggc 3660

atgtcctgtg agtttctgca gcagatcaac tccatggtag acttccttga agtggtgcac 3720

atgatctatc agctgcccac tagagttcga gggagcctga gggcctgtat ctgggcagag 3780

ctacagcgga ggatggcaat gccagaacca gaatggacaa ctgtagggcc agaactgaac 3840

gggctggata gcaagctact cctggactta ccgatccagt tgatggacag actatccaat 3900

gaatccatta tgttggtggt ggagctggtg caaagagctc cagagcagct gctggcactg 3960

acccccctcc accaggcagc cctggcagag agggcactac aaaacctggc tccaaaggag 4020

actccagtct caggggaagt gctggagacc ttaggccctt tggttggatt cctggggaca 4080

gagagcacac gacagatccc cctacagatc ctgctgtccc atctcagtca gctgcaaggc 4140

ttctgcctag gagagacatt tgccacagag ctgggatggc tgctattgca ggagtctgtt 4200

cttgggaaac cagagttgtg gagccaggat gaagtagagc aagctggacg cctagtattc 4260

actctgtcta ctgaggcaat ttccttgatc cccagggagg ccttgggtcc agagaccctg 4320

gagcggcttc tagaaaagca gcagagctgg gagcagagca gagttggaca gctgtgtagg 4380

gagccacagc ttgctgccaa gaaagcagcc ctggtagcag gggtggtgcg accagctgct 4440

gaggatcttc cagaacctgt gccaaattgt gcagatgtac gagggacatt cccagcagcc 4500

tggtctgcaa cccagattgc agagatggag ctctcagact ttgaggactg cctgacatta 4560

tttgcaggag acccaggact tgggcctgag gaactgcggg cagccatggg caaagcaaaa 4620

cagttgtggg gtcccccccg gggatttcgt cctgagcaga tcctgcagct tggtaggctc 4680

ttaataggtc taggagatcg ggaactacag gagctgatcc tagtggactg gggagtgctg 4740

agcaccctgg ggcagataga tggctggagc accactcagc tccgcattgt ggtctccagt 4800

ttcctacggc agagtggtcg gcatgtgagc cacctggact tcgttcatct gacagcgctg 4860

ggttatactc tctgtggact gcggccagag gagctccagc acatcagcag ttgggagttc 4920

agccaagcag ctctcttcct cggcaccctg catctccagt gctctgagga acaactggag 4980

gttctggccc acctacttgt actgcctggt gggtttggcc caatcagtaa ctgggggcct 5040

gagatcttca ctgaaattgg caccatagca gctgggatcc cagacctggc tctttcagca 5100

ctgctgcggg gacagatcca gggcgttact cctcttgcca tttctgtcat ccctcctcct 5160

aaatttgctg tggtgtttag tcccatccaa ctatctagtc tcaccagtgc tcaggctgtg 5220

gctgtcactc ctgagcaaat ggcctttctg agtcctgagc agcgacgagc agttgcatgg 5280

gcccaacatg agggaaagga gagcccagaa cagcaaggtc gaagtacagc ctggggcctc 5340

caggactggt cacgaccttc ctggtccctg gtattgacta tcagcttcct tggccacctg 5400

ctatgagcct gtctctacag tagaaggaga ttgtggggag agaaatctta agtcataatg 5460

aataaagtgc aaacagaagt gcatcctgat tattttcaga agctgatgag gaata 5515

<210> 2

<211> 1775

<212> PRT

<213> 人类

<400> 2

Met Ala Leu Ser Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Phe Ala Val Thr Leu Ala Pro Thr Gly Pro His Ser Leu

20 25 30

Asp Pro Gly Leu Ser Phe Leu Lys Ser Leu Leu Ser Thr Leu Asp Gln

35 40 45

Ala Pro Gln Gly Ser Leu Ser Arg Ser Arg Phe Phe Thr Phe Leu Ala

50 55 60

Asn Ile Ser Ser Ser Phe Glu Pro Gly Arg Met Gly Glu Gly Pro Val

65 70 75 80

Gly Glu Pro Pro Pro Leu Gln Pro Pro Ala Leu Arg Leu His Asp Phe

85 90 95

Leu Val Thr Leu Arg Gly Ser Pro Asp Trp Glu Pro Met Leu Gly Leu

100 105 110

Leu Gly Asp Met Leu Ala Leu Leu Gly Gln Glu Gln Thr Pro Arg Asp

115 120 125

Phe Leu Val His Gln Ala Gly Val Leu Gly Gly Leu Val Glu Val Leu

130 135 140

Leu Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Pro Pro Thr Pro Thr Arg Pro Pro

145 150 155 160

Cys Thr Arg Asp Gly Pro Ser Asp Cys Val Leu Ala Ala Asp Trp Leu

165 170 175

Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Gly Thr Arg Trp Gln Ala Leu Val

180 185 190

Gln Val Gln Pro Ser Val Asp Pro Thr Asn Ala Thr Gly Leu Asp Gly

195 200 205

Arg Glu Ala Ala Pro His Phe Leu Gln Gly Leu Leu Gly Leu Leu Thr

210 215 220

Pro Thr Gly Glu Leu Gly Ser Lys Glu Ala Leu Trp Gly Gly Leu Leu

225 230 235 240

Arg Thr Val Gly Ala Pro Leu Tyr Ala Ala Phe Gln Glu Gly Leu Leu

245 250 255

Arg Val Thr His Ser Leu Gln Asp Glu Val Phe Ser Ile Leu Gly Gln

260 265 270

Pro Glu Pro Asp Thr Asn Gly Gln Cys Gln Gly Gly Asn Leu Gln Gln

275 280 285

Leu Leu Leu Trp Gly Val Arg His Asn Leu Ser Trp Asp Val Gln Ala

290 295 300

Leu Gly Phe Leu Ser Gly Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala Leu Leu His

