KR102247977B1 - IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델 및 그 제조방법 - Google Patents

IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델 및 그 제조방법에 관한 것으로, 비장 세포에서 T, B 및 NK 세포의 결실에 의하여 동물의 면역부전을 유도할 수 있으며, 이를 통하여 인간 암 세포주의 효율적인 이종이식이 가능해지므로, 면역 관련 질환, 예를 들어, 암과 같은 질환에 대한 연구에 효과적으로 사용될 수 있는 동물모델의 제조가 가능하다.

Description

IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델 및 그 제조방법{Immunodeficient Animal Model with Mutation in IL2Rg Gene and Method for Producing the same}
본 발명은 IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델 및 그 제조방법에 관한 것이다.
설치류 동물모델은 생체 내에서 유전자 기능, 질병의 메커니즘 및 새로운 치료제를 연구하는데 유용한 도구이다. 그러나 설치류와 인간의 종 차이로 인해 이러한 연구의 해석이 제한적이다. 비인간 영장류는 인간 질병의 최상의 대안 모델로 사용될 수 있으나, 매우 높은 비용과 윤리적 관심으로 인해 제한적으로 사용된다. 최근, 영장류를 대체하기 위해 인간화된 마우스가 개발되고 있다.
T 세포 성장 인자로 알려진 IL2(interleukin 2)는 B 세포, NK 세포 및 대식세포의 성장 및 활성에 광범위한 기능적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IL-2의 작용은 α, β, γ 사슬을 갖는 IL2 수용체(IL2 receptor, IL2R)를 통해 매개된다. γ 사슬은 거의 모든 세포 집단에서 발현되는데, 그 중 IL-2 수용체 γ(IL2Rg) 사슬은 일반적인 사이토카인 수용체 γ 사슬 및 IL2, IL4, IL7, IL9 및 IL15에 대한 수용체의 가장 중요한 성분으로 알려져 있다. IL2가 없는 환자는 정상적인 수의 T 세포를 갖는다. 그러나, IL2Rg가 없는 환자는 T 세포가 부족한데, γ 사슬이 다수의 사이토카인 수용체 사이에 공유되기 때문이다. 따라서, 마우스에서 IL2Rg의 돌연변이는 T, B 및 NK 세포 발달 및 기능의 손상을 야기할 수 있으므로, NOD/Scid 유전적 배경을 가진 면역결핍 마우스는 발암, 암 치료, 종양 성장 및 종양 전이의 영상화를 분석하는데 특히 중요하다.
CRISPR/Cas9 시스템은 간단한 구조와 높은 DNA 이중 가닥 파괴(double-strand break, DSB) 유도 활성을 나타내므로, 유전적으로 형질전환된 마우스를 생산하는데 편리하게 활용될 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 sgRNA(single guide RNA) 및 PAM(protospacer adjacent motif) 서열에 의해 확정되는 특정 유전자좌를 표적하는 Cas9 뉴클레아제 및 sgRNA로 구성된다. DSB는 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ(non-homologous end-joining)에 의해 복구되므로, 무작위적인 염기의 삽입 또는 결실을 유도하여 표적화된 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있다.
CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 넉아웃 마우스를 생성하기 위하여, Cas9 및 sgRNA는 일반적으로 시험관내 방법을 통하여 합성 및 미세주입(microinjection)된다. 미세주입을 위한 배아의 수집을 위하여, 수정된 배아는 일반적으로 수컷 및 과배란된 암컷을 교배시킴으로써 수집될 수 있으나, 이와 같은 방법으로는 NOD/Scid 마우스에서 게놈 편집에 사용하기 위한 신선한 수정란을 획득하는 것은 어려운 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 효과적인 면역부전 동물모델을 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2018-0012294호
본 발명의 하나의 목적은 IL2Rg(interleukin 2 receptor gamma) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터가 도입된 면역부전 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 면역부전 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 IL2Rg(interleukin 2 receptor gamma) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 명세서에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 활용한 IL2Rg 특이적 유전자가위를 이용하여 마우스 수정란에서 IL2Rg 유전자를 돌연변이시키고, 이를 통하여 면역부전의 표현형을 나타내는 형질전환 동물을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "CRISPR/Cas9 시스템"은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)로 구성되어 있는 제3세대 유전자가위로써, 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 인공제한효소를 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Cas9 단백질"은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성하여, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)로 작용할 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라(Pasteurella) 속, 프란시셀라(Francisella) 속, 캄필로박터(Campylobacter) 속 유래인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "가이드 RNA(gRNA)"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있다. gRNA는 crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 sgRNA(single guide RNA)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환하면 세포 내에 가이드 RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 가이드 RNA 단편은 IL2Rg 유전자를 인식할 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터를 이용하여 세포를 형질전환하면 세포 내에 가이드 RNA 단편 및 tracrRNA 단편 또는 crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 sgRNA를 전달할 수 있고, 전달된 tracrRNA 단편 또는 부분은 crRNA 단편 또는 부분과 복합체 또는 결합 구조를 형성하여 Cas9 단백질이 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.
