CN110461146A - 视网膜劈裂的非人类动物模型 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了适合用作针对视网膜劈裂的动物模型的非人类动物。在一些实施方案中，所提供的非人类动物的特征在于视网膜劈裂蛋白‑1基因座中的断裂。在一些实施方案中，所提供的非人类动物的特征在于突变型视网膜劈裂蛋白‑1基因。在一些实施方案中，所述非人类动物可以描述为具有这样的表型：所述表型包括产生与视网膜劈裂相关的一种或多种症状或表型。本发明还提供了鉴定可以用于预防、延缓或治疗视网膜劈裂或眼部相关的疾病、障碍或病症的治疗候选物的方法。

Description

视网膜劈裂的非人类动物模型
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2017年2月27日提交的美国临时申请No.62/463,872和2017年10月24日提交的美国临时申请No.62/576,256的优先权权益，这两个临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表以引用的方式并入
序列表为2018年2月5日产生的名称为35518_10328WO01_SequenceListing.txt、大小为117KB的ASCII文本文件，其经由EFS-Web提交给美国专利及商标局，并且以引用的方式并入本文。
背景技术
世界卫生组织(WHO)估计，全世界约有1.8亿人视力残疾，其中近600万人的视力残疾是儿童失明的所有原因(Blindness:Vision 2020,The Global Initiative for theElimination of Avoidable Blindness,资料概览No.213,The World HealthOrganization,2000年修订)。视网膜劈裂蛋白-1(Retinoschisin-1)(Rs1)基因中的突变导致的X连锁青少年视网膜劈裂(XLRS)是在男性儿童中发生的早发性黄斑变性，其特征在于视网膜内层的劈裂，所述劈裂会导致严重的视力丧失。目前的治疗选择仅限于低视力助视器，诸如光学装置(例如，放大镜)、非光学装置(例如，作业照明、阅读架等)和电子装置。
发明内容
本公开涵盖以下认知：希望对非人类动物进行工程化改造，以提供改进的体内系统，所述改进的体内系统用于鉴定和开发可用于治疗和/或预防视网膜劈裂(例如，X连锁视网膜劈裂)的新疗法以及在一些实施方案中治疗方案。在一些实施方案中，本文所述的体内系统可用于鉴定和开发用于治疗眼部相关疾病、障碍和/或病症的新疗法。在一些实施方案中，所提供的体内系统还可用于鉴定和开发用于治疗与视力丧失相关的疾病、障碍和/或病症的新疗法。在一些实施方案中，所提供的非人类动物包含Rs1基因和/或其他功能上沉默的Rs1基因中的断裂，以使得主体RS1多肽不表达或产生，并且将所述非人类动物例如用于鉴定和开发恢复和/或改善视网膜结构和/或功能的疗法是所期望的。还提供了包含经工程化的变体或突变型Rs1基因，以使得变体或突变型RS1多肽从所述经工程化的变体或突变型Rs1基因产生的非人类动物，并且将所述非人类动物例如用于鉴定和开发恢复和/或改善视网膜结构和/或功能的疗法是所期望的。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了针对视网膜劈裂的改进的体内系统(或模型)。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了针对眼部相关疾病、障碍和/或病症的改进的体内系统(或模型)。
在一些实施方案中，提供了期望用作针对视网膜劈裂的动物模型的非人类动物。
在多个实施方案中，所提供的非人类动物的特征在于Rs1基因中的断裂(例如，全部或部分编码区缺失)或突变(例如，编码序列中的一个或多个点突变)。在一些实施方案中，Rs1基因中的断裂或突变会影响包含所述断裂或突变的非人类动物的一个或多个视网膜。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的Rs1基因中的断裂或突变会导致非人类动物中以下表型中的一者或多者的形成、发展或出现：视网膜劈裂样表型(例如，视网膜内层的劈裂、视网膜变性和视力下降)；黄斑或视网膜的劈裂；视力回退；视网膜纤维化；和视网膜色素沉着；并且在某些实施方案中，所述表型包括内层视网膜内的囊肿结构的发展，以及与野生型非人类动物相比ERG b-波和a-波反应的减少，其后是感光细胞的丧失。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的Rs1基因中的断裂或突变会导致非人类动物中的视网膜的早发性(例如，在或到出生后第15天、第18天、第21天、第24天或第27天)功能和形态表型。在一些实施方案中，视网膜的早发性功能缺陷可以通过与野生型非人类动物相比，(i)在暗适应和明适应ERG分析中相对于a-波的b-波的减少(产生负ERG)；(ii)ERG b-波的最大反应和灵敏度值的减小；(iii)ERG a-波的最大反应值的减小；或(iv)(i)-(iii)的组合来反映。在一些实施方案中，视网膜的早发性形态缺陷可以通过与野生型非人类动物相比的劈裂、椭圆体区(EZ)变宽、外层视网膜变薄或它们的组合来反映。
在一些实施方案中，非人类Rs1基因中的断裂(例如，缺失)或突变是内源性Rs1基因座处的内源性Rs1基因的断裂或突变。在一些实施方案中，非人类Rs1基因中的断裂(例如，缺失)是核酸序列插入内源性Rs1基因座(在某些实施方案中，包含报告基因)处的内源性Rs1基因中的结果。在一些实施方案中，断裂为或包括内源性Rs1基因的全部或部分的缺失，所述缺失消除了基因产物(例如，mRNA或多肽)的表达或产生。在一些实施方案中，非人类Rs1基因中的突变(例如，点突变)是核酸序列插入内源性Rs1基因座(在某些实施方案中，包含合成外显子(例如，包含点突变的合成外显子))处的内源性Rs1基因中的结果。在一些实施方案中，突变为或包括引起变体RS1多肽的表达的Rs1基因中的一个或多个点突变，所述变体RS1多肽与野生型RS1多肽相比具有减少或改变的功能；在某些实施方案中，非人类动物中的变体RS1多肽的水平小于野生型非人类动物中的野生型RS1多肽的水平。在一些实施方案中，与野生型RS1多肽相比，如本文所述的变体RS1多肽包含一个或多个氨基酸置换。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物具有包含经工程化的Rs1基因的基因组。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因定位于内源性Rs1基因座；并且在其他实施方案中，经工程化的Rs1基因定位于不同的基因座。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因为或包括异源性Rs1基因(例如，人Rs1基因)。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码全部或部分异源性RS1多肽的遗传物质。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码异源性多肽的盘状结构域的遗传物质，与野生型或亲本异源性RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换。在一些实施方案中，与野生型或亲本Rs1基因(例如，内源性或同源基因)相比，经工程化的Rs1基因包含引起变体RS1多肽的表达的一个或多个突变。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码啮齿动物RS1多肽的盘状结构域的遗传物质，与野生型或亲本啮齿动物RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含编码异源性RS1多肽的盘状结构域的遗传物质，与野生型或亲本异源性RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换；例如，经工程化的Rs1基因包含编码人RS1多肽的盘状结构域的核苷酸序列，与野生型人RS1多肽相比，所述盘状结构域含有氨基酸置换。在一些实施方案中，与野生型或亲本RS1多肽相比，由如本文所述的经工程化的Rs1基因编码的RS1多肽的盘状结构域包含一个或多个氨基酸置换。因此，在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的工程化Rs1基因编码特征在于包含氨基酸置换的盘状结构域的RS1多肽(例如，变体RS1多肽)。
在一些实施方案中，提供了这样的非人类动物：在其基因组中包含内源性Rs1基因座处的内源性Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失。在一些实施方案中，缺失导致缺乏由Rs1基因座产生的功能性RS1多肽。在一些实施方案中，缺失是至少外显子2-3的缺失。在某些实施方案中，缺失是外显子1和外显子2-3的至少一部分的缺失。在一些实施方案中，缺失为或包括内源性Rs1基因的核苷酸，所述核苷酸从紧邻起始(ATG)密码子的3’起跨越至外显子3的最后六个核苷酸(包括最后一个核苷酸在内)。在一些实施方案中，包含缺失的Rs1基因座还包含报告基因。在一些实施方案中，报告基因可操作地连接至Rs1启动子。在一些实施方案中，Rs1启动子是内源性Rs1启动子(例如，包含缺失的Rs1基因座处的内源性Rs1启动子)。在一些实施方案中，Rs1启动子是异源性Rs1启动子。
在一些实施方案中，Rs1基因座缺乏外显子1和外显子2-3的一部分(或包含它们的缺失)，例如缺乏从紧邻起始(ATG)密码子的3’起穿过外显子2至外显子3的最后六个核苷酸的核苷酸，并且包含框内融合至Rs1基因座的起始(ATG)密码子的报告基因编码序列。在某些实施方案中，报告基因编码序列(例如，lacZ基因的编码序列)可操作地连接至Rs1基因座处的内源性Rs1启动子(或在所述内源性Rs1启动子的转录控制下)。
在一些实施方案中，报告基因是lacZ基因。在一些实施方案中，报告基因选自荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP。在一些实施方案中，报告基因的表达模式类似于Rs1基因(例如，Rs1基因座处的野生型Rs1基因)的表达模式。在一些实施方案中，报告基因的表达类似于野生型或亲本RS1多肽的表达模式。
在一些实施方案中，提供了基因组包含经工程化的Rs1基因的非人类动物，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码与野生型RS1多肽相比具有一个或多个氨基酸置换的RS1多肽。与野生型RS1多肽相比具有一个或多个氨基酸置换的RS1多肽在本文中也称为变体或突变型RS1多肽。
在一些实施方案中，本文所述的氨基酸置换导致了由于例如蛋白质错误折叠而引起的非人类动物中所产生的功能性RS1多肽的水平的消除或显著降低，所述蛋白质错误折叠可以导致如本文所述的定位于非人类动物的内质网中的变体(或突变型)RS1多肽的聚集、二硫化物连锁的亚基组装缺陷以及RS1多肽不能插入ER的膜中(作为蛋白质分泌过程的一部分)。
在一些实施方案中，变体RS1多肽包含信号序列中的氨基酸置换，例如疏水性残基被脯氨酸或被亲水性残基或带电残基置换。
在一些实施方案中，变体RS1多肽包含在侧接盘状结构域的区域中，即在RS1区域和RS1多肽的C-末端区段中的氨基酸置换。在一些实施方案中，变体RS1多肽包含在38、40、59和223位置处的半胱氨酸的置换。在一些实施方案中，变体RS1多肽包含C59S置换。
在一些实施方案中，变体RS1多肽包含盘状结构域中的氨基酸置换。在一些实施方案中，变体RS1多肽包含在63、83、110、142和219位置处的半胱氨酸被非半胱氨酸残基置换。在其他实施方案中，变体RS1多肽包含盘状结构域中的非半胱氨酸残基被半胱氨酸置换。在特定实施方案中，置换是R141C置换。在一些实施方案中，变体RS1多肽包含盘状结构域中的带电残基被不带电残基置换、不带电残基被带电残基置换或带电残基被带相反电荷的残基置换。在其他实施方案中，变体RS1多肽包含通过插入或除去脯氨酸(即，用另一种残基替换脯氨酸，或反之亦然)而产生的盘状结构域中的置换。在另外其他实施方案中，变体RS1多肽包含通过插入或除去极性残基(即，用非极性残基替换极性残基，或反之亦然)而产生的盘状结构域中的置换。
在一些实施方案中，提供表达包含氨基酸置换的RS1多肽的非人类动物；在某些实施方案中，提供表达包含C59S或R141C置换的RS1多肽的非人类动物。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含外显子3中的点突变，并且编码具有C59S置换的RS1多肽；在某些实施方案中，外显子3中的点突变为或包括TGT至AGT的密码子变化。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因包含外显子5中的点突变，并且编码具有R141C置换的RS1多肽；在某些实施方案中，外显子5中的点突变为或包括CGC至TGC的密码子变化。
在一些实施方案中，本文公开的非人类动物是雄性动物。在X染色体上的内源性Rs1基因座处的Rs1基因中包含断裂或突变的雄性动物还应理解为针对所述断裂或突变的半合子。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物是雌性动物。在一些实施方案中，雌性非人类动物对于如本文所述的内源性Rs1基因座处的Rs1基因中的缺失是纯合的或杂合的。在一些实施方案中，雌性非人类动物对于如本文所述的经工程化的(或突变型)Rs1基因是纯合的或杂合的，在一些实施方案中，所述Rs1基因在内源性Rs1基因座处。
在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因还包含一个或多个选择性标记。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因还包含一个或多个位点特异性重组酶识别位点。在一些实施方案中，经工程化的Rs1基因还包含重组酶基因和侧接有一个或多个位点特异性重组酶识别位点的选择性标记，所述位点特异性重组酶识别位点被定向为引导切除。
在一些实施方案中，一个或多个位点特异性重组酶识别位点包括loxP、lox511、lox2272、lox2372、lox66、lox71、loxM2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT、Dre、rox或它们的组合。在一些实施方案中，重组酶基因选自Cre、Flp(例如，Flpe、Flpo)和Dre。在某些实施方案中，一个或多个位点特异性重组酶识别位点是lox(例如，loxP)位点，并且重组酶基因编码Cre重组酶。
在一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接至启动子，所述启动子驱动分化细胞中的重组酶基因的表达而不驱动未分化细胞中的重组酶基因的表达。在一些实施方案中，重组酶基因与有转录能力和发育调节的启动子可操作地连接。
在可操作地连接至启动子的重组酶基因的一些实施方案中，所述启动子选自鱼精蛋白(Prot；例如，Prot1或Prot5)、Blimp1、Blimp1(1kb片段)、Blimp1(2kb片段)、Gata6、Gata4、Igf2、Lhx2、Lhx5和Pax3。在可操作地连接至启动子的重组酶基因的一些实施方案中，所述启动子为或包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。在可操作地连接至启动子的重组酶基因的一些实施方案中，所述启动子为或包含SEQ ID NO:30。
在一些实施方案中，选择性标记选自新霉素磷酸转移酶(neoR)、潮霉素B磷酸转移酶(hygR)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puroR)、杀稻瘟素S脱氨酶(bsrR)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)。在一些实施方案中，选择性标记在启动子的转录控制下，所述启动子选自UbC启动子、Ubi启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、CAGGS启动子、EF1启动子、pgk1启动子、β-肌动蛋白启动子和ROSA26启动子。在某些实施方案中，选择性标记是neoR或hygR，并且在Ubi启动子的转录控制下。
在一些实施方案中，所提供的非人类动物产生了视网膜劈裂的(或与视网膜劈裂相关的)一种或多种体征、症状和/或病症。
在一些实施方案中，提供了这样的分离的非人类细胞或组织：所述分离的非人类细胞或组织的基因组包含(i)在内源性Rs1基因座处的内源性Rs1基因中的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)在外显子中包含一个或多个点突变的经工程化的Rs1基因，并且编码具有一个或多个氨基酸置换的Rs1多肽，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处。在一些实施方案中，细胞为淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞选自B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。在一些实施方案中，细胞来源于眼部或视网膜的细胞类型或这些细胞类型相关。在某些实施方案中，细胞是眼神经节细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、视锥细胞、视杆细胞或视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，组织选自脂肪、膀胱、大脑、乳房、骨髓、眼、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及它们的组合。在某些实施方案中，眼部组织选自巩膜、脉络膜或视网膜。
在一些实施方案中，提供了从如本文所述的分离的非人类细胞或组织制备、生成、产生或获得的永生化细胞。
在一些实施方案中，提供了这样的非人类胚胎干细胞：所述非人类胚胎干细胞的基因组包含(i)在Rs1基因座处的内源性Rs1基因中的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)在外显子中包含一个或多个点突变的经工程化的Rs1基因，并且编码具有一个或多个氨基酸置换的Rs1多肽，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处。在一些实施方案中，非人类胚胎干细胞是啮齿类动物胚胎干细胞。在一些特定实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞并且来自129品系、C57Bl品系或其混合物。在某些实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且是129和C57BL品系的混合物。在某些实施方案中，啮齿动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，并且来自基因组缺乏Crb1rd8突变(即，基因组包含野生型Crbs1基因)的C57BL品系。在一些实施方案中，如本文所述的非人类ES细胞包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、和SEQ ID NO:28中的任一者。在一些实施方案中，如本文所述的非人类ES细胞包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40中的任一者。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人类胚胎干细胞用于制备非人类动物的用途。在某些实施方案中，非人类ES细胞是小鼠ES细胞，并且用于制备这样的小鼠：所述小鼠包含(i)在Rs1基因座处的内源性Rs1基因中的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)在外显子中包含一个或多个点突变的经工程化的Rs1基因，并且编码如本文所述的具有一个或多个氨基酸置换的Rs1多肽，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处。在某些实施方案中，非人类ES细胞是大鼠ES细胞，并且用于制备这样的大鼠：所述大鼠包含(i)在Rs1基因座处的内源性Rs1基因中的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)在外显子中包含一个或多个点突变的经工程化的Rs1基因，并且编码如本文所述的具有一个或多个氨基酸置换的Rs1多肽，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处。
在一些实施方案中，提供了从本文所述的非人类ES细胞制备、产生、生成或获得的非人类胚胎。在某些实施方案中，非人类胚胎是啮齿动物胚胎；在一些实施方案中，是小鼠胚胎；在一些实施方案中，是大鼠胚胎。在某些实施方案中，所提供的非人类胚胎包含SEQID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29。在某些实施方案中，所提供的非人类胚胎包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:41。
在一些实施方案中，提供了本文描述的非人类胚胎用于制备非人类动物的用途。在某些实施方案中，非人类胚胎是小鼠胚胎，并且用于制备这样的小鼠：所述小鼠包含(i)在Rs1基因座处的内源性Rs1基因中的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)在外显子中包含一个或多个点突变的经工程化的Rs1基因，并且编码如本文所述的具有一个或多个氨基酸置换的Rs1多肽，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处。在某些实施方案中，非人类胚胎是大鼠胚胎，并且用于制备这样的大鼠：所述大鼠包含(i)在Rs1基因座处的内源性Rs1基因中的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)在外显子中包含一个或多个点突变的经工程化的Rs1基因，并且编码如本文所述的具有一个或多个氨基酸置换的Rs1多肽，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处。
在一些实施方案中，提供了包括如本文所述的非人类动物、分离的非人类细胞或组织、永生化细胞、非人类ES细胞或非人类胚胎的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗或诊断的药物(例如，抗体或其抗原结合片段)的本文所述的试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗、预防或改善疾病、病状或病症的药物(例如，抗体或其抗原结合片段)的本文所述的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了本文所述的核酸构建体或靶向载体。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体包含如本文所述的Rs1基因(或基因座)的全部或部分。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体包含含有如本文所述的Rs1基因(或基因座)的全部或部分的DNA片段。在一些实施方案中，提供这样的核酸构建体：所述核酸构建体包含待整合进啮齿动物Rs1基因座处的啮齿动物Rs1基因的核酸序列，所述核酸序列被与啮齿动物Rs1基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列侧接，其中所述核酸序列整合进啮齿动物Rs1基因会产生(i)啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因。在一些实施方案中，待整合的核酸序列包含报告基因，并且核酸序列的整合导致外显子1和外显子2-3的一部分的缺失。在一些实施方案中，待整合的核酸序列包含突变型Rs1外显子，以使得核酸序列整合进啮齿动物Rs1基因产生编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:28中的任一者。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体包含SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体包含一个或多个选择性标记。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体包含一个或多个位点特异性重组位点(例如，loxP、Frt或它们的组合)。在某些实施方案中，所提供的核酸构建体或靶向载体如附图所描绘。
在一些实施方案中，提供了本文所述的核酸构建体或靶向载体用于制备非人类ES细胞、非人类细胞、非人类胚胎和/或非人类动物的用途。
在一些实施方案中，提供了制备非人类动物的方法，所述方法包括(a)将核酸序列引入非人类胚胎干细胞的基因组中，以使得(i)Rs1基因座处的内源性Rs1基因的编码序列的全部或部分缺失，或(ii)Rs1基因座处的内源性Rs1基因的外显子突变，从而编码包含氨基酸置换的RS1多肽；所述核酸序列包含与Rs1基因座处的序列同源的多核苷酸；(b)从(a)获得经遗传修饰的非人类胚胎干细胞；以及(c)使用(b)的经遗传修饰的非人类胚胎干细胞来产生非人类动物。
在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，Rs1基因的外显子3突变，从而编码包含C59S置换的RS1多肽。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，Rs1基因的外显子3突变，从而编码包含C59S置换的RS1多肽，在Rs1基因的内含子2中产生25bp缺失，并且在Rs1基因的内含子3中产生28bp缺失。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，Rs1基因的外显子5突变，从而编码包含R141C置换的RS1多肽。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，Rs1基因的外显子5突变，从而编码包含R141C置换的RS1多肽，在Rs1基因的内含子4中产生10bp缺失，并且在Rs1基因的内含子5中产生29bp缺失。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，Rs1基因座中的编码序列的外显子1和外显子2-3的一部分缺失。在制备非人类动物的方法的某些实施方案中，Rs1基因座处的Rs1基因的13,716bp缺失。
在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，核酸序列还包含一个或多个选择性标记。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，核酸序列还包含一个或多个位点特异性重组酶识别位点。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，核酸序列还包含重组酶基因和与一个或多个位点特异性重组酶识别位点侧接的选择性标记，所述位点特异性重组酶识别位点被定向为引导切除。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，核酸序列还包含位于选择性标记下游的报告基因。
在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接至启动子，所述启动子驱动分化细胞中的重组酶基因的表达但不驱动未分化细胞中的重组酶基因的表达。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，重组酶基因可操作地连接至有转录能力的和发育调节的启动子。
在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：繁育(c)中产生的非人类动物，从而产生对于所述缺失是纯合的或者对于突变型(或经工程化的)Rs1基因是纯合的非人类动物。
在一些实施方案中，提供了制备非人类动物的方法，所述方法包括修饰非人类动物基因组，从而使得经修饰的基因组包含(i)内源性Rs1基因座处的内源性Rs1基因的编码序列的全部或部分缺失，或(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处；以及制备包含经修饰的基因组的非人类动物。在一些实施方案中，利用胚胎干(ES)细胞来修饰非人类动物基因组；即修饰ES细胞的基因组，并且将具有经修饰的基因组的ES细胞用于制备包含经修饰的基因组的非人类动物。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，修饰基因组从而使其包含编码具有C59S或R141C置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因。在制备非人类动物的方法的一些实施方案中，修饰基因组从而使其包含Rs1基因座中的编码序列的外显子1和外显子2-3的至少一部分的缺失；在某些实施方案中，从而使其包含Rs1基因座处的Rs1基因中的13,716bp的缺失。
在一些实施方案中，提供了从如本文所述的方法制备、生成、产生、获得或可从如本文所述的方法获得的非人类动物。
在一些实施方案中，鉴定用于治疗非人类动物中的视网膜劈裂(或与眼部相关的疾病、障碍或病症)的治疗剂的方法，所述方法包括(a)将一种或多种药剂施用于这样的非人类动物：所述非人类动物的基因组包含(i)Rs1基因座处的内源性Rs1基因的编码序列的全部或部分缺失，或(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因，其中在一些实施方案中，所述经工程化的Rs1基因在内源性Rs1基因座处；(b)进行一种或多种测定，以确定一种或多种药剂是否对与视网膜劈裂(或与眼部相关的疾病、障碍或病症)相关的一种或多种体征、症状和/或病症有效；以及(c)将对与视网膜劈裂(或与眼部相关的疾病、障碍或病症)相关的一种或多种体征、症状和/或病症有效的一种或多种药剂鉴定为治疗剂。
在一些实施方案中，提供了这样的非人类动物，所述非人类动物的基因组包含可操作地连接至Rs1基因的起始(ATG)密码子的报告基因，其中所述报告基因定位于Rs1基因的外显子1和外显子2-3的一部分的位置，从而导致Rs1基因测序缺失13,716bp。
在一些实施方案中，提供了这样的非人类动物，所述非人类动物的基因组包含经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因的特征在于存在TGT至AGT的外显子3中的点突变、内含子2中的25bp缺失以及内含子3中的28bp缺失，所述经工程化的Rs1基因编码具有C59S置换的RS1多肽。
在一些实施方案中，提供了这样的非人类动物，所述非人类动物的基因组包含经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因的特征在于存在CGC至TGC的外显子5中的点突变、内含子4中的10bp缺失以及内含子5中的29bp缺失，所述经工程化的Rs1基因编码具有R141C置换的RS1多肽。
在一些实施方案中，提供了视网膜劈裂的非人类动物模型，所述非人类动物表达或产生具有如本文所述的氨基酸置换的RS1多肽。
在一些实施方案中，提供了视网膜劈裂的非人类动物模型，所述非人类动物具有包含如本文所述的经工程化的Rs1基因的基因组。
在一些实施方案中，提供了视网膜劈裂的非人类动物模型，所述非人类动物具有包含如本文所述的Rs1基因(或基因座)中的编码序列的全部或部分缺失的基因组。
在一些实施方案中，提供了视网膜劈裂的非人类动物模型，所述非人类动物模型通过提供这样的非人类动物来获得：所述非人类动物(i)具有包含如本文所述的经工程化的Rs1基因的基因组，(ii)具有包含如本文所述的Rs1基因(或基因座)中的编码序列的全部或部分缺失的基因组，或(iii)表达具有如本文所述的氨基酸置换的RS1多肽；从而提供所述视网膜劈裂的非人类动物模型。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗或诊断的药物的本文所述的非人类动物或细胞。
在一些实施方案中，提供了用于制造用于治疗、预防或改善疾病、病状或病症的药剂的本文所述的非人类动物或细胞。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人类动物或细胞用于制造和/或开发用于医学(诸如用作药剂)的药物或疫苗的用途。
在一些实施方案中，提供了将如本文所述的非人类动物或细胞用于制造和/或开发针对视网膜劈裂的基因疗法药物的用途。
在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是视网膜劈裂。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是眼部相关的疾病、障碍或病症，或者由Rs1功能和/或活性的缺失引起。
在各种实施方案中，如本文所述的一种或多种表是或相较于参考物或对照物而言。在一些实施方案中，参考物或对照物包括非人类动物，其具有如本文所述的修饰、不同于如本文所述的修饰的修饰，或无修饰(例如野生型非人类动物)。
在各种实施方案中，本文所述的非人类动物是啮齿类动物；在一些实施方案中，小鼠；在一些实施方案中，大鼠。在一些实施方案中，本文所述的小鼠选自129品系、BALB/C品系、C57BL/6品系和混合的129xC57BL/6品系；在某些实施方案中，C57BL/6品系。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
本文中包括的由以下各图组成的附图仅用于举例说明目的而非用于限制。
图1示出了非人类(例如，小鼠)视网膜劈裂蛋白-1(Rs1)基因的组织(上图)和基因产物(下图)的未按比例绘制的示意图。上图：在每个外显子下方标示了外显子的编号，还标示了非翻译区(空心方框)和编码序列(竖线)。下图：标示了前导序列(LS)、Rs1结构域(Rs1)、盘状结构域(DD)和C-末端区(CT)以及选定的半胱氨酸和疾病相关的错义突变的位置(从Wu,W.W.H.等人,2003,J.Biol.Chem.278(30):28139-146的图1修改)。
图2示出了如实施例1中所述的用于在啮齿动物中产生Rs1基因中的缺失的靶向载体的未按比例绘制的示意图。lacZ报告基因以可操作连接的方式插入外显子1中的小鼠Rs1起始(ATG)密码子，并且使小鼠Rs1基因座的外显子1至外显子3的最后6个核苷酸的其余部分缺失(13,716bp缺失)。Rs1-lacZ-SDC靶向载体含有自缺失药物选择盒(例如，侧接有loxP序列的新霉素抗性基因；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。在同源重组时，靶向载体中含有的序列被插入如图所示的内源性鼠科动物Rs1基因座的外显子1-3的位置。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即来源于种系细胞含有如上文所述的Rs1基因座中的断裂的小鼠的子代将使选择性标记在发育期间从分化的细胞脱离。在每个外显子上方标示了连续外显子(竖线)的编号，还标示了非翻译区(空心方框)和编码序列(闭合线)。lacZ：β-半乳糖苷酶基因；Cre：Cre重组酶基因；Neo：新霉素抗性基因。
图3示出了鼠科动物Rs1基因的基因组组织的未按比例绘制的示意图，其示出了如实施例1中所述的示例性断裂(例如，外显子1-3的13,716bp缺失)。在每个外显子上方标示了外显子(闭合线)的编号，还标示了非翻译区(空心方框)。实施例1中所述的筛选测定中所用的探针的大致位置(即，Rs1KOmTU、Rs1KOmTD)以粗竖线标示。
图4示出了如实施例1中所述的示例性断裂鼠科动物Rs1基因的未按比例绘制的示意图。小鼠Rs1基因座的外显子1-3的缺失(13,716bp缺失)被示出为可操作地连接至小鼠Rs1起始(ATG)密码子的lacZ报告基因的插入的结果。在每个外显子上方标示了外显子(竖线)的编号，还标示了非翻译区(空心方框)和其余的编码序列(条纹矩形)。所选的核苷酸连接位置在每个连接下面以横线标记，并且以SEQ ID NO标示。
图5示出了如实施例1中所述的用于在啮齿动物(例如，小鼠)中产生突变型Rs1基因的靶向载体的未按比例绘制的示意图。在每个外显子上方或下方标示了连续外显子(竖线)的编号。通过同源重组来插入合成DNA片段和盒元件，由此在外显子3上方标示了外显子3中的示例性点突变(C59S；TGT至AGT)。Rs1C59S-SDC靶向载体含有自缺失药物选择盒(例如，loxP序列侧接的潮霉素抗性基因；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。在同源重组时，靶向载体中含有的合成DNA片段被插入如图所示的内源性鼠科动物Rs1基因座的外显子3的位置。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即来源于种系细胞含有如上文所述的Rs1基因座中的断裂的小鼠的子代将使选择性标记在发育期间从分化的细胞脱离。所选的核苷酸连接位置在每个连接下面以横线标记，并且以SEQ ID NO标示。
图6示出了图5中展示的小鼠Rs1基因的外显子3和突变型Rs1基因的设计的近视图的未按比例绘制的示意图(也参见实施例1)。示出了具有靶向点突变(C59S)的外显子3(黑色矩形)和周围内含子以及两个被设计为落在测定上的小缺失。通过同源重组进行的靶向载体整合在突变型Rs1基因中的周围内含子中产生了编码具有C59S置换和两个小缺失(25bp和28bp)的RS1多肽的一部分的外显子3。实施例1中所述的筛选测定中所用的探针的大致位置(即，Rs1-C59SmTU和Rs1-C59SmTD)以粗竖线标示。
图7示出了实施例1中所述的在靶向载体内含有的盒的重组酶介导的切除之后产生的啮齿动物(例如，小鼠)中的突变型Rs1基因的近视图的未按比例绘制的示意图。示出了具有点突变(所述点突变在Rs1基因产物中产生C59S置换)的外显子3以及其余的loxP位点。在重组酶介导的盒的切除之后保留的核苷酸连接位置在连接下面以横线标记，并且以SEQID NO标示。
图8示出了如实施例1中所述的用于在啮齿动物(例如，小鼠)中产生突变型Rs1基因的靶向载体的未按比例绘制的示意图。在每个外显子上方或下方标示了连续外显子(竖线)的编号。通过同源重组来插入合成DNA片段和盒元件，由此在外显子5上方标示了外显子5中的示例性点突变(R141C；CGC至TGC)。Rs1R141C-SDC靶向载体含有自缺失药物选择盒(例如，loxP序列侧接的潮霉素抗性基因；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。在同源重组时，靶向载体中含有的合成DNA片段被插入如图所示的内源性鼠科动物Rs1基因座的外显子5的位置。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即来源于种系细胞含有如上文所述的Rs1基因座中的断裂的小鼠的子代将使选择性标记在发育期间从分化的细胞脱离。所选的核苷酸连接位置在每个连接下面以横线标记，并且以SEQ ID NO标示。
图9示出了图8中展示的小鼠Rs1基因的外显子5和突变型Rs1基因的设计的近视图的未按比例绘制的示意图(也参见实施例1)。示出了具有靶向点突变(R141C)的外显子5(黑色矩形)和周围内含子以及两个被设计为落在测定上的小缺失。通过同源重组进行的靶向载体整合在突变型Rs1基因中的周围内含子中产生了编码具有R141C置换和两个小缺失(10bp和29bp)的RS1多肽的一部分的外显子5。实施例1中所述的筛选测定中所用的探针的大致位置(即，Rs1-R141CmTU和Rs1-R141CmTD)以粗竖线标示。
图10示出了实施例1中所述的在靶向载体内含有的盒的重组酶介导的切除之后产生的啮齿动物(例如，小鼠)中的突变型Rs1基因的近视图的未按比例绘制的示意图。示出了具有点突变(所述点突变在Rs1基因产物中产生R141C置换)的外显子5以及其余的loxP位点。在重组酶介导的盒的切除之后保留的核苷酸连接位置在连接下面以横线标记，并且以SEQ ID NO标示。
图11A-图11C通过lacZ表达、和免疫组织化学(IHC)示出了Rs1mRNA和蛋白质表达在Rs1无效的(Rs1KO)和Rs1突变型(Rs1C59S、Rs1R141C)动物的视网膜中的分布。A，lacZ染色，在Rs1KO动物的ONL和感光IS中展示出阳性X-gal信号。B，经由的Rs1 mRNA表达，展示出野生型(WT)动物中的内源性Rs1 mRNA表达。在来自Rs1KO动物的视网膜中未检测到Rs1 mRNA。C，IHC，示出了WT动物的所有视网膜层中的RS1蛋白分布。在Rs1KO动物中未检测到RS1蛋白表达，并且RS1蛋白表达被限于Rs1C59S和Rs1R141C动物的ONL和IS(GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层；ONL：外核层；IS：内节；RPE：视网膜色素上皮)。Rs1：红色；DAPI：蓝色。
图12A-图12D通过蛋白质印迹和ELISA测定示出了Rs1无效的(Rs1KO)和Rs1突变型(Rs1C59S、Rs1R141C)动物的视网膜中的RS1蛋白表达。A，还原条件下的SDS-PAGE凝胶的蛋白质印迹，示出了Rs1KO和C57BL/6来源雄性品系中的RS1表达。B，还原条件下的SDS-PAGE凝胶的蛋白质印迹，示出了野生型(WT)和Rs1C59S雄性动物中的RS1表达。C，还原条件下的SDS-PAGE凝胶的蛋白质印迹，示出了野生型(WT)和Rs1R141C雄性动物中的RS1表达。D，ELISA测定，示出了野生型(WT)、Rs1KO、Rs1C59S和Rs1R141C雄性动物中RS1蛋白的水平。每个条柱上方标示了在Rs1突变型动物中表达的RS1蛋白与在野生型同窝仔中表达的RS1蛋白相比较的百分比。D，在蛋白质印迹和ELISA测定中，Rs1敲除雌性动物的视网膜中的RS1蛋白表达。KO：纯合Rs1敲除(Rs1-/-)；HET：杂合Rs1敲除(Rs1-/+)。RS1 HET雌性动物具有与野生型(“WT”)雄性和雌性动物相似的RS1蛋白量。
