JP6475172B2 - ラットの遺伝子組換え - Google Patents
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Description
全米情報交換標準コード(ASCII)に従った2014年2月20日の作成日で2Kbのサイズの441914seqlist.txtのファイル名での配列表の正式なコピーがEFS−Webを介してテキストファイルとして本明細書と同時に提出される。EFS−Webを介して提出される配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
(1)ACIまたはDAから選択される系統の単離されたラットES細胞であって、単離されたラットES細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である単離されたラットES細胞。
(2)細胞がACIラットに由来する実施形態1の単離されたラットES細胞。
(3)細胞がダークアグーチ(DA)ラット2に由来する実施形態1または2の単離されたラットES細胞。
(4)細胞が正倍数体であり、標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である実施形態1、2または3の単離されたラットES細胞。
(5)ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む実施形態4の単離されたラットES細胞。
(6)ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態4の単離されたラットES細胞。
(7)ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す実施形態1〜6のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(8)ラットES細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である実施形態1〜8のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(9)ラットES細胞が、1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含む実施形態1〜8のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(10)標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む実施形態4〜9のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(11)標的とされた遺伝子組換えが非相同のポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの少なくとも1回の挿入を含む実施形態9の単離されたラットES細胞。
(12)非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む実施形態11の単離されたラットES細胞。
(13)(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの少なくとも2コピーを含む実施形態12の単離されたラットES細胞。
(14)選択マーカーが野生型の選択マーカーに比べて高い活性を有する実施形態12の単離されたラットES細胞。
(15)LIFポリペプチド、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培養にてフィーダー細胞層上に置かれると、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する実施形態1〜14のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(16)ラットES細胞が、試験管内で培養されると、フィーダー細胞層にゆるく接着する実施形態1〜15のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(17)細胞が多能性の維持のために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない実施形態1〜16のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(18)細胞がオス(XY)ラットES細胞である実施形態1〜17のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(19)細胞がメス(XX)ラットES細胞である実施形態1〜19のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(20)標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率及び生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地でラットES細胞を少なくとも11回まで継代することができる実施形態1〜19のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(21)ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する実施形態1〜20のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(22)ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1またはそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない実施形態1〜21のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(23)ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない実施形態1〜22のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(24)ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない実施形態1〜23のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(25)ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない実施形態1〜24のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(26)細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーを発現する実施形態1〜25のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(27)ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットESC特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする実施形態1〜26のいずれか1つの単離されたラットES細胞。
(28)ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成するラットES細胞の単離された集団。
(29)ラットES細胞がACIラットに由来する実施形態28のラットES細胞の単離された集団。
(30)ラットES細胞がダークアグーチ(DA)ラット2に由来する実施形態28のラットES細胞の単離された集団。
(31)ラットES細胞が生殖系列を介してゲノムを伝達することが可能である実施形態28〜30のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(32)ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態28〜31のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(33)ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態28〜31のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(34)ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す実施形態28〜31のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(35)ラットES細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である実施形態28〜34のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(36)ラットES細胞が、1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である実施形態28〜35のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(37)標的とされた遺伝子組換えがラットのRosa26遺伝子座にある実施形態36のラットES細胞の単離された集団。
(38)標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む実施形態36のラットES細胞の単離された集団。
(39)標的とされた遺伝子組換えが非相同のポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの少なくとも1回の挿入を含む実施形態36のラットES細胞の単離された集団。
(40)非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む実施形態39のラットES細胞の単離された集団。
(41)(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの少なくとも2コピーを含む実施形態40のラットES細胞の単離された集団。
(42)選択マーカーが野生型の選択マーカーに比べて高い活性を有する実施形態40のラットES細胞の単離された集団。
(43)LIFポリペプチド、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培養にてフィーダー細胞層上に置かれると、細胞が球形様のコロニーを形成する実施形態28〜42のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(44)細胞が、試験管内で培養されると、フィーダー細胞層にゆるく接着する実施形態28〜43のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(45)細胞が多能性の維持のために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない実施形態28〜44のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(46)ラットES細胞がオス(XY)ラットES細胞である実施形態28〜44のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(47)ラットES細胞がメス(XX)ラットES細胞である実施形態28〜44のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(48)標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率及び生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地でラットES細胞を少なくとも11回まで継代することができる実施形態28〜47のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(49)ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する実施形態28〜48のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(50)ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1またはそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない実施形態28〜49のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(51)ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない実施形態28〜50のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(52)ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない実施形態28〜51のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(53)ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない実施形態28〜52のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(54)ラットES細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーを発現する実施形態28〜53のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(55)ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットESC特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする実施形態28〜54のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(56)集団が少なくとも104個の細胞を含む実施形態28〜55のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(57)ラットES細胞が
a.ラットES細胞の少なくとも90%が正倍数体である;
b.ラットES細胞の少なくとも70%が少なくとも1つの多能性マーカーを発現し、少なくとも1つの多能性マーカーはOct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む;
c.ラットES細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットES細胞株のゲノムを子孫に伝達する;
d.ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
e.ラットES細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する;(f)ラットES細胞はGSK3阻害剤、MEK阻害剤、LIF及びLIFを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する;
f.ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す;
g.傍分泌のLIFシグナル伝達を必要とすることなく、ラットES細胞が試験管内で多能性を維持する;
h.ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する;
i.ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する;
j.ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexolから選択される1以上の分化マーカーを発現しない;
k.ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない;
l.ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない;
m.ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない;を含む1以上の特徴を有する実施形態28〜56のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(58)(a)ラットES細胞がラット胚盤胞に由来する、(b)ラットES細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び/または(c)ラットES細胞株が過排卵ラットに由来する実施形態28〜57のいずれか1つのラットES細胞の単離された集団。
(59)フィーダー細胞層と、ラット胚性幹(ES)細胞の集団と、白血病阻害因子(LIF)、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する試験管内培養物。
(60)ラットES細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する実施形態59または60の試験管内培養物。
(61)ラットES細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である実施形態59、60または61の試験管内培養物。
(62)ラットES細胞がACIラットに由来する実施形態59、60または61の試験管内培養物。
(63)ラットES細胞がダークアグーチ(DA)ラット2に由来する実施形態59、60または61の試験管内培養物。
(64)ラットES細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である実施形態59〜63のいずれか1つの試験管内培養物。
(65)ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む実施形態64の試験管内培養物。
(66)ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態64の試験管内培養物。
(67)ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す実施形態59〜66のいずれか1つの試験管内培養物。
(68)ラットES細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である実施形態59〜67のいずれか1つの試験管内培養物。
(69)ラットES細胞が、1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含む実施形態59〜68のいずれか1つの試験管内培養物。
(70)標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む実施形態69の試験管内培養物。
(71)標的とされた遺伝子組換えが非相同のポリヌクレオチドの細胞のゲノムへの少なくとも1回の挿入を含む実施形態69の試験管内培養物。
(72)非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む実施形態71の試験管内培養物。
(73)(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの少なくとも2コピーを含む実施形態72の試験管内培養物。
(74)選択マーカーが野生型の選択マーカーに比べて高い活性を有する実施形態72の試験管内培養物。
(75)細胞が多能性の維持のために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない実施形態59〜74のいずれか1つの試験管内培養物。
(76)細胞がオス(XY)ラットES細胞である実施形態59〜75のいずれか1つの試験管内培養物。
(77)細胞がメス(XX)ラットES細胞である実施形態59〜75のいずれか1つの試験管内培養物。
(78)標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率及び生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地でラットES細胞を少なくとも11回まで継代することができる実施形態59〜77のいずれか1つの試験管内培養物。
(79)ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する実施形態59〜78のいずれか1つの試験管内培養物。
(80)ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1またはそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない実施形態59〜79のいずれか1つの試験管内培養物。
(81)ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない実施形態59〜80のいずれか1つの試験管内培養物。
(82)ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない実施形態59〜81のいずれか1つの試験管内培養物。
(83)ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない実施形態59〜82のいずれか1つの試験管内培養物。
(84)細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む多能性マーカーを発現する実施形態59〜83のいずれか1つの試験管内培養物。
(85)ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットESC特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする実施形態59〜84のいずれか1つの試験管内培養物。
(86)LIFの濃度が50U/mL〜150U/mLである実施形態59〜84のいずれか1つの試験管内培養物。
(87)LIFの濃度が100U/mLである実施形態59〜85のいずれか1つの試験管内培養物。
(88)LIFがマウスに由来するまたは配列番号1に対して少なくとも92%の配列同一性を含む実施形態59〜87のいずれか1つの試験管内培養物。