T 세포 성장 인자로 알려진 IL2(interleukin 2)는 B 세포, NK 세포 및 대식세포의 성장 및 활성에 광범위한 기능적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 마우스에서 IL2Rg의 돌연변이를 유도할 경우, T, B 및 NK 세포의 발달 및 기능의 결실을 유도할 수 있으므로, 이와 같이 IL2Rg가 돌연변이된 면역결핍 동물모델은 발암, 암의 치료, 종양 성장 및 종양 전이와 관련된 실험에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 gRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 gRNA를 사용함으로써, IL2Rg을 코딩하는 DNA의 2bp 결실을 효율적으로 유도할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예를 들어, 진핵 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 발현벡터가 도입된 면역부전 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "면역부전"은 효과적인 면역반응 능력이 결여된 상태를 말하며, 구체적으로, T, B 및 NK 세포의 발달 및 기능의 결실에 의해 야기된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환 세포주로 사용될 세포의 종류는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 마우스 유래의 수정된 단일세포 단계 배아일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 면역부전 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 마우스일 수 있다.
마우스는 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 면역부전은 IL2Rg 유전자의 넉아웃(knock-out)에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃"은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미한다.
IL2Rg 유전자를 구성하는 염기 중 일부의 치환, 결실, 또는 일부 염기의 삽입, 바람직하게는 IL2Rg 유전자를 구성하는 염기 중 일부의 결실, 가장 바람직하게는 IL2Rg 유전자의 엑손(exon) 6을 구성하는 염기 중 2bp의 염기의 결실에 의한 IL2Rg 넉아웃에 의하여, 면역부전 동물모델의 제조가 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 넉아웃은 IL2Rg 유전자 엑손 6의 서열번호 11에 해당하는 염기서열이, 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 염기서열로 돌연변이 되어 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "동물모델"은 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해줄 수 있으므로, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있으며, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초자료를 얻을 수 있다.
본 발명의 면역부전 동물모델에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "돌연변이"는 유전자를 이루는 염기서열의 변화로 유전정보가 변하면서 유전형질이 달라진 상태를 말하며, 이러한 돌연변이에는 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 미스센스 돌연변이 및 넌센스 돌연변이가 포함될 수 있다. 본 발명에서는 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 IL2Rg 유전자의 돌연변이에 따른 IL2Rg 유전자의 발현이 감소 또는 결실된 면역부전 동물모델이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물모델은 IL2Rg 유전자가 넉아웃된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 넉아웃은 IL2Rg 유전자 엑손 6의 서열번호 11에 해당하는 염기서열이, 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 염기서열로 돌연변이 되어 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 마우스일 수 있다.
IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델 및 그 제조방법에 따르면, 비장 세포에서 T, B 및 NK 세포의 결실에 의하여 동물의 면역부전을 유도할 수 있으며, 이를 통하여 인간 암 세포주의 효율적인 이종이식이 가능해지므로, 면역 관련 질환, 예를 들어, 암과 같은 질환에 대한 연구에 효과적으로 사용될 수 있는 동물모델의 제조가 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 sgRNA가 표적하는 IL2Rg 유전자의 Exon 6 영역의 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 재조합벡터의 sgRNA 및 프로모터의 구조를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 면역부전 마우스의 생성 과정을 나타낸 그림이다.
도 4는 IL2Rg 유전자의 돌연변이를 갖는 마우스(F0 마우스 #9, 11 및 13)를 확인한 유전자형 분석 결과 사진이다.