图13A-图13D通过组织学、IHC和光学相干断层扫描(OCT)分析示出了Rs1无效的(Rs1KO)和Rs1突变型(Rs1C59S、Rs1R141C)动物的视网膜中的病理学变化。A，组织学检查，示出了Rs1KO、Rs1C59S和Rs1R141C雄性动物中的INL中的空腔和劈裂(红色三角形)以及INL和OPL的整体解体、感光细胞的退化以及ONL(垂直红色双头箭头)和内节/外节(垂直红色直线)的变薄。B，视网膜特异性细胞标记物(GFAP-神经胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白)的IHC显示出Rs1KO雄性动物中的INL的神经胶质增生(*标示活化的穆勒细胞)。C，通过使用Spectralis海德堡光学相干断层扫描(OCT)进行的体内成像在Rs1KO、Rs1C59S和Rs1R141C雄性动物中观察到视网膜劈裂和感光细胞退化。D，在杂合RS1敲除雌性(Rs1-/+)(“Het”)中未观察到劈裂，而纯合RS1敲除雌性(Rs1-/-)(“KO”)具有匹配半KO雄性的表型。
图14A-图14D示出了通过暗适应(DA)和明适应(LA)全视野视网膜电图(ERG)在20周龄动物中进行的外层视网膜功能的分析。A，在暗适应条件下从野生型(WT)、Rs1KO(KO)、Rs1C59S(C59S)和Rs1R141C(R141C)雄性动物获得的代表性ERG。B，在明适应条件下从野生型(WT)、Rs1KO(KO)、Rs1C59S(C59S)和Rs1R141C(R141C)雄性动物获得的代表性ERG。C，针对刺激亮度变化绘制的暗适应和明适应ERG的主要分量的代表性振幅。数据点表示六只雄性动物的平均值(±SD)。与野生型相比，Rs1KO、Rs1C59S和Rs1R141C(R141C)雄性动物的a-波和b-波二者的振幅都减小。刺激亮度(A和B)记录于最左侧波形图的左侧。D，在暗适应和明适应条件下从野生型(Rs1+/+)、纯合敲除(Rs1-/-)和杂合敲除(Rs1-/+)雌性动物获得的代表性ERG。在所有条件下携带者(杂合)雌性的ERG匹配WT对照的ERG。相比之下，纯合敲除雌性的ERG表型相当于半合敲除雄性的ERG表型，具有负波形和振幅减小的a-波。
图15示出了针对实施例4中所述的研究的实验设计，该研究对Rs1KO小鼠中视网膜的早发性表型进行研究。繁育♂Rs1(-/Y)或Rs1(+/Y)和♀Rs1(+/-)小鼠，从而获得Rs1 KO小鼠：Rs1(-/Y)或Rs1(-/-)以及Rs1 WT小鼠：Rs1(+/Y)或Rs1(+/+)。ERG在P15、18、21和24进行，以6天的间隔对每只小鼠进行ERG或OCT两次或更少。
图16A-图16F展示了ERG和OCT分析中的Rs1 KO小鼠的早发性表型。通过暗适应(DA)(A和D)和明适应(LA)(B和E)全视野ERG来评估外层视网膜功能，所述ERG显示出b-波相对于a-波有所减少，使得在所有时间点产生负ERG(定量数据未示出)。在整个观察时间过程(P15-P24)中呈现出视网膜劈裂表型(C和F，以黄色三角形标示)。
图17A-图17B示出了Rs1 KO小鼠和野生型(WT)小鼠的ERG参数随时间推移的变化(Naka-Rushton分析)。与WT对照相比，在Rs1 KO小鼠中在P15处的a-波和b-波的Rmax值二者均减小；在Rs1 KO小鼠中在P15处，DA-ERG和LA-ERG b-波的Rmax和灵敏度值二者均大大减小。在更大龄时，Rmax值持续减小，但是在Rs1 KO和WT小鼠中灵敏度值是相当的。
图18示出了OCT图像随时间推移的变化。在P15处观察到INL和OPL的显著劈裂(星号)，并且未观察到ELM的证据，这在其后的时间点倾向于缓和。在整个时间期期间，Rs1KO视网膜中的椭圆体区(EZ)比WT宽。
图19A-图19C示出了定量OCT分析的结果。在发育期期间，WT小鼠中的视网膜(包括外层视网膜)稍微变薄(C)。Rs1 KO小鼠中的视网膜(A和B)变薄，主要与中度劈裂有关，并且在时间期期间，Rs1 KO视网膜中的外层视网膜比WT薄(C)。
图20示出了小鼠、大鼠和人RS1多肽的比对。信号序列以下划线表示。序列不同的位置以“*”表示。
定义
断裂：在一些实施方案中，断裂可实现或代表插入、缺失、置换、替换、错义突变或DNA序列移码或它们的任何组合。插入可以包括整个基因或基因片段(例如外显子)的插入，其可以具有除内源序列之外的来源(例如异源序列)。在一些实施方案中，破坏可以增强基因或基因产物(例如由基因编码的蛋白质)的表达和/或活性。在一些实施方案中，断裂可减少基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，断裂可改变基因或编码的基因产物(例如，编码的多肽)的序列。在一些实施方案中，破坏可以截断或分裂基因或已编码的基因产物(例如已编码的蛋白质)。在一些实施方案中，断裂可以延伸基因或所编码的基因产物。在一些此类实施方案中，断裂可以实现融合多肽的组装。在一些实施方案中，断裂可影响基因或基因产物的水平但不影响其活性。在一些实施方案中，断裂可影响基因或基因产物的活性但不影响其水平。在一些实施方案中，断裂可对基因或基因产物的水平无显著影响。在一些实施方案中，断裂可对基因或基因产物的活性无显著影响。在一些实施方案中，断裂可对基因或基因产物的水平或活性都无显著影响。
非人类动物：如本文所用，是指并非人类的任何脊椎动物生物体。在一些实施方案中，非人类动物为圆口纲脊椎动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟。在一些实施方案中，非人类动物为哺乳动物。在一些实施方案中，非人类哺乳动物为灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、奶牛或啮齿动物。在一些实施方案中，非人类动物为啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。
实质上同源性：如本文所用，是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所理解，如果两个序列在对应的位置上含有同源的残基，则它们通常被认为是“实质上同源的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域的普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或被归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的置换可以通常被认为是“同源”置换。典型的氨基酸分类汇总如下。
如本领域中所熟知，氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任何算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序在以下文献中有所描述：Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-410；Altschul,S.F.等人，1997，酶学方法(Methods in Enzymology)；Altschul,S.F.等人，1997，核酸研究(NucleicAcids Res.)，25:3389-3402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编)，生物信息学：APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)，生物信息学方法和方案(分子生物学方法，第132卷)，胡马纳出版社(HumanaPress)，1998。除了鉴定同源序列以外，上文提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在相关的残基序列段(stretch)上是同源的，则这两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关序列段为完全序列。在一些实施方案中，相关序列段为至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或更多个残基。在一些实施方案中，相关序列段包括沿着完全序列的邻接的残基。在一些实施方案中，相关序列段包括沿着完全序列的非邻接的残基，例如通过多肽或其一部分的折叠构象集中在一起的非邻接的残基。在一些实施方案中，相关段具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。
实质上同一性：如本文所用，是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所理解，如果两个序列在对应的位置上含有相同残基，则这两个序列通常被认为是“实质上相同的”。如本领域中所熟知，氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任何算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序在以下文献中有所描述：Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.,215(3):403-10；Altschul,S.F.等人,1996,Meth.Enzymol.266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,NucleicAcids Res.,25:3389-402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编)Bioinformatics:APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)Bioinformatics Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,第132卷,Humana Press,1998。除了鉴定相同的序列以外，上文提及的程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在残基的相关序列段上是相同的，则这两个序列被认为是实质上相同的。在一些实施方案中，相关序列段为完全序列。在一些实施方案中，相关段具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。
靶向载体或靶向构建体：如本文使用的，指包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列相同或基本上相同并且提供靶向构建体(和/或其中包含的序列)经由同源重组至所述细胞、组织或动物的基因组内的位置中的整合的序列。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP或Frt位点)经由重组酶介导的盒交换而靶向细胞、组织或动物的某位置的靶向区域。在一些实施方案中，本文所述的靶向构建体还包含尤其受人关注的核酸序列或基因(例如，报告基因、同源基因、异源基因或突变型基因)、选择性标记、控制和/或调控序列以及编码重组酶或重组多肽的其他核酸序列。在一些实施方案中，靶向构建体可以完整或部分地包含所关注的基因，其中所关注的基因完整或部分地编码功能与内源序列所编码的蛋白质类似的多肽。在一些实施方案中，靶向构建体可包含所关注的突变型基因的全部或部分，其中所关注的突变型基因编码具有与由内源性序列编码的多肽相似的功能的变体多肽的全部或部分。在一些实施方案中，靶向构建体可以完整或部分地包含报告基因，其中所述报告基因编码使用所属领域中已知的技术容易鉴定和/或测量的多肽。
变体：如本文所用，是指显示出与参考实体的显著结构同一性，但相对于该参考实体在一个或多个化学部分的存在或水平上与该参考实体结构上不同的实体。在一些实施方案中，“变体”还在功能上与其参考实体不同。例如，“变体多肽”可由于氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价附接于多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一个或多个差异而与参考多肽不同。在一些实施方案中，“变体多肽”显示出与参考多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。可替代地或另外地，在一些实施方案中，“变体多肽”不与参考多肽共享至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，“变体多肽”共享参考多肽的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，“变体多肽”缺乏参考多肽的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，“变体多肽”显示出相对于参考多肽而言降低水平的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，如果所关注的多肽具有与亲本氨基酸序列相同但在特定位置上具有少数序列改变的氨基酸序列，则所关注的多肽被认为是亲本或参考多肽的“变体”。通常，相对于亲本而言，变体中少于15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的残基被置换。在一些实施方案中，“变体”变体相较于亲本具有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个置换的残基。通常，“变体”具有极少数目(例如，少于5个、4个、3个、2个或1个)的置换的功能性残基(即，参与特定生物学活性的残基)。此外，相较于亲代，“变体”通常具有不超过5个、4个、3个、2个或1个添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约10个、约9个、约8个、约7个、约6个残基，并且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个残基。在一些实施方案中，亲本或参考多肽是天然存在的多肽。如所属领域的技术人员将理解，所关注的特定多肽的多个变异体通常可以在自然界中发现，尤其当所关注的多肽是传染媒介物多肽时。
具体实施方式
提供了在编码视网膜劈裂蛋白-1(RS1)多肽的遗传物质中具有一个或多个断裂或突变的非人类动物，诸如啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)。具体而言，提供了具有Rs1基因的编码序列的全部或部分缺失的非人类动物，所述缺失产生不能在非人类动物中产生RS1多肽的突变型Rs1基因。还提供了在Rs1基因的编码序列中具有一个或多个突变的非人类动物，所述突变产生编码变体或突变型RS1多肽的突变型Rs1基因，与野生型RS1多肽(即，无突变的Rs1基因编码的RS1多肽)相比，所述变体或突变型RS1多肽包含一个或多个氨基酸置换。如本文所述的这种一个或多个氨基酸置换引起所产生的功能性RS1多肽的消除或显著减少，以及在非人类动物中形成与视网膜劈裂(例如，X连锁视网膜劈裂，XLRS)相关的病理和功能特征。所以，本文所公开的非人类动物特别可用于针对视网膜劈裂的治疗和/或改善的治疗性候选物的开发和鉴定。此类非人类动物提供了用于鉴定和开发用于视网膜劈裂的治疗和/或改善的疗法(例如，基因疗法)的细胞的来源。另外，此类非人类动物为有用的动物模型系统提供了开发用于治疗与其相关的眼部相关疾病、障碍和病症的疗法的能力。
在一些实施方案中，本文所述的非人类动物是雄性动物。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物是雌性动物。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物对于如本文所述的Rs1基因中的一个或多个断裂或突变的杂合子雌性动物。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物对于如本文所述的Rs1基因中的一个或多个断裂或突变是纯合的雌性动物。
在以下章节中详细描述了本公开的各个方面。这些章节的使用不旨在进行限制。每个章节可应用于本文所述的一个或多个实施方案。在本专利申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
视网膜劈裂蛋白-1和视网膜劈裂
视网膜劈裂蛋白-1是含有定位于染色体Xp22.2的六个外显子和五个内含子的、长度为约32.4kb的小基因，并且编码可翻译为224个氨基酸的前体多肽(称为视网膜劈裂蛋白)的3.1kb mRNA。视网膜劈裂蛋白作为含有四个不同结构域的单体表达：N-末端信号序列(23个氨基酸)，其指导蛋白质易位至细胞的外部；独特的Rs1结构域(长度为39个氨基酸的长/高度保守的序列基序)；盘状结构域(157个氨基酸)，其有助于RS1的粘附功能，以保持视网膜细胞构造和建立适当的突触连接；以及C-末端区段(5个氨基酸)。
视网膜劈裂蛋白在内质网中组装并作为功能性二硫键连接的同源八聚体(通过Cys59-Cys223二硫键连接在一起的八个亚基)分泌。八聚体内的亚基进一步组织成由Cys(40)-Cys(40)二硫键介导的二聚体。RS1通过离子力结合至感光细胞内节质膜的外部小叶，并且在细胞间相互作用和细胞粘附中发挥功能。RS1在视网膜中表达，在视杆和视锥内节、和双极细胞、以及松果腺中的表达特别明显。视网膜中的免疫染色将视网膜劈裂蛋白定位于感光细胞的内节、双极细胞以及内丛状层和外丛状层。在人、小鼠、大鼠和兔子中存在高序列同源性(小鼠和人之间具有96％同一性和97.8％相似性；另外参见图20)。
视网膜劈裂是一种严重的眼部疾病，可以分为退行性、遗传性、牵引性和渗出性形式。具体而言，视网膜劈裂的遗传性形式X连锁青少年视网膜劈裂(XLRS)是一种早发性黄斑变性，其特征在于视力下降、视网膜的神经感觉层异常劈裂以及视网膜电图(ERG)中的b-波减小。XLRS由视网膜劈裂蛋白-1(RS1)基因中的突变引起，并且以仅在男性中导致疾病的X连锁隐性模式遗传。RS1基因产物中的突变导致完全不产生RS1多肽，或产生功能降低或无功能的缺陷型RS1多肽。据报道，已有近200个RS1基因的突变与XLRS相关，并且表现为个体间存在高度差异的表型(例如，在Kim,D.Y.和S.Mukai,2013,Sem.Ophthalmol.28(5-6):392-6中有所综述)。在已报道的近200个突变中，约40％的致病突变是无义突变或移码突变，预计这些突变导致不产生全长多肽。然而，约50％(100/191)的致病突变是错义突变，所述错义突变允许产生全长突变型多肽(Molday,R.S.等人,2012,Prog.Retin.Eye Res.31:195-212)。大多数这些突变(85/191)存在于盘状结构域中，并且产生功能缺陷的错误折叠多肽。
XLRS有一系列表型。涉及中央凹的囊性黄斑病变是XRLS的特征性临床特征。具体而言，具有“车轮”或“辐条轮”图案的中央凹劈裂是眼底检查的特征性发现，存在于几乎100％的病例中，并且劈裂可以出现于最多50％的患者或视网膜外周。外周劈裂可导致内叶的裂孔和撕裂，可能出现来自无支撑交叉血管的溢血。其他外周变化包括类似于视网膜色素变性的色素沉着、视网膜纤维化和白雀斑、以及玻璃体-视网膜营养不良。ERG显示出显著的b-波减小，在一些患者中出现异常a-波，但是在很多患者中，a-波保持正常。
XLRS的临床表现以及病程是可变的，早在出生时、晚在学龄后出现，仅具有轻度视觉症状。这些变化和临床严重性似乎与基因型无关，并且女性携带者是无症状的。目前，光谱频域OCT(SD-OCT)是针对该疾病的主要诊断技术，而现有的管理选项选择仅限于低视力助视器。在所报道的小型研究中，碳酸酐酶抑制剂(CAI，局部和口服，已批准用于治疗青光眼)已显示出在约50％所治疗的眼睛中具有视力改善效果。
具有突变型或经工程化的Rs1基因的非人类动物
虽然对XLRS的理解取得了重大进展，但是XLRS的很多精确机制仍然未知。本公开基于用于产生和开发针对XLRS的治疗的改进的体内系统的产生，所述治疗依赖于目前已建立的系统中不存在的独特遗传结构。因此，本公开基于以下认识：可以通过在非人类动物(诸如啮齿动物(例如，小鼠))中的内源性Rs1基因座中产生遗传改变来提供用于产生和开发针对XLRS的治疗的改进的体内系统。如本文所述，本公开尤其明确展示了产生Rs1缺陷型和Rs1工程化的(例如，突变型Rs1)非人类动物(例如，啮齿动物，诸如小鼠)的示例性策略，所述非人类动物重现了人类XLRS疾病表型。不希望受任何特定理论的束缚，本文所述的策略可以用于根据需要产生其他Rs1缺陷型和/或Rs1工程化的非人类动物。例如，除以下实施例章节中描述的那些之外，还可以产生含有经工程化的Rs1基因的Rs1工程化的非人类动物，所述经工程化的Rs1基因含有突变或突变的组合。可以被工程化为内源性Rs1基因的突变的实例可见于X连锁视网膜劈裂序列变异数据库中。
在一些实施方案中，本文所公开的非人类动物具有内源性Rs1基因座处的Rs1基因的编码序列的全部或部分的基因组缺失，所述缺失导致缺乏在非人类动物中产生的功能性RS1多肽。在一些实施方案中，缺失包括至少Rs1基因的外显子2-3。外显子2编码RS1多肽的氨基酸18-26(氨基酸18-23是信号序列的最后5个氨基酸)。外显子3编码RS1多肽的氨基酸27-61。在在一些实施方案中，缺失包括Rs1基因的外显子1和外显子2-3的至少一部分。例如，外显子1的一部分可以包含在缺失中，所述外显子1的一部分从紧邻ATG起始密码子的3'开始直到外显子1的3'末端，并且编码RS1多肽的氨基酸2-17。在具体实施方案中，缺失是邻近的基因组片段的，所述基因组片段从Rs1基因的外显子1中紧邻ATG起始密码子之后开始，穿过外显子2，直到外显子3的3'末端或直到外显子3的3'末端处的六个核苷酸。
在其中Rs1基因座具有Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失的一些实施方案中，Rs1基因座包含报告基因。在一些实施方案中，报告基因可操作地连接至Rs1启动子，例如具有Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失的Rs1基因座处的内源性Rs1启动子。在一些实施方案中，Rs1基因座具有邻近的基因组片段的缺失，所述基因组片段从Rs1基因的外显子1中紧邻ATG起始密码子之后开始，直到外显子3的3'末端(或直到外显子3的3'末端处的六个核苷酸)，并且报告基因的编码序列框内融合至Rs1基因的ATG起始密码子。作为与Rs1基因座处的内源性Rs1启动子可操作连接的结果，报告基因的表达类似于Rs1基因的表达模式。适用于本文的报告基因包括例如lacZ，以及编码报告基因蛋白(诸如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP)的基因。
在其他实施方案中，本文所公开的非人类动物具有Rs1基因(例如，内源性Rs1基因或异源性Rs1基因)的编码序列中的一个或多个点突变，相对于野生型RS1多肽(由无点突变的Rs1基因编码)而言，所述点突变产生包含一个或多个氨基酸置换的变体RS1多肽；例如相对于野生型啮齿动物RS1多肽而言，包含一个或多个氨基酸置换的变体啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)RS1多肽，或相对于野生型人类RS1多肽而言，包含一个或多个氨基酸置换的变体人类RS1多肽。
本文所述的氨基酸置换导致从Rs1突变型等位基因(即，具有缺失或点突变的Rs1基因)产生的功能性RS1多肽水平的消除或显著降低。氨基酸置换可以导致功能性RS1多肽水平的消除或显著降低，所述消除或显著降低作为例如多肽的错误折叠、亚基或寡聚体组装缺陷以及多肽不能插入ER的膜中(作为蛋白质分泌过程的一部分)的结果而产生。
在一些实施方案中，氨基酸置换在这样的信号序列中：所述信号序列导致具有氨基酸置换的变体RS1多肽不能插入ER的膜中(用于进行分泌)。例如，信号序列中的疏水性残基被脯氨酸或被亲水性/带电残基置换可以防止信号序列采取插入ER膜所需的α-螺旋二级结构。在具体实施方案中，氨基酸置换是L13的置换(例如，L13P)。
在一些实施方案中，氨基酸置换在侧接盘状结构域的区中，即由氨基酸24-62和C-末端区段(由氨基酸220-224组成)组成的Rs1区。在具体实施方案中，置换是位置38、40、42、59或223处的半胱氨酸被非半胱氨酸残基(例如，Ser、Arg、Trp、Tyr或Gly)置换。C40负责形成C40-C40二硫键连接的二聚体，C59和C223形成分子间二硫键，从而允许RS1二聚体组装成八聚体。因此，位置40、59或223处Cys的置换仅对蛋白质折叠和分泌具有有限效果，但是仍然会导致包含这种置换的突变型RS1多肽不能作为细胞粘附蛋白来发挥功能。在一些实施方案中，位置40、59或223处的半胱氨酸已被Ser、Arg、Trp、Tyr或Gly置换。置换的具体实例包括C38S、C40S、C42S、C59S、C223S、C223R和C223Y。
在其他实施方案中，氨基酸置换在RS1多肽的盘状结构域中，所述盘状结构域由氨基酸63-219组成。
在一些实施方案中，盘状结构域中的置换是盘状结构域中五个Cys残基之一的置换：C63、C83、C110、C142和C219。Cys63和Cys219以及Cys110-Cys142形成两个分子内二硫键，所述分子内二硫键对于蛋白质折叠是重要的。在一些实施方案中，位置63、83、110、142或219之一处的半胱氨酸已被非半胱氨酸残基(例如，Ser、Arg、Trp、Tyr或Gly)置换。置换的具体实例包括C63S、C83S、C110S、C110Y、C142S、C142R、C142W、C219S、C219R、C219W和C219G。
在一些实施方案中，盘状结构域中的置换是不直接涉及二硫键的形成的氨基酸残基的置换，但是对于蛋白质折叠、盘状结构域的形成或稳定、和/或邻近亚基之间的分子间相互作用是重要的。此类残基的实例包括高度保守的、溶剂难以接近的核心残基，诸如E72、G109、E146、R182和P203，以及R141和D143。在一些具体实施方案中，置换是非半胱氨酸残基被半胱氨酸替换的置换，它可以影响硫醇交换；例如，W92C、W96C、R141C、R182C、R200C、P203C和R209C。在一些其他具体实施方案中，置换是通过以下方式来影响蛋白质电荷的置换：使氨基酸残基的电荷消除或反转或者通过用带电残基替换不带电残基而不影响硫醇残基；例如，E72K、W96R、R102W、R102Q、G109E、G109R、R141H、D143V、N179D和R213W。在其他实施方案中，置换是可以通过插入或除去Pro残基来影响构象稳定性的置换；例如，S73P、L127P、P192S、P192T、P193S和P203L。在另外其他实施方案中，置换是可以通过插入或除去极性残基(即，用极性残基替换疏水性残基或用疏水性残基替换极性残基)来影响疏水性核心的置换；例如，I136T和N163Y。
在一些实施方案中，本文所述的非人类动物包含Rs1基因中的一个或多个点突变，所述点突变导致所编码的RS1多肽中的半胱氨酸[Cys,C]被丝氨酸[Ser,S]置换，或精氨酸[Arg,R]被半胱氨酸[Cys,C])置换。在某些实施方案中，置换是C59S置换。在某些实施方案中，置换是R141C置换。
在一些实施方案中，包含内源性Rs1基因或经工程化的Rs1基因中的断裂或突变的如本文所述的非人动物还包含来自异源物种(例如，人类)的遗传物质。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物包含经工程化的Rs1基因(即，突变型人类Rs1基因)，其中所述突变型人类Rs1基因编码包含上文所述的置换(例如，C59S置换或R141C置换)的人类RS1多肽。在某些实施方案中，如本文所述的非人类动物包含随机插入非人类动物的基因组以表达包含上文所述的置换(例如，C59S置换或R141C置换)的人类RS1多肽的突变型人类Rs1基因。
视网膜劈裂蛋白-1序列
示例性人类和非人类Rs1测序如SEQ ID NO:1-22所示并汇总于表1中。
包含lacZ报告基因的非人类(例如，小鼠)Rs1等位基因的断裂所用的示例性自缺失盒、在小鼠鱼精蛋白1启动子的转录控制下的Cre重组酶基因以及在泛素启动子的转录控制下的loxP位点侧接的新霉素抗性基因如SEQ ID NO:23(8,202bp)所示。
非人类(例如，小鼠)Rs1等位基因的示例性缺失(外显子1-3的序列从内源性啮齿动物Rs1基因座缺失)如SEQ ID NO:24(13,716bp)所示。
在重组酶介导的选择盒切除之后的断裂的小家鼠(Mus musculus)Rs1等位基因的示例性部分如SEQ ID NO:25所示。
包含自缺失潮霉素选择盒的编码C59S氨基酸置换的突变型非人类(例如，小鼠)Rs1等位基因的示例性部分如SEQ ID NO:26所示。
在重组酶介导的选择盒切除之后的编码C59S氨基酸置换的突变型非人类(例如，小鼠)Rs1等位基因的示例性部分如SEQ ID NO:27所示。
包含自缺失潮霉素选择盒的编码R141C氨基酸置换的突变型非人类(例如，小鼠)Rs1等位基因的示例性部分如SEQ ID NO:28所示：
在重组酶介导的选择盒切除之后的编码R141C氨基酸置换的突变型非人类(例如，小鼠)Rs1等位基因的示例性部分如SEQ ID NO:29所示。
表1
非人类动物的产生
本文提供了用于产生如本文所述的Rs1基因中具有一个或多个断裂或突变的非人类动物的DNA构建体、靶向载体和方法。
DNA序列可用于制备用于敲除型动物(例如，Rs1 KO)的靶向载体。通常，将编码报告基因或突变型(经工程化的)Rs1基因的全部或部分的多核苷酸分子(例如，插入片段核酸)插入载体中，优选地DNA载体中，以在合适的宿主细胞中复制多核苷酸分子。
多核苷酸分子(或插入片段核酸)包含希望整合进靶标基因座或基因的DNA区段。在一些实施方案中，插入核酸包含一个或多个所关注的聚核苷酸。在一些实施方案中，插入核酸包含一个或多个表达盒。在某些实施方案中，表达盒包含所关注的多核苷酸、编码选择性标记和/或报告基因的多核苷酸，以及在某些实施方案中影响表达的多种调控组分(例如，启动子、增强子等)。几乎任何所关注的聚核苷酸可以容纳于插入核酸内且由此在靶基因组基因座整合。本文所公开的方法提供整合进靶向Rs1基因(或基因座)的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个所关注的多核苷酸。
在一些实施方案中，插入核酸中所含的所关注聚核苷酸编码报告体。在一些实施方案中，包含在插入片段核酸中的所关注的多核苷酸编码异源性变体或异源性变体RS1多肽。在一些实施方案中，包含在插入片段核酸中的所关注的多核苷酸编码选择性标记和/或重组酶。
在一些实施方案中，所关注的聚核苷酸侧接或包含位点特异性重组位点(例如loxP、Frt等)。在某些实施方案中，位点特异性重组位点侧接编码报告的DNA区段、编码选择性标记的DNA区段、编码重组酶的DNA区段以及它们的组合。本文描述了所关注的示例性多核苷酸，包括可以包括在插入片段核酸内的选择性标记、报告基因和重组酶基因。
根据大小，Rs1基因或编码Rs1的序列可以从可从商业供应商获得的cDNA来源直接克隆或基于GenBank提供的公开序列在计算机上设计(参见上文)。或者，细菌人工染色体(BAC)文库可以提供来自所关注的基因的Rs1序列(例如，啮齿动物或异源性Rs1基因)。BAC文库含有100-150kb的平均插入片段大小，并且能够携带高达300kb的插入片段(Shizuya,H.等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:8794-7；Swiatek,P.J.和T.Gridley，1993,Genes Dev.7:2071-84；Kim,U.J.等人，1996,Genomics 34:213-8；以引用的方式并入本文)。例如，已构建人和小鼠基因组BAC文库，并且这些文库可商购获得(例如，Invitrogen,Carlsbad,CA)。基因组BAC文库也可以作为啮齿动物或异源性Rs1序列以及转录控制区的来源。
或者，可以从酵母人工染色体(YAC)分离、克隆和/或转移啮齿动物或异源性Rs1序列。整个啮齿动物或异源性Rs1基因可以被克隆并包含在一个或几个YAC内。如果使用多个YAC并且它们含有重叠同源性区域，则它们可以在酵母宿主菌株内重组以产生代表整个基因座的单一构建体。YAC臂可以用哺乳动物选择盒进一步修饰，所述修饰通过改造以帮助通过本领域已知的和/或本文所述的方法将构建体引入胚胎干细胞或胚胎中来进行。
在一些实施方案中，含有如本文所述的Rs1序列的DNA构建体或靶向载体包含编码啮齿动物RS1多肽的啮齿动物Rs1基因组序列，所述啮齿动物Rs1基因组序列可操作地连接至非人类调控序列(例如，啮齿动物启动子)以用于在经遗传修饰的非人类动物中表达，所述啮齿动物RS1多肽与野生型或亲本啮齿动物RS1多肽相比包含一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，含有如本文所述的Rs1序列的DNA构建体或靶向载体包含编码变体啮齿动物RS1多肽的啮齿动物Rs1基因组序列，所述啮齿动物Rs1基因组序列可操作地连接至啮齿动物Rs1启动子，所述变体啮齿动物RS1多肽与野生型或亲本啮齿动物RS1多肽相比包含氨基酸置换(例如，C59S或R141C)。本文描述了所期望的氨基酸置换的实施例。本文所述的DNA构建体中包括的啮齿动物和/或异源序列可以与天然存在的啮齿动物和/或异源序列(例如，基因组)相同或基本上相同。或者，此类序列可以是人工的(例如，合成的)或可以是人工工程化的。在一些实施方案中，Rs1序列从起点合成，并且包含天然存在的啮齿动物或异源性Rs1基因中存在的一个或多个序列。在一些实施方案中，Rs1序列包含与啮齿动物或异源性Rs1基因天然相关的序列。在一些实施方案中，Rs1序列包括不与啮齿动物或异源性Rs1基因天然相关的序列。在一些实施方案中，Rs1序列包括为在非人类动物中表达而优化的序列。如果将另外的序列用于优化本文所述的突变型(或变体)Rs1基因的表达，则可以使用现有的序列作为探针来克隆此类序列。根据期望的结果，可以从基因组序列或其他来源获得使突变型Rs1基因或编码RS1的序列的表达最大化所必需的另外的序列。
DNA构建体或靶向载体可以使用本领域已知的方法制备。例如，DNA构建体可以制备为较大质粒的一部分。这种制备允许以本领域已知的有效方式克隆和选择正确的构建体。含有本文所述的序列的DNA片段可以定位于质粒上的简便限制性位点之间，使得它们可易于从其余的质粒序列分离，以掺入所需的动物。质粒、DNA构建体和/或靶向载体的制备和宿主生物体的转化所用的许多方法是本领域已知的。关于适用于原核细胞与真核细胞的其它表达系统，以及通用重组程序，参见分子克隆：A Laboratory Manual，第2版，Sambrook,J.等人编，Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989。
如上文所述，上文提供了用于构建用于含有断裂或经工程化的Rs1基因的非人类动物的靶向载体的示例性非人类Rs1核酸和氨基酸序列。其他非人类Rs1序列也可以存在于GenBank数据库中。在一些实施方案中，Rs1靶向载体包含编码报告基因、选择性标记、重组酶基因(或它们的组合)的DNA序列和用于插入转基因非人类动物的基因组的非人类Rs1序列(即，靶标区的侧接序列)。在一个实例中，缺失起始点可以是紧邻起始密码子下游(3’)的组，以允许插入片段核酸可操作地连接至内源性调控序列(例如，启动子)。图2-图4展示了用于制备鼠科动物Rs1基因的编码序列的一部分(例如，外显子1-3)的靶向缺失的示例性方法和靶向载体，所述靶向缺失不包括起始密码子并且用含有来自编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因的序列的盒以及编码新霉素磷酸转移酶(Neo)(用于选择G418抗性胚胎干(ES)细胞群落)的药物选择盒进行了替换。该靶向载体还包括编码由ES细胞特异性微RNA(miRNA)或生殖细胞特异性启动子(例如，鱼精蛋白1启动子；Prot-Cre-SV40)调控的重组酶(例如，Cre)的序列。新霉素选择盒和编码Cre重组酶的序列被loxP重组酶识别位点侧接，这些位点使得能够以发育依赖性方式进行Cre介导的新霉素选择盒切除，即来源于生殖细胞含有上文所述的断裂Rs1基因的啮齿动物的子代将在发育期间使选择性标记脱离(参见美国专利No.8,697,851、8,518,392、8,354,389、8,946,505和8,946,504，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。这允许从分化细胞或生殖细胞自动切除新霉素选择盒等等。因此，在表型分析之前，除去新霉素选择盒，只留下可操作地连接至鼠科动物Rs1启动子的lacZ报告基因(融合至小鼠Rs1起始密码子)(图4)。
用于产生如本文所述的非人类动物的方法采用自缺失选择盒技术(参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。该技术的使用避免了来自非人类动物的基因组中存在选择盒的缺点，所述选择盒有利于选择耐药性克隆。在一些实施方案中，这种自缺失选择盒技术的特征在于可操作地连接至重组酶基因的启动子被纳入靶向载体中。启动子具有转录能力，以使得启动子以发育依赖性方式调节重组酶基因的表达，因为启动子活性被限制于未分化的细胞中(即，ES细胞；关于转录能力，另外参见例如Ram,R.和E.Meshorer,2009,Genes Dev.23:2793-98；Xu,J.等人,2009,Genes Dev.23:2824-38)。结果，重组酶多肽仅在ES细胞开始分化(即，发育)之后表达。已经加入如本文所述的靶向载体的ES细胞由于控制重组酶基因的表达(即，可操作地连接至重组酶基因)的启动子无活性而保留选择盒，但是作为重组酶开始表达的结果，一旦ES细胞开始分化，即促进选择盒的切除。因此，按照设计，从基因组内含有靶向载体的ES细胞发育的子代在发育早期表达重组酶，并且选择性标记在分化(即，发育)时被切除，所述分化由重组酶多肽对侧接选择盒的位点特异性重组酶识别位点的作用介导。
本文提供了在未分化的ES细胞中无活性的合适启动子。将此类启动子可操作地连接至重组酶基因提供了在分化时的特异性表达。如本文所述，使用在侧接选择性标记的平行方向上的位点特异性重组酶识别位点来设计靶向载体，以使得重组酶多肽在表达时指导选择性标记的切除(即，缺失)。位点特异性重组酶识别位点还可以置于侧接选择性标记的相反方向，以使得重组酶多肽在表达时指导选择性标记的反转。对于一些选择性标记，反转可足以发生失活。然而，完全除去选择性标记也可以是所期望的。当选择盒在平行方向上被位点特异性重组酶识别位点侧接时，重组酶多肽在分化的细胞中的表达将导致细胞将选择性标记从基因组切除。如果在选择中维持分化的细胞，则这些分化的细胞将由于选择性标记从基因组在缺失而死亡。以这种方式，未分化的ES细胞得以维持并富集在培养物中，以便随后用作宿主胚胎的供体细胞。
如本文所述，Rs1基因的断裂可以包括Rs1基因或其一部分被插入片段核酸替换或者插入片段核酸插入/添加至Rs1基因或其一部分中。在一些实施方案中，插入核酸包含报告基因。在某些实施方案中，报告基因以与内源性Rs1启动子可操作连接的方式定位。这种修饰允许内源性Rs1启动子驱动的报告基因表达。或者，报告基因不以与内源性Rs1启动子可操作连接的方式放置，并且可操作地连接至另一个启动子。
多种报告基因(或可检测部分)可以用于本文所述的靶向载体。示例性报告基因包括例如β-半乳糖苷酶(编码的lacZ基因)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、MmGFP、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强蓝色荧光蛋白(eBFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、黄色荧光蛋白(YFP)、增强黄色荧光蛋白(eYFP)、Emerald、CyPet、青色荧光蛋白(CFP)、Cerulean、T-Sapphire、荧光素酶、碱性磷酸酶或它们的组合。本文所述的方法示出了构建利用编码β-半乳糖苷酶的lacZ报告基因的靶向载体，然而，技术人员在阅读本公开后将理解，本文所述的非人类动物可以在不存在报告基因的情况下或使用本领域已知的任何报告基因生成。
在一些实施方案中，Rs1靶向载体包含编码突变型(或变体)Rs1基因、选择性标记和重组酶的DNA序列，以及用于插入到转基因非人动物的基因组中的非人类Rs1序列(即，靶标区的侧接序列)。在一个实例中，一个或多个点突变可以引入(例如，通过定点诱变)Rs1基因的编码序列或编码Rs1的序列(例如，外显子)，以使得所需的RS1多肽(例如，变体RS1多肽)由突变型Rs1基因或编码RS1的序列编码。这种突变型Rs1序列可以根据需要可操作地连接至内源性调控序列(例如，启动子)或组成型启动子。图5-图7和图8-图10展示了用于制备鼠科动物Rs1基因的外显子(例如，分别为外显子3和外显子5)中的选定点突变和周围的内含子中的小缺失的示例性靶向载体，所述制备使用含有编码潮霉素(Hyg)的药物选择性标记以选择突变型胚胎干(ES)细胞群落的盒来进行。如实施例章节所述，引入每个点突变周围的小鼠Rs1内含子中的小缺失被设计为有利于突变型(或变体)ES细胞群落的筛选。如图5和图8所示，靶向载体各自还包含编码由ES细胞特异性miRNA或生殖细胞特异性启动子(例如，鱼精蛋白1启动子；Prot-Cre-SV40)调控的重组酶(例如，Cre)的序列。潮霉素选择盒和编码Cre重组酶的序列被loxP重组酶识别位点侧接，这些位点使得能够以发育依赖性方式进行Cre介导的潮霉素选择盒切除，例如来源于生殖细胞含有上文所述的突变型(或变体)Rs1基因的啮齿动物的子代将在发育期间使选择性标记脱离(参见美国专利No.8,697,851、8,518,392、8,354,389、8,946,505和8,946,504，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。这允许从分化细胞或生殖细胞自动切除潮霉素选择盒等等。因此，在表型分析之前，移除潮霉素选择盒，留下可操作地连接至鼠科动物Rs1启动子的突变型Rs1外显子(图7和图10)。
在一些实施方案中，Rs1靶向载体可以包含对应于如上文所述的突变型(或变体)Rs1基因的DNA序列，所述突变型(或变体)Rs1基因包含异源性Rs1基因或异源性编码RS1的序列。合适的异源性Rs1序列在本文中有所提供，并且可以替代以下实施例章节中所例示的序列。与野生型或亲本异源性RS1多肽序列相比，此类异源性序列也可以工程化为含有编码氨基酸置换的点突变。