305 310 315 320

Cys Leu Ser Thr Gly Val Pro Leu Pro Arg Ala Ser Gln Pro Ser Ala

325 330 335

His Ile Ser Pro Arg Gln Arg Arg Ala Ile Thr Val Glu Ala Leu Cys

340 345 350

Glu Asn His Leu Gly Pro Ala Pro Pro Tyr Ser Ile Ser Asn Phe Ser

355 360 365

Ile His Leu Leu Cys Gln His Thr Lys Pro Ala Thr Pro Gln Pro His

370 375 380

Pro Ser Thr Thr Ala Ile Cys Gln Thr Ala Val Trp Tyr Ala Val Ser

385 390 395 400

Trp Ala Pro Gly Ala Gln Gly Trp Leu Gln Ala Cys His Asp Gln Phe

405 410 415

Pro Asp Glu Phe Leu Asp Ala Ile Cys Ser Asn Leu Ser Phe Ser Ala

420 425 430

Leu Ser Gly Ser Asn Arg Arg Leu Val Lys Arg Leu Cys Ala Gly Leu

435 440 445

Leu Pro Pro Pro Thr Ser Cys Pro Glu Gly Leu Pro Pro Val Pro Leu

450 455 460

Thr Pro Asp Ile Phe Trp Gly Cys Phe Leu Glu Asn Glu Thr Leu Trp

465 470 475 480

Ala Glu Arg Leu Cys Gly Glu Ala Ser Leu Gln Ala Val Pro Pro Ser

485 490 495

Asn Gln Ala Trp Val Gln His Val Cys Gln Gly Pro Thr Pro Asp Val

500 505 510

Thr Ala Ser Pro Pro Cys His Ile Gly Pro Cys Gly Glu Arg Cys Pro

515 520 525

Asp Gly Gly Ser Phe Leu Val Met Val Cys Ala Asn Asp Thr Met Tyr

530 535 540

Glu Val Leu Val Pro Phe Trp Pro Trp Leu Ala Gly Gln Cys Arg Ile

545 550 555 560

Ser Arg Gly Gly Asn Asp Thr Cys Phe Leu Glu Gly Leu Leu Gly Pro

565 570 575

Leu Leu Pro Ser Leu Pro Pro Leu Gly Pro Ser Pro Leu Cys Leu Thr

580 585 590

Pro Gly Pro Phe Leu Leu Gly Met Leu Ser Gln Leu Pro Arg Cys Gln

595 600 605

Ser Ser Val Pro Ala Leu Ala His Pro Thr Arg Leu His Tyr Leu Leu

610 615 620

Arg Leu Leu Thr Phe Leu Leu Gly Pro Gly Ala Gly Gly Ala Glu Ala

625 630 635 640

Gln Gly Met Leu Gly Arg Ala Leu Leu Leu Ser Ser Leu Pro Asp Asn

645 650 655

Cys Ser Phe Trp Asp Ala Phe Arg Pro Glu Gly Arg Arg Ser Val Leu

660 665 670

Arg Thr Ile Gly Glu Tyr Leu Glu Gln Asp Glu Glu Gln Pro Thr Pro

675 680 685

Ser Gly Phe Glu Pro Thr Val Asn Pro Ser Ser Gly Ile Ser Lys Met

690 695 700

Glu Leu Leu Ala Cys Phe Ser Pro Val Leu Trp Asp Leu Leu Gln Arg

705 710 715 720

Glu Lys Ser Val Trp Ala Leu Gln Ile Leu Val Gln Ala Tyr Leu His

725 730 735

Met Pro Pro Glu Asn Leu Gln Gln Leu Val Leu Ser Ala Glu Arg Glu

740 745 750

Ala Ala Gln Gly Phe Leu Thr Leu Met Leu Gln Gly Lys Leu Gln Gly

755 760 765

Lys Leu Gln Val Pro Pro Ser Glu Glu Gln Ala Leu Gly Arg Leu Thr

770 775 780

Ala Leu Leu Leu Gln Arg Tyr Pro Arg Leu Thr Ser Gln Leu Phe Ile

785 790 795 800

Asp Leu Ser Pro Leu Ile Pro Phe Leu Ala Val Ser Asp Leu Met Arg

805 810 815

Phe Pro Pro Ser Leu Leu Ala Asn Asp Ser Val Leu Ala Ala Ile Arg

820 825 830

Asp Tyr Ser Pro Gly Met Arg Pro Glu Gln Lys Glu Ala Leu Ala Lys

835 840 845

Arg Leu Leu Ala Pro Glu Leu Phe Gly Glu Val Pro Ala Trp Pro Gln

850 855 860

Glu Leu Leu Trp Ala Val Leu Pro Leu Leu Pro His Leu Pro Leu Glu

865 870 875 880

Asn Phe Leu Gln Leu Ser Pro His Gln Ile Gln Ala Leu Glu Asp Ser

885 890 895

Trp Pro Ala Ala Gly Leu Gly Pro Gly His Ala Arg His Val Leu Arg

900 905 910

Ser Leu Val Asn Gln Ser Val Gln Asp Gly Glu Glu Gln Val Arg Arg

915 920 925

Leu Gly Pro Leu Ala Cys Phe Leu Ser Pro Glu Glu Leu Gln Ser Leu

930 935 940

Val Pro Leu Ser Asp Pro Thr Gly Pro Val Glu Arg Gly Leu Leu Glu

945 950 955 960

Cys Ala Ala Asn Gly Thr Leu Ser Pro Glu Gly Arg Val Ala Tyr Glu

965 970 975

Leu Leu Gly Val Leu Arg Ser Ser Gly Gly Ala Val Leu Ser Pro Arg

980 985 990

Glu Leu Arg Val Trp Ala Pro Leu Phe Ser Gln Leu Gly Leu Arg Phe

995 1000 1005

Leu Gln Glu Leu Ser Glu Pro Gln Leu Arg Ala Met Leu Pro Val

1010 1015 1020

Leu Gln Gly Thr Ser Val Thr Pro Ala Gln Ala Val Leu Leu Leu

1025 1030 1035

Gly Arg Leu Leu Pro Arg His Asp Leu Ser Leu Glu Glu Leu Cys

1040 1045 1050

Ser Leu His Leu Leu Leu Pro Gly Leu Ser Pro Gln Thr Leu Gln

1055 1060 1065

Ala Ile Pro Arg Arg Val Leu Val Gly Ala Cys Ser Cys Leu Ala

1070 1075 1080

Pro Glu Leu Ser Arg Leu Ser Ala Cys Gln Thr Ala Ala Leu Leu

1085 1090 1095

Gln Thr Phe Arg Val Lys Asp Gly Val Lys Asn Met Gly Thr Thr

1100 1105 1110

Gly Ala Gly Pro Ala Val Cys Ile Pro Gly Gln Pro Ile Pro Thr

1115 1120 1125

Thr Trp Pro Asp Cys Leu Leu Pro Leu Leu Pro Leu Lys Leu Leu

1130 1135 1140

Gln Leu Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ala Asn Arg Arg Arg Tyr Trp