도 5는 F0 #9 마우스에서 태어난 마우스의 유전자형의 분석에 따른, 이형접합 돌연변이 마우스(F1, 2 및 3)를 확인한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 6은 F1, 2 및 3 이형접합 돌연변이 마우스의 교배에 의해 태어난 마우스의 유전자형 분석에 따른, 동종접합 돌연변이 NSIG (또는, NIG)마우스(F4)를 확인한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 F4 동종접합 돌연변이 NIG 마우스 및 NOD/Scid 마우스의 IL2Rg mRNA 발현수준 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 F4 동종접합 돌연변이 NIG 마우스 및 Nod/Scid 마우스의 체중을 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 F4 동종접합 돌연변이 NIG 마우스 및 Nod/Scid 마우스의 체중 대비 각 장기의 무게를 비교한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 F4 동종접합 돌연변이 NIG 마우스 및 Nod/Scid 마우스의 혈청학적 파라미터의 수준을 비교한 그래프이다.
도 11은 C57BL/6, Nod/Scid 및 NIG 마우스의 각 비장세포에서 T(CD3), B(b220) 및 NK(CD49b) 세포의 검출을 나타낸 유세포 분석 결과이다.
도 12는 C57BL/6, Nod/Scid 및 NIG마우스의 각 비장세포에서 T, B 및 NK 세포를 비교한 그래프이다.
도 13은 athymic nude 마우스, Nod/scid 마우스 및 본 발명의 일 구체예에 따른 NIG 마우스의 옆구리 내에 각각 피하접종된 HepG2 세포의 종양원성을 비교한 그래프이다.
도 14는 athymic nude 마우스, Nod/scid 마우스 및 본 발명의 일 구체예에 따른 NIG 마우스의 옆구리 내에 각각 피하 접종된 HepG2 세포의 종양원성을 비교한 사진이다.
도 15는 athymic nude 마우스, Nod/scid 마우스 및 본 발명의 일 구체예에 따른 NIG 마우스의 옆구리 내에 각각 피하 접종된 A549 세포의 종양원성((A) 부피 및 (B) 무게)을 비교한 그래프이다.
도 16은 athymic nude 마우스, Nod/scid 마우스 및 본 발명의 일 구체예에 따른 NIG 마우스의 옆구리 내에 각각 피하 접종된 Raji 세포의 종양원성((A) 부피 및 (B) 무게)을 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Nod/scid 마우스의 IL2Rg 유전자 결손에 따른 면역부전마우스 제작 및 검증 방법
1-1. IL2Rg single guide RNA 합성
마우스의 IL2Rg 유전자는 8개의 엑손을 가지며 369개의 아미노산을 암호화한다(Mouse IL2R gamma genomic DNA, 도 2). NOD/Scid 마우스에서 IL2Rg(interleukin-2 receptor γ) 유전자의 돌연변이를 유도하기 위하여, IL2Rg 유전자의 Exon 6 영역을 표적으로하는 sgRNA(single guide RNA)를 설계하였다(도 1).
구체적으로, IL2Rg 유전자 표적화 서열은 20개의 뉴클레오티드, 이어서 PAM(Protospacer Adjacent Motif)인 "NGG" 서열을 갖도록 구성하였다(표 1).
이름 gRNA 및 PAM 염기서열(5'→3') 서열번호
sgRNA-1 CCCUGAUCUUUGUGUACUGUUGG 서열번호 1
sgRNA-2 CUUAUCCCUGUUGGCACCAUGGG 서열번호 2
pT7-gRNA 플라스미드 벡터를 제한효소(BamH1)로 37℃에서 밤새 분해하고, PPT assay(페놀, 클로로포름 및 EtOH)에 의해 정제한 다음, sgRNA-1 또는 sgRNA-2를 전사할 수 있는 주형 DNA를 벡터에 클로닝하였다(도 2). 그 후, 제조사의 지시에 따라 Ambion MEGAshortscrip T7 Transcription Kit(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 벡터로부터 sgRNA를 합성하였다. 합성된 sgRNA를 PPT assay(페놀, 클로로포름 및 EtOH)에 의해 정제하여 미세주입(microinjection)에 사용하였다.
