KR20220150295A - B4galt1-매개 기능의 설치류 모델 - Google Patents

B4galt1-매개 기능의 설치류 모델 Download PDF

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KR20220150295A
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endogenous
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쥬시 델라 가타
칭 팡
알렌 숄디너
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 유전적으로 변형된 동물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는, 예를 들어 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 B4galt1 위치에 있는 암호화된 B4galt1 단백질에서의 Asn에서 Ser로의 치환을 암호화하는 돌연변이를 도입하거나, (예를 들어 간과 같은 선택 조직에서) 기능 상실 돌연변이를 도입하도록, 내인성 B4galt1 유전자가 변형된 설치류 동물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 지질 대사에서 B4galt1의 역할을 구명하는 데 있어서 이러한 설치류 동물의 용도에 관한 것이다.

Description

B4GALT1-매개 기능의 설치류 모델
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/985,045호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
본 개시는 유전적으로 변형된 동물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는, 예를 들어 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하는 변형된 유전자를 갖거나, 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 B4galt1 위치에 있는 암호화된 B4galt1 단백질에서 Asn에서 Ser로의 치환을 암호화하는 돌연변이를 도입하거나, (예를 들어 간과 같은 선택 조직에서) 기능 상실 돌연변이를 도입하도록, 내인성 B4galt1 유전자가 변형된 설치류 동물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 지질 대사에서 B4galt1의 역할을 구명하는 데 있어서 이러한 설치류 동물의 용도에 관한 것이다.
참조에 의한 서열 목록의 통합
2021년 2월 24일에 생성되고, EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 37993PCT_10700WO01_SequenceListing이란 명칭의 27 KB 크기의 ASCII 텍스트 파일 내 서열 목록이 참조로써 본원에 포함된다.
특허, 특허 출원, 수탁 번호, 기술적 항목, 및 학술적 항목을 포함하여 다양한 참조 문헌이 명세서 전체에 걸쳐 인용된다. 각각의 참조 문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
심혈관 질환(CVD)은 미국에서 3건의 사망 중 1건을 차지하며, 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인이다(Benjamin 등의 문헌[Circulation, 2018, 137(12): p. e67-e492]). 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)의 상승은 동맥 플라크 형성과 동맥경화증을 증가시키며, 관상 동맥 질환(CAD)에 대한 위험 인자이다(Nelson 등의 문헌[Primary Care, 2013. 40(1): p. 195-211]). LDL-C의 유전적 결정인자에 대해 더 깊이 이해한다면 CAD의 치료 또는 예방에 더 효과적이고 더 안전할 수 있는 새로운 치료 표적을 밝혀낼 수 있을 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 내인성 B4galt1 유전자가 변형된 유전적으로 변형된 설치류 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트)을 제공한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 β4 갈락토트랜스퍼라아제 1(B4galt1) 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 이러한 구현예에서, 변형은 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 치환을 포함하는 B4galt1 단백질이 감소된 갈락토실트랜스퍼라아제 활성을 나타내도록 B4galt1 단백질 내의 아미노산을 치환하거나 이를 암호화한다. 일부 이러한 구현예에서, 치환은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 설치류 B4galt1 단백질의 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 변형은 설치류의 게놈(즉, 생식선 게놈)에 존재한다. 일부 구현예에서, 변형은 설치류의 표적 조직이나 기관 내의 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다("N352S 녹인"을 포함하는 설치류로도 지칭됨). 일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류는 랫트이고, 치환은 랫트 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다. 일부 구현예에서, 변형은 설치류의 게놈(즉, 생식선 게놈)에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류는 변형에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류는 변형에 대해 동형접합체이다. N352S 녹인을 포함하는 설치류는 변형이 없는 야생형 설치류와 비교했을 때, LDL-C 수준의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형은 설치류의 표적 조직이나 기관 내의 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 기능 상실 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 기능 상실 돌연변이는, 일부 구현예에서 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생한다. 일부 구현예에서, 기능 상실 돌연변이는 설치류의 게놈(예: 생식선 게놈)에 존재한다. 일부 구현예에서, 변형은 설치류의 표적 조직이나 기관 내의 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입된다. 일부 구현예에서, 표적 기관은 간이다.
추가 양태에서, 본원에 기술된 변형, 즉 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 단리된 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 세포 또는 조직이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조직은 변형을 포함하는 설치류로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 이러한 구현예에서, 변형은 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 치환을 포함하는 B4galt1 단백질이 감소된 갈락토실트랜스퍼라아제 활성을 나타내도록 B4galt1 단백질 내의 아미노산을 치환하거나 이를 암호화한다. 일부 이러한 구현예에서, 치환은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 설치류 B4galt1 단백질의 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환이다.
단리된 설치류 세포 또는 조직의 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다("N352S 녹인"을 포함하는 설치류 세포 또는 조직으로도 지칭됨). 일부 구현예에서, 설치류 세포 또는 조직은 마우스 세포 또는 조직이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류는 랫트 세포 또는 조직이고, 치환은 랫트 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류 세포 또는 조직은 변형에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포 또는 조직은 변형에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류 세포 또는 조직은 간 세포 또는 조직이다.
단리된 설치류 세포 또는 조직의 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 기능 상실 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 기능 상실 돌연변이는, 일부 구현예에서 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생한다.
또한, 본원에 개시된 설치류 배아 세포를 포함하는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트) 배아가 본원에 제공된다.
추가 양태에서, 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법 및 상기 방법에 의해 만들어진 설치류가 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (i) 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하여, 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 포함하는 변형된 설치류 ES 세포를 수득하는 단계; 및 (ii) 변형된 설치류 ES 세포를 사용하여 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 이러한 구현예에서, 변형은 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 치환을 포함하는 B4galt1 단백질이 감소된 갈락토실트랜스퍼라아제 활성을 나타내도록 B4galt1 단백질 내의 아미노산을 치환하거나 이를 암호화한다. 일부 이러한 구현예에서, 치환은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 설치류 B4galt1 단백질의 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류는 랫트이고, 치환은 랫트 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 기능 상실 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 기능 상실 돌연변이는, 일부 구현예에서 내인성 설치류 B4GalT-1 유전자의 코딩 서열의 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4GalT-1 유전자의 엑손 2에서 발생한다.
일부 구현예에서, 변형은 유전자 편집 시스템을 통해 설치류 ES 세포 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA, Cas9 효소, 및 단일 가닥 올리고데옥시핵산 분자(ssODN)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 및 ssODN은 (예를 들어, 형질감염 또는 전기천공을 통해) 설치류 ES 세포 내로 도입되며, 여기서 설치류 ES 세포는 이미 Cas9 효소를 발현하거나, 이를 발현하도록 변형되었다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법은 설치류의 표적 조직 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌의 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하여 유전적으로 변형된 설치류를 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 이러한 구현예에서, 변형은 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 치환을 포함하는 B4galt1 단백질이 감소된 갈락토실트랜스퍼라아제 활성을 나타내도록 B4galt1 단백질 내의 아미노산을 치환하거나 이를 암호화한다. 일부 이러한 구현예에서, 치환은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 설치류 B4galt1 단백질의 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환이다.
일부 이러한 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류는 랫트이고, 치환은 랫트 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 기능 상실 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 기능 상실 돌연변이는, 일부 구현예에서 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생한다.
일부 구현예에서, 변형은 유전자 편집 시스템을 통해 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템의 가이드 RNA는 AAV 시스템에 의해 설치류 내로 전달된다. 일부 구현예에서, AAV 시스템은 설치류의 간 내로 가이드 RNA가 전달되는 것을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, Cas9 효소는 가이드 RNA가 설치류 내로 도입되기 전에 설치류에서 발현된다.
또 다른 양태에서, 수득된 설치류 및 설치류 자손을 교배하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는(즉, 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 포함하는) 게놈을 가진 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시켜 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 게놈을 가진 자손 설치류를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 게놈을 가진 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시켜 수득한 자손이 본원에 개시되며, 여기서 자손의 게놈은 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함한다.
추가 양태에서, B4galt1 및 지질 대사에 화합물이 미치는 영향을 시험하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (i) 본원에 기술된 것과 같이 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류를 제공하고, 변형이 없는 야생형 설치류를 제공하는 단계; (ii) 후보 B4galt1 억제 화합물을 야생형 설치류에 투여하는 단계; (iii) 변형을 가진 설치류 및 야생형 설치류를 조사하여 혈청 LDL-C 수준을 측정하는 단계; 및 (iv) 화합물이 투여된 야생형 설치류에서의 측정치, 화합물을 투여하기 전 야생형 설치류에서의 측정치, 및 변형을 가진 설치류에서의 측정치를 비교하여 후보 화합물이 B4galt1의 활성을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
도 1a는 인간 B4GALT1(서열번호 2) 및 마우스 B4galt1(서열번호 4) 단백질 서열의 정렬을 도시한 것이다. 두 서열에 공통인 아미노산는 박스 내에 표시되어 있다. 인간 단백질의 352 위치에서의 Asn 잔기 및 마우스 단백질의 353 위치에서의 상응하는 Asn 잔기는 박스 내에 표시되어 있다.
도 1b는 마우스 B4galt1 유전자(상단) 및 단백질(하단)을 도시한 것이다. 상단: 수평선/막대는 마우스 B4galt1 유전자좌를 나타내며, 엑손은 선 위에 수직 막대로 도시되어 있다. 엑손 1 및 엑손 6의 색이 칠해지지 않은 박스는 각각 5' 미번역 영역(5' UTR) 및 3' UTR을 나타낸다. 하단: 수평 막대는 마우스 B4galt1 단백질을 나타낸다. 엑손 간의 접합부는 막대 내에 수직선으로 도시되어 있고, 접합부에 상응하는 아미노산 위치는 수직선 아래에 표시되어 있다. N353S 치환은 별표로 표시되어 있다.
도 1c는 마우스 B4galt1 유전자의 엑손 5에 돌연변이를 도입하여 마우스 B4galt1 단백질에서 N353S 치환을 생성하는 예시적인 전략을 도시한다. 야생형 엑손 5 서열(서열번호 12)의 일부분에 상보적인 가이드 RNA 서열(서열번호 11)은 뉴클레아제(예: Cas9)가 이중-가닥 절단을 도입하도록 유도한다. 단일 가닥의 공여자 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 서열(서열번호 13)을 템플릿으로서 사용해 복구하는 경우, 돌연변이(A에서 G로의 뉴클레오티드 치환)이 도입되어, 암호화된 B4galt1 단백질에서 N353S 치환을 생성한다.
도 2a~2b는 B4galt1 N352S 녹인이 암컷(2a) 및 수컷(2b) 마우스의 혈장 내 지질 및 효소 수준에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3a~3e는 간 특이적 B4galt1 절제가 혈장 내 지질 및 효소 수준에 미치는 영향을 나타낸다. 3a, 3b: AAV8에 의한 바이러스 형질도입으로부터 14주차에 간 및 비장에서 b4galt1의 편집 백분율. 각 실험군에서, B4galt1 INDEL을 함유하는 판독의 수를 B4galt1 야생형 서열인 경우의 판독의 수와 (실시예 2의 방법 섹션에 기술된 바와 같이) 비교하였다. 3c: AAV8에 의한 바이러스 형질도입으로부터 14주차에 Taqman에 의한 간 내 B4galt1 mRNA 수준의 분석. B4galt1의 발현은 Gapdh 하우스키핑 유전자에 대해 상대적으로 계산하였다. 값은 조건 당 4개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 3d, 3e: B4galt1 간-녹아웃 및 Cfb 녹아웃 대조군에서 LDL-C 및 AST에 대한 혈장 수준이 도시되어 있다. 2주차 시점 후에, 바이러스 벡터를 주사한 시점으로부터 12주의 총 연구 기간 동안 4주마다 주기적으로 채혈을 수행하였다. 값은 3~5개의 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
도 4a~4j는 간 특이적 B4galt1 절제가 혈장 내 지질 및 효소 수준에 미치는 영향을 나타낸다. 4a, 4b: B4galt1의 엑손 2에 대해 설계된 2개의 상이한 gRNA를 보유한 AAV8에 의한 바이러스 형질도입으로부터 14주차에 간 및 비장에서 b4galt1의 편집 백분율. 각 실험군에서, b4galt1 INDEL을 함유하는 판독의 수를 b4galt1 야생형 서열인 경우의 판독의 수와 비교하였다(방법 참조). 4c: AAV8에 의한 바이러스 형질도입으로부터 14주차에 Taqman에 의한 간 내 b4galt1 mRNA 수준의 분석. b4galt1의 발현은 gapdh 하우스키핑 유전자에 대해 상대적으로 계산하였다. 값은 조건 당 4개의 기술적 복제물의 평균을 나타낸다. 4d~4j: 다음에 대한 혈장 수준이 도시되어 있다: b4galt1 간 특이적 녹아웃 및cfb 녹아웃 대조군에서 측정된 LDL-C; AST; T-콜레스테롤; HDL-C; NEFA; 중성지방 및 ALT. 2주차 시점 후에, 바이러스 벡터를 주사한 시점으로부터 12주의 총 연구 기간 동안 4주마다 주기적으로 채혈을 수행하였다. 값은 3~5개의 생물학적 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다.
