KR20180091291A

KR20180091291A - Il2rg 녹아웃 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20180091291A
Application number: KR1020170016255A
Authority: KR
Inventors: 강정택; 박광욱; 조범래
Original assignee: 주식회사 엠젠플러스
Priority date: 2017-02-06
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2018-08-16

Abstract

본 발명은 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 sgRNA(small guide RNA) 및 Cas9 유전자를 포함하는 면역결핍 동물모델 제작용 재조합 벡터를 이용한 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 IL2RG 유전자의 녹아웃을 위한 특이적 sgRNA 및 CRISPR/Cas9법을 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 동물에서 IL2RG 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 녹아웃시켜 면역결핍을 효과적으로 유도할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델은 관련 질병의 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발, 재생의료 개발, 이종 장기 이식 부작용 억제법 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로 향후 재생의료, 장기이식 부작용 억제제, 암 치료제 및 특히 SCID(Severe combined immunodeficiency) 개선 또는 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

IL2RG 녹아웃 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법{Interleukin 2 receptor gamma knockout immunodeficiency animal model and a method for producing the same}

본 발명은 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 sgRNA(small guide RNA) 및 Cas9 유전자를 포함하는 면역결핍 동물모델 제작용 재조합 벡터를 이용한 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

CRISPR(무리 지어진 규칙적 공간 사이의 짧은 회문구조 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))는 바이러스 공격을 방어하기 위한 적응성 면역계로서 박테리아에서 진화하였다. 바이러스에 노출 시, 바이러스 DNA의 짧은 세그먼트는 CRISPR 좌위 내로 통합된다. RNA는 바이러스 서열을 포함하는, CRISPR 좌위의 일부로부터 전사된다. 바이러스 게놈에 상보적인 서열을 함유하는 해당 RNA는 바이러스 게놈 내 표적 서열에 대해 Cas9 단백질의 표적화를 매개한다. Cas9 단백질은 절단되고, 이에 의해 바이러스 표적을 침묵시킨다. 즉, CRISPR/Cas 시스템에 기반하여 표적화된 유전자 조절이 가능하다.

한편, 중증 복합 면역결핍증(Severe combined immunodeficiency, 이하 'SCID'라 함)은 인간에서 관찰된다. 그러나 치료제는 인간 SCID 타입을 반영하는 제한된 동물모델로 인하여 잘 개발되지 않았다. 또한, 인터루킨 2 수용체, 감마(이하, 'IL2RG'라 함)는 X-링크된 SCID 타입과 관련이 있고, IL2RG의 돌연변이는 마우스에서 T 및 NK 세포의 결손 및 기능적으로 손상된 B 세포를 야기한다.

마우스와 같은 동물들은 인간과의 디멘존, 번식, 수명 및 행동양상의 확연한 차이로 인해 보다 인간과 가까운 종을 이용한 질환동물 모델에 대한 필요성이 제기되었고, 영장류의 경우 그 희소성, 사육관리비용 및 사육관리의 어려움으로 인해 극히 제한적인 분야에서만 질환연구에 활용 가능한 제약이 있으므로, 이에 따라 비교적 저렴한 비용과 시설에서 보다 정확한 난치질환 연구를 할 수 있는 돼지를 새로운 모델 동물로서 바이오 메디컬 분야에 활용하고자 하는 요구가 증가되고 있다.

돼지는 해부 생리학적으로 인간과 유사성이 인정되어 이미 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 이용되고 있으며, 특히 오랫동안 경제 동물로 가치가 인정되어 다른 중/대 동물을 질환모델로 사용할 때보다 윤리적인 문제점을 피해갈 수 있으며, 안정적인 사육 시스템이 구축되어 있어 실험동물 모델 개발시 유지 및 관리가 용이한 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 sgRNA 및 Cas9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였고, 이를 이용하여 효율적으로 IL2RG 유전자를 녹아웃시켜 면역결핍 동물모델을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국특허 공개번호 제10-2010-0045192호 한국특허 공개번호 제10-2013-0117165호

