CN114591957B - 一种重症a型血友病动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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-
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Abstract
本发明提供了一种重症A型血友病动物模型的构建方法及其应用,所述靶向FⅧ基因的gRNA组合包括gRNA3和gRNA4;所述gRNA3包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,所述gRNA4包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种FⅧ基因编辑系统、一种重组细胞及其构建方法以及一种重症A型血友病动物模型的构建方法。通过基因编辑及筛选,成功构建了缺失FⅧ基因外显子23至外显子25之间长度为10796bp的序列的A型血友病小鼠模型,可应用于相关的研究中,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域,尤其涉及一种重症A型血友病动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
FⅧ(Coagulation FactorⅧ)又称第八凝血因子,或抗血友病球蛋白。FⅧ在肝脏中合成,参与血液凝集反应,是血液中的一种重要的凝血因子。它的不足或缺失会造成血液凝集障碍,导致出血不止,在临床上定性为A型血友病。A型血友病是凝血因子Ⅷ基因突变导致该凝血因子功能缺陷的一种凝血功能障碍性遗传病。它是一种X-性连锁隐性遗传性疾病,一般为男性发病,女性传递。女性患者极为罕见,男性发病率为1/5000,占血友病发病人数的80%~85%。
FⅧ是血液凝集反应的重要因子,其基因突变会造成FⅧ合成受阻,导致血液凝集发生障碍,进而造成A型血友病的发生。基因缺陷的类型主要包括点突变(错义突变、无义突变以及终止密码子突变)、内含子倒位、异常基因插入、基因缺失和基因片段重复等。
根据凝血因子Ⅷ的缺失程度,A型血友病可以分为轻度血友病(5%~30%凝血因子Ⅷ)、中度血友病(2%~5%凝血因子Ⅷ)和重度血友病(<1%凝血因子Ⅷ),发病率分别为50%、10%和40%。其中,至少50%的重度A型血友病是由22号内含子倒位破坏了基因编码区,造成了凝血因子Ⅷ缺失而引起的,因此,凝血因子Ⅷ基因的22号内含子倒位是造成血友病的最常见的突变。
非等位同源重组(Non-allelic homo-logous recombination,NAHR)是导致凝血因子Ⅷ基因内含子倒位突变的原因。非等位同源重组由基因组中与同源模板序列类似的非同源序列介导,是引起DNA重排的关键机制之一。凝血因子Ⅷ基因含有3个22号内含子同系物(int22h-1、int22h-2和int22h-3)可作为非同源模版,诱发凝血因子Ⅷ基因上的DNA双链断裂,经非等位同源重组途径错误修复,产生内含子倒位。
野生型FⅧ由2个单独调控的转录单元组成,它们分别合成包含FⅧ外显子序列的聚腺苷化转录变体FⅧFL和FⅧB。FⅧFL包含在FⅧ外显子1~26中,含有9030个碱基,编码全长FⅧ蛋白-FⅧFL,其成熟的循环形式包含2332个氨基酸残基,对正常的凝血至关重要。FⅧB包含2598个碱基,包括第一个外显子的169个碱基(在FⅧFL中未发现),最后4个外显子的2429个碱基与FⅧFL的外显子23到26相同,其编码的野生型FⅧB由216个氨基酸组成,功能未知。
内含子22倒位的FⅧ位点也由2个单独调控的转录单元组成,它们分别合成包含FⅧ外显子序列的聚腺苷化转录变体FⅧI22I和FⅧB。此外,FⅧB基因、转录本以及FⅧB蛋白,证实与没有HA的健康人相同。FⅧI22I包含在FⅧ外显子1到22中发现的6756个碱基,以及在外显子23C中额外的48个DCS碱基,其编码的FⅧI22I蛋白包含2159个氨基酸残基。
人类A型血友病是一种罕见的单基因遗传性疾病。A型血友病的预防主要靠产前诊断,而治疗方法主要有预防出血、局部止血、辅助治疗、替代疗法和基因治疗。目前,治疗A型血友病的主要手段是通过补充FⅧ的替代疗法,通过注射FⅧ制剂来维持血液中FⅧ的正常水平。从以前的注射同型新鲜血液到现在由各种技术生产的FⅧ制剂,虽极大地提高了FⅧ制剂的产量,但仍不能满足A型血友病患者对FⅧ的需求。
开发出新的治疗药物以减少或消除A型血友病对患者的危害已成为当务之急。研发治疗A型血友病的药物迫切需要活体模型,作为模式生物的小鼠无疑成为了其中的佼佼者。小鼠具有无可比拟的优势:(1)小鼠的基因序列已经全部测出并公布,基因组与人类有90%同源;(2)生理生化和发育与人相似;(3)繁育和发育速度特别快。因此,小鼠疾病模型是用于疾病研究的理想模型。