인간 대사(예: 지질 대사) 및 질환의 동물 모델로서 사용하기에 적합한 유전적으로 변형된 설치류가 본원에 개시된다. 특히, 예를 들어 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하거나, 아미노산 치환을 초래하는 돌연변이를 도입하거나, 기능 상실 돌연변이를 도입하도록 내인성 B4galt1 유전자가 변형된 설치류 동물이 본원에 개시된다. 또한, 지질 대사에서 B4galt1의 역할을 구명하는 데 있어서 이러한 설치류 동물의 용도가 본원에 개시된다.
B4GALT1
B4GALT1(또는 비인간 공급원 유래의 B4galt1)은 당단백질에서 N-연결 올리고당 모이어티의 가공에 있어서 중요한 역할을 하는 II형 막-결합 당단백질을 암호화하는 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 계열의 구성원이다. B4GALT1(또는 B4galt1) 활성의 손상은 N-결합 올리고당의 구조를 변경하고 글리칸 구조에 변형(aberrations)을 도입할 가능성이 있는데, 여기서의 변형은 당단백질 구조를 변경할 가능성이 있다.
인간 B4GALT1 유전자는 9번 염색체 상의 9p21.1에 위치하고, 6개의 엑손을 갖고, 길이는 약 56 kb이며, 398개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화한다. 마우스 B4galt1 유전자는 4번 염색체에 위치하고, 6개의 엑손을 갖고, 길이는 약 49 kb이며, 399개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화한다. B4GALT1은 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된다. 인간, 마우스, 및 랫트의 예시적인 mRNA 및 단백질 서열은 표 1에 나열된 수탁 번호로 GenBank에서 이용할 수 있으면, 서열 목록에도 서열번호 1~6으로 제시되어 있다.
서열번호 설명 특징
1 호모 사피엔스(Homo sapiens) B4GALT1 mRNA, NM_001497.3 길이: 4214bp
CDS: nt. 190~1386
엑손 1~6: nt. 1~601, 602~837, 838~1025, 1026~1148, 1149~1252, 1254~4199.
PolyA 부위: nt. 4199.
2 호모 사피엔스 B4GALT1 단백질, NP_001488.2 길이: 398 aa
막관통: aa 25~44:
성숙한 가용성 형태: aa 78~398
3 생쥐(Mus musculus) B4galt1
mRNA, NM_022305.4		 길이: 4535 bp
CDS: nt 733~1932
엑손 1~6: nt. 1~1147, 1148~1383, 1384~1571, 1572~1694, 1695~1799, 1800~4535
폴리A 신호 서열: nt. 4493~4498
PolyA 부위: nt. 4515
4 생쥐 B4galt1 단백질, NP_071641.1 길이: 399 aa
막관통: aa 25~44:
5 집쥐(Rattus norvegicus) B4galt1 mRNA, NM_053287.1
길이: 2298 bp
CDS: nt. 219~1418
엑손 1~6: nt.1~633, 634~869, 870~1057, 1058~1180, 1181~1285, 및 1286~2292.
6 집쥐 B4galt1 단백질, NP_445739.1 길이: 399 aa
변형된 B4galt1 유전자를 포함하는 설치류
본 개시는, 예를 들어 아미노산 치환(예를 들어, B4galt1 단백질의 활성을 감소시키는 치환)을 초래하는 돌연변이를 도입하거나, 기능 상실 돌연변이를 도입하도록 내인성 B4galt1 유전자가 변형된 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)를 제공한다.
용어 "돌연변이"는 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이", "변경", 및 "변형"은 상호 교환적으로 사용된다. 돌연변이 유전자(또는 유전자의 돌연변이체 대립유전자)는 야생형 유전자 또는 기준 유전자에 비해 돌연변이, 변경, 또는 변형을 포함하는 것으로 본원에서 이해된다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 단일 뉴클레오티드의 치환이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어, 유전자의 코딩 서열에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실이다. 일부 구현예에서, 유전자에서의 돌연변이는 유전자의 인접 핵산 서열, 예를 들어 하나 이상의 엑손의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자에서의 돌연변이는 암호화된 단백질에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 또는 치환을 야기한다. 일부 구현예에서, 유전자에서의 돌연변이는 암호화된 아미노산을 변화시키지 않는다.
용어 "기능 상실(loss of function)"은 완전한 기능 상실 및 부분적 기능 상실을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자에서의 변형 또는 변경은 변형 또는 변경이 없는 기준 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드에 비해 적어도 기능성이 감소된 폴리펩티드의 발현, 일부 경우에는, 기능성이 실질적으로 감소되거나 기능성이 완전히 결여된 폴리펩티드의 발현을 야기한다. 따라서, 유전적 변형은 완전한 기능 상실 또는 부분적 기능 상실을 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형을 포함하는 설치류 동물이 본원에 개시되며, 여기서 변형을 포함하는 설치류 B4galt1 유전자는 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 변형은 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 B4galt1 단백질 내 아미노산의 치환을 야기하거나 이를 암호화한다. 일부 구현예에서, 치환은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 설치류 B4galt1 단백질의 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 갈락토실트랜스퍼라아제 활성의 감소는, 예를 들어 야생형 설치류 B4galt1 유전자(변형이 없는 설치류 B4galt1 유전자)에 의해 암호화된 고유 또는 야생형 설치류 B4galt1 단백질에 비해 활성이 억제되거나 또는 감소된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 설치류 B4galt1 유전자가 인간 B4galt1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 변형된 B4galt1 단백질을 암호화하도록, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형을 포함하는 설치류 동물이 본원에 개시된다. 이러한 설치류는 본원에서 N352S 녹인을 갖는 설치류로도 지칭된다. 변형은, 예를 들어 인간 B4galt1 단백질 내 위치 352에 상응하는 위치에 있는 Asn에 대한 코돈에서의 뉴클레오티드의 치환일 수 있으며, 이는 암호화된 설치류 B4galt1 단백질에서 Asn을 Ser로 치환시킨다. 이러한 변형은 "N에서 S로의 치환을 암호화하는 것"으로도 일컬어진다. 인간 B4GALT1에서의 N352S 변이는 LDL-C 감소와 관련이 있는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 주어진 폴리펩티드 또는 핵산 분자에서의 위치에 대한 넘버링의 맥락에서 사용될 때의 표현인 "상응하는" 또는 이의 문법적 변형은, 주어진 아미노산 또는 핵산 분자를 기준 분자와 비교할 때(예를 들어 야생형 인간 B4GALT1 폴리펩티드 또는 야생형 인간 B4GALT1 핵산 분자인 본원의 기준 분자와 비교할 때), 명시된 기준 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 대한 넘버링을 지칭한다. 다시 말해, 주어진 중합체에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 위치는, 주어진 중합체 내에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 실제 숫자 위치에 의해 지정되는 것이 아니라 기준 분자에 대해 지정된다. 예를 들어, 주어진 아미노산 서열은 2개의 서열 사이의 잔기 일치를 최적화하기 위한 갭을 도입함으로써 기준 서열에 대해 정렬될 수 있다. 이러한 경우에, 갭이 존재하지만, 주어진 아미노산 또는 핵산 서열에서의 잔기에 대한 넘버링은 이들이 정렬된 기준 서열에 대해 이루어진다.
예를 들어, 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 설치류 B4galt1 내의 위치는 설치류 B4galt1 단백질과 인간 B4GALT1 단백질의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2) 간의 서열 정렬을 수행함으로써 쉽게 식별될 수 있다. 서열번호 2에서의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치를 식별하기 위해 서열 정렬을 수행하는 데 사용될 수 있는 다양한 연산 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, NCBI BLAST 알고리즘(Altschul 등의 문헌[1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]) 또는 CLUSTALW 소프트웨어(Sievers 및 Higgins의 문헌[2014 Methods Mol. Biol. 1079: 105-116])를 사용함으로써 서열 정렬이 수행될 수 있다. 그러나, 서열은 수동으로 정렬될 수도 있다.
일부 구현예에서, 변형된 마우스 B4galt1 유전자가 인간 B4galt1 단백질에서의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 변형된 마우스 B4galt1 단백질을 암호화하도록, 내인성 마우스 B4galt1 유전자에서의 변형을 포함하는 마우스가 본원에 개시된다. 마우스 B4galt1 단백질(예: 서열번호 4)에서의 위치 353은 서열번호 2와 같은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응한다. 예를 들어, 도 1a를 참조한다.
일부 구현예에서, 변형된 랫트 B4galt1 유전자가 인간 B4galt1 단백질에서의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 변형된 랫트 B4galt1 단백질을 암호화하도록, 내인성 랫트 B4galt1 유전자에서의 변형을 포함하는 랫트가 본원에 개시된다. 랫트 B4galt1 단백질(예: 서열번호 6)에서의 위치 353은 서열번호 2와 같은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류 동물이 본원에 개시되며, 여기서 변형은 기능 상실 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 설치류 B4galt1 유전자에서의 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 적어도 일부분의 결실을 포함한다.
유전자의 "일부분"은 유전자의 "단편"과 상호 교환적으로 본원에서 사용되며, 예를 들어, 5' 조절 영역(예: 프로모터), 5' 비코딩 엑손 서열, 3' 비코딩 엑손 서열, 5' 또는 3' 비번역 영역(UTR), 엑손 전체 또는 일부분, 인트론 전체 또는 일부분, 마지막 엑손의 하류에 있는 3' 영역, 또는 이들의 조합을 포함하여, 유전자의 연속 뉴클레오티드 서열 부분에 대한 참조를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자의 일부분은 유전자의 코딩 영역, 예를 들어, 유전자의 ATG 시작 코돈에서 종결 코돈까지를 포함하는 핵산(게놈 DNA 또는 cDNA)을 지칭한다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 (예를 들어, 엑손 내) 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환에 기인하는 기능 상실 돌연변이를 포함하는데, 이는 코딩 서열의 적어도 일부분을 결실시킨다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형(예를 들어, 인간 B4GALT1에서 352에 상응하는 위치에서 N에서 S로의 치환을 초래하는 점 돌연변이, 또는 기능 상실 돌연변이)은 설치류 동물의 게놈(즉, 생식선 게놈)에 존재한다. 일부 구현예에서, 설치류는 변형에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 설치류는 변형에 대해 동형접합체이다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 설치류의 선택되거나 표적화된 조직 또는 기관에 존재한다(즉 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 조직 특이적 또는 기관 특이적 변형이다). 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 설치류의 간에 존재한다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 기능 상실 돌연변이는 설치류 B4galt1 유전자의 간 특이적 절제를 달성하도록 설치류의 간에 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 설치류 동물은 야생형 설치류 B4galt1 단백질을 발현할 수 없다. 예를 들어, 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 하나의 카피는 변형(예: 인간 B4GALT1 내 N352S에 상응하는 치환을 야기하는 변형)을 함유하고 다른 하나의 카피는 파괴되거나 결실되는 설치류가 제공된다. 대안적으로, 설치류 동물은 변형에 대해 동형접합체이며, 결과적으로 야생형 설치류 B4galt1 단백질을 발현할 수 없다.
