KR102362814B1 - 인간 간세포 이식용 동물모델 및 이를 이용한 항바이러스제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 간세포 이식용 동물모델 및 이를 이용한 항바이러스제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 간세포 이식용 동물모델은 인간 간세포를 이식함으로써 인간화 간 동물이 될 수 있어 인간 간에 대한 연구가 용이하게 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인간 간세포 이식용 동물모델로부터 유래된 인간화 간 동물은 종래 인간과 침팬지의 간에서만 발현되는 질병의 연구 개발에 있어 발생하는 많은 비용과 윤리적 문제를 수반하던 문제가 해소될 수 있다.

Description

인간 간세포 이식용 동물모델 및 이를 이용한 항바이러스제 스크리닝 방법 {ANIMAL MODEL FOR TRANSPLANTING HUMAN HEPATOCYTES AND A METHOD FOR SCREENING ANTI-VIRAL AGENT BY USING THE ANIMAL MODEL}

본 발명은 인간 간세포 이식용 동물모델 및 이를 이용한 항바이러스제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

전 세계의 간암환자 사망 중 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염에 의한 간암 발명으로 사망하는 환자가 53%를 차지한다 (Oncogene(003,22:5093-5107)). 우리나라는 B형 간염 바이러스의 감염에 의한 간암 발생이 전체 간암 발생의 70%를 차지하고 있고, 간암의 치료 후 5년 생존율은 암 중에서 낮은 편으로 간암의 치료에 있어서 HBV 감염에 대한 연구가 필요한 상황이다.

이러한 B형 간염 바이러스의 연구를 위해 적합한 in vivo 모델의 확보가 매우 중요하나, B형 간염 바이러스는 인간 및 침팬지와 같은 영장류의 간세포에서만 감염이 이루어지는 것으로 알려져 있어, 현재까지는 B형 간염 바이러스의 연구에 있어 실험동물로 침팬지를 사용하였다. 그러나, 침팬지는 윤리적인 문제와 함께 고가이기 때문에 실험의 사용에 적합하지 않아, 새로운 동물모델이 필요한 실정이다.

설치류 동물모델은 생체 내에서 유전자 기능, 질병의 메커니즘 및 새로운 치료제를 연구하는데 유용한 도구이다. 설치류와 인간의 종 차이로 인해 이러한 연구의 해석이 제한적이긴 하나, 비인간 영장류는 인간 질병의 최상의 대안 모델로 사용될 수 있다. 매우 높은 비용과 윤리적 관심으로 인해 제한적으로 사용되지만, 최근 영장류를 대체하기 위해 인간화된 마우스가 개발되고 있다.

특히, 전술한 바와 같이 인간에게 특이적인 간염 바이러스의 감염이나, 투여된 약제의 대사, 또는 인간 간장의 증식을 해석하는 것을 목적으로 하는, 인간 간 세포를 유지하는 면역 관용 마우스가 몇가지 그룹에 의해 이제까지 만들어져 오고 있다. 구체적으로 우로키나아제형ㆍ플라스미노겐 활성화 인자(uPA)의 트랜스 유전자가 그의 간장 중에서 발현하도록 유지된 면역 부전 마우스에 인간의 간 세포가 이식된 것이 인간에게 특이적인 간염 바이러스가 감염될 수 있는 것이 알려져 있다(Dandri, M. et al. J. Hepatol. (2005) 42, 54-60 및 Tateno, C. et al. Am. J. Pathol. (2004) 165, 901-912). 또한, 이러한 마우스로부터 유래하는 간 세포는 인간의 간에 있어서 발견되는 효소를 발현하여(Katoh, M. et al. J. Pharm. Sci. (2007) 96, 428-43), 피검 물질로부터 인간에게 특이적인 대사물이 생성되는 것(Azuma, H. et al. Nat. Biotechnol. (2007) 25, 903-910)이 알려져 있다.

그럼에도, uPA 트랜스 유전자는 간 세포의 증식에 중요한 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 조절하는 플라스미노겐을 활성화하기 위하여, uPA 트랜스 유전자의 발현은 그 자체가 간 줄기 세포에 대하여 지속적이면서 진행성의 상해를 야기한다. 그로 인해, uPA 트랜스 유전자의 호모 접합체의 태생 치사율은 30％로 높고, 또한 간 세포의 이식 시기도 5 내지 17일로 제한이 확인되는 데다가(국제 공개 제 WO2001067854호 공보), 헤테로 접합체에서의 계통의 유지를 행한 후에 얻어진 호모 접합체를 치사에 이르게 하지 않게 하기 위하여 래트의 간 세포의 이식등의 처치가 필요하고(국제 공개 제 WO2001087059호 공보), 그 계통의 유지에는 번잡한 작업이 필요함과 동시에 원하는 특성을 갖는 마우스를 만들어 내는 빈도도 매우 저빈도이었다. 또한, 간 상해나 저번식률 등의 부작용이 많은 것이 알려져 있다. 그로 인해, 숙주의 육성을 촉진하여 인간 간 세포의 치환율을 상승시키는 시도로서, 숙주인 마우스에 대하여 인간 보체로부터의 공격 방어를 위한 약제를 투여하거나(국제 공개 제 WO2003080821호 공보), 인간 성장 호르몬을 투여하거나(국제 공개 제 WO2007004547호 공보)하는 시도가 행해져 오고 있다.

이와 같은 문제들로 인해 여전히 마우스의 인간화 간세포의 이식 및 증식과 이후의 실질적인 활용에 있어서 실질적으로 활용가능한 마우스 모델의 필요성이 있어왔고, 이에 본 발명자들은 B형 간염 바이러스에 감염될 수 있는 마우스로서 인간화 간 마우스를 연구하였고, 본 발명을 완성하였다.

국제 공개 제 WO2001067854호 공보 국제 공개 제 WO2001087059호 공보 국제 공개 제 WO2003080821호 공보 국제 공개 제 WO2007004547호 공보

Dandri, M. et al. J. Hepatol. (2005) 42, 54-60 (비특헌문헌 2) Tateno, C. et al. Am. J. Pathol. (2004) 165, 901-912 Katoh, M. et al. J. Pharm. Sci. (2007) 96, 428-43 Azuma, H. et al. Nat. Biotechnol. (2007) 25, 903-9

본 발명의 하나의 목적은 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터가 도입되거나 CD(cytosine deaminase) 유전자가 발현되도록 제작된 재조합 발현벡터가 도입된 인간을 제외한 동물의 수정란을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수정란으로부터 수득한, 인간 간세포 이식용 동물모델을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 a) 상기 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계; b) 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계; c) B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계; 및 d) 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델에 5-FC (5-fluorocytosine) 및 아세트아미노펜을 투여한 뒤 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계; b) 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계; c) B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계; 및 d) 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 명세서에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용한 Fah 특이적 유전자가위를 이용하여 수정란에서 Fah 유전자를 돌연변이시키고, 이를 통하여 면역부전의 표현형을 나타내는 형질전환 동물을 생산하는 방법이 제공된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "CRISPR/Cas9 시스템"은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)로 구성되어 있는 제3세대 유전자가위로써, 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 인공제한효소를 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "Cas9 단백질"은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성하여, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라(Pasteurella) 속, 프란시셀라(Francisella) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속 유래인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "가이드 RNA(gRNA)"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있다. gRNA는 crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 sgRNA(single guide RNA)일 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환하면 세포 내에 가이드 RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 가이드 RNA 단편은 Fah 유전자를 인식할 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환하면 세포 내에 가이드 RNA 단편 및 tracrRNA 단편 또는 crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 sgRNA를 전달할 수 있고, 전달된 tracrRNA 단편 또는 부분은 crRNA 단편 또는 부분과 복합체 또는 결합 구조를 형성하여 Cas9 단백질이 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터의 gRNA는 서열번호 2 내지 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 상기 서열번호 2 내지 3는 아래와 같다.

