KR20240027595A - 청력 손실 치료를 위한 유전자 치료 구축물 및 방법 - Google Patents

청력 손실 치료를 위한 유전자 치료 구축물 및 방법 Download PDF

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Abstract

STRC 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 유발된 청력 손실의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있는 조성물 및 방법이 개시된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 STRC 유전자의 활성을 회복하고, 유모세포 생존을 촉진하고, 청력의 더욱 저하를 방지하고 및/또는 청력 손실을 겪는 환자의 청력을 회복시키도록 내이로의 STRC 전달을 용이하게 한다.

Description

청력 손실 치료를 위한 유전자 치료 구축물 및 방법
(관련 출원에 대한 상호 참조)
본 출원은 2021년 5월 14일에 출원된 미국 가출원번호 63/188,857의 이익과 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 포함된다.
본 개시는 청력 손실을 치료 및/또는 예방하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 STRC 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 유발된 청력 손실을 치료 및/또는 예방하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.
(서열 목록)
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열목록을 포함하고, 전체 내용이 참조로 포함되어 있다. 2022년 5월 14일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 BN00002_0051_SL_ST25.txt이고, 크기는 56KB이다.
청력 손실은 인간에게 가장 흔한 감각 장애이다. 세계보건기구(WHO)가 발표한 장애성 청력 손실의 규모에 대한 2018년 추정에 따르면, 전 세계적으로 장애성 청력 손실을 갖고 사는 사람은 4억 6,600만 명(성인 4억 3,200만 명, 어린이 3,400만 명)이 있다. 장애성 청력 손실을 가진 사람의 수는 2030년까지 6억 3천만 명, 2050년에는 9억 명 이상으로 증가할 것이다. 장애성 청력 손실을 가진 사람의 90% 이상(4억 2천만 명)이 전세계의 저소득 지역에 거주한다(청력 손실 유병률에 대한 WHO의 전세계 추정치, 난청의 예방 WHO 2018).
연구에 따르면, 언어 습득 전 난청의 50% 이상이 유전적인 것으로 나타났다. 이러한 유전성 청력 손실 및 난청은 전음성, 감음신경성 또는 이 둘의 조합; 증후군(외이 또는 다른 기관의 기형 또는 다른 기관계와 관련된 의학적 문제와 관련됨) 또는 비증후군(외이의 가시적인 기형 또는 관련 의학적 문제와 관련 없음); 언어 습득 전(언어가 발달하기 전) 또는 언어 습득 후(언어가 발달한 후)일 수 있다. 또한, 연구에 따르면 유전성 청력 손실의 70% 이상이 비증후군성인 것으로 나타났다. 비증후군성 난청의 상이한 유전자좌는 DFN(DeaFNess의 경우)으로 지정된다. 유전자좌는 유전 방식에 기반하여 명명된다: DFNA(상염색체 우성), DFNB(상염색체 열성) 및 DFNX(X 염색체 연쇄성). 상기 명칭 뒤에 오는 숫자는 유전자 매핑 및/또는 발견의 순서를 반영한다. 일반 인구에서, 청력 손실의 유병률은 나이가 들수록 증가한다. 이러한 변화는 유전학과 환경의 영향, 및 환경적 요인과 개인의 유전적 소인 사이의 상호작용을 반영한다.
장애성 청력 손실을 가진 사람들을 위한 현재 치료 옵션은 보청기 또는 인공 와우다. 인공 와우는 환자당 평생 비용이 $1,000,000 이상으로 관련 의료비가 많이 드는 일반적인 처치이다. 인공 와우 및 보청기의 평생 비용은 대부분의 사람들에게 엄두도 못 낼 정도로 높으며, 특히 저소득 지역(난청을 가진 사람의 대부분이 거주하는 곳)에 거주하는 사람들에게는 더욱 그렇다. 불행하게도, 현재 청력 손실 또는 난청을 예방하거나 또는 치료하기 위해 승인된 치료제는 없다. 따라서, 청력 손실용 인공 와우 및 보청기에 대한 비용 효율적인 대안을 제공하기 위한 치료 옵션이 시급히 필요하다.
본 개시는 STRC 기능소실 돌연변이와 관련된 표현형을 구제할 수 있는 내이 세포에서의 STRC의 강력한 발현을 생성하기 위해 전체 길이 또는 거의 전체 길이의 스테레오실린(STRC)이 내이 특이적 프로모터(예를 들면, 마우스 또는 인간 Myo7A 프로모터)의 제어 하에 렌티바이러스 벡터에 포함될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기반하고 있다. 본원의 기술은 유전자 요법을 통해 포유동물(예를 들면, 인간)에게서 STRC 기능소실 돌연변이를 구제하는 능력을 제공한다. 본 개시는 STRC 돌연변이로 인한 장애를 앓고 있는 환자에게 STRC 기능을 회복하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 스테레오실린(STRC)을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 그의 일부; 및 상기 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터를 제공한다.
실시형태에 있어서, 렌티바이러스 발현 벡터는 제 3 세대 자가 불활성화(SIN) 렌티바이러스 벡터이다. 실시형태에 있어서, SIN 렌티바이러스 벡터에는 야생형 렌티바이러스 긴 말단 반복(LTR) 인핸서 요소 및 프로모터 요소가 결여되어 있다.
실시형태에 있어서, 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터 및 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군에서 선택된다. 실시형태에 있어서, 프로모터는 Myo7a이다. 실시형태에 있어서, 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 선택적으로, Myo7a 프로모터는 Myo7a 인핸서를 추가로 포함한다. 선택적으로, Myo7a 프로모터는 Myo7a 인핸서를 추가로 포함한다. 프로모터가 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 실시형태에 있어서, 프로모터는 선택적으로 서열번호 5와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 Myo7a 인핸서를 추가로 포함할 수 있다.
실시형태에 있어서, 핵산은 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 실시형태에 있어서, 핵산은 서열번호 2와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산을 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터를 포함하는 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법에 사용되는 의약 조성물을 제공하고, 여기서 핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산에 작동적으로 연결된다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터; 및 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 세포를 제공한다.
실시형태에 있어서, 핵산은 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
실시형태에 있어서, 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군에서 선택된다.
실시형태에 있어서, 프로모터는 Myo7a이다. 실시형태에 있어서, 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
실시형태에 있어서, 세포는 줄기세포이다. 실시형태에 있어서, 줄기세포는 유도만능 줄기세포이다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 제 1 항에 기재된 렌티바이러스 벡터의 유효량을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
실시형태에 있어서, 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터, 또는 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군에서 선택된다. 실시형태에 있어서, 프로모터는 Myo7a이다. 실시형태에 있어서, 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
실시형태에 있어서, 발현 벡터는 피험체의 내이에 주입함으로써 투여된다.
실시형태에 있어서, 주입 방법은 와우 개창술(cochleostomy), 정원창막(round window membrane), 내림프낭, 스칼라 메디아(scala media), 카날로스토미(canalostomy), 내림프낭을 통한 스칼라 메디아, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
실시형태에 있어서, 피험체는 청력 손실과 관련된 하나 이상의 유전적 위험 인자를 갖는다.
실시형태에 있어서, 유전적 위험 인자 중 하나는 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이로 이루어진 군에서 선택된다.
실시형태에 있어서, 피험체는 청력 손실의 임상 지표를 전혀 나타내지 않는다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 인간 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이/변이로 이루어진 군에서 선택된 청력 손실을 유발하는 돌연변이/변이를 포함하는 형질전환 마우스를 제공한다.
본원에서는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 발현 벡터가 개시된다. 또한, 본원에는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 발현 벡터를 포함하는 청력 소실의 치료 또는 예방하는 방법에 사용되는 의약 조성물로서, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 의약 조성물이 개시된다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터에서 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrhlO, AAVrh39, AAVrh43AAVl, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 Anc80에서 선택되는 렌티바이러스 벡터 또는 아데노연관 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, AAV 벡터는 AAV50 혼합 캡시드일 수 있으며, 이는 Anc80과 비교했을 때 성인 동물에서 내부 및 외부 유모세포의 더 우수한 형질주입을 얻는 것으로 나타났다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 초기 발달 시 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도하고 일생 동안 발현을 유지하는 임의의 유모세포 프로모터, 예를 들면 STRC 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터, Myo7a 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터에서 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 인핸서는 Barhl1 인핸서일 수 있다(예를 들면, Hou et al., (2019) Cell 8(5):458 참조). 내인성 STRC 프로모터 및 인핸서의 예는 표 1에 나타내어져 있다.
본원에서는, 서열번호 1의 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포로서, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 세포를 개시한다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 줄기세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기세포는 유도만능 줄기세포이다.
본원에서는, 서열번호 1의 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 핵산과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터의 유효량을 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법을 개시한다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터에서 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrhlO, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 AAV50에서 선택된 렌티바이러스 벡터 또는 아데노연관 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 초기 발달 시 작동적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 유도하고, 평생 동안 발현을 유지하는 임의의 유모세포 프로모터, 예를 들면 STRC 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터, Myo7a 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터에서 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는, 예를 들면 주입에 의해 피험체의 내이에 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 전달 방법은 와우 개창술, 정원창막, 카날로스토미 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된다(예를 들면 Erin E. Leary Swan et al., 청각 용도용의 내이 약물 전달; Adv Drug Deliv Rev. 2008 12월 14일; 60(15): 1583-1599 참조). 일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 내림프낭을 통한 스칼라 메디아로 전달된다(예를 들면 Colletti V, et al., 인간 내이의 내림프낭으로부터 내림프 구획으로의 가돌리늄 분포의 증거, Audiol Neurootol, 2010; 15(6): 353-63; Marco Mandala, MD, et al., 메니에르병에서 내림프낭으로부터 달팽이관으로의 유도된 내림프 흐름, Otolaryngology-Head and Neck Surgery(2010) 143, 673-679; Yamasoba T., et al., 내림프낭에서의 아데노바이러스 벡터 접종 후 내이 이식유전자 발현, Hum Gene Ther. 1999년 3월, 20; 10(5):769-74 참조). 일부 실시형태에 있어서, 피험체는 청력 손실과 관련된 하나 이상의 유전적 위험 인자를 갖는다. 일부 실시형태에 있어서, 유전적 위험 인자 중 하나는 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이이다. 일부 실시형태에 있어서, STRC 유전자에 있어서의 돌연변이는 청력 손실을 유발한다고 알려진 임의의 하나 이상의 STRC 돌연변이에서 선택된다(예를 들면, 표 4 참조). 일부 실시형태에 있어서, 피험체는 청력 손실의 임상 지표를 전혀 나타내지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 발현 벡터는 다른 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 청력 손실을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 활성 약제와의 병용 요법으로서 투여된다. 예를 들면, 병용 요법은 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 제 1 발현 벡터 및 핵산 서열을 갖는 제 2 발현 벡터를 포함할 수 있으며, 여기서 두 발현 벡터는 청력 손실을 치료하기 위한 병용 요법의 일부로서 피험체에게 투여된다.
본원에서는, 청력 손실을 유발한다고 알려진 임의의 하나 이상의 STRC 돌연변이에서 선택된 돌연변이를 가진 인간 STRC 유전자를 갖는 형질전환 마우스를 개시한다(예를 들면, 표 4 참조).
정의
"변경"이란, 증가 또는 감소를 의미한다. 변경은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30% 만큼 적어질 수 있고, 또는 40%, 50%, 60% 만큼일 수 있고, 또는 심지어 75%, 80%, 90%, 100% 만큼 증가할 수 있다.
"생물학적 샘플"이란, 유기체로부터 유래된 임의의 조직, 세포, 체액 또는 기타 물질을 의미한다.
"실질적으로 동일한"이란, 기준 아미노산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 핵산 서열 중 어느 하나)과 적어도 50%의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 서열과 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 80% 또는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일하다.
"융합 단백질"이란, 2개 이상의 다른 단백질에서 발췌한 서열 요소를 결합시킨 조작된 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "형질주입하다(transfect, transfects)", "형질주입하는" 및 "형질주입"이라는 용어는, 예를 들면 양이온성 지질 비히클(들)의 사용 및/또는 전기천공법 또는 기타 당업자가 인정하는 다른 트랜스펙션 수단에 의해 핵산(보통 DNA 또는 RNA)을 세포질 또는 세포의 핵에 전달하는 것을 지칭한다.
"형질도입(transduction)"이란, 바이러스 전달의 사용을 통해, 예를 들면 렌티바이러스 전달 벡터/플라스미드 또는 그외 분야에서 인정된 트랜스덕션의 수단을 통해 핵산(일반적으로 DNA 또는 RNA)을 세포질 또는 세포의 핵에 전달하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "플라스미드"라는 용어는 표적화 세포의 형질전환을 지시하도록 설계된 유전 물질로 구성된 조작된 구축물을 지칭한다. 플라스미드는 플라스미드 백본으로 이루어진다. 본원에 사용된 바와 같은 "플라스미드 백본"은 핵산 카세트의 핵산이 전사될 수 있고, 필요한 경우 형질주입된 또는 형질도입된 세포에서 번역될 수 있도록, 다른 필요한 유전 요소와 함께 위치적 및 순차적으로 배향된 다수의 유전 요소를 함유한다. 본원에 사용된 바와 같은 플라스미드라는 용어는 특정 유전자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산의 단편이 삽입 또는 복제될 수 있는 핵산, 예를 들면 플라스미드 벡터, 코스미드, 파제미드 또는 박테리오파지로부터 유래된 DNA를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "바이러스 벡터"는 벡터 내에 바이러스 게놈의 일부, 예를 들면 패키징 신호를 포함함으로써 바이러스 입자 내에 물리적으로 포함되는 것이고, 단순히 바이러스 핵산의 일부로부터 취한 DNA 또는 위치한 유전자는 아니다. 따라서, 바이러스 게놈의 일부가 본 개시의 플라스미드에 존재할 수 있지만, 그 일부는 바이러스 입자로의 플라스미드의 포함을 유발하지 않으며, 따라서 감염성 바이러스 입자를 생산할 수 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"라는 용어는 적절한 제어 요소와 관련되었을 때 복제가 가능하고, 또한 세포 사이에서 유전자 서열을 전달할 수 있는, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등과 같은 임의의 유전 요소를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 바이러스 벡터뿐만 아니라 복제 및 발현 비히클을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "통합 벡터"라는 용어는 인테그라제를 통해 핵산(예를 들면 염색체)에의 통합 또는 삽입이 달성되는 벡터를 지칭한다. "통합 벡터"의 예로는 레트로바이러스 벡터, 트랜스포존 및 아데노연관 바이러스 벡터를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "통합된"이라는 용어는 숙주 세포의 게놈(즉, 염색체)에 안정적으로 삽입되는 벡터를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "외인성 유전자"라는 용어는 숙주 유기체 또는 세포에 자연적으로 존재하지 않거나, 또는 숙주 유기체 또는 세포에 인위적으로 도입되는 유전자를 지칭한다.