依据基因打靶技术,美国科学家Bi等人(Bi L,Lawler AM,Antonarakis SE,etal.Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model ofhaemophilia A.Nat Genet,1995,10(1):119-121.)在小鼠胚胎干细胞中通过基因同源重组技术将Neo基因分别插入编码mFⅧ的基因的16号和17号外显子的3’末端,成功构建了HA小鼠模型。Chao等人(Chao BN,Baldwin WH,Healey JF,et al.Characterization of agenetically engineered mouse model of hemophilia A with complete deletion ofthe F8 gene.J Thromb Haemost,2016,14(2):346-355.)通过Cre-lox系统将FⅧ基因的所有外显子从基因组中删除得到了另一种HA小鼠模型。
基因敲除小鼠构建的传统策略是通过同源重组的方式,例如用Neo基因替换目的基因或删除目的基因中的关键外显子,从而实现目的基因的敲除,其缺点是周期长、费用高。
FⅧ基因突变是造成A型血友病发病的主要原因,利用基因敲除技术引发FⅧ基因的移码突变,构建A型血友病小鼠模型,是研究A型血友病最佳的活体替代模型,对A型血友病的研究具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种重症A型血友病动物模型的构建方法及其应用,其使用的靶向FⅧ基因的gRNA组合特异性强,靶向性好,基因编辑效率高,实现了FⅧ基因的大片段敲除,应用价值高。
为达此目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种靶向FⅧ基因的gRNA组合,所述靶向FⅧ基因的gRNA组合包括gRNA3和gRNA4;
所述gRNA3包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,所述gRNA4包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1:CAGTCCGTCACTTAGTTTTATGG;
SEQ ID No.2:GTGGTGCCTAATCGTTACTCAGG。
FⅧ基因位于X染色体长臂末端(Xq28),基因长度超过186kb,由26个外显子和25个内含子组成,本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将FⅧ基因的外显子23至外显子25敲除。
本发明中,所述靶向FⅧ基因的gRNA组合靶向FⅧ基因的内含子序列,其中,gRNA3靶向内含子22,gRNA4靶向内含子25,二者相互配合,降低了脱靶率,特异性更高,可以避免非特异性的基因编辑,同时实现了FⅧ基因的大片段敲除,编辑效率更高。其中gRNA位点与FⅧ基因结构的对应关系如图1所示。
第二方面,本发明提供了一种FⅧ基因编辑系统,所述FⅧ基因编辑系统包括第一方面所述的靶向FⅧ基因的gRNA组合。
优选地,所述FⅧ基因编辑系统还包括Cas9。
优选地,所述Cas9包括Cas9核酸酶和/或Cas9核酸酶的mRNA。
第三方面,本发明提供了一种重组细胞,所述重组细胞含有第一方面所述的靶向FⅧ基因的gRNA组合。
优选地,所述重组细胞含有第二方面所述的FⅧ基因编辑系统。
优选地,所述重组细胞为经过第二方面所述的FⅧ基因编辑系统编辑后,基因组中敲除了FⅧ基因的受精卵细胞。
优选地,所述重组细胞为经过第二方面所述的FⅧ基因编辑系统编辑后,基因组中缺失了FⅧ基因外显子23至外显子25之间的序列的受精卵细胞。
本发明中,通过对细胞的FⅧ基因进行编辑,获得的重组细胞可以通过细胞分裂的方式将突变的基因型传递给子代细胞,实现了基因突变的稳定性及可遗传性,降低了筛选的工作量,应用价值更为广泛。
第四方面,本发明提供了第三方面所述的重组细胞的构建方法,所述构建方法包括:
将第二方面所述的FⅧ基因编辑系统导入受精卵细胞的细胞核内,得到所述重组细胞。
本发明中,将FⅧ基因编辑系统直接导入受精卵细胞的细胞核内,避免了gRNA3、gRNA4和Cas9核酸酶的mRNA只能在细胞分裂、核膜消失时对基因组进行编辑的弊端,提高了基因编辑的效率;选取受精卵细胞用于构建重组细胞,可以降低嵌合体出现的概率,保证有义突变可以传递给子代,降低后期筛选的工作量。
优选地,所述导入包括显微注射。
第五方面,本发明提供一种重症A型血友病动物模型的构建方法,所述重症A型血友病动物模型的构建方法包括:
将第二方面所述的FⅧ基因编辑系统导入哺乳动物受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
将所述重组细胞移植入代孕母体,获得的F0代与野生型交配,得到F1代杂合子;
将所述F1代杂合子自交,获得的F2代纯合子即为所述重症A型血友病动物模型。
本发明中,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将FⅧ基因的23号至25号外显子敲除,并没有影响到FⅧFL蛋白的活性,相较于其他HA小鼠模型而言,更有利于后续体内基因编辑治疗研究工作的开展。
本发明中,采用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除,基因编辑效率高,技术成熟,容易操作,成功率高。
优选地,所述FⅧ基因编辑系统的制备方法包括:
对Cas9核酸酶基因进行体外转录,得到Cas9核酸酶的mRNA;
构建含有编码靶向FⅧ基因的gRNA组合序列的质粒,体外转录为RNA后,与所述Cas9核酸酶的mRNA混合,得到所述FⅧ基因编辑系统。
优选地,所述哺乳动物包括小鼠。
优选地,所述F0代、F1代杂合子和F2代纯合子利用PCR扩增及测序进行鉴定。
优选地,所述构建方法中还包括提取小鼠尾部组织DNA的步骤。
优选地,所述提取小鼠尾部组织DNA的方法包括使用试剂盒进行提取或使用消化缓冲液进行提取。
优选地,所述氯化钾在所述消化缓冲液中的浓度为47~53mM,例如可以是47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM或53mM等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述Tris-HCl在所述消化缓冲液中的浓度为8~15mM,例如可以是8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或15mM等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述Triton X-100在所述消化缓冲液中的质量分数为0.05%~0.15%,例如可以是0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%、0.13%、0.14%或0.15%等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述蛋白酶K在所述消化缓冲液中的浓度为0.3~0.5mg/mL,例如可以是0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL或0.5mg/mL等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述消化缓冲液包括47~53mM氯化钾、8~15mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.05%~0.15%Triton X-100和0.3~0.5mg/mL蛋白酶K。
作为优选技术方案,本发明所述重症A型血友病动物模型的构建方法包括以下步骤,构建的流程示意图如图2所示:
(1)构建含有编码靶向FⅧ基因的gRNA组合序列的质粒,体外转录为RNA后,与体外转录获得的Cas9核酸酶的mRNA混合,得到所述FⅧ基因编辑系统;
(2)对小鼠进行促排卵,体外受精后,培养受精卵;
(3)将所述FⅧ基因编辑系统显微注射入小鼠受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
(4)对重组细胞进行体外培养,并转移到代孕母鼠体内;
(5)提取小鼠尾部组织DNA,利用PCR扩增及测序进行鉴定,挑选FⅧ基因发生缺失的小鼠作为F0代;
(6)将所得F0代小鼠与野生型小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠;
(7)将所述F1代杂合子小鼠自交,利用PCR扩增及测序进行鉴定,挑选F2代FⅧ基因敲除的纯合子小鼠,即所述的重症A型血友病动物模型。
第六方面,本发明提供了第一方面所述的靶向FⅧ基因的gRNA组合、第二方面所述的FⅧ基因编辑系统、第三方面所述的重组细胞或第五方面所述的重症A型血友病动物模型的构建方法中的任意一种或至少两种的组合在筛选A型血友病治疗药物中的应用。
相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明采用双gRNA策略,删除关键外显子区域,确保有效敲除目的基因;由于在FⅧ基因内部删除了10796bp的片段,在PCR检测时,也很容易对敲除小鼠与野生型小鼠进行区分;对FⅧ基因的23号至25号外显子进行敲除,同时并没有影响到FⅧFL蛋白活性,更有利于后续开展相关的研究工作;