본 발명의 목적은 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 DNA 서열 및 Cas9 유전자를 포함하는 면역결핍 동물모델 제작용 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, IL2RG 녹아웃 면역결핍 동물모델의 제조방법 및 상기 방법으로 생산한 IL2RG 녹아웃 면역결핍 동물모델을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 IL2RG 녹아웃 면역결핍 동물모델을 이용한 SCID 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 DNA 서열; 및 Cas9 유전자;를 포함하는 면역결핍 동물모델 제작용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된, 면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산한 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델에 SCID(Severe combined immunodeficiency) 개선 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 면역세포의 발현이 증가되는 경우 이를 SCID 개선 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 SCID 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 IL2RG 유전자의 녹아웃을 위한 특이적 sgRNA 및 CRISPR/Cas9법을 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 동물에서 IL2RG 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 녹아웃시켜 면역결핍을 효과적으로 유도할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델은 관련 질병의 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발, 재생의료 개발, 이종 장기 이식 부작용 억제법 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로 향후 재생의료, 장기이식 부작용 억제제, 암 치료제 및 특히 SCID(Severe combined immunodeficiency) 개선 또는 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 2는 PCR을 통하여 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포주에서 IL2RG 유전자 녹아웃을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 시퀀싱을 통하여 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 세포주에서 IL2RG 유전자 녹아웃된 염기서열을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포주를 이용하여 생산한 면역결핍 돼지를 나타내는 도이다.
도 5는 IL2RG 녹아웃이 이루어진 돼지 태아에 대한 유전자형 검사를 통하여 IL2RG 녹아웃이 이루어진 염기서열을 확인한 결과를 나타내는 도이다; WT는 wild type으로 대조군 돼지를 지칭한다.
도 6(a)는 본 발명에 따른 대조군 돼지의 말초 혈액단핵세포(PBMC; blood mononuclear cell)에 대한 FACS 결과를 나타내는 도이다.
도 6(b)는 본 발명에 따른 IL2RG 녹아웃 돼지의 PMBC에 대한 FACS 결과를 나타내는 도이다.
도 6(c)는 도 6(a) 및 6(b)에 나타낸 결과 비교를 통해 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 PMBC에서 면역세포 분포를 통한 면역결핍을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 기관(organ)의 외관 관찰을 통하여 면역결핍을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 비장에 대한 H&E 염색법을 통하여 면역결핍을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 비장에 대한 면역조직화학법을 통하여 면역결핍을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 면역결핍돼지를 제조하는 절차 모식도를 나타내는 도이다.

본 발명은 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델 및 이의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 DNA 서열; 및 Cas9 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 sgRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA로서, 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 DNA로부터 전사될 수 있다. 특히 목적하는 표적 DNA와의 결합을 위해 상기 sgRNA는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 DNA로부터 전사되는 sgRNA를 모두 포함하는 것이 바람직하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

Cas 유전자의 상대적으로 작은 크기(예를 들어, Cas9는 4.2 kbp)는 바이러스-매개 유전자 전달 같은 몇몇 적용 분야에서 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 조성물에 이점을 제공한다. 추가로, 이러한 sgRNA는 오프-타겟(off-target) 효과를 갖지 않고, 이에 따라 원하지 않는 돌연변이, 결실, 반전 및 중복을 야기하지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다. Cas9 단백질을 암호화하는 유전자는 일반적으로 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)와 관련있으며, 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 존재한다. 대표적으로 세 종류의 CRISPR-Cas 시스템이 존재하며 그 중 Cas9 단백질을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이다.

특히 본 발명에 있어서 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 Cas9 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있으며, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 벡터 제조시 사용되는 제한효소는 EcoRI, BamHⅠ, Bg/Ⅱ, Hind Ⅲ, Pvu Ⅲ, BbsI일 수 있으며, 바람직하게는 BbsI일 수 있으며, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1, 2, 또는 3으로 표시되는 염기서열의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명은 상기 염기서열의 등가물, 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, IL2RG 녹아웃 sgRNA 및 Cas9과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 sgRNA 및 Cas9은 각 서열번호 1, 2 또는 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 IL2RG 유전자의 염기서열을 타겟으로하여, 이대립형질(biallelic)에서의 염기서열 결실시킬 수 있으나 일반적으로는 대립형질 중 어느 한 곳에서 염기서열 결실이 발생할 수 있다. 상기 결실으로 면역결핍 동물모델을 만들 수 있으며, 일대립형질 또는 이대립형질 구분없이 상기 염기서열을 결실시킬 수 있는 어느 동물에도 본 발명을 적용할 수 있다.

상기 이대립형질에서의 염기서열 결실은 서열번호 4로 표시되는 IL2RG 유전자의 엑손 1 내의 염기서열에 대한 결실을 포함하며, 엑손 1의 전체 및 일부 결실이 가능하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로 결실 부위인 엑손 1 내의 염기서열은 서열번호 5 및 6에서의 염기서열 결실을 포함하며, 상기 서열번호 5의 염기서열은 2개의 염기로 구성되어 있으며, 상기 서열번호 6의 염기서열은 93개의 염기로 구성되어 있고, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 결실이 일어난 DNA 가닥에 상보적인 DNA 가닥에서 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 결실이 발생하는 것이 특징이다. 한편, 상기 서열번호 5 및 6의 염기서열은 결실부위의 단순한 예시일뿐, IL2RG 유전자를 녹아웃시키기 위한 서열번호 4의 염기 중 일부라면 본 발명에 제한없이 포함한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 개열 지도를 갖는 것으로, 본 발명의 IL2RG 유전자의 녹아웃을 달성할 수 있는 벡터의 구성이라면, 이에 제한되지 않는다.

[도]

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 이는 예시일뿐, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 sgRNA 및 Cas9 유전자를 포함하는 면역결핍 동물모델 제작용 재조합 벡터가 도입된 면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.

본 발명에 있어서 "세포주"는 세포를 분리해서 순수 배양하여 계대배양해 나갈때 세포계의 각 개체를 말하며, 이때 세포주는 유전적 형질에 의해 다른 세포주와 구별될 수 있으며, 계대배양에도 원 세포의 형질이 유지되는 것을 말한다.

본 발명에 있어서 상기 세포주는 난모세포주, 섬유아세포주 또는 신장세포주일 수 있으며, 바람직하게는 섬유아세포주이다. 상기 세포주는 보다 구체적으로 태아 유래 세포주를 이용할 수 있으며, 동시에 1차(primary) 세포주를 이용할 수 있는바, 본 발명의 세포주는 1차 태아섬유아세포주를 이용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다. 즉, "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.