(89)ラットES細胞が傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としないで多能性を維持することが可能である実施形態59〜88のいずれか1つの試験管内培養物。
(90)フィーダー細胞層がLIFを発現するように遺伝子組換えされない実施形態59〜89のいずれか1つの試験管内培養物。
(91)フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む実施形態59〜90のいずれか1つの試験管内培養物。
(92)MEK阻害剤がPD0325901を含む実施形態59〜91のいずれか1つの試験管内培養物。
(93)GSK3阻害剤がCHIR99021を含む実施形態59〜92のいずれか1つの試験管内培養物。
(94)ラットES細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する実施形態59〜93のいずれか1つの試験管内培養物。
(95)胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む実施形態94の試験管内培養物。
(96)ラットES細胞の集団がラットES細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む実施形態94の試験管内培養物。
(97)ラットの胚性幹(ES)細胞株を生成する方法であって、(a)フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養することと、(b)ラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第2のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移し、マウスのLIFまたはマウスのLIFの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で該増殖物を培養し、それによってラットES細胞の多能性を維持し、それからラットES細胞株を樹立することとを含み、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットES細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子(LIF)または配列番号1に対して少なくとも91%の配列同一性を有し、且つLIF活性を有する配列、及びGSK3阻害剤及びMEK阻害剤を有する培地を含む方法。
(98)ラットES細胞株が少なくとも5回継代される実施形態97の方法。
(99)ラットES細胞株が少なくとも10回継代される実施形態97または98の方法。
(100)培地が約50U/mL〜約150U/mLのマウスLIFを含む実施形態97、98または99の方法。
(101)培地が約100U/mLのマウスLIFを含む実施形態97〜100のいずれか1つの方法。
(102)フィーダー細胞層がLIFを発現するように遺伝子組換えされない実施形態97〜101のいずれか1つの方法。
(103)フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む実施形態97〜102のいずれか1つの方法。
(104)MEK阻害剤がPD0325901を含む実施形態97〜103のいずれか1つの方法。
(105)GSK3阻害剤がCHIR99021を含む実施形態97〜104のいずれか1つの方法。
(106)(a)ラットES細胞株がACIラットに由来するまたはダークアグーチ(DA)ラットに由来する;(b)ラットES細胞株が桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する;及び/または(c)ラットES細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する実施形態97〜105のいずれか1つの方法。
(107)培地がさらに、FGF受容体阻害剤、ROCK阻害剤またはALK阻害剤の少なくとも1つを含む実施形態97〜106のいずれか1つの方法。
(108)FGF受容体阻害剤がPD184352を含み、ROCK阻害剤がY−27632を含み、またはALK阻害剤がA−83−01を含む実施形態107の方法。
(109)少なくとも1つのラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する実施形態97〜108のいずれか1つの方法。
(110)標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも60%である実施形態97〜109のいずれか1つの方法。
(111)そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹(ES)細胞を選択する方法であって、(a)ラットES細胞の試験管内集団を提供することと、(b)ラットES細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも1つのラットES細胞に導入することと、(c)交互に入れ替える第1と第2の培養培地にてラットES細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットES細胞を選択することとを含み、その際、第1の培養培地は第1の期間、有効量の選択剤を含み、第2の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件は多能性を維持するのに十分である方法。
(112)第1と第2の培養培地が24時間ごとに交互に入れ替えられる実施形態111の方法。
(113)選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する実施形態111または112の方法。
(114)抗生剤がG418を含む実施形態111〜113のいずれか1つの方法。
(115)選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neor)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hygr)、プロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ(puror)、ブラスチシジンSデアミナーゼ(bsrr)、キサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−k)またはそれらの組み合わせを含む実施形態111〜114のいずれか1つの方法。
(116)(a)選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び/または(b)選択マーカーの複数のコピーがラットES細胞のゲノムに安定的に組み込まれる実施形態111〜115のいずれか1つの方法。
(117)選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである実施形態116の方法。
(118)単離されたラット胚性幹(ES)細胞を遺伝子組換えする方法であって、実施形態1〜58のいずれか1つの単離されたラットES細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットES細胞を形成することを含む方法。
(119)遺伝子組換えしたラットを作製する方法であって、
(a)実施形態1〜58のいずれか1つの単離されたラット胚性幹(ES)細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットES細胞を形成することと;
(b)標的とされた遺伝子組換えを含むラットES細胞の少なくとも1つをラット宿主胚に導入してF0胚を作出することと;
(c)F0胚を代理母に移植することと;
(d)代理母にてF0胚を出産予定日まで妊娠維持させることと;
(e)標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットを特定することとを含む方法。
(120)オスF0ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるF1子孫を作出することをさらに含む実施形態119の方法。
(121)オスF0ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるF1子孫を作出することをさらに含む実施形態120の方法。
(122)F1子孫のオスラットをF1子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるF2子孫を得ることをさらに含む実施形態119の方法。
(123)遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも3%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する実施形態119〜122のいずれか1つの方法。
(124)遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも10%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する実施形態119〜123のいずれか1つの方法。
(125)遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも60%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する実施形態119〜124のいずれか1つの方法。
(126)遺伝子組換えしたラットES細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する実施形態119〜125のいずれか1つの方法。
(127)遺伝子組換えしたラットES細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する実施形態119〜127のいずれか1つの方法。
(128)集団におけるラットES細胞が、
a.ラットES細胞の少なくとも90%が正倍数体である;
b.ラットES細胞の少なくとも70%が少なくとも1つの多能性マーカーを発現し、少なくとも1つの多能性マーカーはOct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む;
c.ラットES細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットES細胞株のゲノムを子孫に伝達する;
d.ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
e.ラットES細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する;
f.ラットES細胞がGSK3阻害剤、MEK阻害剤、LIF及びLIFを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する;
g.ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す;
h.傍分泌のLIFシグナル伝達を必要とすることなく、ラットES細胞が試験管内で多能性を維持する;
i.ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する;
j.ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する;
k.ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexolから選択される1以上の分化マーカーを発現しない;
l.ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない;
m.ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない;及び/または
n.ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない;を含む、上記クレームのいずれかのラットES細胞の単離された集団、上記クレームのいずれかの試験管内培養物、または上記クレームのいずれかの方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
ACIラットまたはダークアグーチ(DA)ラットから選択される系統の単離されたラットES細胞であって、前記単離されたラットES細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である、前記単離されたラットES細胞。
(項目2)
ラットES細胞がACIラットに由来する項目1に記載の単離されたラットES細胞。
(項目3)
ラットES細胞がDAラットに由来する項目1に記載の単離されたラットES細胞。
(項目4)
ラットES細胞が正倍数体であり、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目1、2または3に記載の単離されたラットES細胞。
(項目5)
ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目4に記載の単離されたラットES細胞。
(項目6)
ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目4に記載の単離されたラットES細胞。
(項目7)
ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す項目1〜6のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目8)
ラットES細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目1〜7のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目9)
ラットES細胞が1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目1〜8のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目10)
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目9に記載の単離されたラットES細胞。
(項目11)
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む項目9に記載の単離されたラットES細胞。
(項目12)
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目11に記載の単離されたラットES細胞。
(項目13)
(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非減衰性の選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードする少なくとも2コピーのポリヌクレオチドを含む項目12に記載の単離されたラットES細胞。
(項目14)
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目12に記載の単離されたラットES細胞。
(項目15)
ラットES細胞が、白血病阻害因子(LIF)、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目1〜14のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目16)
ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目1〜15のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目17)
ラットES細胞が多能性を維持するために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない項目1〜16のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目18)
ラットES細胞がオス(XY)ラットES細胞である項目1〜17のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目19)
ラットES細胞がメス(XX)ラットES細胞である項目1〜17のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目20)
ラットES細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にて少なくとも11回まで継代することができる項目1〜19のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目21)
ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する項目1〜20のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目22)
ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1及びそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない項目1〜21のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目23)
ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2及びそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉マーカーを発現しない項目1〜22のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目24)
ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7及びそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉マーカーを発現しない項目1〜23のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目25)
ラットES細胞が、Nestin、Pax6及びそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない項目1〜24のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目26)
細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目1〜25のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目27)
ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リ
ソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、及びそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットES細胞に特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする項目1〜26のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目28)
ラットES細胞の単離された集団であって、前記ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置くと球形様のコロニーを形成する、前記ラットES細胞の単離された集団。
(項目29)
ラットES細胞がACIラットに由来する項目28に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目30)
ラットES細胞がダークアグーチ(DA)ラットに由来する項目28に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目31)
ラットES細胞が、生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目28〜30のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目32)
ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目28〜31のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目33)
ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目28〜31のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目34)
ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す項目28〜33のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目35)
ラットES細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目28〜34のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目36)
ラットES細胞が1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することができる項目28〜35のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目37)
標的とされた遺伝子組換えがラットのRosa26遺伝子座におけるものである項目36に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目38)
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目36に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目39)
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む項目36に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目40)
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目39に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目41)
