CN114958761B - 一种胃癌模型猪的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达人WNT1、COX‑2和/或mPGES的猪细胞和由该猪细胞通过体细胞克隆技术获得的胃癌模型猪及其构建方法和在生物医药领域的应用。其中，包括将编码人WNT1、COX‑2和/或mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的WNT1、SEQ ID NO：15所示的COX‑2和/或SEQ ID NO：16所示的mPGES的猪细胞和胃癌模型猪，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。本申请研究对象应用性好，猪细胞中目的基因的表达量高、基因编辑效率高。

Description

一种胃癌模型猪的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种采用CRISPR/Cas9系统及同源重组技术构建的在基因组中的特定位置整合并由上皮组织特异性表达启动子即K19基因启动子驱动表达人源WNT1、 COX-2和mPGES蛋白的猪重组细胞，该重组猪细胞被用于克隆生产胃癌模型猪，该胃癌模型猪可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、胃癌发病机制的研究等生物医药领域。
背景技术
胃癌(gastric cancer)是最常见的消化道恶性肿瘤。随着现代医疗的不断发展，尽管在癌症诊断、治疗和寿命方面有了进步，但对死亡率的改善程度一直不大。缺乏对疾病自然史的了解是造成这种局限性的主要原因，目前在分子水平上还不清楚胃癌中具体哪些变化可能导致肿瘤的化生、侵袭和转移。
已有研究表明前列腺素E2(PGE2)水平的升高会导致胃的增生，并伴有SPEM系的粘液细胞化生，SPEM系的胃化生与人类胃癌有很强的相关性，被认为是胃癌的先兆。PGE2的生物合成受3种酶的顺序调控，首先是细胞膜上的磷脂在磷脂酶A2(PLA2)的作用下释放出花生四烯酸(AA)，而后 AA被环氧合酶(COX)催化形成前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2)，PGH2再被前列腺素 E2合成酶(PGES)催化产生PGE2。其中前列腺素E2合成酶1(mPGES，由PTGES基因编码)是 PGE2合成中的关键限速酶。
COX主要有两种：COX-1和COX-2。COX-1是组成型酶，表达于几乎所有组织中。COX-2(由 PTGS2基因编码)则是诱导型酶，在正常组织细胞内的活性极低，当细胞受到炎症等刺激时，其在炎症细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞和滑膜细胞等)中的表达水平可升高至正常水平的10-80倍，促进生成大量的PGE2，导致炎症反应和组织损伤。因此，通过诱导COX-2和mPGES升高PGE2水平在胃癌的发生发展中起重要作用。
WNT是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用，在动物发育中起重要作用，其异常表达或激活能引起肿瘤。WNT1基因是WNT基因家族的一员，其在进化过程中非常保守，已有研究发现约30％的人胃癌中存在WNT信号激活，表明该信号是胃癌发生的主要原因之一。因此，有可能 WNT信号通路和COX-2通路在某些人类胃癌中同时被激活。
但是，目前的研究水平仅仅在于研究胃癌中哪些蛋白高表达、低表达，以及胃癌的发生影响哪几个通路，但是并不能从分子水平通过这些蛋白的调控制备动物模型。研究胃癌发生的病理学机制及研发相应的治疗药物均需要有相关动物疾病模型作为实验工具。目前，常见的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。而猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
因此，本申请采用基因编辑技术及上皮组织特异启动子即K19基因启动子(pK19)构建了胃黏膜上皮组织特异表达人源WNT1、COX-2和mPGES蛋白的猪重组细胞，然后用该重组细胞作为核移植细胞供体克隆生产胃癌模型猪，本申请所得到的胃癌模型猪有望成为研究胃癌分子病理学和胃癌治疗药物开发的有力工具。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种表达人WNT1、COX-2和/或mPGES的猪细胞，将编码人 WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的WNT1、SEQ ID NO：15所示的COX-2和/或SEQ ID NO：16所示的mPGES的猪细胞。
其中，WNT1是一类分泌型糖蛋白，由WNT1基因编码。mPGES为前列腺素E2合成酶1，由PTGES基因编码。COX-2为诱导型酶，由PTGS2基因编码。
优选的，插入的编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列可以为相应的CDS序列或者cDNA序列。即编码人WNT1的核苷酸序列可以为人WNT1基因的CDS序列或者cDNA序列。编码人COX-2的核苷酸序列可以为人PTGS2基因的CDS序列或者cDNA序列。编码人 mPGES的核苷酸序列可以为人PTGES基因的CDS序列或者cDNA序列。
优选的，人WNT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
优选的，人COX-2的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
优选的，人mPGES的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
在本发明的一个具体实施方式中，插入猪安全港位点的核苷酸序列可以为下列任一种：
A)编码人WNT1的核苷酸序列；
B)编码人COX-2的核苷酸序列；
C)编码人mPGES的核苷酸序列；
D)编码人WNT1和mPGES的核苷酸序列；
E)编码人WNT1和COX-2的核苷酸序列；
F)编码人mPGES和COX-2的核苷酸序列；
G)编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列。
优选的，所述的插入的编码人WNT1的核苷酸序列如SEQ ID NO：44所示，插入的编码人 COX-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：45所示，插入的编码人mPGES的核苷酸序列如SEQID NO： 46所示。
优选的，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。
在本发明的一个具体实施方式中，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：47所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：49所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示。
进一步优选的，猪的最佳安全港位点为COL1A1安全港位点。
优选的，所述的编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为pK19。所述的pK19启动子驱动编码人WNT1、COX-2和/或mPGES蛋白的核苷酸序列在胃腺组织(优选胃黏膜上皮组织)中特异表达。