서열번호 2	GCUCGGCCAUGGUAUCCCAC
서열번호 3	GUGGGAUACCAUGGCGAG

서열번호 2 내지 3의 염기서열로 이루어진 gRNA를 사용함으로써, Fah를 코딩하는 DNA의 1771bp 결실을 유도할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100p 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예를 들어, 진핵 세포예컨대, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 발현벡터는 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자를 넉아웃(knock-out)시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃"은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미한다.

Fah 유전자를 구성하는 염기 중 일부의 치환, 결실, 또는 일부 염기의 삽입, 바람직하게는 FAH 유전자를 구성하는 염기 중 일부의 결실, 가장 바람직하게는 Fah 유전자의 엑손(exon) 6 내지 8을 구성하는 염기 중 1771bp의 염기의 결실에 의해 Fah 넉아웃이 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 넉아웃은 Fah 유전자 엑손 6과 8사이의 서열번호 4에 해당하는 염기서열을, 서열번호5의 염기서열로 돌연변이 시키는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 서열번호 4 및 5은 아래와 같다.

서열번호 4

gttcactatc accacctcct ttatcaggct ccacttacct gtgggatacc atggccgagc ttcctccatt gtggtatctg gaaccccgat tcgaagaccc atggggcaga tgagacctga taactgtaag tgactccagt accctaattc cactctctat tgctatgagc tctgtagcct ggtattgatg gttgctttta tctgccatct ttccagcaaa gcctcctgtg tatggtgcct gcagactctt agacatggag ttggaaatgg tgagttctgt gtggaatttt gttgaatggg atctacaaag cgctgtggca gtaaagctct ctttctgggg cggcacttca cacctgtttg gccacaaata gcagcccatg tccccatgtg accactgaat gcagttgatg ttctttcttc agattctgtg tttgtgaatt ctcccacttg ctgaaactta tttgcaaccc aaatattaac acaagtcatt gccacacaga gaagtggaaa atttgagtct cctgatacac acatttgtcc ccagttgagg tcacaccagg ctccctgtct tcgtgtttca ggtctcatgc tataaaaaca tgctatattt ttggtttttt ttctccacat attttccaca tttgaactac ttttattatt tacaatgcct cccaagtgga ggtccattgt ggttccctaa ctgcaggagg gcaattctaa caagtgttag aaaagcctca ttcataccta agttgtagct gttgttgggg aatacagtgt tgttgagcca acactatgtc agctatcttt aacagaaaga ggtaaaatat ggtgagtgtt gtagccagag actatgaaaa cccagcttgt tgcatcttgt gggagcaccg gtccaccttt tttctgtcac attcatggtg attttataca atgtcacatg aacagcaagc atcaaggccc ggtggcaggg cctctatcac tttagaaaga cccacactaa ggctccactc tttatttaaa ttaagcactt tattttgaga gtgctgaaga ctcatatgta gttgtgagaa atgaggtgga gatcccctga atttgaaaga gatggggtcc ttcatgcctc ggtgccctca gctctctctc tctctctctc tctctctccc tctctctctc tctctctctc tctctctctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtatctt gaagattttg cactgtttaa accctatctc aaggacaaat aaaacagtga ccctagccat gaacgtagat gattctgtac tgctcaagga attccttctc ccccgcactt agtttccctt agacatgatt gctagatgtt ctcttggtcc atggctattg gacagatgcc attccttttg ggataggtag ggctgtgaag tcaacttgtc aatcctcctg gaatgagcac ccctgatgtt ttcattcttt acaagtgtca tatactgtca gatgtgaggg tatggagcct ggaatacaga ggaagaatca gaaaggcctg gggtgccctg gggctagggg ggaaagggct catgtgagta gacttcccac cttagagacc cagggaagta atgccaggtc ctcaggcagc cctagtccct ggttgaactt tgaaaatatt ttccctttgc tctgtaagcc acagtgaccc agagcatcgg gtcatctaga ttcttaccaa ctttctccat ggcaggcttt cttcgtaggc cctgggaaca gattcggaga gccaatcccc atttccaaag cccatgaaca cattttcggg atggtcctca tgaacgac

서열번호 5

gttcactatc accacctcct ttatcaggct cccttac a cattttcggg atggtcctca tgaacgac

페닐알라닌의 대사작용에 관여되어 있는 것으로 알려진 Fah (fumarylacetoactate hydrolase, 푸마릴아세토아세테이트 하이드로레이즈)는 푸마릴아세토아세테이트의 탄소-탄소 결합에 대해 가수분해 작용으로 절단하는 기능을 가지고 있다. 이는 페닐알라닌과 티로신의 대사작용에서 중요한 작용을 하는 것으로, 상기 Fah 유전자가 결손될 경우 독성물질인 푸마릴아세토아세테이트가 가수분해되지 못하고 축적되어 세포를 파괴한다. 따라서, 인간 이외의 동물모델에서 Fah의 돌연변이를 유도할 경우 Fah 유전자의 불활성화되어 인간 이외의 동물모델의 간세포 파괴를 야기할 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 Fah 유전자 서열 내 서열번호 4의 서열 부분이 서열번호 5의 서열로 돌연변이가 일어날 경우, Fah 유전자의 불활성화되어 인간 이외의 동물모델의 간세포 파괴를 야기할 수 있다. 이와 같이 Fah 유전자가 돌연변이된 인간 이외의 동물모델은 동물이 가지고 있는 간의 손상이 유도될 것이고, 이후에 인간의 간세포를 이식할 경우 인간의 간세포가 원활하게 증식할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "돌연변이"는 유전자를 이루는 염기서열의 변화로 유전정보가 변하면서 유전형질이 달라진 상태를 말하며, 이러한 돌연변이에는 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 미스센스 돌연변이 및 넌센스 돌연변이가 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 발현 벡터가 도입되거나 CD(cytosine deaminase) 유전자가 발현되도록 제작된 재조합 발현 벡터가 도입된 인간을 제외한 동물의 수정란을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터가 도입된 인간을 제외한 동물의 수정란을 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

인간을 제외한 동물의 수정란으로 사용될 세포의 종류는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 마우스 유래의 수정된 단일세포 단계 배아일 수 있다.