(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または
(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードする少なくとも2コピーのポリヌクレオチドを含む項目40に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目42)
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目40に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目43)
細胞が、LIFポリペプチド、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目28〜42のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目44)
細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目28〜43のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目45)
細胞が多能性を維持するために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない項目28〜44のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目46)
ラットES細胞がオス(XY)ラットES細胞である項目28〜45のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目47)
ラットES細胞がメス(XX)ラットES細胞である項目28〜45のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目48)
ラットES細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にて少なくとも11回まで継代することができる項目28〜47のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目49)
ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する項目28〜48のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目50)
ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1及びそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない項目28〜49のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目51)
ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2及びそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉マーカーを発現しない項目28〜50のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目52)
ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7及びそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉マーカーを発現しない項目28〜51のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目53)
ラットES細胞が、Nestin、Pax6及びそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない項目28〜52のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目54)
ラットES細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目28〜53のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目55)
ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、及びそれらの組み合わせから選択される1以上のラットES細胞に特異的な遺伝子の発現を特徴とする項目28〜54のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目56)
集団が少なくとも10 4 個の細胞を含む項目28〜55のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目57)
ラットES細胞が、
a.ラットES細胞の少なくとも90%が正倍数体である;
b.ラットES細胞の少なくとも70%が少なくとも1つの多能性マーカーを発現し、少なくとも1つの多能性マーカーはOct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む;
c.ラットES細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットES細胞株のゲノムを子孫に伝達する;
d.ラットES細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する;及び/または
e.ラットES細胞はGSK3阻害剤、MEK阻害剤、LIF及びLIFを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養すると多能性を維持する;を含む1以上の特徴を有する項目28〜56のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目58)
(a)ラットES細胞がラット胚盤胞に由来する、(b)ラットES細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び/または(c)ラットES細胞が過排卵ラットに由来する項目28〜57のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目59)
フィーダー細胞層と、ラット胚性幹(ES)細胞の集団と、白血病阻害因子(LIF)
、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する、前記試験管内培養物。
(項目60)
ラットES細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する項目59に記載の試験管内培養物。
(項目61)
ラットES細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目59または60に記載の試験管内培養物。
(項目62)
ラットES細胞がACIラットに由来する項目59〜61のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目63)
ラットES細胞がダークアグーチ(DA)ラットに由来する項目59〜61のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目64)
ラットES細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目59〜63のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目65)
ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目64に記載の試験管内培養物。
(項目66)
ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目64に記載の試験管内培養物。
(項目67)
ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す項目59〜66のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目68)
ラットES細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目59〜67のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目69)
ラットES細胞が、1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目59〜68のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目70)
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目69に記載の試験管内培養物。
(項目71)
標的とされた遺伝子組換えがラットES細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む項目69に記載の試験管内培養物。
(項目72)
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーである項目71に記載の試験管内培養物。
(項目73)
(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードする少なくとも2コピーのポリヌクレオチドを含む項目72に記載の試験管内培養物。
(項目74)
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目72に記載の試験管内培養物。
(項目75)
細胞が多能性を維持するために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない項目59〜74のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目76)
ラットES細胞がオス(XY)ラットES細胞である項目59〜75のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目77)
ラットES細胞がメス(XX)ラットES細胞である項目59〜75のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目78)
ラットES細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にて少なくとも11回まで継代することができる項目59〜77のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目79)
ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する項目59〜78のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目80)
ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1及びそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない項目59〜79のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目81)
ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2及びそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉マーカーを発現しない項目59〜80のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目82)
ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7及びそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉マーカーを発現しない項目59〜81のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目83)
ラットES細胞が、Nestin、Pax6及びそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない項目59〜82のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目84)
細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目59〜83のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目85)
ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(F
ank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせから選択されるラットESCに特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする項目59〜84のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目86)
LIFの濃度が約50U/ml〜約150U/mlである項目59〜85のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目87)
LIFの濃度が約100U/mlである項目59〜85のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目88)
LIFがマウスに由来するまたは配列番号1に対して少なくとも91%の配列同一性を含む項目59〜87のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目89)
フィーダー細胞層がLIFを発現するように遺伝子組換えされない項目59〜88のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目90)
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む項目59〜89のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目91)
MEK阻害剤がPD0325901を含む項目59〜90のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目92)
GSK-3阻害剤がCHIR99021を含む項目59〜91のいずれか1項に記載
の試験管内培養物。
(項目93)
ラットES細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する項目59〜92のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目94)
胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む項目93に記載の試験管内培養物。
(項目95)
ラットES細胞の集団がラットES細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む項目93に記載の試験管内培養物。
(項目96)
ラットの胚性幹(ES)細胞株の生成方法であって、
(a)フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養すること、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットES細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子(LIF)または配列番号1に対して少なくとも91%の配列同一性を有し、且つLIF活性を有する配列、及びGSK3阻害剤及びMEK阻害剤を有する培地を含むことと、
(b)ラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第2のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移すことと、
(c)マウスLIFまたはマウスLIFの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットES細胞の多能性を維持し、それからラットES細胞株を樹立することとを含む、前記方法。
(項目97)
ラットES細胞株が少なくとも5回継代される項目96に記載の方法。
(項目98)
ラットES細胞株が少なくとも10回継代される項目96または97に記載の方法。
(項目99)
培地が約50U/mL〜約150U/mLのマウスLIFを含む項目96、97または98に記載の方法。
(項目100)
培地が約100U/mLのマウスLIFを含む項目96〜99のいずれか1項に記載の方法。
(項目101)
第1及び第2のフィーダー細胞層がLIFを発現するように遺伝子組換えされない項目96〜100のいずれか1項に記載の方法。
(項目102)
第1及び第2のフィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む項目96〜101のいずれか1項に記載の方法。
(項目103)
MEK阻害剤がPD0325901を含む項目96〜102のいずれか1項に記載の方法。
(項目104)
GSK-3阻害剤がCHIR99021を含む項目96〜103のいずれか1項に記
載の方法。
(項目105)
(a)ラットES細胞株がACIラットに由来するまたはダークアグーチ(DA)ラットに由来する;及び/または(b)ラットES細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する項目96〜104のいずれか1項に記載の方法。
(項目106)
培地がさらに、FGF受容体阻害剤、ROCK阻害剤またはALK阻害剤の少なくとも1つを含む項目96〜105のいずれか1項に記載の方法。
(項目107)
FGF受容体阻害剤がPD184352を含み、ROCK阻害剤がY−27632を含み、またはALK阻害剤がA−83−01を含む項目106に記載の方法。
(項目108)
ラットES細胞株が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目96〜107のいずれか1項に記載の方法。
(項目109)
標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも60%である項目96〜108のいずれか1項に記載の方法。
(項目110)
そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹(ES)細胞の選択方法であって、(a)ラットES細胞の試験管内集団を提供することと、(b)前記ラットES細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも1つのラットES細胞に導入することと、(c)交互に入れ替える第1と第2の培養培地にて前記ラットES細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に前記非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットES細胞を選択することとを含み、その際、前記第1の培養培地は第1の期間、有効量の選択剤を含み、前記第2の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、前記方法。
(項目111)
第1の培養培地と第2の培養培地が24時間ごとに交互に入れ替えられる項目110に記載の方法。
(項目112)
選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する項目110または111に記載の方法。
(項目113)
抗生剤がG418を含む項目110〜112のいずれか1項に記載の方法。
(項目114)
選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo r )、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hyg r )、プロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ(puro r )、ブラスチシジンSデアミナーゼ(bsr r )、キサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−tk)またはそれらの組み合わせを含む項目110〜113のいずれか1項に記載の方法。
(項目115)
(a)選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び/または(b)選択マーカーの複数のコピーがラットES細胞のゲノムに安定的に組み込まれる項目110〜114のいずれか1項に記載の方法。
(項目116)
選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである項目115に記載の方法。
(項目117)
単離されたラット胚性幹(ES)細胞の遺伝子組換え方法であって、項目1〜27のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットES細胞を形成することを含む、前記方法。
(項目118)
遺伝子組換えしたラットの作製方法であって、
(a)項目1〜27のいずれか1項に記載の単離されたラット胚性幹(ES)細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットES細胞を形成することと;
(b)標的とされた遺伝子組換えを含むラットES細胞の少なくとも1つをラット宿主胚に導入してF0胚を作出することと;
(c)F0胚を代理母に移植することと;
(d)代理母にてF0胚を出産予定日まで妊娠維持させることと;(e)標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットを特定することとを含む、前記方法。
(項目119)
オスF0ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるF1子孫を作出することをさらに含む項目118に記載の方法。
(項目120)
F1子孫のオスラットをF1子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるF2子孫を得ることをさらに含む項目119に記載の方法。
(項目121)
遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも3%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する項目118〜120のいずれか1項に記載の方法。
(項目122)
遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも10%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する項目118〜121のいずれか1項に記載の方法。
(項目123)
遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも60%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する項目118〜122のいずれか1項に記載の方法。
(項目124)
遺伝子組換えしたラットES細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する項目1
18〜123のいずれか1項に記載の方法。
(項目125)
遺伝子組換えしたラットES細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する項目118〜123のいずれか1項に記載の方法。
(項目126)
集団におけるラットES細胞が、
(a)ラットES細胞の少なくとも90%が正倍数体である;
(b)ラットES細胞の少なくとも70%が少なくとも1つの多能性マーカーを発現し、前記少なくとも1つの多能性マーカーはOct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む;
(c)ラットES細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットES細胞株のゲノムを子孫に伝達する;
(d)ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
(e)ラットES細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する;
(f)ラットES細胞がGSK3阻害剤と、MEK阻害剤と、LIFと、LIFを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層とを含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する;
(g)ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す;
(h)傍分泌のLIFシグナル伝達を必要とすることなく、ラットES細胞が試験管内で多能性を維持する;
(i)ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する;
(j)ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する;
(k)ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexolから選択される1以上の分化マーカーを発現しない;
(l)ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない;
(m)ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない;及び/または
(n)ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない;を含む、上記項目のいずれかに記載のラットES細胞の単離された集団、上記項目のいずれかに記載の試験管内培養物、または上記項目のいずれかに記載の方法。
ラットは長い間、循環器疾患、代謝、毒性学、神経生物学及び行動のような生物医学の幾つかの分野で好まれる齧歯類のモデル生物である。数百系統のラットが開発されており、一部は、たとえば、高血圧症、糖尿病及び癌のような複雑なヒト疾患の優れたモデルである。しかしながら、制御された方法でラットのゲノムを操作することの困難さによってこれらのモデルの遺伝学を理解することにおける進歩は大幅に妨げられている。部位特異的変異誘発の使用を介して、当該遺伝子に突然変異を生じることは可能ではあるが、この方法は不正確で高価なままである。ラットES細胞の標的化及び生殖系列伝達は達成するには困難な課題のままである。
ラットに由来する胚性幹細胞を含む種々の組成物及び方法が本明細書で提供される。幹細胞は無限に自己複製する能力を持つ細胞集団であり、多能性である。「胚性幹細胞」または「ES細胞」は胚または胎児から得られる幹細胞を含む。本明細書で提供される種々のラットES細胞は以下の特性:
(a)ラットES細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットES細胞株のゲノムが子孫に伝達されることを意味する、生殖系列適格性を有する;
(b)標的とされた遺伝子組換えを有するラットES細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットES細胞株のゲノム内の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達されることを意味する、少なくとも1つの標的とされた遺伝子組換えに続いて生殖系列適格性を有する;
(c)試験管内で多能性を有する;
(d)試験管内で分化全能性を有する;
(e)試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
(f)試験管内で培養すると試験管内でフィーダー細胞層上に置かれた際、球形様のコロニーを形成する;
(g)白血病阻害因子(LIF)を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のLIFを含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する;
(h)フィーダー細胞層を含み、培養培地がマウスLIFまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する;
(i)以下を特徴とする分子署名を含む
(i)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせを含むラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(ii)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせ含むラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現;
(iii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(iv)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(v)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(vi)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現;
(vii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(viii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(ix)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(x)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(xi)パート(i)〜(x)のラットES細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ;
(xii)列記された多能性マーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18について表15で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の多能性のランク付けの欄を参照;
(xiii)列記された中胚葉マーカーの少なくとも2、3または4について表15で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の中胚葉のランク付けの欄を参照;
(xiv)列記された内胚葉マーカーの少なくとも2、3、4、5または6について表15で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の内胚葉のランク付けの欄を参照;
(xv)列記された神経マーカーの少なくとも2または3について表15で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の神経のランク付けの欄を参照;
(xvi)列記された栄養外胚葉マーカーについて表15で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照;
(xvii)表15で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び/または栄養外胚葉マーカーの1以上(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30)の相対的な発現レベル。
(xviii)表15で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
(xix)xii〜xiixで示された署名の任意の組み合わせ;及び/または
(xx)i〜xiixで示された署名の任意の組み合わせ;
(j)F0ラットを作出する能力を有する;
(k)継代培養され、未分化状態を維持することが可能である;
(l)正常なラット細胞と同じ数の染色体を有する;
(m)傍分泌LIFのシグナル伝達を必要とせずに試験管内で多能性を維持する;及び/または
(n)多能性を維持しながらそれらが無限に分裂することを意味する、自己複製能を有する;のいずれかの1以上を有することができる。
円形の形態スケール:
10=構造の中心を通って走り、長さが等しい長手軸と縦軸を有する構造を持つ円形。
9=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.9999〜0.9357の間である長手軸と縦軸を有する構造。
8=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.9357〜0.875の間である長手軸と縦軸を有する構造。
7=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.875〜0.8125の間である長手軸と縦軸を有する構造。
6=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.8125〜0.750の間である長手軸と縦軸を有する構造。
5=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.750〜0.6875の間である長手軸と縦軸を有する構造。
4=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.6875〜0.625の間である長手軸と縦軸を有する構造。
3=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.625〜0.5625の間である長手軸と縦軸を有する構造。
2=円形の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.5625〜0.523の間である長手軸と縦軸を有する構造。
1=構造の中心を通って走り、一方の軸が他方の軸の長さの0.523〜0.500の間である長手軸と縦軸と定義される楕円形。
球形様構造の形態スケール:
10=球形はそれぞれ構造の中心を通って走り、等しい長さであるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造である。
9=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも1つの長さの0.9999〜0.9357の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
8=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.9357〜0.875の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
7=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.875〜0.8125の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
6=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.8125〜0.750の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
5=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.750〜0.6875の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
4=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.6875〜0.625の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
3=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.625〜0.5625の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
2=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.5625〜0.523の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
1=構造の中心を通って走り、軸の1つが他の軸の少なくとも一方または双方の長さの0.523〜0.500の間であるX軸及びY軸及びZ軸を有する構造。
本明細書で提供される所与のラットES細胞はラットの胚発生の任意の段階でラット胚から得ることができる。ラットの胚発生の代表的な段階を表1にて以下でまとめる。ラットES細胞を導出するのに採用されるラット胚は、桑実胚期の胚、胚盤胞期の胚または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚であることができる。従って特定の実施形態では、採用されるラット胚は5及び7のWitschiの段階であるまたはその間である。他の実施形態では、採用されるラット胚は5、6または7のWitschiの段階である。
ラットES細胞は以下を特徴とする:
(i)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせを含むラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(ii)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせ含むラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現;
(iii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(iv)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(v)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(vi)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現;
(vii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(viii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(ix)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(x)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(xi)パート(i)〜(x)のラットES細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ;
(xii)列記された多能性マーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18について表15で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の多能性のランク付けの欄を参照;
(xiii)列記された中胚葉マーカーの少なくとも2、3または4について表15で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の中胚葉のランク付けの欄を参照;
(xiv)列記された内胚葉マーカーの少なくとも2、3、4、5または6について表15で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の内胚葉のランク付けの欄を参照;
(xv)列記された神経マーカーの少なくとも2または3について表15で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の神経のランク付けの欄を参照;
(xvi)列記された栄養外胚葉マーカーについて表15で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照;
(xvii)表15で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び/または栄養外胚葉マーカーの1以上(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30)の相対的な発現レベル。
(xviii)表15で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
(xix)xii〜xiixで示された署名の任意の組み合わせ;及び/または
(xx)i〜xiixで示された署名の任意の組み合わせ。
本明細書で開示されるラットES細胞を得るために種々の方法が提供される。特定の実施形態では、そのような方法は、(a)フィーダー細胞層と単離されたラット胚性幹(ES)細胞の集団とを含む試験管内培養物を提供することと、(b)単離されたラットES細胞の多能性及び/または分化全能性を維持するのに十分である条件下で試験管内で培養することと含む。そのような方法はそれによってラットES細胞集団及び/またはラットES細胞株の増殖を可能にする。
種々の方法及び組成物で採用される培養培地はラットES細胞を維持するであろう。用語「維持すること」及び「維持」は本明細書でまとめられるラットES細胞の特徴または表現型の少なくとも1以上の安定的な保護を指す。そのような表現型には多能性及び/または分化全能性、細胞の形態、遺伝子発現のプロファイル及び本明細書で記載されるラット幹細胞の他の機能的な特徴を維持することを挙げることができる。用語「維持する」はまた、幹細胞の増殖または培養される幹細胞の数の増加を包含することもできる。用語はさらに、幹細胞が分裂し、数を増やし続けても増やし続けなくてもよい一方で、幹細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件を熟考する。
ラットの胚性幹(ES)細胞株を生成する方法が提供される。そのような方法は、(a)第1のフィーダー細胞層と桑実胚期の胚、胚盤胞期の胚、または桑実胚期の胚と胚盤胞期の胚の間での発生段階のラット胚とを試験管内で培養し、その際、ラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットES細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子(LIF)またはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含むこと;及び(b)ラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第2のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移し、ラットES細胞の多能性を維持し、マウスのLIFまたはその活性のある変異体若しくは断片を有する培地を含む条件下で該増殖物を培養し、それによってラットES細胞株を樹立することとを含む。種々の方法はさらにラットES細胞株の細胞を試験管内で継代し、培養することを含み、その際、各その後の培養は、ラットES細胞の多能性を維持し、マウスのLIFまたはそのある変異体若しくは断片を有する培地を含む条件下でフィーダー細胞層上にてラットES細胞を培養することを含む。そのような方法によって作製されたラットES細胞株も提供される。
さらに提供されるのはラットの胚性幹細胞株を維持するまたは培養する方法である。方法は、フィーダー細胞層とラットES細胞株を試験管内で培養することを含み、その際、培養条件は、ラット胚性幹(ES)細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子(LIF)またはその活性のある変異体または断片を有する培地を含む。そのような方法は上記でまとめられたような培養培地及びフィーダー細胞層を採用する。一実施形態では、ラットES細胞株は少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50回以上継代することができる。特定の実施形態では、標的とされた遺伝子組換えの標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にてラットES細胞株を少なくとも11回まで継代することができる。
(a)ラットES細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットES細胞株のゲノムが子孫に伝達されることを意味する、生殖系列適格性を有する;
(b)ラットES細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットES細胞株のゲノム内の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達されることを意味する、標的とされた遺伝子組換えに続いて生殖系列適格性を有する;