细胞角蛋白19(Cytokeratin，K19)在从上胚层阶段的多种细胞类型中表达并且被保持在多种上皮细胞类型后胚胎和出生后阶段，包括胃、肠和支气管上皮细胞以及肝管细胞等。因此，K19基因启动子(简称pK19)是研究K19阳性细胞，尤其是胃肠道上皮细胞的生理、病理功能的有力工具。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列在猪细胞中通过pK19驱动，所述的pK19的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示。
优选的，所述的猪细胞为猪的体细胞。进一步优选可以用于体细胞核移植技术的任意猪的体细胞。
优选的，所述的猪细胞可以为乳腺细胞、胃黏膜上皮细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞、成纤维细胞、肌细胞、胶质细胞、脂肪细胞或生殖细胞等等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的猪细胞为猪成纤维细胞或胃腺细胞(优选为胃黏膜上皮细胞)。
本发明的第二方面，提供了一种上述的猪细胞的构建方法，将编码人WNT1、COX-2和/或 mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的WNT1、SEQ IDNO： 15所示的COX-2和/或SEQ ID NO：16所示的mPGES的猪细胞。
具体可以采用基于同源重组的基因编辑、基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术。
优选的，所述的构建方法包括使用安全港位点载体将编码人WNT1、COX-2和/或mPGES 的核苷酸序列插入猪安全港位点，所述的安全港位点载体包含编码人WNT1、COX-2和/或mPGES 的核苷酸序列以及安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：
A)ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQID NO：6所示。优选的，所述的ROSA26安全港位点载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO：4 所示。
B)AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQID NO：8所示。优选的，所述的AAVS1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为AAVS1的5’同源臂和3’同源臂。
C)H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ IDNO：10所示。优选的，所述的H11安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为H11的5’同源臂和3’同源臂。
或D)COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQ ID NO：12所示。优选的，所述的COL1A1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ IDNO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为COL1A1的5’同源臂和3’同源臂。
进一步优选的，猪最佳安全港位点载体骨架为COL1A1安全港位点载体骨架。
优选的，所述的安全港位点载体还包含启动子、信号分子以及编码EGFP蛋白、mCherry 蛋白和puro抗性蛋白的核苷酸序列。其中，所述的启动子为EF-1α启动子、PGK启动子和/或 pCAG启动子。所述的信号分子为EF-1αpoly(A)信号、bGH poly(A)信号和/或β-globin poly(A) 信号。进一步优选还包含绝缘子区域。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的安全港位点载体骨架从5’至3’依次包括5’同源臂、绝缘子区域、EF-1αpoly(A)信号、编码EGFP的核苷酸序列、EF-1α启动子、绝缘子区域、PGK启动子、编码mCherry的核苷酸序列、bGH poly(A)信号、loxP-puro-loxP表达框区域、绝缘子区域、β-globin poly(A)信号、pCAG启动子、绝缘子区域、3’同源臂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的COL1A1安全港位点载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
优选的，使用sgRNA载体进行猪细胞的构建，所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、 H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：
靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
优选的，所述的sgRNA载体还包含骨架载体，所述的骨架载体的核苷酸序列为SEQID NO： 3。
优选的，使用Cas载体进行猪细胞的构建，所述的Cas载体包含编码Cas蛋白、EGFP和Puro 抗性蛋白的核苷酸序列，其中，所述的Cas载体还包含EF1a启动子、CMV增强子、WPRE元件和3’LTR序列元件，优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列从5’-3’依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信号，核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro抗性蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信号序列元件，所述的Cas蛋白选自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csy4、Csel、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Cscl、Csc2、Csa5、Csnl、Csn2、Csml、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、 Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、CsxlO、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、 CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Csdl、Csd2、Cstl、Cst2、Cshl、Csh2、Csal、Csa2、Csa3、 Csa4、Csa5、C2cl、C2c2、C2c3、Cpfl、CARF、DinG、其同源物或其修饰形式，优选为Cas9。进一步优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或2所示，更进一步优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
为了增加Cas9载体的基因编辑能力，本发明在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：
1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；