在适当时，编码报告多肽(和/或选择性标记，和/或重组酶)的全部或部分或RS1多肽(例如，变体RS1多肽)的遗传物质或一个或多个多核苷酸序列的编码区可以被修饰为包含为在非人类动物中表达而优化的密码子(例如，参见美国专利No.5,670,356和5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，并且优选编码由非密码子优化的亲本多核苷酸编码的相同多肽(或具有与全长多肽基本上相同的活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施方案中，编码报告多肽(例如，lacZ)的全部或部分的遗传物质的编码区可包括用于针对特定细胞类型(例如，啮齿动物细胞)优化密码子使用情况的改变的序列。在一些实施方案中，编码如本文所述的RS1多肽(例如，变体RS1多肽)的全部或部分的遗传物质的编码区可以包含用于优化针对特定细胞类型(例如，啮齿动物细胞)的密码子使用的已改变的序列。仅举一个实例，可对待插入非人类动物(例如，啮齿动物)的基因组中的报告基因或突变型Rs1基因的密码子进行优化以在非人类动物的细胞中表达。此序列可描述为密码子优化的序列。
提供了用于制备包含如本文所述的Rs1基因中的断裂或突变的非人类动物的组合物和方法，包括用于制备在Rs1调控性序列(诸如Rs1启动子)的控制下表达报告基因的非人类动物，以及在Rs1调控序列(诸如Rs1启动子)的控制下表达变体RS1多肽的非人类动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供了用于制备在内源性调控序列(诸如内源性启动子(例如，内源性Rs1启动子))的控制下表达报告基因或变体RS1多肽的非人类动物的组合物和方法。这些方法包括将如本文所述的包含报告基因(例如，lacZ；参见图2-图4)的靶向载体插入非人类动物的基因组中，以使得Rs1基因的编码序列的一部分全部或部分缺失。在一些实施方案中，这些方法包括将靶向载体插入非人类动物的基因组中，以使得Rs1基因的外显子1-3缺失。
可操作地连接至Rs1启动子(例如，内源性Rs1启动子)的报告基因的插入利用相对最小的基因组修饰，并且使得报告多肽以Rs1特异性方式在非人类动物中表达(例如，参见图11)。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物或细胞包含含有如本文所述的靶向载体的Rs1基因；在某些实施方案中，包含含有图2或图4中出现的靶向载体的Rs1基因。
在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因包含由报告基因的插入产生的一个或多个(例如，第一和第二)插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:33至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:34至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第二插入连接。在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:33基本上相同或相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:34基本上相同或相同的序列的第二插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:33至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:35至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第二插入连接。在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:33基本上相同或相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:35基本上相同或相同的序列的第二插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因或等位基因包含与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因或等位基因包含与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25基本上相同或相同的序列。
在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因或等位基因包含内源性Rs1基因或等位基因的13,716bp缺失。在多个实施方案中，如本文所述的断裂Rs1基因或等位基因缺乏与SEQ ID NO:24基本上相同或相同的序列。
这些方法还包括将如本文所述的编码变体RS1多肽的全部或部分的靶向载体(参见图5-图7和图8-图10)插入非人类动物的基因组中，以改变Rs1基因的编码序列的一部分(例如，外显子)。在一些实施方案中，这些方法包括将靶向载体插入非人类动物的基因组中，以使得Rs1基因的外显子突变为编码变体RS1多肽。
可操作地连接至Rs1启动子(例如，内源性Rs1启动子)的突变型Rs1基因的插入利用相对最小的基因组修饰，使在功能上和结构上与野生型非人类动物中出现的RS1多肽不同的变体RS1多肽在非人类动物中表达。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物或细胞包含含有如本文所述的靶向载体的Rs1基因；在某些实施方案中，包含含有图5或图8中出现的靶向载体的Rs1基因。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含由如本文所述的靶向载体的插入产生的一个或多个(例如，第一和第二)插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:36至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:37至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第二插入连接。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:36基本上相同或相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:37基本上相同或相同的序列的第二插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:38至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的插入连接。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQID NO:38基本上相同或相同的序列的插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有点突变的第三外显子，以使得突变型Rs1基因编码具有C59S氨基酸置换的RS1多肽。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有TGT至AGT的密码子突变的第三外显子，以使得突变型Rs1基因编码具有C59S氨基酸置换的RS1多肽。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:39至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:40至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的第二插入连接。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:39基本上相同或相同的序列的第一插入连接和含有与SEQ ID NO:40基本上相同或相同的序列的第二插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQ ID NO:41至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列的插入连接。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有与SEQID NO:41基本上相同或相同的序列的插入连接。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有点突变的第五外显子，以使得突变型Rs1基因编码具有R141C氨基酸置换的RS1多肽。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因包含含有CGC至TGC的密码子突变的第五外显子，以使得突变型Rs1基因编码具有R141C氨基酸置换的RS1多肽。
在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因或等位基因包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29至少80％(例如，80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。在多个实施方案中，如本文所述的突变型Rs1基因或等位基因包含与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29基本上相同或相同的序列。
或者，其他的Rs1基因或编码Rs1的序列可用于本文所述的产生基因组含有如本文所述的突变型Rs1基因的非人类动物的方法。例如，异源性Rs1基因可以引入非人类动物中，所述异源性Rs1基因编码如本文所述的变体RS1多肽(即，包含在非人类动物中建立视网膜劈裂样表型的突变)。在另一个实例中，转基因Rs1基因可以随机插入非人类动物的基因组中，使内源性Rs1基因变得无功能(例如，经由遗传修饰、使用DNA或RNA寡核苷酸进行基因敲低等)。本文提供了示例性替代的Rs1基因或编码RS1的序列。技术人员在阅读本公开后将会理解，这种Rs1基因或编码RS1的序列可用于本文所述的产生非人类动物的方法。
本文所述的靶向载体可引入ES细胞中，并筛选携带断裂或突变型Rs1基因的ES克隆，如本文在Frendewey,D.等人,2010,Methods Enzymol.476:295-307中所述。本文所公开的方法和组合物中可以使用多种宿主胚。举例来说，可以将具有靶向基因修饰的多能和/或分化全能细胞引入来自相应生物体的桑椹体前期胚(例如8细胞期胚)中。参见例如美国专利No.7,576,259、7,659,442、7,294,754和美国专利申请公开No.2008-0078000A1，所有这些专利全文以引用方式并入本文。在其他情况下，供体ES细胞可以在2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期或64细胞期植入宿主胚胎。宿主胚胎也可以是囊胚或可以是前囊胚胚胎、前桑葚胚期胚胎、桑葚胚期胚胎、未压实的桑葚胚期胚胎或压实的桑葚胚期胚胎。
在一些实施方案中，可以应用方法(Poueymirou,W.T.等人，2007，自然·生物技术25:91-99)将阳性ES细胞注射到8细胞胚中，以完全产生ES细胞衍生的F0代杂合小鼠，准备用于lacZ表达谱分析或繁殖到纯合性。实施例章节提供了用于产生具有断裂或突变型Rs1基因的非人类动物的示例性方法。
用于产生转基因非人类动物的方法(包括敲除和敲入)是本领域熟知的(参见例如Kitamura,D.等人,1991,Nature 350:423-6；Komori,T.等人,1993,Science 261:1171-5；Shinkai,Y.等人,1993,Science 259:822-5；Mansour,S.L.等人,1998,Nature 336:348-52；Gene Targeting:A Practical Approach,Joyner编,Oxford University Press,Inc.,2000；Valenzuela,D.M.等人,2003,Nature Biotech.21(6):652-9；Adams,N.C.和N.W.Gale,载于Mammalian and Avian Transgenesis–New Approaches,Lois编,S.P.a.C.,Springer Verlag,Berlin Heidelberg,2006)。例如，转基因啮齿动物的生成可涉及内源性啮齿动物基因的基因座的断裂以及报告基因引入啮齿动物基因组，在一些实施方案中，引入与内源性啮齿动物基因相同的位置，或可涉及内源性啮齿动物基因的基因座改变以及一个或多个突变引入啮齿动物基因组，在一些实施方案中，引入与内源性啮齿动物基因相同的位置，从而导致变体多肽表达。
小鼠Rs1基因的基因组组织的示意图(未按比例绘制)提供于图1中。使用报告基因来使小鼠Rs1基因的编码序列的一部分缺失的示例性靶向载体提供于图2中。如图所示，使用报告基因和侧接有位点特异性重组酶识别位点的自缺失药物选择盒来使含有小鼠Rs1基因的外显子1-3(除外显子1中的ATG起始密码子之外)的基因组DNA缺失或替换它们。靶向载体包括可操作地连接至发育调节的启动子的编码重组酶的序列，以使得重组酶在未分化细胞中表达。在同源重组时，内源性小鼠Rs1基因的外显子1-3缺失(或被包含在如图所示的靶向载体中的序列替换)，并且具有结构如图4所示的Rs1基因的工程化小鼠在发育期间经由Cre介导的新霉素盒切除，留下可操作地连接至小鼠Rs1启动子的lacZ报告基因(融合至小鼠Rs1起始密码子)来产生。
用于在小鼠Rs1基因中产生突变(例如，置换突变)的示例性靶向载体提供于图5-图7和图8-图10中。如图所示，使用包含侧接有位点特异性重组酶识别位点的自缺失药物选择盒的靶向载体来产生突变型小鼠Rs1基因(即，在外显子3或5中具有点突变的突变型Rs1基因)，所述自缺失药物选择盒置于突变型Rs1外显子的下游和Rs1内含子之内(另参见图5或图8)。靶向载体包括可操作地连接至发育调节的启动子的编码重组酶的序列，以使得重组酶在未分化细胞中表达。在同源重组时，内源性小鼠Rs1基因的单个外显子(以及周围内含子的部分)被包含在如图所示的靶向载体中的序列替换，并且具有结构如图7或图10所示的突变型Rs1基因的经工程化的小鼠在发育期间经由Cre介导的选择盒切除，留下可操作地连接至小鼠Rs1启动子的单个外显子中的点突变，以及一个或多个邻近的内含子内的小缺失(具有独特的loxP位点)的突变型Rs1基因来产生。所得的突变型Rs1基因各自编码包含氨基酸置换(例如，C59S或R141C)的RS1多肽。
可以包含在本文所述的靶向载体中的示例性启动子包括鱼精蛋白1(Prm1)启动子(诸如SEQ ID NO:30中所示的启动子)、Blimp1启动子1kb(诸如SEQ ID NO:31中所示的启动子)和Blimp1启动子2kb(诸如SEQ ID NO:32中所示的启动子)。可用于本文所述的靶向载体的另外的合适启动子包括美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389中所述的那些；所有这些专利以引用方式并入本文)。
转基因首建者非人类动物可以根据基因组中存在报告基因(或不存在Rs1)和/或报告基因在非人类动物的组织或细胞中表达(或缺乏RS1的表达)，或者Rs1编码序列(例如，外显子)中存在一个或多个点突变和/或基因组中缺失非编码Rs1序列(例如，内含子)和/或变体RS1多肽在非人类动物的组织或细胞中表达(或缺乏野生型RS1多肽的表达)来鉴定。然后可将转基因首建者非人类动物用于繁育另外的携带报告基因或突变型Rs1基因的非人类动物，从而产生一系列各自携带如本文所述的断裂或突变型Rs1基因的一个或多个拷贝的非人类动物。
还可以产生含有选定系统的转基因非人类动物，这些系统允许转基因或多核苷酸分子(例如，插入片段核酸)的调控或定向表达。示例性系统包括噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统(参见例如Lakso,M.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236)和酿酒酵母的FLP/Frt重组酶系统(O’Gorman,S.等人,1991,Science 251:1351-1355)。此类动物可以通过构建“双”转基因动物，例如通过两个转基因动物的交配来提供，其中一个含有编码选定多肽(例如，报告蛋白、变体或异源性RS1多肽)的转基因，另一个含有编码重组酶(例如，Cre重组酶)的转基因。
虽然本文广泛讨论了利用小鼠中的Rs1基因中的断裂或突变的实施方案，但还提供了Rs1基因座中包含此类修饰(或改变)的其他非人类动物。在一些实施方案中，此类非人动物包含Rs1基因中的断裂(例如，Rs1编码序列的一部分缺失的小鼠)，所述断裂的特征在于可操作地连接至内源性Rs1启动子的报告基因的插入，或者Rs1基因中的突变(例如，一个或多个Rs1外显子中具有一个或多个点突变的小鼠)，所述突变的特征在于可操作地连接至内源性Rs1启动子的一个或多个突变型Rs1外显子(例如，含有一个或多个点突变的外显子)的插入。此类非人动物包括可以遗传修饰为使本文公开的Rs1基因的编码序列断裂或突变的那些动物中的任一种，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、貂、灵长类动物(例如，狨猴、猕猴)等。对于合适的可经遗传修饰的ES细胞不容易获得的那些非人类动物，采用其他方法来制备包含遗传修饰的非人类动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多能细胞)并利用体细胞核转移(SCNT)来将经遗传修饰的基因组转移至合适的细胞，例如去核卵母细胞，以及在适于形成胚胎的条件下在非人类动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)。
简单来说，核转移方法包括以下步骤：(1)将卵母细胞去核；(2)分离出供体细胞或核以便与去核的卵母细胞组合；(3)将所述细胞或核插入去核的卵母细胞中以形成重建的细胞；(4)将重建的细胞植入动物子宫中以形成胚；以及(5)允许所述胚发育。在此类方法中，卵母细胞通常从死亡的动物回收，但它们也可以从活动物的输卵管和/或卵巢分离。卵母细胞在去核之前可以在所属领域的技术人员已知的多种培养基中成熟。卵母细胞的去核可以按照所属领域的技术人员已知的多种方式执行。将供体细胞或核插入去核的卵母细胞中以形成重建的细胞典型地是通过将供体细胞显微注射于透明带下再融合来达成。融合可以通过跨越接触/融合平面施加DC电脉冲(电融合)、通过使细胞暴露于促进融合的化学物质(例如聚乙二醇)或借助于灭活病毒(例如仙台病毒)来诱导。重建的细胞典型地在核供体和接受者卵母细胞融合之前、期间和/或之后，通过电学和/或非电学方式活化。活化方法包括电脉冲、化学上诱导的休克、利用精子穿透、增加卵母细胞中的二价阳离子含量，和减少卵母细胞中的细胞蛋白质磷酸化(如通过激酶抑制剂)。活化的重建细胞或胚典型地在所属领域的技术人员已知的培养基中培养，且然后转移到动物的子宫中。参见例如美国专利No.7,612,250；美国专利申请公开No.2004-0177390 A1和2008-0092249 A1；和国际专利申请公开No.WO 1999/005266 A2和WO 2008/017234 Al；每个专利以引用方式并入本文。
用于修饰非人动物基因组(例如，猪、奶牛、啮齿动物、鸡等基因组)的方法包括例如利用锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)或Cas蛋白(即，CRISPR/Cas系统)将基因组修饰为包含如本文所述的断裂或突变型Rs1基因。
在一些实施方案中，本公开的非人类动物是哺乳动物。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物是啮齿动物。在一些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自鼠总科。在一些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的动物来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在某些实施方案中，本文所述的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在某些实施方案中，本文所述的小鼠来自鼠科的成员。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是啮齿动物。在某些实施方案中，如本文所述的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是小鼠。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是啮齿动物，所述啮齿动物是选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠是选自以下品系的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人,1999,MammalianGenome 10:836；Auerbach,W.等人,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032)。在某些实施方案中，如本文所述的经遗传修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合品系。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠是前述129品系的混合品系，或前述BL/6品系的混合品系。在某些实施方案中，如本文所述的小鼠是前述BL/6品系的混合物或来源于前述BL/6品系，所述BL/6品系不含(或缺乏)Crb1rd8突变(即，包含野生型Crb1)。在某些实施方案中，如本文所述的混合品系的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施方案中，如本文所述的小鼠是BALB品系和另一种前述品系的混合品系。
在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物是大鼠。在某些实施方案中，如本文所述的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和DarkAgouti。在某些实施方案中，如本文所述的大鼠品系是选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti的两个或更多个品系的混合品系。
大鼠多能和/或全能细胞可以来自任何大鼠品系，包括例如ACI大鼠品系、DarkAgouti(DA)大鼠品系、Wistar大鼠品系、LEA大鼠品系、Sprague Dawley(SD)大鼠品系或Fischer大鼠品系(诸如Fisher F344或Fisher F6)。大鼠多能细胞和/或全能细胞也可从来源于上述两种或更多种品系的混合品系的品系获得。例如，大鼠多能细胞和/或全能细胞可来自DA品系或ACI品系。ACI大鼠品系的特征在于具有黑灰色，伴随白色腹部和足部以及RT1av1单倍型。此类品系可以从多种来源(包括Harlan Laboratories)获得。来自ACI大鼠的大鼠ES细胞系的实例是ACI.G1大鼠ES细胞。Dark Agouti(DA)大鼠品系的特征在于具有野灰色皮毛和RT1av1单倍型。此类大鼠可以从多种来源(包括Charles River和HarlanLaboratories)获得。来自DA大鼠的大鼠ES细胞系的实例是DA.2B大鼠ES细胞系和DA.2C大鼠ES细胞系。在一些情况下，大鼠多能细胞和/或全能细胞来自近交大鼠品系。参见例如，以引用的方式并入本文的美国专利申请公开号2014-0235933A1。本领域还描述了大鼠ES细胞和制备经遗传修饰的大鼠的方法。参见，例如US 2014/0235933 A1、US 2014/0310828 A1、Tong等人(2010)Nature 467:211-215和Tong等人(2011)Nat Protoc.6(6):doi:10.1038/nprot.2011.338(所有这些文献均以引用的方式并入本文)。
提供了包含Rs1基因中的断裂或突变的非人类动物。在一些实施方案中，Rs1基因中的断裂或突变导致功能丧失。具体地讲，功能丧失突变包括导致RS1的表达减少或缺乏和/或RS1的活性/功能减少或缺乏的突变。在一些实施方案中，与野生型非人类动物相比，功能丧失突变产生一个或多个表型。RS1的表达可以直接测量，例如通过测定如本文所述的非人动物的细胞或组织中的RS1水平来测量。
通常，如果RS1的表达和/或活性水平在统计学上低于(p≤0.05)不包含相同断裂(例如，缺失)的适当对照细胞或非人动物中RS1的水平，则RS1的表达水平和/或活性降低。在一些实施方案中，纯合子雌性动物或半合子雄性动物中RS1的浓度和/或活性相对于缺乏相同断裂(例如，缺失)的对照细胞或非人类动物降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在其他实施方案中，使用包括但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析的方法来选择具有使RS1的表达水平和/或活性降低的Rs1基因中的断裂或突变的细胞或生物体。然后将此类细胞或非人类动物用于本文所述的多种方法和组合物。
在一些实施方案中，内源性Rs1基因未缺失(即，完整的)。在一些实施方案中，内源性Rs1基因是改变的、断裂的、缺失的或被异源序列(例如，编码报告基因的序列)替换的。在一些实施方案中，全部或基本上全部内源性Rs1基因被插入片段核酸替换；在某些实施方案中，替换包括内源性Rs1基因的编码序列的一部分被报告基因(例如，lacZ)替换，以使得报告基因与Rs1启动子(例如，内源性Rs1启动子)可操作连接。在一些实施方案中，将报告基因的一部分(例如，其功能片段)插入内源性非人类Rs1基因。在一些实施方案中，报告基因是lacZ基因。在一些实施方案中，将报告基因插入雌性非人类动物中的内源性Rs1基因的两个拷贝中的一个中，从而产生关于报告基因杂合的非人类雌性动物。在一些实施方案中，提供了对于报告基因纯合的非人类雌性动物。
提供了包含Rs1基因中的一个或多个突变的非人类动物。在一些实施方案中，Rs1基因中的突变导致变体RS1多肽的表达(例如，与野生型RS1多肽相比，包含一个或多个氨基酸置换的RS1多肽)。变体RS1的表达可以直接测量，例如通过测定如本文所述的非人类动物的细胞或组织中的变体RS1水平来测量。
在其他实施方案中，使用包括但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析的方法来选择具有Rs1基因中的一个或多个突变的细胞或生物体。然后将此类细胞或非人类动物用于本文所述的多种方法和组合物。
在一些实施方案中，内源性Rs1基因是改变的或被突变型Rs1序列替换的(例如，编码Rs1的突变型序列的全部或部分)。在一些实施方案中，所有或基本上所有内源性Rs1基因被插入片段核酸替换；在某些实施方案中，替换包括内源性Rs1外显子(例如，外显子3或外显子5)被突变型Rs1外显子(例如，合成外显子3或合成外显子5)替换，以使得突变型Rs1外显子与Rs1启动子(例如，内源性Rs1启动子)和其他内源性Rs1外显子可操作连接。在一些实施方案中，将突变型Rs1外显子插入内源性Rs1基因，所述突变型Rs1外显子含有一个或多个点突变；在某些实施方案中，所述突变型Rs1外显子含有一个点突变。在一些实施方案中，将突变型Rs1外显子插入雌性非人类动物中的内源性Rs1基因的两个拷贝中的一个中，从而产生关于突变型Rs1外显子杂合的雌性非人类动物。在一些实施方案中，提供了针对突变型Rs1外显子纯合的雌性非人类动物。在一些实施方案中，包含突变型内源性Rs1基因的非人类动物还包含含有缺失和/或位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP)的一个或多个Rs1内含子。
视网膜劈裂的非人类动物模型以及使用方法
本文所述的非人类动物提供了针对视网膜劈裂的改进的动物模型。具体而言，如本文所述的非人类动物提供了转化为X连锁视网膜劈裂疾病病理学的改进的动物模型，所述动物模型的特征在于例如由于视网膜的退化而产生的中心和周边视力的累进性丧失。
例如，如本文所述的Rs1基因中的断裂或突变可导致本文提供的非人类动物中的许多症状(或表型)。在一些实施方案中，Rs1基因中的断裂或突变产生在出生时大体正常，但在年龄增加时，例如在约8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周、52周、53周、54周、55周、56周、57周、58周、59周、60周等之后发展出一种或多种症状的非人类动物。在一些实施方案中，Rs1基因中的断裂或突变产生具有异常结构和/或功能的一个或两个视网膜的非人类动物。在一些实施方案中，Rs1基因中的断裂或突变产生展示出一种或多种与视网膜劈裂相关的症状(或表型)的非人类动物。这些症状(或表型)可以包括例如一个或两个视网膜劈裂为两层、视网膜和/或黄斑结构或构造异常、中央凹(黄斑的中心)中的辐条样条纹、一个或两个视网膜劈裂为两层所产生的间隙中存在水疱和/或血管破裂、血液渗入一个或两个视网膜的玻璃体中、视力丧失和/或受损、失明、视网膜色素沉着和/或退化、玻璃体退化和从视网膜分离、以及视网膜剥离。在某些实施方案中，症状或表型包括内层视网膜内的囊肿结构的发展、以及与野生型非人类动物相比ERG b-波和a-波反应的减少、其后是感光细胞的丧失。在一些实施方案中，如本文所述的非人类动物的Rs1基因座中的断裂或突变会导致非人类动物中的视网膜的早发性(例如，在或到出生后第15天、第18天、第21天、第24天或第27天)功能和形态表型。在一些实施方案中，视网膜的早发性功能缺陷可以通过与野生型非人类动物相比，(i)在暗适应和明适应ERG分析中相对于a-波的b-波的减少(产生负ERG)；(ii)ERG b-波的最大反应和灵敏度值的减小；(iii)ERGa-波的最大反应值的减小；或(iv)(i)-(iii)的组合来反映。在一些实施方案中，视网膜的早发性形态缺陷可以通过与野生型非人类动物相比的劈裂、椭圆体区(EZ)变宽、外层视网膜变薄或它们的组合来反映。在一些实施方案中，本文所述的非人动物提供了用于鉴定和开发用于治疗视网膜劈裂(例如，X连锁视网膜劈裂)的候选疗法的改进的体内系统。因此，在至少一些实施方案中，本文所述的非人动物提供了针对X连锁视网膜劈裂和/或眼部疾病的改进的动物模型，并且可用于开发和/或鉴定用于治疗和/或预防眼部相关疾病、病状或病症的治疗剂。
如本文所述的非人类动物提供了改进的体内系统和缺乏RS1表达或表达可用于许多测定的变体RS1多肽的生物材料(例如，细胞)的来源。在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于开发治疗、预防和/或抑制与RS1表达和/或活性缺乏相关的一种或多种症状的疗法(例如，基因疗法/替代)。在多个实施方案中，本文所述的非人类动物用于开发治疗、预防和/或抑制与变体RS1多肽的表达相关的一种或多种症状的疗法。由于变体RS1多肽的表达，本文所述的非人类动物可用于多种测定，以确定对视网膜结构和发育的功能性后果。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物提供了用于筛选涉及RS1结构和/或功能的分子的动物模型。
本文所述的非人类动物还提供了用于鉴定治疗、预防和/或抑制一个或两个视网膜的结构和/或功能退化所产生的累进性视力丧失的治疗剂的体内系统。在一些实施方案中，通过将所述治疗剂施用于基因组包含如本文所述的Rs1基因的非人类动物来体内确定治疗剂的作用。
本文所述的非人类动物还提供了针对眼部相关疾病、障碍或病症的改进的动物模型。具体而言，如本文所述的非人类动物提供了转化为特征在于一个或两个视网膜的神经感觉层中的细胞间粘附破坏的病症的改进的动物模型。
可以向非人类动物施用通过任何简便途径(例如通过静脉内、腹膜内或玻璃体内注射)来测试的治疗剂。此类动物可以包括在免疫学研究中，以确定与未接受治疗剂的适当对照非人类动物相比，治疗剂对非人类动物的视力的作用(例如，对视网膜的神经感觉功能的作用)。也可以进行动物组织(例如，眼部组织)的活检或解剖评估，并且/或者可以收集血样。
在多个实施方案中，本文所述的非人类动物用于鉴定、筛选和/或开发能够恢复一个或两个视网膜的感光功能的候选治疗剂(例如，抗体)。在多个实施方案中，本文所述的非人类动物用于确定向感光细胞的Rs1基因递送的功效。在一些实施方案中，本文所述的非人类动物用于确定和/或优化编码RS1多肽的一种或多种候选视网膜基因疗法的载体设计。
在多个实施方案中，本文所述的非人类动物用于确定候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)的药代动力学特征。在多个实施方案中，将一种或多种本文所述的非人类动物和一种或多种对照或参考非人类动物各自以多个剂量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更高)暴露于一种或多种候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)。候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)可以经由任何期望的施用途径(包括用于在本文所述的非人类动物中进行评估的肠胃外和非肠胃外施用途径)给药。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如口服、鼻腔、透皮、肺部、直肠、面颊、阴道、眼部。施用也可以通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射来进行。在多个时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或最多30天或更多天)从非人类动物分离血液。可使用从本文所述的非人类动物获得的样品进行多种测定以确定所施用的药物的药代动力学特征，包括但不限于总IgG、抗药物反应、凝集等。
在多个实施方案中，本文所述的非人类动物用于确定一种或多种候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)的治疗功效。在多个实施方案中，将一种或多种本文所述的非人类动物和一种或多种对照或参考非人类动物各自以多个剂量(例如，0.1mg/μL、0.2mg/μL、0.3mg/μL、0.4mg/μL、0.5mg/μL、0.6mg/μL、0.7mg/μL、0.8mg/μL、0.9mg/μL、1.0mg/μL、1.1mg/μL、1.2mg/μL、1.3mg/μL、1.4mg/μL、1.5mg/μL、1.6mg/μL、1.7mg/μL、1.8mg/μL、1.9mg/μL、2.0mg/μL、2.1mg/μL、2.2mg/μL、2.3mg/μL、2.4mg/μL、2.5mg/μL、2.6mg/μL、2.7mg/μL、2.8mg/μL、2.9mg/μL、3.0mg/μL、3.1mg/μL、3.2mg/μL、3.3mg/μL、3.4mg/μL、3.5mg/μL、3.6mg/μL、3.7mg/μL、3.8mg/μL、3.9mg/μL、4.0mg/μL、4.1mg/μL、4.2mg/μL、4.3mg/μL、4.4mg/μL、4.5mg/μL、4.6mg/μL、4.7mg/μL、4.8mg/μL、4.9mg/μL或5.0mg/μL或更高)暴露于一种或多种候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)。在一些实施方案中，在出生时或出生后不久(例如，在出生后18天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内)将候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)给予本文所述的非人类动物。候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)优先地经由玻璃体内途径给药，然而可以在本文所述的非人类动物中评估任何期望的施用途径(包括肠胃外和非肠胃外施用途径(参见上文))给药。在多个实施方案中，以多个体积(例如，1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL、26μL、27μL、28μL、29μL、30μL、31μL、32μL、33μL、34μL、35μL、36μL、37μL、38μL、39μL、40μL、41μL、42μL、43μL、44μL、45μL、46μL、47μL、48μL、49μL或50μL或更多)经由玻璃体内途径注射一种或多种候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)。注射可以是连续的或遵循特定的时间过程(例如，每周、每两周、每月等)。在多个时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、15天、18天、21天、24天或最多30天或更多天)使用本领域已知的和/或本文所述的测定来确定视网膜功能和/或视力。可以在施用一种或多种候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)之后对从本文所述的非人类动物和一种或多种对照或参考非人类动物采集的视网膜和/或视杯进行各种功能和/或形态分析，以确定对RS1功能和/或RS1依赖性过程的作用。
在多个实施方案中，如本文所述的非人类动物用于测量恢复Rs1活性的治疗效果以及作为眼部中的细胞变化的结果对视网膜结构和/或功能的效果。在多个实施方案中，将如本文所述的非人类动物或从所述非人类动物分离的细胞暴露于候选药物(例如，Rs1基因疗法药物)，并且在随后的一段时间后，分析对Rs1依赖性过程(或相互作用)的作用。
如本文所述的非人类动物的细胞(例如，视网膜细胞)可以随时分离和使用，或可以在培养中维持多代。在多个实施方案中，来自本文所述的非人类动物的细胞是永生化的(例如，通过使用病毒、细胞融合等)并且在培养中无限期维持(例如，在连续培养中)。
本文所述的非人类动物提供了用于分析和测试药物或疫苗的体内系统。在多个实施方案中，候选药物或疫苗可以递送至一种或多种本文所述的非人类动物，然后监测该非人类动物以确定对药物或疫苗的一种或多种免疫应答、药物或疫苗的安全性质，或对疾病或病症和/或疾病或病症的一个或多个症状的作用。用于确定安全性质的示例性方法包括测量毒性、最佳剂量浓度、药物或疫苗的功效和可能的风险因素。此类药物或疫苗可以在此类非人类动物中进行改进和/或开发。
疫苗功效可以多种方式确定。简而言之，使用本领域已知的方法疫苗接种本文所述的非人类动物，然后用疫苗攻击或将疫苗施用于已经感染的非人类动物。一种或多种非人类动物对疫苗的应答可以通过以下方法进行测量：监测一种或多种非人类动物(或从它们分离的细胞)，和/或对一种或多种非人类动物(或从它们分离的细胞)进行一种或多种测定以确定疫苗的功效。然后使用本领域已知的和/或本文所述的一种或多种测量，将一种或多种非人类动物对疫苗的应答与对照动物进行比较。
疫苗功效还可以通过病毒中和测定来确定。简而言之，免疫本文所述的非人类动物，并且在免疫后的不同日收集血清。将连续稀释的血清与病毒一起预温育，在此期间血清中对病毒具有特异性的抗体将与其结合。然后将病毒/血清混合物加入受纳细胞，以通过噬菌斑测定或微量中和测定来确定传染性。如果血清中的抗体中和病毒，则与对照组相比，存在较少的噬菌斑或较低的相对荧光素酶单位。
本文所述的非人类动物提供了用于评估药物(例如，Rs1基因递送药物)的药代动力学性质和/或功效的体内系统。在多个实施方案中，药物可以递送或施用于一种或多种本文所述的非人类动物，然后监测非人类动物(或从其分离的细胞)或对其进行一种或多种测定，以确定药物对非人类动物的作用。药代动力学性质包括但不限于非人类动物将药物处理成多种代谢物的方式(或一种或多种药物代谢物，包括但不限于毒性代谢物的存在或不存在的检测)、药物半衰期、施用后药物的循环水平(例如药物的血清浓度)、抗药物应答(例如抗药物抗体)、药物吸收和分布、施用途径、排泄途径和/或药物清除。在一些实施方案中，监测药物在本文所述的非人类动物中或通过使用本文所述的非人类动物来监测药物的药物动力学和药效学特性。
在一些实施方案中，执行分析包括测定对药物所施用于的非人类动物的表型和/或基因型的影响。在一些实施方案中，执行分析包括测定药物的批次间可变性。在一些实施方案中，执行分析包括测定施用于本文所述的非人类动物与参考非人类动物的药物的作用之间的差异。在多个实施方案中，参照非人类动物可具有如本文所述的修饰、与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型非人类动物)。
非人类动物(从其分离出的细胞和/或使用从其分离出的细胞)的可以测量的示例性参数(用于评估药物的药物动力学特性)包括(但不限于)凝集、自体吞噬、细胞分裂、细胞死亡、补体介导的溶血、DNA完整性、药物特异性抗体效价、药物代谢、基因表达阵列、代谢活性、线粒体活性、氧化应激、吞噬、蛋白质生物合成、蛋白质降解、蛋白质分泌、应激反应、靶组织药物浓度、非靶组织药物浓度、转录活性等等。在多个实施方案中，本文所述的非人类动物用于确定药物的药学有效剂量。
试剂盒
本公开还提供包装或试剂盒，其包括装有至少一种如本文所述的非人类动物、非人类细胞、DNA片段和/或靶向载体的一个或多个容器。试剂盒可以用于任何适用的方法(例如，研究方法)。任选地与一个或多个此类容器相关的可以是由政府机构规定形式的注意事项，该注意事项规定药物或生物产品的制造、使用或销售，该注意事项反映了(a)机构关于用于人类施用的制造、使用或销售的批准，(b)使用说明或它们二者，或管理两个或更多个实体之间的材料和/或生物产品(例如，本文所述的非人类动物或非人类细胞)的转移的合约。
本公开的其他特征将在以下对示例性实施方案的描述的过程中显而易见，这些示例性实施方案是为了说明而给出的，而无意进行限制。
实施例
提供以下实施例是为了向本领域的普通技术人员描述如何制备和使用本公开的方法和组合物，而非旨在限制发明人所认为的其公开的范围。除非另外指明，否则温度用摄氏度说明，且压力是或接近大气压。
实施例1.经工程化的视网膜劈裂蛋白-1啮齿动物品系的产生
本实施例展示了用于在啮齿动物的视网膜劈裂蛋白-1(Rs1)基因座中产生修饰的一系列靶向载体的构建。具体而言，本实施例特别描述了这样的靶向载体的构建：所述靶向载体用于在Rs1基因座中产生断裂(即，无效等位基因)并且将一个或多个点突变引入Rs1基因座中的编码序列的一个或多个外显子中，从而产生编码与亲本RS1多肽相比具有一个或多个氨基酸置换的变体RS1多肽的突变型Rs1基因。通过使用包含含有点突变(参见下文)单个外显子的合成DNA片段来构建突变型等位基因。如下文所述，针对小鼠同源盒和连接QC来设计测序寡核苷酸。克隆含有潮霉素抗性基因的自缺失盒(SDC)，以产生靶向细菌人工染色体(BAC)克隆的供体。通过PCR和桑格(Sanger)测序来确认对每个点突变具有特异性的两种单独供体。使供体线性化以移除骨架，并用于靶向含有啮齿动物Rs1基因的BAC克隆DNA，以产生突变型Rs1基因。通过药物选择、PCR和对整个同源连接的桑格测序、PFG电泳和Illumina分析来确认经修饰的BAC。