"유전자"라는 용어는 전구체 또는 폴리펩티드(예를 들면 STRC)의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예를 들면 DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 폴리펩티드는 전체 길이 또는 단편의 소망하는 활성 또는 기능적 특성(예를 들면 개선된 유모세포 생존 및 유모세포 기능)이 유지되는 한, 전체 길이 코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 인코딩될 수 있다. 또한, 이 용어는 구조 유전자의 코딩 영역을 포함하며, 유전자가 전체 길이 mRNA의 길이와 일치하도록 양 단부에서 약 1kb 이상의 거리에 걸쳐 5' 및 3' 양 말단의 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하며, mRNA에 존재하는 서열은 5' 미번역 서열이라고 칭해진다. 코딩 영역의 3' 또는 그 하류에 위치하며, mRNA에 존재하는 서열은 3' 미번역 서열이라고 칭해진다. "유전자"라는 용어는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태를 모두 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"이라고 하는 비코딩 서열로 중단된 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자의 세그먼트이며; 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체에서 제거되거나 또는 "스플라이스드 아웃(spliced out)"되므로, 메신저 RNA(mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역 중에 초기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 순서를 지정하는 기능을 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자 발현"이라는 용어는 유전자의 "전사"를 통해(즉, RNA 폴리메라아제의 효소 작용을 통해) 유전자에 인코딩된 유전 정보를 RNA(예를 들면 mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 변환하는 과정, 및 단백질 인코딩 유전자일 경우에는 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 변환하는 과정을 지칭한다. 유전자 발현은 이 과정의 다수의 단계에서 조절될 수 있다. "상향 조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 산물(예를 들면 RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 지칭하는 한편, "하향 조절" 또는 "억제"는 생산을 감소시키는 조절을 지칭한다. 상향 조절 또는 하향 조절에 관여하는 분자(예를 들면 전사 인자)는 각각 '활성화제'와 '억제제'라고 부르는 경우도 있다.
본원에서 "아미노산 서열"이 자연적으로 발생하는 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하기 위해 인용되는 경우, "아미노산 서열" 및 유사 용어, 예를 들면 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 서열을 인용된 단백질 분자와 관련된 완전한 네이티브 아미노산 서열로 제한하고는 것을 의미하는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산 분자 인코딩", "DNA 서열 인코딩", "DNA 인코딩", "RNA 서열 인코딩" 및 "RNA 인코딩"이라는 용어는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 가닥을 따라 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드(단백질) 쇄를 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, DNA 또는 RNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
본원에 사용된 바와 같이, "변이체"라는 용어는, 단백질과 관련하여 사용될 때, 단백질의 아미노산 서열이 변이하도록 부분적으로 상동하는 핵산에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "변이체"라는 용어는 단백질 기능의 변화를 초래하지 않는 보수적 및 비보수적 아미노산 치환 둘 다를 갖는 상동 유전자에 의해 인코딩된 단백질뿐만 아니라, 단백질 기능의 감소(예를 들면 널 돌연변이) 또는 단백질 기능의 증가를 유발하는 아미노산 치환을 갖는 상동 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능한 조합으로", "작동 가능한 순서로" 및 "작동적으로 연결된"이라는 용어는 주어진 유전자의 전사 및/또는 소망하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식으로의 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 또한, 이 용어는 기능성 단백질이 생산되는 방식으로의 아미노산 서열의 연결을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "조절 요소"라는 용어는 핵산 서열의 발현의 일부 양태를 제어하는 유전 요소를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 작동적으로 연결된 코딩 영역의 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 스플라이싱(splicing) 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호, RNA 내보내기(export) 요소, 내부 리보솜 진입 부위 등이다.
진핵 생물의 전사 조절 신호는 "프로모터" 요소 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 짧은 배열의 DNA 서열로 이루어진다(Maniatis et al., (1987) Science 236:1237). 프로모터 요소 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유류 세포에 있어서의 유전자를 포함한 다양한 진핵 생물, 및 바이러스로부터 분리되어 왔다(유사 제어 요소, 즉 프로모터는 원핵 생물에서도 발견됨). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 관심 있는 단백질을 발현시키기 위해 사용할 세포 유형에 따라 달라진다. 일부 진핵 생물 프로모터 및 인핸서는 숙주 범위가 넓은 반면, 그외의 것은 세포 유형의 제한된 서브셋에서 기능적이다(검토를 위해서는 Voss et al., (1986) Trends Biochem. 11 : 287; 및 Maniatis et al., 상기 참고, 참조). 예를 들면, SV40 초기 유전자 인핸서는 다수의 포유류 종 유래의 다양한 세포 유형에서 매우 활성이어서, 포유류 세포에서의 단백질 발현에 널리 사용되어 왔다(Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4:761). 광범위한 포유류 세포 유형에서 활성인 프로모터/인핸서 요소의 두 가지 다른 예는 인간 신장 인자 1α 유전자(Uetsuki et al., (1989) J. Biol. Chem., 264:5791; Kim et al., (1990) Gene 91:217; 및 Mizushima and Nagata, (1990) Nuc. Acids. Res., 18:5322) 및 루스 육종 바이러스(Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. USA 79:6777) 및 인간 거대세포바이러스(Boshart et al., (1985) Cell 41:521)의 긴 말단 반복으로부터의 것들이다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터/인핸서"라는 용어는 프로모터 기능 및 인핸서 기능(즉, 프로모터 요소 및 인핸서 요소에 의해 제공되는 기능, 이들 기능에 대한 논의는 상기 참조)을 모두 제공할 수 있는 서열을 포함하는 DNA의 세그먼트를 나타낸다. 예를 들면, 레트로바이러스의 긴 말단 반복은 프로모터와 인핸서 기능을 모두 포함한다. 인핸서/프로모터는 "내인성", "외인성" 또는 "이종성"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈의 주어진 유전자와 자연적으로 연결되어 있는 것이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 해당 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉, 복제 및 재조합과 같은 분자생물학적 기술)을 통해 유전자에 병치되게 배치된 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "프로모터", "프로모터 요소" 또는 "프로모터 서열"이라는 용어는 관심 있는 뉴클레오티드 서열에 결찰되었을 때, 관심 있는 뉴클레오티드 서열의 mRNA로의 전사를 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터는 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 관심 있는 뉴클레오티드 서열의 5'(즉, 상류)에 위치하여 mRNA로의 전사를 제어하며, 전사 개시를 위한 RNA 폴리메라아제 및 다른 전사 인자에 의한 특정 결합을 위한 부위를 제공한다.
프로모터는 구성적이거나 또는 조절 가능할 수 있다. 프로모터와 관련하여 "구성적"이라는 용어는 프로모터가 자극(예를 들면 열 충격, 화학 물질 등)의 부재시 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 이와 대조적으로, "조절 가능한" 프로모터는 자극의 부재시 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사의 수준과는 상이한, 자극(예를 들면 열 충격, 화학 물질 등)의 존재시 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 지시할 수 있는 것이다. 또한, 소정의 프로모터는 그러한 프로모터의 제어 하에 핵산 서열의 발현에 조직 특이성 및/또는 시간적/발달적 특이성을 부여하는 것으로 당업자에게 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "레트로바이러스"라는 용어는 세포에 들어갈 수 있고(즉, 입자가 숙주 세포 표면에 결합하여 바이러스 입자가 숙주 세포의 세포질로 들어가는 것을 용이하게 할 수 있는 외피 단백질 또는 바이러스 G 당단백질과 같은 막 관련 단백질을 포함함), 레트로바이러스 게놈(이중가닥 프로바이러스)을 숙주 세포의 게놈에 통합할 수 있는 레트로바이러스 입자를 지칭한다. "레트로바이러스"라는 용어는 종양 바이러스(예를 들면 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV, 및 본원에서는 단순히 "MLV"라고도 함), 몰로니 마우스 육종 바이러스(MoMSV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 스푸마 바이러스(spumavirinae), 및 렌티 바이러스(예를 들면 인간 면역결핍 바이러스, 시미안 면역결핍 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스, 및 카프린 관절염-뇌염 바이러스; 예를 들면 미국특허 제5,994,136호 및 제6,013,516호 참조, 모두 본원에 참조로 통합되어 있음)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "레트로바이러스 벡터"라는 용어는 관심 있는 유전자를 발현하도록 변형된 레트로바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 감염 과정을 이용하여 유전자를 숙주 세포로 효율적으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 게놈 내로 복제된(즉, 분자생물학적 기술을 사용하여 삽입된) 외래 또는 이종성 유전자는 레트로바이러스에 감염되기 쉬운 숙주 세포에 효율적으로 전달될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "렌티바이러스 벡터"라는 용어는 비분열성 세포에 통합될 수 있는 렌티바이러스과(예를 들면 인간 면역결핍 바이러스, 시미안 면역결핍 바이러스, 말 전염성 빈혈 바이러스, 및 카프린 관절염-뇌염 바이러스)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 지칭한다(예를 들면 미국 특허 제5,994,136호 및 제6,013,516호 참조, 둘 다 본원에 참조로 포함되어 있음).
본원에 사용된 바와 같이, "아데노연관 바이러스(AAV) 벡터"라는 용어는 아데노연관 바이러스 항원형으로부터 유래된 벡터를 지칭하며, 제한되지는 않지만, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 등을 포함한다. AAV 벡터는 전체 또는 일부가 삭제된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 렙(rep) 유전자 및/또는 캡(cap) 유전자를 가질 수 있지만, 기능성 플랭킹(flanking) ITR 서열을 보유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "시험관 내"라는 용어는 인공 환경 및 인공 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 지칭한다. 시험관 내 환경은 시험관 및 세포 배양으로 이루어질 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. "생체 내"라는 용어는 자연 환경(예를 들면 동물 또는 세포) 및 자연 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"라는 용어는 시험관 내 또는 생체 내 위치된 것에 관계없이, 임의의 진핵 세포(예를 들면 포유류 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다.
"투여"라는 용어는 피험체에게 물질을 도입하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 예를 들면 비경구(예를 들면 정맥), 경구, 국소, 피하, 복막, 동맥 내, 흡입, 질, 직장, 비강, 뇌척수액으로의 도입, 또는 체 구획(body compartment)으로의 주입을 포함한 임의의 투여 경로가 이용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 투여는 경구 투여이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에 있어서, 투여는 비경구 투여이다. 일부 실시형태에 있어서, 투여는 정맥 내 투여이다.
"약제"는 임의의 작은 화합물(예를 들면, 저분자), 항체, 핵산 분자, 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편 또는 동종 이식 및/또는 CART 세포 요법과 같은 세포 치료제를 지칭한다.
"STRC 핵산 분자"는 STRC 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예시적인 STRC 핵산 분자는 하기 서열(예를 들면 NM_153700)(서열번호 1)과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다:
"STRC 폴리펩티드"란 하기 서열(예를 들면 NP_714544.1)(서열번호 2)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 또는 그 단편을 의미한다:
"STRC 게놈 서열"이란 STRC 폴리펩티드를 인코딩하는 게놈 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예시적인 STRC 게놈 서열은 하기 서열(예를 들면 NC_000015.10)(서열번호 3)과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다:
"인간 Myo7A 프로모터"란 인간 Myo7A 프로모터 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예시적인 Myo7A 프로모터 핵산 분자는 하기 서열(서열번호 4)과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다:
"인간 Myo7A 인핸서"란 Myo7A 인핸서 영역(예를 들면, 인트론 1 인핸서)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예시적인 인간 Myo7A 인핸서 핵산 분자는 하기 서열(서열번호 : 5)과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다:
"마우스 Myo7A 프로모터"란 마우스 Myo7A 프로모터 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예시적인 Myo7A 프로모터 핵산 분자는 하기 서열(서열번호 6)과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다:
구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 사용되는 용어 "약"은 당업계의 정상적인 허용 범위 내, 예를 들면 평균의 2 표준편차 내인 것으로 이해된다. "약"은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다.
소정 실시형태에 있어서, 용어 "대략" 또는 "약"은 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 내에 속하는 값의 범위, 또는 달리 명시되지 않거나 문맥상 달리 명백하지 않는 한, 명시된 기준값의 어느 방향(보다 크거나 작음)으로든 그 이하를 말한다(해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
문맥상 달리 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 "약"이라는 용어로 수식된다.
"대조군" 또는 "참조"는 비교 표준을 의미한다. 대조군 샘플을 선택하고 테스트하는 방법은 해당 분야의 능력 내에 있다. 통계적 유의성의 결정, 예를 들면 긍정적인 결과를 구성하는 평균으로부터의 표준 차의 수는 당업자의 능력 내에 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 항목의 컬렉션과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "각각"은 컬렉션에 있어서의 개별 항목을 식별하도록 의도되었지만 반드시 컬렉션의 모든 항목을 지칭하는 것은 아니다. 명시적인 공개 또는 문맥에 따라 달리 명시되는 경우 예외가 발생할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "피험체"는 인간 및 포유동물(예를 들면, 마우스, 래트, 돼지, 고양이, 개 및 말)이 포함된다. 다수의 실시형태에 있어서, 피험체는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 일부 실시형태에 있어서, 피험체는 소, 양, 염소, 암소, 돼지 등과 같은 가축; 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금류; 개 및 고양이와 같은 가축, 특히 반려동물이다. 일부 실시형태에 있어서(예를 들면, 특히 연구 문맥에서), 피험체 포유동물은 예를 들면 설치류(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 근친교배된 돼지 등과 같은 돼지일 것이다.