구체적으로 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 인간을 제외한 동물의 수정란은 2019년 7월 8일 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 18785P로 기탁한 것 일 수 있고, 상기 CD(cytosine deaminase) 유전자가 발현되도록 제작된 재조합 발현 벡터가 도입된 인간을 제외한 동물의 수정란은 2019년 7월 8일 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 18784P로 기탁한 것 일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 CD 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

서열번호 6

gtgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca gaagccatcg attacaaacg ttga

시토신의 대사작용에 관여되어있는 것으로 알려진 CD (cytosine deaminase, 시토신 디아미나아제)는 시토신과 물을 기질로 하고, 펩타이드 결합 외에 탄소-질소 결합에 작용하여 우라실 (uracil)과 NH3로 변환하는 효소로서, 상기 CD 유전자는 포유류 세포에서 발현되지 않는다. 그러나, 이를 발현토록 조작할 경우 비독성물질인 5-fluorocytosine을 투여할 경우 CD의 효소작용으로 인해 5-fluorouracil로 변형되어 간세포를 파괴한다. 따라서, 인간 이외의 포유류 동물모델에서 CD를 발현토록 돌연변이를 유도하고 5-fluorocytosine을 투여할 경우 인간 이외의 포유류 동물모델의 간세포 파괴를 야기할 수 있다. 구체적으로 인간 이외의 포유류 동물모델에서 서열번호 6의 CD 유전자를 발현토록 돌연변이를 유도하고 5-fluorocytosine을 투여할 경우 인간 이외의 포유류 동물모델의 간세포 파괴를 야기할 수 있다. 이와 같이 CD가 발현토록 돌연변이 된 인간 이외의 동물모델은 5-fluorocytosine이 투여될 때 동물이 가지고 있는 간의 손상이 유도될 것이고, 이후에 인간의 간세포를 이식할 경우 인간의 간세포가 원활하게 증식할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 NOD/SCID마우스에서 IL2Rg 유전자가 넉아웃된 마우스인 것일 수 있다.

NOD/SCID마우스는 T세포와 B세포가 결핍되고 NK 세포도 상당히 결핍되었으나 아직도 약간의 NK 세포가 남아있는 마우스이다 (Exp Hematol 1998;26:332-344).

T 세포 성장 인자로 알려진 IL2(interleukin 2)는 B 세포, NK 세포 및 대식세포의 성장 및 활성에 광범위한 기능적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 마우스에서 IL2 receptor subunit Gamma (IL2Rg)의 돌연변이를 유도할 경우, T, B 및 NK 세포의 발달 및 기능의 결실을 유도할 수 있으므로, 이와 같이 IL2Rg가 돌연변이된 면역결핍 동물모델은 발암, 암의 치료, 종양 성장 및 종양 전이와 관련된 실험에 유용하게 활용될 수 있다.

상기 IL2Rg 유전자 넉아웃된 NOD/SCID 마우스는 IL2Rg 유전자가 불활성화 된 마우스를 의미하며, 구체적으로는 IL2Rg 유전자를 구성하는 염기 중 일부의 치환, 결실, 또는 일부 염기의 삽입, 바람직하게는 IL2Rg 유전자를 구성하는 염기 중 일부의 결실, 가장 바람직하게는 IL2Rg 유전자의 엑손(exon) 6을 구성하는 염기 중 2bp의 염기의 결실에 의한 IL2Rg 넉아웃된 NOD/SCID 마우스 (NSIG 마우스)이다.

IL2Rg 유전자의 넉아웃은 공지의 방법으로 이루어질 수 있고, 구체적으로는 IL2Rg(interleukin 2 receptor gamma) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 도입함으로서 이루어질 수 있다.

상기 IL2Rg 유전자를 넉아웃 시키는 발현벡터를 인간을 제외한 동물의 수정란에 도입하고, 이로부터 IL2Rg 유전자 넉아웃 마우스를 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은, 상기 수정란으로부터 수득한, 인간 간세포 이식용 동물모델을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "동물모델"은 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해줄 수 있으므로, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있으며, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초자료를 얻을 수 있다. 구체적으로 본 발명의 인간 간세포 이식용 동물모델은 후술되는 바와 같이 인간 간세포를 이식함으로써 인간화 간 동물이 될 수 있고, 이를 통해 종래 인간과 침팬지의 간에서만 발현되는 질병, 특히 B형 간염 바이러스의 연구 및 치료제 개발에 많은 비용이 드는 문제와 윤리적 문제를 해소할 수 있다.

본 발명의 동물모델에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 동물모델은 공지의 방법으로 수득할 수 있다. 구체적으로, Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델은 IL2Rg 유전자 넉아웃된 NOD/SCID 마우스의 수정란에 상기 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 미세주입하고 대리모 난관에 이식, 산자를 얻는 방법으로 수득할 수 있다. 산자를 얻는 과정에서는 수득율을 높이기 위해 티로신 분해 과정 에서 hydroxyphenylpyruvate dioxygenase 활성제어물질인 2-(2-nitro-4-trifluoro-methylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione(NTBC) 을 임신 중반부터 투여할 수 있다.

또한, 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델은 IL2Rg 유전자 넉아웃된 NOD/SCID 마우스의 수정란에 CD 발현 벡터를 미세주입하고 산자를 얻는 방법으로 수득할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물모델은 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)되거나 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 a) 상기 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계; b) 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계; c) B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물투여하는 단계; 및 d) 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 a) 단계는 상기 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계이다. 상기 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델은 수득율을 높이기 위한 2-(2-nitro-4-trifluoro-methylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione(NTBC)의 투여를 중단하게 되면 Fah 발현의 부재로 인해 동물 모델의 간 세포가 파괴되기 시작한다. 이와 함께 인간 간세포를 동물모델에 이식하게 되면 동물의 간세포는 파괴됨과 동시에 인간 간세포는 증식하게되어 인간화 간 마우스를 얻을 수 있다. 구체적으로 NTBC 투여의 중단은 간세포 이식 효율을 증가시키는 uPA virus를 투여한 다음날 인간 간세포 투여 후 NTBC 투여량을 25% (0-2일), 12% (2-4일), 6% (4-6일), 0% (7-21일), 100%(21-28일) 투여하는 일정을 1사이클로 4사이클 실시하였다.

상기 urokinase plasminogen activator (uPA)는 세린 프로테아제로서, 첫 번째 생리학적 기질은 세린 프로테아제 플라스민의 불활성 자이모겐 형태인 플라스미노겐이다. 플라스민의 활성화는 생리학적 환경 특히, 혈전용해 또는 세포외 매트릭스 분해에 의존적인 단백질분해 캐스케이드(cascade)를 촉발한다.

상기 b) 단계는 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계이다. 구체적으로 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 정맥 투여하여 감염시킬 수 있다.

상기 c) 단계는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계이다. 상기 항바이러스제 후보물질은 후보물질의 특성에 따라 투여방식 및 투여량이 조절될 수 있다.