내인성 B4galt1 유전자(N352S 녹인 또는 간 특이적 절제에 대해 동형접합체이거나 이형접합체인 유전자)의 변형의 결과로서, 본원에 제공된 설치류 동물은 야생형 마우스(즉, 변형이 없는 마우스)와 비교했을 때, 예를 들어 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상만큼 감소한 LDL-C 수준을 나타낸다.
본원에 기술된 구현예 중 어느 하나의 경우, 설치류는, 예를 들어 마우스, 랫트, 및 햄스터를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 설치류는 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류는 C57BL 계통, 예를 들어 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스이다. 다른 구현예에서, 설치류는 129 계통, 예를 들어 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2로 이루어진 군으로부터 선택된 129 계통의 마우스이다(예를 들어, Festing 등의 문헌[(1999), Mammalian Genome 10:836]; Auerbach 등의 문헌[(2000), Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032] 참조). 일 구현예에서, 설치류는 전술한 129 계통 및 전술한 C57BL/6 계통의 잡종인 마우스이다. 특정 구현예에서, 마우스는 전술한 129 계통의 잡종(즉, 혼성종), 또는 전술한 C57BL 계통의 잡종, 또는 C57BL 계통과 129 계통의 잡종이다. 특정 구현예에서, 마우스는 C57BL/6 계통과 129 계통의 잡종이다. 특정 구현예에서, 마우스는 F1H4로도 알려진 VGF1 계통이며, 이는 C57BL/6 및 129의 혼성종이다. 다른 구현예에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 일부 구현예에서, 마우스는 BALB 계통 및 전술한 다른 계통의 잡종이다.
일부 구현예에서, 설치류는 랫트이다. 특정 구현예에서, 랫트는 위스타 랫트(Wistar rat), LEA 계통, 스프래그 다울리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 랫트는 위스타, LEA, 스프래그 다울리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 계통의 잡종이다.
B4galt1 유전자에서의 변형을 포함하는 설치류를 만드는 방법
본원에 제공된 설치류로서, 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류는 다양한 방법을 사용하여 만들 수 있다.
일부 구현예에서, 변형은 유전자 편집 시스템("표적화된 게놈 편집" 시스템으로도 알려짐)을 사용하여 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN)로부터 선택된다. ZFN은 Carroll, D.의 문헌[Genetics, 188.4 (2011): 773-782]에 검토되어 있고, TALEN은 Zhang 등의 문헌[Plant Physiology, 161.1 (2013): 20-27]에 검토되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템을 사용해 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입한다. CRISPR/Cas 시스템은 박테리아 II형 CRISPR(규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복단위의 배열)/Cas(CRISPR-결합) 면역 체계를 기반으로 하는 방법이다. CRISPR/Cas 시스템은 맞춤형 짧은 비코딩 RNA(가이드 RNA 또는 gRNA)에 의해 가이드된 게놈 DNA의 표적화 절단을 통해, 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 및 상동성-유도 복구(HDR) 메커니즘 둘 다에 의해 유전자를 변형시킬 수 있다. CRISPR-Cas 및 유사한 유전자 편집 시스템은 당업계에 알려져 있고, 시약 및 프로토콜을 손쉽게 이용할 수 있다. 예시적인 게놈 편집 프로토콜은 Jennifer Doudna 및 Prashant Mali의 문헌["CRISPR-Cas: A Laboratory Manual" (2016) (CSHL Press, ISBN: 978-1-621821-30-4)] 및 Ran, F. Ann, 등의 문헌[Nature Protocols (2013), 8 (11): 2281-2308]에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 변형은 CRISPR/Cas 시스템 및 외인성 공여자 핵산을 사용하여 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입된다. 일부 구현예에서, 설치류 ES 세포가 사용되어 Cas 뉴클레아제를 발현하거나 이를 발현하도록 변형된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD로도 알려짐), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 또는 Csx12로도 알려짐), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA로도 알려짐), Cse2 (CasB로도 알려짐), Cse3 (CasE로도 알려짐), Cse4 (CasC로도 알려짐), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이들의 동족체 또는 변형된 버전으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9이다.
일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 데옥시리보핵산(DNA)을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 선형 형태이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 원형 형태이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODM)이다. 예를 들어, Yoshimi 등의 문헌[(2016) Nat. Commun. 7:10431], 미국 특허 공개 제2019/0032155호 및 제2019/0032156호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 약 50개 뉴클레오티드 내지 약 5 kb 길이이거나, 약 50개 뉴클레오티드 내지 약 3 kb 길이이거나, 약 50 내지 약 1,000개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 약 40 내지 약 200개 뉴클레오티드의 길이이다. 예를 들어, 외인성 공여자 핵산은 약 50~60개, 60~70개, 70~80개, 80~90개, 90~100개, 100~110개, 110~120개, 120~130개, 130~140개, 140~150개, 150~160개, 160~170개, 170~180개, 180~190개, 또는 190~200개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 약 50~100개, 100~200개, 200~300개, 300~400개, 400~500개, 500~600개, 600~700개, 700~800개, 800~900개, 또는 900~1000개 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 약 1~1.5, 1.5~2, 2~2.5, 2.5~3, 3~3.5, 3.5~4, 4~4.5, 또는 4.5~5 kb의 길이이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 5 kb, 4.5 kb, 4 kb, 3.5 kb, 3 kb, 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb, 900개 뉴클레오티드, 800개 뉴클레오티드, 700개 뉴클레오티드, 600개 뉴클레오티드, 500개 뉴클레오티드, 400개 뉴클레오티드, 300개 뉴클레오티드, 200개 뉴클레오티드, 100개 뉴클레오티드, 또는 50개 뉴클레오티드 이하의 길이이다.
일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 약 80 내지 약 200개 뉴클레오티드 길이의 ssODN이다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 약 80개 뉴클레오티드 내지 약 3 kb 길이의 ssODN이다. 일부 구현예에서, ssODN은 각각 약 40개 뉴클레오티드 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이의 상동 아암들을 갖는다. 일부 구현예에서, ssODN은 각각 약 30개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이의 상동 아암들을 갖는다. 일부 구현예에서, 상동 아암들은 각각의 상동 아암에서 동일한 수의 뉴클레오티드를 갖는 대칭이다. 일부 구현예에서, 상동 아암들은 각각의 상동 아암에서 상이한 수의 뉴클레오티드를 갖는 비대칭이다.
일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 표적 게놈 유전자좌에서 관심 핵산 서열을 결실시키고 이를 핵산 삽입체로 치환하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 외인성 공여자 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 도입하도록 설계된다. 외인성 공여자 핵산의 예는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 ssODN이다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템 및 외인성 공여자 핵산은 설치류 배아 줄기(ES) 세포 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하기 위해 설치류 ES 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 설치류 ES 세포는 CRISPR/Cas 시스템의 일부 성분을 이미 발현한다. 특정 구현예에서, 설치류 ES 세포는 미국 특허 제2019/0032155 A1호(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)에 기술된 Cas-레디(Cas-ready) 마우스 배아 세포이며, 동 특허 문헌은 그 전체가 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA, Cas 단백질, 및/또는 외인성 공여자 핵산은 임의의 전달 방법(예: 아데노-연관 바이러스(AAV), 지질 나노입자(LNP), 또는 유체역학적 유전자 전달(HDD)) 및 임의의 투여 경로를 통해 세포 또는 비인간 동물(예: 설치류) 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 구성요소(예: 가이드 RNA, Cas 단백질, 및/또는 외인성 공여자 핵산)는 AAV 매개 전달을 통해 전달된다. 예를 들어 미국 특허 공개 제2016/0159436호를 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. AAV의 여러 혈청형이 식별되었다. 이들 혈청형은 이들이 감염시키는 세포의 유형(즉, 혈청형의 향성)이 상이하므로, 특정 세포 유형의 우선적인 형질 도입을 가능하게 한다. CNS 조직을 위한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 심장 조직을 위한 혈청형은 AAV1, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 신장 조직을 위한 혈청형은 AAV2를 포함한다. 폐 조직을 위한 혈청형은 AAV4, AAV5, AAV6, 및 AAV9를 포함한다. 췌장 조직을 위한 혈청형은 AAV8을 포함한다. 광수용체 세포를 위한 혈청형은 AAV2, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 망막 색소 상피 조직을 위한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 골격근 조직을 위한 혈청형은 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 간 조직을 위한 혈청형은 AAV7, AAV8, 및 AAV9, 그리고 특히 AAV8을 포함한다.
일부 구현예에서, 향성은 상이한 바이러스 혈청형 유래의 캡시드와 게놈을 혼합하는 위형화(pseudotyping)를 통해 더 정제될 수 있다. 예를 들어, AAV2/8은 혈청형 8 유래의 캡시드에 포장된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 일부 구현예에서, 위형화된 바이러스는 형질 도입 효율의 개선 뿐만 아니라, 변경된 향성도 나타낸다. 일부 구현예에서, 상이한 혈청형에서 유래된 하이브리드 캡시드가 바이러스 향성을 변경시키는 데 사용된다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템 및 AAV 시스템을 사용함으로써 간의 내인성 설치류 B4galt1 유전자를 변형을 위해 표적화한다.
일부 구현예에서, 간 특이적 표적화는 간에 대한 향성을 갖는 AAV 시스템에 의해 달성된다. 특정 구현예에서, AAV 시스템은 AAV8, AAV2/8, AAV7, AAV9, 및 간 향성을 갖는 상이한 혈청형으로부터 유래된 하이브리드 캡시드(예를 들어 간 향성 AAV인 AAV7, AAV8, 및 AAV9에서 유래된 캡시드의 임의의 조합)를 포함하는 하이브리드 AAV 계통으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, Cas9, gRNA, 및/또는 외인성 공여자 핵산(예: ssODN)은 AAV8을 통해 전달된다. 일부 구현예에서, Cas9, gRNA, 및/또는 외인성 공여자 핵산(예: ssODN)은 AAV2/8을 통해 전달된다. 일부 구현예에서, Cas9, gRNA, 및/또는 외인성 공여자 핵산(예: ssODN)은 간 향성을 갖는 하이브리드 캡시드를 포함하는 AAV 균주를 통해 전달된다.
일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 변형은 유전자 편집 시스템의 적어도 하나의 구성요소의 간 특이적 발현을 통해 간 특이적으로 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 간 특이적 발현은 유전자 편집 시스템 구성요소 중 적어도 하나의 구성요소(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템의 경우 gRNA, Cas 단백질, 외인성 공여자 핵산 등)를 간 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결함으로써 달성된다. 특정 구현예에서, 간 특이적 프로모터는 알부민 프로모터이다.
일부 구현예에서, 특이적 간 표적화는 유전자 편집 시스템의 구성요소의 유체역학적 꼬리 정맥 주입에 의해 촉진된다. 유체역학적 꼬리 정맥 주입 방법은 Kim, Mee J. 및 Nadav Ahituv의 문헌[Pharmacogenomics. Humana Press, Totowa, NJ, 2013. 279-289]에 기술되어 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 전술한 구현예들 중 하나 이상의 조합, 즉 (i) CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소 또는 외인성 공여자 핵산을 전달하기 위한 간 향성 AAV 시스템, (ii) CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소 또는 외인성 공여자 핵산의 간 특이적 발현을 실행하기 위한 간 특이적 프로모터, 및 (iii) CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소 및 외인성 공여자 핵산의 유체역학적 꼬리 정맥 주입, 또는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소를 보유한 핵산 또는 바이러스 벡터 및 외인성 공여자 핵산의 유체역학적 꼬리 정맥 주입의 조합을 사용하여 간 특이적 변형을 달성한다.