1145 1150 1155

Glu Leu Pro Trp Ser Glu Gln Gln Ala Gln Phe Leu Trp Lys Lys

1160 1165 1170

Met Gln Val Pro Thr Asn Leu Thr Leu Arg Asn Leu Gln Ala Leu

1175 1180 1185

Gly Thr Leu Ala Gly Gly Met Ser Cys Glu Phe Leu Gln Gln Ile

1190 1195 1200

Asn Ser Met Val Asp Phe Leu Glu Val Val His Met Ile Tyr Gln

1205 1210 1215

Leu Pro Thr Arg Val Arg Gly Ser Leu Arg Ala Cys Ile Trp Ala

1220 1225 1230

Glu Leu Gln Arg Arg Met Ala Met Pro Glu Pro Glu Trp Thr Thr

1235 1240 1245

Val Gly Pro Glu Leu Asn Gly Leu Asp Ser Lys Leu Leu Leu Asp

1250 1255 1260

Leu Pro Ile Gln Leu Met Asp Arg Leu Ser Asn Glu Ser Ile Met

1265 1270 1275

Leu Val Val Glu Leu Val Gln Arg Ala Pro Glu Gln Leu Leu Ala

1280 1285 1290

Leu Thr Pro Leu His Gln Ala Ala Leu Ala Glu Arg Ala Leu Gln

1295 1300 1305

Asn Leu Ala Pro Lys Glu Thr Pro Val Ser Gly Glu Val Leu Glu

1310 1315 1320

Thr Leu Gly Pro Leu Val Gly Phe Leu Gly Thr Glu Ser Thr Arg

1325 1330 1335

Gln Ile Pro Leu Gln Ile Leu Leu Ser His Leu Ser Gln Leu Gln

1340 1345 1350

Gly Phe Cys Leu Gly Glu Thr Phe Ala Thr Glu Leu Gly Trp Leu

1355 1360 1365

Leu Leu Gln Glu Ser Val Leu Gly Lys Pro Glu Leu Trp Ser Gln

1370 1375 1380

Asp Glu Val Glu Gln Ala Gly Arg Leu Val Phe Thr Leu Ser Thr

1385 1390 1395

Glu Ala Ile Ser Leu Ile Pro Arg Glu Ala Leu Gly Pro Glu Thr

1400 1405 1410

Leu Glu Arg Leu Leu Glu Lys Gln Gln Ser Trp Glu Gln Ser Arg

1415 1420 1425

Val Gly Gln Leu Cys Arg Glu Pro Gln Leu Ala Ala Lys Lys Ala

1430 1435 1440

Ala Leu Val Ala Gly Val Val Arg Pro Ala Ala Glu Asp Leu Pro

1445 1450 1455

Glu Pro Val Pro Asn Cys Ala Asp Val Arg Gly Thr Phe Pro Ala

1460 1465 1470

Ala Trp Ser Ala Thr Gln Ile Ala Glu Met Glu Leu Ser Asp Phe

1475 1480 1485

Glu Asp Cys Leu Thr Leu Phe Ala Gly Asp Pro Gly Leu Gly Pro

1490 1495 1500

Glu Glu Leu Arg Ala Ala Met Gly Lys Ala Lys Gln Leu Trp Gly

1505 1510 1515

Pro Pro Arg Gly Phe Arg Pro Glu Gln Ile Leu Gln Leu Gly Arg

1520 1525 1530

Leu Leu Ile Gly Leu Gly Asp Arg Glu Leu Gln Glu Leu Ile Leu

1535 1540 1545

Val Asp Trp Gly Val Leu Ser Thr Leu Gly Gln Ile Asp Gly Trp

1550 1555 1560

Ser Thr Thr Gln Leu Arg Ile Val Val Ser Ser Phe Leu Arg Gln

1565 1570 1575

Ser Gly Arg His Val Ser His Leu Asp Phe Val His Leu Thr Ala

1580 1585 1590

Leu Gly Tyr Thr Leu Cys Gly Leu Arg Pro Glu Glu Leu Gln His

1595 1600 1605

Ile Ser Ser Trp Glu Phe Ser Gln Ala Ala Leu Phe Leu Gly Thr

1610 1615 1620

Leu His Leu Gln Cys Ser Glu Glu Gln Leu Glu Val Leu Ala His

1625 1630 1635

Leu Leu Val Leu Pro Gly Gly Phe Gly Pro Ile Ser Asn Trp Gly

1640 1645 1650

Pro Glu Ile Phe Thr Glu Ile Gly Thr Ile Ala Ala Gly Ile Pro

1655 1660 1665

Asp Leu Ala Leu Ser Ala Leu Leu Arg Gly Gln Ile Gln Gly Val

1670 1675 1680

Thr Pro Leu Ala Ile Ser Val Ile Pro Pro Pro Lys Phe Ala Val

1685 1690 1695

Val Phe Ser Pro Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ala

1700 1705 1710

Val Ala Val Thr Pro Glu Gln Met Ala Phe Leu Ser Pro Glu Gln

1715 1720 1725

Arg Arg Ala Val Ala Trp Ala Gln His Glu Gly Lys Glu Ser Pro

1730 1735 1740

Glu Gln Gln Gly Arg Ser Thr Ala Trp Gly Leu Gln Asp Trp Ser

1745 1750 1755

Arg Pro Ser Trp Ser Leu Val Leu Thr Ile Ser Phe Leu Gly His

1760 1765 1770

Leu Leu

1775

<210> 3

<211> 19238

<212> DNA

<213> 人类

<400> 3

gccctgccct cacctggcta tcccacacag gtgagaataa ccagaactca cctccggtac 60

cagtgttcac ttggaaacat ggctctcagc ctctggcccc tgctgctgct gctgctgctg 120

ctgctgctgc tgtcctttgc aggtaagaag aacagtgagc agaactgggg atgaggagga 180

gggtggctgg aaaaagactt taagaatatg gaggtgaacc tgttagatag aaggacaaag 240

gagagaggca gagacttgtg caaaagggaa aaatgagggt taagaaaagc aggccaagac 300

ttactgtagg ccagtgaaag gggttcagct caccatcccc tcacctcatc tttagatcca 360

ggtagggaac tgtgctcagg ggcagggttg agtttgggct ctgtgttcct ctccttcagt 420

gacctctggt ttctctcctt acagtgactc tggcccctac tgggcctcat tccctggacc 480

ctggtctctc cttcctgaag tcattgctct ccactctgga ccaggctccc cagggctccc 540

tgagccgctc acggttcttt acattcctgg ccaacatttc ttcttccttt gagcctggga 600

gaatggggga aggaccagta ggagagcccc cacctctcca gccgcctgct ctgcggctcc 660

atgattttct agtgacactg agaggtagcc ccgactggga gccaatgcta gggctgctag 720

gggatatgct ggcactgctg ggacaggagc agactccccg agatttcctg gtgcaccagg 780

caggggtgct gggtggactt gtggaggtgc tgctgggagc cttagttcct gggggccccc 840

ctaccccaac tcggccccca tgcacccgtg atgggccgtc tgactgtgtc ctggctgctg 900

actggttgcc ttctctgctg ctgttgttag agggcacacg ctggcaagct ctggtgcagg 960

tgcagcccag tgtggacccc accaatgcca caggcctcga tgggagggag gcagctcctc 1020

actttttgca gggtctgttg ggtttgctta ccccaacagg ggagctaggc tccaaggagg 1080

ctctttgggg cggtctgcta cgcacagtgg gggcccccct ctatgctgcc tttcaggagg 1140

ggctgctccg tgtcactcac tccctgcagg atgaggtctt ctccattttg gggcagccag 1200

agcctgatac caatgggcag tgccagggag gtgagtgtgg ccagggctgg gactgggatg 1260

tggcagggca aggaaagtga aattggggta gttttcttcc ttactctttc cctcctaggt 1320

aaccttcaac agctgctctt atggtaagta acaggagacc agttctgagg gattgggcct 1380

ggaaaatctg gaggtgaaga gctgaagacc tcagcctcta gagaggaaaa ctgatgggag 1440

gagtgtagtt tagtggtttt ggggtgtgac tgtctgggtt ggtgtcccag ctccacctct 1500

tcctagccat atgaccttga gcaggttaca tagtctttct atacctcagt ttccccattt 1560

ataaaatgag aatgataata ttagttacca cagagttgtt gcacccggtt aaatgagttg 1620

atactgtgta tgcaaacgac ttaaaaccgt gctggcacat agcgcttaat aatgttagct 1680

agtaaagatg ggatttggaa aataaggaca cagctggatt cctctacccc cttactactt 1740

cagtacaaca atgccagaca gtagttagac atattgagtt gctgagcaga tttcctaaca 1800

tgaggcccgc tgagggttgt gtttaagcta tctaaaagca tacgaagaaa ggagacagaa 1860

gggggccagg tggacagaaa gaattccaac tggggcttct cctaggtgat tttggacctt 1920

ggcagggcag ctttctcttt tttgccccgt tgcagcattt caaccagtaa cgcctaaact 1980

ctcagggacc tcgcttgtag aaaagcctat gcttgccatg ccccttgagg gctctgagtc 2040

agggtcagaa tcttcagctg gaggaaatgt gaactgacca gatcctgcct gctcctccct 2100

ctgcacccag gggcgtccgg cacaaccttt cctgggatgt ccaggcgctg ggctttctgt 2160

ctggatcacc acccccaccc cctgccctcc ttcactgcct gagcacgggc gtgcctctgc 2220

ccagagcttc tcagccgtca gcccacatca gcccacgcca acggcgagcc atcactgtgg 2280

aggccctctg tgagaaccac ttaggcccag caccacccta cagcatttcc aacttctcca 2340

tccacttgct ctgccagcac accaagcctg ccactccaca gccccatccc agcaccactg 2400

ccatctgcca gacagctgtg tggtatgcag tgtcctgggc accaggtgcc caaggctggc 2460

tacaggcctg ccacgaccag tttcctgatg agtttttgga tgcgatctgc agtaacctct 2520

ccttttcagc cctgtctggc tccaaccgcc gcctggtgaa gcggctctgt gctggcctgc 2580

tcccaccccc taccagctgc cctgaaggcc tgccccctgt tcccctcacc ccagacatct 2640

tttggggctg cttcttggag aatgagactc tgtgggctga gcgactgtgt ggggaggcaa 2700

gtctacaggc tgtgcccccc agcaaccagg cttgggtcca gcatgtgtgc cagggcccca 2760

ccccagatgt cactgcctcc ccaccatgcc acattggacc ctgtggggaa cgctgcccgg 2820

atgggggcag cttcctggtg atggtctgtg ccaatgacac catgtatgag gtcctggtgc 2880

ccttctggcc ttggctagca ggccaatgca ggataagtcg tgggggcaat gacacttgct 2940

tcctagaagg gctgctgggc ccccttctgc cctctctgcc accactggga ccatccccac 3000

tctgtctgac ccctggcccc ttcctccttg gcatgctatc ccagttgcca cgctgtcagt 3060