구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "한(a, an)", 및 "그(the)"는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
범위는 본원에서 하나의 특정값 "약"으로부터, 및/또는 또 다른 특정값 "약"까지 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 양태는 하나의 특정값으로부터 및/또는 다른 특정값으로인 것을 포함한다. 유사하게, 앞의 "약"을 사용하여 값이 근사값으로 표현되는 경우, 특정값이 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해된다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여, 그리고 다른 종점과 독립적으로 둘 다 중요하다는 것도 추가로 이해된다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 있고, 또한 각각의 값은 값 자체에 추가하여 특정값인 "약"으로서 본원에 개시된다는 것도 이해된다. 또한, 용도 전반에 걸쳐서 데이터는 다수의 상이한 형식으로 제공되며, 이 데이터는 데이터 지점의 임의의 조합에 대한 종점, 개시점 및 범위를 나타낸다. 예를 들면, 특정 데이터 지점 "10"과 특정 데이터 지점 "15"가 개시되면, 10과 15 사이뿐만 아니라, 10 및 15에 대해 초과, 이상, 미만, 이하, 및 동등한 것도 간주하여 개시되는 것으로 이해된다. 또한, 2개의 특정 유닛 사이의 각각의 유닛도 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 10과 15가 기재되면, 11, 12, 13 및 14도 개시된다.
본원에 제공되는 범위는 해당 범위 내의 모든 값에 대한 약어로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 50의 범위는 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50뿐만 아니라, 예를 들면 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 및 1.9와 같은 상술한 정수 사이의 모든 개입 십진수로 이루어지는 군에서 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 양쪽 종점으로부터 확장되는 "내포된 하위 범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들면, 1 내지 50의 예시적인 범위의 내포된 하위 범위는 한 방향으로 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 및 1 내지 40, 또는 다른 방향으로는 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20, 및 50 내지 10을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 임상 결과의 바람직한 변화를 목표로 하는 다양한 활동을 포함한다. 예를 들면, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 본원에 기술된 바와 같이 청력 손실의 하나 이상의 임상 지표 또는 증상의 검출가능한 개선을 달성하는 것을 목표로 하거나 달성하는 모든 활동을 포함한다.
"포함하는(including)", "함유하는(containing)" 또는 "을 특징으로 하는(characterized by)"과 동의어인 과도기적 용어 "포함하는(comprising)"은 포괄적이거나 개방적이며, 추가적이고, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 대조적으로, "이루어진"이라는 과도기적 문구는 청구항에 명시되지 않은 모든 요소, 단계 또는 성분을 한정한다. "본질적으로 이루어진"이라는 과도기적 문구는 청구항의 범위를 본 개시에 제시된 청구된 실시형태의 지정된 재료 또는 단계 "및 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"으로 한정한다.
이하에 설명되고 청구범위에 인용된 실시형태는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
본 개시의 다른 특징 및 이점은 바람직한 실시형태의 이하의 설명, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시에 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 이하에 기술되어 있다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 인용된 다른 공개된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서는 제어될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐이고 한정하려는 의도는 아니다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 서열번호 1로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열, 서열번호 1의 핵산과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 예를 들면 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 AAV50과 같은 아데노연관 바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터, Barhl1 프로모터/인핸서, 또는 Pou4f3 프로모터일 수 있다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 서열번호 1의 핵산 서열 또는 서열번호1의 핵산과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터를 포함하는 청력 손실의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 의약 조성물을 제공하며; 상기 핵산 서열은 핵산에 작동적으로 연결되어 있다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 서열번호 1의 핵산 서열, 서열번호 1의 핵산과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 서열번호 1로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열, 서열번호 1의 핵산과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 유효량을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 예를 들면 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 AAV50과 같은 렌티바이러스 벡터 또는 아데노연관 바이러스 벡터일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 STRC 프로모터, Myo 6 프로모터, Myo7a 프로모터, 프레스틴 프로모터/인핸서, Myo15 프로모터/인핸서, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터, Barhl1 프로모터/인핸서, 또는 Pou4f3 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포는 줄기세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기세포는 유도만능 줄기세포이다.
일부 실시형태에 있어서, 발현 벡터는 피험체의 내이로의 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 주사 방법은 와우 개창술(cochleostomy), 정원창막(round window membrane), 내림프낭, 스칼라 메디아(scala media), 카날로스토미(canalostomy), 내림프낭을 통한 스칼라 메디아, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시형태에 있어서, 피험체는 청력 손실과 관련된 하나 이상의 유전적 위험 인자를 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 유전적 위험 인자는 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 피험체는 청력 손실의 임상 지표를 전혀 나타내지 않는다.
한 양태에 있어서, 본 개시는 인간 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이/변이로 이루어진 군에서 선택된 청력 손실을 유발하는 돌연변이/변이를 포함하는 형질전환 마우스를 제공한다.
본 발명으로 간주되는 주제는 명세서 말미의 청구범위에서 특히 지적되고 명백하게 청구된다. 본 발명의 상술한 다른 목적, 특징 및 이점은 수반되는 도면과 함께 취해지는 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 15q13-q21로부터 염색체 15에 있는 스테레오실린(STRC) 유전자의 위치를 나타낸다.
도 2는 STRC의 mRNA 전사 맵을 나타낸다.
도 3은 STRC 위유전자의 mRNA 전사 맵을 나타낸다.
도 4는 예시적인 LV-SIN 렌티바이러스 벡터의 선형 벡터 맵을 나타내며, GOI는 STRC 유전자를 나타낸다.
도 5는 예시적인 LV-ctrl 렌티바이러스 벡터의 선형 벡터 맵을 나타낸다.
도 6a-6d는 HEI-OC1 세포에 있어서의 dTom 발현을 나타내는 일련의 점도표이다. 특히, 벡터-인코딩된 dTomato 리포터 및 STRC 단백질을 발현하는 HEI-OC1 세포의 백분율이다. 유세포 분석은 MOI2에서 LV-ctrl 또는 LV-SIN으로 형질도입된 세포 및 비형질도입 대조군(NTC)에 있어서의 dTom 발현에 대한 세포내 염색시 수행된다. 나타낸 집단은 SSC-A/FSC-A 특성을 사용하여 살아있는 세포에 대해 사전 게이팅되고, 이어서 FSC-A/FSC-H 특성에 따라 단일 세포에 대해 게이팅된다. 도 6a는 NTC에 대한 데이터를 나타낸다. 도 6b는 MOI 1.277에서의 dTom 발현을 나타낸다. 도 6c는 MOI 3.278에서의 dTom 발현을 나타낸다. 도 6d는 MOI 10.279에서의 dTom 발현을 나타낸다.
도 7은 인간 거대세포바이러스 프로모터(hcmv-p)/STRC/dTom 카세트가 수포성 구내염 바이러스(VSV-g) 단백질로 슈도타입 형성된 제 3 세대 렌티바이러스에 통합된 유전자 치료 구축물의 예시적 실시형태를 통해 마우스의 내이로 예시적인 인간 STRC 유전자를 전달하는 형광 이미지를 나타낸다. 간단히 말하면, STRC 전사는 hcmv-p에 의해 제어되고, dTom 태그는 발현된 STRC 단백질의 검출을 용이하게 한다. 내부 유모세포(화살표) 및 외부 유모세포(별)로의 강력한 전달이 감지된다.
도 8은 성체 마우스 내이에 있어서의 슈도타입 형성된 LV-hcmv-dTom의 분포를 나타낸다. P30 C57Bl/6 마우스의 후방 반고리관에 1×10^6 PU를 전달한다. dtom의 발현은 STRC에 있어서의 돌연변이에 의해 표적화되는 세포를 표적화하는 이 벡터의 능력을 입증하는 나선 신경절뿐만 아니라 모든 유모세포에서 볼 수 있다.
본 개시는 전장 또는 거의 전장의 스테레오실린(STRC) 유전자가 내이 세포에 있어서의 STRC의 강력한 발현을 생성하기 위해 내이 특이적 프로모터(예를 들면, 마우스 또는 인간 Myo7A 프로모터)의 제어 하에서 렌티바이러스 벡터에 통합될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 본원의 기술은 유전자 요법을 통해 포유동물(예를 들면, 인간)에 있어서의 STRC 기능 상실 돌연변이를 구제하는 능력을 제공한다. 본 개시는 STRC 돌연변이로부터 야기된 장애를 겪고 있는 환자에게 STRC 기능을 회복하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
개요
청력 손실은 인간에게 가장 흔한 감각 장애이다. 세계보건기구(WHO)가 발표한 청력 손실 장애 규모에 대한 2018년 추산에 따르면, 전 세계적으로 청력 손실 장애를 가진 사람은 4억6,600만명(성인 4억3,200만명, 어린이 3,400만 명)에 이른다. 청력 손실 장애를 가진 사람의 수는 2030년까지 6억3천만 명, 2050년에는 9억명 이상으로 증가할 것이다. 청력 손실 장애를 가진 사람의 90% 이상(4억2천만명)이 전 세계의 저소득 지역에 거주하고 있다(청력 손실의 유병률에 관한 WHO 글로번 추산, Prevention of Deafness WHO 2018).
언어 습득 전의 난청의 50% 이상이 유전적이다(Centers for Disease Control and Prevention- Genetics of Hearing Loss). 유전적 청력 손실 및 난청은 전음성, 감음신경성, 또는 이 둘의 조합; 증후군(외이 또는 다른 기관의 기형, 또는 다른 기관계와 관련된 의학적 문제와 관련됨) 또는 비증후군(외이의 가시적인 기형 또는 임의의 관련 의학적 문제와 관련 없음); 및 언어 습득 전(언어가 발달하기 전) 또는 언어 습득 후(언어가 발달한 후)일 수 있다(Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview; GeneReviews; Richard JH Smith, MD, A Eliot Shearer, Michael S Hildebrand, PhD, and Guy Van Camp, PhD).
청각 장애는 신생아 1000명 중 약 1명에게 영향을 미치는 이질적인 장애이다. 현재, 42개 유전자와 69개 유전자좌(http://hereditaryhearingloss.org)가 비증후군성 상염색체 열성 난청(유전자좌 표기법 DFNB)과 관련되어 있다. 유럽 인구에서, 비증후군성 청력 손실(NSHL)의 20-40%는 DFNB1 유전자좌를 함께 구성하는 GJB2(MIM: 121011) 및 GJB6(MIM:604418)의 돌연변이로 인해 발생한다. 거의 예외 없이, 상염색체 열성 NSHL은 유사한 증상을 보이며, 청력 손실은 DFNB16 유전자좌를 포함하는 염색체 15q15.3에 STRC(MIM: 606440)가 할당된 언어 습득 전 발병 초기 후보 유전자 접근으로 극심하게 심각하다. 부동섬모는 종방향 강성과 외부 유모세포 구조에 필요한 교차결합을 형성하고, 기계적 편향시에 부동섬모 전달 민감한 채널이 세포 탈분극을 위해 열린다. 수개의 마우스 조직으로부터 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응(RT PCR)은 내이에 있어서 강하고 거의 독점적인 발현을 보이고 있으며, 녹아웃시에 이러한 주요 구조는 없었다(Vona, B et al. "DFNB16 is a frequent cause of congenital hearing impairment: implementation of STRC mutation analysis in routine diagnostics."　Clinical genetics　vol. 87,1 (2015): 49-55. doi:10.1111/cge.12332).
혼합성 난청 인구에 있어서 1% 이상의 STRC 결실 빈도가 계산되었으며, STRC 청력 손실의 발생률은 16,000명 중 1명으로 추정된다. 축적된 증거는 DFNB16이 NSHL을 포함하는 유전적으로 이질적인 병인의 상당 부분을 구성한다는 것을 시사한다. STRC 스크리닝의 진단 실행을 방해하는 한 가지 과제는 4개의 유전자: HISPPD2A(MIM: 610979), CATSPER2(MIM: 607249), STRC 및 CKMT1A(MIM: 613415)를 가진 분절 중복을 포함하는 영역에서 STRC로부터 하류 100kb 미만에 존재하는 98.9% 게놈 및 99.6% 코딩 서열 동일성을 가진 처리되지 않은 위유전자의 존재이다. CKMT1A 이외에도, 이러한 위유전자에는 그들을 비활성화시키는 돌연변이를 가지고 있다. STRC와 CATSPER2의 동형접합 결손은 CATSPER2가 정자 운동성에 필요하기 때문에, 남성과 여성 모두에 있어서의 난청, 및 배타적 남성 불임을 특징으로 하는 난청 불임 증후군(DIS; MIM: 611102)을 야기한다. 위유전자 포함 없이 정확한 서열 분석 데이터를 생성하는 것이 어려울 뿐만 아니라, 이러한 데이터베이스는 위유전자 데이터로 '오염'되어 있기 때문에, 돌연변이 해석을 위한 신뢰할 수 있는 일반적 자원 없이 이러한 데이터를 해석하는 것은 훨씬 더 어렵다(Vona, B et al.(2015)).
유전적 청력 손실의 70% 이상이 비증후군성이다. 비증후군성 난청에 대한 상이한 유전자좌는 DFN(DeaFNess의 경우)으로 지정된다. 유전자좌는 유전 방식에 따라 명명된다: DFNA(상염색체 우성), DFNB(상염색체 열성) 및 DFNX(X-연관). 상기 지정 뒤에 오는 숫자는 유전자 매핑 및/또는 발견의 순서를 반영한다(Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview; GeneReviews; Richard JH Smith, MD, A Eliot Shearer, Michael S Hildebrand, PhD, and Guy Van Camp, PhD). 일반적인 인구에서, 청력 손실의 유병률은 나이가 들수록 증가한다. 이러한 변화는 유전학과 환경의 영향, 및 환경적 요인과 개인의 유전적 소질 사이의 상호작용을 반영한다.