1-2. 동물 준비
모든 마우스는 22±1℃의 항온, 55±10%의 습도 및 12시간 명/암 주기에서 사육되었으며, 모든 동물실험은 한국생명공학연구원(KRIBB) 동물실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다(KHMC-IACUC-16015).
1-3. 배란 및 체외 수정
최근의 연구에 따르면 NOD/Scid 생쥐에서 배란 또는 자연 교배 후 수정된 배아를 얻는 것은 어려운 것으로 보고되었다. 따라서, 체외 수정(in vitro fertilization, IVF)에 의하여 수정된 배아를 수득하였다. 한편, IVF는 널리 사용되는 보조 생식 기술이며 건강한 마우스를 생산하는데 매우 효과적인 것으로 알려져 있다.
구체적으로, NOD/scid 마우스는 1990년 Jackson Laboratory에서 받은 후 20년 이상 KRIBB에서 사육되었다. 4 내지 5주령 암컷 NOD/Scid 마우스에 5IU 임신말 혈청성 성선자극 호르몬(pregnant mare serum gonadotropin)(sigma, St. Louis, USA)을 복강내 주사(intraperitoneal injection)하고, 46시간 후, 5IU 태반성 성선자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)(hCG, sigma, St. Louis, USA)을 주사하여 과배란(superovulation)을 유도하였다. hCG 투여 14시간 후, 마우스를 희생시키고 난관을 수득하였다. 난관으로부터 난모세포-난구세포(oocyte-cumulus) 복합체를 얻어 HTF 배지로 구성된 사전-평형화된 수정액 점적액에 놓았다. 한편, 수컷 NOD/scid mice(5개월령)의 부고환 및 정관으로부터 신선한 정자를 얻어 HTF 배지로 분리하였다. 난모세포-난구세포 복합체를 수정능 획득 정자(capacitated sperm)를 함유하는 수정액 점적액으로 옮기고, 8시간 동안 배양하여(37℃, 5% CO2) HTF 배지에서 수정을 유도하였다. 배양 후, 난모세포를 새로운 HTF 배지로 세척하여 과량의 정자를 제거하고, M16 배지에서 7시간 동안 배양(37℃, 5% CO2)한 다음, M2 배지에서 미세주입을 수행하였다.
1-4. 세포질 미세주입 및 대리모 착상
체외 수정 후 가시적 전핵(pronuclei)을 갖는 실시예 1-3의 수정된 배아(embryo)를 세포질 미세주입 위해 선택하고, 미네랄 오일하에 M2 배지를 함유하는 미세주입 디쉬로 옮겼다. CRISPR/Cas 시약 혼합물은 Cas9 단백질(ToolGen, Daejeon, Korea)이 40ng/㎕, 및 실시예 1-1의 IL2Rg sgRNA-1 또는 IL2Rg sgRNA-2가 40ng/㎕의 농도를 갖도록 주입 버퍼(DW)로 희석하여 각각 준비하였다. 연속 흐름 주입 모드(continuous flow injection mode)를 사용하여 단일세포 단계의 수정된 배아 세포질에 CRISPR/Cas 시약 혼합물을 미세주입한 다음, 생존한 배아를 대리모의 난관에 외과적으로 이식하였다.
1-5. IL2Rg 결핍 NOD/Scid 마우스의 유전자형 분석 및 유전자 구축
실시예 1-4의 대리모로부터 태어난 pup에서 게놈 DNA를 추출하고, 표 2의 프라이머를 사용하여 IL2Rg 유전자 단편을 증폭한 다음, 정제된 PCR 생성물에 대해 T7E1 assay(T7endonuclease1, ToolGen, Daejeon, Korea) 및 시퀀싱(Bioneer, Daejeon, Korea)을 수행하여 IL2Rg 유전자형을 분석하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
IL2Rg forward ctttggctccgtctctctgc 서열번호 3
reverse tccctctcaggagctgtgtg 서열번호 4
동종접합 돌연변이(-/-) 마우스를 NIG로 명명하였으며, 동종접합 돌연변이 수컷 마우스와 동종접합 돌연변이 암컷 마우스를 교배시킴으로써 동종접합 NIG 마우스를 유지시켰다.