본 발명의 재조합 벡터를 세포주에 도입하여 형질전환하는 방법은 본 발명의 재조합 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 진핵세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있으며, 바람직하게는 미세주사 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는 IL2RG 녹아웃 면역결핍 동물모델의 제조방법을 제공한다.

상기 면역결핍 동물모델의 제조방법은 체세포 핵이식(SCNT; somatic cell nuclear transfer)에 의한 것이며, 본 발명에 있어서 "체세포 핵이식"은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 유전자 조작기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.

본 발명에 있어서, "핵 이식란"은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

본 발명에 있어서 "융합"은 핵 공여 세포와 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 핵 공여 세포로서, 핵 수용체인 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다.

본 발명에 있어서, 난자는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말하며, 어떤 동물의 난자일 수 있으나, 바람직하게는 돼지의 난자를 말한다.

또한, 본 발명은 상기 면역결핍 동물모델의 제조방법으로 생산한 IL2RG 녹아웃 면역결핍 동물모델을 제공한다.

본 발명에 있어서 "면역결핍"은 일반적으로 대상의 특이적 및/또는 비-특이적 면역 시스템 기능이 병리학적으로 감소되거나 부재하는 상태를 의미한다. 면역결핍 또는 "면역결핍 장애"와 관련된 질환 또는 상태는, 면역 시스템 내의 하나 이상의 결함으로 인한 면역결핍으로부터 기인하는, 결과적인 중증 급성, 재발성 또는 만성 질환과 함께 기회감염 가능성이 증가되어 특징화되는 상태를 말한다. 면역결핍 장애는 모든 소견이 면역 결함의 결과인 "면역결핍 증후군", 및 일부, 심지어 현저한 소견이 면역 결함에 의해 설명될 수 없는 "면역결핍 동반 증후군"이 제한 없이 포함된다.

본 발명에 있어서 "동물모델"이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서 "동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소,양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 돼지이다.

본 발명에 있어서 상기 면역결핍 동물모델은 IL2RG 유전자의 엑손 1 내 염기서열이 전체 또는 일부 결실된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 상기 면역결핍 동물모델은 IL2RG 유전자 중 하나의 DNA 가닥 또는 두 DNA 가닥 모두에서 염기서열 결실이 일어날 수 있고, 바람직하게는 IL2RG 유전자의 이대립형질 모두에서 염기서열 결실이 일어나는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 서열번호 5 및 6로 표시되는 염기서열 결실이 일어나는 것을 특징으로 한다. 다만 이에 본 발명이 제한되지 않으며 암컷, 수컷을 가리지 않고 상기와 같은 IL2RG 유전자의 염기서열 결실을 통해 면역결핍 동물모델을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 면역결핍 동물모델에 SCID 개선 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 면역세포의 발현이 증가되는 경우 이를 SCID 개선 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 SCID 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 면역결핍은 중증 합병성 면역결핍 장애, 즉 SCID(Severe combined immunodeficiency)에 의한 경우와 같은 면역결핍 상태와 상동하며, 특히 X 염색체와 관련된 SCID(XSCID)에서와 상동한 면역결핍 상태를 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로 상기 SCID는 희귀 선천성 증후군의 한 종류로 혈액 및 조혈기관의 질환과 면역기전을 침범하는 특정 장애로서 대표적인 면역결핍 질환 중 하나이며, 기회감염이 자주 일어나고, 아구창, 요로감염, 패혈증, 패렴, 피부 감염, 호흡기 감염 또는 홍역과 같은 증상 등을 수반할 수 있다.

본 발명에 있어서 "후보물질"은 SCID 개선 및 치료제로서 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보물질은 또한 천연물질뿐만 아니라, 합성물질도 포함한다.

본 발명에 있어서 "개선"과 "치료"는, 상기 후보물질의 투여로 상기 동물모델의 SCID 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서 "대조군"은 실험 결과가 제대로 도출되었는지 여부를 판단하기 위해 어떤 조작이나 조건도 가하지 않은 집단을 말하며, 실험의 직접적인 목적을 이루기 위해 설정된 집단인 실험군과 달리, 대조군은 실험군의 결과를 좀 더 확실하게 하기 위해 설정된 집단이다. 본 발명에서의 대조군은 바람직하게는 상기 면역결핍 동물모델에 후보물질을 처리하지 않은 집단을 말한다.

본 발명에 있어서 면역결핍 동물모델은 면역결핍과 관련하여 암세포나 장기 이식의 부작용 등을 확인할 수 있고, 특히 상기 동물모델은 면역결핍인 SCID, 특히 X 염색체 관련 SCID 환자에 대한 질병 모델로서, 상기 스크리닝 방법에 의하여 얻은 물질은 SCID 환자에 대한 치료물질의 탐색, 진단법의 개발 등에 다양하게 활용하여 SCID 개선 또는 치료제를 개발할 수 있다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. CRISPR / Cas 9 시스템을 통한 IL2RG ( interleukin 2 receptor gamma) 유전자 녹아웃 재조합 벡터의 제조

IL2RG 유전자를 녹아웃시키기 위한 재조합 벡터를 제조하기 위해 사용한 sgRNA(작은 가이드 RNA, small guide RNA)는 온라인 CRISPR 디자인 툴(http://zifit.partners.org/ZiFiT/Disclaimer.aspx)을 이용하여 제조하였고, 구체적으로는 하기 표 1의 서열번호 1 및 2로 표시되는 서열을 사용하였으며, 이는 돼지의 IL2RG 유전자를 특이적으로 인식하여 IL2RG 유전자의 엑손 1에서 이중가닥을 모두 녹아웃하도록 고안된 서열이다. 굵은 색 글씨의 서열은 PAM 염기서열을 나타낸다.