상기 d) 단계는 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계이다. 구체적으로, 후보물질의 처리를 통해 B형 간염 바이러스의 수가 줄어드는 경우 항바이러스 효과가 있는 것으로 평가할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 a) 상기 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델에 5-FC (5-fluorocytosine) 및 아세트아미노펜을 투여한 뒤 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계; b) 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계; c) B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계; 및 d) 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 a) 단계는 상기 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델에 5-FC (5-fluorocytosine) 및 아세트아미노펜을 투여한 뒤 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계이다. 상기 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델은 비독성물질인 5-FC(5-fluorocytosine)을 투여할 경우 CD의 효소작용으로 인해 5-fluorouracil로 변형되어 간세포가 파괴되기 시작한다. 5-FC와 함께 아세트아미노펜을 투여할 경우 간세포의 파괴가 촉진된다. 이에 인간 간세포를 동물모델에 이식하게 되면 동물의 간세포는 파괴됨과 동시에 인간 간세포는 증식하게되어 인간화 간 마우스를 얻을 수 있다. 구체적으로 인간 간세포 투여 5일전부터 5-FC는 500mg/kg을 매일 1회씩 총 5회 투여하였고, 아세트아미노펜은 200mg/kg을 2일전부터 매일 1회씩 총 2회 투여하여, 마우스 간세포의 파괴를 유도하였다. 또한, 간세포 이식 효율을 증가시키는 uPA virus를 5-FC 및 아세트아미노펜과 함께 투여하고 다음날 1x10⁶개의 인간 간세포를 마우스에 투여될 수 있다.

상기 b) 단계는 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계이다. 구체적으로 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 정맥 투여하여 감염시킬 수 있다.

상기 c) 단계는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계이다. 상기 항바이러스제 후보물질은 후보물질의 특성에 따라 투여방식 및 투여량이 조절될 수 있다.

상기 d) 단계는 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계이다. 구체적으로, 후보물질의 처리를 통해 B형 간염 바이러스의 수가 줄어드는 경우 항바이러스 효과가 있는 것으로 평가할 수 있다.

본 발명의 인간 간세포 이식용 동물모델은 인간 간세포를 이식함으로써 인간화 간 동물이 될 수 있어 인간 간에 대한 연구가 용이하게 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인간 간세포 이식용 동물모델로부터 유래된 인간화 간 동물은 종래 인간과 침팬지의 간에서만 발현되는 질병의 연구 개발에 있어 발생하는 많은 비용과 윤리적 문제를 수반하던 문제가 해소될 수 있다.

도 1 은 본 발명의 일 구체예에 따른 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자의 엑손 6 및 8의 gRNA 타겟 위치와 상기 유전자의 넉아웃(knock-out)을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델을 수득하는 과정을 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델의 Fah 발현량을 나타내는 그림이다. 구체적으로 대조군(NSIG), NSIG/FAH^+/- (hetero type) 및 NSIG/FAH^-/- (homo type)의 Fah 유전자 발현을 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase) 유전자가 발현되도록 제작된 재조합 발현벡터의 도입을 나타내는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델의 CD 유전자 (CD mRNA) 발현량을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 인간 간세포 (HepG2), 인간 간세포(HepG2)에 실시예 2-2의 albumin promoter/CD 발현 벡터를 도입한 세포 및 실시예 2-3에서 제조된 NSIG/CD^+/wt 마우스의 간세포의 CD 유전자 발현을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델의 CD 단백질 발현량을 웨스턴블랏 (도 6A) 및 조직면역염색 (도 6B)으로 확인한 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 과정 및 NTBC 투여량 조절을 나타내는 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)의 Human albumin (h-Albumin)분비량을 나타내는 그림이다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)의 h-Albumin 분비량을 나타낸 그림(도 9A) 이고, Human Fah (도 9B) 및 Human albumin (도 9C) 발현량을 확인할 수 있는 조직면역염색 그림이다.
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 과정을 나타내는 그림이다.
도 11은 본 발명의 일 구체예에 따른 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)의 h-Albumin 분비량을 나타낸 그림 (도 11A)이고, Human albumin (도 11B) 발현량을 확인할 수 있는 조직면역염색 그림이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에 따른 인간화 간 동물 (humanized liver animal)에서 B형 간염 바이러스 감염을 확인하기 위한 실험 과정을 나타내는 그림이다.
도 13은 본 발명의 일 구체예에 따른 인간화 간 동물 (humanized liver animal)에 감염된 B형 간염 바이러스의 정량분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 14는 본 발명의 일 구체예에 따른 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 이용한 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 결과를 나타내는 그림이다. 구체적으로 실험예 5에 따른 실험 과정을 나타내는 그림 (도 15 A) 이고, 항바이러스제 Tenofovir 투여 여부에 따른 HBV DNA 상대량을 나타내는 그림 (도 15B) 이며, RT-PCR 결과를 나타낸 그림이다 (도 15C).

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. IL2Rg가 넉아웃 된 NSIG 마우스에서 Fah 유전자가 결손된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/FAH ^-/- )의 제작

1-1. Fah sgRNA 준비

마우스의 Fah 유전자는 8개의 엑손을 가지며 20784개의 유전자로 이루어져있다 (서열번호 1, C57BL/6J Mouse strain Fah genomic DNA). IL2Rg가 넉아웃된 NSIG 마우스에서 Fah 유전자의 돌연변이를 유도하기 위하여, Fah 유전자의 Exon 6 영역을 표적으로하는 sgRNA(single guide RNA)를 설계하였다(도 1 참조). 구체적으로, 아래의 표 4와 같은 서열을 갖도록 설계하였다.

이름	gRNA 및 PAM 염기서열(5'->3')	서열번호
sgRNA-1	GCUCGGCCAUGGUAUCCCAC	서열번호 2
sgRNA-2	GUCCUCAUGAACGACUGGAG	서열번호 3

pT7-gRNA 플라스미드 벡터를 제한효소(BamH1)로 37

에서 밤새 분해하고, PPT assay(페놀, 클로로포름 및 EtOH)에 의해 정제한 다음, sgRNA-1, sgRNA-2 또는 sgRNA-3를 전사할 수 있는 주형 DNA를 벡터에 클로닝하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 Ambion MEGAshortscrip T7 Transcription Kit(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 벡터로부터 sgRNA를 합성하였다. 합성된 sgRNA를 PPT assay(페놀, 클로로포름 및 EtOH)에 의해 정제하여 미세주입(microinjection)에 사용하였다.

1-2. NSIG 마우스의 준비

모든 마우스는 22±1℃의 항온, 55±10%의 습도 및 12시간 명/암 주기에서 사육되었으며, 모든 동물실험은 한국생명공학연구원(KRIBB) 동물실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다.

구체적으로, NSIG 마우스는 NOD/SCID 마우스에서 IL2Rg 유전자가 결핍된 마우스이다. 구체적으로, NSIG 마우스는 아래와 같은 방법으로 제작된 것이다:

4 내지 5주령 암컷 NOD/SCID 마우스에 5IU 임신말 혈청성 성선자극 호르몬(pregnant mare serum gonadotropin)(sigma, St. Louis, USA)을 복강내 주사(intraperitoneal injection)하고, 46시간 후, 5IU 태반성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)(hCG, sigma, St. Louis, USA)을 주사하여 과배란(superovulation)을 유도하였다. hCG 투여 14시간 후, 마우스를 희생시키고 난관을 수득하였다. 난관으로부터 난모세포-난구세포(oocyte-cumulus) 복합체를 얻어 HTF 배지로 구성된 사전-평형화된 수정액 점적액에 놓았다. 한편, 수컷 NOD/SCID mice(5개월령)의 부고환 및 정관으로부터 신선한 정자를 얻어 HTF 배지로 분리하였다. 난모세포-난구세포 복합체를 수정능 획득 정자(capacitated sperm)를 함유하는 수정액 점적액으로 옮기고, 8시간 동안 배양하여(37℃ 5% CO₂) HTF 배지에서 수정을 유도하였다. 배양 후, 난모세포를 새로운 HTF 배지로 세척하여 과량의 정자를 제거하고, M16 배지에서 7시간 동안 배양(37℃ 5% CO₂)한 다음, M2 배지에서 미세주입을 수행하였다.