简而言之，用于无效等位基因，使用lacZ报告基因构建体来制备小鼠Rs1基因的编码序列的外显子1-3的缺失(即，从外显子1中的ATG密码子的3’开始到外显子3的3’末端，产生13,716bp缺失)，所述lacZ报告基因构建体以与小鼠Rs1启动子可操作连接的方式(即，与外显子1的ATG密码子同框)放置。用于在内源性小鼠Rs1基因座中产生断裂的Rs1-lacZ-SDC靶向载体如上所述构建(参见例如美国专利No.6,586,251；Valenzuela等人,2003,NatureBiotech.21(6):652-659；以及Adams,N.C.和N.W.Gale,载于Mammalian and AvianTransgenesis–New Approaches,Lois编,S.P.a.C.,Springer Verlag,BerlinHeidelberg,2006)。用于产生Rs1无效等位基因的示例性靶向载体(或DNA构建体)如图2中所示。
简而言之，使用小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-213O8(Invitrogen)和上述自缺失新霉素选择盒(lacZ-pA-ICeuI-loxP-mPrm1-Crei-SV40pA-hUb1-em7-Neo-PGKpA-loxP)生成Rs1-lacZ-SDC靶向载体(参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389；所有这些专利以引用方式并入本文)。Rs1-lacZ-SDC靶向载体包括可操作地连接至发育调节的小鼠鱼精蛋白1启动子的编码Cre重组酶的序列，以使得重组酶在未分化细胞中表达。在同源重组时，包含内源性鼠科动物Rs1基因的外显子1中的ATG密码子的核苷酸3’至外显子3的3’末端之前的最后六个核苷酸的缺失(13,716bp)被包含在靶向载体中的序列(～8,202bp)替换。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即来源于种系细胞含有上文所述的断裂Rs1基因的小鼠的子代将在发育期间使选择性标记从分化的细胞脱离(参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。
对于第一突变型等位基因，修饰小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-213O8，从而引入内源性Rs1基因的外显子3中的点突变(TGT至AGT)，以使得具有C59S氨基酸置换的RS1多肽将由所得的突变型Rs1基因编码(图5)。在内含子2(25bp)和内含子3(28bp)中产生另外的缺失，以便筛选阳性克隆(图6)。使用通过从头DNA合成(GeneScript,Piscataway,NJ)制备的合成片段来引入点突变和缺失。将包含突变型外显子3和周围的内含子序列(5’和3’)的合成片段包含在质粒骨架中，并且使其在细菌中在氨苄青霉素的选择下复制。使用限制性酶将潮霉素抗性基因连接至合成片段并附上同源臂，以产生用于与RP23-213O8 BAC同源重组的靶向载体(图5)。然后通过电穿孔将所得的经修饰的RP23-213O8 BAC克隆引入ES细胞中(参见下文)。Rs1C59S-SDC靶向载体包含可操作地连接至发育调节的小鼠鱼精蛋白1启动子的编码Cre重组酶的序列，以使得重组酶在未分化细胞中表达(图5；另参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389；所有这些专利均以引用的方式并入本文)。在同源重组时，合成的突变Rs1外显子3被插入内源性鼠科动物Rs1基因座的外显子3的位置，并且通过靶向载体中含有的序列来制备周围的内含子(即，内含子2和内含子3)中的小缺失。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即来源于种系细胞含有上文所述的突变Rs1基因的小鼠的子代将在发育期间使选择性标记从分化的细胞脱离(图7；另参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。含有周围外显子、内含子和非翻译区(UTR)的内源性DNA未通过诱变和选择盒改变。靶向载体的序列分析确认了突变型Rs1基因的全部外显子、内含子、剪接信号和开放阅读框。
对于第二突变型等位基因，修饰小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆RP23-213O8，从而引入内源性Rs1基因的外显子5中的点突变(CGC至TGC)，以使得具有R141C氨基酸置换的RS1多肽将由所得的突变型Rs1基因产生(图8)。具体而言，含有上文所述的R141C点突变的合成外显子5被插入野生型外显子5的位置，并且内含子4(10bp)和内含子5(29bp)中具有另外的缺失，将这些缺失包括在内有利于筛选阳性克隆(图9)。通过从头DNA合成来制备合成片段(GeneScript,Piscataway,NJ)。将包含突变型外显子5和周围的五子序列(5’和3’)的合成片段包含在质粒骨架中，并且使其在细菌中在氨苄青霉素的选择下复制。使用限制性酶将包含潮霉素抗性基因的盒(使用loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Hygro-pA-loxP，5,032bp)连接至合成片段并附上同源臂，以产生用于与RP23-213O8 BAC同源重组的靶向载体(图8)。然后通过电穿孔将所得的经修饰的RP23-213O8 BAC克隆引入ES细胞中(参见下文)。Rs1R141C-SDC靶向载体包含可操作地连接至发育调节的小鼠鱼精蛋白1启动子的编码Cre重组酶的序列，以使得重组酶在未分化细胞中表达(图8；另参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389；所有这些专利均以引用的方式并入本文)。在同源重组时，合成的突变Rs1外显子5被插入内源性鼠科动物Rs1基因座的外显子5的位置，并且通过靶向载体中含有的序列来制备周围的内含子(即，内含子4和内含子5)中的小缺失。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即来源于种系细胞含有上文所述的突变Rs1基因的小鼠的子代将在发育期间使选择性标记从分化的细胞脱离(图10；另参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。含有周围外显子、内含子和非翻译区(UTR)的内源性DNA未通过诱变和选择盒改变。靶向载体的序列分析确认了突变型Rs1基因的全部外显子、内含子、剪接信号和开放阅读框。
通过聚合酶链式反应和序列分析来确认每个靶向载体的构建，然后将所述靶向载体用于电穿孔小鼠胚胎干(ES)细胞，以产生包含无效Rs1基因和突变型Rs1基因的经修饰的ES细胞。用于电穿孔的小鼠ES细胞来自杂交背景(50％129/S6/SvEv/Tac，50％C57BL/6NTac；Auerbach,W.等人(2000)Biotechniques 29(5):1024-8,1030,1032)。在电穿孔后10天挑取耐药性克隆，通过进行筛选，并且如上所述(Valenzuela等人，出处同上；Frendewey,D.等人,2010,Methods Enzymol.476:295-307)使用检测lacZ报告基因或点突变向内源性Rs1基因的适当引入的引物/探针组进行核型分析以得到正确的靶向(表1以及图3、图6和图9)。通过测序来确认阳性ES细胞克隆。
然后使用方法将阳性ES细胞克隆用于移植雌性小鼠(参见例如美国专利No.7,294,754；DeChiara,T.M.等人,2010,Methods Enzymol.476:285-94；DeChiara,T.M.,2009,Methods Mol.Biol.530:311-24；Poueymirou等人,2007,Nat.Biotechnol.25:91-9)，其中将靶向ES细胞注入未致密化的8细胞期Swiss Webster胚胎，以产生针对无效Rs1基因或突变型Rs1基因的健康的全ES细胞来源的F0代小鼠杂合子。已报道，C57BL/6N小鼠品系含有使得在形成视网膜变性动物模型中的用途变得复杂的突变(Crb1rd8)(参见例如Mattapallil,M.J.等人,2012,Immunol.Microbiol.53(6):2921-7；Mehalow,A.K.等人,2003,Hum.Mol.Genet.12:2179-89)。通过使F0代杂合子雄性与C57Bl6/NTac Crbs1雌性交配来校正该突变，以避免从该突变产生的任何可能的并发症。然后使从这些杂交获得的F1杂合子杂交，以产生F2代纯合子和野生型小鼠，从而用于表型分析。
上文所述的经工程化的Rs1小鼠品系的世代使得在每个经工程化的Rs1基因座中产生独特的核苷酸连接。对于无效等位基因，整个上游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，所述序列标示了内源性小鼠Rs1 5’序列以及与lacZ编码序列(小写字体)邻接的小鼠Rs1 ATG密码子(小括号中包含的大写字体，ATG密码子以中括号标示)。(GCTCTCCACTTCACTTAGAT CTTGCTGTGA CCAAGGACAA GGAGAAA[ATG])ggtaccgatt taaatgatccagtggtcctg cagaggagag attgggagaa(SEQ ID NO:33)。整个下游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，该序列标示了与外显子3的最后六个核苷酸邻接的盒序列(小写字体，NheI位点以中括号标示)以及小鼠Rs1基因的内含子4的开始序列(包含在小括号中，以大写字体标示)：cagcccctag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat[gctagc](TTCCAGGTGAGTGGCTCAAC GCCCTAGCAT TCCTCCTTCC AACTCTTAAT)(SEQ ID NO:34)。在重组酶介导的选择盒切除之后，整个下游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，该序列标示了与小鼠Rs1序列(包含在小括号中，以大写字体标示)邻接的其余的lacZ序列(小写字体，ICeu-I、loxP和NheI位点以中括号标示)：
对于C59S等位基因，整个上游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，该序列标示了在插入点与盒序列(小写字体，XhoI位点以中括号标示，loxP位点以粗体字体标示)邻接的内源性小鼠Rs1外显子3和周围的内含子序列(包含在以下小括号中的大写字体，外显子3以中括号标示，突变密码子以粗体字体标示)： 整个下游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，所述序列标示了与插入点下游的小鼠Rs1内含子3序列(包含在以下小括号中的大写字体)邻接的盒序列(小写字体，I-CeuI位点和NheI位点均以中括号标示，loxP位点以粗体字体标示)：
在重组酶介导的选择盒切除之后，整个插入点中的核苷酸序列包含以下序列，所述序列标示了与其余的盒序列(包含在以下小括号中的小写字体，XhoI、I-CeuI和NheI位点以粗体字体标示，loxP位点以粗体字体表示)并置的小鼠Rs1外显子3序列和其余的内含子3序列(大写字体，外显子3以中括号标示)：
对于R141C等位基因，整个上游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，该序列标示了在插入点与盒序列(小写字体，XhoI位点以中括号标示，loxP位点以粗体字体标示)邻接的内源性小鼠Rs1外显子5和周围的内含子序列(包含在以下小括号中的大写字体，外显子5以中括号标示，突变密码子以粗体字体标示)： 整个下游连接点中的核苷酸序列包含以下序列，所述序列标示了与插入点下游的小鼠Rs1内含子5序列(包含在以下小括号中的大写字体)邻接的盒序列(小写字体，I-CeuI位点和NheI位点均以中括号标示，loxP位点以粗体字体标示)： 在重组酶介导的选择盒(内含子5中的其余78bp)切除之后，整个插入点中的核苷酸序列包含以下序列，所述序列标示了小鼠Rs1序列(内含子4、外显子5和内含子5以大写字体标示)以及其余的盒序列(内含子5中其余的loxP和克隆位点[78bp]，以包含在小括号中的小写字体标示；XhoI、I-CeuI和NheI位点以中括号标示，loxP位点以粗体字体标示)：
总之，本实施例展示了基因组包含经工程化的Rs1基因座的三种啮齿动物(例如，小鼠)品系的世代。此类经工程化的Rs1啮齿动物品系提供了用于阐明视网膜劈裂的生物学和分子机制以及用于开发能够有效治疗和/或改善此类疾病的治疗剂的体内系统。
表2.用于测定的引物/探针组
实施例2.经工程化的Rs1啮齿动物品系的表征
本实施例描述了根据实施例1制备的经工程化的Rs1啮齿动物品系的表征。具体而言，本实施例展示了这些经工程化的小鼠的视网膜中RS1蛋白的定位和分布。还描述了所有经工程化的Rs1品系的视网膜构造。
LacZ表达谱分析.通过CO2吸入来对小鼠实施安乐死。摘除眼部并用4％溶于PBS的多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)在4℃下固定3小时。在用1xPBS(ThermoFisherSci.)洗涤三次之后，在解剖显微镜下解剖眼部。移除前部部分和晶体；在37℃缓慢旋转下用HistoMark X-Gal底物组(KPL)对眼部的其余部分(视杯)进行染色2天。在染色之后，用1xPBS充分冲洗视杯，然后将转移至30％蔗糖放置过夜。将视杯包埋在O.C.T.化合物(VWR)中，并在干冰上进行冷冻。在Plus显微载玻片上制备20微米冷冻切片。将切片在室温下干燥30分钟，然后用1xPBS洗涤三次以除去O.C.T化合物，并且使用含DAPI的ProLong金抗荧光淬灭封固剂(ProLong Gold Antifade Mountant withDAPI)(ThermoFisher Sci.)来密封盖玻片。来自雄性小鼠的代表性结果如图11A所示。
Rs1 mRNA表达.根据制造商的说明书(Advanced Cell Diagnostics)使用通过原位杂交来确定实施例1中描述的经工程化的Rs1小鼠品系中的Rs1mRNA的表达模式。简而言之，将福尔马林或4％多聚甲醛(PFA)固定的和石蜡或O.C.T.包埋的小鼠视杯切成5至10μm切片，并且装配在Plus载玻片上。进行如下程序：首先在室温下进行10分钟预处理1(ACD,320037)，然后在预处理2(ACD,320043)中使用Oster气蒸器(IHC World,LLC,Model 5709)进行20分钟煮沸，以及在40℃下在HybEZ烘箱(ACD,310010)中进行预处理3(ACD,320037)30分钟。还包括另外的DNA酶处理步骤，以减少来自使用染色体DNA进行的探针杂交的潜在背景。在预处理3之后，用水洗涤载玻片三次，并将DNA酶I的溶液(50u/ml溶于1x DNA酶I缓冲液,AM2224,Ambion)添加至眼部组织，在40℃下温育30分钟。用水洗涤载玻片五次，在40℃下用探针杂交二小时，进行制造商的测定方案的其余步骤(ACD,322360)，即放大1至放大6。洗涤载玻片两次(每次在室温下进行两分钟)，每个步骤使用洗涤缓冲剂(ACD,310091)进行。在放大步骤之后，通过以下步骤来检测信号：在室温避光条件下温育红色工作溶液(红色B与红色A的比率为1:60)10分钟，然后在水中洗涤载玻片若干次，并在显微镜下观察。在一些实验中，进行IHC技术，使用开放视野Nikon Eclipse Ti-E显微镜来查看和捕获荧光信号。来自雄性小鼠的代表性结果如图11B所示。
Rs1蛋白表达.通过免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹和ELISA测定来确定野生型和经工程化的Rs1啮齿动物的视网膜各层中的蛋白质表达水平。来自雄性小鼠的代表性结果如图11C和图12A-图12D所示；来自雌性纯合KO(Rs1-/-)和Rs1杂合子KO(Rs1-/+)品系的代表性结果如图12E所示。
免疫组织化学(IHC).简而言之，通过CO2吸入来对动物实施安乐死。摘除眼部并在4℃下用4％溶于1xPBS(ThermoFisher Sci.)的PFA(Electron Microscopy Sciences)固定三小时。在用1xPBS洗涤三次之后，在解剖显微镜下解剖眼部。移除前段和晶体，在4℃下30％蔗糖中温育眼部的其余部分(视杯)过夜。然后将视杯包埋在O.C.T.化合物(VWR)中，并在干冰上进行速冻。在用于免疫荧光染色的Plus显微载玻片上制备10微米冷冻切片。用Super Pap阻液笔(Liquid Blocker Super Pap Pen)(Electron Microscopy Sciences)封闭载玻片上的切片，并在室温下空气干燥30分钟。制备如下的阻断溶液：5％正常山羊血清(VectorLabs)、1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)和0.3％溶于1xPBS的Triton-X 100(Sigma-Aldrich)。制备如下的洗涤溶液：0.1％溶于1xPBS的Tween 20(Amresco)。将载玻片置于带黑盖的染色容器中，用1xPBS洗涤三次以除去O.C.T.化合物。将阻断溶液添加至载玻片，并在室温下保持一小时。在除去阻断溶液之后，在阻断溶液中稀释一抗并在4℃下施加于切片过夜。在第二天，用洗涤溶液来洗涤载玻片三次。在1xPBS中1:1000稀释荧光团缀合的二抗并在室温下施加于切片一小时(在黑暗中进行以避免光漂白)。用1xPBS洗涤载玻片三次，并且使用含DAPI的ProLong金抗荧光淬灭封固剂(ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI)(ThermoFisher Sci.)来密封盖玻片。
ELISA.简而言之，在解剖显微镜下分离小鼠视网膜，并且使用Omini匀浆器在金属珠管的RIPA缓冲液中进行匀化，每个视网膜用100μl含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液匀化。使用BCA试剂盒来确定蛋白质浓度，然后储存在-80℃下直到使用(ELISA、蛋白质印迹)。使用RS1标准蛋白质(Novus Biologicals,0-40ng/ml)来涂覆ELISA板(NUNC)，将总视网膜蛋白质样品(在PBS中1:2000稀释)一式三份在4℃下放置过夜。在用T-TBS溶液(T-TBS缓冲液，0.05％溶于TBS溶液的Tween20)洗涤三次之后，在室温下用阻断缓冲液(1％BSA，5％溶于TBS的山羊血清)阻断平板一小时。在3次洗涤之后，将抗RS1多克隆抗体(NovusBiologicals USA，1:4000溶于阻断缓冲液)添加至平板，并且在室温下温育二小时，然后添加生物素缀合的山羊抗小鼠抗体(Jackson Lab,1:5000)和链亲和素-HRP(Thermo,1:200)，最后在避光条件下添加底物工作溶液(R&D systems)。用2N HCl终止反应。用SpectraMaxPlus系统(Molecular Devices)来记录光密度。
蛋白质印迹.将10-20μg总视网膜蛋白加入4-12％溶于含有4％SDS的样品缓冲液(Nupage LDS样品缓冲液，Thermo)的Bis-Tris凝胶，以进行蛋白质分离，然后转移至硝酸纤维素膜(0.45μm孔径，Invitrogen)，然后在室温下用SuperBlock T20(TBS,Thermo)阻断一小时。在室温下用抗RS1抗体(Novus Biologicals USA,1:4000)温育印迹二小时，或在4℃下温育过夜。在用抗RS1抗体温育之后，在室温下以1:5000的比例添加HRP缀合的抗小鼠多克隆抗体(Cell Signaling)一小时。使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo)通过C-Dogit印迹扫描仪(Li-Cor)对蛋白质带显影和成像。
组织学.简而言之，通过CO2吸入来对动物实施安乐死。摘除眼部并在室温下用Davidson固定剂(Electron Microscopy Sciences)固定一小时，将眼部转移至组织处理包埋盒(Electron Microscopy Sciences)，并在室温下用自来水洗涤五分钟。用10％溶于磷酸盐缓冲液的中性缓冲福尔马林(Electron Microscopy Sciences)来固定盒。通过连续稀释的乙醇、三次变化的二甲苯和两次变化的石蜡(用于进行包埋)来处理眼部。在Plus显微载玻片(VWR)上制备5微米石蜡切片，并根据制造商的说明书(苏木精和伊红(H&E)染色(Regressive)Ricca Chemical Company)用苏木精和伊红进行染色。来自雄性小鼠的代表性结果如图13A-图13B所示。
总之，本实施例表明，在根据实施例1制备的经工程化的Rs1啮齿动物品系中重现与X连锁视网膜劈裂相关的疾病表型的典型病理学特征。因此，此类经工程化的啮齿动物品系可用于评估和开发治疗剂(例如，实验基因疗法)。
实施例3.经工程化的Rs1啮齿动物品系的功能和形态分析
本实施例描述了根据实施例1制备的经工程化的Rs1啮齿动物品系的视网膜表型的表征。具体而言，通过暗适应(DA)和明适应(LA)全视野视网膜电图(ERG)来评估实施例1中制备的无效和突变型Rs1啮齿动物品系中的外层视网膜功能。还通过光学相干断层扫描(OCT)来评估视网膜构造。来自雄性小鼠的代表性结果如图13C和图14A-图14C所示；来自雌性纯合KO(Rs1-/-)和杂合子KO(Rs1-/+)品系的代表性结果如图13D和图14D所示。
光学相干断层扫描(OCT).简而言之，在指定时间点用Heidelberg SpectralisHRA+OCT系统(Heidelberg Engineering,Franklin,MA,USA)进行解剖前(in-life)眼科检查。通过腹膜内注射开他敏(120mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)来麻醉动物。使用0.5％托吡卡胺眼用溶液(Bausch&Lomb,Rochester,NY)来散瞳。从中心和选定的象限(通常是鼻上和颞上)采集红外眼底图像，然后获得一系列61份侧面光学扫描图，以用于视网膜形态评估。
视网膜电图检查(ERG).简而言之，使动物暗适应过夜并麻醉(开他敏：80mg/kg；甲苯噻嗪：16mg/kg)，其后使用滴眼剂进行散瞳(1％托吡卡胺；2.5％盐酸去氧肾上腺素)和麻醉角膜表面(1％盐酸丙美卡因)。针状电极作为参考电极(面颊)和接地电极(尾部)，使用1％羧甲基纤维素润湿的不锈钢电极来记录ERG。向暗适应的眼部提供频闪刺激并在光适应至少五分钟之后叠加在稳定的适应场(20cd/m2)上。刺激范围为-3.6至2.1log cd s/m2。使反应放大(0.03-1000Hz)并使用LKC(Gaithersburg,MD)UTAS E-3000信号平均系统来储存。在从刺激前基线开始闪烁后测量8ms时a-波的振幅，同时测量从a-波波谷至b-波波峰的b-波振幅。
总之，本实施例表明，本文所述的经工程化的Rs1啮齿动物品系中显示的表型重现了X连锁视网膜劈裂患者中的观察结果。此外，该表型中的变化与遗传突变的性质相关联。本说明书明确展示了视网膜劈裂的非人类动物模型的产生。在本文所述的全部三种经工程化的Rs1啮齿动物品系中重现了通常与X连锁视网膜劈裂相关的病理学和功能特征，包括在内层视网膜内产生囊肿结构，以及特征性ERG b-波和a-波反应减少，其后是感光细胞的丧失。此类经工程化的品系用于进一步理解视网膜结构的细胞解体的基本分子机制，并且提供了用于开发针对X连锁青少年视网膜劈裂治疗的基因疗法的合适的体内系统。
实施例4.Rs1 KO小鼠中视网膜的早发性表型
本实施例描述了研究实施例1中描述的Rs1敲除(KO)小鼠中的视网膜的早发性功能和形态表型所进行的实验。
在出生后第15天至第24天之间每三天(P15、P18、P21和P24)检查Rs1KO小鼠和野生型(WT)同窝仔的视网膜一次(图15)。通过暗适应(DA)和明适应(LA)全视野ERG来评估外层视网膜功能。用Naka-Rushton方程来分析ERG a-波和b-波振幅，得到最大反应(Rmax)和灵敏度(K)参数。通过光学相干断层扫描(OCT)来评估视网膜构造。
来自雄性小鼠的结果如图16A-图19C所示。在整个观察时间过程(P15-P24)中提供了通过暗适应和明适应ERG评估的外层视网膜功能，所述ERG表明在所有时间点和视网膜劈裂表型中b-波相对于a-波减少。Rs1 KO视网膜还表现出早期感光缺陷，具体而言，a-波振幅减少、EZ变宽以及外层视网膜(ONL+PRL)变薄。在Rs1 KO视网膜中，在振幅和灵敏度二者方面，b-波受累大于a-波，这表明Rs1缺失对突触产生了早期影响。
这些观察结果表明，视网膜劈裂蛋白在视网膜早期发育期间发挥了重要作用。
序列表
<110> 再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)
<120> 视网膜劈裂的非人类动物模型
<130> 35518 (10328WO01)
<150> 62/463,872
<151> 2017-02-27
<150> 62/576,256
<151> 2017-10-24
<160> 59
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5855
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 1
aacaatacct ccccagactg cttgttgagg caggggacta tgtggcttaa ttggatgggg 60
gctgagtgaa agacctaaga actaaatgaa ataagatgct taagttaatc gcctgctcct 120
atgccagctc tccacttcac ttagatcttg ctgtgaccaa ggacaaggag aaaatgccac 180
acaagattga aggcttcttc ttgttacttc tctttggcta tgaagccaca ttgggattgt 240
catcgacaga ggatgagggt gaggacccct ggtaccagaa agcatgcaag tgtgattgcc 300
aggtaggagc caatgctctg tggtctgctg gagctacctc cttagactgt attccagaat 360
gcccatatca caagcccctg ggtttcgagt caggggaggt cacgccagat cagatcactt 420
gctccaaccc agagcagtat gtgggctggt attcctcatg gacagcaaac aaggcccgac 480
tcaacagtca aggttttggg tgtgcttggc tttccaagta tcaggacagc agccagtggt 540
tacagataga tttgaaggag atcaaggtga tttcggggat cctgacccaa ggacgctgtg 600
acatagacga gtgggtgacc aagtacagtg tgcagtatag gactgatgag cgcctgaact 660
ggatctacta taaggatcag accggaaaca atcgggtctt ctatggaaac tcagaccgga 720
gttctacagt tcagaactta ctcaggcccc ccatcatttc ccgcttcatc cgactgatcc 780
ctctaggctg gcatgtccga attgccatcc ggatggagct gcttgagtgt gccagcaagt 840
gtgcctgatg tctatttcag ctcagttctg tcacttgcag ggagagcttt ggggggaggg 900
caccctgaaa taccactggg atgaatgggg ctatatctta taagcacttt acaatgtaga 960
tctgggtaga gaatatttca ctttttaaaa gatagtttca aatttcaaag ggagagagag 1020
agagagagag agagagagag agagagagag agaagctttt aagcttttct tcaactcagg 1080
gccaaagaaa ataagaacaa agaaagtatc tctcaaacca attttcttac acaaacccaa 1140
atagcagggg taatttgctg ctctggctcc ccatcttttt ctctttgtct cagtgacacc 1200
gtcaaaggtg caggcccagg ggaacacaaa gcagctctga taatttgaaa attctttttg 1260
gctcttagca cattcagaag aggagcgtac tctttggcaa agcctcacat gaacacttgc 1320
atgaaatcct cactatagag gcctggtgac aagtacatag gtgtgaagaa agcagaagga 1380
agcctggcgt atggcccacg agtctggagc cagtaaccaa ccaaccaact aaccaactaa 1440
ccaaccagtc aaggcttccc cctccctgga attgcttttg cctggaaggg gtggagctcc 1500
ttgtgcagaa actccattct acagcccttt tggcaatgtg tccttctgtg attgcctgga 1560
gatgaatgca aggggcaggc tatatgtgtg tgtggatagt gaggtttccc ttaaactgag 1620
gaagcccaaa taactagaat acatcacacc ttctttatcc atggctacag tttcccagaa 1680
attgaacagg cttagaaaac agctgagata aaccatatct ctatctactg ggaagagatc 1740
atgctttggg ggaaggggtt aggactccta tcatagagga ctgtacacag atgatctgtc 1800
agtaaagggc ttgctgtaca gcataggaac ttgagattat atttctagaa tgcatgtaaa 1860
aagctaggta tggacaggta tggtggaaca tgccattagt cttagtattt ggaagacaga 1920
ggcaagcaga tctgagttca gggccagcct ggtctacata gcagttccaa gctagccaag 1980
gctacacagt aaggccctgt ttcaagaaaa aaagaccagg catggagggg cacacctgca 2040
aatccaggac taggaggcag gcagagacag gatgatgcct agagcttgtc tgccaatcag 2100
tacactccag gttcatggtc agaccctgtc tcaaaactaa agtgaagagc tattgaggaa 2160
gataccagat gtcaacctct gtccaacatg cacacataca catacactgg taggtttcaa 2220
acctggggca aatggcagag gtgcctagtt aaggttctcc cagcatctct cagcccctac 2280
caggtcctcc tagttggcat accccgcccc ctaccccgaa actcttcagc ccagggggtt 2340
gggcttcttc cctatataat ccaactattt tggtcaccct ttctctttgt acctttgggc 2400
ctcctggttg ctgcatctgg ttcctctgtt ctcccttatc tcttttcctc cctcctctcc 2460
tcacaaggcc cagcttagag tgttcatgtc tattctggac tctctcccgg atgcccctgc 2520
ctctggctat gctctcccac atatctacca taaactctct cctctaccat acctaggaca 2580
agtcatgttc ctttcctttt cctttttgtt tcccattcaa acatgtaaat aggaaaaaca 2640
aaatacaaca acaacaaaca aaaataaaac cacaaaagcc ttctctccga gcggcttcct 2700
cccgtcctgc ccacccaaac atgcttactc agacatgaca tttgaaactt ctttcggtag 2760
tcattctctg gcaggaatag ctcatttaat caggagcttt ggagcctgag agaatgacta 2820
ctggtctcta gctcatttcc atctgtagct caagctgggt ttgaggctct tctctgggag 2880
aggctgttaa ctggagtgag ggtcaaaaag gcatgcgggg agaagctgag aatgagaact 2940
gcccagagac aaggtcttgg cctcacacac acacaataca gccttggtta gtacttttct 3000
ctgagctatt ttctatttcc aggtattaaa ggagattaca tggattcaca ccaaaataac 3060
tttggatggc cagacatggt atcttccatc tttaatccta gcactgggaa aacacagaca 3120
ggtggatctc tgtgagttca aggccaggtt tgcatagcaa gctccagacc agccaaggct 3180
atgtagtgag actgtctcaa aaatcaatcc atcaatcaaa tgatcttgga tgtcacattc 3240
ttctcagtga atagaacaac attttaatag catcaaattt cctacctagt attttggagt 3300
tccacaggtg tgtgtgtatg tgtggcaatg tacaacaata ttcctggtat gactacatat 3360
gtacaaattc attttggata atattcctga cagcagacct ttatttggaa aattgagtta 3420
cctttctcac cacactgagt aattgttaga gaaaaatggc aataacttaa gaatactgat 3480
cagggagaaa aaaacccaaa tggtacaagg catgggtaaa tagtcatcaa attaaaaaat 3540
catgccataa atttgttttc taatagtttc attaacttca cataaacagt cctaattcat 3600
ttaaggtgtg taattcaata tagtatattc aaacttgaac aatcatcact acaagtaact 3660
ttagactatt cttatcaccc ccaagagaat cctctaacaa tgggccatca gccaccacag 3720
ctctagatta ctcgtcatcc attttctatt tgtgtgtgga ttttttttcc attctgggca 3780
tttctccaca caaatggaat cttagaatat atagtagttt atgacttgtt tcttgtactt 3840
atcatagtgt ttttaaagtc catgtgttgg agaagtacat cctccttttt tgttattaac 3900
attctgtgta gggtattgta ttattattta tccatgcatt tgggtggggc tagtatgaat 3960
aatgctgctt catgaaaatt tatatgtaag ttattgcgtg gacatgtttt atcttgggca 4020
tactcacact gagaatagag aattgttggg tctcttggga actatttctc caggtggctg 4080
taccatcttc tgttcccacc agcaatgtct aatgcttcca gcctctcatc tttagcaatg 4140
cttcttgtat ttcattagat ctgtcctagt atgtatgaag tagcattcga tgatgaattt 4200
gatttgcatt tctctaataa ccaatgtttt ttgagcatct tttcaagtca ccagtgacat 4260
atttttggag aaagttctat tcagaccctt gcccatataa agatttcatt tcacggattc 4320
attaagagtt ctttgggtgt tctacataca attctcttat gcaaacattt cttccatcct 4380
gtttttcttc ttgtcattgt cttggtttag ttttgcacca ggatttcact atgtagctca 4440
ggctggcctg gaacttgcaa agatccttct gtctctgcct cccaggttct gagattctgg 4500
gtatttgcca ccacacctgg cctttctctg aagcacaaca aataccaaat tttaatgaag 4560
tccaaccttc cggtttcctt ttttggtgta ttatctgaga aactactgtc aaaccatggt 4620
caagaagatt cactcttgtg ttttcttcta aatgttttga aaaaaaattt ttaaaaagtt 4680
ttaaagtttt aactcttact ttgtgaacag ttataaagta agggtgtaat ttcattcttt 4740
ggatatcaat atgcagctgt cttggtagct tgtgttgtct tcaccacagt caatggtctt 4800
tattcttcca aaaacaactg accaagaata ttagagtata tgctaggcct cataattcta 4860
ttaccacata gtcttcatta ctgtagcatt gtagtgagtt gtggaattag gacatataaa 4920
tcttccaatt ctggttatgt ttcaagactg aactaactat tctgggttcc ttaaacttct 4980
aagtaagtat atctgtaaat aagccagcca ggggtctcac aatggaaaat gttttcaatt 5040
tcaaaattaa ataaacaatg agatattaag atctgcaaga tatttatctg tagttaattt 5100
tctttcaata gttaatgaaa atgttagcat tttcttcctt ttgtgttagg atatatatat 5160
aaaagaaacc ctattattaa agtaaacctg aaaaagaatc ttcctattaa acaaaaaata 5220
tgtttgcaat attatttctt ttagggggca actaattcaa taaagattat ataatggagg 5280
aaagtcattc ctatcttaac acattttgtt tatttttacc actagacttt gggttattaa 5340
ggattttatt ttttatggtt ttgaggacat aacccaggtt tttcatacat ggtaggcaaa 5400
tactcttcaa ttgagttctc tctgcagcct gcagatcaaa acaaaacaaa acattatggt 5460
aaagcataac aatttacata cttttagtta actgtgaagc attaaataat gatattaaga 5520
aaaaaatgga agtaatcctg gtagttgatg tgggaggtta tatagtgtgg tggtttggat 5580
atgcttggcc tattaggagg tgtggctttg ttggagtagg tgtggccttg ttggaagaag 5640
tacatcattg tgggagtggg ctttgacacc ctcctcctcg ctgcccgaaa gacagtattc 5700
tggctacctt tggatcaaga tatagaactc ttggctcctt ctccagcacc atgtctgcct 5760
gcatgctgtt ggctaggatg ataattgact aaacatctga aactgtaagc cagccccaat 5820
taaatgttgt ctttctaaga aaaaaaaaaa aaaaa 5855
<210> 2
<211> 224
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Val Gly Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Val Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Ser Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Ala Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 3
<211> 675
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 3