	염기서열
sgRNA 1	5'-CGAAGGTCCTCACGCACAGT(서열번호 1)GGG-3'
sgRNA 2	5'-CCGAAGGTCCTCACGCACAG(서열번호 2)TGG-3'

상기 제조된 sgRNA를 BbsI 제한효소를 사용하여 px330 벡터로 도입하였다. 상기 벡터는 생체 내 전사시에 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 DNA로부터 전사되는 sgRNA 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 Cas9 mRNA를 생성하는 주형으로 사용되었다. 상기 과정을 통해 제작한 벡터의 개열지도를 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 재조합 벡터의 배아 이식

2-1. 동물 실험에 사용된 돼지

본 실험에 사용한 돼지는 MGENPLUS사(한국, #2014-1) 및 Virginia Tech(미국, #14-019)의 동물실험윤리위원회(IACUC; Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인받아 사용하였고, 이하 돼지를 이용한 모든 실험 과정은 위원회의 가이드라인에 따라 수행하였다. 수술 과정은 일반적인 마취 하에 수행되었고, 최대한 동물의 고통을 줄이기 위한 방향으로 진행되었다. 일반적인 가축 사양조건에서 돼지를 사육하였다.

2-2. 배아 배양

본 실험에 사용될 난자의 체외성숙(in vitro muturation)을 위하여, 난구-난자 복합체(COC; cumulus oocyte complex)는 0.5 IU/ml FSH, 0.5 IU/ml LH, 0.82 mM 시스테인, 3.02 mM 글루코스, 0.91 mM 염화피루브산 및 10 ng/ml EGF을 포함하는 TCM-199 기반 성숙 배지 내에서 성숙시켰다. 42 내지 44 시간의 성숙 시간이 경과한 후, 1%의 히알루로니다아제를 포함하는 배지로 난자를 옮겨 난구세포를 제거하였다. 제1 극체가 노출된 난자는 체외수정(IVF; in vitro fertilization)을 위해 사용되었다. 그 후 25 내지 30개의 난자 그룹의 성숙한 난자를 IVF 배지(113.1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7.5 mM CaCl₂, 11 mM 글루코스, 20 mM 트리스(Tris), 2 mM 카페인, 5 mM 염화피루브산, 및 2 mg/ml BSA로 된 변형된 트리스 버퍼(Tris-buffered) 배지)에 놓아두었다. 정자는 PBS로 3회 세척하였고 정자 펠렛은 mTBM 배지로 재현탁하였다. 그리고 나서 50 μL 정자(2.5⁵ 정자/mL)를 난자를 포함하는 mTBM에 첨가하였다. 상기 생식세포를 5시간 동안 공동 배양하였다. 상기 공동 배양으로 수정된 것, 즉 수정란이 된 것으로 추측되는 배아는 CRISPR/Cas9 시스템의 미세주입 전까지 38.5℃, 5% 이산화탄소 및 5% 산소 배양기에 PZM-3(돼지 생식세포 배지; Porcine Zygote Media 3)에 유지하였다.

2-3. 배아 이식

상기 실시예 2-3에서의 IVF 후 2 내지 4시간이 경과한 후, 수정란에는 IL2RG 유전자를 타겟하기 위한 RNA 형태의 CRISPR/Cas9 시스템이 주입되었다. sgRNA 10 ng/μL 및 Cas9 mRNA 20 ng/μL 를 FemtoJet 미세주입기(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 수정된 난자의 세포질로 주입하였다. 미세주입은 Nikon 도립현미경(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)의 관찰 하에서 수행되었고, 배양 배지(0.6mM NaHCO₃, 2.9mM HEPES, 30mM NaCl, 10ng/ml 겐타마이신 및 3mg/ml BSA로 된 CM199)에서 수행하였다. 주입된 생식세포를 세척하였고, 그 후 PZM3 배지로 옮긴 후 배양하였다. 배아 이식을 위해 사용한 배아는 배아 이식 전까지 10 ng/mL GM-CSF 존재 하는 PZM3 배지에서 배양되었다. 총 245개의 미세주입된 배아는 IVF 후 5 내지 6일 경과시에 두 개의 대리모에 이식되었다. 상기 배아는 수술을 통해 대리모의 나팔관으로 이식하였다.