cctctgtccc agctcttgct caccccacac gcctacacta tctcctccgc ctgctgacct 3120

tcctcttggg tccaggggct gggggcgctg aggcccaggg gatgctgggt cgggccctac 3180

tgctctccag tctcccagac aactgctcct tctgggatgc ctttcgccca gagggccggc 3240

gcagtgtgct acggacgatt ggggaatacc tggaacaaga tgaggagcag ccaaccccat 3300

caggctttga acccactgtc aaccccagct ctggtataag caagatggag ctgctggcct 3360

gctttagtgt gagtgctctg ccagagggaa agctcctaga acagtgagaa ggccctccag 3420

gggaattcct cgaatactca gaggcagtag tgtggggtag tagttgaagc acacagctct 3480

agagtcagac aggcttggat tcatatcttg gttctgtgac cagccttgaa tgagttattt 3540

aacttctctg agcaatattt ttctcgtctc atttataaac tagggatgat aatggtatat 3600

gagataatac atgctgtggg cttagcacag tgcatgatac acaaacatgc aataaatatt 3660

accttgttat tcttttgggc tctttgactc tctcactttc tgcaccagaa agaaaaagga 3720

tcaagttaga ggactctaaa tttttcccct agagagtgag aattggaggc tggcagaata 3780

caggaagata aggtaggaat gagaaagatt cagggacact accaatcaga agactttggt 3840

tctaggttca actgtgccac aaattagtgt gatcttaggc aagcaatttc atttagtttt 3900

tctgggcttc agtttttagt ctgtagaatg gaggggtgag aatatgttaa acaccataat 3960

taattcactg agtgcctatt atatgcaagg cactttgcta ggttctgtag gatatataaa 4020

gatttcttac tccatgttgg ggccaccttt ttcaaaccct gggcccagta aaatggaatt 4080

agatagtctc atagtatttg gttcaggtct acaagtatta attgagccaa ctatggacct 4140

ggcatgggag agggtacaag agaaattaga gatatgatcc cggacctaaa agagcttaat 4200

atctgaagaa tcacacttga gatgatggac aagcatccca gcaagtggag ctggaatgcc 4260

tgggggagct gcaggagaga cagagaagac agctctgttg gcatattgtc tttcttccca 4320

ccagcctgtg ctgtgggatc tgctccagag ggaaaagagt gtttgggccc tgcagattct 4380

agtgcaggta acaggtggag ggcacatggg tgggctgggt gacagccatg gctggaggtc 4440

cctgccccgt gaggtgaggc catacccacc atgacctcct attcgcaggc gtacctgcat 4500

atgcccccag aaaacctcca gcagctggtg ctttcagcag agagggaggc tgcacagggc 4560

ttcctgacac tcatgctgca ggggaagctg caggggaagc tgcaggtgag cactgagaaa 4620

ggggagcaag ggcacctgga gcctagtgtt cagagggctt gctttagtgg gaggaggaac 4680

tccagagagg aaatggcagg gatactgagc atctccagag gcagaatcca ttcctgtgcc 4740

cctacaggta ccaccatccg aggagcaggc cctgggtcgc ctgacagccc tgctgctcca 4800

gcggtaccca cgcctcacct cccagctctt cattgacctg tcaccactca tccctttctt 4860

ggctgtctct gacctgatgc gcttcccacc atccctgtta gccaacgaca gtgtgtaagg 4920

ttcttgcact actcctcctg ctcctgtcac ggtcaggcca accgcatcca cctggagcag 4980

ccccttccgg agctcctctc tgtttttttc tttcatgcca gataggcaat gtgccaacat 5040

cgtagcaagg tttgagagag gcacatctca cgcctgagtg tgaaaaccca atcattatgc 5100

taatgaacta caaaaggatc agagagctcc tctctattaa aaccagggag aggatgggcg 5160

tggtggctca tgcctgtaat cccagcacgt tgggagcccg aggcaggtgg atcactaggt 5220

ccgcctagtg agttcgagac cagcctggcc aatatggtga aaccccgtct ctattaaact 5280

acaaaaatta gccaggcatg gtggtgggcg cttgtagtcc cagttactct ggaggctgag 5340

gcaggaggat agcttgaacc tgggaggcag aggttgcagt gaaccaagat cgtgccactg 5400

cactccagcc tgggtgacag agcgagactc cgtcttaaaa aaaacaaaaa acaaaacaaa 5460

acaaaaaaac agggagagtc tccttcctat ctagacagca gggctacaga gggtcagagg 5520

aaaacagttt ggaggaagac aaagggttaa gacccatgac tcctcgcagc ctggctgcca 5580

tccgggatta cagcccagga atgaggcctg aacagaagga ggctctggca aagcgactgc 5640

tggcccctga actgtttggg gaagtgcctg cctggcccca ggagctgctg tgggcagtgc 5700

tgcccctgct cccccacctc cctctggaga actttttgca gctcagccct caccaggtat 5760

gagaatcatc ttctttactt gactggccca tcttctgcta gtggggacaa agagtcaatg 5820

gcatgtctct cagtggcccc tccctgcaag aaccctatag tgaccccagt gcgagctaac 5880

cttccccatc tcagatccag gccctggagg atagctggcc agcagcaggt ctggggccag 5940

ggcatgcccg ccatgtgctg cgcagcctgg taaaccagag tgtccaggat ggtgaggagc 6000

aggtacgcag gtgagttgtt gtgggatcag taaccaaggc aagagtggaa gaggtagaga 6060

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agtggtgtag tgtcagagtg cccagtgtat gtacccatac catctgctgc caggcctgcc 6240

ttagtgctag tcttggggac cacacaaagg tcagcttcat gccctcctca ggcttgggcc 6300

cctcgcctgt ttcctgagcc ctgaggagct gcagagccta gtgcccctga gtgatccaac 6360

ggggccagta gaacgggggc tgctggaatg tgcagccaat gggaccctca gcccagaagg 6420

acgggtgagc ccctcagcac aagcctacaa gactttaggc ttcccctggg tctgtgtgga 6480

tggctttccc attgtgtcaa cttgagcaca gtggtgccag cccccatccc acttttgcaa 6540

cctccattcc ttactccatg gccattctta cctgttacca cctcttcctg gcccttctct 6600

atctggtctg tagcacccca aacataccct ttgccatttt gaacctaatc tactccagtc 6660

caatccctag ttccaaaccc tagcccaggc cctgggaaat tcagatgtgg gattagagag 6720

gaagttcaag gttcatctgt cttttctctc cagtcctaaa ccttctttgg ttacaggtgg 6780

catatgaact tctgggtgtg ttgcgctcat ctggaggagc ggtgctgagc ccccgggagc 6840

tgcgggtctg ggcccctctc ttctctcagc tgggcctccg cttccttcag gagctgtcag 6900

agccccagct tagagccatg cttcctgtcc tgcagggaac tagtgttaca cctgctcagg 6960

tttgcctgtc tcactccctg gcatgtaccc tccatccccg cttgagcccc agtcaagaga 7020

atcccattca gggataaaag cagcccctcc tttccctggg tgaacagtag aggtaaactc 7080

tgtctgcagg aggacgcctt cattcccttt cctcagatca agaagggacc tgagtcactg 7140

aggatggtta ctagggatgg ttaagaggca gcgggaagtt ttggagggtt tgccttagga 7200

acccacttag gacctggctg ctgggtcctg agagctgttg ttttcggtcc catcccaaca 7260

caggctgtcc tgctgcttgg acggctcctt cctaggcacg atgtgagtag cagcaacttc 7320

tcagcctccc gccagaggtc tctatcctct tttaacctgg ctcctgcatc tgcccctcct 7380

ctctctccgc tcccctcata cttactgcct tgctgcattg tgattgttgt cttccccaac 7440

acccttccct tcttcttcag gcctcttgtc tctcttgctc tttagctatc cctggaggaa 7500

ctctgctcct tgcaccttct gctaccaggc ctcagccccc agacactcca ggccatccct 7560

aggcgagtcc tggtcggggc ttgttcctgc ctggcccctg aactgtcacg cctctcagcc 7620

tgccagaccg cagcactgct gcagaccttt cgggtatgag agtggcaagg aggatgagat 7680

aatcagggat accggctctt tctggttggg aggaaggcat cttccctgag gccagggaag 7740

gcctttcata cctccccact tacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 7800

accaattctc atgcaggtta aagatggtgt taaaaatatg ggtacaacag gtgctggtcc 7860

agctgtgtgt atccctggtc aggtaagtgt gagatctccc aactgagctc ctctccccat 7920

tctggggcag tttcatatgg ctggtgctac ctcccacact accctgcagt ggccctgaga 7980

gttctggtta gctctgtgcc cattagcagc cctccccagt gccagatgca ggacagcatg 8040

atccactcac attgtcctag actaatgtca aagctggaag ggcctgagaa atcttccagg 8100

ccacccaccc tgctttcaga tgaaaagacc aaggctggga gaagctaagg gactttgttt 8160

gcctggtgcc taactagcag caacacttga ccacagcagc ctgcagtgtg aggctcttag 8220

gcgtttattg ctacagtggc aaatgccatt ccacttctgt cctagctttg gtccctttcc 8280

acccccatgg ttccttttct ctgagtgcta agtacagact ctctcaccta tcactacact 8340

gctataccca tcaccgccag cagcctattc ccaccacctg gccagactgc ctgcttcccc 8400

tgctcccatt aaagctgcta caactggatt ccttggctct tctggcaaat cgaagacgct 8460

actgggagct gccctggtct gagcagcagg taattctccc cacttaattt cagaacttcc 8520

tccctcaatg tagtctacct tctttaccta tcccttagcc ctatttggcc agcttatccc 8580

tactatcctt tatttgattg tttgagatac agtctcactc tgttgcccag gctgcagtgc 8640

agtggcatga tcagagttcg ctgtaacctc aaactcctga gctcaggcaa tctttctgcc 8700

tcagcctcct gaatagctag gacgacaggt ggttaccacc atgcctggct aatttttaaa 8760

tttttttttt gttttttgag atgaagtctt gctctgtcac ccaggcttga gtacagtggc 8820

acaagcttgg ctcactgcaa cctctgtctc ccgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc 8880