2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a 启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；
3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9 的核定位能力；
4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9 的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；
5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：
1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；
2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；
3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；
6)转录终止信号：bGHpolyA signal；
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin抗性蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为 C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。
优选的，所述的安全港位点载体、sgRNA载体或Cas载体均为环状质粒。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将安全港位点载体、sgRNA载体和 Cas载体共转染至猪细胞。
本发明的第三方面，提供了一种包含上述的猪细胞的组织或器官。
优选的，所述的组织为组成胃的上皮组织、肌肉组织、神经组织、结缔组织。
优选为上皮组织。
优选为胃腺组织。
更优选为胃黏膜上皮组织。
优选的，所述的器官为胃。
本发明的第四方面，提供了一种表达WNT1、COX-2和/或mPGES的模型猪的构建方法，将编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ IDNO： 14所示的WNT1、SEQ ID NO：15所示的COX-2和/或SEQ ID NO：16所示的mPGES的猪细胞。优选的，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点为COL1A1位点。
优选的，所述的构建方法还包括制备上述猪细胞的步骤。
优选的，所述的构建方法包括将上述的猪细胞移入去核的猪卵母细胞中，获得模型猪。在本发明的一个具体实施方式中，移入位置为去核卵母细胞的卵周隙。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括提供上述的猪细胞或者采用上述的猪细胞构建方法获得猪细胞，然后将该猪细胞进行体细胞核移植动物克隆，获得表达WNT1、COX-2和/或mPGES的模型猪。
本发明的第五方面，提供了一种胃癌模型猪的构建方法，将编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的WNT1、SEQ ID NO：15所示的COX-2和/或SEQ ID NO：16所示的mPGES的猪细胞。优选的，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点为COL1A1位点。
优选的，所述的构建方法包括将上述的猪细胞移入去核的猪卵母细胞中，获得胃癌模型猪。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括提供上述的猪细胞或者采用上述的猪细胞构建方法获得猪细胞，然后将该猪细胞进行体细胞核移植动物克隆，获得胃癌模型猪。
本发明的第六方面，提供了一种安全港位点载体，所述的安全港位点载体包含编码人WNT1、 COX-2和/或mPGES的核苷酸序列以及安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人WNT1、COX-2和/或mPGES的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：
A)ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQID NO：6所示。优选的，所述的ROSA26安全港位点载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO：4 所示。
B)AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQID NO：8所示。优选的，所述的AAVS1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为AAVS1的5’同源臂和3’同源臂。
C)H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ IDNO：10所示。优选的，所述的H11安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为H11的5’同源臂和3’同源臂。
或D)COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQ ID NO：12所示。优选的，所述的COL1A1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ IDNO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为COL1A1的5’同源臂和3’同源臂。
进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点载体骨架为COL1A1安全港位点载体骨架。
优选的，所述的安全港位点载体还包含启动子、信号分子以及编码EGFP蛋白、mCherry 蛋白和puro抗性蛋白的核苷酸序列。其中，所述的启动子为EF-1α启动子、PGK启动子和/或 pCAG启动子。所述的信号分子为EF-1αpoly(A)信号、bGH poly(A)信号和/或β-globin poly(A) 信号。进一步优选还包含绝缘子区域。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的安全港位点载体骨架从5’至3’依次包括5’同源臂、绝缘子区域、EF-1αpoly(A)信号、编码EGFP的核苷酸序列、EF-1α启动子、绝缘子区域、PGK启动子、编码mCherry的核苷酸序列、bGH poly(A)信号、loxP-puro-loxP表达框区域、绝缘子区域、β-globin poly(A)信号、pCAG启动子、绝缘子区域、3’同源臂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的COL1A1安全港位点载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
本发明的第七方面，提供了上述的安全港位点载体、上述的Cas载体、上述的sgRNA载体或者上述的sgRNA在制备猪细胞、模型猪中的应用。