체외 수정 후 가시적 전핵(pronuclei)을 갖는 상기 수정된 배아(embryo)를 세포질 미세주입 위해 선택하고, 미네랄 오일하에 M2 배지를 함유하는 미세주입 디쉬로 옮겼다. CRISPR/Cas 시약 혼합물은 Cas9 단백질(ToolGen, Daejeon, Korea)이 40ng/㎕, 및 IL2Rg sgRNA-1 (CCCUGAUCUUUGUGUACUGUUGG, 서열번호 7) 또는 IL2Rg sgRNA-2 (CUUAUCCCUGUUGGCACCAUGGG, 서열번호 8)가 40ng/㎕의 농도를 갖도록 주입 버퍼(DW)로 희석하여 각각 준비하였다. 연속 흐름 주입 모드(continuous flow injection mode)를 사용하여 단일세포 단계의 수정된 배아 세포질에 CRISPR/Cas 시약 혼합물을 미세주입한 다음, 생존한 배아를 대리모의 난관에 외과적으로 이식하였다.

상기 대리모로부터 태어난 pup에서 게놈 DNA를 추출하고, 수행하여 IL2Rg 유전자형을 분석하였다. 이들 중 동종접합 돌연변이(-/-) 마우스를 NSIG로 명명하였으며, 동종접합 돌연변이 수컷 마우스와 동종접합 돌연변이 암컷 마우스를 교배시킴으로써 동종접합 NSIG(-2bp)^-/- 마우스를 제작하였다.

한편, NSIG 마우스는 일반 SPF (Specific Pathogen free) 시설에서는 사육이 어렵다는 것이 알려져 있어, IVC rack (NISO 70)에서 사육하였다.

1-3. NSIG/FAH ^-/- 마우스의 제작

도 2와 같은 과정을 통해 NSIG/FAH^-/- 마우스를 제작하였다. 구체적으로, 4 내지 5주령 암컷 NSIG 마우스에 5IU 임신말 혈청성 성선자극 호르몬(pregnant mare serum gonadotropin)(sigma, St. Louis, USA)을 복강내 주사(intraperitoneal injection)하고, 46시간 후, 5IU 태반성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)(hCG, sigma, St. Louis, USA)을 주사하여 과배란(superovulation)을 유도하였다. hCG 투여 14시간 후, 마우스를 희생시키고 난관을 수득하였다. 난관으로부터 난모세포-난구세포(oocyte-cumulus) 복합체를 얻어 HTF 배지로 구성된 사전-평형화된 수정액 점적액에 놓았다. 한편, 수컷 NSIG(5개월령)의 부고환 및 정관으로부터 신선한 정자를 얻어 HTF 배지로 분리하였다. 난모세포-난구세포 복합체를 수정능 획득 정자(capacitated sperm)를 함유하는 수정액 점적액으로 옮기고, 8시간 동안 배양하여(37℃ 5% CO₂) HTF 배지에서 수정을 유도하였다. 배양 후, 난모세포를 새로운 HTF 배지로 세척하여 과량의 정자를 제거하고, M16 배지에서 7시간 동안 배양(37℃ 5% CO₂)한 다음, M2 배지에서 미세주입을 수행하였다.

체외 수정 후 가시적 전핵(pronuclei)을 갖는 상기 NSIG 마우스의 수정된 배아(embryo)를 세포질 미세주입 위해 선택하고, 미네랄 오일하에 M2 배지를 함유하는 미세주입 디쉬로 옮겼다. CRISPR/Cas 시약 혼합물은 Cas9 단백질(ToolGen, Daejeon, Korea)이 40ng/㎕, 및 실시예 1-1의 Fah sgRNA-1, Fah sgRNA-2 가 40ng/㎕의 농도로 총 80ng/㎕의 농도를 갖도록 주입 버퍼(DW)로 희석하여 각각 준비하였다. 연속 흐름 주입 모드(continuous flow injection mode)를 사용하여 단일세포 단계의 수정된 배아 세포질에 CRISPR/Cas 시약 혼합물을 미세주입한 다음, 생존한 배아를 대리모의 난관에 외과적으로 이식하였다.

상기 대리모로부터 태어난 pup에서 게놈 DNA를 추출하고, 시퀀싱(Bioneer, Daejeon, Korea)을 수행하여 Fah 유전자형을 분석하였다. 그 결과 도 1 과 같이 Fah 유전자의 엑손 6과 8사이에 1771bp의 유전자가 결손된 NSIG/FAH^-/- (homo type) 과 NSIG/FAH^+/- (hetero type)을 확인하였다.

상기 NSIG/FAH^-/- (homo type) 마우스 암컷과 NSIG/FAH^+/- (hetero type) 마우스 암컷 및 수컷의 수정란 300여개를 확보/동결하여 2019.07.08자로 KCTC 18785P로 기탁하였다.

한편, 상기 Fah 유전자가 결손된 마우스는 태자 16일부터 발현되어야 하는 Fah 유전자가 발현되지 않기 때문에, tyrosine catabolic pathway에서 hydroxyphenylpyruvate dioxygenase 활성제어물질인 2-(2-nitro-4-trifluoro-methylbenzoyl) -1,3-cyclohexanedione(NTBC) 을 임신 중반부터 처리하여 NSIG/FAH^-/-마우스를 안정적으로 생산하는 조건을 확립하게 되었음. 구체적으로 대리모의 임신 15일부터 64 mg/l의 NTBC를 음용수로 주었다. 그리고, 제조된 NSIG/FAH^-/-마우스에게는 8mg/L로 투여하였다.

1-4. NSIG/FAH ^+/- 마우스 및 NSIG/FAH ^-/- 마우스에서 Fah 유전자발현 확인

상기 실시예 1-3에서 제조된 NSIG/FAH^+/-마우스 및 NSIG/FAH^-/-마우스에서 Fah 발현을 확인하였다. 구체적으로 control (NSIG), NSIG/FAH^+/-마우스 및 NSIG/FAH^-/-마우스의 간조직으로부터 RNA를 추출하고 first-strand cDNA synthesis kit(Fermentas, Burlington, Ontario, Canada)를 사용하여 총 RNA 샘플로부터 cDNA를 합성하였다. 실시간 qRT-PCR 분석은 Exicycler^TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(Bioneer, Daejeon, Korea) 및 SYBR Premix Ex Taq(Takara, Otsu, Japan)을 사용하여 3반복으로 수행되었다.

그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이 control (NSIG), NSIG/FAH^+/-마우스의 경우 간에서 Fah가 발현되었으나, NSIG/FAH^-/-마우스에서는 Fah 유전자가 발현되지 않음을 확인하여 NSIG/FAH^-/-마우스는 FAH KO인 것을 확인할 수 있다.