tcccgagtag ctgggactac aggcactccc cacaatgcct ggctaatttt ttttttgttt 8940

tagtagagac agggtttcac catattggcc aggctggtct cgaactgctg accttgtgat 9000

ctgcctgcct ctgcctctca aagtgctggg attacaggtg tgagccacca tgcccggcca 9060

atttttaaat tttttgtaga gacagacaat acaaaaatgt ggacactatg tggagacact 9120

atgttgaggt actatgctgt ccagattggt cttgaactcc tggcctcaag caatcctcct 9180

gccttggcct cccaaagtgc tgggattaca gacctgagcc actgcaccca gccccctagt 9240

atctcttata atgtgacttg cttttctttt tctttctcct tcccttttct ttcatttctt 9300

tctcactctc gagagaagag tgggcatctg ggagagtggg aggctggtgg gtcccacaga 9360

gtgaggaggc aggactgggt ccaaggcagt cctgcctctc cactctaggg ggtatccttg 9420

gacagtgtct cttctgggaa ggggctcgtc tttctttctc ttgtaggcac agtttctctg 9480

gaagaagatg caagtaccca ccaaccttac cctcaggaat ctgcagtgag taacttgtgt 9540

tgagcagtgc gctgaattcg accaacattt ttttgagtgc ttactatgtg ccaggcacca 9600

tgtgatatgg aatgggggat atagggatga atgatgcata gtccctgcct cgtggacgtt 9660

ctcctagcac ctccctttgc cctcctttcc ttccacagtg ccatgcctat cctgactaga 9720

gccaaaggac tcagaaaacc tggattcagg ttccagtcct gtcacctact tgtcctcttg 9780

ggcaagtcat ttaacgtccc tgtgtcagtt ttcccttctt taaatgagaa ttacaatggc 9840

accagcctca taggtagtta ctgtgaagat taaatgaggt aggtcatgta agatatttaa 9900

cacagtgttt ggtccattgt aaagtcccag tagtcatttg ctactgttag tttacttcag 9960

gatgacttca gaggcactgg ccaagcaaga ataaatagga ataagaaggt atcactttac 10020

ttacacccac attagaagaa caatgggctt cagaatcttt tttttttttt ttttttcgag 10080

acagtcttgc tctgttgccc aggctggagt gcagtggcgc gatttcggct cactgcaacc 10140

tctgcctccc aggttcaagc gattctcctg tctcagcctc tggagtagct gggattacag 10200

gaatgtgcca ccatacccag ctaatttttg tatttttagt agagatgggg tttcaccatt 10260

ttggccaggc tggtctcaaa ctcctgacct caggtgatcc acccgcctca gcctcccaag 10320

ggcttcagaa tctaagacat ggctctagtt tcagtttacc acatttctag cagaatgatg 10380

ttgggaatgt cacctgactt ccataaatcc ttattttctc ctctgataaa cagcagtgat 10440

gttatgggga gctgatgaga tatctatgta aaaacatttc tcaaaccata aattacggtg 10500

gatgaacatc tgtacttgtg ttgagagtac tgatatcaag gagcaaacag gctgttgtat 10560

gtgttgaatg agcctctccc cactcacaca cccacagggc tctgggcacc ctggcaggag 10620

gcatgtcctg tgagtttctg cagcagatca actccatggt agacttcctt gaagtggtgc 10680

acatgatcta tcagctgccc actagagttc gagggagcct ggtgagaggg ggtgcctgga 10740

ctttagtggg agcagggagg ctgggaccct aggtatagaa cccagctcct atgttctgct 10800

ctggcctcac actgcttccc tacagagggc ctgtatctgg gcagagctac agcggaggat 10860

ggcaatgcca gaaccagaat ggacaactgt agggccagaa ctgaacgggc tggatagcaa 10920

gctactcctg gacttaccgt aagtactgca gctagagata ttggcccctc agaaagctca 10980

atctggggtg aagatctgcc cttagggaat gccctggagg aggtagtttt tctgtctggt 11040

agttccctga cataatttat agcccaaagc agaggatttt attcaaagtt gctctatgta 11100

ttgactggtt cccagaatat gctccagcac agggcagctg agggtggcaa cactgtattg 11160

aagcctgcca agtaatctta caataaccta gtccacatta attgagattg agacagagca 11220

tctgaagtga gggaggcaat gctccaaatc tgccccagag gattgtagtt tgctcagggc 11280

actgtgttct tagtgcattc agaggagtag atcgagagaa aaatatatga aaaatgtgat 11340

aaataccttc aaatacctga ggggctatca agtagaaatt agattgtcat atttatgagt 11400

ggccccattg ggcaagacta agagtagtta acggagatca gatttttaca tagtataaga 11460

aaaactaagg tagtgagttc ctggtccttg gagctgttcg agcctaagcc agatggcccc 11520

atggcaggaa tgttgtagag cacgttcata tacaggttgt gggaagaaaa ggctatagga 11580

acccaaggct cctccctacc catggagaaa tttattagta tgttactcat atgctgcttt 11640

tctcatttta cccctaccac caccccgttg ccatccgcac tgtaagtcag gataggaaaa 11700

tgctggtgtt acagtcttcc tggggaatat ggagctgaag tggagtaaaa gcagttgact 11760

tcattcctac ttttttcttt tttttctttt tttttttttt tgagacagag ttttgctgtg 11820

tcaccaaggc tggagtgcag tgacgtgatc tcggctcact gcaacctcca tcttccaggt 11880

tcaagcaatt ctcctgcctc agtctcccga gtagctggga ctgtaggtgt gcaccaccat 11940

gccaggctaa tttttgtatt tgttgtaggg acgagctttc accatgttgg ccaggctggt 12000

cttgaactcc tggcttcaag tgatctgccc acctcggctt cccaacattc ttatattttt 12060

ataggccttt ccacagattt cagctcttgt atgacttagc ccagttccag aactggtaat 12120

cctaggtagg gtacaggtta tcacctctga tttcgggtaa aagggattta tttatttatt 12180

tgtttattta tttatatttt tgagacagag tctcgctctg tcacccaggc tggagtgcaa 12240

tggtgccatc tcggctcact gcaacctctc cctctggggt tcaagcaatt ctcctgcctc 12300

agcctgctga gtagctggga ttacaggcgc gtgccaccac acccggctaa tttttgcatt 12360

tttagtagag acggggtttc accatgttgc tcagggtggt ctcgaatttc tgaccctgtg 12420

atctgcctgc ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac tgcgtccggc 12480