감음신경성 청력 손실(SNHL)은 인간에게 가장 흔한 신경퇴행성 질환이며, 현재 승인된 약리학적 개입은 없다. SNHL은 유전적 장애로 인해 발생할 수도 있고, 소리 외상 및 이독성과 같은 부상을 통해 얻을 수도 있다. 유전적 진단은 비증후군성 감음신경성 청력 손실을 일으키는 적어도 100개의 유전자가 있는 것으로 증명되었으며, 유전자에 있어서의 원인이 되는 변화의 대부분은 단일 뉴클레오티드 변이(SNV) 또는 작은 삽입/삭제(인델)인 것으로 나타났다. 최근에는, 복제수 변이(CNV)가 신경 발달 장애를 포함한 다수의 인간 질병에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. CNV; 즉, 약 1kb 이상의 유전자의 삭제, 삽입 또는 복제를 통한 변경은 유전자 발현, 표현형의 변이, 및 유전자 파괴를 통한 적응에 영향을 미치는 것으로 생각되며, 이는 질병 특성에 영향을 미칠 수 있다. 보다 최근에는, CNV가 SNHL의 주요 원인으로 인식되고 있다. Sheareret 외에는, 89개의 청력 손실 관련 유전자 중 16개에서 확인되었으며, STRC 유전자는 SNHL4의 가장 흔한 원인이라고 보고되어 있다(Yokota, Yoh et al. "Frequency and clinical features of hearing loss caused by STRC deletions."　Scientific reports　vol. 9,1 4408. 13 Mar. 2019, doi:10.1038/s41598-019-40586-7).
CNV가 검출된 청력 손실 환자의 임상 특성은 1,025명의 피험체(연령 범위, 0~70세, 평균 연령, 11.8세)를 피험체로 한 연구를 통해 확인되었다. 발병 연령을 기준으로 선천성-6세, 7-18세, 성인기(>18세) 또는 알려지지 않음으로 분류하는 경우, 원인이 되는 STRC 결실이 있는 피험체의 대부분은 청소년기에 SNHL로 진단되었다. 원인이 되는 동형접합성 STRC 결실은 분리된 상염색체 열성 또는 산발성으로 분류된 723 사례 중 14개(1.94%), 상염색체 우성 유전이 있는 264 사례 중 3개(1.14%)에서 발견되었다. STRC의 중복(3개 복제)이 19명(1.85%)에서 확인되었다. 3개의 STRC 복제가 병원성인지 또는 표현형에 영향을 미치는지의 여부는 불분명했다. 추가적으로, 27명의 피험체가 캐리어 결실로 정의된 ST9RC 이형접합 결실로 확인되었다. 캐리어 STRC 결실의 빈도는 청력 손실 코호트에서 2.63%(27/1,025)이었으며, 이는 정상적인 청력 대조군의 빈도와 동일했다(2.63%, 4/152)(Yokota, Yoh et al.(2019)).
유전적 청력 손실로 진단된 연구 피험체 중 STRC의 CNV 유병률은 모든 피험체의 5%(17/395)를 차지했다. 또한, 청력 수준을 기준으로 경도에서 중도 또는 고도에서 심도로 분류하는 경우, 원인이 되는 STRC 결실의 유병률은 경도에서 중도의 SNHL을 가진 피험체에서 12%(17/140)이었다. 결과적으로, STRC 중의 CNV는 GJB2 중의 SNV 후에 경도에서 중도의 SNHL의 두 번째로 흔한 원인이었다. 고도에서 심도 또는 비대칭 SNHL을 가진 피험체 중 누구도 STRC에서 질병을 야기하는 CNV를 가지고 있지 않았다(Yokota, Yoh et al.(2019).
최근 유전적 및 유전자 치료 기술의 발전으로 인해 유전자 치료를 통해 다양한 열성 유형의 청력 손실을 구제할 수 있는 것으로 나타났다(Akil et al., 2012; Askew et al., 2015). 내이로의 장기간 유전자 전달은 아데노연관 바이러스 벡터(AAV)를 사용하여 달성되었다(Shu, Tao, Wang, et al., 2016). 유전자 치료(CGF166)를 사용하여 청력 손실을 역전시키는 최초의 인간 임상 시험은 2014년 6월에 개시되어 2019년 12월에 완료되었다(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02132130). 이 시험에서는 달팽이관 지지 세포에서 atoh1의 과발현이 유모세포의 재생을 유도하는 효과를 평가했다. 이 도메인의 중개 연구를 위한 대체 질병 표적은 내이 내의 규정된 세포 그룹에 영향을 미치는 열성 유전적 청력 손실이다. 일반적인 집단 내의 돌연변이의 유병률 및 정상적인 세포 구조의 유지는 추가적인 고려 사항이다.
현재 청력 손실이나 난청을 예방 또는 치료하기 위해 승인된 치료제는 없다. 청력 손실 장애를 가진 사람들을 위한 현재 치료 옵션은 보청기 또는 인공 와우이다. 인공 와우 이식은 환자당 평생 비용이 $1,000,000가 넘는 관련 의료비용가 많이 드는 흔한 처치이다(Mohr PE, et al.(2000)). 미국에서는 고도에서 심도 청력 손실에 있어서 사회적 비용이 든다(Int J Technol Assess Health Care ;16(4):1120-35). 인공 와우 및 보청기의 평생 비용은 대부분의 사람들에게, 특히 저소득 지역(장애성 청력 손실을 가진 사람들의 대부분이 거주하는 곳)에 거주하는 사람들에게는 감당할 수 없을 만큼 높다. 인공 와우 및 보청기에 대한 비용 효율적인 대안을 제공하려면 치료 옵션이 필요하다.
본원에 기술된 바와 같이, 청력 손실의 흔한 열성 원인의 발생률을 주의 깊게 평가하고, 유전자의 크기와 바이러스 벡터 기술(즉, 운반 능력)의 최근 발전을 고려함으로써, 접근가능하고 상당히 흔한 환자 집단을 갖는 유전자 치료 프로그램을 개발하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들면, STRC는 전 세계적으로 선천성 청력 손상의 주요 원인이며, 평생 보청기를 사용해야 하고 심한 경우에 인공 와우 이식이 필요할 정도로 심각하다.
STRC
STRC 유전자는 경도에서 중도 청력 손실을 일으키는 것으로 알려진 난청 관련 유전자로 알려져 있으며, DFNB16 유전자좌의 염색체 15q15.3에서 큰 결실의 일부이다. STRC 유전자는 염색체 15번의 직렬 복제의 일부이고; 제 2 복제는 위유전자이다. 두 복제는 100kb 미만의 간격으로 텔로미어에서 중심체 방향으로 되어 있다. 위유전자는 엑손 20에서의 정지 코돈(예를 들면, n.t.4057C>T, a.a.Gln1353Stop)에 의해 중단된다.
STRC에는 대략 19kb를 포함하는 29개의 엑손이 포함되어 있다. STRC는 1,809개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 추정 신호 펩타이드와 여러 소수성 세그먼트를 포함하고 있어 원형질막 국소화를 암시한다. STRC 후 신호 펩타이드 절단의 예상 분자량은 194kD이다.
염색체 15번 염기쌍 위치(음성 가닥)를 포함하는 STRC의 엑손 맵은 표 2에 나타내어져 있다.
STRC 유전자에 일치하는 것으로 밝혀진 mRNA 전사체는 이하의 표 3에 나타내어져 있다. 일부 실시형태에 있어서, STRC 유전자는 Q7RTU9 서열을 포함한다.
스테레오실린은 내이, 신경계, 및 CD14+ 세포에서 발현된다. STRC 결실의 발생률은 농인 인구에서 약 1%에서 약 5% 사이로 추정된다(Yokota 2019). STRC 유전자에서의 돌연변이는 상염색체 열성 비증후군성 난청 유형 DFNB16과 관련되어 있다. DFNB16 청력 손실은 선천성 청력 손상의 주요 원인이다. DFNB16 청력 손실의 임상 특징은 다음과 같다(OMIM 603720):
·상 염색체 열성이다.
·대부분 선천성 발현한다.
·언어 습득 전 발병한다.
·청력 손실은 중도에서 심도이다.
·고주파수(예를 들면, 고주파수 경사)에 영향을 미친다.
·경시에 따라 안정될 가능성이 가장 높다.
STRC 유전자는 내이에서의 외부 유모세포의 부동섬모에서 발견되는 큰 세포외 구조 단백질인 스테레오실린을 인코딩한다. 이는 입체섬모 끝(OMIM 606440)의 적절한 응집 및 위치 지정에 중요한, 수평 상단 커넥터 및 외막 부착 크라운과 관련되어 있다. 외부 유모세포(OHC) 다발은 부동섬모라고 불리는 단단한 미세융모로 구성되어 있으며, 음파의 기계적 수용과 관련되어 있다.
STRC 널 마우스에 있어서, OHC 번들 팁 링크는 점차적으로 악화되고 서로 완전히 분리된다. 또한, 가장 높은 부동섬모의 팁이 지각막에 내포되지 못한다. STRC는 성숙한 OHC 모발 다발의 응집성을 유지하는, 수평 상부 커넥터의 형성에 필수적이다(Veropy 2011).
혼합성 난청 인구에서 ＞1%의 STRC 결실 빈도가 계산되었으며, STRC 청력 손실의 발생률은 16,000명 중 1명으로 추정된다. 축적된 증거는 DFNB16이 비증후군성 감음신경성 청력 손실(NSHL)을 포함하는 유전적으로 이질적인 병인의 상당 부분을 구성한다는 것을 시사한다(Vona, 2015).
청력 손실을 유발하는 것으로 알려진 15번 염색체 상의 STRC 변이체/돌연변이는 표 4에 설명되어 있다.
표 5에는 변이의 이름, 영향을 받은 유전자, 단백질 변화가 있는 경우, 야기되는 조건과 임상적 중요성을 보여주는 STRC 돌연변이가 있는 환자 31명이 나열되어 있다. 돌연변이의 위치, 등록번호 및 환자의 ID도 제공된다.
그 전체가 본원에 참고로 포함된, 미국 출원 공개 번호 2013/0095071은 내이의 둥근 창막에 아포토시스 단백질(XIAP)의 X-연결된 억제제를 전달하기 위해 돌연변이된 티로신 아데노연관 바이러스 벡터를 사용하여 연령 관련 청력 손실을 회복하기 위한 유전자 치료 방법을 설명한다. 그러나, 상기 간행물은 본원에 개시된 바와 같이, STRC 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 야기된 청력 손실의 발병을 예방하거나 지연시키거나 회복시키기 위해, 기능적인 STRC를 인코딩하는 핵산 서열의 전달을 고려하지 않는다.
또한, 청력 장애에 대한 임상 유전자 치료를 개발하기 위한 현재 기술 상태에 있어서의 중요한 함정은 인간의 청력 손실을 반영하는 동물 모델이 부족하다는 것이다. 인간의 성인 발병으로 인한 유전적 청력 손실에 대해 이용가능한 마우스 모델 중 다수는 선천성 청력 손실을 가지고 있어 전달 연구를 복잡하게 만든다. 청력 발달 후에 유전적 청력 손실이 발병한 모델은 거의 없다. 신생아 마우스에서의 벡터 전달은 성체 마우스에서의 전달과 상이한 형질감염 패턴을 야기한다(Shu, Tao, Li, et al., 2016). 상이한 벡터 시스템 및 유전자 표적을 사용하여 청력 구조를 평가하는 데 사용할 수 있는 신규한 동물 모델이 필요하다.
현재 청력 손실 또는 난청을 예방하거나 치료하기 위해 승인된 치료법이 없으며, 그러한 치료법을 테스트하는 데 유용한 전임상 동물 모델이 부족하다. 본 발명은 돌연변이된 STRC 유전자의 활성을 회복하고, 유모세포 생존을 촉진하여 청력 손실 또는 난청으로부터 고통받는 환자의 청력을 회복시키기 위해 내이로 STRC의 바이러스 벡터 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법, 및 그러한 조성물 및 방법을 테스트하기 위한 세포 기반 및 동물 기반을 기술하고 있다.
STRC 돌연변이로 인한 청력 손실은 일반적으로 두 집단으로 나타난다: (i) 피험체가 청력 손실을 가지고 태어난 선천적 집단, 및 (ii) 피험체가 출생 시 측정가능한 청력 손실을 가지고 있지는 않지만 일정 기간에 걸쳐서 점진적인 청력 손실을 보이는 진행성 집단. 따라서, 일부 경우에, 피험체가 STRC 유전자에서 돌연변이가 있을 수 있지만(예를 들면, 유전자 진단 테스트에서 검출된 바와 같이), 아직 청력 손실의 임상 지표나 증상이 나타나지 않으므로 치료적 개입을 개시할 수 있는 기회를 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 청력의 점진적인 퇴행 기간 동안 치료적 개입을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 그러한 기간 이전에 착수될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 청력 손실을 치료하는 방법은 청력 손실의 발병, 또는 청력 손실의 임상 지표 또는 증상의 진행을 예방하거나 지연시키는 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "청력 손실"은 소리를 듣는 능력의 감소를 설명하기 위해 사용되며, 난청 및 소리를 전혀 들을 수 없는 상태를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 위의 "치료" 설명에서 기술된 것과 같은 하나 이상의 바람직한 임상 결과를 달성하거나 달성하는 데 기여하기에 충분한 본원에 기술된 활성제의 양을 의미한다. 임의의 개별적인 사례에서 적절한 "유효량"은 용량 증량 연구와 같은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성제"는 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용되도록 의도되고, 생물학적으로 활성, 예를 들면 청력 손실 치료 목적이 되도록 의도된 분자(예를 들면, 본원에 기술된 Lenti 또는 AAV 유래 벡터)를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "의약 조성물"은 본원에 기술된 적어도 하나의 활성제 또는 둘 이상의 활성제의 조합, 및 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁화제, 증점제, 부형제 등과 같은 약학 전달에 사용하기 위해 적합한 하나 이상의 다른 성분을 포함하는 조성물을 말한다.