atgccacaca agattgaagg cttcttctta ttgcttctct ttggctatga agccacattg 60
ggattgtctt cgacagagga tgagggtgag gacccttggt accagaaagc gtgcaagtgt 120
gattgccagg gaggagccaa tgctctgtgg tctgctggag ccgcctcctt agactgtatt 180
ccagaatgcc catatcacaa gcccctgggt ttcgagtcag gggaagtcac accagatcag 240
atcacttgct ccaacccaga gcagtatgtg ggctggtatt cctcatggac tgcaaacaag 300
gcccggctca acagtcaagg ttttgggtgt gcttggcttt ccaagtatca ggacagtagc 360
cagtggttac agatagattt gaaggagatc aaggtgattt cggggatcct tacccaagga 420
cgctgtgaca tagatgagtg gatgaccaag tacagtgtgc aatataggac tgatgaacgc 480
ctgaactgga tttactataa ggatcagact ggaaacaatc gggtcttcta tggaaactcc 540
gaccggagtt ctacagtcca gaacttactg aggcccccca ttatttcccg cttcatccga 600
ctgatccctc taggctggca tgtccgaatt gccatccgga tggagctgct tgagtgtgcc 660
agcaagtgtg cctga 675
<210> 4
<211> 224
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 4
Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Ala Ala Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Ser Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Ala Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 5
<211> 994
<212> DNA
<213> 普通猕猴
<400> 5
cagttcagta aggtagagct tcggccgagg acgaggggaa gatgtcacgc aagatagaag 60
gctttttgct attacttctc tttggctatg aagccacatt gggattatcg tctaccgagg 120
atgaaggcga ggacccctgg taccaaaaag catgcaagtg tgattgccaa ggaggaccca 180
atgctctgtg gtctgcaggt gccacctcct tggactgcat accagaatgc ccatatcaca 240
agcccctggg tttcgagtca ggggaggtca caccagacca gatcacctgc tctaacccgg 300
agcagtatgt gggctggtat tcctcgtgga ctgcaaacaa ggcccggctc aacagtcaag 360
gctttgggtg cgcctggctc tccaagttcc aggacagtag ccagtggtta cagatagatc 420
tgaaggagat caaggtgatt tcagggatcc ttacccaggg gcgctgtgac atcgatgagt 480
ggatgaccaa gtacagcgtg cagtacagga ccgatgagcg cctgaactgg atttactata 540
aggaccagac tggaaataac cgggtcttct atggcaactc ggaccgcacc tccacggttc 600
agaacctgct gcggcccccc atcatctccc gcttcattcg cctcatcccg ctgggctggc 660
acgtccgcat tgccatccgg atggagctgc tggagtgcgt cagcaagtgt gcctgatgcc 720
tgcctcagct tggcgcctgc tggggggtga ccggcgcaga gcggggccgt aggggacccc 780
ctcacatacc actgggatgg acagggctat atttcgcaaa gcaaatttta actgcagtgc 840
tgggtagata cttttttttt tttttttttt aagatatagc tttctgattt caatgaaata 900
aaaatgaact tattccccac tcagggccag agaaagtcag aacaaagaaa atgtcccgaa 960
aaccaatttt cttacaaaag cctaagcagc aggg 994
<210> 6
<211> 224
<212> PRT
<213> 普通猕猴
<400> 6
Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 7
<211> 3039
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
agtaaggtag agctttggcc gaggacgagg ggaagatgtc acgcaagata gaaggctttt 60
tgttattact tctctttggc tatgaagcca cattgggatt atcgtctacc gaggatgaag 120
gcgaggaccc ctggtaccaa aaagcatgca agtgcgattg ccaaggagga cccaatgctc 180
tgtggtctgc aggtgccacc tccttggact gtataccaga atgcccatat cacaagcctc 240
tgggtttcga gtcaggggag gtcacaccgg accagatcac ctgctctaac ccggagcagt 300
atgtgggctg gtattcttcg tggactgcaa acaaggcccg gctcaacagt caaggctttg 360
ggtgtgcctg gctctccaag ttccaggaca gtagccagtg gttacagata gatctgaagg 420
agatcaaagt gatttcaggg atcctcaccc aggggcgctg tgacatcgat gagtggatga 480
ccaagtacag cgtgcagtac aggaccgatg agcgcctgaa ctggatttac tacaaggacc 540
agactggaaa caaccgggtc ttctatggca actcggaccg cacctccacg gttcagaacc 600
tgctgcggcc ccccatcatc tcccgcttca tccgcctcat cccgctgggc tggcacgtcc 660
gcattgccat ccggatggag ctgctggagt gcgtcagcaa gtgtgcctga tgcctgcctc 720
agctcggcgc ctgccagggg gtgactggca cagagcgggc cgtaggggac cccctcacac 780
accaccgaga tggacagggc tatatttcgc aaagcaattg taactgcagt gctgggtaga 840
taattttttt ttttttaaga tatagctttc tgatttcaat gaaataaaaa tgaacttatt 900
ccccactcag ggccagagaa agtcagaaca aagaaaatgt ccccgaaacg aattttctta 960
caaaagccta agtagcaggg gtaattttct gctcattttt tgtctcagtg atactgtgaa 1020
aggtgcagtc tcaggggaac acaaagcagc cctgataatt tgaaaattca tttgctttac 1080
cacattcaag acagaaacat acagtttcct aaagcctggc tttgaatgca gaagggagca 1140
gctcctccta gttaagtttc cactaaatca tcgccaaaga ggacttcaga gccctgggga 1200
ggcagctgag ggtctcaagg gtgactgggt ggcagggatg agtgcggtgg gtgagaatcc 1260
cggtgccctg agaggctata cgtgacaaat gaccaaaagc ccaaggtagg ggagtttcct 1320
ctgctcacag ttcttacctt caaggcggat ctgggcttcc accctcatga acacagggat 1380
tggggaggga ccagagcgcc caatacacac agctccatta tgcaatccat tccagcaaat 1440
tccccgtgtc tgtggtcacc atttaggtga tcatacagga caggctgcac atctcagtat 1500
atgtagggac cccaaatgac cacaacacag tacaattgcc ctttacctag ggctaccatt 1560
tcctagcaaa ccaaacatag ttcgagaaca gctggcccag gagctaccac tggctactca 1620
gaggaggctc attagctggc tacatgcttc gcaggaagtg ggaaggactc acatcataaa 1680
aaggaccatg tagctttttc cctgaaagct tctcaccctc caccctctgc cttgcaatac 1740
gcaaactgcg cctgctcctg aaaagctctc tgggaaggaa tgggcctggc tttccgttcc 1800
tggaggcggc gccttagatt gggaggcctc attggccact tagagcgcag cctgagtttc 1860
caggcccctt cctgggagag gctgttaaca cgggggaggg gcaggagagg gatatggaga 1920
gcaggtggtg gaatcagagg acgaggctgc tctaaagact gttctggccc cagacacagg 1980
gtagtctttg ctagcagctc atttccgagt tacttttcat tttcaaatgc caaggcaagt 2040
gactagactc gcgctaatac agtgctggac aacacattca ccttttctgt gaacaggcag 2100
ccttctaaaa gccccaaaca tccttcttga tgctttgggg gctcaattat tttatatcca 2160
acccagcatc tttctagtcc ctatgctgta tgcttgaact cggaaaatgc ttttccccgc 2220
ccaatcttct ctcaaatata aacacatcac acagggtgtt gggggtgggg ggggggggtg 2280
gggggactta tccctggcct taggacacag gacaaatcta ttttggatag aaatgcctga 2340
acagagaccc ttatttggaa aggtgaatta actttggtca cgacatggac tgtcagacaa 2400
aatggcagta tcctaagagt taaggcacat caaacacagg agtcgagaga gtgcagttca 2460
gggaaaaagg agaggaggaa acagtgaggc agggagaaag gctttccaaa taagagttca 2520
tgttggaaac ttttgtcacg gctttattga gattaagttc acatacaatt tgtatccatt 2580
taaagtgtac aatttgatga cttttggtat attcagagtt gtgcaaccat tatcactaga 2640
tcaattttag aaagtttatc accccaaaga gaaatcctgc acccatcagc caacactccc 2700
caacccatcg gccaccccaa gccctctgca accacgaatc gactgtctct gtagattggc 2760
cttctggacg ttctacataa atgaaatcat atagtatgtg gtatttcgtg actggcttct 2820
ttcacttagc atagtgtttt aaagttcatc cacgttataa catgtgtatc actatgtcac 2880
ttgtcactcc tttttattgc tgaacatcat tgttcagtat catgtcaaga gcacattgtt 2940
atttatccat tcatccattg atggatattt gggtttccac tctttagcta ttatgaataa 3000
tgctgctatg aacatttgtg tataaaaaaa aaaaaaaaa 3039
<210> 8
<211> 224
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 9
<211> 2061
<212> DNA
<213> 狼
<400> 9
aatgaggcca gcgctcaagt taagcccctg ctcctggaga agctctccac ttggataagg 60
tagagctgcg gccaaggaca aggggagaat gccccgcaag atagaaggct tcttgttttt 120
acttctcttc ggctatgaag ccacactggg attatcgtct actgaggatg agagtgagga 180
cccctggtac cagaaagcat gcaaatgtga ctgccaaggc agtcccaatg gcctctggtc 240
ggctggtgcc acctccttag attgcatacc agaatgcccg tatcataagc ccctgggttt 300
cgagtcagga gaggttacac cagaccagat cacttgctcc aacctggatc agtatgtggg 360
ctggtattcc tcatggacag ctaacaaggc ccggctcaac agtcaaggct ttgggtgcgc 420
ctggctctcc aagtaccagg acagcagcca gtggttacag atcgatctga aggaggtcaa 480
ggtgatttca ggaatcctca cccaggggcg ctgtgacatc gacgagtgga tgaccaagta 540
cagcgtgcag tacaggacgg atgagaacct gaactggatt tactataagg accagacagg 600
aaacaatcgg gtcttctatg gaaattcaga ccgaacctcc acagtccaga accttctgcg 660
gccccccatc atttcccgct tcattcggct gatcccgctg ggctggcatg tccgcattgc 720
catccggatg gagctgctgg aatgcgtcag caagtgtgcc tgaggcctcc ttcagctcca 780
cacctgccct ggggtggggg tggggggtag ataggggtgg agggctcaga gcagcctgca 840
ggggaaccct gacagggttc caacagggtg acaaacgcag ctgtatttta caagctcttt 900
tcaatgcaga gcctggcaga aataatttct ttaaaaaaac aagtttccca tttcaatcaa 960
agagaaagga aaacgagcgt atttcccact cactgccaaa gaaaataaga acaaagaaaa 1020
cgtccctaaa actagttttc atctaaaagc ctaagtagca ggggtaattt tgctgctttt 1080
tctttttggt tttggtctga cagtgtgaaa ggtgtggtcc cagggaacac aaaagagccc 1140
agataattta aaaactcttt tgctttacca cactaaaaac aggaacatag aggtttttct 1200
tttcttttct tttcttttct tttcttttct tttcttttct tttcttttct tttcttttct 1260
tttctttccg gaacacagag tttcataaaa ccttgatttg attgcaaatg gggagcaagc 1320
ttgcggtttc tccttttaag ttttcagtga atcatggcct tttaggactt ttagagcacc 1380
cggcatgcag ggggcaaggt tttgggtgac tggttgtcag agatgagtag agcagttggg 1440
agcctgtgtc ctggtgtcct gagagctgtg cacaaccaat ccccccaggt aagagggctt 1500
cctctgctct gagctttcac ccccacgcac acaaggatag ggagggggtg gttgcagagc 1560
tctcattaca tacagatcta ttctagcaaa tttttccagc ctgtggtcac tatctgggtg 1620
aatacatggg acaggctgca catgtaagca gcagttctct atatttagga aagccaaatg 1680
accagagctc accagaattt ccccttatct agggctacca tttttcaaca agcttaacat 1740
tttaaaaaca gctggcccag gagctatcac tggctacaca gaggaagccc attagctaac 1800
tgcatgcttt gcaggaagtg gtcagaccct atgtcctaag aagggccatg tggctgtgtc 1860
tctcacgacc caactgttta acctctcccc cttgccctag aacacacaac catgcctact 1920
cctgaggctg aaatggcctt gggagggacg gggctaggaa tgggcctggc cttccgaggg 1980
gagtgcataa agcagggact tttcagggac cacagcctaa gcctcctctg tcatttatag 2040
ctcagcctga gttttcaggc t 2061
<210> 10
<211> 224
<212> PRT
<213> 狼
<400> 10
Met Pro Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Phe Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Ser Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Ser Pro Asn Gly
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Leu Asp Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Asn
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 11
<211> 1772
<212> DNA
<213> 野猪
<400> 11
ccgggtcttc tgattccagt ttctattttc ctccactgct tcccttacat ttaaagatag 60
aataaagcca gtagcttcct ttgctaaacc gacctcagtt gacatcggct tcttctcaga 120
gacttccttg ttgaggcagg taacgacgtg ggttaacttg tcggggctca gccaaagccc 180
taagagctaa atggaataag atgcttaatg aggccagtgc tcaagttaag ctcctgttcc 240
tagggaagct ctccacttcg ataaggaaga gcagcagcca aggacaaggg gagaatgcca 300
cgcaagatag aaggcttctt gtttttactt ctctttggct atgaagccac cctgggatta 360
tcgtctacgg aggatgaggg tgaggacccc tggtacaaca aagcgtgcaa gtgtgactgc 420
caaggaggcg ccaatgccct gtggtctgcg ggcaccaccc ccttagactg cataccggaa 480
tgcccgtatc ataagcccct ggggttcgag tcaggagagg ttacaccaga ccagattacc 540
tgctccaacc tggagcagta cgtgggctgg tattcctcgt ggactgccaa caaggcccgg 600
ctcaacagtc aaggctttgg gtgcgcctgg ctctccaagt tccaggacag cagccagtgg 660
ttacagatag atctgaagga ggtcaaggtg atttcaggga tcctcaccca gggccgctgt 720
gacatcgatg agtggatgac caagtacagc gtgcagtaca ggaccgatga gagcctgaac 780
tggatttact ataaggacca gactggaaac aaccgggttt tctatggaaa ctcagaccga 840
acctccacag tccagaacct gctacggccc cccatcattt cccgcttcat ccggctcatc 900
ccgctgggct ggcacgtgcg cattgccatc cggatggagt tgctggagtg cgtcagcaag 960
tgtacctgac ggggtgcccg ccagggtgcg cagggcacgg agcagccggg cgactgctga 1020
tctaccgctg tgaccaacaa ggctgtatct tacaggctct actcaatgca gagctgggca 1080
gagaagacat ctttctttct ttggttttct tcctttcttt ttttttaaat atagtttgca 1140
tttcaataaa caaaccgaat taaatcttca ctcagggcca aagaaaataa gaacaaagaa 1200
aatgtcccta aaaacaattt tcatgcaaaa gcaaagcagg agtaatttgc tgctctctgg 1260
agttttttgt tttcgctttt tttttttttt ttttttttga ttgtttgctt tttggtctca 1320
gtgacactgt gcaaggtgcc ctcccaggag aatgcaaagc agccctaata atctgaaaat 1380
tcttttgctt taccacattc aaaacaagaa cacagagttt cataaagcct cactttgaaa 1440
gcaaagaggg agcaagcttg tgggttctcc tagcttcgtt ttcattaaat catggccttt 1500
tagaacttga gagcactggg tatgcagggt aaaaggttct ggagtgacta ggagggtggg 1560
agcccatttt acggtcccct gagagccagg taggagggcc tcccctgctc agagtttcac 1620
ccccagtcag tgcaatttat cctagtctgt ggtcactact taggtgaata atggacaggc 1680
tgcacatgta tgtagccaag tctccctata tttaggaacc tcaaatgacc agaacacacc 1740
agaatttcct tttatctagg gtaaccattt aa 1772
<210> 12
<211> 224
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 12
Met Pro Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Phe Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr Asn Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Thr Thr Pro Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Leu Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Ser
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Thr
210 215 220
<210> 13
<211> 899
<212> DNA
<213> 家牛
<400> 13
ctccactttg ataaggaaga gcagcagcca aggacaaggg gagaatgcca cgcaagatag 60
aaaacttctt gtttttactt ctcttcggct atgaagccac actgggatta tcatctactg 120
aggatgaggg tgaagatccc tggtaccaca aagcgtgcaa gtgcgattgc caaggaggtg 180
ccaatgccct gtggtctgca ggtcccaccc ccttggactg cataccggaa tgcccatacc 240
ataagcccct gggtttcgag tcaggagagg ttacaccaga ccagatcacc tgctccaacg 300
tggagcagta cgtgggctgg tattcttcct ggactgccaa caaggcccgg cttaacagtc 360
aaggctttgg gtgtgcctgg ctctccaagt tccaggacag cagccagtgg ttacagatag 420
atctgaagga ggtcaaggtg atttcgggga tcctcaccca ggggcgctgt gacatcgatg 480
agtggatgac caagtacagt gtgcagtaca ggaccgatga gagtctgaac tggatttact 540
ataaagacca gaccggaaac aaccgggttt tctatggaaa ttcggaccga acctccacag 600
tccagaacct gctgcggccc cccatcatct cccgcttcat ccggctcata ccgctaggct 660
ggcatgttcg cattgccatc cggatggagc tgctggagtg cgtcagcaag tgtacctgat 720
gttgcctcgg ctcatacctg cagtgggtga agggtgcaga gcggcccatg ggggaacgct 780
gacttatcac tgtgaccagc agggctggat tttacaggct cttttcagcg cagggctggg 840
cagagaatac tatctttttt gcatagtttc caatttcagt gagagaaaat gaaaatgaa 899
<210> 14
<211> 224
<212> PRT
<213> 家牛
<400> 14
Met Pro Arg Lys Ile Glu Asn Phe Leu Phe Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr His Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Pro Thr Pro Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Val Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Ser
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Thr
210 215 220
<210> 15
<211> 1604
<212> DNA
<213> 绵羊
<400> 15
actttgactt cttccagaag gggccttgtt aactttttat gtgactatta tcactttgct 60
tttccgtgta atgagtcatt tgttgaattt ttctttcttg ttttaacttg atttttcctc 120
tcttgtcctt ttgctcagcc acactgggat tatcatctac tgaggtatgt tacagtaaga 180
aggctggaat tcatacggat actgtttttg aacattttca tagccaaaaa caatgtatag 240
gattatcact tctttaaaaa tgtattttta aacatatatt ttttctggtg gtggaaatag 300
catgttttat ctggacaaag ttcaagactg attcagataa atgagacaat gcaagtgaac 360
caggtcttat gtcagatggc agaatcttga attcagtccc ttttaaaact ggatccccag 420
aagggccctg cagatgtgag gagcctgact ggaagatcac tacaatgggg tggacacggc 480
tctctacata ggtgtgtctg tgaagttttt agctggtcat ccacagtgac aaacatttgt 540
ctatttagac tcaaagatga gtggtgactg tgtgttaaac tgggttcata agtcagttgc 600
actgctgtag agtgaaagct gccctagaca ataggaacta aatgagtgag gtttgtgaat 660
gcaagctttt ccagtagttc tgaccacagt tgcctttgac tatggctttt ctgaagttcc 720
tgccccctga tttcccgcag gatgagggtg aggatccctg gtaccacaaa gcatgcaagt 780
gtgattgcca aggaggtgcc aatgccctgt ggtctgcagg ttccaccccc ttggactgca 840
taccggaatg cccataccat aagcccctgg gtttcgagtc aggagaggtt acaccagacc 900
agatcacctg ctccaacgtg gagcagtacg tgggctggta ttcttcctgg actgccaaca 960
aggcccggct caacagtcaa ggctttgggt gcgcttggct ctccaagttc caggacagca 1020
gccagtggtt acagatagat ctgaaggagg tcaaggtgat ttcggggatc ctcacccagg 1080
ggcgctgtga catcgatgag tggatgacca agtacagtgt gcagtacagg accgatgaga 1140
gcctgaactg gatttactat aaagaccaga ctggaaacaa ccgggttttc tatggaaatt 1200
cggaccgaac ctccacagtc cagaacctgc tgcggccccc catcatctcc cgcttcatcc 1260
ggctcatccc actaggctgg catgtccgca ttgccatccg gatggagctg ctggagtgcg 1320
tcagcaagtg tacctgatgc tgcctcggct catgcctgca gtgggtgaag ggcgcagagt 1380
ggcccatggg ggaactctga cttatcactg tgaccaacag ggctggattt tacaggctct 1440
tttcagtgca gggctgggca gagaatacta tcttttttgc atagtttcca atttcagtaa 1500
gagaaaatga aaataaacgt atttcccatt cagggtcaaa gaaaataaga acaaagaaaa 1560
tgtctctaaa aacaatttcc atgcagaaag cctaagtagc agga 1604
<210> 16
<211> 211
<212> PRT
<213> 绵羊
<400> 16
Met Ala Phe Leu Lys Phe Leu Pro Pro Asp Phe Pro Gln Asp Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asp Pro Trp Tyr His Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Trp Ser Ala Gly Ser Thr Pro Leu Asp Cys Ile Pro
35 40 45
Glu Cys Pro Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr
50 55 60
Pro Asp Gln Ile Thr Cys Ser Asn Val Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Ser Ser Trp Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly
85 90 95
Cys Ala Trp Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile
100 105 110
Asp Leu Lys Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg
115 120 125
Cys Asp Ile Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr
130 135 140
Asp Glu Ser Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn
145 150 155 160
Arg Val Phe Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly
180 185 190
Trp His Val Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser
195 200 205
Lys Cys Thr
210
<210> 17
<211> 4553
<212> DNA
<213> 家猫
<400> 17
cttctgagga aaccctccac tcggataagg tagagctaca gccaaggaca aggggagaat 60
gccacgcaag atagaaggtt tcttgttctt acttctcttt ggctacgaag ccacactggg 120
actgtcgtct actgaggatg agggtgagga cccctggtac cacaaagcat gcaaatgcga 180
ttgccaagga ggtgccaatg ccctctggtc tgctggcgcc acctccttag actgcattcc 240
ggaatgccca tatcataagc ccctgggttt cgaatcggga gaagttacac cagaccagat 300
cacctgctcc aacctggagc agtacgtggg ctggtattcc tcgtggaccg ctaacaaggc 360
ccggctcaac agtcaaggct ttgggtgcgc ctggctgtcc aagtaccagg acagcagcca 420
gtggctagag atagatctga aggaggtcaa ggtgatttca gggatcctca cccaggggcg 480
ctgtgacatt gatgagtgga tgaccaagta cagcgtgcag tacaggaccg atgagaacct 540
gaactggatt tactataagg accagacagg aaacaaccgg gtcttctacg gcaactcaga 600
ccgaacctcc acggtccaga acctcctgcg gccccccatc atttcccgct tcatccggct 660
gatcccactg ggctggcacg tccgcattgc catccggatg gagctgttgg agtgcgtcag 720
caagtgtgcg tgacgcctcc ttcagctcgg cacctgccag gtggggtgga gggcgcagag 780
cagcctgtag gggaaaattg acgcgaccag ggcttgaaca gggtgacaaa cagggctgaa 840
ttttacaagc tcttttcaat gcagagctgg gcagaaataa tttctttttt ttaagacgta 900
gtttccaatg tcaatgagag agaaagaaaa atgaactcat tccccactca gggccaaaga 960
aaataagaac aaagaaaatg tccctaaaga caatgttcat caaaagccta agtagcaggg 1020
gtaattttct gctcttgggt ttttgtgttt ggcctgacag tgtgaaaggt gtggtctcag 1080
ggaacacaaa ggagcccaga taatttaaaa acccttttgc ttcaccaccc tgaaaacagg 1140
aacagaagtt tcataaaacc ttgatttgaa cgcaaatggg tagcaggctt gcggtctctc 1200
cggcgttttc accaaattag ggcctctcac aactttagag caccgtgtat gcagacggaa 1260
aggatttggg gtgactgggg ggccgaaagg catagtcggg agcctgtgtc ctggtctcct 1320
ggaggctggc accatcaccc caggcaggag ggcctcccct gctctgcgcc ttcaccccca 1380
cgcacacaag gactgtggag ccacaaaagc tctcatcaca tacagatcca ttctagcaaa 1440
gttttccagt ctgtggtcac tatttgggta aatacatggg acgggctgca tgtgtaagta 1500
gcaaagtttc tctgtattta ggaaccccac atgaccgaag cacaccagaa tttcccttca 1560
tctagggcta ccatttttca acaggattca cattttaaaa ccagttggca caggagctag 1620
atcactggct acacggagga ggcccatcag ctaaccacat gctttgcagg aagtgggcag 1680
accgcaagtc ctaagaaggg atgtggatac gtttcttgtg acccacggtt aaacttcacc 1740
ccttgccttg caacacacaa aacaggcctg ctcctgaggt tgaaacctcc ttgagaagga 1800
ccgggcctgg catgggcctg gccttccccc tcctggagga gctcatgaag ctgggacctt 1860
tcgggaagag tctcagtctc ctgagttttc aggcccttcc ctggggagag gctgatgaca 1920
tggggagtgg gcaggagagg tatatgaaag taggagctga gagggggtga aactggggga 1980
tgagggccct ctgacaagac tggggaatcc gagactgtcc tggccctgac acagcacagc 2040
ctctactaga ggctttctcc tgagttactt tctgttttca aatgccaagc cgagtgaaga 2100
ctcacactaa catgatcctg gacatcacat tcaccttctc tgtgaggggg aagcctccta 2160
aaaaccccaa atctcttccc tggtgttttg ggcttagaac agctctatat ttaacccacc 2220
atcctttttt tttttttttt tttttttttt aacgtttatt ttgaaagaga gaggagagag 2280