ctgtttttac ttttttttaa tgccattcag atctgtttaa atatgtgggt tctgtgagat 12540

aatttagaat cccaaggtta cagatgaggt gaaagatcct agaccatgca tcaaaaaact 12600

tgagtttctc atttgtgaaa gaaggataag agaaacacct attttgtctg ggtgcagtgg 12660

ctcatgccta taatcccagc atttggggag gccaaggtgg gtggatcacg gaggtcaggt 12720

gttcaagacc agactggcca acatggcaaa acaccatctc tactaaaaat acaaaagtta 12780

gctgggcgtg gtggcacgtg cgtgtaattc cagctattcg ggaggctgag gcacgagaat 12840

tgcttgaacc tgggaggtgc gggttgcagt gaactgagat cgcagcacca ctgtgctcca 12900

gcctgagtga tggagtgagg ccaggtcttg ttgtaggatc aaatgagata acacctgaaa 12960

gaactttgta aattgtatag cacgtacaaa caagaaggga cctcttcaca agcagaggaa 13020

gggtggtcct gtggaaaaaa acgggaattg ggagtgagag acctcaacat ttgatctctg 13080

tgaacctcag ttttttaatc tataaaatgg ggaaatgtta atggtactta atatttggag 13140

cttttgagtc cattagatca ggtaggattg ttcgttattt ttttttttta ggaagactag 13200

aaatatgttg ctcccttttt ctcccccact caagcttgat ggtgggaatt ggccctggag 13260

ctgtttacta tcagttcctg tccagcttca ctaaatttgg tctggggtca catcttagct 13320

gcggactgtg gggttttgtg gtcccttctc gacttggccc agctccacct gaatcctgtt 13380

gttgtcaaat tgctgtaata ggatccagtt gatggacaga ctatccaatg aatccattat 13440

gttggtggtg gagctggtgc aaagagctcc agagcagctg ctggcactga cccccctcca 13500

ccaggcagcc ctggcagaga gggcactaca aaacctggta agagtccacc ctaccagact 13560

cagatttgct gccctgggca attcttgctc ctcagacaat gctctctgac tgtcccccaa 13620

ccctctactt cttgctttct tgctgccaaa cagattcctg tctacaaggc ctggcccctg 13680

ttttgcctct gggttctgtt ccttgataat atgcttcacg ttacttgtcc atacctcttg 13740

gagtccgaga aatctcttgg agtccacctc tcagtctttc tgcctgctcc tatctgggct 13800

cattgcttaa ggaagtgaac aaaggtagtg agcatcatag ggtgctgagc tgggagcagg 13860

agggagggaa ggttaggggg cttggtgtct tgatcaaggt gtctggtatt ctgagtcaga 13920

agtgcattgt ccaagttctg atgctcttct ccaggctcca aaggagactc cagtctcagg 13980

ggaagtgctg gagaccttag gccctttggt tggattcctg gggacagaga gcacacgaca 14040

gatcccccta cagatcctgc tgtcccatct cagtcagctg caaggcttct gcctaggaga 14100

gacatttgcc acagagctgg gatggctgct attgcaggag tctgttcttg ggtatggacc 14160

ttcgagaact tcagattcta actcattcta tacccagtcc ctcagccacc atcatcagtg 14220

gcagcctgtt ccatattctt aaggtcccct ggagccctgt gtccgaaatc ctagcatgtc 14280

ctcttttccc cttccttttc ctcacagttc cctcagctcc ccagcccccg attttcttcc 14340

tgtccccagg aaaccagagt tgtggagcca ggatgaagta gagcaagctg gacgcctagt 14400

attcactctg tctactgagg caatttcctt gatccccagg gtgagatgaa ggaagaaggg 14460

aagggagtaa atgcatagag gggactggtg agctggttat ggggacccgt ggccaaagag 14520

ggcaaaggat atgaagccta gatctggggg gagactgcaa aacagagaca ggactttgga 14580

cttagagcta tagcagcagg tcctgatctg tccagatctc cccactctcc ttctaccttc 14640

tcatgcagga ggccttgggt ccagagaccc tggagcggct tctagaaaag cagcagagct 14700

gggagcagag cagagttgga cagctgtgta gggagccaca gcttgctgcc aagaaagcag 14760

ccctggtagc aggggtggtg cgaccagctg ctgaggatct tccaggtgaa actacccaaa 14820

tacttatatg tccagcagga tgtacaggga gtatcaaacg gtctgggttc tacatgtgct 14880

cttccctggg actgggtttt ctaatttata aagcaaagag tttagaggga tgatcttcaa 14940

gcctcttgta gttctagaat tctgtagttc tgggagtttg taaactatta agttttcttt 15000

tagcccagaa cttccatttt cctgctctct cgtgtctgct ctagactcag ctctagctcg 15060

gctaagtgtg gagctctctg ctggggagat ccctagaagc tttgaaggag acattgtgag 15120

gctggagaac tgggttcaaa ttcagtgcta ccattaaatc tctgaataac atcctcagtc 15180

ttccatctat aaaagtcttg gcatctccaa tcacttcttg ttctattatc tcctaagccc 15240

tatacatatt actctgtaat actcctttga tccctatttc tcacagtgct ctatcctcca 15300

aaggttggaa gactcactct atctacagat atctctctgg gcatatttta ttactgcgct 15360

gacctcctgg ccctgccttc ccccttcaga acctgtgcca aattgtgcag atgtacgagg 15420

gacattccca gcagcctggt ctgcaaccca gattgcagag atggagctct cagactttga 15480

ggactgcctg acattatttg caggagaccc aggacttggg cctgaggaac tgcgggcagc 15540

catgggcaaa gcaaaacagg ttagggatgg agagccaact ggggttggcc atgaggaagc 15600

tatttgggtg tgatgtagga cacaaagaga atggagagtt ggatgagagg tgggggaagc 15660

aagagataga agagttagaa gatttgggtc acaagtagga ggtgaaggga gataaatatt 15720

gaggaaagag agctagtata atgaatagag ggacgaaagc agtggttacc aaattttaat 15780

gcatatcacg atcatcaagg gaacagattt ttttctttat ttttttttct ttcttaaaaa 15840

aataatggca tgcttcggct gggtgcagcg gctcacgcct ataatctcag aactttggga 15900

ggccaaggcg ggcagatcac gaggtcagga gatcaagacc atcctgtcta acacggcgaa 15960

acacggtctc tactaaaaat acaaaaaagt tagccgggca tggtggtgca cacttgttgt 16020

cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atggcgtgaa cctgggaggg ggagcttgca 16080

gtgagccgaa gtcaagccaa tgcactccat cctgggtgac agagcaagac tccatctcaa 16140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ggcatgcttc atgaatttgc gtgttatcct tgcacaggcg 16200