실시예 3. 섬유아세포에서 INL2RG 유전자의 녹아웃 확인

3-1. PCR을 통한 IL2RG 유전자 녹아웃 확인

체세포 이식을 수행하기 전에, 상기 실시예 2-3에서 생산한 돼지 태아 #1 내지 #6 세포주에서 IL2RG 유전자 녹아웃이 정상적으로 발생하였는지 여부를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. 먼저, 돼지 임신(gestation) 후 40일이 되었을 때의 돼지 태아(fetus)를 자궁으로부터 꺼내 태아조직 및 세포를 얻었고, 이의 각 샘플에서 유전체 DNA(genomic DNA)는 제작자의 메뉴얼에 따라 DNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, Seongnam-si, Korea)를 사용하여 추출하였다. PCR은 2x Taq. Premix(PCR Biosystems, London, UK)를 이용하여 수행하였다. 보다 구체적으로, PCR은 다음과 같은 방법으로 하기 표 2에 나타낸 돼지 IL2RG 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 40회 반복하여 수행하였다: 5분 동안 95℃에서 1차 변성으로 1회 반복하였고, 후에 50초 동안 95℃에서 변성, 30초 동안 52℃에서 어닐링(annealing) 및 30초 동안 72℃에서 연장하는 단계를 40회 반복하였으며, 마지막으로 10분 동안 72℃에서 후-연장으로 1회 반복하였다.

		서열(5'→3')
서열번호 8	정방향 프라이머	CAGAGGATTTAGCCTGTGTCATAGCATACATTG
서열번호 9	역방향 프라이머	CCCAGTACTCTAAAATTTTGCCCACATCCTTC

IL2RG 유전자 부위에서 염기서열상의 변이를 T7 엔도뉴클라아제 I(T7E1) 효소를 이용하여 PCR 엠플리콘을 분해하는 방식으로 확인하였다. 세포주로부터 분리한 PCR 산물은 5분 동안 95℃에서 변성하고 10분 동안 상온에서 리어닐링(re-anneal)하였고, 그 후 37℃에서 30분 동안 T7E1(ToolGen labs)로 분해하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸바와 같이, 정상적인 IL2RG 유전자의 녹아웃이 확인된 돌연변이가 태아 #1, #2, #4 및 #5에서 발생하였고, #3 및 #6에서는 서열의 결실이 심하게 이루어진 경우로서 정상적인 IL2RG 녹아웃이 일어나지 않음을 확인하였다.

연장된 프라이머를 이용하여 추가적으로 PCR을 수행하여 태아 #3 및 #6 내에서 일어난 돌연변이를 확인하였다. 먼저, 각 태아의 DNA를 조각조각 잘라냈고, 37℃에서 30초 동안 0.25% 트립신-0.02% EDTA로 분해하였다. 트립신 처리 후에, 세포를 원심분리를 통해 세척하였다. 이 후에 37.5℃에서 5% 이산화탄소 하에 배양 디쉬에서 15% 소태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM(Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 배양하였다. 3일이 경과한 후에 조직 절편을 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline; Gibco BRL)로 채워진 플라스크에서 세척하였고, 섬유아세포에 부착된 잔여물은 세포에 완전히 흡수될 때까지 배양하였다. 이를 상기에서 개시한 PCR 수행 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과 태아 #3 및 #6에서는 돌연변이가 정상적으로 일어나지 않았음을 재차 확인하였다.

3-2. 시퀀싱을 통한 IL2RG 유전자 녹아웃 확인

보다 명확하게 태아 #4에서 일어난 돌연변이 서열을 확인하기 위하여 실시예 3-1에서 제조한 PCR 산물을 VBI(Biocomplexity institute of Virginia)로 보내 시퀀싱을 실시하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 굵은 글씨의 서열은 뉴클레오타이드에서 삽입 혹은 교환이 일어난 경우를 나타내고, '-'는 뉴클레오타이드의 결실이 일어난 경우를 나타낸다.

도 3에서는 상기 정상적인 IL2RG 유전자 녹아웃 돌연변이가 일어난 태아 #4에 대하여 보다 자세한 시퀀싱 결과를 보다 구체적으로 나타내었다. DNA의 양 가닥이 모두 결실이 발생한 돌연변이이며, 한 DNA 가닥은 2개의 염기 가닥, 나머지 상보적인 DNA 가닥은 93개의 염기 가닥이 결실된 형태임을 확인하였다.

실시예 4. 핵 공여 세포의 체세포 핵이식 ( SCNT ; Somatic cell nuclear transfer) 및 이에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 제조

4-1. SCNT에 사용되는 난자의 제조

SCNT를 수행하기 위하여 공여세포의 핵이 주입될 난자를 준비하기 위해, 지역 도살장으로부터 수집한 돼지 난자를 25 내지 30℃에서 0.9%(W/V) NaCl 조건의 용액에 담아 실험실로 옮겨왔다. 난자는 성숙난포(antral follicle; 지금 3 내지 6 mm의 크기)로부터 얻었고, 100% 습소에서 5% 이산화탄소로 39℃ 조건하에 성숙 배지에서 배양하였다. 44시간 경과 후, 성숙된 난자를 사이토칼라신 B(5mg/ml 스톡(stock), 10 ml 조작 배지 당 1.5 μm)로 보충한 조작된 배지에서 얇은 유리 파이펫(지름 20 μm)으로 제1 극제 및 인접 세포질을 흡입하여 탈핵화(exonucleation)시켰다. 후에 이는 SCNT에 사용되는 공여세포의 핵을 주입할 난자로 사용되었다.