本发明的第八方面，提供了一种上述的猪细胞、上述的构建方法获得的猪细胞或上述的构建方法获得的表达WNT1、COX-2和/或mPGES的模型猪在制备胃癌动物模型中的应用，或者在筛选治疗胃癌的药物及药效评价中的应用，或者在基因及细胞治疗中的应用，或者在研究胃癌的发病机制中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种上述的组织或器官或者上述的构建方法获得的模型猪在筛选治疗胃癌的药物及药效评价中的应用，或者在基因及细胞治疗中的应用，或者在研究胃癌的发病机制中的应用。
本申请所述的“胃癌”是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其可发生于胃的任何部位，包括但不限于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁等等。
术语“载体”是细胞内能够在自身控制下复制的多核苷酸，或者通过插入到宿主细胞染色体进行复制和/或表达的遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、细菌噬菌体和粘粒。
本发明所述的“gRNA”，也称指导RNA，是由sgRNA载体在细胞中转录得到的，对细胞中的靶序列具有特异性并且可与Cas蛋白形成复合体的RNA。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。
而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称 pKG-GE3)载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，编辑效率比原载体提高100％以上。
(3)本发明针对猪基因组进行了4个安全港位点基因敲入后表达情况的摸索，从中筛选出了最佳的供外源基因插入的猪基因组安全港位点，可有效改善基因敲入后目的基因的表达情况。
(4)本发明采用上皮组织特异启动子pK19来驱动外源基因在上皮组织中的特异表达，将使外源基因在靶组织特异地发挥作用，同时避免外源基因高水平泛表达对机体造成的影响。
(5)利用本发明所得到的pK19-hWNT1-hC2mE表达框纯合敲入的单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到pK19-hWNT1-hC2mE表达框纯合敲入的克隆猪，并且该纯合插入基因可稳定遗传。进一步的，可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、胃癌发病机制的研究等生物医药领域。
在小鼠模型制作中，通常采用受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植，因其直接获得基因敲入后代的概率非常低(低于1％)，同时需要进行后代的杂交选育来筛选纯合敲入的个体，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，然后再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应模型猪，可大大缩短模型猪制作周期，并节省人力、物力、财力。
本发明通过基因编辑及体细胞克隆技术获得了快速模拟人胃癌发展进程的pK19-hWNT1-hC2mE 胃癌模型猪，将有助于研究并揭示胃癌的发病机制，并可用于进行药物筛选、药效检测、基因及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为预防和治疗人类胃癌提供有力的实验手段。本发明对于人类胃癌发病机制的研究、药物的研发及临床前试验均具有重大应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图3为pU6gRNA载体的结构示意图。
图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成能结合靶序列的gRNA)插入质粒pKG-U6gRNA 的示意图。
图5为含ROSA26插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图6为含AAVS1插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图7为含H11插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图8为含COL1A1插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图9为含COL1A1插入位点的pKG-pK19-hWNT1-hC2mE Donor质粒的结构示意图。
图10为质粒配比优化测试的测序结果。
图11为质粒pX330和质粒pKG-GE3编辑效果的测序结果。
图12为不同安全港位点调控GFP绿色荧光表达图。
图13为不同安全港位点调控GFP转录水平荧光定量PCR结果。
图14为不同安全港位点调控GFP蛋白表达的FACS检测结果。
图15为鉴定猪COL1A1安全港插入位点5’端pK19-hWNT1-hC2mE表达框是否重组成功的电泳图，其中，WT为野生型对照，Blank为空白对照，sh4代表安全港位点COL1A1，Lr代表5’同源臂， 1414或5965代表检测位点信息。
图16为鉴定猪COL1A1安全港插入位点3’端pK19-hWNT1-hC2mE表达框是否重组成功的电泳图，其中，WT为野生型对照，Blank为空白对照，sh4代表安全港位点COL1A1，Rr代表3’同源臂， 282或4723代表检测位点信息。
图17为鉴定pK19-hWNT1-hC2mE表达框是否纯合插入猪COL1A1安全港位点的电泳图，其中， WT为野生型对照，Blank为空白对照，sh4代表安全港位点COL1A1，JDF代表鉴定引物F，JDR代表鉴定引物R，1085或1560代表检测位点信息。
图18为猪COL1A1安全港位点调控人源WNT1、PTGS2(编码COX-2)、PTGES(编码mPGES) 基因转录水平荧光定量PCR结果，其中2-ΔCt代表相对荧光定量，其中，ΔCt为靶基因的Ct值-内参基因的Ct值，WNT1-WT、PTGS2-WT和PTGES-WT分别为野生型对照猪胃黏膜上皮细胞中的WNT1、 PTGS2和PTGES基因的表达量，WNT1-WNT1、PTGS2-PTGS2和PTGES-PTGES分别为模型猪胃黏膜上皮细胞中的WNT1、PTGS2和PTGES基因的表达量。
图19为猪COL1A1安全港位点调控人源WNT1、COX-2、mPGES蛋白表达的FACS检测结果，其中，WT代表野生型对照猪胃黏膜上皮细胞相关蛋白的抗体结合情况，WNT1、COX-2、mPGES分别代表模型猪胃黏膜上皮细胞相关蛋白的抗体结合情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％ DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％ CO2、5％O2的恒温培养箱。
制备猪原代成纤维细胞的方法：从初生从江香猪的耳组织制备猪原代成纤维细胞。
①取猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比) Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 0.1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液，用于进行后续电转实验。
实施例1、载体的构建
一、Cas9高效表达载体(简称pKG-GE3)的构建
出发商品质粒为：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，简称质粒pX330，如SEQID NO：1所示。