실시예 2. IL2Rg가 넉아웃 된 NSIG 마우스에서 CD 유전자가 발현된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/CD ^+/wt )의 제작

2-1. CD 유전자 및 이를 포함하는 벡터의 준비

CD (시토신 디아미네이즈, Cytosine deaminase)는 포유류 세포에서 발현되지 않는 유전자로, 1284개의 유전자로 이루어져있다 (서열번호 6). IL2Rg가 넉아웃된 NSIG 마우스에서 CD 유전자의 발현을 유도하기 위하여, CD 유전자 발현 벡터를 디자인 및 제작하였다. 구체적으로 도 4에서 확인되는 바와 같이 Escherichia coli str. K-12 sub-Strain의 genomic DNA에서 PCR으로 CD유전자를 증폭시켜 CD유전자를 확보하였고, 간 특이적 발현 벡터인 albumin promotor vector (pBluescript II SK-)를 EcoRV 및 EcoRI 효소로 벡터를 자르고 확보된 CD 유전자를 ligation하여 클로닝하였다. 클로닝된 Albumin Promoter-CD 유전자-bGH poly A 벡터에 albumin promotor 를 도입하여albumin promotor/CD를 제작하였다 (도 4 참조). 이후 이를 마이크로 인젝션하는 방법으로 도입하였다.

2-2. NSIG 마우스의 준비

NSIG 마우스는 전술한 실시예 1-2와 동일하게 준비하였다.

2-3. NSIG/CD ^+/wt 마우스의 제작

상기 준비된 NSIG 마우스에 대하여 IVF (In vitro Fertilation)을 통해 얻은 NSIG 수정란에 albumin promoter/CD 벡터를 미세주입하고 대리모의 난관에 이식하여 임신을 통해 산자를 확보하였다.

구체적으로, 4 내지 5주령 암컷 NOD/SCID 마우스에 5IU 임신말 혈청성 성선자극 호르몬(pregnant mare serum gonadotropin)(sigma, St. Louis, USA)을 복강내 주사(intraperitoneal injection)하고, 46시간 후, 5IU 태반성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)(hCG, sigma, St. Louis, USA)을 주사하여 과배란(superovulation)을 유도하였다. hCG 투여 14시간 후, 마우스를 희생시키고 난관을 수득하였다. 난관으로부터 난모세포-난구세포(oocyte-cumulus) 복합체를 얻어 HTF 배지로 구성된 사전-평형화된 수정액 점적액에 놓았다. 한편, 수컷 NOD/SCID mice(5개월령)의 부고환 및 정관으로부터 신선한 정자를 얻어 HTF 배지로 분리하였다. 난모세포-난구세포 복합체를 수정능 획득 정자(capacitated sperm)를 함유하는 수정액 점적액으로 옮기고, 8시간 동안 배양하여(37℃ 5% CO₂) HTF 배지에서 수정을 유도하였다. 배양 후, 난모세포를 새로운 HTF 배지로 세척하여 과량의 정자를 제거하고, M16 배지에서 7시간 동안 배양(37℃ 5% CO₂)한 다음, M2 배지에서 미세주입을 수행하였다.

체외 수정 후 가시적 전핵(pronuclei)을 갖는 상기 수정된 배아(embryo)를 세포질 미세주입 위해 선택하고, 미네랄 오일하에 M2 배지를 함유하는 미세주입 디쉬로 옮겼다. 이후 실시예 2-2에서 제조된 albumin promoter/CD 벡터를 3 ng/㎕의 농도를 갖도록 주입 버퍼(DW)로 희석하여 각각 준비하였다. 연속 흐름 주입 모드(continuous flow injection mode)를 사용하여 단일세포 단계의 수정된 배아 세포질에 albumin promoter/CD 벡터 시약 혼합물을 미세주입한 다음, 생존한 배아를 대리모의 난관에 외과적으로 이식하였다.

상기 대리모로부터 태어난 pup는 PCR을 통해 유전형을 분석하였을 때 albumin promoter/CD 의 삽입 및 발현을 확인하였다. 그 결과 CD 유전자가 삽입되고 발현이 이루어지는 NSIG/CD^+/wt를 확인하였다.

상기 NSIG/CD^+/wt 마우스 암컷과 수컷의 수정란 300여개를 확보/동결하여 2019.07.08자로 KCTC18784P로 기탁하였다.

2-4. NSIG/CD ^+/wt 마우스의 CD 유전자 발현 확인

상기 실시예 2-3에서 제조된 NSIG/CD^+/wt 마우스의 간세포와 인간 간세포 (HepG2) 및 인간 간세포(HepG2)에 실시예 2-2의 albumin promoter/CD 발현 벡터를 도입한 세포에서 CD 유전자 발현을 확인하였다. 구체적으로 상기 간세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR 을 진행하였다.

그 결과 도 5에서 확인되는 바와 같이 인간 간세포 (HepG2) 에서는 CD의 발현이 확인되지 않았으나, 실시예 2-3에서 제조된 NSIG/CD^+/wt 마우스의 간세포 (도 5의 #32, 33, 36) 및 인간 간세포(HepG2)에 실시예 2-2의 albumin promoter/CD 발현 벡터를 도입한 세포에서는 CD의 발현이 확인되었다.

또한, 상기 실시예 2-3에서 제조된 NSIG/CD^+/wt 마우스의 간세포와 실시예 2-2의 albumin promoter/CD 발현 벡터가 도입되지 않은 NSIG 마우스의 간세포에서의 CD 유전자 발현여부를 확인하기 위해 웨스턴블랏(Western blotting) 및 면역염색(Immunohistochemistry)를 진행하였다.

그 결과, 도 6에서 확인되는 바와 같이 albumin promoter/CD 발현 벡터가 도입되지 않은 NSIG 마우스(도 6A의 WT 및 도 6B의 왼쪽)는 간세포에서 CD 유전자가 발현되지 않는 반면 실시예 2-3에서 제조된 NSIG/CD^+/wt 마우스(도 6A의 Tg 및 도 6B의 오른쪽)의 간세포에서는 CD유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3. 인간화 간 마우스의 제조

3-1. FAH 유전자가 결손된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/FAH ^-/- )를 인간화 간 마우스로 제조

도 7과 같은 과정으로 Fah 유전자가 결손된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/FAH^-/-)를 인간화 간 마우스로 제조하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 Fah 유전자가 결손된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/FAH^-/-)는 전술한 바와 같이 Fah 유전자가 결손되어 NTBC가 지속적으로 투여가 필요하고, NTBC의 투여가 중단되면, Fah 유전자 발현의 부재로 인해 간세포가 파괴되기 시작한다. 이에, 간세포 이식 효율을 증가시키는 uPA virus를 투여한 다음날 인간 간세포의 증식 및 마우스 간세포의 파괴를 위하여 인간의 간세포 이식 및 NTBC의 투여량 감소를 진행하였다. 구체적으로, 1x10⁶개의 인간 간세포를 NSIG/Fah^-/-마우스에 이식하였고, 이식 첫날부터 NTBC 투여량을 25% (2mg/L, 0-2일), 12% (1mg/L, 2-4일), 6% (500ug/L, 4-6일), 0% (0, 7-21일), 100%(8mg/L, 21-28일) 투여하는 일정을 1사이클로 4사이클 실시하였다.