1-6. 총 RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR에 의한 IL2Rg mRNA 발현수준 분석
NIG 마우스 및 NOD/Scid 야생형 마우스에서 IL2Rg의 mRNA 발현수준을 분석하였다. 구체적으로, TRIzol(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)을 사용하여 마우스 꼬리 조직으로부터 총 RNA를 추출하고, first-strand cDNA synthesis kit(Fermentas, Burlington, Ontario, Canada)를 사용하여 총 RNA 샘플로부터 cDNA를 합성하였다. 실시간 qRT-PCR 분석은 표 3의 프라이머, ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(Bioneer, Daejeon, Korea) 및 SYBR Premix Ex Taq(Takara, Otsu, Japan)을 사용하여 3반복으로 수행되었다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
IL2Rg forward tcgaagctggacggaactaa 서열번호 5
reverse ctccgaacccgaaatgtgta 서열번호 6
Gapdh forward agaacatcatccctgcatgg 서열번호 7
reverse cacattgggggtaggaacac 서열번호 8
1-7. 말초 혈액의 혈청 분석
정상적인 먹이공급 후, 4시간 동안 마우스를 절식시키고, retro-orbital phlebotomy을 위해 이소플루란(isoflurane)을 사용하여 마우스를 마취시켰다. 냉각된 원심분리기에서 신선하게 수득된 혈액을 1500g에서 10분 동안 원심분리한 다음 투명한 상청액을 수득하여 혈청을 준비하였으며, 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 혈청 AST, ALT, 총 콜레스테롤(CHO), 트리글리세리드(triglyceride, TG), ALP 및 크레아티닌(creatinine) 수준은 자동 분석기(AU480 Chemistry System, Beckman Coulter)를 사용하여 측정되었다.
1-8. 이종이식(xenograft)
혼합된 100㎖ 마트리겔(matrigel)에 재현탁된 5×106세포를 8주령 athymic nude 수컷 마우스, Nod/scid 수컷 마우스 및 NIG 수컷 마우스(n=5)의 옆구리 내에 각각 피하접종(subcutaneous inoculation)하여, 간암 세포주 HepG2, 폐암 세포주 A549 및 림프암 세포주 Raji의 종양원성(tumorigenicity)을 분석하였다. 각 세포 접종 4일 후부터 3주 동안 매주 2 내지 3회 캘리퍼(caliper)를 사용하여 하기의 식으로 종양 부피를 계산하였고, 마지막 날 종양을 촬영하였다.
종양 부피 = 길이 × 너비2 × π/6
1-9. NIG 마우스의 비장에서 세포의 분리
NIG 마우스의 비장으로부터 세포를 분리하기 위하여, 세포 스트레이너(cell strainer)를 4-웰 플레이트에 놓고 비장을 놓았다. 그 후, 배지(7㎖)를 필터에 넣고 비장을 분쇄하였다. 분쇄된 비장 세포를 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 수득하였다. 적혈구를 제거하기 위하여, RBC 용해 버퍼(1㎖)를 첨가하였다. 세포 현탁액을 실온에서 10분 동안 방치한 다음, FACS 버퍼(7㎖)를 첨가하고, 1200rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 수득하였다. 이를 2회 반복하여 얻은 최종 시료에 FACS 버퍼(1㎖)을 첨가하였다.
1-10. 유세포 분석에 의한 T, B 및 NK 세포의 검출
세척 및 RBC-용해된 실시예 1-9의 비장 세포를 단일클론항체와 같은 면역 세포 마커로 4℃에서 20분 동안 염색하였다: FITC(fluorescein isothiocyanate)-conjugated anti-CD3, APC-conjugated anti-CD49b, PE(phycoerythrin)-Cy7-conjugated anti-B220, PE(phycoerythrin)-conjugated anti-Ly-6G 및 eFluor450-conjugated anti-F4/80. 염색된 세포를 FACS 완충액(1㎖)에 첨가하고 1200rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 수득하였다. 고정 버퍼(200㎕)를 최종 현탁액 세포에 첨가하고, Facscalibur를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다.
실시예 2. CRISPR/Cas9 시스템에 의한 IL2Rg 유전자 돌연변이 NOD/Scid 마우스의 생성
2-1. sgRNA의 오프-타겟 분석
최근의 연구에 따르면 다른 서열과 2개 이상의 뉴클레오티드가 불일치(mismatch)하는 sgRNA는 오프-타겟을 나타내지 않는 것으로 보고되었다. 따라서, NCBI 블라스트 시스템을 사용하여 IL2Rg에서 표 1의 sgRNA의 오프-타겟을 분석하였다.