(c)試験管内で多能性を有する;
(d)試験管内で分化全能性を有する;
(e)試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
(f)試験管内で培養すると試験管内でフィーダー細胞層上に置かれた際、球形様のコロニーを形成する;
(g)白血病阻害因子(LIF)を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のLIFを含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する;
(h)フィーダー細胞層を含み、培養培地がマウスLIFまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する;
(i)以下を特徴とする分子署名を含む:
(i)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせを含むラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(ii)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせ含むラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現;
(iii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(iv)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(v)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(vi)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現;
(vii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(viii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(ix)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(x)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(xi)パート(i)〜(x)のラットES細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ;
(xii)列記された多能性マーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18について表15で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の多能性のランク付けの欄を参照;
(xiii)列記された中胚葉マーカーの少なくとも2、3または4について表15で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の中胚葉のランク付けの欄を参照;
(xiv)列記された内胚葉マーカーの少なくとも2、3、4、5または6について表15で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の内胚葉のランク付けの欄を参照;
(xv)列記された神経マーカーの少なくとも2または3について表15で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の神経のランク付けの欄を参照;
(xvi)列記された栄養外胚葉マーカーについて表15で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照;
(xvii)表15で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び/または栄養外胚葉マーカーの1以上(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30)の相対的な発現レベル。
(xviii)表15で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
(xix)xii〜xiixで示された署名の任意の組み合わせ;及び/または
(xx)i〜xiixで示された署名の任意の組み合わせ;
(j)F0ラットを作出する能力を有する;
(k)継代培養され、未分化状態を維持することが可能である;
(l)正常なラット細胞と同じ数の染色体を有する;及び/または
(m)傍分泌LIFのシグナル伝達を必要とせずに試験管内で多能性を維持する;
(n)多能性を維持しながらそれらが無限に分裂することを意味する、自己複製能を有する。
本明細書で提供されるラットES細胞及びラットES細胞株はキットまたは製造物品の中に含有されることができる。特定の実施形態では、キットまたは製造物品は本明細書で開示されるES細胞株またはES細胞集団のいずれかを含む。キットはさらに、ラットES細胞の多能性を維持する培地を含む、ラットES細胞を維持する培養培地を含むことができる。そのような培地は、本明細書のどこかでさらに詳細に議論されるように、マウスLIFまたはその活性のある変異体または断片を有する培養培地を含むことができる。キット内の培地はさらに、MEK阻害剤及びGSK3阻害剤を含むことができる、または代わりにキット内の培地はさらに、MEK阻害剤及びGSK3阻害剤から成る阻害剤の組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、キット内の培地はPD0325901を含むMEK阻害剤及び/またはCHIR99021を含むGSK3阻害剤を含む。本明細書で議論される種々の培地のいずれかをキット内に含有することができる。
本明細書で開示される種々のラットES細胞及びラットES細胞株は少なくとも1つの標的とされた遺伝子組換えを含有するように操作することができる。従って、本明細書で開示されるような単離されたラット胚性幹(ES)細胞を遺伝子組換えするために種々の方法が提供される。方法は、本明細書で開示される単離されたラットES細胞のゲノムに標的とされた遺伝子組換えを導入して遺伝子組換えしたラットES細胞を形成することを含む。標的とされた遺伝子組換えは、たとえば、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、突然変異またはそれらの組み合わせを含むラットESのゲノムへの操作を含むことができる。一実施形態では、標的とされた遺伝子組換えはラットES細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの挿入を含む。本明細書で使用されるとき、配列への参照における「非相同の」は、異種を起源とする配列、または同種に由来するならば、意図的なヒトの介入によって組成及び/またはゲノム遺伝子座におけるネイティブな形態から実質的に操作される配列である。
本明細書で開示される方法及び組成物にて種々の選択マーカーを使用することができる。そのような選択マーカーは、たとえば、G418、ハイグロマイシン、ブラストシジン、プロマイシンまたはネオマイシンのような抗生剤に対する耐性を付与することができる。そのような選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neor)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hygr)、プロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、及びブラスチシジンSデアミナーゼ(bsrr)が挙げられる。さらに他の実施形態では、選択マーカーは誘導性プロモータに操作可能に連結され、選択マーカーの発現は細胞にとって毒性である。そのような選択マーカーの非限定例には、キサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、ヒポキサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)が挙げられる。たとえば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるSanterreら、(1984)、Gene、30:147−56;Joyner(1999)、The Practical Approach Series,293;Santerreら、(1984)、Gene、30:147−56;Bernardら、(1985)、Exp.Cell Res.158:237−43;Giordano及びMcAllister、(1990)、Gene,88:285−8;Izumiら、(1991)、Exp.Cell Res.197:229−33)を参照のこと。特定の実施形態では、neoR選択可能マーカーは、参照によって本明細書に組み入れられるBeckら、(1982)、Gene,19:327−36のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子である。neoR選択マーカーはそれぞれ参照によって本明細書に組み入れられるUS7,205,148または6,596,541にて使用されたものである。
本明細書で提供される方法は、標的とされた遺伝子組換えを行うのに必要とされるような種々の成分を含む1以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの構築物を細胞に導入することを含む。「導入すること」は配列が細胞の内部へのアクセスを獲得するような方法で細胞に配列(ポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を提示することを意味する。本明細書で提供される方法は、標的とされたゲノム統合系の成分を細胞に導入する特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチドが少なくとも1つの細胞の内部へのアクセスを獲得することのみに依存する。種々の細胞型にポリヌクレオチドを導入する方法は当該技術で既知であり、それには、安定的な形質移入法、一時的な形質移入法及びウイルスが介在する方法が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法には、エレクトロポレーション、細胞質内注入、ウイルス感染(アデノウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスのベクターを含む)、形質移入、脂質介在性の形質移入及び/またはNucleofaction(商標)が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、Stadtfeldら、(2009)、Nature Methods、6(5):329−330;Yusaら、(2009)、Nat.Methods、6:363−369;Woltjenら、(2009)、Nature、458,766−770を参照のこと。そのような方法には、生体外の形質移入によるようなDNAの直接送達(Wilsonら,Science,244:1344−1346,1989,Nabel及びBaltimore,Nature326:711−713,1987)、注入による任意でFugene6(Roche)またはLipofectoamineによる(Invitorogen)(それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるUS5,994,624;5,981,274;5,945,100;5,780,448;5,736,524;5,702,932;5,656,610;5,589,466及び5,580,859)、微量注入を含む(参照によって本明細書に組み入れられるHarland及びWeintraub,J.Cell Biol.,101:1094−1099,1985;US5,789,215);エレクトロポレーションによる(参照によって本明細書に組み入れられるUS5,384,253;Tur−Kaspaら,Mol.Cell Biol.,6:716−718,1986;Potterら,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,81:7161−7165,1984);リン酸カルシウム沈殿による(Graham及びVan Der Eb,Virology,52:456−467,1973;Chen及びOkayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745−2752,1987;Rippeら,Mol.Cell Biol.,10:689−695,1990);DEAEデキストラン、その後ポリエチレングリコールを用いることによる(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188−1190,1985);直接音波負荷による(Fechheimerら,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,84:8463−8467,1987);リポソーム介在性の形質移入による(Nicolau及びSene,Biochim.Biophys.Acta,721:185−190,1982;Fraleyら,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,76:3348−3352,1979;Nicolauら,Methods Enzymol.,149:157−176,1987;Wongら,Gene,10:87−94,1980;Kanedaら,Science,243:375−378,1989;Katoら,Biol.Chem.,266:3361−3364,1991);及び受容体が介在する形質移入(Wu及びWu,Biochemistry,27:887−892,1988;Wu及びWu,J.Biol.Chem.,262:4429−4432,1987);及びそのような方法の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されず、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み入れられる。
標的とされた遺伝子組換えをゲノムに安定的に組み入れているラットES細胞を選択し、維持するために種々の方法が提供される。非限定の一実施例では、非相同のポリヌクレオチドをラットES細胞に導入する場合、方法は、(a)ラットES細胞の試験管内集団を提供することと、(b)ラットES細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも1つのラットES細胞に導入することと、(c)交互に入れ替える第1と第2の培養培地にてラットES細胞集団を試験管内で培養することとを含むことができ、その際、第1の培養培地は第1の時間の間有効量の選択剤を含み、第2の培養培地は選択剤を含まず、試験管内培養の条件は多能性または分化全能性を維持し、それによって非相同のポリヌクレオチドをゲノムに安定的に統合しているラットES細胞を選択する。標的とされた遺伝子組換えを有するラットES細胞を所与の集団にて選択することができる種々の方法はラットES細胞が多能性を維持するのを可能にする試験管内培養の系を採用することができる。従って、本明細書で議論される試験管内培養の培地及びフィーダー細胞のいずれかを採用することができる。
(a)ラットES細胞がラット宿主胚に移植されると、ラットES細胞株のゲノム内の標的とされた遺伝子組換えが子孫に伝達されることを意味する、標的とされた遺伝子組換えに続いて生殖系列適格性を有する;
(b)試験管内で多能性を有する;
(c)試験管内で分化全能性を有する;
(d)試験管内で培養するとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
(e)試験管内で培養すると試験管内でフィーダー細胞層上に置かれた際、球形様のコロニーを形成する;
(f)白血病阻害因子(LIF)を発現するように遺伝子組換えされないフィーダー細胞層を含み、培養培地が十分な濃度のLIFを含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する;
(g)フィーダー細胞層を含み、培養培地がマウスLIFまたはその活性のある変異体若しくは断片を含む条件下で試験管内で培養すると多能性を維持する;
(h)以下を特徴とする分子署名を含む
(i)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせを含むラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(ii)接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせ含むラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現;
(iii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(iv)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表14で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(v)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現;
(vi)表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現;
(vii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(viii)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表13で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(ix)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の1以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(x)F1H4マウスES細胞と比べたとき、表12で示されるようなラットES細胞特異的な遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50以上の発現における少なくとも20倍の上昇;
(xi)パート(i)〜(x)のラットES細胞特異的な遺伝子の発現の任意の組み合わせ;
(xii)列記された多能性マーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18について表15で示されるような多能性マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の多能性のランク付けの欄を参照;
(xiii)列記された中胚葉マーカーの少なくとも2、3または4について表15で示されるような中胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の中胚葉のランク付けの欄を参照;
(xiv)列記された内胚葉マーカーの少なくとも2、3、4、5または6について表15で示されるような内胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の内胚葉のランク付けの欄を参照;
(xv)列記された神経マーカーの少なくとも2または3について表15で示されるような神経マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の神経のランク付けの欄を参照;
(xvi)列記された栄養外胚葉マーカーについて表15で示されるような栄養外胚葉マーカーの相対的な発現レベル。相対的な発現レベルについては表15の栄養外胚葉のランク付けの欄を参照;
(xvii)表15で示されるような多能性マーカー、中胚葉マーカー、内胚葉マーカー、神経マーカー及び/または栄養外胚葉マーカーの1以上(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30)の相対的な発現レベル。
(xviii)表15で示されるマーカーのそれぞれの相対的な発現レベル。
(xix)xii〜xixで示された署名の任意の組み合わせ;及び/または
(xx)i〜xixで示された署名の任意の組み合わせ;
(i)F0ラットを作出する能力を有する;
(j)継代培養され、未分化状態を維持することが可能である;
(k)正常なラット細胞と同じ数の染色体を有する;
(l)傍分泌LIFのシグナル伝達を必要とせずに試験管内で多能性を維持する;及び/または
(m)多能性を維持しながらそれらが無限に分裂することを意味する、自己複製能を有する。
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」及び「核酸断片」は本明細書では相互交換可能に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、任意で合成の、非天然のまたは変化させたヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーである。DNAのポリマーの形態でのポリヌクレオチドは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはそれらの混合物の1以上の断片から構成され得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在する分子及び合成の類似体及びこれらの組み合わせ含むデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム及びループ構造等を含むが、これらに限定されない配列のあらゆる形態も包含する。
本明細書で提供される種々の方法及び組成物を用いて遺伝子組換えしたラットを生成することができる。そのような方法は一般に、(a)本明細書で開示される単離されたラットES細胞のゲノムに標的とされた遺伝子組換えを導入して遺伝子組換えを有するラットES細胞を形成することと、(b)遺伝子組換えを有する遺伝子組換えしたラットES細胞の少なくとも1つをラット宿主胚に移植してF0胚を作出することと、(c)F0胚を代理母に移植することと、(d)F0胚を代理母にて出産予定日まで妊娠維持させることと、(e)遺伝子組換えを有するF0ラットを特定することとを含む。
一部の実施形態では、標的とされた遺伝子組換えを有するラットES細胞は、相当する生物に由来する前桑実胚期の胚、たとえば、8細胞期のマウス胚に導入される。たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるUS7,576,259,US7,659,442,US7,294,754,及びUS2008−0078000A1を参照のこと。他の実施形態では、ドナーのラットES細胞は宿主胚の4細胞期、8細胞期にて移植され得る。