이식 4주 후 마우스 혈액으로부터 human-albumin (hAlb) 수치를 측정하였을 때, 도 8에서 확인되는 바와 같이 Fah 유전자가 결손된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/FAH^-/-)로부터 제조된 인간화 간 마우스는 hAlb의 수치 증가를 확인하였다.

또한, 상기 마우스에 대해 인간 간세포 이식 후 10주까지 human-albumin 수치 및 면역염색(Immunohistochemistry)을 통한 Fah 발현을 확인하였을 때 인간 간세포 이식 후 10주까지 human-albumin 수치가 증가하는 것과 Fah 발현을 확인할 수 있었다.

이를 통해 Fah 유전자가 결손된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/FAH^-/-)로부터 제조된 인간화 간 마우스는 안정적으로 인간의 간세포가 이식, 증식되는 것을 알 수 있다.

3-2. CD 유전자가 발현된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/CD ^+/wt )를 이용한 인간화 간 마우스 제조

도 10과 같은 과정으로 CD 유전자가 발현된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/CD^+/wt)를 인간화 간 마우스로 제조하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 CD 유전자가 발현된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/CD^+/wt)는 비독성물질인 5-FC(5-fluorocytosine)을 투여할 경우 CD의 효소작용으로 인해 5-fluorouracil로 변형되어 간세포가 파괴되기 시작한다. 이에 아세트아미노펜을 병용 투여할 경우 간세포의 파괴가 촉진된다. 이에 인간 간세포의 증식 및 마우스 간세포의 파괴를 위해 인간의 간세포 투여전에 5-FC 및 아세트아미노펜을 투여하였다. 구체적으로 인간 간세포 투여 5일전부터 5-FC는 500mg/kg 아세트아미노펜은 200mg/kg을 매일 1회, 5일간 총 5회 투여하여 마우스 간세포의 파괴를 유도하였다. 또한, 간세포 이식 효율을 증가시키는 uPA virus를 5-FC 및 아세트아미노펜과 함께 투여하고 다음날 1x10⁶개의 인간 간세포를 마우스에 투여하였다.

이식 4주 후 마우스 혈액으로부터 human-albumin (hAlb) 수치를 측정하였을 때, 도 11에서 확인되는 바와 같이 CD 유전자가 발현된 인간 간세포 이식용 마우스 (NSIG/CD^+/wt)로부터 제조된 마우스는 hAlb 의 발현을 확인하였다.

또한, 상기 마우스에 대해 인간 간세포 이식 후 면역염색(Immunohistochemistry)으로 확인하였을 때 human-albumin의 발현을 확인하였다.

실시예 4. 인간 화 간 마우스의 B형 간염 바이러스 감염

B형 간염 바이러스는 인간 및 침팬지의 간에서만 감염이 일어나는 것으로 알려져 있어, 통상의 마우스에서는 감염이 일어나지 않는다. 그러나, 본 발명의 인간화 간 마우스의 경우 인간의 간 세포가 이식, 증식 된 것이기 때문에 B형 감염이 가능한지 확인하였다.

인간화 간 마우스의 B형 간염 바이러스 감염은 도 12와 같은 과정으로 진행하였다. 상기 실시예 3-1에서 제조된 인간화 간 마우스와 상기 실시예 3-2에서 제조된 인간화 간 마우스에 B형 간염 바이러스를 투여하여 B형 간염 바이러스 감염을 확인하였다.

구체적으로, 실시예 3-1에서 제조된 인간화 간 마우스 및 실시예 3-2에서 제조된 인간화 간 마우스에 대하여 인간 간세포 이식 (PHH transplantation) 8주 후에 B형 간염바이러스 (1x10⁹ Geq/head)를 마우스의 꼬리 정맥으로 감염시켰다 (HBV infection). 감염 후 2주 (10주차)에 마우스를 채혈하여 혈청에서 바이러스를 분리하여 PCR로 바이러스를 확인하였다.

그 결과 B형 간염바이러스가 감염된 실시예 3-1 인간화 간 마우스 및 실시예 3-2의 인간화 간 마우스에서 10⁶~10⁸ copies/ml의 HBV DNA를 검출하였다 (도 13 및 표 5 참조).

실시예 5. 인간화 간 마우스에서 항바이러스제 스크리닝 가능성 평가

전술한 실시예 4를 통해 본 발명의 인간화 간 마우스가 B형 간염 바이러스의 감염이 일어나는 것을 확인하였다. 이에 추가적으로 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝에 활용 가능성을 확인하였다.

구체적으로 도 14A에 개시된 과정과 같이 실시예 3의 인간화 간 이식 마우스에 대하여 인간 간세포 이식 (PHH) 후 8주 후에 B형 간염 바이러스를 꼬리 정맥으로 감염시켰다 (HBV). 이후 12주 내지 14주, 총 2주간 항바이러스제 Tenofovir를 10mpk/head 양으로 매일 경구투여하고 14주 내지 16주, 총 2주간 항 바이러스제 투여를 중단하였다.

그 결과, Tenofovir를 투여하지 않은 군 (대조군, 도 14 B, C의 Mock)에 비하여 Tenofovir를 2주간 투여하였을 때 HBV DNA 검출량이 감소된 것을 확인할 수 있고 (도 14 B, C의 TDF 10mpk), Tenofovir의 투여를 중단하였을 때 다시 HBV DNA 검출량이 증가하는 것을 확인할 수 있다 (도 14 B, C의 TDF (-)).

이를 통해 본 발명의 인간화 간 마우스는 마우스 간의 파괴 및 인간화 간의 이식 및 증식되어 있기 때문에, 인간, 침팬지에서만 감염이 확인되는 B형 간염 바이러스의 감염이 일어나고 이를 통해 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝에 활용될 수 있다.