그 결과, 표 4에서와 같이, 각각의 sgRNA는 오프-타겟을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
sgRNA sgRNA 표적서열 엑손 Strand 오프 타겟
염기서열(5'→3') 서열번호 0 1 2 3
1 ACAGTACACAAAGATCAGGG 서열번호 9 6 + 0 0 0 1
2 ATGGTGCCAACAGGGATAAG 서열번호 10 6 + 0 0 0 0
2-2. IL2Rg 유전자 돌연변이 NOD/Scid 마우스의 생성
IL2Rg 유전자 돌연변이 NOD/Scid 마우스를 생성하기 위하여, 실시예 1-4를 수행하여 실시예 1-3의 수정된 배아에 표 1의 sgRNA 및 Cas9 단백질을 미세주입하고, 생존한 세포 배아를 대리모의 난관에 이식하였다(도 3).
그 결과, 미세주입 후 생존한 2개의 세포 배아를 대리모의 난관에 이식하여, 2마리의 대리모로부터 총 13마리의 마우스를 얻었다(표 5).
sgRNA No. of embryo Newborns
(Survived)
Collection Injection Survived Transferred
sgRNA-1 214 96 45(38) 20 7
sgRNA-2 18 6
2-3. IL2Rg 유전자의 돌연변이 확인
IL2Rg 유전자의 돌연변이 확인하기 위하여, 실시예 1-5를 수행하여 실시예 2-2에서 얻은 13마리 마우스의 유전자형 분석을 수행하였다.
그 결과, 야생형 대립 유전자는 633bp에서 하나의 밴드로 표시되는 반면, 이형접합 대립 유전자(F0 마우스 #9, 11 및 13)는 633 및 453bp에서 두 밴드로 생성되었다(도 4). 또한, IL2Rg 유전자에서 돌연변이를 확인하기 위해, PCR 생성물에 대해 DNA 서열분석을 수행한 결과, F0 마우스 #9, 11 및 13는 sgRNA 표적화 부위에서 2bp 결실을 갖는 반면, 다른 야생형은 어떠한 변형도 갖지 않는 것으로 확인되었다(표 6).
구분 염기서열(5'→3') 서열번호
WT AAAGATCAGGGTAATAATCAACCCCATGG TG CCAACAGGGATAAGCACAGCTTCCAGTGC 서열번호 11
F0 #9 AAAGATCAGGGTAATAATCAACCCCATGG CCAACAGGGATAAGCACAGCTTCCAGTGC 서열번호 12
F0 #11 AAAGATCAGGGTAATAATCAACCCCAT TGCCAACAGGGATAAGCACAGCTTCCAGTGC 서열번호 13
F0 #13 AAAGATCAGGGTAATAATCAACCCCATGG CCAACAGGGATAAGCACAGCTTCCAGTGC 서열번호 14
이와 같은 결과를 통하여 F0 마우스 #9, 11 및 13이 이형접합 돌연변이 마우스인 것으로 확인되었다.
실시예 3. 돌연변이 IL2Rg 대립 유전자의 생식계통 전달 확인
돌연변이 IL2Rg 유전자형이 다음세대로 전달되는지를 확인하기 위하여, NOD/SCID 암컷 및 수컷 마우스와 F0 #9 수컷 및 #11, 13 암컷 마우스를 개별적으로 교배시켜 번식을 수행한 결과, F0 #9 마우스는 F1 마우스를 낳았으나, 다른 마우스는 그들의 세대를 유지하지 않은 것으로 확인되었다.
돌연변이 IL2Rg 대립 유전자의 전달을 확인하기 위하여, 실시예 1-5를 수행하여 F0 #9 마우스에서 태어난 마우스의 유전자형을 분석한 결과, F1, 2 및 3 이형접합 돌연변이 마우스를 확인하였으며(도 5), 이들 마우스를 서로 교배하여 F4 동종접합 돌연변이 마우스를 얻었다.