agagagggag agagcatgca tacgcacgcg agcaagcaga gaagggtcag atagagaggg 2340
agacagagga tctgaagcgg gctctgcacg gtcagcagtg agcctgatgt ggggccgaac 2400
ttgtgacctg tgagatcatg acctgagctg aagtcggacg cttaaccgac tgagccgccc 2460
aggtgcccct aacccaccat ctttttaatc ccccaactgt atacttggac ctggaaaaat 2520
gcttcccttg ctcagtattc tctcaaatac aaacatatca aattcaaggt ggggaaaaaa 2580
aaatccttct ctggactttg gacacatgaa taaatccatt tagagcaggc gcctcatcag 2640
agccccttag tgaaaagctg aatgaacttt catcatgaca cggattgtca gagaaaatgg 2700
tggtagccta agagctcagg tcctctacag tggtcacatc agacacagga ggcgagtacg 2760
gttaagagga aagaagaaaa gaatgaaact gtgaggcagt gataaaggtt ctccaactaa 2820
ttgttcatgt tagaaatgtt tgctttgtaa aggtttaatg agataaagtc acataccgta 2880
caaatttcaa ccatttcaag tgtacaattc aatgactttt agtagactca gagttgagga 2940
accattatca caattttaga aaaatttcat caccccacag agaaaccctg cacccattaa 3000
ccatcacctc ccaacctact cgtccccgca gccctaggca accactgatg gactttctgt 3060
ctcagtagat ttgcctattc tggacatttc atataaatgg gatcattttc tgcctggctt 3120
cttttgctta gcatagtgtt tttccaagtt tcattcaggt tgcagcatgc acttaattcc 3180
ttcttatagc tgaacatcat tccgttatat ggataggtca cattgtattt atccgttcat 3240
ctgttgatgg acatttgggt tgtttctaca tttttggcta tcgtgaataa tgctgctata 3300
aacacctgtg tacaagtttt tgtttggaca tatgttttta tttatcttgg gcatatacct 3360
aggagtggaa tgctggggtc atatggtaac tctacgtcta acctttttag gaactgtcag 3420
acaattttcc aaaggggcca caccattatg cattcccacc agcaacatat gagagtttca 3480
ggttctctac atttgttatt atctttttga ttagagccgt cctggtgtgt atgaagtagc 3540
atcactctgg tttttgattt gcatttccct aggactaatg atgctaagca tcttttttat 3600
gtgttcactg gccttttgaa taacttcttt ggagaaatgt cttttccgat cctttgccca 3660
tttaaaaatc aggtggcctt tttattaacg aattgtaaga gctctttaat attctagata 3720
caaccccctt aggagatacg tgacttgcaa atactttctc ctattcggta ggttatcttc 3780
ttactctctt gatggagtcc tttgaaacac atttttaaat tttgataaag tccaatttat 3840
tcttttttgt tgcatgtgtt tttggtgtca tatctgaggt accattgcca aatcccgatc 3900
atgaagattt actcctatgt ttcaagagtt ttatagtttt acttcttaca tttagacctt 3960
tgatctattt ggggttattt tgtatatggt atgaggtagg ggtccaactt cagtatctgc 4020
acgtggacat ccagttgtcc cagcaccatt tgttgaaaag actttttccc cactgaatgg 4080
tcttggcatc ctttttgaga aatcaattaa ccataaaggt gagaatttgt ttctggatcc 4140
tcaattctat tccattatag gtctatcttt ataccagtac cacacagttg tcattactgt 4200
agccttttta gtaagttttg aaattggaac aggttaactc tccaactttg ttcttcttca 4260
aggctgtctg ggctgctgag tcctttgaat gtccatatga attttagaat cactgtgtca 4320
atttctgcaa agaagccagc tgagatttca catcggaaat cgctccatac ttgagaattt 4380
aatcaacaat gagatactga gatccataat acgttaatct gtaggtaacc tgtgtataac 4440
agcatattaa ttatttactt catttaattt agaacagaaa gtataaaaac aaaactttta 4500
ttgaggggca tctgcagcct aacagaatct tgctattaaa cacatgaact gtg 4553
<210> 18
<211> 224
<212> PRT
<213> 家猫
<400> 18
Met Pro Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Phe Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr His Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Leu Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Glu Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Asn
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 19
<211> 1193
<212> DNA
<213> 马
<400> 19
atgccacaca aaatagaagg cttcttgttt ttacttctct ttggctatga agccacactg 60
ggattatcgt ctactgagga tgagggcgag gacccctggt accacaaagc gtgcaagtgc 120
gattgccaag gaggcaccaa caccctgtgg tctgtgggtg ccacctcctt agactgcata 180
ccggaatgcc cataccataa gcccctgggt ttcgagtcag gagaggtgac cccagagcag 240
atcacctgct ccaacccgga gcagtacgtg ggctggtact cctcgtggac cgccaacaag 300
gcccggctca acagtcaagg ctttgggtgc gcctggctct ccaaattcca ggacagcagc 360
cagtggttac agatagacct gaaggaggtc aaggtgattt cagggatcct cacccagggg 420
cgctgtgaca tcgacgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacaggac tgatgagagc 480
ctgaactgga tttactataa ggaccagacc ggaaataacc gggtcttcta tggaaactca 540
gaccgaacct ccacagtcca gaacctgctg cggcccccaa ttatttcccg cttcatccgg 600
ctgatcccac tgggctggca cgtccgcatc gccatccgga tggagctgct ggagtgtgtc 660
agcaagtgtc cctgacgcct cctgcctcag cctcggccct cggggggagg gcgcagaggg 720
cctgggggac cctgatgccg cactgtgaca aacaaggccg tattttacaa gctgctctcg 780
ggtttttttt gtctccatga tgctgtgaaa ggtgcagtcc caggggaaca cgaagcagcc 840
ctgatcattc gagaattctt gtgctttacc acgttcaaaa caggaacaga gagtttcata 900
aaccctcact ttgaatgcaa agggggagca agcttgcagt ttctcctagc taggttttcg 960
ttaaatcagg gcctcttagg actttagagc accgggtagg cagagtgaaa gttttggggc 1020
tgactgggtg gcggcgttga gtatggtgga tgggagcctg tgtcctggtc tcctgagagc 1080
catacacgtc caaacgcctc acgtaggatg gcctcccctg ccccgggctc tcgtctcctg 1140
cacacagaga ttgtgcatgg gcccatgctg cagcccattt caggccaact gtc 1193
<210> 20
<211> 224
<212> PRT
<213> 马
<400> 20
Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Leu Phe Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr His Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Thr Asn Thr
35 40 45
Leu Trp Ser Val Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Glu Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Ser
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Pro
210 215 220
<210> 21
<211> 675
<212> DNA
<213> 穴兔
<400> 21
atgctacgca agatggaagg cttcttgttc ttacttctct ttggctatga agccacactg 60
ggattatcgt ctactgagga tgagagtgag gacccgtggt accacaaagc gtgcaagtgc 120
gactgccaag gaggagccaa tgccctgtgg aatgcaggtg ccacctcctt agactgcata 180
ccagaatgcc cgtatcacaa gcccctgggt ttcgagtcag gggaagtgac agcagaccag 240
atcacctgct ccaatccgga gcagtatgtg ggctggtatt cctcgtggac cgcaaacaag 300
gcccggctca atagtcaagg ctttgggtgc gcttggctct ccaagttcca ggacagcagc 360
cagtggttac agatagacct gaaggagatc aaggtgattt cgggcatcct cacccaagga 420
cgctgtgaca tcgatgagtg gatgaccaag tacagtgtgc agtacaggac cgatgagcgc 480
ctgaactgga tttactacaa ggaccagacc ggaaacaacc gggtcttcta tggcaactcg 540
gaccgaagct ccacagtcca gaacctgctg cggccaccga tcatctcccg cttcatccgg 600
ctgatcccgc tgggctggca cgtccgcatt gccatccgga tggagctgct ggagtgtgtc 660
agcaagtgtg cctga 675
<210> 22
<211> 224
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 22
Met Leu Arg Lys Met Glu Gly Phe Leu Phe Leu Leu Leu Phe Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Ser Glu Asp Pro
20 25 30
Trp Tyr His Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Trp Asn Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Ala Asp Gln
65 70 75 80
Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp
85 90 95
Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp
100 105 110
Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys
115 120 125
Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile
130 135 140
Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe
165 170 175
Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Ser Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val
195 200 205
Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala
210 215 220
<210> 23
<211> 8202
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 23
ggtaccgatt taaatgatcc agtggtcctg cagaggagag attgggagaa tcccggtgtg 60
acacagctga acagactagc cgcccaccct ccctttgctt cttggagaaa cagtgaggaa 120
gctaggacag acagaccaag ccagcaactc agatctttga acggggagtg gagatttgcc 180
tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc 240
gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc 300
aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt 360
tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt 420
atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac 480
ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa 540
aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat 600
atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa 660
atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag 720
gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg 780
cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag 840
cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg 900
agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg 960
ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg 1020
ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct 1080
ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag 1140
aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg 1200
tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg 1260
ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg 1320
cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa 1380
tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc 1440
cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg 1500
atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa 1560
aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg 1620
atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt 1680
ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac 1740
ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc 1800
tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa 1860
caccagcagc agtttttcca gttccgttta tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa 1920
tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag 1980
ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa 2040
ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg 2100
caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt 2160
ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc 2220
accagcgaaa tggatttttg catcgagctg ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag 2280
tcaggctttc tttcacagat gtggattggc gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc 2340
gatcagttca cccgtgcacc gctggataac gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt 2400
gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg 2460
ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg 2520
tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt 2580
ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg 2640
attggcctga actgccagct ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg 2700
ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca 2760
ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg 2820
cgcgaattga attatggccc acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc 2880
tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc 2940
acatggctga atatcgacgg tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg 3000
tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt 3060
caaaaataat aataaccggg caggggggat ctaagctcta gataagtaat gatcataatc 3120
agccatatca catctgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 3180
aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 3240
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 3300
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat cccccggcta 3360
gagtttaaac actagaacta gtggatcccc gggctcgata actataacgg tcctaaggta 3420
gcgactcgac ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgcat gccagtagca 3480
gcacccacgt ccaccttctg tctagtaatg tccaacacct ccctcagtcc aaacactgct 3540
ctgcatccat gtggctccca tttatacctg aagcacttga tggggcctca atgttttact 3600
agagcccacc cccctgcaac tctgagaccc tctggatttg tctgtcagtg cctcactggg 3660
gcgttggata atttcttaaa aggtcaagtt ccctcagcag cattctctga gcagtctgaa 3720
gatgtgtgct tttcacagtt caaatccatg tggctgtttc acccacctgc ctggccttgg 3780
gttatctatc aggacctagc ctagaagcag gtgtgtggca cttaacacct aagctgagtg 3840
actaactgaa cactcaagtg gatgccatct ttgtcacttc ttgactgtga cacaagcaac 3900
tcctgatgcc aaagccctgc ccacccctct catgcccata tttggacatg gtacaggtcc 3960
tcactggcca tggtctgtga ggtcctggtc ctctttgact tcataattcc taggggccac 4020
tagtatctat aagaggaaga gggtgctggc tcccaggcca cagcccacaa aattccacct 4080
gctcacaggt tggctggctc gacccaggtg gtgtcccctg ctctgagcca gctcccggcc 4140
aagccagcac catgggaacc cccaagaaga agaggaaggt gcgtaccgat ttaaattcca 4200
atttactgac cgtacaccaa aatttgcctg cattaccggt cgatgcaacg agtgatgagg 4260
ttcgcaagaa cctgatggac atgttcaggg atcgccaggc gttttctgag catacctgga 4320
aaatgcttct gtccgtttgc cggtcgtggg cggcatggtg caagttgaat aaccggaaat 4380
ggtttcccgc agaacctgaa gatgttcgcg attatcttct atatcttcag gcgcgcggtc 4440
tggcagtaaa aactatccag caacatttgg gccagctaaa catgcttcat cgtcggtccg 4500
ggctgccacg accaagtgac agcaatgctg tttcactggt tatgcggcgg atccgaaaag 4560
aaaacgttga tgccggtgaa cgtgcaaaac aggtaaatat aaaattttta agtgtataat 4620
gatgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttagg ctctagcgtt cgaacgcact 4680
gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 4740
ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 4800
agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 4860
aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg 4920
gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 4980
cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc 5040
ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 5100
cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 5160
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 5220
gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 5280
gatggcgatt aggcggccgg ccgctaatca gccataccac atttgtagag gttttacttg 5340
ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 5400
ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 5460
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 5520
tatcttatca tgtctggatc ccccggctag agtttaaaca ctagaactag tggatccccc 5580
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gagcgctgcc acgtcagacg aagggcgcag cgagcgtcct gatccttccg cccggacgct 5700
caggacagcg gcccgctgct cataagactc ggccttagaa ccccagtatc agcagaagga 5760
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aggcgaggaa aagtagtccc ttctcggcga ttctgcggag ggatctccgt ggggcggtga 5880
acgccgatga ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag ctagttccgt cgcagccggg 5940
atttgggtcg cggttcttgt ttgtggatcg ctgtgatcgt cacttggtga gtagcgggct 6000
gctgggctgg ccggggcttt cgtggccgcc gggccgctcg gtgggacgga agcgtgtgga 6060
gagaccgcca agggctgtag tctgggtccg cgagcaaggt tgccctgaac tgggggttgg 6120
ggggagcgca gcaaaatggc ggctgttccc gagtcttgaa tggaagacgc ttgtgaggcg 6180
ggctgtgagg tcgttgaaac aaggtggggg gcatggtggg cggcaagaac ccaaggtctt 6240
gaggccttcg ctaatgcggg aaagctctta ttcgggtgag atgggctggg gcaccatctg 6300
gggaccctga cgtgaagttt gtcactgact ggagaactcg gtttgtcgtc tgttgcgggg 6360
gcggcagtta tggcggtgcc gttgggcagt gcacccgtac ctttgggagc gcgcgccctc 6420
gtcgtgtcgt gacgtcaccc gttctgttgg cttataatgc agggtggggc cacctgccgg 6480
taggtgtgcg gtaggctttt ctccgtcgca ggacgcaggg ttcgggccta gggtaggctc 6540
tcctgaatcg acaggcgccg gacctctggt gaggggaggg ataagtgagg cgtcagtttc 6600
tttggtcggt tttatgtacc tatcttctta agtagctgaa gctccggttt tgaactatgc 6660
gctcggggtt ggcgagtgtg ttttgtgaag ttttttaggc accttttgaa atgtaatcat 6720
ttgggtcaat atgtaatttt cagtgttaga ctagtaaatt gtccgctaaa ttctggccgt 6780
ttttggcttt tttgttagac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 6840
ataatacgac aaggtgagga actaaaccat gggatcggcc attgaacaag atggattgca 6900
cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 6960
aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 7020
tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 7080
gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 7140
aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 7200
tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 7260
ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 7320
ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 7380
cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca 7440
tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 7500
ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 7560
tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 7620
tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaggggatcc 7680
gctgtaagtc tgcagaaatt gatgatctat taaacaataa agatgtccac taaaatggaa 7740
gtttttcctg tcatactttg ttaagaaggg tgagaacaga gtacctacat tttgaatgga 7800
aggattggag ctacgggggt gggggtgggg tgggattaga taaatgcctg ctctttactg 7860
aaggctcttt actattgctt tatgataatg tttcatagtt ggatatcata atttaaacaa 7920
gcaaaaccaa attaagggcc agctcattcc tcccactcat gatctataga tctatagatc 7980
tctcgtggga tcattgtttt tctcttgatt cccactttgt ggttctaagt actgtggttt 8040
ccaaatgtgt cagtttcata gcctgaagaa cgagatcagc agcctctgtt ccacatacac 8100
ttcattctca gtattgtttt gccaagttct aattccatca gacctcgacc tgcagcccct 8160
agataacttc gtataatgta tgctatacga agttatgcta gc 8202
<210> 24
<211> 13716
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 24
ccacacaaga ttgaaggctt cttcttgtta cttctctttg gctatgaagg tatgtactat 60
tctactattg gcatttatta atgtatttaa taatgtgatt taatatagaa atatatagaa 120
aatagttgat aaatagaaat gcaacctgag taataaaaat tgttggatga caacatgcca 180
attagttcac aggttattaa tttaaaaggt cactgttgtg tggctctttg tcactgtctt 240
gctcctggct tcctggtttc atgaggaacc ttctaaagtt caaatgatat tgaaactcaa 300
cagaaagaag gaagggcctc agagtttcta taaaaacaac tttaaattgc aacaattaat 360
gagaagtcat gtttcttgga aattttagga ggcaaagttg aagcaattgt agaatttaat 420
attgtaagcc ggactattac tgagggttaa ggatgaagct attaatagct ctgctgggac 480
aagtgtaaat gaggactgtc ccaggcaaat caggacaaag ggtcacccta gtttaaatat 540
ggattagcat aaggccaagc accactgcag tctaatagaa gtctaataaa ataatccaaa 600
gaaagtcaat aaaccctaaa gactcaatat attccatcac ttttaaactt ctaaatgtgg 660
ccctggcagg cataatatgc ttaaataagg acagattaaa gctaaatctc taaaatgtca 720
atcaaataaa ctttaaatct ctttccatct tagacataat actctctcat gcctctctta 780
cctctctagt gcccatcaat tcagaattcc ttttaaagtt tatactttca aatattaaaa 840
attggttgaa gggttgggga tgtggctcag tggtacagcc cctgcccagc cttcatgagt 900
ccctgagtta aattcccaga agcagtataa gacaaacaaa caaaaacctt acttcatcca 960
ttttctggca tagctacaca tacctgcaat cctagttctg gacaaattca agcaggagca 1020
ttcaatgcca acctcagcta cttaggtttg ggctatctga gaccctgtct taacattggg 1080
ggagagccta ggctaggctg agctatacag taagcctctg tctgggaagg agggaaaaag 1140
gaaggaaaga cattggttga atgacttgtg ggtgacactg tatgtttaga gtgttcaggg 1200
aaaaggaggc ctctctgctc tgcaaatgac ctgccactca gataagacga atacacacaa 1260
gagtcagaat tcctctgttt cttctatatt catgaaccag cagtcttgtg tcttttatta 1320
tctaataata tttctagtgt ctggaaagcc ttgtgaaaat aaaatctcaa ggtcatacgg 1380
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gagggcatca gatctcgtta cggatggttg tgagccacca tgtggttgct gggatttgaa 1560
cttcagacct tcggaagagc agtcgggtgc tcttacccac tgagccatct caccagcccc 1620
aggttttttt tttcttagtt gttattatta ttgttattct tttgagacag gatcccacac 1680
tgaaactcag gctagccttc aatttcctat ggatttgacc tcatagcagt cagccagttt 1740
ccaccttctg agtgctaaga tttcaagcct gagccaccac acccaattcc taagatatgt 1800
ttttaagcaa ggttattggc attacacctt aaccctttgc aatgacgtgt caggaatttg 1860
cacctttttt ttttttccag ttgtcaggcc tggcaatgga gcccagggcc ctgtgcttgc 1920
taaacgatgg ctctacccct aagttatata tacccagctt atcccaggat ctttctcaga 1980
ctttctgatg tttgctatcg atgttgcttc tctttggttc cttgctcttt tctcacaaaa 2040
agatctaagc aagaaccctt gtctggagtc agagagatag cttagtctgg aaagtgctta 2100
tagcttacac acagaaactt gagttcgatc cccagaactt ttcttgttta aaaaacaaac 2160
aaacaaacaa acaaaaacta ggcatgacag ctggagaggt ggcttcgcaa ttaacagcac 2220
ttgttaaaga ggacctcagc ttggttccca gggctctata actccagttc cagggcctca 2280
gacagcctcc tgtagcctct tcatgcatca gacatggtcc atatgcatgc aggtcaaaca 2340
ctcatacaca ttaaatgaaa aataaaagtc taaaaaaagg tcaaacatag tgatgcatgc 2400