4-2. 핵 공여 세포의 SCNT 수행

상기 실시예 3-1 및 3-2 과정을 통하여 선별된 정상적인 IL2RG 유전자 녹아웃 돌연변이가 일어난 태아에서 얻은 핵 공여자 세포 하나를, 실시예 4-1에서 제조한 탈핵화된 난자의 위란강(perivitelline space)으로 주입(injection)하였다. 난자 세포질-세포 복합체는 융합(fusion)되었고 전기적인 펄스(BTX, 60초 동안 두 개의 1.1 kV/cm 직류 펄스)로 활성화(activation)되었다. 재구성된 난자는 14 내지 16시간 동안 39℃의 온도, 5% 이산화탄소가 존재하는 배양기에서 히스톤 디아세틸라제 억제제인 Scriptaid 0.5 μM이 첨가된 PZM3 배지 하에서 배양하였다.

상기 실시예 2에서 얻은 IL2RG 유전자 녹아웃 배아에서 성공적으로 돌연변이가 일어난 배아만을 선별하여 공여세포주를 확보하고 SCNT법을 통한 핵이식을 수행함으로서, 보다 정확도 높은 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지를 만들 수 있도록 하였다.

4-3. IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 제조

상기 실시예4-2에서 제작한 복제수정란을 발정기(estrus)가 2일 경과한 대리모를 선별하여 개복수술을 통하여 나팔관으로 주입하였다(평균 230개의 난자). 초기임신의 성공 여부는 복제 수정란 이식 후 28일이 경과한 후에 복부초음파로 확인하였다. 임신 경과는 매 2주마다 모니터하였다. 복제 수정란 이식 후 약 114일이 경과한 후에 대리모의 제왕절개(c-section)나 자연분만(natural paturition)을 통해 복제돼지의 산자를 얻었다. 제조된 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지는 도 4에 나타내었다.

4-4. IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 녹아웃 확인

SCNT를 통한 IL2RG 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어졌는지 여부를 확인하기 위하여 돼지가 태어난 날에 각 돼지에 대하여 유전체 DNA 추출 및 유전자형 검사를 위해 꼬리 생체검사(tale biopsy)를 수행하였다. 먼저, 태어난 산자의 꼬리로부터 유전체 DNA 추출 시료를 얻었고, 각 유전체 DNA는 제작자의 메뉴얼에 따라 DNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, Seongnam-si, Korea)를 사용하여 추출하였다. 이 후 실시예 3-1에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 꼬리 생체검사를 수행하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. WT는 야생형 돼지의 유전자를 나타내고, '-'는 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 서열에서 결실 돌연변이를 나타낸다.

도 5에 나타낸 바와 같이, IL2RG 유전자 녹아웃 돼지가 서열번호 5 및 6으로 표시되는 서열이 결실된 서열을 가짐을 확인하였고, 이는 상기 실시예 3에서 확인한 핵 공여자 세포에서 발견된 돌연변이와 동일한 돌연변이가 제조된 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 나타남을 의미한다. 이는 상기에서 제조한 CRISPR/Cas9 법으로 생산한 태아 섬유아세포에 SCNT를 수행하여도 그 성질이 변하지 않은 상태로 난자로 함입되어 하나의 개체로서 돼지가 생산되는 것을 의미한다.

실험예 1. FACS (유동 혈구 계산 분석; Flow Cytometric Analysis)을 통한 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 면역 결핍 확인

실시예 4에서 제조한 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 IL2RG 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 FACS 분석을 수행하여 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 면역 결핍을 확인하였다. 먼저, 녹아웃시킨 말초 혈액 단핵세포(PBMC; blood mononuclear cell) 및 지라세포를 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지 및 동일한 연령의 대조군 돼지의 혈액 및 비장으로부터 분리하였다. 모든 5×10⁵개의 PBMC 또는 지라세포는 4℃에서 40분 동안 항-돼지 CD3e(Southern Biotech, AL, USA), CD4a, CD8a, 마우스 항-인간 CD21(BD Pharmingen, CA, USA), 마우스 항-돼지 CD16(AbD Serotec, NC, USA) 및 마우스 항-돼지 단핵구 및 과립구(M/G, BD Pharmingen, CA, USA)들과 함께 배양하였고 PBE로 두 번 세척하였다. 한 번에 적어도 10,000 세포를 분석하였고, 샘플은 CELLQUEST 소프트웨어(BD Bioseciences, CA, USA)로 FACS Calibur 시스템을 사용하여 분석하였다. 상기 마우스 항-돼지 CD3e, CD4a, CD8a 및 마우스 항-인간 CD21는 CD3⁺, CD4⁺및 CD8⁺ T세포 및 CD21⁺ B 세포를 분석하기 위하여 사용하였고, 상기 마우스 항-돼지 CD16 및 마우스 항-돼지 단핵구 및 과립구(M/G^-)는 NK 세포를 분석하기 위하여 사용하였다. 그 결과는 도 6(a) 및 6(b)에 나타내었다. 또한, 도 6(a) 및 6(b)에 나타낸 결과를 6(c)에 그래프로 나타내었다. 도 6(a) 및 6(b)에 나타낸 점의 분포는 T 세포의 아집단의 분포에서 CD3^-, CD21⁺ 세포와 M/G^- 세포 및 CD16⁺ 세포를 나타낸다.