본원에 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 용어 "피험체" 또는 "환자"는 인간, 비인간 영장류, 설치류(래트, 마우스 및 기니아 피그 등) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유동물을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에 있어서, 피험체는 인간이다.
본 발명의 활성제의 용량은 활성제의 효능 및/또는 유효량을 결정하기 위해 인간 또는 다른 포유동물에서 수행된 연구를 기초로 계산될 수 있다. 용량 및 투여 빈도 또는 투여 시기는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있고, 활성제의 약학적 형태, 투여 경로, 하나의 활성제만 또는 다수의 활성제가 사용되는지의 여부(예를 들면, 필요한 제 1 활성제의 투여량은 이러한 제제가 제 2 활성제와 조합하여 사용되는 경우에 더 낮을 수 있음), 및 연령, 체중 또는 약물 대사에 영향을 미치는 임의의 의학적 상태의 존재를 포함한 환자 특성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
한 실시형태에 있어서, 단일 용량이 투여될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 다중 용량은 일정 기간에 걸쳐, 예를 들면 1일 4회, 1일 2회, 1일 1회, 매주, 매달 등과 같은 특정 간격으로 투여될 수 있다.
청력 손실의 임상적 특징
유전적 청력 손실 및 난청은 전음성, 감음신경성 또는 이 둘의 조합일 수 있다: 증후군(외이 또는 다른 기관의 기형 또는 다른 기관계와 관련된 의학적 문제와 관련됨) 또는 비증후군(외이의 가시적인 기형 또는 임의의 관련 의학적 문제와 관련 없음); 및 언어 습득 전(언어 발달 전) 또는 언어 습득 후(언어 발달 후).(Richard JH Smith, MD, et al.; Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview; GeneReviews; Initial Posting: February 14, 1999; Last Revision: January 9, 2014)
진단/테스트
청력 손실의 유전적 형태는 청력 손실의 후천적(비유전적) 원인과 구별되어야 한다. 청력 손실의 유전적 형태는 이과학, 청력학, 및 신체 검사, 가족력, 보조 검사(예를 들면, 측두골의 CT 검사) 및 분자 유전적 테스트를 통해 진단된다. 많은 유형의 증후군성 및 비증후군성 난청에 대해 가능한 분자 유전적 테스트는 진단 및 유전적 상담에서 중요한 역할을 한다.
청력 손실을 측정하는 데 사용되는 선택된 테스트:
1. 변조 이음향 방사(Distortion Product Otoacoustic Emissions: DPOAE).
변조 이음향 방사(DPOAE)는 비율이 1.1~1.3 사이인 두 개의 순음 주파수에 의해 달팽이관이 동시에 자극될 때 생성되는 반응이다. DPOAE의 생성 메커니즘에 대한 최근 연구에서는 DPOAE 반응에 두 가지 중요한 구성 요소가 존재한다는 점을 강조하며, 하나는 상호 변조 "왜곡"에 의해 생성되고, 다른 하나는 "반사"에 의해 생성된다.
DPOAE의 유병률은 정상적인 성인 귀에서 100%이다. 왼쪽 귀와 오른쪽 귀의 반응은 종종 상관 관계가 있다(즉, 매우 유사함). 정상 피험체의 경우에, 여성은 진폭 DPOAE가 더 높다. 노화 과정은 DPOAE 진폭을 낮추고 DPOAE 응답 스펙트럼을 좁힘으로써 DPOAE 응답에 영향을 미친다(즉, 더 높은 주파수에서의 응답이 점차적으로 감소함). DPOAE는 도마뱀, 마우스, 래트, 기니피그, 친칠라, 닭, 개, 원숭이와 같은 임상 연구에 사용되는 다른 동물 종에서도 기록될 수 있다(이음향 방사(Otoacoustic Emissions) 웹사이트).
2. 청각 뇌간 반응(ABR)
청각 뇌간 반응(ABR) 테스트는 내이(달팽이관) 및 청력을 위한 뇌 경로에 대한 정보를 제공한다. 이 테스트는 청각 유발 전위(AEP)라고도 한다. 이 테스트는 청력 선별의 종래의 행동 방법으로 어려움을 겪는 어린이나 다른 사람들에게 사용할 수 있다. ABR은 또한 나선형 신경절 세포에서 수많은 청각 신경 섬유의 동시 발생을 포함하는 신경 활동의 척도인 WAVE 1 진폭을 측정할 수 있다(Verhulst, 2016). ABR은 또한 뇌 또는 뇌 경로의 청력 손실 유형을 시사하는 징후, 증상 또는 불만이 있는 사람에게도 적용된다. 이 테스트는 인간과 동물 모두에게 사용된다. ABR은 심전도를 실행할 때 심장 주위에 전극을 배치하는 것과 유사한 전극을 머리에 붙이고 소리에 반응하여 뇌파 활동을 기록하는 방식으로 수행된다. 테스트를 받는 사람은 테스트가 진행되는 동안 조용히 쉬거나 잠을 잔다. 응답이 필요하지 않다. ABR은 또한 신생아 청력 선별 프로그램의 선별 검사로도 사용될 수 있다. 선별 검사로 사용되는 경우에, 강도나 음량 수준 중 하나만 확인하여, 아기는 선별 검사를 통과하거나 실패한다(미국 음성-언어-청각 협회(American Speech-Language-Hearing Association) 웹사이트).
청력 손실의 임상적 징후
청력 손실은 유형과 발병에 따라 설명된다:
유형
·전음성 청력 손실은 외이 및/또는 중이 뼈의 기형으로 인해 발생한다.
·감음신경성 청력 손실은 내이 구조(예를 들면, 달팽이관)의 기능장애로 인해 발생한다.
·혼합성 청력 손실은 전음성 청력 손실과 감음신경성 청력 손실이 결합된 것이다.
·중추 청각 기능장애는 제 8 뇌신경, 청각 뇌간, 또는 대뇌 피질의 수준에서 손상 또는 기능장애로 인해 발생한다.
발병
·언어 습득 전 청력 손실은 언어가 발달하기 전에 나타난다. 모든 선천성(출생시 존재) 청력 손실은 언어 습득 전 청력 손실이지만, 모든 언어 습득 전 청력 손실이 선천적인 것은 아니다.
·언어 습득 후 청력 손실은 정상적인 언어 발달 이후에 발생한다.
(Richard JH Smith, MD, et al.; Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview; GeneReviews; Initial Posting: February 14, 1999; Last Revision: January 9, 2014)
청력 손실의 중증도
청력은 데시벨(dB)로 측정된다. 각각의 주파수에 대한 임계값 또는 0dB 표시는 정상적인 젊은 성인이 톤 버스트를 50% 동안 인식하는 수준을 나타낸다. 개인의 임계값이 정상 임계값의 15dB 내에 있으면 청력은 정상으로 간주된다. 청력 손실의 중증도는 표 6과 같이 등급이 매겨진다.
청력 손실 비율
청력 손실 비율을 계산하기 위해 500Hz, 1000Hz, 2000Hz, 3000Hz의 순음 평균에서 25dB를 차감한다. 결과에 1.5를 곱하여 귀-특이적 레벨을 얻는다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 손상은 양호한 귀에 열악한 귀의 5배 가중치를 부여함으로써 결정된다. 일상 대화는 약 50-60dB HL(청력 수준)이므로 순음 평균을 기준으로 기능 손상을 계산하는 것은 오해의 소지가 있을 수 있다. 예를 들면, 45dB 청력 상실은 30%가 의미하는 것보다 기능적으로 훨씬 더 유의하다. 제한된 청력 상실이라도 언어 발달에 큰 영향을 미칠 수 있는 어린이에게는 다른 평가 척도가 적합하다[Northern & Downs 2002].
청력 상실의 주파수
청력 상실의 주파수는 이하과 같이 지정된다.
·저 (<500Hz)
·중 (501-2000Hz)
·고 (>2000Hz)
유전자 치료
유전자 치료는 유전 질환을 치료하기 위해 DNA를 환자에게 주입하는 것이다. 일반적으로, 새로운 DNA에는 기존 유전자의 질병 유발 돌연변이의 효과를 교정하는 기능을 하는 유전자가 포함된다. 실험 또는 치료 목적을 위한 유전자 도입은, 벡터 또는 벡터 시스템을 사용하여 유전 정보를 표적 세포로 이동시킨다. 벡터 또는 벡터 시스템은 유전자 도입 반응의 효율성, 특이성, 숙주 반응, 약리학 및 수명의 주요 결정 인자라고 여겨진다. 현재, 유전자 도입을 달성하는 가장 효율적이고 효과적인 방법은, 복제 결함을 만드는 바이러스 기반의 벡터 또는 벡터 시스템을 사용하는 것이다(PCT 공개 No. WO 2015/054653; Methods of Predicting Ancestral Virus Sequences and Uses Thereof).
성체 포유류 달팽이관의 감각 세포는 자가 복구 능력이 부족하고; 결과적으로, 현재의 치료 전략은 일차 감각 유모세포 또는 청각 신경을 형성하고 음향 정보를 뇌에 전달하는 나선형 신경절 뉴런의 영구적인 손상을 보상하기 위해 소리 증폭(예를 들면, 보청기), 더욱 양호한 소리 전달(예를 들면, 중이 보철/능동 임플란트) 또는 직접적인 신경 자극(예를 들면, 달팽이관 임플란트)에 의존한다. 이러한 접근법은 혁신적이었지만, 현대 생활에 있어서 중요한 복합적 인간 청력 기능을 복원하는 데는 최적이 아니다.
달팽이관으로의 치료적 유전자 도입은 연령 관련 및 환경적 유발 청력 손실로부터 STRC 등의 유전적 형태의 난청에 이르기까지 현재의 치료 표준을 더욱 향상시키는 것으로 여겨지고 있다. 300개 이상의 유전자 좌가 유전성 청력 손실과 연관되어 있으며 70개 이상의 원인 유전자가 설명되어 있다(예를 들면, Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Arch. Dis. Childhood, 100:271-8 참조). 이러한 접근법의 치료 성공은 달팽이관의 코르티 기관(OC)의 관련 치료 세포 표적에 대한 외인성 유전자 구조의 안전하고 효율적인 전달과 크게 관련된다.
종래의 바이러스 및 비바이러스계 유전자 도입 방법을 사용하여 달팽이관 등의 표적 조직 또는 포유류 세포에 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법은 핵산 표적화 시스템의 구성요소를 인코딩하는 핵산을 배양 중의 세포 또는 숙주 유기체의 세포에 투여하는 데 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템에는 DNA 플라스미드, RNA(예를 들면, 벡터의 전사물), 네이키드 핵산, 및 리포솜 등의 전달 비히클과 복합화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 핵산의 비바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다중 양이온 또는 지질: 핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 DNA의 작용제 강화 흡수를 포함한다(예를 들면, 공개번호 제 JP 2022/000041A; Systems, methods and compositions for targeted nucleic acid editing 참조).
벡터
현재까지 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 및 렌티바이러스는 모두 달팽이관 유전자 전달에 대해 테스트되었다. 이들 중 아데노연관 바이러스(AAV)가 가장 큰 잠재력을 입증했지만, AAV는 길이가 4.7kb 미만인 유전자의 DNA 패키징 용량이 제한되어 있다. STRC 유전자의 길이는 5.5kb이다. 2개의 다른 벡터 시스템이 테스트될 것이고, 하나는 렌티바이러스 벡터 시스템을 기반으로 하고 다른 하나는 이중 AAV 벡터 시스템을 기반으로 한다. 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터 시스템은 삽입 돌연변이 유발의 위험이 최소화되고 유모세포를 표적으로 하도록 슈도타입되었다. 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터 시스템은 귀에서의 안전성이 테스트되었으며 기저부에서 정점까지 95% 이상의 유모세포에 일관된 전달을 나타내었다.
렌티바이러스 벡터
렌티바이러스는 레트로바이러스과류에 속한다. 이는 유사분열 및 유사분열 후 세포를 감염시킬 수 있기 때문에, 레트로바이러스 중에서 특유하다. 이들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스 벡터는, 특히 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터이다.
제 3 세대 렌티바이러스 벡터 시스템은, 소위 자가 불활성화(SIN: self-inactivating) 벡터가 도입되었다. 바람직한 제 3 세대 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 제조 및 사용될 수 있으며, 예를 들면 2021년 12월 3일에 출원된 PCT/EP2021/084131에 기재되어 있고, 모든 목적에 대해 그 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
복제 불능을 달성하는 최적의 방법은, 3' LTR의 U3 영역의 삭제로 인한 분할 패키징 설계 및 자가 불활성화(SIN)를 설정하는 것이다. 유전자 vive vpr, vpu, nef 및 선택적으로 tat는 제거되어야 한다. 구체적으로, 렌티바이러스 시스템의 강화에는 U3 위치에 구성적으로 활성의 이종 프로모터, 반복 영역(R) 및 U5 영역을 포함하는 5' LTR, 프라이머 결합 부위(PBS), 스플라이스 도너 부위(SD), 패키징 신호(y), Rev 반응 요소, 및 선택적으로 스플라이스 수용체(SA) 부위, 카고 서열에 작동 가능하게 연결된 내부 인핸서/프로모터 영역, 선택적으로 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(PRE)를 포함하는 RNA 처리 요소를 포함하는 5' UTR, 및 결실된(SIN) U3 영역, 반복 영역(R) 및 U5 영역이 있는 3' LTR을 포함한다.