일부 구현예에서, 설치류 B4galt1 유전자의 변형은 설치류의 게놈(즉, 생식선 게놈) 내로 도입된다. 이는 설치류 ES 세포 내 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입함으로써 달성될 수 있는데, 그런 다음 변형된 ES 세포(즉, 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 갖는 설치류 ES 세포)를 공여자 세포로서 사용하여 생식선 게놈에서 변형을 갖는 설치류를 만든다.
일부 구현예에서, 변형은 전술한 것과 같은 유전자 편집 시스템을 사용해 설치류 ES 세포 내 설치류 B4galt1 유전자 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 변형은, 변형을 함유하는 설치류 B4galt1 핵산 서열을 운반하는 표적화 벡터의 사용을 통해 설치류 ES 세포 내 내인성 B4galt1 유전자 내로 도입된다. 표적화 벡터는 변형-함유 설치류 B4galt1 핵산 서열에 추가로, 돌연변이-함유 설치류 B4galt1 핵산 서열의 상동성 재조합 및 내인성 설치류 B4galt1 유전자 내로의 혼입을 매개할 수 있도록, 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 설치류 B4galt1 유전자 서열에 상동성이고 길이가 적절한 측면에 위치한 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 설치류 B4galt1 유전자 변형을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 삽입 핵산)는 벡터, 바람직하게는 DNA 벡터 내에 삽입된다. 크기에 따라, 변형된 설치류 B4galt1 유전자 서열을 cDNA 공급원으로부터 직접 클로닝하거나, GenBank로부터 이용 가능한 공개된 서열에 기초하여 가상 환경에서 설계할 수 있다. 대안적으로, 박테리아 인공 염색체(BAC) 라이브러리는 설치류 B4galt1 유전자 서열을 제공할 수 있다. 설치류 B4galt1 유전자 서열은 효모 인공 염색체(YAC)로부터 단리되고, 클로닝되고/되거나 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 핵산은 또한 선택성 마커 유전자(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호에 기재된 바와 같이, 선택성 마커 유전자를 함유하는 자가 결실 카세트)를 함유하며, 이는 부위 특이적 재조합 부위(예를 들어, loxP, Frt 등)가 측면에 위치하거나, 이를 포함할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 형질감염체의 용이한 선택을 가능하게 하기 위해 돌연변이에 인접한 벡터 상에 배치될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 설치류 B4galt1 유전자 서열을 보유하는 BAC 벡터는, 예를 들어, 전기천공에 의해 설치류 배아 줄기(ES) 세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 ES 세포와 랫트 ES 세포 모두는 당업계에 기술되어 있다. 참조: 예를 들어, US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, 및 US 2008-0078000 A1(이들 모두는 본원에 참조로 통합됨)은 마우스 ES 세포, 및 유전적으로 변형된 마우스를 제조하기 위한 VELOCIMOUSE® 방법을 기술하고 있고; US 2014/0235933 A1 및 US 2014/0310828 A1(이들 모두는 본원에 참조로 통합됨)은 랫트 ES 세포, 및 유전적으로 변형된 랫트를 제조하기 위한 방법을 기술하고 있다.
수용체 세포에서의 상동성 재조합은 혼입 부위에 염색체 DNA의 파괴를 도입함으로써 촉진될 수 있으며, 이는 특정 뉴클레아제를 특이적 혼입 부위에 표적화함으로써 달성될 수 있다. 표적 유전자좌에서 DNA 서열을 인식하는 DNA-결합 단백질은 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열에서 특정 3-뉴클레오티드 서열을 인식하는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)가 사용된다. 일부 구현예에서, 전사 활성화제 유사(TAL) 효과기 뉴클레아제(TALEN) 또한 부위 특이적 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 구성요소(Cas9 및 tracrRNA) 및 표적-특이적 CRISPR RNA(crRNA)로 이루어진 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN)가 사용된다.
일부 구현예에서, 5' 및 3' 상동 아암이 측면에 위치한 대상 핵산(예를 들어, 도입될 변형을 함유하는 핵산)을 보유한 표적화 벡터는 하나 이상의 추가 벡터 또는 mRNA와 함께 세포 내로 도입된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 추가 벡터 또는 mRNA는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), ZFN 이량체, 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), TAL 효과기 도메인 융합 단백질 및 RNA-유도식 DNA 엔도뉴클레아제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 부위 특이적 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
기술된 표적화 벡터 또는 유전자 편집 시스템의 사용을 통해 변형된 유전자 서열이 통합된 게놈을 갖는 ES 세포가 선택될 수 있다. 선택 후, 필요에 따라 양성 ES 클론을 변형시켜, 예를 들어 자가 결실 카세트를 제거할 수 있다. 그런 다음, 게놈에 혼입된 변형을 갖는 ES 세포는 VELOCIMOUSE 방법(예를 들어, 미국 특허 제7,576,259호, 제7,659,442호, 제7,294,754호, 및 제2008/0078000 A1호 참조), 또는 미국 특허 제2014/0235933 A1호 및 제2014/0310828 A1호에 기술된 방법을 사용해 전시기(pre-morula stage)의 배아(예를 들어, 8 세포기 배아)에 주입하기 위한 공여자 ES 세포로서 사용된다. 공여자 ES 세포를 포함하는 배아는 배반포 단계까지 배양된 다음, 대리모에 이식되어 공여자 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 설치류를 생산한다. 돌연변이 대립유전자를 가진 설치류 새끼는 돌연변이 서열 또는 선택성 마커 유전자의 존재를 검출하는 대립유전자(MOA) 검정(Valenzuela 등의 전술한 문헌)의 변형을 사용하여, 꼬리 조각으로부터 단리된 DNA의 유전형을 분석함으로써 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형은 설치류의 생식선 게놈에 도입되는 대신에 설치류의 표적 조직 또는 기관 내 설치류 B4galt1 유전자 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 변형은 설치류의 간 내 설치류 B4galt1 유전자 내로, 즉 설치류의 간에 특이적으로 도입된다. 용어 "간 특이적"은 원하는 결과(전달, 발현, 및/또는 표적화된 변형)가 다른 조직 또는 기관과 비교했을 때 상당히 더 (예를 들어, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 그 이상) 많이 발생하는 것을 의미한다. 전술한 바와 같이, 다음 접근법 중 하나 이상을 사용해 간 특이적 변형을 달성할 수 있다: (i) CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소 또는 외인성 공여자 핵산을 전달하기 위한 간 향성 AAV 시스템, (ii) CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소 또는 외인성 공여자 핵산의 간 특이적 발현을 실행하기 위한 간 특이적 프로모터, 및 (iii) CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소 및 외인성 공여자 핵산의 유체역학적 꼬리 정맥 주입, 또는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소를 보유한 핵산 또는 바이러스 벡터 및 외인성 공여자 핵산의 유체역학적 꼬리 정맥 주입.
교배 방법 및 생산된 자손
일부 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같이 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는(즉, 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 포함하는) 게놈을 가진 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시켜 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 게놈을 가진 자손 설치류를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 인간 B4GALT1 단백질 내 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환(즉, "N352S 녹인")을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하는 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 생성하며; 이러한 구현예에서, 상기 방법은 N352S 녹인을 포함하는 게놈을 갖는 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시켜 N352S 녹인을 포함하는 게놈을 갖는 자손 설치류를 생성하는 단계를 포함한다. 교배("breeding" 또는 "cross" 또는 "cross-breeding")는 당업계에서 쉽게 이용할 수 있는 프로토콜에 따라 수행될 수 있으며; 예를 들어, JoVE Science Education Database. Lab Animal Research, Fundamentals of Breeding and Weaning, JoVE, Cambridge, MA, (2018) (영상자료); Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice, A Jackson Laboratory Resource Manual, ⓒ2007 The Jackson Laboratory를 참조하고; 이들 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같이 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 게놈을 가진 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시켜 수득한 설치류 자손이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형은 N352S 녹인을 포함하며; 이러한 구현예에서, N352S 녹인을 포함하는 게놈을 가진 제1 설치류와 제2 설치류 간의 교배로 수득된 자손으로서 N352S 녹인을 포함하는 자손이 제공된다. 일부 구현예에서, 자손 설치류는 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형에 대해 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 자손 설치류는 설치류 B4galt1 유전자에서의 변형에 대해 동형접합체이다. 자손은 교배에 사용된 제2 설치류로부터 물려받은 다른 바람직한 표현형 또는 유전자 변형을 가질 수 있다.
설치류 모델
추가 양태에서, 동물 모델로서 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류의 용도가 본원에 개시되며, 상기 용도는 지질 대사에서 B4galt1의 기능을 구명할 수 있게하고, 대사 장애 및 심혈관 장애를 치료함에 있어서 B4galt1을 표적으로 하는 치료제를 시험하고 개발할 기회를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같이 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류는 B4galt1 단백질의 활성을 억제하는 제제를 시험, 스크리닝, 또는 식별하는 방법에 사용된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류가 변형이 없는 야생형 설치류와 함께 사용되고, 후보 제제는 야생형 설치류에게 투여된다. 변형을 갖는 설치류 및 야생형 설치류 둘 다는 이들의 지질 프로파일, 예를 들어, HDL-C, LDL-C, 및 중성지방의 수준을 측정하기 위해 검사된다. 제제의 투여 후 야생형 설치류에서의 측정치, 투여 전 야생형 설치류에서의 측정치(또는 제제를 투여하지 않은 다른 야생형 설치류에서의 측정치), 및 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 갖는 설치류에서의 측정치를 서로 비교하여, 제제가 B4galt1 단백질의 활성을 억제하는지 여부를 결정한다. 예를 들어, 내인성 B4galt1 유전자에서의 변형이 N352S 녹인 또는 기능 상실 돌연변이인 경우, 투여 전의 야생형 설치류(또는 제제가 투여되지 않은, 즉 N352S 녹인 또는 기능 상실 돌연변이를 갖는 설치류와 동일한 방향으로 제제가 투여되지 않은 또 다른 야생형 설치류)에 비해 LDL-C의 수준을 감소시키는 제제는 B4galt1 단백질의 활성을 억제하는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 제제는, 제제가 투여되지 않은 야생형 설치류에 비해, 제제가 투여된 야생형 설치류에서 혈청 LDL-C 수준을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25% 또는 그 이상만큼 감소시킨다.
일부 구현예에서, 내인성 B4galt1 유전자에서의 변형에 대해 동형접합체인 설치류가 사용된다. 일부 구현예에서, 내인성 B4galt1 유전자에서의 변형에 대해 이형접합체인 설치류가 사용된다. 일부 구현예에서, 내인성 B4galt1 유전자에서의 변형에 대해 동형접합체인 설치류 및 내인성 B4galt1 유전자에서의 변형에 대해 이형접합체인 설치류 둘 다가 시험에 사용된다.
일부 구현예에서, 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 갖는 설치류는 암컷이다. 일부 구현예에서, 내인성 B4galt1 유전자에서 변형을 갖는 설치류는 수컷 설치류이다.
소분자 화합물 및 큰 분자(예를 들어, 항체) 둘 다를 포함하여, 다양한 후보 약제가 본원에 개시된 설치류 및 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 일부 구현예에서, 후보 제제는 B4galt1 단백질(예: 인간 B4GALT1 단백질)에 특이적인 항체이다. 본 설명은 다음의 실시예들에 의해 추가로 예시되며, 다음의 실시예들은 어떤 방식으로도 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 모든 인용된 참조 문헌(문헌 참조, 발행된 특허 및 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 공개된 특허 출원을 포함함)의 내용은 본원에 참조로서 명백하게 포함된다.
다음의 대표적인 구현예가 제시된다.
구현예 1. 설치류로서, 내인성 설치류 β4 갈락토트랜스퍼라아제 1(B4galt1) 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는, 설치류.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 설치류.
구현예 3. 구현예 2에 있어서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 설치류.
구현예 4. 구현예 2 또는 3에 있어서, 설치류는 변형이 없는 야생형 설치류와 비교했을 때, 감소된 LDL-C 수준을 나타내는, 설치류.
구현예 5. 구현예 1에 있어서, 변형은 설치류의 게놈에 존재하는, 설치류.