以pX330质粒为基础，构建质粒pU6gRNAeEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3，如SEQ ID NO：2所示。
质粒pX330和质粒pKG-GE3均为环形质粒。
质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第 727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第 1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
质粒pKG-GE3的结构示意图见图2。SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第 682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A (自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin抗性蛋白(简称PuroR蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和T2A的存在，融合蛋白自发被裂解成三个独立的蛋白，即Cas9蛋白、EGFP蛋白和Puro抗性蛋白。
与质粒pX330相比，所构建的质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列 (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有 chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9 基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予真核细胞荧光及嘌呤霉素抗性双重筛选标记；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
二、pKG-U6gRNA表达载体的构建
以pUC57为出发质粒，构建pKG-U6gRNA载体，结构示意图见图3，序列如SEQ ID NO：3所示。 SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA 骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
三、构建含GFP基因的不同安全港位点Donor载体
质粒PB-1G 2R 3-puro-ROSA26结构示意图见图5。SEQ ID NO：4中，第1-345位核苷酸组成ROSA26 安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH1左臂，如SEQ ID NO：5所示)，第9184-10195位核苷酸组成 ROSA26安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH1右臂，如SEQ IDNO：6所示)，第346-546、3132-3531、 6506-6706、8975-9175位核苷酸分别组成4个不同的绝缘子区域，第1954-3131位核苷酸组成EF-1α启动子，第1216-1935位核苷酸编码EGFP蛋白，第637-1209位核苷酸组成EF-1αpoly(A)信号,第3543-4042位核苷酸组成PGK启动子，第4059-4769位核苷酸编码mCherry蛋白，第4791-5015位核苷酸组成bGH poly(A)信号，第5054-6504位核苷酸为loxP-puro-loxP表达框区域，第7259-8974位核苷酸组成pCAG启动子，第6969-7233位核苷酸组成β-globin poly(A)信号。
质粒PB-1G 2R 3-puro-AAVS1结构示意图见图6。仅将SEQ ID NO：4中的第1-345位核苷酸替换为 AAVS1安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH2左臂)，见SEQ ID NO：7；将SEQID NO：4中的第 9184-10195位核苷酸替换为AAVS1安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH2右臂)，见SEQ ID NO：8。其他序列与SEQ ID NO：4一致。
质粒PB-1G 2R 3-puro-H11结构示意图见图7。仅将SEQ ID NO：4中的第1-345位核苷酸替换为H11 安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH3左臂)，见SEQ ID NO：9；将SEQ IDNO：4中的第9184-10195 位核苷酸替换为H11安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH3右臂)，见SEQ ID NO：10。其他序列与 SEQ ID NO：4一致。
质粒PB-1G 2R 3-puro-COL1A1结构示意图见图8。仅将SEQ ID NO：4中的第1-345位核苷酸替换为 COL1A1安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH4左臂)，见SEQ ID NO：11；将SEQ ID NO：4中的第 9184-10195位核苷酸替换为COL1A1安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH4右臂)，见SEQ ID NO： 12。其他序列与SEQ ID NO：4一致。
四、构建pKG-pK19-hWNT1-hC2mE Donor载体
构建质粒pKG-pK19-hWNT1-hC2mE，结构示意图见图9。SEQ ID NO：13中，第9-860位核苷酸为猪基因组COL1A1安全港插入位点5’端同源序列，第887-1087位核苷酸为绝缘子1(Insulator 1)序列，第1174-3190位核苷酸为pK19启动子序列(来源于小鼠基因组)，第3202-4311位核苷酸为human WNT1 蛋白的编码序列(全基因合成于生工生物，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示),第4321-4377 位核苷酸为P2A序列，第4378-6189位核苷酸为human COX-2蛋白的编码序列(全基因合成于生工生物，基因名称为PTGS2，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示)，第6199-6252位核苷酸为T2A序列，第6253-6711位核苷酸为human mPGES蛋白的编码序列(全基因合成于生工生物，基因名称为PTGES，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示)，第6760-6784位核苷酸为bGH Poly(A)序列，第7146-7475 位核苷酸为SV40启动子序列，第7524-8120位核苷酸为Puromycin抗性蛋白(简称PuroR蛋白)编码序列，第8300-8421位核苷酸为SV40 Poly(A)序列，第7070-7103及8466-8499位核苷酸分别为方向相同的LoxP 序列，第8508-8708位核苷酸为绝缘子2(Insulator 2)序列，第8729-9435位核苷酸为猪基因组COL1A1 安全港插入位点3’端同源序列。SEQ ID NO：13中，第3202-6711形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和T2A的存在，融合蛋白自发被裂解成三个独立的蛋白，即WNT1、COX-2和mPGES。