생물자원센터 (KCTC) KCTC18745P 20190708 생물자원센터 (KCTC) KCTC18784P 20190708

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> ANIMAL MODEL FOR TRANSPLANTING HUMAN HEPATOCYTES AND A METHOD FOR SCREENING ANTI-VIRAL AGENT BY USING THE ANIMAL MODEL <130> PN200048 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20784 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> C57BL/6J Mouse strain Fah genomic DNA <400> 1 gggtgctaaa agaatcacta gggtggggag gcggtcccag tggggcgggt aggggtgtgt 60 gccaggtggt accgggtatt ggctggagga agggcagccc ggggttcggg gcggtccctg 120 aatctaaagg ccctcggcta gtctgatcct tgccctaagc atagtcccgt tagccaaccc 180 cctacccgcc gtgggctctg ctgcccggtg ctcgtcagca tgtcctttat tccagtggcc 240 gaggactccg actttcccat ccaaaacctg ccctatggtg ttttctccac tcaaagcaac 300 gtgagcatcg atttttgggc tcgggagccg ggaggtggga gttctggtca gtttctccag 360 agcctcgggg agagcgcctg tggctacagt gccgctcagg acccatagct gtgcacgtta 420 cggaaattaa gtatatgtgg gtatatatgg gcctgtgcaa gaaccagagc atagagaaat 480 gggagctatc acccctgcct gggcagcagg cctaagcgat tgtgacccaa aaacggacgc 540 ataatttcct tacaaaacgc gggtggtcgt 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gggacggcta ccgtgttggc tttggccagt 20640 gtgctgggaa agtgctgcct gccctttcac cagcctgaag ctccggaagt cacaagacac 20700 acccttgcct tatgaggatc atgctaccac tgcatcagtc aggaatgaat aaagctactt 20760 tgattgtggg aaatgccaca gaaa 20784 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fah sgRNA-1 <400> 2 gcucggccau gguaucccac 20 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fah sgRNA-2 <400> 3 gugggauacc auggcgag 18 <210> 4 <211> 1838 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> C57BL/6J Mouse strain Fah genomic DNA <400> 4 gttcactatc accacctcct ttatcaggct ccacttacct gtgggatacc atggccgagc 60 ttcctccatt gtggtatctg gaaccccgat tcgaagaccc atggggcaga tgagacctga 120 taactgtaag tgactccagt accctaattc cactctctat tgctatgagc tctgtagcct 180 ggtattgatg gttgctttta tctgccatct ttccagcaaa gcctcctgtg tatggtgcct 240 gcagactctt agacatggag ttggaaatgg tgagttctgt gtggaatttt gttgaatggg 300 atctacaaag cgctgtggca gtaaagctct ctttctgggg cggcacttca cacctgtttg 360 gccacaaata gcagcccatg tccccatgtg accactgaat gcagttgatg ttctttcttc 420 agattctgtg tttgtgaatt ctcccacttg ctgaaactta tttgcaaccc aaatattaac 480 acaagtcatt gccacacaga gaagtggaaa atttgagtct cctgatacac acatttgtcc 540 ccagttgagg tcacaccagg ctccctgtct tcgtgtttca ggtctcatgc tataaaaaca 600 tgctatattt ttggtttttt ttctccacat attttccaca tttgaactac ttttattatt 660 tacaatgcct cccaagtgga ggtccattgt ggttccctaa ctgcaggagg gcaattctaa 720 caagtgttag aaaagcctca ttcataccta agttgtagct gttgttgggg aatacagtgt 780 tgttgagcca acactatgtc agctatcttt aacagaaaga ggtaaaatat ggtgagtgtt 840 gtagccagag actatgaaaa cccagcttgt tgcatcttgt gggagcaccg gtccaccttt 900 tttctgtcac attcatggtg attttataca atgtcacatg aacagcaagc atcaaggccc 960 ggtggcaggg cctctatcac tttagaaaga cccacactaa ggctccactc tttatttaaa 1020 ttaagcactt tattttgaga gtgctgaaga ctcatatgta gttgtgagaa atgaggtgga 1080 gatcccctga atttgaaaga gatggggtcc ttcatgcctc ggtgccctca gctctctctc 1140 tctctctctc tctctctccc tctctctctc tctctctctc tctctctctg tgtgtgtgtg 1200 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtatctt gaagattttg cactgtttaa accctatctc 1260 aaggacaaat aaaacagtga ccctagccat gaacgtagat gattctgtac tgctcaagga 1320 attccttctc ccccgcactt agtttccctt agacatgatt gctagatgtt ctcttggtcc 1380 atggctattg gacagatgcc attccttttg ggataggtag ggctgtgaag tcaacttgtc 1440 aatcctcctg gaatgagcac ccctgatgtt ttcattcttt acaagtgtca tatactgtca 1500 gatgtgaggg tatggagcct ggaatacaga ggaagaatca gaaaggcctg gggtgccctg 1560 gggctagggg ggaaagggct catgtgagta gacttcccac cttagagacc cagggaagta 1620 atgccaggtc ctcaggcagc cctagtccct ggttgaactt tgaaaatatt ttccctttgc 1680 tctgtaagcc acagtgaccc agagcatcgg gtcatctaga ttcttaccaa ctttctccat 1740 ggcaggcttt cttcgtaggc cctgggaaca gattcggaga gccaatcccc atttccaaag 1800 cccatgaaca cattttcggg atggtcctca tgaacgac 1838 <210> 5 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial C57BL/6J Mouse strain Fah genomic DNA <400> 5 gttcactatc accacctcct ttatcaggct cccttacaca ttttcgggat ggtcctcatg 60 aacgac 66 <210> 6 <211> 1284 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Escherichia coli Cytosine deaminase DNA <400> 6 gtgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60 tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120 cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180 ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240 acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300 gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360 cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420 aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480 ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540 gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600 accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660 gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720 gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780 cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840 attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900 gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960 tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020 ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080 acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140 ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200 ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260 gaagccatcg attacaaacg ttga 1284 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Rg-sgRNA1 <400> 7 cccugaucuu uguguacugu ugg 23 <210> 8 <211> 1284 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Rg-sgRNA2 <400> 8 gtgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60 tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120 cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180 ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240 acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300 gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360 cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420 aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480 ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540 gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600 accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660 gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720 gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780 cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840 attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900 gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960 tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020 ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080 acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140 ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200 ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260 gaagccatcg attacaaacg ttga 1284

Claims (12)

1. Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
   Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
   상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터;
   상기 발현벡터는 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자의 엑손 6과 8사이의 서열번호 4에 해당하는 염기서열을, 서열번호 5 의 염기서열로 돌연변이 시켜 넉아웃(knock-out)시키는 것인 재조합 발현벡터.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항의 재조합 발현 벡터가 도입되거나 CD(cytosine deaminase) 유전자가 발현되도록 제작된 재조합 발현벡터가 도입된 인간을 제외한 동물의 수정란.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 CD 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것인 수정란
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 동물은 NOD/SCID마우스에서 IL2Rg 유전자가 넉아웃된 마우스인 것인 수정란.
   
8. 제 5 항의 수정란으로부터 수득한, 인간 간세포 이식용 동물모델.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 동물모델은 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)되거나 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 것인 인간 간세포 이식용 동물모델.
   
10. 제 8 항에 있어서, 상기 동물은 NOD/SCID마우스에서 IL2Rg 유전자가 넉아웃된 마우스인 것인 인간 간세포 이식용 동물모델.
    
11. a) 제 9 항의 Fah(fumaryl acetoactate hydrolase) 유전자가 넉아웃(knock-out)된 인간 간세포 이식용 동물모델에 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계;
    b) 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계;
    c) B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계; 및
    d) 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계
    를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법.
    
12. a) 제 9 항의 시토신 디아미네이즈(CD, cytosine deaminase)가 발현된 인간 간세포 이식용 동물모델에 5-FC (5-fluorocytosine) 및 아세트아미노펜을 투여한 뒤 인간 간세포를 이식하여 인간화 간 동물 (humanized liver animal)를 제조하는 단계;
    b) 상기 제조된 인간화 간 동물에 B형 간염 바이러스를 감염시키는 단계;
    c) B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 후보물질을 상기 B형 간염 바이러스 감염된 인간화 간 동물에 투여하는 단계; 및
    d) 상기 후보물질의 항바이러스 효과를 평가하는 단계
    를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스제 스크리닝 방법.

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