구현예 6. 구현예 2 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 설치류는 변형에 대해 동형접합체인, 설치류.
구현예 7. 구현예 1에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 설치류.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 설치류.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 설치류.
구현예 10. 구현예 7 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 변형은 설치류의 게놈 내에 존재하는, 설치류.
구현예 11. 구현예 7 내지 9 중 어느 하나에서, 변형은 설치류의 표적 조직이나 기관 내의 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입되는, 설치류.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 변형은 설치류의 간 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입되는, 설치류.
구현예 13. 구현예 1 내지 2 또는 구현예 4 내지 12 중 언 하나에 있어서, 설치류는 마우스 또는 랫트인, 설치류.
구현예 14. 단리된 설치류 세포 또는 조직으로서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 15. 구현예 14에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 16. 구현예 15에 있어서, 설치류 세포 또는 조직은 마우스 세포 또는 조직이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 17. 구현예 14에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 18. 구현예 17에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 20. 구현예 14 내지 15 또는 구현예 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 설치류 세포 또는 조직은 마우스 세포 또는 조직인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 21. 구현예 14 내지 15 또는 구현예 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 설치류 세포 또는 조직은 랫트 세포 또는 조직인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 22. 구현예 14 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 (ES) 세포인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
구현예 23. 설치류 배아로서, 구현예 22의 단리된 설치류 세포를 포함하는 설치류 배아.
구현예 24. 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하여, 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 포함하는 변형된 설치류 ES 세포를 수득하는 단계; 및
(ii) 변형된 설치류 ES 세포를 사용하여 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 25. 구현예 24에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 방법.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 방법.
구현예 27. 구현예 24에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 방법.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 방법.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 방법.
구현예 30. 구현예 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 변형은 유전자 편집 시스템을 통해 내인성 설치류 B4galt1 유전자 내로 도입되는, 방법.
구현예 31. 구현예 30에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인, 방법.
구현예 32. 구현예 31에 있어서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA, Cas9 효소, 및 단일 가닥 올리고데옥시핵산 분자(ssODN)를 포함하는, 방법.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, 가이드 RNA 및 ssODN은 설치류 ES 세포 내로 도입되고, 설치류 ES 세포는 Cas9 효소를 발현하는, 방법.
구현예 34. 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법으로서, 상기 방법은 설치류 조직 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하여 유전적으로 변형된 설치류를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 방법.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 방법.
구현예 37. 구현예 34에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 방법.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 방법.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 방법.
구현예 40. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 변형은 유전자 편집 시스템을 통해 내인성 설치류 B4galt1 유전자 내로 도입되는, 방법.
구현예 41. 구현예 40에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인, 방법.
구현예 42. 구현예 41에 있어서, CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 포함하고, 가이드 RNA는 AAV 시스템에 의해 설치류 내로 전달되는, 방법.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, AAV 시스템은 설치류의 간 내로 가이드 RNA가 전달되는 것을 표적으로 하는, 방법.
구현예 44. 구현예 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, Cas9 효소는 가이드 RNA가 설치류 내로 도입되기 전에 설치류에서 발현되는, 방법.
구현예 45. 구현예 24 내지 44 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 설치류.
구현예 46. 화합물이 B4galt1의 활성에 미치는 영향을 시험하는 방법으로서, 상기 방법은
구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 따라, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류를 제공하는 단계;
변형이 없는 야생형 설치류를 제공하는 단계;
야생형 설치류에게 후보 B4galt1 억제 화합물을 투여하는 단계;
변형을 갖는 설치류 및 야생형 설치류를 검사하여 혈청 LDL-C 수준을 측정하는 단계; 및
화합물을 투여한 야생형 설치류에서의 측정치, 화합물을 투여하기 전 야생형 설치류에서의 측정치, 및 변형을 갖는 설치류에서의 측정치를 비교하여 후보 화합물이 B4galt1의 활성을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 47. 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 게놈을 가진 제1 설치류를 제2 설치류와 교배시키는 단계를 포함하는 방법.
구현예 48. 구현예 47에 있어서, 변형은 갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 감소된 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 방법.
구현예 49. 구현예 47에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 방법.
구현예 50. 구현예 47 내지 49 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득된 자손으로서, 변형을 포함하는 게놈을 가진, 자손.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본원에서 청구된 조성물 및/또는 방법이 어떻게 실시되고 평가되는지에 관한 완전한 개시 및 설명을 제공하도록 제시되고, 순수하게 예시적인 것으로 의도되며, 본 개시를 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1. N352S K/I 마우스의 생성 및 특성 분석
N352S K/I 마우스의 설계 및 생성
B4galt1 p.N353S 돌연변이 마우스를 만들기 위해, CRISPR Cas9 유전자 편집 기술을 사용하였다. 간략하게, 35 ug의 합성된 ssODN, 2.5 ug의 합성된 가이드 RNA(gRNA), 및 5 ug의 Cas9 단백질을 100% C57BL/6NTac(VGB6) 마우스 배아 줄기 세포(ESC) 내로 전기천공하였다. ssODN의 서열은 다음과 같다: ATGCTGTAGTAGGGAGGTGTCGAATGATCCGGCATTCAAGAGACAAGAAAAATGAGCCCAgTCCcCAGAGGTACGTCCTCTCTGTGCCTTCCCTTTATTTATTTATATGTTAGATTTATTT (서열번호 13, 소문자의 뉴클레오티드는 표적화된 ES 클론에서 p.N353S 및 p.P3P 비동의 변화(nonsynonymous changes)를 유발하는 점 돌연변이임). gRNA의 서열은 GAGGACGTACCTCTGAGGATtgg이다(서열번호 11, 소문자의 뉴클레오티드는 PAM 서열임). 표적화된 세포를 TaqMan qPCR 검정에 의해 스크리닝한 다음, Charles River Laboratories(Swiss Webster)의 알비노 마우스의 8-세포 배아에 미세주입하여, 표적화된 세포로부터 100% 유래된 F0 VelociMice®를 생성하였다(Poueymirou 등의 문헌[2007, Nature Biotech. 25(1):91-99]). F0 마우스를 C57BL/6NTac와 1회 교배시켜 유전적 배경이 100% C57BL/6NTac인 표적화된 마우스를 생성하고, 이를 후속하여 동형접합체와 교배시키고 전체 기간 동안 Regeneron 사육 시설에서 유지하였다. 모든 실험에서 대조군으로서 사용된 야생형 마우스도 100% C57BL/6NTac이었다.
혈장 채취
마우스를 규칙적인 일반 식이로 유지시키고, 13주령에 채혈하였다(암컷 WT=14, Het=16, HO=16; 수컷 WT=15, Het=18, HO=14). 마우스를 밤새 굶긴 다음 4.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 굴근 반사(pedal reflex)가 없는 것을 확인한 후, 150~200 ul의 전혈을 후안와 공동 탭을 통해 채취한 즉시, K3 EDTA(Starstedt)로 코팅되고 프로테아제(Roche cOmplete?? Mini EDTA Free) 및 DPP-4 억제제가 담긴 혈장 수집 튜브 내로 옮겼다. 혈장을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 수집하고 -80℃에서 보관하였다.
샘플을 ADVIA Chemistry XPT(Siemens)를 사용하여 검정하였다. 간 및 지질 프로파일에는 다음 시약들이 포함된다: 알라진 아미노전이효소(ALT) - (Siemens REF 03036926); 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) - (Siemens REF 07499718); 콜레스테롤_2(CHOL_2) - (Siemens REF 10376501); 직접 HDL 콜레스테롤(D-HDL) - (Siemens REF 07511947); 직접 LDL 콜레스테롤(DLDL) - (Siemens REF 09793248); 비-에스테르형 지방산(NEFA) - (Wako 999-34691, 995-34791, 991-34891, 993-35191); 중성지방_2(TRIG_2) - (Siemens REF 10335892). 샘플을 분석기에 로딩하고, 시약 혼합, 분석 타이밍, 흡광도, 및 농도 계산을 분석기에 의해 수행하였다. 통계는 시닥의 다중 비교 검정(Prism)을 이용한 이원 ANOVA를 사용하여 계산하였다.
도 2a 내지 도 2b에 도시된 바와 같이, 야생형 마우스와 비교했을 때 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 이형접합성 및 동형접합성 N352S 녹인에서 LDL-C의 수준 감소가 관찰된 반면, 이형접합성 또는 동형접합성 N352S 녹인 마우스와 야생형 마우스 간에 HDL-C, 중성지방, 콜레스테롤, 또는 비-에스테르형 지방산(NEFA)의 수준에 대해서는 명백한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, 이형접합성 또는 동형접합성 N352S 녹인 마우스와 야생형 마우스 간의 ALT 또는 AST 수준에 대해서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 2. B4galt1 간 녹아웃 마우스의 생성 및 특성 분석
지질 대사에서 B4GALT1의 역할을 더 이해하기 위해, CRISPR/Cas9 생체 내 툴박스를 이용하여 간에서 마우스 오소로그(ortholog)(B4galt1)를 녹아웃하였다. 간략하게, Cas9 효소를 구성적으로 발현하는 성체 마우스에게 AAV8을 형질도입하여 B4galt1의 엑손 2를 표적으로 하는 gRNA의 간 특이적 전달을 달성하였다(하기 방법 참조). 이러한 접근법을 통해서 간에서 B4galt1의 50% 유전자를 편집한 반면, 비장에서 B4galt1의 약 2% 유전자를 편집하였다(도 3a, 3b). 그 결과, 간에서 B4galt1 mRNA 수준의 50% 감소가 관찰되었고(도 3c), 비장에서 mRNA의 변화가 없었다(데이터 미도시). 그런 다음, 바이러스 형질도입으로부터 2주차에 시작하여 12주의 연구 기간 전체에 걸쳐 순환하는 LDL-C 수준을 측정하였다. 전체 연구 기간 동안 전체적으로 LDL-C의 50% 감소가 검출되었다(도 3d; 2주차 p < 0.0001; 4주차 p < 0.01; 8주차 p < 0.00001; 12주차 p < 0.01). 동시에, 순환하는 AST 효소의 증가 추세도 시간 경과에 따라 관찰되었지만, HDL-C 또는 총 콜레스테롤에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다(도 3e). LDL-C 수준의 감소는 항상 B4galt1의 엑손 2에 대해 설계되는 2개의 다른 독립적인 gRNA를 사용하여 확인하였다(도 4a 내지 도 4j).
마지막으로, LDL-C에서 나타난 감소가 B4galt1 특이적 절제에 의해 결정되었음을 확인하기 위해, 제2 독립 유전자인 Cfb(보체 인자 B를 암호화하는 유전자)의 간 특이적 녹아웃을 동시에 생성하였다. Cfb를 대조군으로 선택했는데, 이는 Cfb가 간에서 많이 발현되고 LDL-C 및 콜레스테롤 대사에서 있어서는 아직 아무런 작용을 하지 않기 때문이다. 결과적으로, 간에서 Cfb의 편집률은 약 50%인 반면, 비장에서의 편집률은 <1%이었고, Cfb 간 발현은 50% 감소하였다. 예상한대로, LDL-C 수준은 Cfb 간 녹아웃에 의해 영향을 받지 않았다. 또한, 이러한 접근법은 Cas9 구성적 발현 및 바이러스 감염에 의한 임의의 가능한 이차 효과를 배제할 수 있게 하였다. 시간 경과에 따른 Cfb 대조군 간 녹아웃에서의 LDL-C 수준의 임의의 변화는 최소 수준이였고, 이는 주로 생체 내 조작의 고유한 가변성으로 인한 것이었다(도 3d 및 도 4a~4j).
이들 결과는 포유류 계통에서 b4galt1과 LDL-C 대사 간의 기능적 연결을 뒷받침한다.