(2)采用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,操作上十分简单,具有很好的重复性,同时也缩短了实验周期,降低了实验费用;采用一对gRNA进行基因编辑,降低了脱靶率,基因编辑的特异性更好;构建得到的重症A型血友病动物模型的突变基因型可以遗传给下一代,实现了表型的稳定性与可遗传性,同时降低了筛选的工作量。
附图说明
图1为gRNA位点与FⅧ基因结构的对应关系图片;
图2为重症A型血友病动物模型的构建流程示意图;
图3为突变小鼠的筛选原理示意图;
图4为12只小鼠的区域1的扩增产物结果图片;
图5为12只小鼠的区域2的扩增产物结果图片;
图6为12只小鼠的区域3的扩增产物结果图片;
图7为12只小鼠的区域4的扩增产物结果图片;
图4~图7中,泳道N-空白对照,泳道WT-野生型对照,泳道M-标准DNA分子量Marker,泳道1~12,编号为1~12的小鼠的扩增产物;
图8为1号小鼠的扩增产物的测序结果图片;
图9为11号小鼠的扩增产物的测序结果图片;
图10为不同组小鼠的养殖存活率的统计结果图片;
图11为不同组小鼠的出血时间的统计结果图片;
图12为不同组小鼠的出血量的统计结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种靶向FⅧ基因的gRNA组合,所述靶向FⅧ基因的gRNA组合包括gRNA3和gRNA4;
所述gRNA3包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,所述gRNA4包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1:CAGTCCGTCACTTAGTTTTATGG;
SEQ ID No.2:GTGGTGCCTAATCGTTACTCAGG。
实施例2
本实施例提供一种FⅧ基因编辑系统,所述FⅧ基因编辑系统包括实施例1中的靶向FⅧ基因的gRNA组合以及Cas9核酸酶的mRNA。
本发明中,所述FⅧ基因编辑系统通过以下方法进行制备:
构建含有编码靶向FⅧ基因的gRNA3、gRNA4序列的质粒,通过overlapping PCR技术先扩增T7 promoter和gRNA编码序列的融合基因,克隆到通用载体中(具体步骤可参见Cell,2013,153:910~918),测序验证正确后体外转录为RNA;
体外转录合成Cas9核酸酶的mRNA,与所得gRNA3、gRNA4混合,得到所述FⅧ基因编辑系统。
实施例3
本实施例提供一种重症A型血友病动物模型,所述重症A型血友病动物模型通过以下方法进行构建:
(1)对小鼠(来自C57BL/6品系)进行促排卵,体外受精后,培养受精卵;
(2)将实施例2中的FⅧ基因编辑系统显微注射入小鼠受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
(3)对重组细胞进行体外培养,并转移到代孕母鼠体内;
(4)提取小鼠尾部组织DNA,利用PCR扩增及测序进行鉴定,挑选FⅧ基因发生缺失的小鼠作为F0代;
(5)将所得F0代小鼠与野生型小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠;
(6)将所述F1代杂合子小鼠自交,利用PCR扩增及测序进行鉴定,挑选F2代FⅧ基因敲除的纯合子小鼠,即所述的重症A型血友病动物模型。
其中,所述提取小鼠尾部组织DNA的方法包括使用试剂盒进行提取或使用消化缓冲液进行提取:
使用试剂盒进行提取:
使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA提取试剂盒(Ver.5.0_CodeNo.9765)以获得高纯度的基因组DNA,步骤如下:
a.在含鼠尾(2~5mm)的微量离心管中加入180μL GL缓冲液、20μL蛋白酶K和10μLRNase A;
b.56℃孵育过夜;
c.在微量离心机中以12000rpm的转速离心2min以去除杂质;
d.加入200μL GB缓冲液和200μL无水乙醇并充分混合;
e.将离心柱置于收集管中,以12000rpm的转速离心2min,弃废液;
f.向离心柱中加入500μL W缓冲液,并以12000rpm的转速离心1min,弃废液;
g.向离心柱中加入700μL WB缓冲液(已与100%乙醇预混),并以12000rpm的转速离心1min,弃废液;
h.重复步骤g;
i.将离心柱置于收集管中并以12000rpm的转速离心2min;
j.将离心柱放在新的1.5mL离心管中,在柱膜中心加入50~200μL无菌水或洗脱缓冲液,静置5min;
k.将离心柱以12000rpm的转速离心2min;