開示されたLIFポリペプチド、特にマウスLIFポリペプチドの活性のある変異体及び断片が本明細書で提供される。「変異体」は実質的に類似の配列を指す。本明細書で使用されるとき、「変異体ポリペプチド」は、ネイティブのタンパク質のN末端及び/またはC末端における1以上のアミノ酸の欠失(いわゆる切り詰め);ネイティブのタンパク質の1以上の内部部位における1以上のアミノ酸の欠失及び/または付加;またはネイティブのタンパク質での1以上の部位における置換によるネイティブのタンパク質に由来するポリペプチドを意味するように意図される。変異体ポリペプチドはネイティブのポリペプチドの所望の生物活性を持ち続け、すなわち、それらはラット及び/またはマウスの胚性幹細胞の分化を阻害し、幹細胞の自己複製能に寄与する。本明細書で開示されるポリペプチド(すなわち、配列番号1またはSwissProt受入番号P09056)の変異体は通常、参照配列に対して少なくとも約65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性を有するであろう。
実施例1:ラットES細胞の導出
rESCの特徴づけ。図1にて示すように、rESCはディッシュにてごく普通に分離し、浮いている小型の球形のコロニーとして増殖する(近接撮影、図4)。B、C、F、G:rESCはOct−4(図2A)及びSox2(図2B)を含む多能性マーカーを発現し、高レベルのアルカリホスファターゼを発現する(図3、左のパネル)。DA株の核型は42X,Yである(図4、右のパネル)。rESCは四倍体になることが多いので、分裂中期の染色体の広がりを数えることによって細胞株を事前にスクリーニングし、次いで最も正常なカウントを持つ細胞株の核型を正式に調べた。
ACIの胚盤胞は市販の過排卵メスから得た;DAの胚盤胞は商業的に得た凍結8細胞期胚から培養した。酸タイロードによって透明帯を取り除き、有糸分裂上不活化されたMEF上に胚盤胞を置いた。増殖物を採取し、常法を用いて増殖させた。胚盤胞はすべてプレートに入れ、2i培地を用いて培養し、増殖させた(参照によって本明細書に組み入れられるLiら、(2008)、Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts,Cell、135:1299−1310)。
胚盤胞の注入及び生殖系列を介したrESCゲノムの伝達によってキメララットを作出した。親ACI.G1rESCを用いた胚盤胞の微量注入によって作出したキメラを図5に示す。図5にて星印(*)で標識したACI/SDキメラを父親とするアルビノ同腹仔を伴ったF1アグーチの仔を図6にて示す。
rRosa26遺伝子座はマウスにおけるように同じ間隔でSetd5及びThumpd3の間にある。rRosa26遺伝子座(図7、パネルB)はmRosa26遺伝子座(図7、パネルA)とは異なる。mRosa26の転写物は2または3のエクソンから成る。ラットの遺伝子座はマウスエクソン1に相同なエクソン(Ex1a)に加えて第2のエクソン1(Exb1b)を含有する。ラットでは第3のエクソンが同定されている。rRosa26対立遺伝子の標的化は図7(下)に示され、DAのrESCに由来するゲノムDNAを用いたPCRによって5kbの相同性アームがそれぞれクローニングされた。標的とされた対立遺伝子はrRosa26イントロンにおける117bpの欠失を置き換えるSA−lacZ−hUb−neoカセットを含有する。
過排卵プロトコール、ラット
0日目:妊娠メスウマ血清を注射:IP、20U(0.4ml)
1日目:動きなし
2日目:(46時間後):hCG、IP、50U(1ml)による注射
−単一のメス交配を設定
3日目:膣栓のチェック。メスに膣栓があった。これが0.5日目
6日目(e3.5):メスを安楽死させ、胚を流し出した。
0日目
(1)メスラットをCO2で安楽死させた。
(2)70%エタノールで前面腹部を拭き取り、ハサミを用いて前面腹壁を開き、内臓をさらした。
(3)卵管及び子宮角を取り出し、温かいN2B27培地を含有する組織培養ディッシュに入れた。多量の血液を出来るだけ洗い流し、N2B27を伴った新しいディッシュに移した。
(4)1mlの注射器と鈍い27gの針を用いて子宮角及び卵管から培地を流し出して胚盤胞を培地に押し出した。
(5)口ピペットで胚盤胞を回収し、KSOM+2i(1μMPD0325901,3μMのCHIR99021)を含有する胚培養ディッシュに移す。KSOMはMilliporeによって製造された培養培地である。カタログ番号はMR−106−Dである。
(6)37℃、7.5%CO2にて一晩培養した。
0日目
(1)M2培地にて凍結8細胞期胚(商業的に入手)を融解した。
10分間、室温で培養した。
(2)KSOM+2iに移し、一晩培養した。
1日目
(1)空洞を作った胚を2i培地に移し、一晩培養する。
(2)KSOM+2iにて空洞のない胚を培養し続けた。
2日目
(1)残りの胚すべてを2i培地に移した(それらが空洞を作っていようといまいと)。
(2)一晩培養した;早期の胚を2i培地にて培養し続けた。
3日目
(1)胚を30〜60秒間、酸タイロードに移して透明帯を取り除いた。
(2)2i培地で3回、胚を洗浄して酸タイロードを取り除いた。
(3)96穴のフィーダープレートの別々のウェル(ウェルは有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含有する)に各胚を分配した。
(4)2i培地で一晩培養した。
4〜5日目
(1)増殖物(細胞の不定形で未分化の塊)の存在についてプレートの胚をモニターした。増殖物はプレートの胚のほぼ2倍の大きさである場合いつでも移せる。
(2)毎日:費やした培地を微量ピペットで取り除き、新鮮な2i培地で置き換える。
(3)増殖物を新しいフィーダーウェルに移した:
a.費やした培地を取り除き、PBSでウェルを穏やかに洗浄する。
b.PBSを取り除き、30μlの0.05%トリプシンを加え、10分間インキュベートする。
c.30μlの2i+10%FBSを加えることによってトリプシン反応を停止した。
d.微量ピペットで細胞を穏やかに解離させ、ウェルの内容物全体を24穴フィーダープレートの新しいウェルに移した。これが継代1(P1)だった。
e.2i培地で一晩培養した。
5〜8日目(タイミングは各細胞株がどれくらい速く増殖するかに左右される)
(1)毎日培地を交換し(2i培地)、ESCの形態を持つコロニーの存在についてモニターした。
(2)コロニーが現れるとコロニーが約50%の集密度に増殖するまで培養し続けた。
(3)6穴ディッシュにて細胞株当たり1ウェルでフィーダー上に載せる前にトリプシン処理し、コロニーを継代した。これが継代2(P2)だった。
進行中
(1)ほぼ50%の集密度まで各細胞株を養い、モニタリングし続けた。
(2)いつものように細胞をトリプシン処理した。
(3)2i+10%FBSでトリプシンを止め;遠心分離によって細胞をペレットにした(Beckman−Coulter卓上遠心機で1200rpm、5分間)。
(4)上清を吸引し、400μlの凍結培地(70%2i,20%FBS,10%DMSO)にて細胞を穏やかに再浮遊させた。
(5)2つのバイアルに細胞を分配し、−80℃で凍結する。これが継代3(P3)だった。
(6)長期の保存には、バイアルを液体N2貯蔵に移した。
2i培地は表7にて以下のように調製した。
妊娠メスウマ血清性腺刺激ホルモン(PMSG)
ヒト妊娠尿絨毛性性腺刺激ホルモン(HCG)
メスラット(5〜12週齢)
オスラット(12週齢〜8ヵ月齢)、ケージ当たり1匹
注射器/針
6:00〜18:00に照明のつく動物室
手順:
1日目:8:00〜10:00AM
20IUのPMSG(0.4ml)をIPでメスに注射する。
使用しなかったPMSGを捨てる。
3日目:8:00〜10:00AM(PMSG注射の48時間後)
50IUのHCG(1ml)をIPでメスに注射する。
交配ケージにおけるオス当たりメス1匹を入れる。
使用しなかったHCGを捨てる。
4日目:8:00〜10:00AM(HCG注射の24時間後)
膣栓についてメスをチェックする。
ホルモンの供給者
PMSG:Sigma#G−4877(1000IU)。50IU/mlの最終[]にPBSにて再懸濁する。1mlのアリコートで−20℃にて保存。
HCG:Sigma#CG−5(5000IU)。50IU/mlの最終[]にPBSにて再懸濁する。1mlのアリコートで−20℃にて保存。
本明細書で生成されたラットES細胞株の核型を分析した、結果を表8〜11にて要約する。
1.エレクトロポレーションの24〜48時間前にラットES細胞を継代した。
2.エレクトロポレーションの24時間前に培地をRVG2i+ROCKi(10μMのY−27632)に交換した。
3.トリプシン処理の30分前に培地を交換した。
4.エレクトロポレーションされるDNAを等分した。
5.DNAを室温で>10分温めた。
6.DNAを62℃で5分間加熱した。DNAを氷上に置いた。
7.トリプシン処理した細胞
a.浮かんでいるコロニーを回収した。プレートを洗浄して浮かんでいるものを出来るだけ多く回収した。
b.750rpmで3分間、コロニーをペレットにした。
c.5〜10mlのPBSでペレットを1回洗浄した及び再スピン/ペレット
d.上清を吸引した;500λのトリプシン、0.05%+1%ニワトリ血清を加えた。
i.試験管当たり10cmプレート1枚分のコロニーを超えてプールしなかった。トリプシン処理の間に試験管の底に多すぎるコロニーが詰め込まれると、それらは凝集し、細胞のほとんどが失われるであろう。
e.37℃で4分間。コロニーを数回ピペッティングして凝集を出来るだけ抑える。
f.工程を1〜2回繰り返す;37℃で4分間。
g.500λのRVG2i+10%FBSでトリプシンを止めた。
8.細胞をペレットにした:1200rpmで5分間。
9.10mlのPBSに細胞を再浮遊させた。20λの2つのアリコートを数えて総細胞数を決定する。
10.細胞をペレットにした(5分間/1200rpm);総細胞数と再浮遊総容量を計算して正しい細胞濃度を達成する(標的#75μlのEP緩衝液)。
11.最少容量のEP緩衝液に再浮遊させた;総容量を測定し、EP緩衝液で目標容量に合わせる。エレクトロポレーション用緩衝液はMilliporeによって販売されている。カタログ番号はES−003−Dである。参照によって本明細書に組み入れられるValenzuelaら、(2003)、Nature Biotechnology、21:652−659を参照のこと。
12.50λのDNAに75λの細胞を加える。125λの細胞/DNA溶液をBTX48穴キュベットのウェルの1つに移す。
a.同じカラムにおける空のウェルを125λのEP緩衝液で満たす。
13.BTXエレクトロポレータにて1回キュベットをパルスした。
a.設定:400V;Ω;100μF(設定は変わり得る)
14.15分間キュベットを氷上に置き、回復させた。
15.細胞を取り出し5mlのRVG2i+10μMのROCKiに入れた。
16.20mlのRVG2i+10μMのROCKiを伴った15cmのプレートに加えた。プレートは2×neoR MEF(プロジェクトに応じて他のMEF)を有する。neoR選択可能マーカーは、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるBeckら、(1982)、Gene,19:327−36またはUS7,205,148または6,596,541のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子である。
17.37℃でインキュベートした。48時間後選択を開始する。
使用したROCK阻害剤はY−27632だった。
1.エレクトロポレーションの24〜48時間前にラットES細胞を継代した。
2.エレクトロポレーションの24時間前に培地をRVG2i+ROCKi(10μMのY−27632)に交換した。
3.トリプシン処理の30分前に培地を交換した。
4.エレクトロポレーションされるDNAを等分した。
5.DNAを室温で>10分温めた。
6.DNAを62℃で5分間加熱した。DNAを氷上に置いた。
7.トリプシン処理した細胞
h.浮かんでいるコロニーを回収した。プレートを洗浄して浮かんでいるものを出来るだけ多く回収した。
i.750rpmで3分間、コロニーをペレットにした。
j.5〜10mlのPBSでペレットを1回洗浄した及び再スピン/ペレット
k.上清を吸引した;500λのトリプシン、0.05%+1%ニワトリ血清を加える。
i.試験管当たり10cmプレート分1枚分のコロニーを超えてプールしなかった。トリプシン処理の間に試験管の底に多すぎるコロニーが詰め込まれると、それらは凝集し、細胞のほとんどが失われるであろう。
l.37℃で4分間。コロニーを数回ピペッティングして凝集を出来るだけ抑える。
m.工程1〜2を37℃で4回繰り返す。
n.500λのRVG2i+10%FBSでトリプシンを止めた。
8.細胞をペレットにした:1200rpmで5分間。
9.10mlのPBSに細胞を再浮遊させた。20λの2つのアリコートを数えて総細胞数を決定する。
10.細胞をペレットにした(5分間/1200rpm);総細胞数と再浮遊総容量を計算して正しい細胞濃度を達成する(標的#/75μlのEP緩衝液)。
11.最少容量のEP緩衝液に再浮遊させた;総容量を測定し、EP緩衝液で目標容量に合わせた。
12.50λのDNAに75λの細胞を加える。125λの細胞/DNA溶液をBTX48穴キュベットのウェルの1つに移す。
a.同じカラムにおける空のウェルを125λのEP緩衝液で満たす。
13.BTXエレクトロポレータにて1回キュベットをパルスした。
a.設定:400V;Ω;100μF(設定は変わり得る)
14.15分間キュベットを氷上に置き、回復させた。
15.細胞を取り出し5mlのRVG2i+10μMのROCKiに入れた。
16.20mlのRVG2i+10μMのROCKiを伴った15cmのプレートに加えた。プレートは2×neoR MEF(プロジェクトに応じて他のMEF)を有した。
17.37℃でインキュベートした。48時間後選択を開始する。
18.G418の選択プロトコールは以下のとおりだった:
a.2日目(EP後2番目の日):2i培地+75μg/mlのG418にて細胞をインキュベートした。
b.3日目:G418を含まない2i培地にて細胞をインキュベートした。
c.4日目:2i培地+75μg/mlのG418にて細胞をインキュベートした。
d.5日目:G418を含まない2i培地にて細胞をインキュベートした。
e.6日目:2i培地+75μg/mlのG418にて細胞をインキュベートした。
f.7日目:G418を含まない2i培地にて細胞をインキュベートした。
g.8日目:2i培地+75μg/mlのG418にて細胞をインキュベートした。
h.9日目:G418を含まない2i培地にて細胞をインキュベートした。
i.10日目:2i培地+75μg/mlのG418にて細胞をインキュベートした。
j.11日目:G418を含まない2i培地細胞をインキュベートした。
k.12日目:コロニーを採取してスクリーニングのために増殖させた。各コロニーを0.05%トリプシン+1%ニワトリ血清にて10分間解離させ、次いで、96穴フィーダープレートの1ウェルに入れた。
19.2i培地にて3日間コロニーを増殖させた。
20.クローンを1:1で継代し、新しい96穴フィーダープレートに入れた。
21.2i培地にて3日間コロニーを増殖させた。
22.各クローンについて、トリプシンにてコロニーを解離させた。各クローンの2/3を凍結し、−80℃で保存する。残りの1/3をラミニンプレート(10μg/mlのラミニンで被覆した96穴プレート)に入れた。
23.ラミニンプレートが集密になったら、クローンの遺伝子型分析のためにスクリーニング研究室に渡した。
表13に列記された遺伝子は、マウスES細胞における相当する遺伝子よりもラットES細胞にて20倍高いレベルで発現された。表12に列記された遺伝子は、マウスES細胞における相当する遺伝子よりもラットES細胞にて20倍低いレベルで発現された。
(項目1)
ACIまたはDAから選択される系統の単離されたラットES細胞であって、前記単離されたラットES細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達している及び伝達することが可能である、前記単離されたラットES細胞。
(項目2)
細胞がACIラットに由来する項目1に記載の単離されたラットES細胞。
(項目3)
細胞がダークアグーチ(DA)ラット2に由来する項目1または2に記載の単離されたラットES細胞。
(項目4)
細胞が正倍数体であり、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目1、2または3に記載の単離されたラットES細胞。
(項目5)
ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目4に記載の単離されたラットES細胞。
(項目6)
ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目4に記載の単離されたラットES細胞。
(項目7)
ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す項目1〜6のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目8)
ラットES細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目1〜8のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目9)
ラットES細胞が1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目1〜8のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目10)
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目4〜9のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目11)
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む項目9に記載の単離されたラットES細胞。
(項目12)
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目11に記載の単離されたラットES細胞。
(項目13)
(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードする少なくとも2コピーのポリヌクレオチドを含む項目12に記載の単離されたラットES細胞。
(項目14)
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目12に記載の単離されたラットES細胞。
(項目15)
ラットES細胞が、LIFポリペプチド、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目1〜14のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目16)
ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目1〜15のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目17)
細胞が多能性を維持するために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない項目1〜16のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目18)
細胞がオス(XY)ラットES細胞である項目1〜17のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目19)
細胞がメス(XX)ラットES細胞である項目1〜19のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目20)
ラットES細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にて少なくとも11回まで継代することができる項目1〜19のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目21)
ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する項目1〜20のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目22)
ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1またはそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない項目1〜21のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目23)
ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉マーカーを発現しない項目1〜22のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目24)
ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉マーカーを発現しない項目1〜23のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目25)
ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない項目1〜24のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目26)
細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目1〜25のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目27)
ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットESCに特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする項目1〜26のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞。
(項目28)
ラットES細胞の単離された集団であって、前記ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置くと球形様のコロニーを形成する、前記ラットES細胞の単離された集団。
(項目29)
ラットES細胞がACIラットに由来する項目28に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目30)