이러한 변형은 외부 바이러스 외피 단백질을 표면에 운반하는 능력에 대한 렌티바이러스 벡터의 슈도타입을 형성한다. 이러한 바이러스 표면 당단백질은 특정 세포 수용체와 상호 작용하여 숙주 세포로의 바이러스 진입을 조절하여 막 융합을 유도하고 피험체의 내이로 카고 로드(즉, STRC)를 전달할 수 있게 한다. 특정 강화는, MARAV-G, COCV-G, VSV-G 또는 VSV-G ts 등의 LDL 수용체 또는 LDL-R 계열 구성원, 및 SLC1A5 수용체, Pit1/2 수용체 및 PIRYV-G 수용체에 결합할 수 있는 바이러스 외피 당단백질로 렌티바이러스 벡터의 슈도타입을 형성하는 것을 가능하게 한다.
본원의 기술에 따라 사용될 수 있는 예시적인 렌티바이러스 벡터는 부분적으로 또는 전체적으로 PCT/EP2021/084131에 개시된 제 1 렌티바이러스 서열이다. 또한, 렌티바이러스 벡터는 PCT/EP2021/084131에 개시된 제 1 렌티바이러스 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 그 전체가 PCT/EP2021/084131에 개시된 제 1 렌티바이러스 서열로 구성될 수 있다. 대안적으로, 렌티바이러스 벡터가 야생형 VSG, VSV-G 또는 LDL 수용체 또는 LDL-R 계열 구성원과 결합할 수 있는 VSG 유도체로 슈도타입을 형성하는 경우, 및 야생형 VSV-G가 인디애나 VSV 혈청형에서 유래된 당단백질인 경우, PCT/EP2021/084131에 개시된 임의의 렌티바이러스 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 생체내 투여 시, 보다 높은 입자 안정성을 달성하고 숙주의 보체계에 의한 잠재적인 인식을 회피하기 위해, 열에 안정하고 보체 저항성이 있는 VSV-G 당단백질(VSV-G ts)을 대안적으로 사용할 수 있으며 LDL-R 또는 LDL-R 계열 구성원과 결합시킬 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 COCV-G 당단백질, 즉 Cocal 바이러스로부터 유래된 당단백질로 슈도타입을 형성할 수 있다. COCV-G는 LDL 수용체와 결합할 수 있다. 대안적으로, LDL-수용체와 결합할 수 있는 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 슈도타입을 형성하는데 사용되는 당단백질은 MARAV-G이다. 또한, 렌티바이러스 벡터는 SLC1A5-수용체와 결합할 수 있는 RD114 당단백질(GP)로부터 유래된 바이러스 외피 당단백질로 슈도타입을 형성할 수 있다. 또한, 이는 SLC1A5 수용체와 결합할 수 있는 BaEV GP로부터 유래된 당단백질일 수 있다.
또한, 렌티바이러스 벡터는 Pit1/2-수용체를 결합할 수 있는 바이러스 외피 당단백질로 슈도타입을 형성할 수 있다. Pitl 및 Pit2는 정상적인 세포 기능을 보장하기 위해 인산염 수송에 필수적인 역할을 하는 나트륨 의존성 인산염 수송체이다. 또한, Pitl 및 Pit2는 각각 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GALV)와 암포트로픽 뮤린 백혈병 바이러스(A-MuLV)에 대한 수용체로서의 역할을 한다. 따라서, 바이러스 외피 당단백질은 GALV로부터 유래될 수 있다. GALV GP는 Pit1/2-수용체를 결합할 수 있다. 대안적으로, 바이러스성 당단백질은 A-MuLV/Ampho로부터 유래될 수 있다. 이러한 Ampho GP는 Pit1/2-수용체를 결합할 수 있다. 또한, 이는 Pit1/2-수용체를 결합할 수 있는 당단백질로 슈도타입을 형성할 수 있고, 10A1 MLV로부터 유래될 수 있다.
또한, 렌티바이러스 벡터는 Pit1/2-수용체를 결합할 수 있는 당단백질로 슈도타입을 형성할 수 있고, 10A1 MLV로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 대안적으로 PIRYV-G로 슈도타입을 형성할 수 있다. 따라서, 당단백질은 PIRYV-G에 의해 들어갈 수 있는 숙주 세포로의 진입을 매개할 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 패키징하는 공정에 적어도 4개의 다른 발현 플라스미드가 제공된다. 렌티바이러스 입자는 상술한 바와 같이 렌티바이러스 벡터 게놈 자체를 인코딩하는 벡터 플라스미드, Gag 및 Pol을 코딩하는 패키징 플라스미드, Rev를 인코딩하는 플라스미드 및 본원에 언급된 외피 당단백질 중 적어도 하나를 인코딩하는 플라스미드로부터 제공될 수 있다. 벡터 플라스미드, Rev 인코딩 플라스미드 및/또는 Env 인코딩 플라스미드는 PCT/EP2021/084131에 개시된 핵산 서열일 수 있다.
본원의 기술은 STRC를 발현하는 귀 세포에서 높은 수준의 STRC 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 작동적으로 연결된 스테레오실린 유전자(STRC) 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, PCT/EP2021/084131에 개시된 바와 같은 제 3 세대 렌티바이러스 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, STRC를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 인간 Myo7a 프로모터 또는 마우스 Myo7a 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 서열번호 4와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 당업자는 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 나타내어지는 Myo7a 프로모터 서열이 프로모터의 능력을 촉진하기 위해 단축될 필요가 있음을 이해할 것이다: 렌티바이러스 벡터의 패키징 제한에 통합되는 STRC 재조합 핵산이 본원에 개시된다. 특히, 얻어진 LV-SIN 벡터를 바이러스 입자로 충분히 패키징하도록 하는 방식으로 Myo7a:STRC 재조합 뉴클레오티드가 본원에 개시된 렌티바이러스와 통합되는 능력을 촉진하도록 특정 프로모터 서열의 5' 말단의 결실을 포함하는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 다양한 유도체가 구성될 수 있음이 본 개시의 범위 내에서 명시적으로 고려된다.
Myo7a 프로모터는 특성화되었으며, 코어 프로모터(예를 들면, 서열번호 4)는 Myo7a 유전자의 제 1 인트론에 위치된 인핸서(예를 들면, Street et al. (2011) A DNA Variant within the MY07A Promoter Regulates YY1 Transcription Factor Binding and Gene Expression Serving as a Potential Dominant DFNA11 Auditory Genetic Modifier, JBC, 286(17): 15278-15286; Boeda et al.(2001) A specific promoter of the sensory cells of the inner ear defined by trans-Genesis, Human Molecular Genetics, 10(15): 1581-1589 참조)와 서열번호 5로 나타내어지는 서열의 인간 버전에 의해 명확하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 개시의 범위 내에서 서열번호 5로 나타내어지는 핵산 서열의 일부 또는 전부가 STRC의 전사 활성화를 촉진하기 위해 개시된 프로모터 서열과 조합하여 사용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 인핸서는 서열번호 5와 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4 또는 서열번호 6은 서열번호 5의 일부 또는 전부와 조합되어 프로모터/인핸서 조합을 생성할 수 있으며, 그런 후 이것은, STRC와 작동적으로 연결되어 본원에 개시된 제 3 세대 렌티바이러스 벡터와 통합될 수 있다. 이론에 구속됨이 없이, 이러한 프로모터/인핸서 조합은 생체내 STRC의 전사 활성을 더욱 증가시켜 STRC 돌연변이와 연관된 장애가 있는 환자에서의 STRC' 표현형을 구제하도록 본원에 개시된 LV-SIN 벡터의 능력을 향상시킬 수 있는 것으로 생각된다.
아데노연관 바이러스 벡터
아데노연관 바이러스(AAA; Adeno associated virus) 벡터는 다양한 인간의 질병 치료를 위한 유전자 전달용의 선도적인 플랫폼이다. 임상적으로 바람직한 AAV 캡시드를 개발하고, 혁신적인 생명공학을 활용한 게놈 설계를 최적화하는 최근 발전은, 유전자 치료 분야의 성장에 실질적으로 기여하고 있다. AAV 매개 유전자 대체, 유전자 편집 및 유전자 침묵에서의 전임상 및 임상적 성공은 AAV가 이상적인 치료 벡터에 대한 주요 선택이 되도록 도왔고, 2개의 AAV 기반 치료법이 유럽 또는 미국에서 규제 승인을 얻고 있다(예를 들면, Wang, D., Tai, P.W.L. & Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.(2019) Nat Rev Drug Discov 18, 358-378 참조). AAV 생물학에 대한 지속적인 연구와 관련 치료 과제 및 한계에 대한 이해 증가는 향후 임상 성공을 위한 기반을 구축할 것이다.
아데노연관 바이러스 벡터(AAV) 매개의 내이 유전자 치료가 유전성 청력 상실의 동물 모델에 적용되어 청력 기능을 향상시켰지만, 일부 달팽이관 세포 유형에서의 감염률이 낮다. 부분적으로 이것은 AAV의 큰 사이즈 때문이고, 최대 4.6kb의 작은 유전자만 절단된 단백질의 생성 위험없이 벡터에 효과적으로 통합될 수 있기 때문이다. 내이 유전자 치료가 청력 손실을 효과적으로 치료하기 위해서는 보다 높은 효율의 바이러스 벡터가 요구된다.
내이로 전달되는 AAV 매개의 내이 유전자 치료는 정확하고 집중적인 전략을 포함한다. 코르티 기관(OC)은 복잡한 청력 기능에 요구되는 프로세스인, 2종의 감각 유모세포: 소리에 의해 전달된 기계적 정보를 신경 구조로 전달되는 전기 신호로 변환하는 내부 유모세포(IHC) 및 달팽이관 반응을 증폭하고 조정하는 역할을 하는 외부 유모세포(OHC)를 포함한다. 내이의 다른 잠재적 표적은 나선형 신경절 뉴런, 나선연의 원주 세포가 포함되며, 이것은 보호 기능이 있고 초기 신생아 단계까지 유모세포로 직접 교차 분화되도록 촉발될 수 있는 인접한 덮개막 또는 지지세포의 유지에 중요하다.
고칼륨 내림프액으로 채워지는 달팽이관에 대한 주입은, 유모세포로의 직접 접근을 제공할 수 있다. 그러나, 이 섬세한 유체 환경을 변경하면 달팽이관 내 잠재력을 방해하여 주입 관련 독성의 위험을 높일 수 있다. 타원형 또는 원형 창 막(RWM)을 통해 달팽이관, 고실계 및 전정계를 둘러싸고 있는 외림프가 채워진 공간을 중이로부터 접근할 수 있다. 내이로 들어가는 유일한 뼈가 없는 개구부인 RWM은 많은 동물 모델에서 비교적 용이하게 접근할 수 있으며, 이 경로를 사용한 바이러스 벡터의 투여는 잘 허용된다. 인간의 달팽이관 이식은, 일반적으로 RWM을 통한 수술용 전극 삽입에 의존한다.
유전성 난청의 마우스 모델에서 청력의 부분적 구제는 기관형 달팽이관 체외 이식 및 생체내 내이 주입에서의 AAV 혈청형을 평가한 종래 연구의 결과이었다. 이러한 연구에서는 원형의(ancestral) AAV 캡시드 단백질을 함유하는 아데노연관 바이러스(AAV)가 높은 효율로 OHC를 형질 도입하는 것으로 관찰되었다. 이 발견은 종래의 AAV 혈청형을 사용한 달팽이관 유전자 치료법의 성공적인 개발을 제한하는 낮은 형질도입률을 극복한다. 원형의 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 AAV는 IHC 및 OHC뿐만 아니라, 유전적 청력 및 균형 장애로 인해 손상되는 다양한 다른 내이 세포 유형으로 내이 유전자 전달을 위한 가치있는 플랫폼을 제공할 수 있다. 높은 형질도입률을 제공하는 것 외에도, 원형의 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 AAV는 전신 주입 시 마우스와 비인간 영장류에 있어서 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 나타났으며 순환 AAV와 항원적으로 구별되어 종래의 AAV 벡터의 효능을 제한하는 기존 면역성의 면에서 잠재적인 이점을 제공한다.
원형의 AAV 캡시드 단백질을 함유하는 본원에 기재된 바이러스는 다양한 핵산을 내이 세포로 전달하는 데 사용될 수 있다. 내이 세포로 전달되고 발현될 수 있는 대표적인 형질전환 유전자는 신경영양 인자(예를 들면, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT3) 또는 열충격 단백질(HSP)-70), 면역조절 단백질 또는 항종양성 전사체를 인코딩하는 형질전환 유전자가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 내이 세포로 전달되고 발현될 수 있는 대표적인 형질전환 유전자는 항체 또는 그 단편, 안티센스, 침묵화 또는 긴 비암호화 RNA 종, 또는 게놈 편집 시스템(예를 들면, 유전자 변형 진 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 또는 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문식 반복(CRISPR))을 인코딩하는 형질전환 유전자가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 내이 세포로 전달되고 발현될 수 있는 대표적인 형질전환 유전자는 본원에 나타낸 핵산 STRC가 포함되지만, 선택적으로 본원에 개시된 제 3 세대 렌티바이러스 벡터에 포함되는 ACTG1, ADCY1, ATOHI, ATP6V1B1, BDNF, BDP1, BSND, DATSPER2, CABP2, CD164, CDC14A, CDH23, CEACAM16, CHD7, CCDC50, CIB2, CLDN14, CLIC5, CLPP, CLRN1, COCH, COL2A1, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL9A1, COL9A2, COL11A1, COL11A2, CRYM, DCDC2, DFNA5, DFNB31, DFNB59, DIAPHL, EDN3, EDNRB, ELMOD3, EMOD3, EPS8, EPS8L2, ESPN, ESRRB, EYA1, EYA4, FAM65B, FOXI1, GIPC3, GJB2, GJB3, GJB6, GPR98, GRHL2, GPSM2, GRXCR1, GRXCR2, HARS2, HGF, HOMER2, HSD17B4, ILDRl, KARS, KCNE1, KCNJ10, KCNQ1, KCNQ4, KITLG, LARS2, LHFPL5, LOXHD1, LRTOMT, MARVELD2, MCM2, MET, MIR183, MIRN96, MITF, MSRB3, MT-RNR1, MT-TS1, MYH14, MYH9, MY015A, MYOIA, MY03A, MY06, MY07A, NARS2, NDP, NF2, NT3, OSBPL2, OTOA, OTOF, OTOG, OTOGL, P2RX2, PAX3, PCDH15, PDZD7, PJVK, PNPT1, POLR1D, POLR1C, POU3F4, POU4F3, PRPS1, PTPRQ, RDX, S1PR2, SANS, SEMA3E, SERPINB6, SLC17A8, SLC22A4, SLC26A4, SLC26A5, SIX1, SIX5, SMAC/DIABLO, SNAI2, SOX10, SYNE4, TBC1D24, TCOF1, TECTA, TIMM8A, TJP2, TNC, TMC1, TMC2, TMIE, TMEM132E , TMPRSS3, TRPN, TRIOBP, TSPEAR, USH1C, USH1G, USH2A, USH2D, VLGR1, WFS1, WHRN 및 XIAP가 포함될 수도 있다.