l.洗脱后的基因组DNA通过电泳定量。
使用消化缓冲液获得基因组DNA,步骤如下:
a.在含鼠尾(2~5mm)的微量离心管中加入100μL消化缓冲液(50mM氯化钾、10mMTris-HCl(pH 9.0)、0.1%Triton X-100和0.4mg/mL蛋白酶K);
b.56℃孵育过夜;
c.98℃孵育13min使蛋白酶K变性;
d.在微量离心机中离心15min,直接从管中取出上清液(50μL反应中添加2μL)进行PCR。
突变小鼠的筛选原理示意图如图3所示,对突变位点附近的4个区域进行扩增验证,具体的判断标准如下:
区域1:
扩增引物为F(SEQ ID No.3)和R(SEQ ID No.4)
野生型:扩增产物的片段大小为11440bp;
突变纯合子:扩增产物的片段大小为640bp;
突变杂合子:扩增产物同时含有11440bp和640bp两个片段。
SEQ ID No.3:AAAGACAAGGCAAACCATGTAGGAAA;
SEQ ID No.4:TCAGTAGTTTCTCATCATCTTCCCTCC。
区域2:
扩增引物为F(SEQ ID No.3)、R(SEQ ID No.4)和Wt/He-R(SEQ ID No.5)
野生型:扩增产物的片段大小为476bp;
突变纯合子:扩增产物的片段大小为640bp;
突变杂合子:扩增产物同时含有476bp和640bp两个片段。
SEQ ID No.5:AGCTTTCAAATGCCAGTGTTTCACTA。
区域3:
扩增引物为F(SEQ ID No.3)、R(SEQ ID No.4)和Wt/He-F(SEQ ID No.6)
野生型:扩增产物的片段大小为445bp;
突变纯合子:扩增产物的片段大小为640bp;
突变杂合子:扩增产物同时含有445bp和640bp两个片段。
SEQ ID No.6:CAAGGAAGTAATAGTGAGGGTTTAGGAGATTG。
区域4:
扩增引物为F1(SEQ ID No.7)和R1(SEQ ID No.8)
野生型:扩增产物的片段大小为488bp;
突变纯合子:无扩增产物;
突变杂合子:扩增产物的片段大小为488bp。
SEQ ID No.7:GAGACTGTGAGGAGGGATTTCTATCACAG;
SEQ ID No.8:TGAGGTCGCCAGGCATTAGTCC。
其中,
区域1的PCR反应体系如下:
区域2的PCR反应体系如下:
区域3的PCR反应体系如下:
区域4的PCR反应体系如下:
其中,使用的Taq酶均为HS Taq DNA聚合酶(TaKaRa R007A)。
扩增程序如下:
预变性:94℃,5min;
循环延伸:94℃,30s;60℃,30s;72℃,按1kb/min计算,循环35次;循环外延伸:72℃,5min。
通过上述反应体系及程序,对12只小鼠进行筛选,同时设置野生型对照(WT,模板为400ng野生型小鼠的基因组DNA)和空白对照(N,不添加DNA模板)。12只小鼠的区域1的扩增产物结果图片如图4所示,区域2的扩增产物结果图片如图5所示,区域3的扩增产物结果图片如图6所示,区域4的扩增产物结果图片如图7所示。
根据筛选标准,最终确认编号为1、4、6、7、8、9和11的小鼠为突变纯合子,对其中的1号和11号小鼠的扩增产物进行测序验证,使用的测序引物为R(SEQ ID No.4),测序结果分别如图8和图9所示。
测序结果显示,上述2只小鼠的突变类型相同,均缺失了10796bp的片段,表明所述重症A型血友病动物模型构建成功。
实施例4
本实施例对实施例3构建的重症A型血友病动物模型进行检测。
外形及成活率检测
对野生型、突变杂合子和突变纯合子小鼠的外形进行观察,并对其在性成熟前的存活率进行统计。
结果显示,重症A型血友病动物模型的小鼠外形和正常老鼠相似,但养殖成活率低(统计结果如图10所示)。
凝血功能测试
设置野生型、治疗组以及突变组3个实验组别。测试实验前,按照说明的指示,对治疗组中的突变小鼠注射表达FⅧ凝血因子的AVV病毒,另外2组小鼠注射等量的生理盐水。
测试时,将小鼠在麻醉状态下剪尾,将伤口浸泡在温水浴中,直至伤口不再流血。离心收集水浴中的血细胞,并对其质量进行统计。
断尾放血实验表明,模型小鼠的出血时间和出血量均大于正常对照小鼠(如图11和图12所示),这些结果表明此模型小鼠的表型和人类重症A型血友病相似。另外,利用这个模型小鼠进行了基因治疗的初步实验,结果表明注射表达FⅧ凝血因子的AVV病毒小鼠在断尾放血实验中降低了出血时间,减少了出血量(如图11和图12所示)。
综上所述,本发明通过构建FⅧ基因编辑系统,注射到小鼠受精卵的细胞核内,再进行后续的筛选鉴定,成功构建了重症A型血友病动物模型。所述重症A型血友病动物模型缺失了FⅧ基因外显子23至外显子25之间长度为10796bp的片段,可应用于相关的疾病研究及药物筛选中,应用前景广阔。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 吴文书