tataatccca gtgctaggga ggcaaatgtc tggaccttgt cggtcggcca gtcagtcagc 2460
cagccagtca gtctagccta gcatagccta ctaggtgtgc tccagcccaa tgagagacct 2520
tgtctctaaa aaaaagggta gaaagaaaag acaaaatgga tgtctcctga ggaatgatac 2580
ccacggatac ccacaattgt cctctggtct ccgtgtgcaa tacaaaccca tgtctgaata 2640
tttgcaacag ggtaaacatt agagtttgat gttcagaatt agactagatt ccctcatcta 2700
gtaaagctgt gctttggccc tcccatctgt cttatttttc tactggtgtg ctaaggcacc 2760
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gcttgtatct tgagacacgg ttacaaagct gagagatagc taagtgggcc tggtgtgagc 2940
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cttcccaaac agttctacca actgggaacc aagcattcat atgagcctca ggggagcagt 3060
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ataaaccaac acacatagga aagatacact ccactggaca gtgggagccc atgcacaaag 3360
gttctttggc tcatttagtc tatgctgttt ctattcttcg atgacagcag tttcttatta 3420
ttgggaaata agatcagtag atgagctttg tttctgccct gggtgagagt ttatttagga 3480
acacacatgt gatcacacta agacaaccac tgatggccta gaacaaagtc agagcactgt 3540
gcgttgtgga tcttaggcca ttcatgatga ttaaagcatc catcctatta aaatgtgtta 3600
gtccattttt ggggttatgt ttactataca aaggtggaag gggttatctg gccccatctt 3660
acaggtaact gtgtcccttt tgtggatata aaaaccatca gatactgcaa ttttattttt 3720
gtaaaaagca actgtttttt tttaagactt attttatttt tgattatgtg tctgagggag 3780
cagtatgcac atctgcatgc aggtgcctgt ggaagcctgt ggagacatca gatcacctga 3840
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caaaagcagt atattttatt aatctgtgag ccatctctcc agccaaaagc aacctttaaa 3960
agctgtggtt tatgtgccat ttaattcatc cacttagagg gtacacttca atagtttttt 4020
ttaaaaatat gcttacagat ctgtgggcac atatgatcca attttagaac ccttttagca 4080
ctacagatat taaatactta ctccctattc tccccagccc ccagctccag tccctggcat 4140
ccacaaatcc ccttcctgcc atctatagat tcacctcttc tagactttac actgaaatgg 4200
tattacacaa catgtggtct tttgtctttt gcttgccgtg tgtctgtgag gttcatctgt 4260
gttgagcatg aaaggataac agatttaccc atgaatatgc ctgtcgccta aaatagcaac 4320
actttcacac tagaagcaat ttccttcttt cttcttccca agagggacat tattgcagcc 4380
tgctagtttt ctcctgtgtc ttttttcgtg tttctcaagt agatgaaggg actggttact 4440
tttatttttt taatcattca tacttttata cttttctccc ctgctttgtc agtttcctaa 4500
atgagtgaat actgtatttg gtgatcccca atcagaaaga ccaaaataat ttaaaataat 4560
ctcgtctcta tatcactaag gtatcctttt ccacttgggc catgcagaga aataagcatg 4620
ccttgattga ccccacccca ccccaacccc cagtggtgac aaggacctcc ccagcggctc 4680
aaccatttga ataaaaagga cacttgagcc cattttgcac aaatctaaga tgagcaagtg 4740
gcagtgtcac ctgtaaacat gtgcctggag cacggaacga cctgagtagg cagaaaaagg 4800
tggaagtaat ttatgatttt tcttttaaag gttgccattt cccccacctt tctcactttc 4860
caacaatatt atattctggt gtgatatgtt gtagacaaaa aaagctttaa gcttttattc 4920
cccagttgtt ttggtgatta aatcattttg ggggaactgc aacagtgact ctcattcact 4980
gctcccttgg tgacagtgtt ttttttctgt aaaaagcgcc tgctgttccc tctgtctctg 5040
ctcattttca taggaatctg gcaccttaga atcccaggct gcctgcagtc aaatgcttgc 5100
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ctaagctcct acaccatgcc tgattagcag ctaggtctca tccttacccc tccaggaata 5220
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ctcacctgaa ctttagtaga tattctttag cgacatattt gggctttggt cctctctctt 5340
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ctgagggggt gggaagccag tgggtggcgg aacctgcaag aaatccgccc caaatttaag 5460
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gggggggagg aaggaaggaa ggaaggaagg aagggaggga gggagggagg gagggaggga 5940
gggagggagg gaggaaggat gttgagaaca aaagccaagg ccaacaggtg agttgggatt 6000
aggaaaagtc cttttcatag caaaggggat gtggaagaag agaagttgac aggtaagtag 6060
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tcatttctct gcattcacag atggaggata gatgtgtgca actatcttta gcagtgaggc 6300
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tttatcacta tgtatcttgc ctcttgacgg tcacacaagt acttccagtt gaagagtagg 6480
cattacaagg tctgcttcca tgaatattct agggcacatt tttattccag gaaaaaatat 6540
atgaaagcat ttctaattat gaatggaatt ggtggtttat ggggaacaca tatgctcagc 6600
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tttagcaatg tctgtgcggt acttggagta agctaagctc tcaaagaaaa ccaagattta 6840
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cagatggaag ggcagtgctg gggagaatcc attgcatttg gaaagaagaa gccctctgcg 6960
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catcctgggc tatatgagat cctgtttcca aaacccccaa atagaaacaa taaaaaaatg 7860
gcagtccttc atgttcactg ctaccctaga aggtcagttt tgcttgtaac agatgactaa 7920
cagaggaaca aggtcccgga agagctacca gtatgctggc tgccaatgaa gctgctgaag 7980
tcttagtaga tttaggagct atggtcctga cttccatcac agccccagca ccaccatggg 8040
cactgcccag cagtctatct tcttttaggt cttcaggtgt ccctgggtag agaacaaggc 8100
ttctgcttgc atagggctga tgccccagta cagtgacagt ctcacaatga gtgcagcaat 8160
gtggccacag aacggggaaa tgtgtgttct ttaactagta gcttttataa tcatgataaa 8220
aagataagtg tctactctca agctgaaagc ttttcacagg catctgattc tcttgctaaa 8280
tgacaaagtg gttagaggag ggacctacag ctttcattgt ctacactcag gtttcttttg 8340
agaattttac agtaggtatg tattgttttc tagtcaacac agaaataaaa ggatttgttt 8400
tgttgaaaag aagtgggggt tttggtactg atgaggggaa attgatttat gttacttatt 8460
cattctcagg ttcatggctg agactcctta tgacaaatga tagattaata aaagcatgca 8520
aatgctggag ctctgctggc ggagtacctg atatgcaagg atgaagatct ctgttcaatc 8580
cccagaaatc aaataaaaaa gctgggcata gtgaggaaga ggagatggga ggattcctgt 8640
ggctggctgg acagctaacc tagcctattc atctatttcc aggccactaa gggatggtac 8700
cttaaaaaat aacaataata ataaaaaata acaataataa taaataaaaa aggtagctgg 8760
ttcctgagga gcatctaagg atatccttta actccacgtg cacatacact gtatacacag 8820
gaacacatac aagcatgcag atttacctat caagttttac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8880
aaaaagaaca ctttattcac tgttggtggg tatgtaaact ggcatatgta gccactatga 8940
aaatcagcac agaggttccc ttcccactcc aacaaaacaa aacaaaacaa aacaaaacaa 9000
aacaaaacaa aacaaaacaa aaccctctag aactagaact agaactactg cacgatccag 9060
gtttaccact cctaggtatt tactcaaagg actctatacg tcaacctgtg acagaggcat 9120
catatacaag cagggagtgg tggcacctgc ctttaatccc acccctcagg aggcagagtc 9180
aggtagatct ctgtgagttc gaggccagtt tggtctacat agtgagttct agtacagcca 9240
taagaccata tagccatatg gaggggggat tgtgagcata gagtatgaat gttcttgaga 9300
gaattattaa atgaattgga attattatac actgtcttct ttcataggaa aaatgaacag 9360
aaagggagag atctttgggt ggggctaaca gcatacatga catgaaagca gaaggggatt 9420
agttattgga aggcagggag ggacccagga ggatgaaggg aagagaatgc aagggaaagg 9480
agtaaaggag gaggaggtag aggtacacac tattaattcc agcacttgtg aggaggggac 9540
agagctctgt gagttcaagg tcagccccct ctgcatagtc agttccagga tagccaatgg 9600
ctacataatg agaccctgtg tcagagaagg tggccggcga gggatattga tgcttacagt 9660
ttactttagc caccacacag ctgaatgagt taaacctgtt cctgctactt ttgcactttc 9720
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ttctttcttt ctttctttct tttttttttt ttttttttgg ttttttgaaa cagggtttct 9900
ctgtatagcc ctggctgtcc tggaactcac tttgtacacc aggctggcct cgaactcaga 9960
aatccacctg cctctgcctc ccgagtgctc ggattaaagg cgtgcaccac caccgtcccg 10020
caaaaaataa cctgtttttg ttgttttaat tatttttaag attttatgtg tatgggtgtc 10080
tgtctgtatg tatgtctgtg taccacttgt atgcttggtg cccaagaagg acagaacaga 10140
tcatagggtt tcctgggata agagttatag gagttataga tgactgtaag ccaccaagtg 10200
gacgctggga attgaacctt ggttagctgg aagagtgtcc agtattttta attccagtcc 10260
ccgttgtttg tctatgaaga ttttgcttgg tagtccagtc tggctttaag aaacagggtc 10320
tcatgcatcc ctggcttgct cagacttcca tgcagctgag gatggcttta gagtaacaac 10380
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cctaacaaga atgtggcaca gggaggcaac tgggaatcaa acaggaagga ggagtaaaag 10500
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tggtagtggt ggaggaagag gaggaggagg aggaggagga ggagggggac ttaatcagta 10620
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gcacttggga ggcagaggca agcggatttc tgagttcgag gccagcttgg tctacaaagt 10920
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gcattgtttt cattttgcct tctttccttt cttaatttca ttttttccct ctcttgttct 11160
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ccctactcct gaagcctgag agcctttttc aaatgtctgt tgttttagtt gggtgttggg 11400
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gttattgctt tttgatgtca ttgttgcttt tttttttttt tttttttttt tttttttggc 12420
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cctaggaata atcagttggt gcctatagtg agaagcattt ttttttttat ttagatgagc 12720
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agtttaaaat cggcctggga tacacgagag agaccctgtg taagagcagt agcagcagca 13440
agaactcaag ctgaaaagga acatgcagtg taagacaaag ggccactgtg tgcatagagc 13500
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ctctgtggtc tgctggagct acctccttag actgta 13716
<210> 25
<211> 3670
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 25
aagaactaaa tgaaataaga tgcttaagtt aatcgcctgc tcctatgcca gctctccact 60
tcacttagat cttgctgtga ccaaggacaa ggagaaaatg ggtaccgatt taaatgatcc 120
agtggtcctg cagaggagag attgggagaa tcccggtgtg acacagctga acagactagc 180
cgcccaccct ccctttgctt cttggagaaa cagtgaggaa gctaggacag acagaccaag 240
ccagcaactc agatctttga acggggagtg gagatttgcc tggtttccgg caccagaagc 300
ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg tcgtcccctc 360
aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtgacct atcccattac 420
ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc tcacatttaa 480
tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg gcgttaactc 540
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gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa aaccgcctcg cggtgatggt 660
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tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa atcagcgatt tccatgttgc 780
cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag gctgaagttc agatgtgcgg 840
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gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct ctgcatggtc aggtcatgga 1200
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ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg tgcgaccgct acggcctgta 1320
tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg ccaatgaatc gtctgaccga 1380
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cgacgcgctg tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc cgcccggtgc agtatgaagg 1560
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acgctggaag gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga 2580
tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac 2640
cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt 2700
tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg attggcctga actgccagct 2760
ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga 2820
ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc 2880
gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc 2940
acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc tacagtcaac agcaactgat 3000
ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg 3060
tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcca 3120
gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt caaaaataat aataaccggg 3180
caggggggat ctaagctcta gataagtaat gatcataatc agccatatca catctgtaga 3240
ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa 3300
tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 3360
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 3420
actcatcaat gtatcttatc atgtctggat cccccggcta gagtttaaac actagaacta 3480
gtggatcccc gggctcgata actataacgg tcctaaggta gcgactcgac ataacttcgt 3540
ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagc ttccaggtga gtggctcaac gccctagcat 3600
tcctccttcc aactcttaat ccctctgctt tctctcaagt tggcttgtga gcttcacatc 3660
tcaccgtggc 3670
<210> 26
<211> 5987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 26
gcatgcaaga acatgtgcac ctgaatgtaa catgtgcgca cacacacaca cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaca catttttaaa aagtaatata gagctggagt gtacctttgt 120
tgatagaaca cttgtttagg attcgtgaag gtaaactggg cacccatcta gaagcccagc 180
actcagaggt ggagacagga ggtcaggagt tcaacaaggt cattctctgc tacacagtga 240
gtttaaaatc ggcctgggat acacgagaga gaccctgtgt aagagcagta gcagcagcaa 300
gaactcaagc tgaaaaggaa catgcagtgt aagacaaagg gccactgtgt gcatagagcc 360
agcaacctca cactgtaatg aacgggtctg acctttgcaa gtaagcttct tgtgatgctc 420
tggttgagcc tttgactacg acttttgtga cttgtgctcc tctggatgct tgcaggatga 480
gggtgaggac ccctggtacc agaaagcatg caagtgtgat tgccaggtag gagccaatgc 540
tctgtggtct gctggagcta cctccttaga cagtattcca ggtgagtggc tcaacgccct 600
agcattcctc cttccaactc ttaatccctc tgctttctct caagttggct tgtgagcttc 660
acatctcacc gtggccactg ctccaacatt ctgttcatta tcaagtgcca ggctctctcc 720
ctccctggct tgcctgagat ggtcaggtaa gacccctcga gataacttcg tataatgtat 780
gctatacgaa gttatatgca tgccagtagc agcacccacg tccaccttct gtctagtaat 840
gtccaacacc tccctcagtc caaacactgc tctgcatcca tgtggctccc atttatacct 900
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tccctcagca gcattctctg agcagtctga agatgtgtgc ttttcacagt tcaaatccat 1080
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gcattaccgg tcgatgcaac gagtgatgag gttcgcaaga acctgatgga catgttcagg 1620
gatcgccagg cgttttctga gcatacctgg aaaatgcttc tgtccgtttg ccggtcgtgg 1680
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gattatcttc tatatcttca ggcgcgcggt ctggcagtaa aaactatcca gcaacatttg 1800
ggccagctaa acatgcttca tcgtcggtcc gggctgccac gaccaagtga cagcaatgct 1860
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tgtattttag gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac caggttcgtt cactcatgga 2040
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atctgccacc agccagctat caactcgcgc cctggaaggg atttttgaag caactcatcg 2400
attgatttac ggcgctaagg atgactctgg tcagagatac ctggcctggt ctggacacag 2460
tgcccgtgtc ggagccgcgc gagatatggc ccgcgctgga gtttcaatac cggagatcat 2520
gcaagctggt ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac tatatccgta acctggatag 2580
tgaaacaggg gcaatggtgc gcctgctgga agatggcgat taggcggccg gccgctaatc 2640
agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 2700
aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 2760
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 2820
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat cccccggcta 2880
gagtttaaac actagaacta gtggatcccc cgggatcatg gcctccgcgc cgggttttgg 2940
cgcctcccgc gggcgccccc ctcctcacgg cgagcgctgc cacgtcagac gaagggcgca 3000
gcgagcgtcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc ggcccgctgc tcataagact 3060
cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg acgggacttg ggtgactcta 3120
gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga aaagtagtcc cttctcggcg 3180
attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg attatataag gacgcgccgg 3240
gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc gcggttcttg tttgtggatc 3300
gctgtgatcg tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg gccggggctt tcgtggccgc 3360
cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc aagggctgta gtctgggtcc 3420
gcgagcaagg ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc agcaaaatgg cggctgttcc 3480
cgagtcttga atggaagacg cttgtgaggc gggctgtgag gtcgttgaaa caaggtgggg 3540
ggcatggtgg gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc gctaatgcgg gaaagctctt 3600
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tgaggggagg gataagtgag gcgtcagttt ctttggtcgg ttttatgtac ctatcttctt 3960
aagtagctga agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt tggcgagtgt gttttgtgaa 4020
gttttttagg caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa tatgtaattt tcagtgttag 4080
actagtaaat tgtccgctaa attctggccg tttttggctt ttttgttaga cgtgttgaca 4140
attaatcatc ggcatagtat atcggcatag tataatacga caaggtgagg aactaaacca 4200
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taggagggcg tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc 4380
gttatgttta tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg 4440
gggaattcag cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc 4500
aagacctgcc tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcagcc ggtcgcggag gccatggatg 4560
cgattgctgc ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa 4620
tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc 4680
actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc 4740
tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct 4800
ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga 4860
tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt 4920
gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc 4980
ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg 5040
gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag 5100
ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct 5160
gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg 5220
aataggggga tccgctgtaa gtctgcagaa attgatgatc tattaaacaa taaagatgtc 5280
cactaaaatg gaagtttttc ctgtcatact ttgttaagaa gggtgagaac agagtaccta 5340
cattttgaat ggaaggattg gagctacggg ggtgggggtg gggtgggatt agataaatgc 5400
ctgctcttta ctgaaggctc tttactattg ctttatgata atgtttcata gttggatatc 5460
ataatttaaa caagcaaaac caaattaagg gccagctcat tcctcccact catgatctat 5520
agatctatag atctctcgtg ggatcattgt ttttctcttg attcccactt tgtggttcta 5580
agtactgtgg tttccaaatg tgtcagtttc atagcctgaa gaacgagatc agcagcctct 5640
gttccacata cacttcattc tcagtattgt tttgccaagt tctaattcca tcagacctcg 5700
acctgcagcc cctagataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg ctaggtaact 5760
ataacggtcc taaggtagcg agctagcagc gtgagggaag tcccttcctc ttaggtatca 5820
gaggaaatgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtttctat atcctgtgga gtcatgctgt 5880
ctctaaatca gtaatgagga tatggagggc aagaatttag taaaacaagt cgcttctaga 5940
agctaaatta ctgtcatttc atggattggc agaaaactgg gcaccca 5987
<210> 27
<211> 1033
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 27
gcatgcaaga acatgtgcac ctgaatgtaa catgtgcgca cacacacaca cacacacaca 60
cacacacaca cacacacaca catttttaaa aagtaatata gagctggagt gtacctttgt 120
tgatagaaca cttgtttagg attcgtgaag gtaaactggg cacccatcta gaagcccagc 180
actcagaggt ggagacagga ggtcaggagt tcaacaaggt cattctctgc tacacagtga 240
gtttaaaatc ggcctgggat acacgagaga gaccctgtgt aagagcagta gcagcagcaa 300
gaactcaagc tgaaaaggaa catgcagtgt aagacaaagg gccactgtgt gcatagagcc 360
agcaacctca cactgtaatg aacgggtctg acctttgcaa gtaagcttct tgtgatgctc 420
tggttgagcc tttgactacg acttttgtga cttgtgctcc tctggatgct tgcaggatga 480
gggtgaggac ccctggtacc agaaagcatg caagtgtgat tgccaggtag gagccaatgc 540
tctgtggtct gctggagcta cctccttaga cagtattcca ggtgagtggc tcaacgccct 600
agcattcctc cttccaactc ttaatccctc tgctttctct caagttggct tgtgagcttc 660
acatctcacc gtggccactg ctccaacatt ctgttcatta tcaagtgcca ggctctctcc 720
ctccctggct tgcctgagat ggtcaggtaa gacccctcga gataacttcg tataatgtat 780
gctatacgaa gttatgctag gtaactataa cggtcctaag gtagcgagct agcagcgtga 840
gggaagtccc ttcctcttag gtatcagagg aaatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 900
ttctatatcc tgtggagtca tgctgtctct aaatcagtaa tgaggatatg gagggcaaga 960
atttagtaaa acaagtcgct tctagaagct aaattactgt catttcatgg attggcagaa 1020
aactgggcac cca 1033
<210> 28
<211> 5629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 28
aagagctcat ttgttaaaca tgccagggaa gtctttccta aggaaaagaa ttaagagtcg 60