방법
Cas9 mESC의 생성
mESC(50% C57BL/6NTac 및 50% 129S6/SvEvTac)의 표적화는 전술한 방법을 사용해 수행하였다(Valenzuela 등의 문헌[Nat Biotechnol, 2003. 21(6): p. 652-9]). 간략하게, R26 BAC(BAC_ESr2-445b1_sfi_1)를 변형하여, 탠덤 폴리아데닐화 신호 양측에 LoxP 부위가 위치한 네오마이신 선택을 포함하는 카세트(아미노 3'-글리코실 포스포트랜스퍼라아제)로 R26 인트론 1의 일부를 치환하고, 이어서 전사물이 mESC의 R26 프로모터에 의해 가동될 수 있도록 Cas9를 P2A GFP로 치환하여 표적화 벡터를 제작하였다. 그런 다음, 선형화된 변형된 BAC를 mESC 내로 전기천공하여 변형된 BAC의 표적화 아암을 사용하여 R26 유전자좌에서 상동성 재조합을 유도하였다. 네오마이신 내성에 대해 양성 형질전환체를 선택하였다. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 기초하여 유전자 이식 삽입을 표적화된 재조합과 구별하였다. 표적화가 확인된 후, Cre 재조합효소를 이용해 클론을 전기천공하여 차단 카세트를 절제하고 활성 대립유전자를 생성하였다.
마우스 생산
Cas9 mESC를 8-세포 배아에 주입하여 100% ES 유래 F0 마우스를 생성하였다(Valenzuela 등의 문헌[Nat Biotechnol, 2003. 21(6): p. 652-9]; Poueymirou 등의 문헌[Nat Biotechnol, 2007. 25(1): p. 91-9]). 주입한 8-세포 배아를 대리모에게 옮겨 원하는 삽입을 갖는 살아있는 새끼를 생산하였다. 대리모의 임신 시, 주입된 배아는 검출 가능한 숙주 배아 기여를 갖지 않는 F0 마우스를 생산한다. 완전한 mESC-유래 마우스는 일반적으로 정상이고, 건강하고, 생식력이 있었다. 모든 동뮬 실험은 Regeneron의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행하였다.
가이드 RNA의 설계
가이드 RNA는 CRISPOR 및 BLAT를 참조하여 UCSC(NCBI37/mm9)를 사용하여 설계하였다(Kent 등의 문헌[Genome Res, 2002. 12(6): p. 996-1006]; Kent의 문헌[Genome Res, 2002. 12(4): p. 656-64]; Haeussler 등의 문헌[Genome Biol, 2016. 17(1): p. 148]). Cas9 KO 가이드는 다음 B4galt1 엑손 2를 표적화하도록 설계하였다: B4galt1_mGU1; TATTAAAGTCAATCAGCATG (서열번호 7), 위치 chr4:40770681-40770700, B4galt1_mGU3; GGGCGGCCGTTACTCCCCCA (서열번호 8), 위치 msChr4:40770612-40770631, 및 B4galt1_mGU5; ATGATGATGGCCACCTTGTG (서열번호 9), 위치 msChr4:40770575-40770594. 또한, Cfb를 대조군으로서 선택하고, Cas9 KO 가이드를 msChr17:34998886-34998905에 있는 GAGCGCAACTCCAGTGCTTG(서열번호 10)를 표적화하도록 설계하였다.
바이러스 입자의 생성
표준 결찰에 의해 가이드 RNA 서열을 적절한 AAV 골격 내로 클로닝하였다. HEK 293T 세포를 일시적으로 형질감염시켜 AAV8 벡터를 생산하였다. 형질감염은 폴리에틸렌이민(PEI) MAX(Polysciences)를 사용하여 수행하였다. 아데노바이러스 헬퍼 유전자인 AAV2 rep 및 AAV8 cap 유전자를 암호화하는 3개의 플라스미드, 및 AAV2 반전 말단 반복(ITR)이 측면에 위치한 이식 유전자를 함유하는 재조합 AAV 게놈으로 세포를 형질감염시켰다. 바이러스 함유 배지를 수집하고 0.2 μm PES 막(Nalgene)을 통해 여과하였다. 바이러스를 일련의 원심분리 단계 또는 밀도 구배 초원심분리에 의해 정제하였다.
원심분리에 의한 정제의 경우, 전술한 바와 같이 바이러스 함유 배지를 PEG 침전에 의해 농축시켰다(Arden 등의 문헌[J Biol Methods, 2016. 3(2)]). 펠릿을 PBS(Life Technologies)에 재현탁하고, 10,000 RCF로 원심분리하여 추가로 정제하였다. 상청액을 옮기고, 초원심분리기에서 10℃에서 149,600 RCF로 3시간 동안 회전시켜 AAV를 추가로 펠릿화하였다. AAV 함유 펠릿을 PBS에 재현탁하고, 원심분리로 정화하고, 0.22 μm 아세트산셀룰로오스 막(Corning)을 통해 여과하였다.
아이오딕사놀 구배 분리에 의한 정제의 경우, 접선 유동 여과에 의해 배지를 농축시키고 아이오딕사놀 구배 상에 로딩하였다. 아이오딕사놀 용액 및 구배는 전술한 바와 같이 약간의 변형을 가하여 제조하였다(Zolotukhin 등의 문헌[Gene Ther, 1999. 6(6): p. 973-85]). 구배를 초원심분리기에서 14시간 동안 149,600 RCF로 회전시켰다. AAV 함유 분획을 추출하고, Zeba Spin Desalting 컬럼(ThermoFisher Scientific)을 사용해 0.001% Pluronic(ThermoFisher Scientific)이 포함된 PBS로 완충액을 교환하였다.
꼬리 정맥 주사
꼬리 기저부 정맥 내로 27-게이지 바늘을 삽입하고 약 2 x 1011개의 바이러스 게놈을 100 μL로 주입하여 측면 꼬리 정맥 주사를 수행하였다.
앰플리콘 라이브러리 제조
치료 당 3~5마리의 연구 동물(AAV B4galt1 CR1~5; 무관한 대조군)로부터 간 및 비장 생검을 채취하고, 단백분해효소 K-기반 용해 완충액을 사용하여 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 표적 특이적 올리고를 설계하여(21~27 염기쌍, bp) 프라이머 용융 온도(Tm)가 60~65℃인 350 bp의 최대 앰플리콘 크기를 생성하였다. Illumina 어댑터를 표적 특이적 올리고에 첨가하고, 전체 서열을 Integrated DNA Technologies(IDT)로부터 주문하였다. 각 gDNA 샘플에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 완료하였다. 요약하자면, 각 반응에서, 4 나노그램(ng)의 gDNA를 제조업체의 사양에 따라 IDT 올리고, Q5 중합효소(#M0491, New England Biolabs), 10uM dNTP, 완충액, 및 물과 합쳤다. 다음으로, 증폭 산물을 1:100으로 희석하고 PCR 바코드화 반응에 사용하여 최종 시퀀싱 라이브러리를 생성하였다. 각각의 바코드화 반응은 고유한 Illumina 특이적 바코드와 색인을 갖는 단일 증폭된 표적 및 순방향 및 역방향 프라이머를 함유하였다. 각각의 PCR 플레이트를 동일한 부피로 풀링한 다음, 제조사의 지침에 따라 AMPure XP 시약(#A63881, Beckmann-Coulter)을 사용하여 단일 튜브에서 정제하였다. 최종 라이브러리 농도는 Qubit 형광계(#Q32866, Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 4 nM의 제조된 라이브러리를 2x300 리드 키트(#MS-102-3003, Illumina)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 Illumina MiSeq 상에 로딩하였다.
서열 맵핑 및 특성 분석
바코드화된 샘플을 개별 리드(FASTQ 포맷)로 탈다중화하였다. 그런 다음, (Zhang 등의 문헌[Bioinformatics. 2014 Mar 1; 30(5): 614-620]에 기술된) PEAR 프로그램을 사용해 각 FASTQ 파일의 전방향 및 역방향 리드를 병합하였다. 병합된 리드를 (Langmead 등의 문헌[Nat Methods. 2012 Mar 4; 9(4): 357-359]에 기술된) Bowtie2 프로그램을 사용해 생쥐 게놈 버전 9(Mus musculus　genome version 9, mm9)에 맵핑하였다. 각각의 샘플을 예상 가이드 절단 위치에 걸쳐 최소 20,000개의 병합된 리드로 시퀀싱하였다. 마지막으로, 사용자 정의 펄 스크립트(perl script)를 사용하여 바코드화된 샘플의 특성화를 수행하였다. 간략하게, 예상 절단 부위의 상류 20개 염기 및 하류 20개 염기의 윈도우 내에 있는 모든 삽입, 결실, 또는 염기 변화(INDEL)는 CRISPR로 유도된 변형인 것으로 간주하였다. INDEL을 함유하는 리드의 수를 야생형 서열을 갖는 리드의 수와 비교하여 동물 및 조직당 B4galt1 편집 백분율을 결정하였다.
Taqman 발현 분석
간을 신선한 상태로 절제하여 RNALater 안정화 시약(Qiagen)에 넣고 -20℃에서 보관하였다. 조직을 TRIzol에서 균질화하고 상 분리를 위해 클로로포름을 사용하였다. 총 RNA를 함유하는 수성상을 제조사의 사양에 따라 miRNeasy Mini Kit(Qiagen, Cat#217004)를 사용해 정제하였다. MagMAX?? Turbo?? DNase 완충액 및 TURBO DNase(Ambion by Life Technologies)를 사용해 게놈 DNA를 제거하였다. SuperScript® VILO?? Master Mix(Thermofisher)을 사용해 mRNA(최대 2.5 ug)를 cDNA로 역-전사하였다. ABI 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystem)을 사용해 SensiFASY Probe Hi-ROX(Meridian)로 cDNA를 증폭시켰다. Gapdh를 내부 대조군 유전자로서 사용해 cDNA 입력 차이를 정규화하였다.
혈장 채취
마우스를 밤새 굶긴 다음 4.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 굴근 반사(pedal reflex)가 없는 것을 확인한 후, 150~200 ul의 전혈을 후안와 공동 탭을 통해 채취한 즉시, K3 EDTA(Starstedt)로 코팅되고 프로테아제(Roche cOmplete?? Mini EDTA Free) 및 DPP-4 억제제가 담긴 혈장 수집 튜브 내로 옮겼다. 혈장을 에펜도르프 튜브에 수집하고 -80℃에서 보관하였다.