PCR 생성물 시퀀싱을 사용하여 확인(도 6)한 F4 동종접합 돌연변이 마우스의 유전자형을 실시예 1-6을 수행하여 분석하였다. NOD/Scid(야생형) 및 F4 동종접합 돌연변이 마우스로부터 RNA를 준비하고 qRT-PCR에 의해 IL2Rg의 mRNA 수준을 측정하였다. 그 결과, NIG 마우스에서 IL2Rg의 mRNA는 배경수준에서 검출되지 않았다(도 7). 이와 같은 결과를 통하여, NOD/Scid 마우스에서 생성된 IL2Rg 넉아웃(knock-out) 대립 유전자는 생식계통을 통해 전달됨을 확인하였다.
실시예 4. NIG 마우스의 기본 특성 확인
NIG 마우스의 기본 표현형을 확인하기 위하여, 신체 및 장기의 중량을 측정하고 실시예 1-7을 수행하여 Nod/Scid 및 NIG 마우스의 혈청에서 혈액 생화학 검사를 수행하였다.
그 결과, NIG 마우스는 Nod/Scid 마우스와 비교하여 체중(도 8), 흉선 및 비장 무게(도 9)가 유의하게 감소한 것으로 나타났다(표 7).
구분 성별 개체수 (g)
간 흉선 폐 비장 심장 신장 고환
Nod/scid
(13주령)		 수컷 4 1.46
±0.05		 0.03
±0.01		 0.20
±0.01		 0.07
±0.01		 0.17
±0.02		 0.47
±0.03		 0.20
±0.05
NIG
(13주령)		 수컷 5 1.11
±0.15		 0.01
±0.00		 0.27
±0.04		 0.05
±0.00		 0.15
±0.01		 0.35
±0.05		 0.19
±0.04
흉선 및 비장 크기는 형질전환 계통간에 다양하게 나타났으나, NIG 마우스는 형태학적으로 정상적인 흉선 및 비장을 갖는 것으로 확인되었다. 또한, Nod/Scid 및 NIG 마우스가 C57BL6에 비해 ALP이 약간 감소하고 트리글리세리드가 증가한 것으로 확인되었다(도 10 및 표 8).
구분 성별 개체수 크레아티닌 TG AST ALT T-CHO ALP
C57BL6
(13주령)		 수컷 1 0.43 7.5 274.1 132.7 108 509.3
Nod/scid
(13주령)		 수컷 4 0.335 17.1 302.7 146.3 109.7 212.7
NIG
(13주령)		 수컷 5 0.312 13.7 318.5 154.3 83.2 259.9
이와 같은 결과를 통하여, NIG 마우스에서 체중 및 면역-관련 장기의 무게 감소가 나타났으며, T, B 및 NK-세포의 감소에 따른 대조군 마우스 대비 혈청학적 파라미터의 변화를 확인하였다.
실시예 5. NIG 마우스에서 인간 암 세포주의 성공적인 이종이식 확인
5-1. NIG 마우스의 T, B 및 NK 세포 존재 여부 확인
NIG 마우스에서 인간 암 세포주의 이종이식이 용이한지 확인하기 위하여, NIG 마우스에서 실시예 1-9의 방법으로 분리한 비장 세포의 T, B 및 NK 세포의 계통 마커(lineage marker) 발현을 실시예 1-10의 방법으로 분석하고, 발현 프로파일을 C57BL/6 및 Nod/scid 마우스에서의 발현과 비교하였다.
그 결과, C57BL/6, Nod/Scid 및 NIG 마우스의 각 비장세포에서 T(CD3), B(b220) 및 NK(CD49b) 세포의 검출을 확인하였다(도 11). 구체적으로, Nod/Scid 마우스는 C57BL/6과 비교하여 T 및 B 세포가 부족하였고 NK 세포는 C57BL/6 마우스에 비해 감소한 것으로 나타났다. 반면, NIG 마우스에는 T, B 및 NK 세포가 없는 것으로 나타났다(도 12).
5-2. NIG 마우스에서 간암 세포주의 이종 이식 효율 확인
NIG가 다른 마우스보다 인간 암 세포주에 이종이식 효율이 증가하는지 여부를 조사하기 위하여, NIG 마우스에 실시예 1-8의 방법으로 간암 세포를 이종이식하여 이종이식의 효율을 평가하였다.