ラットES細胞がダークアグーチ(DA)ラットに由来する項目28に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目31)
ラットES細胞が、生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目28〜30のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目32)
ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目28〜31のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目33)
ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目28〜31のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目34)
ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す項目28〜31のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目35)
ラットES細胞が連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目28〜34のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目36)
ラットES細胞が1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含み、生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することができる項目28〜35のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目37)
標的とされた遺伝子組換えがラットのRosa26遺伝子座におけるものである項目36に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目38)
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目36に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目39)
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む項目36に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目40)
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーを含む項目39に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目41)
(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードする少なくとも2コピーのポリヌクレオチドを含む項目40に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目42)
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目40に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目43)
細胞が、LIFポリペプチド、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培養物におけるフィーダー細胞上に置かれると、球形様のコロニーを形成する項目28〜42のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目44)
細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する項目28〜43のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目45)
細胞が多能性を維持するために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない項目28〜44のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目46)
ラットES細胞がオス(XY)ラットES細胞である項目28〜44のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目47)
ラットES細胞がメス(XX)ラットES細胞である項目28〜44のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目48)
ラットES細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にて少なくとも11回まで継代することができる項目28〜47のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目49)
ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する項目28〜48のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目50)
ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1またはそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない項目28〜49のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目51)
ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉マーカーを発現しない項目28〜50のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目52)
ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉マーカーを発現しない項目28〜51のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目53)
ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない項目28〜52のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目54)
ラットES細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目28〜53のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目55)
ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットESCに特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする項目28〜54のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目56)
集団が少なくとも104個の細胞を含む項目28〜55のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目57)
ラットES細胞が、
a.ラットES細胞の少なくとも90%が正倍数体である;
b.ラットES細胞の少なくとも70%が少なくとも1つの多能性マーカーを発現し、少なくとも1つの多能性マーカーはOct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む;
c.ラットES細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットES細胞株のゲノムを子孫に伝達する;
d.ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
e.ラットES細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する;(f)ラットES細胞はGSK3阻害剤、MEK阻害剤、LIF及びLIFを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層を含む培地にて試験管内で培養すると多能性を維持する;
f.ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す;
g.傍分泌のLIFシグナル伝達を必要とすることなく、ラットES細胞が試験管内で多能性を維持する;
h.ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する;
i.ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する;
j.ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexolから選択される1以上の分化マーカーを発現しない;
k.ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない;
l.ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない;及び/または
m.ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない;を含む1以上の特徴を有する項目28〜56のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目58)
(a)ラットES細胞がラット胚盤胞に由来する、(b)ラットES細胞がラット桑実胚期の胚に由来する、及び/または(c)ラットES細胞株が過排卵ラットに由来する項目28〜57のいずれか1項に記載のラットES細胞の単離された集団。
(項目59)
フィーダー細胞層と、ラット胚性幹(ES)細胞の集団と、白血病阻害因子(LIF)、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地とを含む試験管内培養物であって、ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、ラットES細胞が球形様のコロニーを形成する、前記試験管内培養物。
(項目60)
ラットES細胞がフィーダー細胞層にゆるやかに接着する項目59または60に記載の試験管内培養物。
(項目61)
ラットES細胞が生殖系列を介してそのゲノムを伝達することが可能である項目59、60または61に記載の試験管内培養物。
(項目62)
ラットES細胞がACIラットに由来する項目59、60または61に記載の試験管内培養物。
(項目63)
ラットES細胞がダークアグーチ(DA)ラットに由来する項目59、60または61に記載の試験管内培養物。
(項目64)
ラットES細胞が生殖系列を介して標的とされた遺伝子組換えを伝達することが可能である項目59〜63のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目65)
ラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を含む項目64に記載の試験管内培養物。
(項目66)
ラットES細胞が少なくとも60%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目64に記載の試験管内培養物。
(項目67)
ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す項目59〜66のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目68)
ラットES細胞が、連続回のエレクトロポレーションに続いて標的とされた遺伝子組換えを子孫に伝達することが可能である項目59〜67のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目69)
ラットES細胞が、1以上、2以上または3以上の標的とされた遺伝子組換えを含む項目59〜68のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目70)
標的とされた遺伝子組換えが挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む項目69に記載の試験管内培養物。
(項目71)
標的とされた遺伝子組換えが細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む項目69に記載の試験管内培養物。
(項目72)
非相同のポリヌクレオチドが選択マーカーである項目71に記載の試験管内培養物。
(項目73)
(a)選択マーカーがプロモータに操作可能に連結された非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む、または(b)ラットES細胞が選択マーカーをコードする少なくとも2コピーのポリヌクレオチドを含む項目72に記載の試験管内培養物。
(項目74)
選択マーカーが野生型選択マーカーと比べて高い活性を有する項目72に記載の試験管内培養物。
(項目75)
細胞が多能性を維持するために傍分泌のLIFシグナル伝達を必要としない項目59〜74のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目76)
細胞がオス(XY)ラットES細胞である項目59〜75のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目77)
細胞がメス(XX)ラットES細胞である項目59〜75のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目78)
ラットES細胞が、標的とされた遺伝子組換えのその標的化効率または生殖系列伝達効率を低下させることなく、GSK3阻害剤及びMEK阻害剤を含む培地にて少なくとも11回まで継代することができる項目59〜77のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目79)
ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する項目59〜78のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目80)
ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexo1またはそれらの組み合わせから選択される1以上の多能性マーカーを発現しない項目59〜79のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目81)
ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉マーカーを発現しない項目59〜80のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目82)
ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉マーカーを発現しない項目59〜81のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目83)
ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない項目59〜82のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目84)
細胞が、Oct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせから選択される多能性マーカーを発現する項目59〜83のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目85)
ラットES細胞が、接着接合関連タンパク質(Ajap1)、クラウジン5(Cldn5)、Cdc42グアニンヌクレオチド交換因子9(Arhgef9)、カルシウム/カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼIV(Camk4)、エフリン−A1(Efna1)、EPH受容体A4(Epha4)、ギャップ接合タンパク質beta5(Gjb5)、インスリン様増殖因子結合タンパク質様1(Igfbpl1)、インターロイキン36beta(Il1f8)、インターロイキン28受容体alpha(Il28ra)、左右決定因子1(Lefty1)、白血病阻害因子受容体alpha(Lifr)、リソホスファチジン酸受容体2(Lpar2)、ニューロンペントラキシン受容体(Ntm)、タンパク質チロシンホスファターゼ−非受容体型18(Ptpn18)、尾型ホメオボックス2(Cdx2)、フィブロネクチンIII型及びアンキリン反復ドメイン1(Fank1)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、フォークヘッドボックスE1(甲状腺転写因子2)(Foxe1)、YRPWモチーフ2に関連したヘアリー/エンハンサ−オブ−スプリット(Hey2)、リンパエンハンサ−結合因子1(Lef1)、Sal−様3(ショウジョウバエ)(Sall3)、SATBホメオボックス1(Satb1)、miR−632、またはそれらの組み合わせの1以上から選択されるラットESCに特異的な遺伝子の1以上の発現を特徴とする項目59〜84のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目86)
LIFの濃度が50U/ml〜150U/mlである項目59〜84のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目87)
LIFの濃度が100U/mlである項目59〜85のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目88)
LIFがマウスに由来するまたは配列番号1に対して少なくとも92%の配列同一性を含む項目59〜87のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目89)
ラットES細胞が、傍分泌LIFのシグナル伝達を必要とせずに多能性を維持することが可能である項目59〜88のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目90)
フィーダー細胞層がLIFを発現するように遺伝子組換えされない項目59〜89のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目91)
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む項目59〜90のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目92)
MEK阻害剤がPD0325901を含む項目59〜91のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目93)
GSK-3阻害剤がCHIR99021を含む項目59〜92のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目94)
ラットES細胞の集団がラット胚盤胞期の胚またはラット桑実胚期の胚に由来する項目59〜93のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
(項目95)
胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚がさらにラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を含む項目94に記載の試験管内培養物。
(項目96)
ラットES細胞の集団がラットES細胞の不定形で未分化の塊の単離された増殖物を含む項目94に記載の試験管内培養物。
(項目97)
ラットの胚性幹(ES)細胞株の生成方法であって、(a)フィーダー細胞層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養することと、(b)ラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を第2のフィーダー細胞層を十分に含む試験管内培養物に移し、マウス白血病阻害因子(LIF)またはマウスLIFの活性のある変異体を有する培地を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットES細胞の多能性を維持し、それからラットES細胞株を樹立することとを含み、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、培養条件はラットES細胞の多能性を維持し、マウス白血病阻害因子(LIF)または配列番号1に対して少なくとも91%の配列同一性を有し、且つLIF活性を有する配列、及びGSK3阻害剤及びMEK阻害剤を有する培地を含む、前記方法。
(項目98)
ラットES細胞株が少なくとも5回継代される項目97に記載の方法。
(項目99)
ラットES細胞株が少なくとも10回継代される項目97または98に記載の方法。
(項目100)
培地が約50U/mL〜約150U/mLのマウスLIFを含む項目97、98または99に記載の方法。
(項目101)
培地が約100U/mLのマウスLIFを含む項目97〜100のいずれか1項に記載の方法。
(項目102)
フィーダー細胞層がLIFを発現するように遺伝子組換えされない項目97〜101のいずれか1項に記載の方法。
(項目103)
フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む項目97〜102のいずれか1項に記載の方法。
(項目104)
MEK阻害剤がPD0325901を含む項目97〜103のいずれか1項に記載の方法。
(項目105)
GSK-3阻害剤がCHIR99021を含む項目97〜104のいずれか1項に記載の方法。
(項目106)
(a)ラットES細胞株がACIラットに由来するまたはダークアグーチ(DA)ラットに由来する;(b)ラットES細胞株が桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する;及び/または(c)ラットES細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期のラット胚に由来する項目97〜105のいずれか1項に記載の方法。