实施例2、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
选择位于RAG1基因的高效gRNA靶点：
RAG1-gRNA4的靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：17)。
用于扩增包含靶点的片段的引物如下：
RAG1-nF126：5’-CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA-3’(SEQ ID NO：18)；
RAG1-nR525：5’-TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：19)。
一、构建RAG1基因gRNA重组质粒
对质粒pKG-U6gRNA用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。分别合成RAG1-4S和RAG1-4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
RAG1-4S：5’-caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：20)；
RAG1-4A：5’-aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc-3’(SEQ ID NO：21)。
RAG1-4S和RAG1-4A均为单链DNA分子。
二、质粒配比优化
1、质粒共转染猪原代成纤维细胞
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：1：1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：2：1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：3：1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染至猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和 RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。
电泳后回收目的条带并进行测序，测序结果见图10。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第三组的基因编辑效率依次为9％、53％、66％。第四组不发生基因编辑。结果表明，第三组编辑效率最高，确定单gRNA 质粒与Cas9质粒最适配比为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。
三、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
1、共转染
RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330，即两种DNA的摩尔比为3:1。
RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒 pKG-GE3，即两种DNA的摩尔比为3:1。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。RAG1-B组不发生基因编辑。 RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率依次为28％、68％。测序结果示例性峰图见图11。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3、筛选供外源基因定点插入的猪基因组最佳安全港位点
一、猪基因组ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1安全港位点gRNA重组载体的构建及高效切割靶点筛选
通过前期筛选，ROSA26、H11、AAVS1、COL1A1安全港位点的高效切割靶点分别为sgRNAROSA26-g3(切割效率38％)、sgRNAAAVS1-g4(切割效率30％)、sgRNAH11-g1(切割效率60％)、sgRNACOL1A1-g3(切割效率56％)，靶点序列如下：
sgRNAROSA26-g3靶点：5’-GAAGGAGCAAACTGACATGG-3’(SEQ ID NO：22)；
sgRNAAAVS1-g4靶点：5’-TGCAGTGGGTCTTTGGGGAC-3’(SEQ ID NO：23)；
sgRNAH11-g1靶点：5’-TTCCAGGAACATAAGAAAGT-3’(SEQ ID NO：24)；
sgRNACOL1A1-g3靶点：5’-GCAGTCTCAGCAACCACTGA-3’(SEQ ID NO：25)。
这4个gRNA靶点对应的gRNA质粒分别为pKG-U6gRNA(ROSA26-g3)、pKG-U6gRNA(AAVS1-g4)、pKG-U6gRNA(H11-g1)、pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)，其中，骨架载体均为pKG-U6gRNA(SEQ ID NO：3)，质粒构建方法同实施例2。
二、含不同安全港插入位点两侧同源臂的荧光Donor载体(即包含外源基因GFP的不同安全港位点载体)、sgRNA载体和Cas9载体(实施例1制备的pKG-GE3)混合电转猪原代成纤维细胞
分别将PB-1G 2R 3-puro-不同安全港插入位点荧光载体与对应的高效sgRNA载体以及高效Cas9 表达载体共转染猪原代成纤维细胞。使用哺乳动物核转染试剂盒(Neonkit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪进行电转实验(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
共转染质粒组合及配比：
第一组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-ROSA26、质粒pKG-U6gRNA(ROSA26-g3)和质粒pKG-GE3 共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G2R 3-puro-ROSA26、 0.82μg质粒pKG-U6gRNA(ROSA26-g3)：0.92μg质粒pKG-GE3，即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第二组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-AAVS1、质粒pKG-U6gRNA(AAVS1-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G 2R 3-puro-AAVS1、 0.82μg质粒pKG-U6gRNA(AAVS1-g4)：0.92μg质粒pKG-GE3，即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第三组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-H11、质粒pKG-U6gRNA(H11-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G 2R 3-puro-H11、0.82μg质粒pKG-U6gRNA(H11-g1)：0.92μg质粒pKG-GE3，即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第四组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-COL1A1、质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)和质粒pKG-GE3 共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G2R 3-puro-COL1A1、 0.82μg质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)：0.92μg质粒pKG-GE3，即3种DNA的摩尔比为：1：3： 1。