ccatgcaaat ctctgtatca ttccaatttt ttggggtatg tgctgctgaa ctgagcatgg 16260

gaacagtgcc agtgccagat taccatgctt cactgactta ataaaaacct ttggggaggc 16320

tgggcgcagt gactcatgcc tgtaatcaca gcactttggg aggcggaggc aggtggattg 16380

cttgagccca ggagttagag accagactgg gcaacatggt gaaaccctgt ctctactaaa 16440

aatagaaaaa acattagctg ggtgtggcgg cacatgcctg taatcccagc tactcaggag 16500

gctggggtag gagaatccca tgagtgcagg aggtggaggg tgcaatgtgc caagatcgca 16560

ccactgccct ccagcctggg tgtcagagca agaccctgtc tcataaatta aaaaataagc 16620

ctctggggga aagagtctag acatctgcat ctcctttttt tttttttttt tttttttttg 16680

agacagagtc tcactctgtc acccagcatc caggctggag tgcagtggtg tgatcttggc 16740

tcactgtaac ctctacatcc tgggttcaaa cgatcctcct gcctcagcct ctcaagtagc 16800

tgggactaca ggtgcaccac acctggctaa tttttgtatc tttggtagag atggggtttc 16860

actatgttgc ccaggatggt ctcgaacttc tgggctcaag caatcctccc acctcagcct 16920

cccaaagtgc tgggattaca gctgttagcc actgtgctgg gccctaggca tctgttttaa 16980

taagcgtctc tgtgtctgat gcacataaaa gtgtggaact catggactag agttagtttg 17040

ctcttctttt ccactgattg taatgtcttt caaaacacct tagaggaact gtaaggcaac 17100

ggtctcattt tatagtggag gaaactaaag aaaaggcaaa tgatttacct agagttatac 17160

agctaagggc agaggcaaga cttaaaaccc agcagtatga ctcccaatcc actgcttttc 17220

cactcacatt gttcctgtct ttctcctagt tgtggggtcc cccccgggga tttcgtcctg 17280

agcagatcct gcagcttggt aggctcttaa taggtctagg agatcgggaa ctacaggagc 17340

tgatcctagt ggactgggga gtgctgagca ccctggggca gatagatggc tggagcacca 17400

ctcaggtaac acttttcctc ctccctacgg cttcccaaac acccatccca cagacccagc 17460

cctatagatc atctaaagcc caaggaattt ttttcctgtg accctacctg gtccttcttt 17520

ctatcttttg ttgatacccc atactagtga ccttcaggac tctgatttat tcactctgag 17580

gccctggaca cataatactg tctcctacct cttttcctgg aggcttcctc tttttctttc 17640

cttttctttt ctgagtcctc agccttcccc atgactcctt aggtcttaat agtaacagaa 17700

tataacccag taacacctat cacttccctg tccattaatt ctccataact ttcctccttc 17760

ccctcttctc ccacccccca ccccagctcc gcattgtggt ctccagtttc ctacggcaga 17820

gtggtcggca tgtgagccac ctggacttcg ttcatctgac agcgctgggt tatactctct 17880

gtggactgcg gccagaggag ctccagcaca tcagcagttg ggagttcagg tcatttgtga 17940

aggggctgag ggtggtggtg ctgaggtaaa ggtggactta ctggggaaag aaggatcatg 18000

aaggtctggt cccatggagg aagggaactc atttgaagcc atctcttcct ttgtctcatg 18060

accacagccc ctttcactga agccgaattc ttcttccttc cttcctactg ttctacagcc 18120

aagcagctct cttcctcggc accctgcatc tccagtgctc tgaggaacaa ctggaggttc 18180

tggcccacct acttgtactg cctggtgggt ttggcccaat cagtaactgg gggcctgaga 18240

tcttcactga aattggcacc atagcaggtg gggagctggg ccactgctgg tgcaagttgg 18300

tttggtttct ataccatggg tggactggat ggaagactgc cctgcaattc ttaaggtggg 18360

ggcctgaggg tgtttaaata aggggctaga gacatattgg ggaaggtcta tgatagggca 18420

ctttgggagt agttagagaa ggtctatagg tttgaagaga gggaaggtca gtctaagaca 18480

atgtttggat gccacttgct tcaacagctg ggatcccaga cctggctctt tcagcactgc 18540

tgcggggaca gatccagggc gttactcctc ttgccatttc tgtcatccct cctcctaaat 18600

ttgctgtaag tattaatgga ctggggtgac cacaggagag ccagggccca atggggacta 18660

catgcatgca ctgattccta cccctgccct caggtggtgt ttagtcccat ccaactatct 18720

agtctcacca gtgctcaggc tgtggctgtc actcctgagc aaatggcctt tctgagtcct 18780

gagcagcgac gagcagttgc atgggcccaa catgagggaa aggagagccc agaacagcaa 18840

ggtgagttcc cagctgcaca gcttgatcct ccatctcctg acccagaatc aaacccctaa 18900

tttggtgctg tctggctctt agagtgcacc cagggagatc cctggagtga aggagtctac 18960

aggcagagcg ctaatttcca agtatcaatg ctcctggaga gctgagttgt gatattactc 19020

ccattccctg tctattatag gtcgaagtac agcctggggc ctccaggact ggtcacgacc 19080

ttcctggtcc ctggtattga ctatcagctt ccttggccac ctgctatgag cctgtctcta 19140

cagtagaagg agattgtggg gagagaaatc ttaagtcata atgaataaag tgcaaacaga 19200

agtgcatcct gattattttc agaagctgat gaggaata 19238

<210> 4

<211> 2301

<212> DNA

<213> 人类

<400> 4

ccaggcaggt aaggatcagg ggtgataggg gagagcaatt actttgttca ctgtatgcac 60

ccgcgggggc ctgggagtcc ccatttgcag gtgggtaggg cctccagccc acaccaccca 120

gacctaggct tccctcttct caggatccac cacagggtta ggggacagga agcctgttct 180

attctcaata aatcttacaa aattccaaaa agactttcct gtgtccctct gtccccctgg 240

ggggaaggga caatggagga atattcccca ggcctgggcg actgtccgct ggtcagaggg 300

aaggccccgc tgcctgcccg gtgcacctgt gagctgagat tgtggggatc attcagtcat 360

tcctttattc agtagatctg tacggggctg gctttgtgcc aaggcctgcc ccgggcacct 420

gggatgtggg gaaccaggca tagcaatccc tgctctggga cagtctacaa acgagcagcg 480

agaacaaaga catactctgg tcatgacaga cactaccccg cacattactg atggggcagt 540

gtgggcctgc tgggttagag acggcctact ccctgatctg tgcatgaagg gctgggaaga 600

ggagatgggc cttcggggca caggaaggtg tggggggacc agagcggagg ctgctgaggg 660

cagatgcagg catctagggc caggaagctg gtgtggtggt ggggagaagc agggttggga 720

tgactgaaag cagagtggac gactcaatga aaaacgactt gggagacggg gtgagtgcag 780

tgtgagggca aagtgaaccg agatgcctcg ctttcttcat gggactgaga aatgggtatt 840

gcaaatcgtg tgatctgctt agcatagtgc ctggttcata gcatggctga acacaatgta 900

gctgtcatcc tggtgtttgg aggccgccct gtcccccata acctgcccac ctctctgccc 960

cattcccaca gctcactgca ttttgtccct gctgccagtc gtgtgccatg ggctctcctg 1020

tgctcccccg gggtctcatt tccccatccg tgtagggctg acgccactgg ccccgcccag 1080

cctgggagga tggagagggg ggacttgagg agtggccagt actgggtttc ggcagcaggt 1140

gcaaatccca ggtggggact gtgttccagg gactcctgga ctcctgttag gccagcaggc 1200

taaggggcag acggcatcct ggggtcttcc tgggacaggg tcgtcgggtc tgaggggacc 1260

caggccctag cagaagctga ctcctgtcac ggtcacttcc cagcggtgct cagcccgcct 1320

gacggaagca gctgggcagt ggggcctgtg accagcaggc ggcgctggcg agctatagcg 1380

cccctttggg cccccacccc accttctggg cagcttccct gcagacaccc cagttatggg 1440

ggctagggac ccaaaagaga catccttctg ccacccagag ctgccctggc gaggtgcact 1500

atggggccgc cgacagctgc gtggctgccg agggcggaaa ggagaaactg tcatgtcccg 1560

atagggccgc gcgaggtctc catcctcgac aacgctaata acaaagacgt gtgctcctct 1620

ttgcttggtt ccccccactc ctttaaatca cagatttcac ttcagtttat ctgtgtcgct 1680

gtcacacgtg gggtggctcc cagtcagctg gtttggcaaa gtttctggat gattacggaa 1740

taacatgtgt ccccaacccg cagagcaggt tgtgggggca atgttgcatt gaccagcgtc 1800

agagaacaca catcagaggc aagggtgggt gtgcaggagg gagaaggcgc agaaggcagg 1860

gctttagctc agcactctcc ctcctgccat gctctgcctg accgttccct ctctgagtcc 1920

caaacagcca ggtagaggag gaagaaatgg ggctgagacc ccagcacatc agtgattaag 1980

tcaggatcag gtgcggtttc ctgctcaggt gctgagacag caggcggtgt cctgcaaaca 2040

acaggaggca cctgaagcta gcctgggggg cccacgccca ggtgcggtgc attcagcagc 2100

acagccagag acagacccca atgaccccgc ctccctgtcg gcagccagtg ctctgcacag 2160

agccctgagc agcctctgga cattagtccc agccccagca cggcccgtcc cccacgctga 2220

tgtcaccgca cccagacctt ggaggccccc tccggctccg cctcctggga gaaggctctg 2280

gagtgaggag gggagggcag c 2301

<210> 5

<211> 2343

<212> DNA

<213> 人类

<400> 5

agtgctggct ggacagctgc tctgggcagg agagagaggg agagacaaga gacacacaca 60

gagagacggc gaggaaggga aagacccaga gggacgccta gaacgagact tggagccaga 120

cagaggaaga ggggacgtgt gtttgcagac tggctgggcc cgtgacccag cttcctgagt 180

cctccgtgca ggtggcagct gtaccaggct ggcaggtcac tgagagtggg cagctgggcc 240

ccaggtaagg atgggctgcc cactgtcctg ggcattggga ggggtttgga tgtggaggag 300

tcatggactt gagctacctc tagagcctct gccccacagc cacttgctcc tgggactggg 360

cttcctgcca cccttgaggg ctcagccacc acagccactg aatgaaactg tcccgagcct 420

gggaagatgg atgtgtgtcc cctggaggag ggaagagcca aggagcatgt tgtccatcga 480

atcttctctg agctggggct ggggttagtg gcatcctggg gccaggggaa tagacatgct 540