도 6(a) 내지 6(c)에 나타낸 바와 같이, IL2RG 대립유전자가 모두 녹아웃된 형질전환 돼지는 야생형 대조군 돼지에 비하여 CD4/CD8 단일- 또는 이중-양성(+) 세포를 가지지 않음을 확인하였다. 또한 CD3⁺CD4⁺ 및 CD3⁺CD8⁺의 비가 녹아웃 돼지에서 급격하게 낮아진 반면, 야생형 대조군 돼지에서는 그 비가 약 20%인 것으로 확인되었다. 이는 PB 및 비장에서 T 림프구의 결핍을 나타낸다. B 세포(CD21+)의 평균적인 개수는 야생형 돼지에 비하여 현저하게 낮아짐을 확인하였다. 또한 NK 세포는 야생형 돼지에 비하여 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 현저하게 낮은 수치를 가짐을 나타낸다.

실험예 2. 조직학적 분석(Histological analysis)을 통한 IL2RG 녹아웃 돼지의 면역 결핍 확인

2-1. 돼지 기관(organ) 관찰

실시예 4에서 제조한 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 IL2RG 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 돼지 기관의 외관 관찰을 수행하여 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 면역 결핍을 확인하였다. 이를 현미경(Original magnification 200X)으로 관찰한 결과를 도 7에 나타내었다. 노란색 점선으로 된 원은 흉선의 위치를 나타낸다.

도 7에 나타낸 바와 같이, IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 흉선이 존재하지 않음을 확인하였다. 또한 기관 간의 크기에서 두드러지는 차이가 관찰되지는 않았으나, IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 기관이 비슷한 연령의 야생형 돼지의 기관에 비해 보다 얇고 느슨하게 기관이 분포하고 있는 것을 관찰할 수 있었고, 관찰 결과 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지가 상대적으로 건강하지 못한 상태임을 확인할 수 있었다. 이는 IL2RG 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어져 상기 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 면역 결핍이 발생하였음을 나타낸다.

2-1. H&E 염색

실시예 4에서 제조한 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 IL2RG 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 돼지 비장에 H&E 염색을 수행하여 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 면역 결핍을 확인하였다. 먼저, IL2RG 유전자 녹아웃 돼지 및 비슷한 연령의 야생형 돼지로부터 비장을 분리하여 10% 중성 버퍼된 포르말린에서 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀에 넣었다. 이 후 제작자의 메뉴얼에 따라 일반적인 H&E 염색 키트를 사용하여 염색을 수행하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 비장에서 동맥주위림프초(periarterial lymphatic sheath)의 중심 동맥이 발육 부진 상태이고, 백비수(white pulp)가 덜 발달되었음을 확인하였다. 이는 IL2RG 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어져 상기 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지가 면역 결핍이 발생하였음을 나타낸다.

2-2. 면역조직화학(IHC; immunohistochemistry) 분석

실시예 4에서 제조한 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 IL2RG 유전자의 녹아웃이 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여 돼지 비장에 면역조직화학을 수행하여 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지의 면역 결핍을 확인하였다. 먼저, 상기 실험예 2-1에서 수행한 것과 같이, IL2RG 유전자 녹아웃 돼지 및 비슷한 연령의 야생형 돼지로부터 비장을 분리하여 10% 중성 버퍼된 포르말린에서 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀에 넣고 보관하다가 이 후에 고정된 조직에 T 및 B 림프구의 분포를 분석하기 위해 T 림프구 마커인 토끼 항-돼지 CD3 항체(abcam, MA, USA)와 B 림프구 마커인 마우스 항-돼지 CD79a 항체(abcam, MA, USA)를 첨가하였다. 이를 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, CD 양성 T 림프구 및 CD79 양성 B 림프구는 모든 IL2RG 녹아웃 돼지의 비장에서 거의 발견되지 않았고, 이를 통하여 림프구의 수는 야생형 대조군에 비하여 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지에서 림프구의 수가 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 이는 IL2RG 유전자 녹아웃이 정상적으로 이루어져 상기 IL2RG 유전자 녹아웃 돼지가 면역 결핍이 발생하였음을 나타낸다.