유도만능 줄기세포(iPSC)
유도만능 줄기세포(IPS 또는 IPSC)는 세포를 재프로그래밍하고, 이를 배아 줄기세포의 모든 특징을 갖는 세포로 변형시키는 유전자의 도입을 통해 성체 세포, 예를 들면 피부, 간, 위 또는 다른 성숙한 세포로부터 생성된 줄기세포이다. 용어 만능은 신체 기관, 신경계, 피부, 근육 및 골격을 형성하는 3개의 배아 계통을 모두 포함하는 여러 세포 유형을 발생시키는 세포의 능력을 의미한다.
자가의 유도만능 줄기세포(iPSC)는, 이론적으로 환자특이적 세포 기반 장기 복구 전략을 위한 무제한의 세포 공급원을 구성한다. 그러나 이들 세대는 기술 및 제조상의 곤란함을 야기하며 임의의 급성 치료 방식을 개념적으로 방지하는 긴 과정이다. 동종이형 iPSC 기반 치료법 또는 배아 줄기세포 기반 치료법은 제조 관점에서 보다 용이하고, 잘 선별되고 표준화된 고품질 세포 생성물의 생성을 가능하게 한다. 그러나, 그 동종이형 기원으로 인해 이러한 세포 생성물이 거부될 수 있다. 세포의 항원성을 감소 또는 제거함으로써 보편적으로 허용되는 세포 생성물이 생성될 수 있다. 만능 줄기세포는 3배엽의 임의의 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에, 줄기세포 치료법의 적용 가능성은 광범위하다. 분화는 이식 부위의 기관 환경에서 계속해서 분화되고 성숙되는 선조세포를 이식함으로써 생체외 또는 생체내에서 행해질 수 있다. 생체외 분화는 연구자 또는 임상의가 절차를 면밀히 모니터링하고 이식 전에 적절한 세포 집단이 생성되도록 한다.
그러나 대부분의 경우, 미분화된 만능 줄기세포는 기형종을 형성하는 성향이 있기 때문에 임상 이식 치료법에서는 회피된다. 오히려, 이러한 치료법은 분화된 세포(예를 들면, 심부전을 겪고 있는 환자의 심근에 이식된 줄기세포 유래 심근세포)를 사용하는 경향이 있다. 이러한 만능세포 또는 조직의 임상 적용은 이식 후 세포의 성장과 생존을 제어하는 "안전 기능"으로부터 이익을 얻을 수 있다.
만능 줄기세포(PSC)는 빠르게 증식하고 다양한 세포 유형으로 분화되기 때문에 사용될 수 있다. PSC 계열은 다양한 기술을 통해 생성되고 명백한 면역원성 특징을 보유한 여러 구성원을 포함한다. PSC에서 유래된 조작된 세포 또는 조직과의 환자 적합성은 면역 거부의 위험과 면역억제의 필요성을 결정한다.
거부반응 문제를 회피하기 위해, 환자 특이적 만능 줄기세포를 생성하는 다양한 기술이 개발되고 있다. 이들은 체세포 핵을 제핵 난모세포로의 이식(체세포 핵 이식(SCNT) 줄기세포), 체세포와 ESC의 융합(하이브리드 세포), 및 특정 전사 인자를 사용한 체세포의 재프로그래밍(유도된 PSC 또는 iPSC)이 포함된다. 그러나 SCNT 줄기세포와 iPSC는 염색체 동일성에도 불구하고 각각 핵이나 세포 도너와 면역부적합을 가질 수 있다. SCNT 줄기세포는 난모세포에서 전달된 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 운반한다. mtDNA로 코딩된 단백질은 관련 소수 항원으로 작용하여 거부반응을 유발할 수 있다. iPSC의 재프로그래밍 및 배양 확장과 관련된 DNA 및 mtDNA 돌연변이와 유전적 불안정성은 면역 거부와 관련된 소수의 항원을 생성할 수도 있다. 이러한 문제는 SCNT 줄기세포 또는 iPSC를 사용한, 거부반응이 없는 환자 특이적 조직의 성공적인 대규모 조작 가능성을 감소시킨다.
CRISPR/Cas9 유전자 편집
또한, 본원에 기재된 방법은 STRC 유전자 돌연변이를 편집함으로써 청력을 구제하기 위한 CRISPR/Cas9((규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문식 반복 및 CRISPR 관련 단백질) 게놈 편집의 사용을 고려한다.
이 기술은 2개의 유전적 청력 상실 마우스 모델(Tmc1 및 Pmca2)에서 청력을 성공적으로 구제하는 데 사용되어 왔다(Askew, C et al., Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice; Sci Transl Med. 2015 July 8; 7(295):295ra108). 상기 기술은 주로 우성 청력 상실을 표적화하는 데 사용되어 왔지만, 이는 STRC 녹-인 마우스 모델에서, 및 궁극적으로 STRC 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되는 청력 상실을 갖는 인간에서의 열성 청력 상실을 표적화하고, 청력을 복원하기 위해 개발될 수 있다. 결함성 유전자 서열을 복구하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집의 사용은, 또한 PCT 공개 No. WO 2016/069910, PCT 공개 No. WO 2015/048577, 및 미국 출원 공개 No. 2015/0291966에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시에 따라 당업계 기술 내에 있는 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 생화학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있으며 이하의 실시예에 예시되어 있다. 본 발명은 이하의 실시예에서 더욱 설명되고, 이것은 청구범위에 기재된 방법 및 물질의 조성의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: STRC-돌연변이 마우스 모델의 개발
인간의 상태와 최대한 유사한 마우스 모델의 개발은 초기 임상 개발에 중요하다. 녹아웃 STRC 마우스 모델은 시판업체로부터 입수할 수 있으며 본 실시예에서 설명된 실험에 사용될 수 있다. 또한, CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 인간에게 청력 상실을 유발하는 것으로 알려진 돌연변이가 있는 마우스 모델도 생성되었다. STRC 마우스 모델은 인간 돌연변이가 마우스에서의 청력 상실을 유발한다는 것을 보여주며, 이는 하기에 기재된 유전자 치료 구성체의 평가에 상기 모델을 가치있게 만든다.
본 개시는 본 연구를 위해 인간 돌연변이를 보유하는 STRC 마우스 모델을 제공한다. 본원에 개시된 STRC 녹인 마우스 모델은 ABR, DPOAE 및 조직학에 의한 유모세포의 생존 및 청력 상실을 연구하는 능력을 제공한다. 마우스의 특성화는 STRC 마우스가 진행성 청력 상실, 부동섬모 팁 링크의 악화, 덮개막에 대한 부동섬모의 분리를 포함하여 인간 STRC 표현형의 전체 스펙트럼을 나타내는지의 여부를 확인하며, 이는 인간 DFNB16에 대한 STRC 마우스 모델의 생성을 입증할 것이다.
실시예 2: 유전자 치료를 위한 렌티바이러스-STRC 구축물의 생성
도 1에 나타낸 바와 같이, 스테레오실린(STRC) 유전자는 염색체 15번의 위치 15ql3-q21에 위치한다. 도 2는 STRC의 mRNA 전사 맵을 나타낸다. 도 3은 STRC 유사 유전자의 mRNA 전사 맵을 나타낸다.
새로운 제 3 세대 고용량 렌티바이러스 벡터 시스템을 사용하여 하나의 벡터에 대형 5,515bp STRC cDNA와 dTomato 리포터 유전자를 전달하였다. 간략하게, NCBI(NM_153700)에 기탁된 인간 STRC cDNA 서열(STRC)은 PCR에 의한 5' Kozak 공통 서열 및 SgrAI/AgeI 제한 부위뿐만 아니라 3' SalI 제한 부위의 측면에 위치하고 있었다. STRC 서열을 Myo7a 프로모터를 보유하는 최첨단 제 3 세대 자가 불활성화(SIN) 렌티바이러스 벡터에 클로닝하여 LV-SIN을 생성하였다(도 4에 나타낸다).
도 4는 목적 유전자(GOI) 및 프로모터(PROM)를 포함하는 일반적인 제 3 세대 렌티바이러스 벡터의 개략도를 나타내고, 여기서 GOI는 STRC이고 프로모터는 Myo7a(예를 들면, 서열번호 4 또는 서열번호 6)이다.
SFFV 프로모터에 의해 구동된 dTomato 리포터만을 발현하는 대조구 벡터는 도 5에 나타내는 바와 같이, pRRL.PPT.SF.dTomato.pre(LV-ctrl)를 생성하는 독특한 Agel 및 Sail 제한 부위를 사용하여 Agel 및 Sail의 측면에 위치하는 dTomato 서열을 벡터 백본에 삽입함으로써 발생되었다.
STRC 돌연변이에 대한 유전자 치료 옵션을 확립하기 위해, 고용량 제 3 세대 렌티바이러스 벡터는 천연 STRC 이소형의 대형 5,515bp cDNA 서열이 구비되었다. 벡터는 긴 말단 반복순서(LTR)로 자연적으로 존재하는 인핸서 및 프로모터 요소가 없는 자가 불활성화(SIN) 아키텍처를 가졌다. 이 설계는 삽입 돌연변이 유발의 위험성을 저감시킴으로써 향상된 안전성 프로파일을 제공하고, 또한 선택한 내부 프로모터(예를 들면, 프레스틴, 미오신 6, 미오신 7, 미오신 15 또는 hcmv 프로모터)를 사용하여 형질변환 유전자 발현을 유도하게 한다. 여기서 myo7a 프로모터는 형질변환 유전자 카세트의 높은 수준 및 지속적인 세포 유형 특이적 발현을 중재하기 위해 선택되었다. 바이러스 벡터 입자 제제의 적정 및 시험관내 및 생체내 적용 시 성공적으로 형질도입된 세포의 식별을 용이하게 하기 위해, 도 4에 나타낸 바와 같이 STRC cDNA를 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 통해 dTomato 리포터 유전자에 연결하여 렌티바이러스 벡터 LV-SIN을 생성하였다. dTomato를 발현하는 대응물은 단지 참조 및 대조(LV-ctrl)로서 제공되고, 도 5에 나타내어진다.
분할 패키징 시스템을 사용한 임시 생성은 STRC cDNA의 어려운 크기에도 불구하고 렌티바이러스 입자를 성공적으로 생성하였다. LV 역가는 시험관내 및 생체내 적용에 충분한 범위에 있었다.
실시예 3: 렌티바이러스 STRC 구축물은 귀 세포주 및 코르티 기관 배양물에서 발현된다.
STRC 발현을 유도하는 LV-SIN의 능력은 HEI-OC1 Otic 세포주에서 초기에 테스트되었다. MY07A와 dTomato는 연구 목적으로 사용할 수 있는 몇 안 되는 마우스 청력 세포주 중 하나인 달팽이관 유래 세포주 HEI-OC1의 시험관내 형질도입 시 성공적으로 발현되었다. HEI-OC 1 세포는 약물 활성화 세포사멸 경로, 자가포식, 노화, 세포 보호 메커니즘, 염증 반응, 세포 분화, 약리학적 약물의 유전적 및 후생적 영향 등을 조사하는 데 유용하다. 본원의 기술에 따르면, HEI-OC 1 세포를 사용하여 청력 세포에서의 유전자 구축물의 발현을 평가할 수 있다. 중요한 것은 HEI-OC 1 세포가 외부 유모세포의 중요한 운동 단백질인 프레스틴을 내생적으로 발현한다는 것이다. 이와 관련하여 HEI-OC 1 세포는 유용한 시험관내 청력 모델로서 제공된다.
벡터 기능과 내이 세포를 형질도입하는 능력을 평가하기 위해, LV-SINLV-SIN은 확립된 유모세포 유사 세포주 HEI-OC1을 사용하여 시험관내 성능에 대해 테스트되었다(Kalinec et al. (2003) A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurotol.).
HEI-OC1 세포를 형질도입 전날에 24-웰 플레이트의 웰당 3x104으로 시딩하였다. 형질도입 시점의 세포 수를 결정하기 위한 계수를 위해 3개의 웰을 수확하였고, 벡터의 역가를 기준으로 바이러스 벡터 상층액의 부피를 산출하여 규정된 감염 다중도(MOI), 즉 시딩된 세포당 규정된 입자 수를 적용하였다. 형질도입 절차는 적정 하에 기재된 것과 동일한 프로토콜을 따랐다. 벡터로 인코딩된 dTomato 리포터 단백질을 발현하는 세포의 비율은 적정 하에 기재된 바와 같은 유세포 분석으로 평가되었다.