第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加任何质粒进行电转染操作。
具体实施方法：
细胞：电转前猪原代成纤维细胞融合度达到60％，0.25％胰蛋白酶消化，台盼蓝染色计数，取等量细胞进行五组电转。
猪原代细胞电转：
(1)将细胞用胰酶消化，得到的细胞悬液用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用58μL电转基本溶液R buffer重悬细胞(11μL/个)，重悬过程中要避免气泡的产生；
(2)吸取10μL细胞悬液与质粒电转反应液混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
(3)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL Buffer E；
(4)用电转枪吸取10μL步骤(2)得到的混合液，插入电击杯内，选择电转程序(1450V 10ms 3pulse)，电击转染后立即将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL的完全培养液(15％胎牛血清 (Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio))；
(5)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；
(6)电转12-24h换液，电转48h使用嘌呤霉素加压，筛选阳性细胞。
三、嘌呤霉素加压筛选及细胞GFP荧光强度检测
细胞经质粒电转48h，加入1.5μg/mL嘌呤霉素筛选，每两天更换含有相同浓度嘌呤霉素的培养基，同时进行GFP绿色荧光拍照，连续筛选两周，待细胞内质粒完全降解后再继续加压筛选一周。通过 GFP荧光表达的强弱判断安全港位点表达外源基因效率的高低。
嘌呤霉素筛选一周后，ROSA26、COL1A1安全港位点实验组荧光强度明显强于AAVS1、H11实验组；嘌呤霉素筛选两周后，荧光强度由强到弱依次为：COL1A1>ROSA26>H11>AAVS1，其中H11 组荧光强度不太均一，ROSA26组整体荧光强度较均一，且荧光强度较高，AAVS1组细胞荧光表达最弱，COL1A1组荧光细胞数最多,荧光最强；嘌呤霉素继续筛选三周后，荧光强度由强到弱依次为： COL1A1>ROSA26>H11>AAVS1，结果如图12。
四、GFP基因转录水平检测
为了比较GFP基因整合入四个不同安全港位点后mRNA转录水平的差异性，能否参与GFP的表达调控及对表达量的影响。在GFP基因外显子处设计一对引物，取嘌呤霉素筛选三周后的细胞，提取总RNA,反转录成cDNA,用于检测原代细胞在四个不同安全港位点整合GFP基因后的转录水平，同时用野生型原代细胞即第五组的细胞(无质粒的对照电转组)所得到的定量结果作为对照。以GAPDH 为内参基因按照2-ΔCt法进行计算。
(1)引物信息(表1)
表1：荧光定量PCR引物信息
(2)细胞总RNA提取
根据Bio Flux的Simply P总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA提取
(3)cDNA第一链获得
根据Vazyme反转录试剂盒II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(R211-01/02)说明书合成 cDNA第一链，具体步骤和程序如下：
1)配制第一链cDNA合成反应液
在RNase-free离心管中配制如下表2混合液
表2
用移液枪轻轻吹打混匀。
2)按下列条件进行第一链cDNA合成反应，反应条件见表3。
表3
产物立即用于qPCR反应，或存放于-80℃保存，避免反复冻融。
(4)荧光定量PCR
利用实时荧光定量PCR法检测插入四组不同安全港位点(ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1) 猪原代成纤维细胞中GFP的表达量，GAPDH作为内参基因。操作步骤及程序如下：
1)反应体系配制见表4
表4
2)qPCR反应程序如下表5
表5
3)统计与分析
用SPSS统计学软件进行数据分析，以(平均数±标准差)表示，采用双因素方差分析进行统计学分析。2-ΔCt值结果显示嘌呤霉素筛选三周后AAVS1、H11组GFP表达量较低，ROSA26、COL1A1组 GFP表达量较高，且COL1A1组和ROSA26组相对于AAVS1和H11组GFP转录水平差异极显著 (P<0.01)，2-ΔCt值见表6，差异显著性分析结果如图13。
表6：2-ΔCt值信息
综上，根据培养细胞三周后的荧光信号强度与GFP基因实时荧光定量PCR的结果，可以得出如下结论，在ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1这四个基因组安全港位点中，COL1A1位点插入外源基因后表达效果最好。
五、GFP基因的蛋白表达水平FACS检测
为了比较GFP基因整合入四个不同安全港位点后GFP蛋白的表达情况。分别用胰蛋白酶消化嘌呤霉素筛选三周后的电转细胞，400g离心4min后，弃上清。以1mL完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液分别转移至流式管内。在BD FACSMelody流式细胞仪的FITC通道内检测GFP信号，并以野生型细胞作为阴性对照，收集5×104个细胞进行分析，结果如图14所示。结果显示GFP荧光信号 COL1A1>ROSA26>H11>AAVS1。
因此，综合上述结果，COL1A1位点是ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1四个安全港位点中最高效表达外源基因的猪原代细胞安全港位点。
实施例4、制备pK19-hWNT1-hC2mE表达框定点插入猪COL1A1安全港位点的单细胞克隆
一、共转染
将质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)、质粒pKG-GE3和质粒pKG-pK19-hWNT1-hC2mE(如SEQ ID NO：13所示)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.89μg质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)：0.99μg质粒pKG-GE3：1.12μg质粒pKG-pK19-hWNT1-hC2mE，即3 种DNA的摩尔比为：3：1：1。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。采用完全培养液培养电转后的细胞16-18小时，更换新的完全培养液进行培养，培养总时间为48小时，然后更换为含抗生素的培养基进行阳性转化细胞的筛选。