종합적으로, 이상의 실험 결과를 통해 본 발명에 따른 IL2RG 유전자의 녹아웃을 위한 특이적 sgRNA 및 CRISPR/Cas9법을 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 동물에서 IL2RG 유전자를 암호화하는 DNA 가닥을 녹아웃시켜 면역결핍을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델은 관련 질병의 기전의 규명, 치료물질의 탐색, 진단법의 개발, 재생의료 개발, 이종 장기 이식 부작용 억제법 개발 등에 다양하게 활용될 수 있으므로 향후 재생의료, 장기이식 부작용 억제제, 암 치료제, 특히 SCID(Severe combined immunodeficiency) 개선 또는 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예 및 실험예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> MGENPLUS CO., LTD. <120> Interleukin 2 receptor gamma knockout immunodeficiency animal model and a method for producing the same <130> P-12 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA coding DNA sequence <400> 1 cgaaggtcct cacgcacagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA coding DNA sequence <400> 2 ccgaaggtcc tcacgcacag 20 <210> 3 <211> 4272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 coding DNA sequence <400> 3 atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60 gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120 gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240 agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300 acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360 ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt 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ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160 ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220 ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280 gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2340 aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2400 gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460 aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520 gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580 atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640 gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700 aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760 tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820 aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880 gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940 aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000 ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060 caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120 cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180 atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240 atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300 ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360 accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420 acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480 agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540 tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600 gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660 ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720 tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780 aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840 tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900 cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960 ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020 atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080 gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200 ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260 aagaaaaagt aa 4272 <210> 4 <211> 151 <212> DNA <213> Sabellastarte indica <400> 4 gacacagtct acacccagga aacaaggagt aagcgccatg ttgaagccac cattgccagt 60 caaatccctc ttattcctgc agctgcctct gctgggggtg ggactgaacc cgaaggtcct 120 cacgcacagt gggaatgaag acatcacagc t 151 <210> 5 <211> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> knockout sequence <400> 5 ca 2 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> knockout sequence <400> 6 gggactgaac ccgaaggtcc tcacgcacag tggg 34 <210> 7 <211> 8508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant vector <400> 7 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 cgaaacaccg gaaggtcctc acgcacagtg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 300 aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag 360 ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag 420 acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 480 gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 540 tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 600 gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca 660 gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 720 taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 780 acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 840 gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 900 gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 960 gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac 1020 gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 1080 tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 1140 agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta atgtttaatt 1200 acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggacta 1260 taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa 1320 gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa 1380 gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 1440 gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 1500 gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 1560 gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 1620 gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 1680 cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 1740 cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 1800 cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 1860 ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 1920 gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 1980 cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 2040 tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct 2100 gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 2160 gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 2220 ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 2280 catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 2340 atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 2400 tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 2460 cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 2520 cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 2580 cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 2640 gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 2700 gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 2760 gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 2820 gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 2880 cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct 2940 gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca 3000 gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct 3060 gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga 3120 agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa 3180 ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac 3240 actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga 3300 cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg 3360 gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa 3420 gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt 3480 taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat 3540 tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt 3600 ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc 3660 cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat 3720 cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 3780 ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 3840 ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca 3900 gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg 3960 gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 4020 gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 4080 gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 4140 ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 4200 cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 4260 cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 4320 ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 4380 ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 4440 gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 4500 ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 4560 gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 4620 gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 4680 cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 4740 ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 4800 ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 4860 ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc 4920 caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 4980 cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 5040 cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 5100 gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 5160 ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 5220 cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 5280 gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 5340 caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 5400 cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 5460 gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa 5520 gtaagaattc ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 5580 gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 5640 tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 5700 ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg 5760 gagcggccgc aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 5820 ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 5880 gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag gggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 5940 catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg 6000 gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 6060 ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 6120 cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 6180 tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 6240 cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 6300 ctggaacaac actcaaccct atctcgggct attcttttga tttataaggg attttgccga 6360 tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 6420 aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 6480 agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 6540 tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 6600 tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 6660 aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 6720 tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 6780 gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 6840 atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 6900 cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 6960 tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 7020 caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 7080 ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 7140 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 7200 taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 7260 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 7320 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 7380 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 7440 taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 7500 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tggaagccgc ggtatcattg 7560 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 7620 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 7680 attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 7740 tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 7800 aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 7860 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 7920 cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 7980 gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 8040 agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 8100 ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 8160 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 8220 acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 8280 gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 8340 ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 8400 agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 8460 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgt 8508 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 8 cagaggattt agcctgtgtc atagcataca ttg 33 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 9 cccagtactc taaaattttg cccacatcct tc 32

Claims

sgRNA(small guide RNA)를 암호화하는 서열번호 1 및 2 중 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 DNA 서열; 및 Cas9 유전자;를 포함하는 면역결핍 동물모델 제작용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 Cas9 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 IL2RG(interleukin 2 receptor gamma) 유전자의 엑손 1 내 염기서열을 결실시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제3항에 있어서,
상기 결실은 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 염기서열의 결실인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 하기 도에 기재된 개열 지도를 가지는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
[도]
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된, 면역결핍 동물모델 제작용 형질전환 세포주.
제7항에 있어서,
상기 세포주는 난모세포주, 섬유아세포주 또는 신장세포주인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
제7항의 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및
상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델의 제조방법.
제9항의 방법으로 생산한 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델.
제10항에 있어서,
상기 면역결핍 동물모델은 돼지인 것을 특징으로 하는, IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델.
제10항에 있어서,
상기 면역결핍 동물모델은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 IL2RG 유전자의 엑손 1 내 염기서열이 결실된 것을 특징으로 하는, IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델.
제10항에 있어서,
상기 결실은 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 염기서열의 결실인 것을 특징으로 하는, IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델.
1) 제10항의 IL2RG 유전자 녹아웃 면역결핍 동물모델에 SCID(Severe combined immunodeficiency) 개선 또는 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및
2) 상기 후보물질을 투여한 동물모델을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 후보물질에 의해 면역세포의 발현이 증가되는 경우 이를 SCID 개선 또는 치료제로 판단하는 단계;를 포함하는 SCID 개선 또는 치료제의 스크리닝 방법.