샘플을 ADVIA Chemistry XPT(Siemens)를 사용하여 검정하였다. 간 및 지질 프로파일에는 다음 시약들이 포함된다: 알라진 아미노전이효소(ALT) - (Siemens REF 03036926); 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) - (Siemens REF 07499718); 콜레스테롤_2(CHOL_2) - (Siemens REF 10376501); 직접 HDL 콜레스테롤(D-HDL) - (Siemens REF 07511947); 직접 LDL 콜레스테롤(DLDL) - (Siemens REF 09793248); 비-에스테르형 지방산(NEFA) - (Wako 999-34691, 995-34791, 991-34891, 993-35191); 중성지방_2(TRIG_2) - (Siemens REF 10335892). 샘플을 분석기에 로딩하고, 시약 혼합, 분석 타이밍, 흡광도, 및 농도 계산을 분석기에 의해 수행하였다. 통계는 시닥의 다중 비교 검정(Prism)을 이용한 이원 ANOVA를 사용하여 계산하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> A Rodent Model of B4GALT1-Mediated Functions <130> 37993PCT (10700WO01) <150> 62/985,045 <151> 2020-03-04 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4214 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcgcctcggg cggcttctcg ccgctcccag gtctggctgg ctggaggagt ctcagctctc 60 agccgctcgc ccgcccccgc tccgggccct cccctagtcg ccgctgtggg gcagcgcctg 120 gcgggcggcc cgcgggcggg tcgcctcccc tcctgtagcc cacacccttc ttaaagcggc 180 ggcgggaaga tgaggcttcg ggagccgctc ctgagcggca gcgccgcgat gccaggcgcg 240 tccctacagc gggcctgccg cctgctcgtg gccgtctgcg ctctgcacct tggcgtcacc 300 ctcgtttact acctggctgg ccgcgacctg agccgcctgc cccaactggt cggagtctcc 360 acaccgctgc agggcggctc gaacagtgcc gccgccatcg ggcagtcctc cggggagctc 420 cggaccggag gggcccggcc gccgcctcct ctaggcgcct cctcccagcc gcgcccgggt 480 ggcgactcca gcccagtcgt ggattctggc cctggccccg ctagcaactt gacctcggtc 540 ccagtgcccc acaccaccgc actgtcgctg cccgcctgcc ctgaggagtc cccgctgctt 600 gtgggcccca tgctgattga gtttaacatg cctgtggacc tggagctcgt ggcaaagcag 660 aacccaaatg tgaagatggg cggccgctat gcccccaggg actgcgtctc tcctcacaag 720 gtggccatca tcattccatt ccgcaaccgg caggagcacc tcaagtactg gctatattat 780 ttgcacccag tcctgcagcg ccagcagctg gactatggca tctatgttat caaccaggcg 840 ggagacacta tattcaatcg tgctaagctc ctcaatgttg gctttcaaga agccttgaag 900 gactatgact acacctgctt tgtgtttagt gacgtggacc tcattccaat gaatgaccat 960 aatgcgtaca ggtgtttttc acagccacgg cacatttccg ttgcaatgga taagtttgga 1020 ttcagcctac cttatgttca gtattttgga ggtgtctctg ctctaagtaa acaacagttt 1080 ctaaccatca atggatttcc taataattat tggggctggg gaggagaaga tgatgacatt 1140 tttaacagat tagtttttag aggcatgtct atatctcgcc caaatgctgt ggtcgggagg 1200 tgtcgcatga tccgccactc aagagacaag aaaaatgaac ccaatcctca gaggtttgac 1260 cgaattgcac acacaaagga gacaatgctc tctgatggtt tgaactcact cacctaccag 1320 gtgctggatg tacagagata cccattgtat acccaaatca cagtggacat cgggacaccg 1380 agctagcgtt ttggtacacg gataagagac ctgaaattag ccagggacct ctgctgtgtg 1440 tctctgccaa tctgctgggc tggtccctct catttttacc agtctgagtg acaggtcccc 1500 ttcgctcatc attcagatgg ctttccagat gaccaggacg agtgggatat tttgccccca 1560 acttggctcg gcatgtgaat tcttagctct gcaaggtgtt tatgcctttg cgggtttctt 1620 gatgtgttcg cagtgtcacc ccagagtcag aactgtacac atcccaaaat ttggtggccg 1680 tggaacacat tcccggtgat agaattgcta aattgtcgtg aaataggtta gaatttttct 1740 ttaaattatg gttttcttat tcgtgaaaat tcggagagtg ctgctaaaat tggattggtg 1800 tgatcttttt ggtagttgta atttaacaga aaaacacaaa atttcaacca ttcttaatgt 1860 tacgtcctcc ccccaccccc ttctttcagt ggtatgcaac cactgcaatc actgtgcata 1920 tgtcttttct tagcaaaagg attttaaaac ttgagccctg gaccttttgt cctatgtgtg 1980 tggattccag ggcaactcta gcatcagagc aaaagccttg ggtttctcgc attcagtggc 2040 ctatctccag attgtctgat ttctgaatgt aaagttgttg tgtttttttt taaatagtag 2100 tttgtagtat tttaaagaaa gaacagatcg agttctaatt atgatctagc ttgattttgt 2160 gttgatccaa atttgcatag ctgtttaatg ttaagtcatg acaatttatt tttcttggca 2220 tgctatgtaa acttgaattt cctatgtatt tttattgtgg tgttttaaat atggggaggg 2280 gtattgagca ttttttaggg agaaaaataa atatatgctg tagtggccac aaataggcct 2340 atgatttagc tggcaggcca ggttttctca agagcaaaat caccctctgg ccccttggca 2400 ggtaaggcct cccggtcagc attatcctgc cagacctcgg ggaggatacc tgggagacag 2460 aagcctctgc acctactgtg cagaactctc cacttcccca accctcccca ggtgggcagg 2520 gcggagggag cctcagcctc cttagactga cccctcaggc ccctaggctg gggggttgta 2580 aataacagca gtcaggttgt ttaccagccc tttgcacctc cccaggcaga gggagcctct 2640 gttctggtgg gggccacctc cctcagaggc tctgctagcc acactccgtg gcccaccctt 2700 tgttaccagt tcttcctcct tcctcttttc ccctgccttt ctcattcctt ccttcgtctc 2760 cctttttgtt cctttgcctc ttgcctgtcc cctaaaactt gactgtggca ctcagggtca 2820 aacagactat ccattcccca gcatgaatgt gccttttaat tagtgatcta gaaagaagtt 2880 cagccgaacc cacaccccaa ctccctccca agaacttcgg tgcctaaagc ctcctgttcc 2940 acctcaggtt ttcacaggtg ctcccacccc agttgaggct cccacccaca gggctgtctg 3000 tcacaaaccc acctctgttg ggagctattg agccacctgg gatgagatga cacaaggcac 3060 tcctaccact gagcgccttt gccaggtcca gcctgggctc aggttccaag actcagctgc 3120 ctaatcccag ggttgagcct tgtgctcgtg gcggacccca aaccactgcc ctcctgggta 3180 ccagccctca gtgtggaggc tgagctggtg cctggcccca gtcttatctg tgcctttact 3240 gctttgcgca tctcagatgc taacttggtt ctttttccag aagcctttgt attggttaaa 3300 aattattttc cattgcagaa gcagctggac tatgcaaaaa gtatttctct gtcagttccc 3360 cactctatac caaggatatt attaaaacta gaaatgactg cattgagagg gagttgtggg 3420 aaataagaag aatgaaagcc tctctttctg tccgcagatc ctgacttttc caaagtgcct 3480 taaaagaaat cagacaaatg ccctgagtgg taacttctgt gttattttac tcttaaaacc 3540 aaactctacc ttttcttgtt gttttttttt tttttttttt tttttttttg gttaccttct 3600 cattcatgtc aagtatgtgg ttcattctta gaaccaaggg aaatactgct ccccccattt 3660 gctgacgtag tgctctcatg ggctcacctg ggcccaaggc acagccaggg cacagttagg 3720 cctggatgtt tgcctggtcc gtgagatgcc gcgggtcctg tttccttact ggggatttca 3780 gggctggggg ttcagggagc atttcctttt cctgggagtt atgaccgcga agttgtcatg 3840 tgccgtgccc ttttctgttt ctgtgtatcc tattgctggt gactctgtgt gaactggcct 3900 ttgggaaaga tcagagaggg cagaggtggc acaggacagt aaaggagatg ctgtgctggc 3960 cttcagcctg gacagggtct ctgctgactg ccaggggcgg gggctctgca tagccaggat 4020 gacggctttc atgtcccaga gacctgttgt gctgtgtatt ttgatttcct gtgtatgcaa 4080 atgtgtgtat ttaccattgt gtagggggct gtgtctgatc ttggtgttca aaacagaact 4140 gtatttttgc ctttaaaatt aaataatata acgtgaataa atgaccctat ctttgtaaca 4200 aaaaaaaaaa aaaa 4214 <210> 2 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30 His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 35 40 45 Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80 Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro 85 90 95 Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser 100 105 110 Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 115 120 125 Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile Glu 130 135 140 Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln Asn Pro Asn 145 150 155 160 Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His 165 170 175 Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys 180 185 190 Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu Asp 195 200 205 Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn Arg 210 215 220 Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp 225 230 235 240 Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp 245 250 255 His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val Ala 260 265 270 Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly Gly 275 280 285 Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro 290 295 300 Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg 305 310 315 320 Leu Val Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 325 330 335 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn 340 345 350 Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser 355 360 365 Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr 370 375 380 Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 385 390 395 <210> 3 <211> 4535 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 actccatttt ctcactatcc caaggctacc gcctgtcctc ttgtcctcac tagctgctgt 60 cccaggccca tacccgagtc actgggtacg tcaggaagtg gtgagcagct cgttgaacaa 120 gaagctggtt tagagagact taagctccac ggtgaacgct aggaagaaaa gctgagcgcc 180 gctgggtatg ggatgcccgc tcaacccaag gctgcggtgg ggctggcgga gcgccacgtt 240 tagtccccaa gtgtcgcgac gccctgcaac ccaacctccc gagggcccgc cccttagtgc 300 ctgcccccca agctccgccc tcccttagct gccagaaaaa cccggctgaa ggttccgccc 360 ctcagtcccc tctccgagcc ttgtccctca tgccccgccc ctctcgaaaa agacccgctt 420 tgcggcccca ccccttagac tccgcccccc caggttccgc gaacagcctt ccgaaacccg 480 gttgaggccc cgccctaggt cgagaccacg ccccctgctc atccgcgctt gtggttcccg 540 ctgatctctc caaagtcccg cggccagggg tgtcggcttt ccgccgcagg cggccggtgc 600 tgcgctaggt cctagccccc tccccccggc ccctccttcg atcgctgtgg tcgggtagcg 660 cctggcgggc ggcctgcggg cgggccgtcc tctcagccgt agcccacccc ctcttaaagc 720 cgcggcggga agatgaggtt tcgtgagcag ttcctgggcg gcagcgccgc gatgccgggc 780 gcgaccctgc agcgggcctg ccgcctgctc gtggccgtct gcgcgctgca cctcggcgtc 840 accctcgtct attacctctc tggccgcgat ctgagccgcc tgccccagtt ggtcggagtc 900 tcctctacac tgcagggcgg cacgaacggc gccgcagcca gcaagcagcc cccaggagag 960 cagcggccgc ggggtgcgcg gccgccgcct cctttaggcg tctccccgaa gcctcgcccg 1020 ggtctcgact ccagccctgg tgcagcttct ggccccggct tgaagagcaa cttgtcttcg 1080 ttgccagtgc ccaccaccac tggactgttg tcgctgccag cttgccctga ggagtccccg 1140 ctgctcgttg gccccatgct gattgacttt aatattgctg tggatctgga gcttttggca 1200 aagaagaacc cagagataaa gacgggcggc cgttactccc ccaaggactg tgtctctcct 1260 cacaaggtgg ccatcatcat cccattccgt aaccggcagg agcatctcaa atactggctg 1320 tattatttgc atcccatcct tcagcgccag caactcgact atggcatcta cgtcatcaat 1380 caggctggag acaccatgtt caatcgagct aagctgctca atattggctt tcaagaggcc 1440 ttgaaggact atgattacaa ctgctttgtg ttcagtgatg 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ccacccaacg tctccagttc 3180 ttattgttct ccttccttcc ttctttcctt tcccttctca cctctttgcc tccttcccta 3240 aaattcgctg tggccctcgg ggtcagactg ttcattctcc agcatgattg tgccttttaa 3300 ttagaggtct agaaagttca cctgaaccca cacccccttc ttcctgagaa ttctggtgcc 3360 tctaaagccc ctccttgcca ctcagggttt tagtgggtgc tcccactgct cagtgtaccc 3420 atgagctgtc gtcattcaca gagccctgtg ccaggccgtg ttctgtgcct gcctgcggtg 3480 atgtagccag aagcacgtac tcaggtcatc aagccgagag ggcgtcaaag aggaagcctg 3540 ggctgggatc cttaggctca gctgtctgtc taatcccaga gctaagccct ttctgcttcg 3600 ggcagcctgg actccagccc tgagtataga ggcggtgtgg atggctggcc ctcatcctac 3660 ctgtgtcttt attgctttga tcaccacagt ctctaacttg ctgctttctc cagaagcctt 3720 tttatgtatg ggttagaaac tcttttttcc ctagtcagag cagccaggct gtacaaaatc 3780 tgtgctctct cggttcccca tgcctctaga aggccgttaa aaccaagact ggatgcactg 3840 agaggagtct tttttttttt tttttttttt ttctgtccca agatcctgac ttttccaaag 3900 tgccttaaaa gaagggagac agactcattg agtgtgttgc ttctttctct cctaaagcaa 3960 acctctgcct tttctctatg ctgttcgtgt tgggttttgt 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Ala Ala Ser Lys Gln Pro Pro Gly Glu Gln Arg Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Val Ser Pro Lys Pro Arg Pro 85 90 95 Gly Leu Asp Ser Ser Pro Gly Ala Ala Ser Gly Pro Gly Leu Lys Ser 100 105 110 Asn Leu Ser Ser Leu Pro Val Pro Thr Thr Thr Gly Leu Leu Ser Leu 115 120 125 Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile 130 135 140 Asp Phe Asn Ile Ala Val Asp Leu Glu Leu Leu Ala Lys Lys Asn Pro 145 150 155 160 Glu Ile Lys Thr Gly Gly Arg Tyr Ser Pro Lys Asp Cys Val Ser Pro 165 170 175 His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu 180 185 190 Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Ile Leu Gln Arg Gln Gln Leu 195 200 205 Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Met Phe Asn 210 215 220 Arg Ala Lys Leu Leu Asn Ile Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr 225 230 235 240 Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asp 245 250 255 Asp Arg Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val 260 265 270 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly 275 280 285 Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ala Ile Asn Gly Phe 290 295 300 Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn 305 310 315 320 Arg Leu Val His Lys Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val 325 330 335 Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro 340 345 350 Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Arg 355 360 365 Phe Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Lys Val Leu Asp Val Gln Arg 370 375 380 Tyr Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Arg 385 390 395 <210> 5 <211> 2298 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 cctctcgtgc cccgctgatc tctccagagt cccgcggctg ggggtgtcga ctttccgcca 60 caggcggccg gtgctgcgct aggtcctagc cctccccccg gcccccaccc cccggcccct 120 ccttccatcg ctgtggtcgg gtagcgcctg gcgggcggcc tgcgggcggg ccgtcctctc 180 agccgtagcc caccccctct taaagccgcg gcgggaagat gaggtttcgt gagccgttcc 240 tgggcggcag cgccgcgatg ccgggcgcga ccctgcagcg ggcctgccgc ctgctcgtgg 300 cggtctgcgc gctgcacctt ggcgtcaccc tggtctatta cctctccggt cgcgatctga 360 gccgcctgcc ccaactggtc ggagtctcct cttcactgca aggcggcacg aacggcgccg 420 ccgccagcaa gcagccctcg ggagagctcc ggccccgggg cgcgcggccg ccgcctcctt 480 taggcgtctc cccgaagcct cgcccgggtt ctgactccag ccctgatgcg gcttctggcc 540 ccggcctgaa gagcaacttg acttcggtgc caatgcccac cagcactgga ttgttgactc 600 tgcctgcttg ccctgaggag tccccgctgc tcgttggccc catggtgatt gactttaata 660 ttcctgtgga tctggagctt ttggcaaaga agaacccaga gataaagatg ggcggccgtt 720 acttccccaa ggactgtatc tcccctcaca aggtggccat cattatccca ttccgtaacc 780 ggcaggagca cctcaaatac tggctgtatt atttgcatcc agtccttcag cgccagcaac 840 tcgactatgg catctacgtc atcaatcagg ctggagacac catgtttaat cgagctaagc 900 tgctcaacgt tggctttcaa gaggccttga aagactatga ctacaactgc tttgtgttca 960 gtgatgtgga cctcattcca atggatgacc ataatgccta caggtgcttt tcacagccac 1020 ggcatatttc tgtcgcaatg gacaagttcg ggtttagcct gccttacgtt cagtattttg 1080 gaggtgtctc cgctctcagt aaacaacagt tccttaccat caatggattt cctaataatt 1140 actggggctg gggaggagaa gatgatgaca tttttaacag attagttcat aaaggcatgt 1200 ctatatcacg cccaaatgct gtggtaggca ggtgtcgcat gatccggcac tcaagagaca 1260 agaaaaatga gcccaaccct cagaggtttg accggatcgc acatacaaag gaaacgatgc 1320 gccttgatgg tttgaactca cttacctacc aggtgttgga catacagaga tacccgttat 1380 ataccaaaat cacagtggac atcgggacac caagatagca ttttggtaca aataagagac 1440 ccgaggatgg ccagagacct cagatgtgtg tctctgccag tcgactgggc tggtccctct 1500 catttgttca gtctgaatga tagttctcct tccttaccat tcagacatct ttccagatgc 1560 ccagggtgaa tgtcacgttt acccacaacc tggctcggca ctgggtgaaa ttctacaagg 1620 tgtttatcag tgtaaaaacg gtcagccttt ggagaggttt cttggacacg tcacccccaa 1680 agagtcggaa ctgtgcccag ctccaacctt agtgactgtg ggtcatagtc ccagtgctga 1740 aactgctgaa gtgtgacatg ggtaagagct ttgctttagt cggcgatgtc cacacttcat 1800 gaccaatgga ggctgctgct ggattcggat tcacaagata ttcttgcata tttttttata 1860 caaaaaatca aaatttcaat cagtctcgtg ttctgtccct ttcctatgtc ctctcaccgg 1920 tatgcaacta ttacaatcac tgcgtgtgcg tcttttctta gcaaaagagt tttaaaactt 1980 gagcctggag cttggtgtcc tgtgagtgtg gctgccgagg ccttgccctc agagcagggg 2040 ccgggacact cacttccgtg acccgtctcc agatccctgt ctgatttctg aatgtaaaga 2100 ggttttttgt ggttgttgtt ttgttttgtt tttgttttta gaagcagttt gtagtatttt 2160 aaagaataaa tcaagttttg attatgctat aggttgattt ttgtgttgat ccaaattgga 2220 atagctattg agtgttttaa gtcgtgactt tatttttctg ggcatgctat ataaacttga 2280 atttcctatg taaaaaaa 2298 <210> 6 <211> 399 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Arg Phe Arg Glu Pro Phe Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30 His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ser Gly Arg Asp Leu Ser 35 40 45 Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Ser Ser Leu Gln Gly Gly Thr 50 55 60 Asn Gly Ala Ala Ala Ser Lys Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Val Ser Pro Lys Pro Arg Pro 85 90 95 Gly Ser Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Ser Gly Pro Gly Leu Lys Ser 100 105 110 Asn Leu Thr Ser Val Pro Met Pro Thr Ser Thr Gly Leu Leu Thr Leu 115 120 125 Pro Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Val Ile 130 135 140 Asp Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Glu Leu Leu Ala Lys Lys Asn Pro 145 150 155 160 Glu Ile Lys Met Gly Gly Arg Tyr Phe Pro Lys Asp Cys Ile Ser Pro 165 170 175 His Lys Val Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu 180 185 190 Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu 195 200 205 Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Met Phe Asn 210 215 220 Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr 225 230 235 240 Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asp 245 250 255 Asp His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val 260 265 270 Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly 275 280 285 Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe 290 295 300 Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn 305 310 315 320 Arg Leu Val His Lys Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val 325 330 335 Gly Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro 340 345 350 Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Arg 355 360 365 Leu Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Ile Gln Arg 370 375 380 Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Arg 385 390 395 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 7 tattaaagtc aatcagcatg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 8 gggcggccgt tactccccca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 9 atgatgatgg ccaccttgtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 10 gagcgcaact ccagtgcttg 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 11 gaggacgtac ctctgaggat tgg 23 <210> 12 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 atgctgtagt agggaggtgt cgaatgatcc ggcattcaag agacaagaaa aatgagccca 60 atcctcagag gtacgtcctc tctgtgcctt ccctttattt atttatatgt tagatttatt 120 t 121 <210> 13 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotides <400> 13 atgctgtagt agggaggtgt cgaatgatcc ggcattcaag agacaagaaa aatgagccca 60 gtccccagag gtacgtcctc tctgtgcctt ccctttattt atttatatgt tagatttatt 120 t 121

Claims (46)

  1. 설치류로서, 내인성 설치류 β4 갈락토트랜스퍼라아제 1(B4galt1) 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는, 설치류.
  2. 제1항에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 설치류.
  3. 제2항에 있어서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 설치류.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 설치류는 변형이 없는 야생형 설치류와 비교했을 때, 감소된 LDL-C 수준을 나타내는, 설치류.
  5. 제1항에 있어서, 변형은 설치류의 게놈에 존재하는, 설치류.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 변형에 대해 동형접합체인, 설치류.
  7. 제1항에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 설치류.
  8. 제7항에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 설치류.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 설치류.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 설치류의 게놈 내에 존재하는, 설치류.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 설치류의 표적 조직이나 기관 내의 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입되는, 설치류.
  12. 제11항에 있어서, 변형은 설치류의 간 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 도입되는, 설치류.
  13. 제1항 내지 제2항 또는 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 랫트인, 설치류.
  14. 단리된 설치류 세포 또는 조직으로서, 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  15. 제14항에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  16. 제15항에 있어서, 설치류 세포 또는 조직은 마우스 세포 또는 조직이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  17. 제14항에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  18. 제17항에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  20. 제14항 내지 제15항 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 세포 또는 조직은 마우스 세포 또는 조직인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  21. 제14항 내지 제15항 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 세포 또는 조직은 랫트 세포 또는 조직인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  22. 제14항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 세포는 설치류 배아 줄기 (ES) 세포인, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  23. 제22항의 단리된 설치류 세포를 포함하는 설치류 배아.
  24. 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 설치류 배아 줄기(ES) 세포의 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하여, 변형된 설치류 B4galt1 유전자를 포함하는 변형된 설치류 ES 세포를 수득하는 단계; 및
    (ii) 변형된 설치류 ES 세포를 사용하여 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 유전자 편집 시스템을 통해 내인성 설치류 B4galt1 유전자 내로 도입되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 가이드 RNA, Cas9 효소, 및 단일 가닥 올리고데옥시핵산 분자(ssODN)를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 가이드 RNA 및 ssODN은 설치류 ES 세포 내로 도입되고, 설치류 ES 세포는 Cas9 효소를 발현하는, 방법.
  34. 유전적으로 변형된 설치류를 만드는 방법으로서, 상기 방법은:
    설치류 조직 내 내인성 설치류 B4galt1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 B4galt1 유전자에 변형을 도입하여 유전적으로 변형된 설치류를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 변형은 인간 B4GALT1 단백질의 위치 352에 상응하는 아미노산 위치에서 Asn에서 Ser으로의 치환을 포함하는 B4galt1 단백질을 암호화하도록 설치류 B4galt1 유전자를 변형시키는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 설치류는 마우스이고, 치환은 마우스 B4galt1 단백질의 아미노산 위치 353에 존재하는, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 변형은 기능 상실 돌연변이인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 기능 상실 돌연변이는 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 코딩 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환은 내인성 설치류 B4galt1 유전자의 엑손 2에서 발생하는, 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 유전자 편집 시스템을 통해 내인성 설치류 B4galt1 유전자 내로 도입되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 포함하고, 가이드 RNA는 AAV 시스템에 의해 설치류 내로 전달되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, AAV 시스템은 설치류의 간 내로 가이드 RNA가 전달되는 것을 표적으로 하는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, Cas9 효소는 가이드 RNA가 설치류 내로 도입되기 전에 설치류에서 발현되는, 방법.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 설치류.
  46. 화합물이 B4galt1의 활성에 미치는 영향을 시험하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 제13항 중 어느 한 항에 따라, 내인성 설치류 B4galt1 유전자에서 변형을 포함하는 설치류를 제공하는 단계;
    변형이 없는 야생형 설치류를 제공하는 단계;
    야생형 설치류에게 후보 B4galt1 억제 화합물을 투여하는 단계;
    변형을 갖는 설치류 및 야생형 설치류를 검사하여 혈청 LDL-C 수준을 측정하는 단계; 및
    화합물을 투여한 야생형 설치류에서의 측정치, 화합물을 투여하기 전 야생형 설치류에서의 측정치, 및 변형을 갖는 설치류에서의 측정치를 비교하여 후보 화합물이 B4galt1의 활성을 억제하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
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BR112020001364A2 (pt) 2017-07-31 2020-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. métodos para testar e modificar a capacidade de uma crispr/cas nuclease.
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