세포가 트립신 보조 탈착을 사용하여 수확되었고, 400×g에서 5분간 원심분리에 의해 펠릿화되었다. 펠릿을 500 μL 고정 완충액(Cat # 420801, BioLegend, San Diego, CA, USA)에 재현탁시켰고, 세포를 실온에서 20분 동안 배양하였다. 샘플을 다시 펠릿화하였고, 1mL FACS 완충액으로 세척한 후, 1×세포내 염색 펌 세척 완충액(Cat # 421002, BioLegend)에 3회 재현탁하고 400×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 1차 항체 폴리클로날 토끼-항-미오신-VIIA(Catalog # 25-6790, Proteus BioSciences Inc., Ramona, CA, USA)를 사용한 배양은 1×세포내 염색 펌 세척 완충액으로 1:300 희석으로 실온에서 20분 동안 행해진 후, 1×세포내 염색 펌 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 2차 항체 Alexa Fluor® 488 AffmiPure Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)(Catalog # 711-545-152, Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Ely, UK)를 사용한 배양은 암소에서 실온으로 1×세포내 염색 펌 세척 완충액으로 1:800 희석으로 행해졌다. 1×세포내 염색 펌 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 세포 펠릿을 FACS 완충액에 재현탁하였고 CytoFLEX S 유세포 분석기에서 처리하였고 CytExpert 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
다양한 감염 다중도(MOI)로의 형질도입 시, 즉 시딩된 세포당 규정된 바이러스 벡터 입자수를 적용하면, 성공적으로 형질도입된 dTomato 양성 세포의 비율에 유의한 차이가 없는 것으로 테스트된 모든 MOI에 걸쳐 LV-SINLY-SIN과 LV-ctrl 사이의 유세포 분석에 의해 관찰되었다. 도 6a-6d는 HEI-OC1 세포에서의 dTom 발현을 보여주는 일련의 점 도표이다. 특히, 벡터로 인코딩된 dTomato 리포터와 STRC 단백질을 발현하는 HEI-OC1 세포의 비율이다. 일련의 다른 MOI에서 LV-ctrl 또는 LV-SIN으로 형질도입된 세포와 비형질도입 대조구(NTC)에서 dTom 발현에 대한 세포내 염색 시, 유세포 분석을 행하였다. 표시된 집단은 SSC-A/FSC-A 특성을 사용하여 살아있는 세포에 대해 사전 게이팅된 후 FSC-A/FSC-H 특성에 따라 단일 세포에 대해 게이팅되었다. 도 6a는 NTC에 대한 데이터를 나타낸다. 도 6b는 MOI 1.277에서의 dTom 발현을 나타낸다. 도 6c는 MOI 3.278에서의 dTom 발현을 나타낸다. 도 6d는 MOI 10.279에서의 dTom 발현을 나타낸다. 이는 대형 STRC cDNA를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효율이 보다 작은 벡터와 유사하다는 것을 확인시켰다.
면역형광 현미경 또는 유세포 분석을 통한 시각화는 비형질도입 HEI-OC1 세포에서 낮은 수준의 내인성 STRC 발현을 나타내었고, dTomato에 대한 신호는 없음을 나타내었다(도 6a-6d). 전체적으로, STRC 형질변환 유전자의 대형 크기에도 불구하고, 귀 표적 세포에서 STRC를 성공적으로 도입하고 발현시키는 완전한 기능의 LV 벡터 입자가 생성될 수 있었다.
실시예 4: 렌티바이러스 STRC 구축물이 마우스의 내이에서 발현된다.
STRC가 LV-STRC에 의해 전달되고 발현될 수 있음을 확인한 후, STRC가 생체내에서 적절하게 발현되는 능력을 조사하였다. 16일령 성체 C57BL/6 마우스를 염화나트륨 0.9%에의 케타민(150mg/kg), 자일로카인(6mg/kg) 및 아세프로마진(2mg/kg)의 혼합물을 복강내(IP) 주사하여 마취시켰다. 등쪽 귀후절개를 하여 후반고리관을 노출시켰다. 마이크로드릴을 사용하여 외이도관 성형술을 행하여 외림프 공간을 노출시켰다. 이어서, 0.1μL 눈금의 해밀턴 마이크로시린지와 36게이지 바늘을 사용하여 1μL의 벡터를 주입하였다. 외이도관 성형술을 골납으로 밀봉하였고 동물을 회복시켰다.
LV-SIN이 LV-STRC의 능력을 평가하도록 상술한 바와 같이 야생형 마우스의 내이에 주입되어 인간 STRC의 생체내 발현을 유도하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, STRC(dTom 발현으로 시각화됨)는 마우스의 내이에서 강력하게 발현되었다. 특히, 내부 유모세포(화살표)에서 강력한 발현이 관찰되었고 외부 유모세포(별표)가 검출되었다. 야생형 마우스에 대한 부작용이 없는 상태 하에 STRC의 성공적인 패키징 및 효율적인 생체내 전달의 특징은, LV-SIN이 STRC 관련 유전 질환의 생체내 유전자 치료에 바람직한 후보임을 나타낸다.
도 8은 성체 마우스 내이에서 슈도타입 형성된 LV-hcmv-dTom의 분포를 나타낸다. P30 C57B1/6 마우스의 후방 반고리관에 1×106 PU를 전달한다. dTom의 발현은 이 벡터의 능력을 입증한 나선형 신경절뿐만 아니라 모든 유모세포에서 볼 수 있어 STRC의 돌연변이에 의해 표적화되는 세포를 표적화한다.
실시예 5: 청력 회복에서의 LV-SIN 연구.
LV-SIN은 신생의 STRC 돌연변이 마우스 내이에 주입된다. LV-GFP/dTom을 주사한 마우스와 대조구 마우스에 대해 청력 테스트, 세포 및 분자 연구, 장기간 효과에 대한 분석을 행한다. LV-SIN은 생후 1개월에 유모세포 생존을 촉진하는지의 여부를 측정하기 위해 세포 수준에서 평가될 수 있다. LV-GFP/dTom을 주입한 대조구 돌연변이 귀에 있어서, 이 시점에서 유모세포가 손실될 것으로 예상된다. 한편, LV-SIN을 주입한 유모세포는 생존할 것으로 예상된다. 보다 양호한 청력 회복을 위한 주사 시술(달팽이관 절개술, 원형창막, 외이도관 성형술) 및 복용량. 중요한 것은, 청력 회복 가능성을 평가하기 위해 성체(1-6개월령) 마우스에 대해 주사를 행할 수 있다는 것이다. 중재가 여전히 효과가 있는 기간대에 대한 정보를 제공하는, 성체 주사 결과를 신생 마우스 결과와 비교할 것이다.
실시예 6: 환자 유도만능 줄기세포(iPS) 세포로부터 유래된 유모세포의 연구.
연구의 한 가지 중요한 양상은 본원에 개시된 기술이 인간 유모세포에 효과적일 수 있음을 입증하는 것이다. 연구에 사용할 수 있는 인간 측두골이 없기 때문에 iPS 세포주는 환자 섬유아세포와 대조구 섬유아세포를 사용한 환자 iPS 세포로부터 확립된다. 가장 빈번한 돌연변이를 갖는 환자로부터 섬유아세포를 수확하고 iPS 세포주가 확립된다. iPS 세포주는 유모세포를 포함한 내이 세포로 분화된다. 배양 시스템에 의해 LV-SIN은 iPS 유래 유모세포를 감염시키는 데 사용된다. 감염된 유모세포는 패치 클램핑에 의한 유모세포 형질도입 및 생존에 대해 연구된다. 미감염 및 미처리의 대조구 유모세포에 비하여 유모세포 생존 및 유모세포 기능이 향상될 것으로 예상된다. 이 연구는 인간 유모세포의 LENTI-STRC 감염 및 STRC 유전자 발현의 효과를 평가할 수 있는 기회를 제공한다. 이러한 성과는 결함이 있는 인간 유모세포가 LV-SIN으로 치료될 수 있음을 보여주는 것이며, 이는 향후 임상 연구를 위한 중요한 진전이다.
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cctcgcctgt ttcctgagcc ctgaggagct gcagagccta gtgcccctga gtgatccaac 6360 ggggccagta gaacgggggc tgctggaatg tgcagccaat gggaccctca gcccagaagg 6420 acgggtgagc ccctcagcac aagcctacaa gactttaggc ttcccctggg tctgtgtgga 6480 tggctttccc attgtgtcaa cttgagcaca gtggtgccag cccccatccc acttttgcaa 6540 cctccattcc ttactccatg gccattctta cctgttacca cctcttcctg gcccttctct 6600 atctggtctg tagcacccca aacataccct ttgccatttt gaacctaatc tactccagtc 6660 caatccctag ttccaaaccc tagcccaggc cctgggaaat tcagatgtgg gattagagag 6720 gaagttcaag gttcatctgt cttttctctc cagtcctaaa ccttctttgg ttacaggtgg 6780 catatgaact tctgggtgtg ttgcgctcat ctggaggagc ggtgctgagc ccccgggagc 6840 tgcgggtctg ggcccctctc ttctctcagc tgggcctccg cttccttcag gagctgtcag 6900 agccccagct tagagccatg cttcctgtcc tgcagggaac tagtgttaca cctgctcagg 6960 tttgcctgtc tcactccctg gcatgtaccc tccatccccg cttgagcccc agtcaagaga 7020 atcccattca gggataaaag cagcccctcc tttccctggg tgaacagtag aggtaaactc 7080 tgtctgcagg aggacgcctt cattcccttt cctcagatca agaagggacc tgagtcactg 7140 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aggaggagct ggggctttgg gaggagccca ggtgacccca 2280 gccaggctca aggcttccag ggctggcctg cccagaagca tgacatggtc tctctccctg 2340 cag 2343 <210> 6 <211> 2063 <212> DNA <213> mouse <400> 6 agagggatct gtctgtttca tttttcccgt accccgcacc cccccccaca cacacacaca 60 caagggtaaa gacagagggc acaatgggta gctgacctct ggtcagaagg atgagcaagg 120 aaggccttgg gaatcacaga taaaagctgg ccttgctggt tacctagtga gtcagagctc 180 agctctgtgg aatccttcag gttccctgtc agtgtggggc tggctttgcc gagctctgcc 240 catctcaggc cctggggaca tgggggcaca cagttcctgc tctgcagcag ccttccagca 300 actgaggaaa atgtacaaat catgtctgat cgaagtactg cagtgtcctt gataggcagt 360 gtccctagga gctgactctc agtctctgag ttcaagatct gtgccctgtt ctagtggaga 420 ggagagactt acatgcaggc cacagacaga ggtggcagag cagagatact gggaaggtgc 480 ggtagctaga gctaggaatt tatggccagg gccacgggca gaagctgggt tgggttgtgg 540 aaaacgaaat gatggaatac gacgatagat tggatttgga ggggcgaggg tggtatgaac 600 ttaagaccag ttctgcagtg gttcagatgt ggtgccctta agaggctcag gtgccagaaa 660 ccagtgcccc ttctggatag ggcagaaaac aggcagaacc 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ggataacagc 1560 acactcaaga ctcctaggac aggctgtggg ggccagttgt agagcttggg ggtggggtgc 1620 atcttgggga gtcctggttt ggatgttgtg tccagccaag gctccaggta ttgcaaagcc 1680 tgctcatcta tgtggtctct agtagtgccc tgacgaggga agctgggtga gcaggggagg 1740 ctactgggaa ctgagaccca gcaaaatcat gaggaagatg ggacgtgatc aggtgtccta 1800 accatgcaga gatggcaggt agtaacacat gtgacaagag accctgaggt cctgatggtt 1860 ggccccaggc ccgaggttcc cactggccag cagtgccccc tggagcttct atgccttgca 1920 tccctgctgg ttagctttac acagcacctt gggcaacctc tagacgttag tcagcagccc 1980 cagcacagcc cgcccctcat gctgatgtca ccacatccag accttcgagg cccccagggc 2040 tccgcctcct gggagaaggc ttt 2063

Claims (26)

  1. 스테레오실린(STRC)을 인코딩하는 핵산 서열 또는 그 일부; 및
    상기 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 렌티바이러스 발현 벡터는 제 3 세대 자가 불활성화(SIN) 렌티바이러스 벡터인 렌티바이러스 발현 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 SIN 렌티바이러스 벡터는 야생형 렌티바이러스 긴 말단 반복(LTR) 인핸서 요소 및 프로모터 요소가 결여되어 있는 렌티바이러스 발현 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터 및 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 렌티바이러스 발현 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 프로모터는 Myo7a이며, 선택적으로 Myo7a 인핸서를 더 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하며, 선택적으로 서열번호 5와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 Myo7a 인핸서를 더 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 렌티바이러스 발현 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 2와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 렌티바이러스 발현 벡터.
  9. 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산을 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터를 포함하는 청력 손실의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 의약 조성물로서,
    핵산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산에 작동적으로 연결되는 의약 조성물.
  10. 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터; 및 상기 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 세포.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 1과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 세포.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 세포.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 프로모터는 Myo7a인 렌티바이러스 발현 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 렌티바이러스 발현 벡터.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포는 줄기세포인 세포.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 줄기세포는 유도만능 줄기세포인 세포.
  17. 제 1 항에 기재된 렌티바이러스 벡터의 유효량을 그를 필요로 하는 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 청력 손실의 치료 또는 예방 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 프로모터는 STRC 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 거대세포바이러스(HCMV) 프로모터, 거대세포바이러스/치킨 베타-액틴(CBA) 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 프로모터는 Myo7a인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 프로모터는 서열번호 4 또는 서열번호 6과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 피험체의 내이에 주입함으로써 투여되는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 주입 방법은 와우 개창술, 정원창막, 내림프낭, 스칼라 메디아, 카날로스토미, 내림프낭을 통한 스칼라 메디아, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서,
    상기 피험체는 청력 손실과 관련된 하나 이상의 유전적 위험 인자를 갖는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 유전적 위험 인자 중 하나는 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 피험체는 청력 손실의 임상 지표를 전혀 나타내지 않는 방법.
  26. 인간 STRC 유전자에 있어서의 돌연변이/변이로 이루어진 군에서 선택되는 청력 손실을 유발하는 돌연변이/변이를 포함하는 형질전환 마우스.
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