(項目107)
培地がさらに、FGF受容体阻害剤、ROCK阻害剤またはALK阻害剤の少なくとも1つを含む項目97〜106のいずれか1項に記載の方法。
(項目108)
FGF受容体阻害剤がPD184352を含み、ROCK阻害剤がY−27632を含み、またはALK阻害剤がA−83−01を含む項目107に記載の方法。
(項目109)
少なくとも1つのラットES細胞が少なくとも3%の標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率を有する項目97〜108のいずれか1項に記載の方法。
(項目110)
標的とされた遺伝子組換えの生殖系列伝達効率が少なくとも60%である項目97〜109のいずれか1項に記載の方法。
(項目111)
そのゲノムの中に非相同のポリヌクレオチドを安定的に組み入れているラットの胚性幹(ES)細胞の選択方法であって、(a)ラットES細胞の試験管内集団を提供することと、(b)前記ラットES細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドを少なくとも1つのラットES細胞に導入することと、(c)交互に入れ替える第1と第2の培養培地にて前記ラットES細胞集団を試験管内で培養し、それによってそのゲノムの中に前記非相同のポリヌクレオチドを安定的に統合しているラットES細胞を選択することとを含み、その際、前記第1の培養培地は第1の期間、有効量の選択剤を含み、前記第2の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、前記方法。
(項目112)
第1の培養培地と第2の培養培地が24時間ごとに交互に入れ替えられる項目111に記載の方法。
(項目113)
選択マーカーが抗生剤への耐性を付与する項目111または112に記載の方法。
(項目114)
抗生剤がG418を含む項目111〜113のいずれか1項に記載の方法。
(項目115)
選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neor)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hygr)、プロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ(puror)、ブラスチシジンSデアミナーゼ(bsrr)、キサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−k)またはそれらの組み合わせを含む項目111〜114のいずれか1項に記載の方法。
(項目116)
(a)選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び/または(b)選択マーカーの複数のコピーがラットES細胞のゲノムに安定的に組み込まれる項目111〜115のいずれか1項に記載の方法。
(項目117)
選択マーカーが非弱毒化選択マーカーである項目116に記載の方法。
(項目118)
単離されたラット胚性幹(ES)細胞の遺伝子組換え方法であって、項目1〜58のいずれか1項に記載の単離されたラットES細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えしたラットES細胞を形成することを含む、前記方法。
(項目119)
遺伝子組換えしたラットの作製方法であって、
(a)項目1〜58のいずれか1項に記載の単離されたラット胚性幹(ES)細胞のゲノムに非相同のポリヌクレオチドを導入して遺伝子組換えを有するラットES細胞を形成することと;
(b)標的とされた遺伝子組換えを含むラットES細胞の少なくとも1つをラット宿主胚に導入してF0胚を作出することと;
(c)F0胚を代理母に移植することと;
(d)代理母にてF0胚を出産予定日まで妊娠維持させることと;
(e)標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットを特定することとを含む、前記方法。
(項目120)
オスF0ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるF1子孫を作出することをさらに含む項目119に記載の方法。
(項目121)
オスF0ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるF1子孫を作出することをさらに含む項目120に記載の方法。
(項目122)
F1子孫のオスラットをF1子孫のメスラットと交配させ、遺伝子組換えについてホモ接合体であるF2子孫を得ることをさらに含む項目119に記載の方法。
(項目123)
遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも3%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する項目119〜122のいずれか1項に記載の方法。
(項目124)
遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも10%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する項目119〜123のいずれか1項に記載の方法。
(項目125)
遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも60%が遺伝子組換えをF1子孫に伝達する項目119〜124のいずれか1項に記載の方法。
(項目126)
遺伝子組換えしたラットES細胞がラット宿主胚と同じラット系統に由来する項目119〜125のいずれか1項に記載の方法。
(項目127)
遺伝子組換えしたラットES細胞がラット宿主胚と異なるラット系統に由来する項目119〜127のいずれか1項に記載の方法。
(項目128)
集団におけるラットES細胞が、
(a)ラットES細胞の少なくとも90%が正倍数体である;
(b)ラットES細胞の少なくとも70%が少なくとも1つの多能性マーカーを発現し、前記少なくとも1つの多能性マーカーはOct−4、Sox2、アルカリホスファターゼまたはそれらの組み合わせを含む;
(c)ラットES細胞の集団に由来する細胞が、ラット宿主胚と組み合わせられるとラットES細胞株のゲノムを子孫に伝達する;
(d)ラットES細胞が試験管内で培養されるとフィーダー細胞層にゆるく接着する;
(e)ラットES細胞が試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると、球形様のコロニーを形成する;
(f)ラットES細胞がGSK3阻害剤と、MEK阻害剤と、LIFと、LIFを発現するように遺伝子組換えされていないフィーダー細胞層とを含む培地にて試験管内で培養されると多能性を維持する;
(g)ラットES細胞が少なくとも2%の相同組換えの標的化効率を示す;
(h)傍分泌のLIFシグナル伝達を必要とすることなく、ラットES細胞が試験管内で多能性を維持する;
(i)ラットES細胞の少なくとも70%が正倍数体であり、試験管内でフィーダー細胞層上に置かれると球形様のコロニーを形成する;
(j)ラットES細胞が、Dnmt3L、Eras、Err−beta、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受容体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの多能性マーカーを発現する;
(k)ラットES細胞が、c−Myc、Ecat1、Rexolから選択される1以上の分化マーカーを発現しない;
(l)ラットES細胞が、Brachyury、Bmpr2またはそれらの組み合わせから選択される1以上の中胚葉性マーカーを発現しない;
(m)ラットES細胞が、Gata6、Sox17、Sox7またはそれらの組み合わせから選択される1以上の内胚葉性マーカーを発現しない;及び/または
(n)ラットES細胞が、Nestin、Pax6またはそれらの組み合わせから選択される1以上の神経マーカーを発現しない;を含む、上記項目のいずれかに記載のラットES細胞の単離された集団、上記項目のいずれかに記載の試験管内培養物、または上記項目のいずれかに記載の方法。
Claims (38)
- ラットの胚性幹(ES)細胞株の生成方法であって、
(a)白血病阻害因子(LIF)を発現するように組換えされていないフィーダー細胞の第1の層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養すること、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、その培養条件はラットES細胞の多能性を維持するものであって、50U/mL〜150U/mL LIF、並びにGSK3阻害剤及びMEK阻害剤から成る阻害剤を含むが、FGFR阻害剤を含まない培地の使用を含むことと、
(b)工程(a)から得られたラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を、LIFを発現するように組換えされていない前記フィーダー細胞の第2の層を含む試験管内培養ウェルに移すことと、
(c)50U/mL〜150U/mL LIF、並びにMEK阻害剤及びGSK3阻害剤から成る阻害剤を含むが、FGFR阻害剤を含まない培地の使用を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットES細胞の多能性を維持することと、
(d)ラットES細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む、標的とされた遺伝子組換えを含むようにラットES細胞を組換えることであって、ここで、ラットES細胞が
(i)標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である、
(ii)c−Mycの発現を欠く、
(iii)正常な核型を有する、および
(iv)培養物において自由に浮かんでいる球形のコロニーを形成する、
こととを含む、前記方法。 - (e)工程(d)からの組換えられたラットES細胞の少なくとも1つをラット宿主胚に導入してF0胚を作出することと;
(f)F0胚を代理母に移植することと;
(g)代理母にてF0胚を出産予定日まで妊娠維持させることと;
(h)標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットを特定することと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 遺伝子組換えラットの作製方法であって、
(a)白血病阻害因子(LIF)を発現するように組換えされていないフィーダー細胞の層上で、50U/mL〜150U/mL LIF、並びにMEK阻害剤PD0325901及びGSK3阻害剤CHIR99021から成る阻害剤を含むが、FGFR阻害剤を含まない培地を用いて、単離されたラットES細胞を培養することによって得られたラットES細胞の集団を含むラットES細胞株を提供することであって、ここで、前記ラットES細胞の集団は、
c−Mycの発現を欠く、
培養物において自由に浮かんでいる球形のコロニーを形成する、
二倍体である、かつ
生殖系列適格性である、ことと;
(b)標的とされた組換えを含むラットES細胞クローンを得ることであって、
(i)標的とされた遺伝子組換えを含むように前記ラットES細胞の集団を組換えすることと、
(ii)前記標的とされた遺伝子組換えを含むラットES細胞クローンを特定することと
からなる、得ることと;
(c)前記ラットES細胞クローンを、ラット宿主胚に導入することであって、ここで、前記ラットES細胞クローンが、前記ラット宿主胚とは異なるラット系統に由来する、ことと;
(d)前記ラットES細胞クローンを含む前記ラット宿主胚を、代理母において妊娠維持させることであって、ここで、前記代理母が、前記標的とされた遺伝子組換えを含むF0子孫を生じ、前記標的とされた遺伝子組換えが、生殖系列を介して伝達される、ことと
を含む、前記方法。 - 前記提供する工程(a)が、
(i)白血病阻害因子(LIF)を発現するように組換えされていないフィーダー細胞の第1の層と胚盤胞期のラット胚または桑実胚期のラット胚とを試験管内で培養すること、その際、胚盤胞期のまたは桑実胚期のラット胚の透明帯は取り除かれており、その培養条件はラットES細胞の多能性を維持するものであって、50U/mL〜150U/mL LIF、並びにMEK阻害剤PD0325901及びGSK3阻害剤CHIR99021から成る阻害剤を含むが、FGFR阻害剤を含まない培地の使用を含むことと、
(ii)ラットES細胞の不定形で未分化の塊の増殖物を、LIFを発現するように組換えされていない前記フィーダー細胞の第2の層を含む試験管内培養ウェルに移すことと、(iii)50U/mL〜150U/mL LIF、並びにMEK阻害剤PD0325901及びGSK3阻害剤CHIR99021から成る阻害剤を含むが、FGFR阻害剤を含まない培地の使用を含む条件下で前記増殖物を培養し、それによってラットES細胞の多能性を維持することと、
を含む、請求項3に記載の方法。 - (i)標的とされた遺伝子組換えを含むオスF0ラットを野生型のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてヘテロ接合体であるF1子孫を作出することと;必要に応じて
(j)F1子孫のオスラットを、F1子孫のメスラットと交配させ、標的とされた遺伝子組換えについてホモ接合体であるF2子孫を得ることと
をさらに含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも3%が標的とされた遺伝子組換えをF1子孫に伝達し、必要に応じて、標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも10%が標的とされた遺伝子組換えをF1子孫に伝達する、請求項5に記載の方法。
- 標的とされた遺伝子組換えを有するF0ラットの少なくとも60%が標的とされた遺伝子組換えをF1子孫に伝達する、請求項6に記載の方法。
- (I)ラットES細胞株がACIラットに由来するかまたはダークアグーチ(DA)ラットに由来する;および/または
(II)ラットES細胞株が過排卵させたラットからの桑実胚期のまたは胚盤胞期の胚に由来する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記標的とされた遺伝子組換えが、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換え工程(d)が、前記ラットES細胞を、2以上の標的とされた組換えを含むように組換えることを含み、前記ラットES細胞が、2以上の標的とされた遺伝子組換えを、生殖系列を通して伝達することが可能である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ラットES細胞が、オス(XY)ラットES細胞またはメス(XX)ラットES細胞である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培地が75U/mL〜125U/mL LIFを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培地が、90U/mL〜110U/mL LIFを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記培地が100U/mL LIFを含む、請求項13に記載の方法。
- フィーダー細胞が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中のLIFが、マウスLIFである、または、配列番号1に対して少なくとも91%の配列同一性を有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- MEK阻害剤がPD0325901である、および/またはGSK3阻害剤がCHIR99021である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- MEK阻害剤が0.8μM〜1.2μMの濃度のPD0325901であり、GSK3阻害剤が、2.5μM〜3μMまたは3μM〜3.5μMの濃度のCHIR99021であり、必要に応じて、
MEK阻害剤の濃度が1μMであり、GSK3阻害剤の濃度が3μMである、請求項17に記載の方法。 - 培地中のLIFの濃度が100U/mLであり、MEK阻害剤が1μMの濃度のPD0325901であり、GSK3阻害剤が3μMの濃度のCHIR99021である、請求項18に記載の方法。
- 培地が、1×DMEM/F12基本培地;1×神経基本培地;1%ペニシリン/ストレプトマイシン;4mM L−グルタミン;0.1mM 2−メルカプトエタノール;1×N2補完剤;1×B27補完剤;100U/mL LIF;1μM PD0325901;および3μM CHIR99021を含む、請求項19に記載の方法。
- 組換え工程が、1回以上のエレクトロポレーションを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされた遺伝子組換えが、相同組換え事象を介して行われる、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされた遺伝子組換えが、挿入ポリヌクレオチドに隣接する上流と下流の相同性アームを含む標的化ベクターを用いることによって行われ、ここで、相同性アームは、標的とされたゲノム遺伝子座の中のゲノム領域に相当する、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされた遺伝子組換えが、標的とされたゲノム遺伝子座での一本鎖または二本鎖の切断を生成するヌクレアーゼ剤を用いて行われる、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ剤が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、メガヌクレアーゼ、または、CRISPR/Cas系である、請求項24に記載の方法。
- 組換え工程が、
(i)ラットES細胞にて活性のあるプロモータに操作可能に連結された選択マーカーを含む非相同のポリヌクレオチドをラットES細胞に導入することと、
(ii)交互に入れ替える第1と第2の培養培地にて前記ラットES細胞を試験管内で培養し、それによって前記非相同のポリヌクレオチドがそのゲノムの中に安定的に統合されているラットES細胞を選択することとを含み、その際、前記第1の培養培地は第1の期間、有効量の選択剤を含み、前記第2の培養培地は選択剤を含まず、試験管内の培養条件が多能性を維持するのに十分である、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。 - 第1の培養培地と第2の培養培地が24時間ごとに交互に入れ替えられ、そして選択マーカーが抗生剤への耐性を付与し、必要に応じて、
選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neor)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hygr)、プロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ(puror)、ブラスチシジンSデアミナーゼ(bsrr)、キサンチン/グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)及び単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−tk)のうち1つ以上を含み、必要に応じて、
抗生剤がG418である、請求項26に記載の方法。 - 選択マーカーが以下の特徴のうちの1つまたは複数を有する:
(a)選択マーカーが非弱毒化選択マーカー遺伝子を含む;
(b)選択マーカーが野生型選択マーカーに比べて高い活性を有する、及び
(c)ラットES細胞が、ゲノムに安定的に組み込まれた選択マーカーの複数のコピーを含む、請求項26または27に記載の方法。 - 試験管内培養物であって、
(a)白血病阻害因子(LIF)を発現するように組換えられていないフィーダー細胞層と;
(b)50U/mL〜150U/mL LIF、並びにMEK阻害剤及びGSK3阻害剤から成る阻害剤を含むが、FGFR阻害剤を含まない培地と;
(c)ラットES細胞のゲノムへの非相同のポリヌクレオチドの少なくとも1回の挿入を含む、標的とされた遺伝子組換えを含む1以上のラットES細胞、の集団と
を含み、ここで、ラットES細胞が
(i)標的とされた遺伝子組換えを生殖系列を介して伝達することが可能である、
(ii)c−Mycの発現を欠く、
(iii)正常な核型を有する、および
(iv)培養物において自由に浮かんでいる球形のコロニーを形成する、
試験管内培養物。 - 培地が、75U/mL〜125U/mL LIFを含む、請求項29に記載の試験管内培養物。
- 培地が、90U/mL〜110U/mL LIFを含む、請求項30に記載の試験管内培養物。
- 培地が、100U/mL LIFを含む、請求項31に記載の試験管内培養物。
- フィーダー細胞層が有糸分裂上不活化されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)の単層を含む、請求項29〜32のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
- 培地中のLIFが、マウスLIFである、または、配列番号1に対して少なくとも91%の配列同一性を有する、請求項29〜33のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
- MEK阻害剤がPD0325901である、および/またはGSK3阻害剤がCHIR99021である、請求項29〜34のいずれか1項に記載の試験管内培養物。
- MEK阻害剤が0.8μM〜1.2μMの濃度のPD0325901であり、GSK3阻害剤が、2.5μM〜3μMまたは3μM〜3.5μMの濃度のCHIR99021であり、必要に応じて、
MEK阻害剤の濃度が1μMであり、GSK3阻害剤の濃度が3μMである、請求項35に記載の試験管内培養物。 - 培地中のLIFの濃度が100U/mLであり、MEK阻害剤が1μMの濃度のPD0325901であり、GSK3阻害剤が3μMの濃度のCHIR99021である、請求項36に記載の試験管内培養物。
- 培地が、1×DMEM/F12基本培地;1×神経基本培地;1%ペニシリン/ストレプトマイシン;4mM L−グルタミン;0.1mM 2−メルカプトエタノール;1×N2補完剤;1×B27補完剤;100U/mL LIF;1μM PD0325901;および3μM CHIR99021を含む、請求項37に記載の試験管内培養物。
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