gtggtggcag agagaagagt ccgttctctc tgtctccttt gctttctctc tgacactctt 600

tatctccgtt tttggataag tcacttcctt cctctatgcc ccaaatatcc catctgtgaa 660

atgggagtat gaagccccaa cagccagggt tgtagtgggg aagaggtaaa atcaggtata 720

gacatagaaa tacaaataca gtctatgccc cctgttgtca gttggaaaag aaattaactt 780

gaaggtggtc tagttctcat ttttagaaat gaaatgtctg tctggtcatt ttaaaatgtg 840

gcccttaaat ttcacgccct caccactctc ccccatccct tggagcccca tgtctctagt 900

gaaagcactg gctctgcccc cagccctcat ggctcatgct ggcatagggc gcctgctcca 960

cagcctgggc accatcttca gacaagtgcc cggtggcaac tgcctgctgg ccctgttgaa 1020

tccacatctc caccaggcat ccagactagt tcaggtctct ggaaggactg tgggtttgct 1080

gtgtcccaga gctccagggc aggggtcagg gctcggatgt cgggcagtgt catgggcaga 1140

ggatcgaatg ccccggcggc tctgaatggg cccttgtgaa aaattgatgc gcattctagg 1200

agacaggttg ggagccagag gggcctcata ccagggtctg taggctgggg ctgcctttta 1260

agctccttcc tgaggccgtc tctgggtctg gccctgtgct ggacaaggct ggagacaagg 1320

caatgtctca gaccctctcc cattggccac atcctgccct ggatcaactc gccaactttg 1380

ggggcagagg tgggactgac ccttaccctg acaacataat gcatatagtc aaaatgggat 1440

aaaggggaat atagaggctc ttggcagctt gggagtggtc agggaaggct tcctggagga 1500

ggtatcatct gaactgagcc atgaaccata agtggaaatt cactagtcaa aatttcaggt 1560

agaagggcca gtgtgtgaag gccaggagat ggcaagagct ggcgtatttc aggaacagtg 1620

agtcactgag gatgtccaag tataagggta ggaaagggag tgagcagtga gagaaaagac 1680

cgaggcatca gcaggggcca gattgtgctg ggcctagcgg ggcgggcccg ggcccgggcc 1740

caggcccagg tgcggtgcat tcagcagcac agccagagac agaccccaat gaccctgcct 1800

ccccgtcagc agccagtgct ctgcacagag ccatcctgag ggcagtgggt gctcttgaga 1860

ggtttcaggc agggtgtgct gtgagcaggt catgcccagc ccttgacctt ctgctcagtc 1920

aggcttgtcc ttgtcaccca cattcctggg gcagtcccta agctgagtgc cggagattaa 1980

gtcctagtcc taaatttgct ctggctagct gtgtgaccct gggcaagtct tggtccctct 2040

ctgggcccct ttgccgtagg tccctggtgg ggccagactt gctactttct aggagccctt 2100

tgggaatctc tgaatgacag tggctgagag aagaattcag ctgctctggg cagtggtgct 2160

ggtgacagtg gctgaggctc aggtcacaca ggctgggcag tggtcagagg gagagaagcc 2220

aaggagggtt cccttgaggg aggaggagct ggggctttgg gaggagccca ggtgacccca 2280

gccaggctca aggcttccag ggctggcctg cccagaagca tgacatggtc tctctccctg 2340

cag 2343

<210> 6

<211> 2063

<212> DNA

<213> 老鼠

<400> 6

agagggatct gtctgtttca tttttcccgt accccgcacc cccccccaca cacacacaca 60

caagggtaaa gacagagggc acaatgggta gctgacctct ggtcagaagg atgagcaagg 120

aaggccttgg gaatcacaga taaaagctgg ccttgctggt tacctagtga gtcagagctc 180

agctctgtgg aatccttcag gttccctgtc agtgtggggc tggctttgcc gagctctgcc 240

catctcaggc cctggggaca tgggggcaca cagttcctgc tctgcagcag ccttccagca 300

actgaggaaa atgtacaaat catgtctgat cgaagtactg cagtgtcctt gataggcagt 360

gtccctagga gctgactctc agtctctgag ttcaagatct gtgccctgtt ctagtggaga 420

ggagagactt acatgcaggc cacagacaga ggtggcagag cagagatact gggaaggtgc 480

ggtagctaga gctaggaatt tatggccagg gccacgggca gaagctgggt tgggttgtgg 540

aaaacgaaat gatggaatac gacgatagat tggatttgga ggggcgaggg tggtatgaac 600

ttaagaccag ttctgcagtg gttcagatgt ggtgccctta agaggctcag gtgccagaaa 660

ccagtgcccc ttctggatag ggcagaaaac aggcagaacc tggagaggta cggtggagca 720

tgaggtggta aggacacaca ccatctcagg tggtttgttt tgggggaaac aagcatggat 780

ttctaggttt ctccgatcgg gtgacctgct tagccgagtt tgggtgctga ggaaatgtct 840

ccgttatggt tctgagacca ctttctcacc cacccactgc cttcccagca tgcacctcag 900

ccccaacgaa gcacacctgc cccagttgcc gccttgtcga ttgggctctg gatgctccaa 960

cctgtgtctc tcctactctg tgtaggctca tgctactcac ctgactcata agtatcagtt 1020

tcgtaggtga aggctgcgtt gggtgcaagt caaccttgga ccgtggtctc actgtggcac 1080

cctggtatga ggaagttgac cggcttttcc ttagtcttgt agcagttggc tgtgcccagc 1140

aggtggcacc attgcaccat tgattctccc cactccatac ccactataga ttccacccca 1200

ccctattccc ctccccacct taacccaccc acccccaccg aaaagcagct ttcctgagta 1260

gatgtcccag ctggcaagtg tgggcagaag aaggggccag gtctcaggag gaggaggagg 1320

aggaagagga agaggagtcc tccatcctcc atcctcatct accatgatga gtatttgtgt 1380

cctgttcatt cccacccact ccctttttta aatcacacat ttaaatcaca cacacacaca 1440

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca caccgggtaa 1500

gtctgtcctg cgtgaggtgg ctcctactca ggtggctttg caaactgtct ggataacagc 1560

acactcaaga ctcctaggac aggctgtggg ggccagttgt agagcttggg ggtggggtgc 1620

atcttgggga gtcctggttt ggatgttgtg tccagccaag gctccaggta ttgcaaagcc 1680

tgctcatcta tgtggtctct agtagtgccc tgacgaggga agctgggtga gcaggggagg 1740

ctactgggaa ctgagaccca gcaaaatcat gaggaagatg ggacgtgatc aggtgtccta 1800

accatgcaga gatggcaggt agtaacacat gtgacaagag accctgaggt cctgatggtt 1860

ggccccaggc ccgaggttcc cactggccag cagtgccccc tggagcttct atgccttgca 1920

tccctgctgg ttagctttac acagcacctt gggcaacctc tagacgttag tcagcagccc 1980

cagcacagcc cgcccctcat gctgatgtca ccacatccag accttcgagg cccccagggc 2040

tccgcctcct gggagaaggc ttt 2063

Claims (26)

1.一种慢病毒表达载体，其包含：

编码硬纤毛蛋白(STRC)的核酸序列或其一部分；和

可操作地链接至所述核酸序列的启动子。

2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其中所述慢病毒表达载体是第三代自灭活(SIN)慢病毒载体。

3.根据权利要求2所述的慢病毒表达载体，其中所述SIN慢病毒载体缺乏野生型慢病毒长末端重复序列(LTR)增强子和启动子元件。

4.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其中所述启动子选自由STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和Pou4f3启动子组成的组。

5.根据权利要求4所述的慢病毒表达载体，其中所述启动子是Myo7a，任选地进一步包含Myo7a增强子。

6.根据权利要求5所述的慢病毒表达载体，其中所述启动子与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，任选地进一步包含与SEQ ID NO:5为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的Myo7a增强子。

7.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其中所述核酸与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

8.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其中所述核酸编码与SEQ ID NO:2为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。

9.一种在治疗或预防听力损失的方法中使用的药物组合物，所述药物组合物包含慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸，其中所述核酸序列可操作地链接至与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸。

10.一种细胞，其包含：慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列；和可操作地链接至所述核酸的启动子。

11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述核酸与SEQ ID NO:1为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

12.根据权利要求10所述的细胞，其中所述启动子选自由STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或Pou4f3启动子组成的组。

13.根据权利要求12所述的慢病毒表达载体，其中所述启动子是Myo7a。

14.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体，其中所述启动子与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

15.根据权利要求10所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。

16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述干细胞是诱导多能干细胞。

17.一种用于治疗或预防听力损失的方法，所述方法包括向有此需要的受试者给药有效量的根据权利要求1所述的慢病毒载体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述启动子选自由STRC启动子、Myo7a启动子、人巨细胞病毒(HCMV)启动子、巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或Pou4f3启动子组成的组。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述启动子是Myo7a。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述启动子与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6为95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述表达载体通过注射至所述受试者的内耳中来给药。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述注射方法选自由耳蜗造口术、圆窗膜、内淋巴囊、中阶、小管切开术、经由内淋巴囊的中阶、或其组合组成的组。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者具有与听力损失相关联的一种或多种遗传风险因素。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述遗传风险因素中的一种选自由STRC基因中的突变组成的组。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者不表现出听力损失的任何临床指标。

26.一种转基因小鼠，其包括引起听力损失的突变/变异，所述突变/变异选自由人的STRC基因中的突变/变异组成的组。