그 결과, NIG 마우스에서 종양의 형성이 증가하는 것으로 나타난 반면, 다른 마우스 그룹에서 종양 부피의 현저한 증가는 나타나지 않아, 간암 세포주의 이종 이식의 효율이 NIG 마우스에서 증가한 것으로 확인되었다(도 13 및 14).
5-3. NIG 마우스에서 폐암 세포주의 이종 이식 효율 확인
NIG가 다른 마우스보다 인간 암 세포주에 이종이식 효율이 증가하는지 여부를 조사하기 위하여, NIG 마우스에 실시예 1-8의 방법으로 폐암 세포를 이종이식하여 이종이식의 효율을 평가하였다.
그 결과, NIG 마우스에서 종양의 형성이 증가하는 것으로 나타난 반면, 다른 마우스 그룹에서 종양 부피의 현저한 증가는 나타나지 않아, 폐암 세포주의 이종 이식의 효율이 NIG 마우스에서 증가한 것으로 확인되었다(도 15).
5-4. NIG 마우스에서 림프암 세포주의 이종 이식 효율 확인
NIG가 다른 마우스보다 인간 암 세포주에 이종이식 효율이 증가하는지 여부를 조사하기 위하여, NIG 마우스에 실시예 1-8의 방법으로 림프암 세포를 이종이식하여 이종이식의 효율을 평가하였다.
그 결과, NIG 마우스에서 종양의 형성이 증가하는 것으로 나타난 반면, 다른 마우스 그룹에서 종양 부피의 현저한 증가는 나타나지 않아, 림프암 세포주의 이종 이식의 효율이 NIG 마우스에서 증가한 것으로 확인되었다(도 16).
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Immunodeficient Animal Model with Mutation in IL2Rg Gene and Method for Producing the same <130> PN190075 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-1 <400> 1 cccugaucuu uguguacugu ugg 23 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-2 <400> 2 cuuaucccug uuggcaccau ggg 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Rg_forward <400> 3 ctttggctcc gtctctctgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Rg_reverse <400> 4 tccctctcag gagctgtgtg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Rg_forward <400> 5 tcgaagctgg acggaactaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL2Rg_reverse <400> 6 ctccgaaccc gaaatgtgta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_forward <400> 7 agaacatcat ccctgcatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_reverse <400> 8 cacattgggg gtaggaacac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA1_target <400> 9 acagtacaca aagatcaggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA2_target <400> 10 atggtgccaa cagggataag 20 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT <400> 11 aaagatcagg gtaataatca accccatggt gccaacaggg ataagcacag cttccagtgc 60 60 <210> 12 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F0 #9 <400> 12 aaagatcagg gtaataatca accccatggc caacagggat aagcacagct tccagtgc 58 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F0 #11 <400> 13 aaagatcagg gtaataatca accccattgc caacagggat aagcacagct tccagtgc 58 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F0 #13 <400> 14 aaagatcagg gtaataatca accccatggc caacagggat aagcacagct tccagtgc 58

Claims (11)

  1. IL2Rg(interleukin 2 receptor gamma) 유전자를 암호화하는 DNA에 혼성화하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 gRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
    Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
    상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터
    를 포함하는 재조합 발현벡터.
  2. 삭제
  3. 제 1 항의 재조합 발현벡터가 도입된 면역부전 동물모델 제작용 형질전환 세포주.
  4. 제 3 항의 형질전환 세포주를 인간을 제외한 동물인 대리모의 난관에 이식하는 단계
    를 포함하는 면역부전 동물모델의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것인 면역부전 동물모델의 제조방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 면역부전은 IL2Rg 유전자의 넉아웃(knock-out)에 의한 것인 면역부전 동물모델의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 넉아웃은 IL2Rg 유전자 엑손 6의 서열번호 11에 해당하는 염기서열이, 서열번호 12 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열로 돌연변이 되어 발생된 것인 면역부전 동물모델의 제조방법.
  8. IL2Rg(interleukin 2 receptor gamma) 유전자 엑손 6의 서열번호 11에 해당하는 염기서열이, 서열번호 12 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열로 돌연변이 되어 넉아웃된 돌연변이 면역부전 동물모델.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것인 IL2Rg 유전자 돌연변이 면역부전 동물모델.
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