ggctatgtct gaaggcccag atacctcttg atgctaggta acccttcaaa actcagcacc 120
tgttggcttt ttacagacat agataagagg atggctcctg gtaatttggt gtgttcctgg 180
caggtgtgct tggctttcca agtatcagga cagcagccag tggttacaga tagatttgaa 240
ggagatcaag gtgatttcgg ggatcctgac ccaaggatgc tgtgacatag acgagtgggt 300
gaccaagtac agtgtgcagt ataggactga tgagcgcctg aactggatct actataagga 360
tcagaccgga aacaatcggg taagtggggg tcactccgag tcagcttcag ctcacactgc 420
ggagacacac tccatcccta tgttcctgct gtccgcgtct gtctgagcat tgacccctct 480
acatgctggg tcatctgctc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg 540
catgccagta gcagcaccca cgtccacctt ctgtctagta atgtccaaca cctccctcag 600
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tcaatgtttt actagagccc acccccctgc aactctgaga ccctctggat ttgtctgtca 720
gtgcctcact ggggcgttgg ataatttctt aaaaggtcaa gttccctcag cagcattctc 780
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cctaagctga gtgactaact gaacactcaa gtggatgcca tctttgtcac ttcttgactg 960
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ccagctcccg gccaagccag caccatggga acccccaaga agaagaggaa ggtgcgtacc 1260
gatttaaatt ccaatttact gaccgtacac caaaatttgc ctgcattacc ggtcgatgca 1320
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cggatccgaa aagaaaacgt tgatgccggt gaacgtgcaa aacaggtaaa tataaaattt 1680
ttaagtgtat aatgatgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt aggctctagc 1740
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ctacctgttt tgccgggtca gaaaaaatgg tgttgccgcg ccatctgcca ccagccagct 2100
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gcgagatatg gcccgcgctg gagtttcaat accggagatc atgcaagctg gtggctggac 2280
caatgtaaat attgtcatga actatatccg taacctggat agtgaaacag gggcaatggt 2340
gcgcctgctg gaagatggcg attaggcggc cggccgctaa tcagccatac cacatttgta 2400
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agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 2580
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcccccggc tagagtttaa acactagaac 2640
tagtggatcc cccgggatca tggcctccgc gccgggtttt ggcgcctccc gcgggcgccc 2700
ccctcctcac ggcgagcgct gccacgtcag acgaagggcg cagcgagcgt cctgatcctt 2760
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atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac catgaaaaag cctgaactca 3960
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aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg aggccatgga tgcgattgct gcggccgatc 4320
ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat 4380
ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg 4440
acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg 4500
actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg 4560
acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat 4620
acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc 4680
gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc gcggctccgg gcgtatatgc 4740
tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag 4800
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cacaaatcgc ccgcagaagc gcggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg 4920
atagtggaaa ccgacgcccc agcactcgtc cgagggcaaa ggaatagggg gatccgctgt 4980
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tctttactat tgctttatga taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa 5220
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tgggatcatt gtttttctct tgattcccac tttgtggttc taagtactgt ggtttccaaa 5340
tgtgtcagtt tcatagcctg aagaacgaga tcagcagcct ctgttccaca tacacttcat 5400
tctcagtatt gttttgccaa gttctaattc catcagacct cgacctgcag cccctagata 5460
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<210> 29
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 29
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ggctatgtct gaaggcccag atacctcttg atgctaggta acccttcaaa actcagcacc 120
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gaccaagtac agtgtgcagt ataggactga tgagcgcctg aactggatct actataagga 360
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ggagacacac tccatcccta tgttcctgct gtccgcgtct gtctgagcat tgacccctct 480
acatgctggg tcatctgctc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgct 540
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<210> 30
<211> 680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 30
ccagtagcag cacccacgtc caccttctgt ctagtaatgt ccaacacctc cctcagtcca 60
aacactgctc tgcatccatg tggctcccat ttatacctga agcacttgat ggggcctcaa 120
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<210> 31
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 31
tgccatcatc acaggatgtc cttccttctc cagaagacag actggggctg aaggaaaagc 60
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<210> 32
<211> 2008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 32
gtggtgctga ctcagcatcg gttaataaac cctctgcagg aggctggatt tcttttgttt 60
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tgttttggtt tggttttttt gggttttttt tttttttttt tttttggttt ttggagacag 180
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ccagtgtatt ctactcttgt ccccggtata aatttgattg ttccgaacta cataaattgt 360
agaaggattt tttagatgca catatcattt tctgtgatac cttccacaca cccctccccc 420
ccaaaaaaat ttttctggga aagtttcttg aaaggaaaac agaagaacaa gcctgtcttt 480
atgattgagt tgggcttttg ttttgctgtg tttcatttct tcctgtaaac aaatactcaa 540
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gaacctgcga tgaggcaagc aagataaggg gaagacttga gtttctgtga tctaaaaagt 780
cgctgtgatg ggatgctggc tataaatggg cccttagcag cattgtttct gtgaattgga 840
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caggctcaga acgagcccca ctaattactg cctccaacag ctttccactc actgccccca 1080
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gaagcctggc tgtgggtttg ggcatgagag gcagggacaa caaaaccagt atatatgatt 1200
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<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 33
gctctccact tcacttagat cttgctgtga ccaaggacaa ggagaaaatg ggtaccgatt 60
taaatgatcc agtggtcctg cagaggagag attgggagaa 100
<210> 34
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 34
cagcccctag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagc ttccaggtga 60
gtggctcaac gccctagcat tcctccttcc aactcttaat 100
<210> 35
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 35
atcccccggc tagagtttaa acactagaac tagtggatcc ccgggctcga taactataac 60
ggtcctaagg tagcgactcg acataacttc gtataatgta tgctatacga agttatgcta 120
gcttccaggt gagtggctca acgccctagc attcctcctt ccaactctta at 172
<210> 36
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 36
ctggagtgta cctttgttga tagaacactt gtttaggatt cgtgaaggta aactgggcac 60
ccatctagaa gcccagcact cagaggtgga gacaggaggt caggagttca acaaggtcat 120
tctctgctac acagtgagtt taaaatcggc ctgggataca cgagagagac cctgtgtaag 180
agcagtagca gcagcaagaa ctcaagctga aaaggaacat gcagtgtaag acaaagggcc 240
actgtgtgca tagagccagc aacctcacac tgtaatgaac gggtctgacc tttgcaagta 300
agcttcttgt gatgctctgg ttgagccttt gactacgact tttgtgactt gtgctcctct 360
ggatgcttgc aggatgaggg tgaggacccc tggtaccaga aagcatgcaa gtgtgattgc 420
caggtaggag ccaatgctct gtggtctgct ggagctacct ccttagacag tattccaggt 480
gagtggctca acgccctagc attcctcctt ccaactctta atccctctgc tttctctcaa 540
gttggcttgt gagcttcaca tctcaccgtg gccactgctc caacattctg ttcattatca 600
agtgccaggc tctctccctc cctggcttgc ctgagatggt caggtaagac ccctcgagat 660
aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atatgcatgc cagtagcagc accc 714
<210> 37
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 37
ttccatcaga cctcgacctg cagcccctag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 60
ttatgctagg taactataac ggtcctaagg tagcgagcta gcagcgtgag ggaagtccct 120
tcctcttagg ta 132
<210> 38
<211> 760
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 38
ctggagtgta cctttgttga tagaacactt gtttaggatt cgtgaaggta aactgggcac 60
ccatctagaa gcccagcact cagaggtgga gacaggaggt caggagttca acaaggtcat 120
tctctgctac acagtgagtt taaaatcggc ctgggataca cgagagagac cctgtgtaag 180
agcagtagca gcagcaagaa ctcaagctga aaaggaacat gcagtgtaag acaaagggcc 240
actgtgtgca tagagccagc aacctcacac tgtaatgaac gggtctgacc tttgcaagta 300
agcttcttgt gatgctctgg ttgagccttt gactacgact tttgtgactt gtgctcctct 360
ggatgcttgc aggatgaggg tgaggacccc tggtaccaga aagcatgcaa gtgtgattgc 420
caggtaggag ccaatgctct gtggtctgct ggagctacct ccttagacag tattccaggt 480
gagtggctca acgccctagc attcctcctt ccaactctta atccctctgc tttctctcaa 540
gttggcttgt gagcttcaca tctcaccgtg gccactgctc caacattctg ttcattatca 600
agtgccaggc tctctccctc cctggcttgc ctgagatggt caggtaagac ccctcgagat 660
aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atgctaggta actataacgg tcctaaggta 720
gcgagctagc agcgtgaggg aagtcccttc ctcttaggta 760
<210> 39
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 39
tctttcctaa ggaaaagaat taagagtcgg gctatgtctg aaggcccaga tacctcttga 60
tgctaggtaa cccttcaaaa ctcagcacct gttggctttt tacagacata gataagagga 120
tggctcctgg taatttggtg tgttcctggc aggtgtgctt ggctttccaa gtatcaggac 180
agcagccagt ggttacagat agatttgaag gagatcaagg tgatttcggg gatcctgacc 240
caaggatgct gtgacataga cgagtgggtg accaagtaca gtgtgcagta taggactgat 300
gagcgcctga actggatcta ctataaggat cagaccggaa acaatcgggt aagtgggggt 360
cactccgagt cagcttcagc tcacactgcg gagacacact ccatccctat gttcctgctg 420
tccgcgtctg tctgagcatt gacccctcta catgctgggt catctgctcg agataacttc 480
gtataatgta tgctatacga agttatatgc atgccagtag cagcaccc 528
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 40
ttttccagat gtgatctggg agactagcag 30
<210> 41
<211> 574
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组或合成多核苷酸
<400> 41
tctttcctaa ggaaaagaat taagagtcgg gctatgtctg aaggcccaga tacctcttga 60
tgctaggtaa cccttcaaaa ctcagcacct gttggctttt tacagacata gataagagga 120
tggctcctgg taatttggtg tgttcctggc aggtgtgctt ggctttccaa gtatcaggac 180
agcagccagt ggttacagat agatttgaag gagatcaagg tgatttcggg gatcctgacc 240
caaggatgct gtgacataga cgagtgggtg accaagtaca gtgtgcagta taggactgat 300
gagcgcctga actggatcta ctataaggat cagaccggaa acaatcgggt aagtgggggt 360
cactccgagt cagcttcagc tcacactgcg gagacacact ccatccctat gttcctgctg 420
tccgcgtctg tctgagcatt gacccctcta catgctgggt catctgctcg agataacttc 480
gtataatgta tgctatacga agttatgcta ggtaactata acggtcctaa ggtagcgagc 540
tagcttttcc agatgtgatc tgggagacta gcag 574
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
tgggacaagt gtaaatgagg ac 22
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
agtggtgctt ggccttatgc 20
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
tcccaggcaa atcaggacaa agggtc 26
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
gagccagcaa cctcacac 18
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
gcatccagag gagcacaagt c 21
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
tgtaatgaac gggtctgacc tttgcaa 27
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
tcgtgaaggt cttgatttga tcct 24
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
acctcctgtc tccacctctg 20
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
aagcaccatg taaactgggc accc 24
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
ccctggcttg cctgagatg 19
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
ggacttccct cacgctgagt t 21
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
tcaggtaaga cccaattgtc aatgca 26
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
gagtcgggct atgtctgaag g 21
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
gccaacaggt gctgagttt 19
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
ccagatttgg gatgatacct cttgatgc 28
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
cctctacatg ctgggtcatc tg 22
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
ggacttccct cacgctgagt t 21
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
gacccacatt catttacaaa ctgc 24

Claims (79)

1.一种啮齿动物，所述啮齿动物的基因组中包含内源性啮齿动物Rs1基因座处的内源性啮齿动物视网膜劈裂蛋白-1(Rs1)基因的编码序列的全部或部分的缺失。
2.如权利要求1所述的啮齿动物，其中所述缺失导致缺乏从所述Rs1基因座产生的功能性RS1多肽。
3.如权利要求1或权利要求2所述的啮齿动物，其中所述缺失是至少外显子2-3的缺失。
4.如权利要求1或权利要求2所述的啮齿动物，其中所述缺失是外显子1和外显子2-3的至少一部分的缺失。
5.如权利要求1至权利要求4中任一项所述的啮齿动物，其中所述Rs1基因座包含报告基因。
6.如权利要求5所述的啮齿动物，其中所述报吿基因可操作地连接至Rs1启动子。
7.如权利要求6所述的啮齿动物，其中所述Rs1启动子是内源性启动子。
8.如权利要求2所述的啮齿动物，其中所述Rs1基因座缺乏来自紧邻外显子1的ATG起始密码子的3'的编码部分，缺乏外显子2-3，并且包含框内融合至所述Rs1基因的所述起始(ATG)密码子的报告基因编码序列。
9.如权利要求5至权利要求8中任一项所述的啮齿动物，其中所述报告基因是lacZ或编码选自以下的蛋白质的基因：荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP。
10.如权利要求5至权利要求9中任一项所述的啮齿动物，其中所述报告基因的表达模式类似于野生型非人类动物中的内源性啮齿动物Rs1基因座处的野生型啮齿动物Rs1基因的表达模式。
11.如权利要求1所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雄性啮齿动物。
12.如权利要求1所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雌性啮齿动物。
13.如权利要求12所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述缺失是纯合的。
14.如权利要求12所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述缺失是杂合的。
15.一种啮齿动物，所述啮齿动物的基因组包含经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码与野生型RS1多肽相比具有至少一个氨基酸置换的RS1多肽。
16.如权利要求15所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是信号序列中的置换。
17.如权利要求16所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是疏水性残基被脯氨酸或者被亲水性残基或带电残基置换。
18.如权利要求15所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是RS1区或侧接盘状结构域的C-末端区段中的置换。
19.如权利要求18所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是选自位置38、40、59和223的位置处的半胱氨酸的置换。
20.如权利要求19所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是C59S置换。
21.如权利要求15所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是所述盘状结构域中的置换。
22.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是选自位置63、83、110、142和219的位置处的半胱氨酸的置换。
23.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是所述盘状结构域中的非半胱氨酸残基被半胱氨酸置换。
24.如权利要求23所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是R141C置换。
25.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是所述盘状结构域中的带电残基被不带电残基置换、不带电残基被带电残基置换或带电残基被带相反电荷的残基置换。
26.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是通过插入或除去脯氨酸而产生的所述盘状结构域中的置换。
27.如权利要求21所述的啮齿动物，其中所述至少一个氨基酸置换是通过插入或除去极性残基而产生的所述盘状结构域中的置换。
28.如权利要求15至权利要求27中任一项所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因还包含一个或多个选择性标记。
29.如权利要求15至权利要求27中任一项所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因还包含一个或多个位点特异性重组酶识别位点。
30.如权利要求29所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因还包含重组酶基因和侧接有所述一个或多个位点特异性重组酶识别位点的选择性标记，所述位点特异性重组酶识别位点被定向为引导切除。
31.如权利要求30所述的啮齿动物，其中所述重组酶基因可操作地连接至启动子，所述启动子驱动分化细胞中的所述重组酶基因的表达而不驱动未分化细胞中的所述重组酶基因的表达。
32.如权利要求20或权利要求21所述的啮齿动物，其中所述启动子为或包括SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。
33.如权利要求15至权利要求32中任一项所述的啮齿动物，其中所述经工程化的Rs1基因是在内源性啮齿动物Rs1基因座处。
34.如权利要求33所述的啮齿动物，其中所述点突变在所述内源性啮齿动物Rs1基因座处的所述内源性啮齿动物Rs1基因的外显子中。
35.如权利要求33至权利要求34中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雄性啮齿动物。
36.如权利要求33至权利要求34中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是雌性啮齿动物。
37.如权利要求36所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述经工程化的Rs1基因是纯合的。
38.如权利要求36所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述经工程化的Rs1基因是杂合的。
39.一种啮齿动物，所述啮齿动物表达包含C59S或R141C置换的RS1多肽。
40.如前述权利要求中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物产生视网膜劈裂的一种或多种症状，任选地到出生后15天、18天、21天或24天产生所述症状。
41.如前述权利要求中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
42.一种分离的啮齿动物细胞或组织，所述分离的啮齿动物细胞或组织的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码具有一个或多个氨基酸置换的RS1多肽。
43.一种永生化细胞，所述永生化细胞从如权利要求42所述的分离的啮齿动物细胞制备。
44.一种啮齿动物胚胎干(ES)细胞，所述啮齿动物胚胎干(ES)细胞的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因包含外显子中的一个或多个点突变，并且编码具有一个或多个氨基酸置换的RS1多肽。
45.一种啮齿动物胚胎，所述啮齿动物胚胎从如权利要求44所述的胚胎干细胞产生。
46.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1至权利要求41中任一项所述的啮齿动物、如权利要求42所述的分离的啮齿动物细胞、如权利要求43所述的永生化细胞、如权利要求44所述的啮齿动物胚胎干细胞或如权利要求45所述的啮齿动物胚胎。
47.一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，所述方法包括
修饰啮齿动物基因组，以使得所述经修饰的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因；以及
制备包含所述经修饰的基因组的经遗传修饰的啮齿动物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述啮齿动物基因组通过以下过程来修饰：所述过程包括
(a)将核酸序列引入啮齿动物ES细胞的所述基因组，以获得经遗传修饰的啮齿动物ES细胞，所述经遗传修饰的啮齿动物ES细胞的基因组包含(i)所述的缺失或(ii)所述的经工程化的Rs1基因；以及
(b)使用(a)所述的经遗传修饰的啮齿动物ES细胞来产生啮齿动物。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述经工程化的Rs1基因是将所述核酸序列引入所述啮齿动物ES细胞的所述基因组的结果，所述引入在内源性啮齿动物Rs1基因座处的内源性啮齿动物Rs1基因的外显子中产生点突变。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述内源性啮齿动物Rs1基因的外显子3突变为编码包含C59S置换的RS1多肽。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述内源性啮齿动物Rs1基因的外显子5突变为编码包含R141C置换的RS1多肽。
52.如权利要求48所述的方法，其中所述缺失是所述Rs1基因座处的所述Rs1基因的编码序列的外显子1和外显子2-3的一部分的缺失。
53.如权利要求48至权利要求52中任一项所述的方法，其中所述核酸序列还包含一个或多个选择性标记。
54.如权利要求48至权利要求53中任一项所述的方法，其中所述核酸序列还包含一个或多个位点特异性重组酶识别位点。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述核酸序列还包含重组酶基因和侧接有所述一个或多个位点特异性重组酶识别位点的选择性标记，所述位点特异性重组酶识别位点被定向为引导切除。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述核酸序列还包含位于所述选择性标记下游的报告基因。
57.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述重组酶基因可操作地连接至发育调节的启动子。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述启动子为或包括SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。
59.如权利要求52所述的方法，其中包含所述缺失的所述Rs1基因座还包含报告基因。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述报吿基因可操作地连接至啮齿动物Rs1启动子。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述啮齿动物Rs1启动子是所述Rs1基因座处的所述内源性Rs1启动子。
62.如权利要求59至权利要求61中任一项所述的方法，其中所述缺失是从外显子1中的紧邻ATG起始密码子之后开始到所述Rs1基因的外显子3的最后六个核苷酸的核苷酸缺失，并且其中所述报告基因的所述编码序列框内融合至所述Rs1基因的外显子1中的所述起始(ATG)密码子。
63.如权利要求56或权利要求59至权利要求62中任一项所述的方法，其中所述报告基因是lacZ或编码选自以下的蛋白质的基因：荧光素酶、GFP、eGFP、CFP、YFP、eYFP、BFP、eBFP、DsRed和MmGFP。
64.如权利要求56或权利要求59至权利要求63中任一项所述的方法，其中所述报告基因的表达模式类似于内源性啮齿动物Rs1基因座处的野生型啮齿动物Rs1基因的表达模式。
65.如权利要求47至权利要求64中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是雄性啮齿动物。
66.如权利要求47至权利要求64中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是雌性啮齿动物。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述缺失或所述经工程化的Rs1基因是纯合的。
68.一种啮齿动物，所述啮齿动物可通过权利要求47至权利要求67中任一项所述的方法获得。
69.一种鉴定用于治疗啮齿动物中的视网膜劈裂的治疗剂的方法，所述方法包括
(a)将一种或多种药剂施用于啮齿动物，所述啮齿动物的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因；
(b)进行一种或多种测定，以确定所述一种或多种药剂是否对与视网膜劈裂相关的一种或多种体征、症状和/或病症有效；以及
(c)将对所述与视网膜劈裂相关的一种或多种体征、症状和/或病症有效的所述一种或多种药剂鉴定为所述治疗剂。
70.一种鉴定用于治疗与啮齿动物的眼部相关的疾病、障碍或病症的治疗剂的方法，所述方法包括
(a)将一种或多种药剂施用于啮齿动物，所述啮齿动物的基因组包含
(i)内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因；
(b)进行一种或多种测定，以确定所述一种或多种药剂是否对与所述眼部相关的所述疾病、障碍或病症相关的一种或多种体征、症状和/或病症有效；以及
(c)将对所述与眼部相关的所述疾病、障碍或病症相关的一种或多种体征、症状和/或病症有效的所述一种或多种药剂鉴定为所述治疗剂。
71.如权利要求69或权利要求70所述的方法，其中所述啮齿动物的所述基因组包含经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因编码具有C59S置换的RS1多肽。
72.如权利要求69或权利要求70所述的方法，其中所述啮齿动物的所述基因组包含经工程化的Rs1基因，所述经工程化的Rs1基因编码具有R141C置换的RS1多肽。
73.如权利要求69或权利要求70所述的方法，其中所述啮齿动物的所述基因组包含内源性啮齿动物Rs1基因座中的内源性啮齿动物Rs1基因的编码序列的外显子1和外显子2-3的至少一部分的缺失。
74.如权利要求69或权利要求70所述的方法，其中将所述一种或多种药剂在所述啮齿动物出生时或出生后不久进行施用。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述一种或多种测定在出生后15-24天进行。
76.如权利要求47至权利要求75中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
77.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含
待整合进的啮齿动物Rs1基因座处的啮齿动物Rs1基因的核酸序列，所述核酸序列被与所述啮齿动物Rs1基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列侧接，其中所述核酸序列整合进所述啮齿动物Rs1基因产生
(i)所述啮齿动物Rs1基因的编码序列的全部或部分的缺失，或
(ii)编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因。
78.如权利要求77所述的核酸构建体，其中所述核酸序列包含报告基因，并且所述核酸序列的整合导致外显子1和外显子2-3的一部分的缺失。
79.如权利要求77所述的核酸构建体，其中所述核酸序列包含突变型Rs1外显子，以使得所述核酸序列整合进所述啮齿动物Rs1基因产生编码具有氨基酸置换的RS1多肽的经工程化的Rs1基因。
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