<120> 一种重症A型血友病动物模型的构建方法及其应用
<130> 2022
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagtccgtca cttagtttta tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
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<400> 4
tcagtagttt ctcatcatct tccctcc 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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Claims (8)
1.一种重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述重症A型血友病动物模型的构建方法包括:
将FⅧ基因编辑系统导入小鼠受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
将所述重组细胞移植入代孕母体,获得的F0代与野生型交配,得到F1代杂合子;
将所述F1代杂合子自交,获得的F2代纯合子即为所述重症A型血友病动物模型;
所述FⅧ基因编辑系统包括靶向FⅧ基因的gRNA组合和Cas9;
所述靶向FⅧ基因的gRNA组合为gRNA3和gRNA4;
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述Cas9包括Cas9核酸酶或Cas9核酸酶的mRNA;
所述FⅧ基因编辑系统编辑受精卵细胞后,基因组中缺失了FⅧ基因外显子23至外显子25之间的序列。
2.根据权利要求1所述的重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述导入包括显微注射。
3.根据权利要求1所述的重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述FⅧ基因编辑系统的制备方法包括:
对Cas9核酸酶基因进行体外转录,得到Cas9核酸酶的mRNA;
构建含有编码靶向FⅧ基因的gRNA组合序列的质粒,体外转录为RNA后,与所述Cas9核酸酶的mRNA混合,得到所述FⅧ基因编辑系统。
4.根据权利要求1所述的重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述F0代、F1代杂合子和F2代纯合子利用PCR扩增及测序进行鉴定。
5.根据权利要求1所述的重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述构建方法中还包括提取小鼠尾部组织DNA的步骤。
6.根据权利要求5所述的重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述提取小鼠尾部组织DNA的方法包括使用试剂盒进行提取或使用消化缓冲液进行提取;
所述消化缓冲液包括47~53 mM氯化钾、8~15 mM pH为9.0的Tris-HCl、0.05%~0.15%Triton X-100和0.3~0.5 mg/mL蛋白酶K。
7.根据权利要求1所述的重症A型血友病动物模型的构建方法,其特征在于,所述的重症A型血友病动物模型的构建方法包括:
(1)构建含有编码靶向FⅧ基因的gRNA组合序列的质粒,体外转录为RNA后,与体外转录获得的Cas9核酸酶的mRNA混合,得到所述FⅧ基因编辑系统;
(2)对小鼠进行促排卵,体外受精后,培养受精卵;
(3)将所述FⅧ基因编辑系统显微注射入小鼠受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
(4)对重组细胞进行体外培养,并转移到代孕母鼠体内;
(5)提取小鼠尾部组织DNA,利用PCR扩增及测序进行鉴定,挑选FⅧ基因发生缺失的小鼠作为F0代;
(6)将所得F0代小鼠与野生型小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠;
(7)将所述F1代杂合子小鼠自交,利用PCR扩增及测序进行鉴定,挑选F2代FⅧ基因敲除的纯合子小鼠,即所述的重症A型血友病动物模型。
8.权利要求1-7任一项所述的重症A型血友病动物模型的构建方法在筛选A型血友病治疗药物中的应用。
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