二、嘌呤霉素加压筛选及单细胞分选
1.嘌呤霉素筛选pK19-hWNT1-hC2mE表达框阳性插入细胞
细胞经质粒电转48h后，加入1.5μg/mL嘌呤霉素筛选，每天更换含有相同浓度嘌呤霉素的培养基，连续筛选一周后野生型对照孔细胞全部死亡，因电转效率较低，pKG-pK19-hWNT1-hC2mE质粒电转孔筛选一周后细胞也出现大量死亡；继续加入嘌呤霉素筛选一周，细胞只有零星死亡，部分阳性克隆开始分裂增殖，细胞数不断增多；继续加压筛选一周使细胞内质粒降解完全以排除假阳性细胞克隆。加压筛选三周后停止加压，采用不含嘌呤霉素的完全培养液恢复培养2代(每2天1代)，让细胞恢复至良好状态用于下一步的单细胞分选。
2.单细胞分选，放大培养
(1)将嘌呤霉素筛选三周后的群体细胞，进行单细胞分选，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到96孔板中(每孔预先加入100μL不含嘌呤霉素的完全培养液)，每组细胞挑取一板96孔单细胞，每孔一个细胞，放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，培养2天后，更换为含1.5μg/mL 嘌呤霉素的完全培养液，之后每2～3天更换一次细胞培养液(含1.5μg/mL嘌呤霉素)，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；
(2)待96孔板的孔中细胞长满孔底(大约2周左右)，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3细胞收集在1.5mL离心管中用于下一步的基因型检测；
(3)待6孔板细胞长至50％丰满度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
三、猪COL1A1安全港位点定点插入pK19-hWNT1-hC2mE的单细胞克隆基因组水平鉴定
为了检测猪COL1A1安全港位点是否成功定点插入了pK19-hWNT1-hC2mE表达框。取嘌呤霉素加压筛选完毕后的单细胞克隆，提取基因组DNA，进行PCR扩增(分别采用sh4-Lr-JDF1414和 sh4-Lr-JDR5965组成的引物对、sh4-Rr-JDF282和sh4-Rr-JDR4723组成的引物对、sh4-wt-JDF1085和sh4-wt-JDR1560组成的引物对)，然后进行电泳。将猪原代脂肪干细胞作为野生型对照。sh4-Lr-JDF1414 和sh4-Lr-JDR5965组成的引物对用来鉴定猪COL1A1安全港插入位点5’端pK19-hWNT1-hC2mE表达框是否重组成功(靶序列为4552bp)；sh4-Rr-JDF282和sh4-Rr-JDR4723组成的引物对用来鉴定猪 COL1A1安全港插入位点3’端pK19-hWNT1-hC2mE表达框是否重组成功(靶序列为4442bp)；sh4-wt-JDF1085和sh4-wt-JDR1560组成的引物对用来鉴定猪COL1A1安全港位点定点插入的 pK19-hWNT1-hC2mE表达框为纯合型还是杂合型(野生型基因组可扩增出476bp片段，外源插入片段太大无法扩增；因此，如果不显示扩增产物，说明细胞为插入pK19-hWNT1-hC2mE表达框的纯合型；如果显示476bp扩增产物，说明细胞为插入pK19-hWNT1-hC2mE表达框的杂合型或者是野生型)。
sh4-Lr-JDF1414：CCTGCTGTAAGTGCCGTAGT(SEQ ID NO：30)
sh4-Lr-JDR5965：CTAGGGGCACAGCACGTC(SEQ ID NO：31)
sh4-Rr-JDF282：AAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTT(SEQ ID NO：32)
sh4-Rr-JDR4723:CCCATCATTCCGTCCCAGAG(SEQ ID NO：33)
sh4-wt-JDF1085:TGCTGAGTTCTGGCTTCCTG(SEQ ID NO：34)
sh4-wt-JDR1560:TCTACCAAGAGAGTGACCAGCAG(SEQ ID NO：35)
电泳图分别见图15、图16和图17。通过电泳的结果，我们初步判定编号为1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30的单细胞克隆为成功在猪COL1A1安全港位点定点插入pK19-hWNT1-hC2mE的克隆，其中4、12、14、 23号单细胞克隆为纯合定点插入，1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、15、16、17、18、19、20、21、 24、25、26、27、28、29、30为杂合定点插入(表7)。
表7 pK19-hWNT1-hC2mE表达框定点插入猪COL1A1安全港位点单细胞克隆的基因型
将表7中编号为pK19-hWNT1-hC2mE-12(纯合定点插入)的单细胞克隆株进行实施例5中的体细胞核移植生产疾病模型克隆猪。
实施例5胃癌模型猪的克隆生产及所插入的目标基因在模型猪中的表达分析
一、利用体细胞核移植技术克隆生产胃癌模型猪
1、卵母细胞体外成熟
从屠宰场采集新鲜的离体猪卵巢，卵巢在含75mg/mL青霉素和50mg/mL链霉素的0.9％(w/v) 氯化钠溶液中保存，于25–30℃温度下运输至实验室。从直径3～6mm的卵泡中抽取卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)，选择至少具有三层致密卵丘细胞的COCs，接种至4孔板中，每孔装有200μL猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养基(即以TCM-199培养基为基础，内含0.1mg/mL 丙酮酸、0.1mg/mL盐酸半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子、10％(v/v)猪卵泡液、75mg/mL青霉素， 50mg/mL链霉素，10IU/mLeCG和hCG)，每孔接种50个，每次移植需培养300-400个COCs。将含 COCs的培养板在38.5℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中培养42-44小时。
2、体细胞核移植(SCNT)与胚胎移植
(1)体细胞核移植
体外成熟42小时后，用0.1％(w/v)透明质酸酶反复吹打去除COCs的扩张卵丘细胞。将具有完整膜且含排出的第一极体的卵母细胞在含有0.1mg/mL地美可辛、0.05M蔗糖和4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的NCSU23培养基中培养0.5-1h，促使卵母细胞核突起，然后使用尖部倾斜的显微注射针 (直径约20μm)在含有10μm HEPES、0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、10％FBS，0.1mg/mL地美可辛和5mg/mL细胞松弛素B的Tyrode乳酸培养基中去除突起的细胞核和极体。以纯合插入靶基因的单细胞克隆株(pK19-hWNT1-hC2mE-12)作为核供体，将单个供体细胞注入去核卵母细胞的卵周隙。使用胚胎细胞融合仪(ET3，Fujihira Industry)在含有0.25M D-山梨醇、0.05mM Mg(C2H3O2)2、20mg/mL BSA和0.5mM HEPES(acid-free)的融合培养基中用200V/mm的直流脉冲将供体细胞与受体卵母细胞融合20μs。将重构胚在PZM-3溶液(配方如下)中培养2h以允许细胞核重编程，然后在含有0.25M D-山梨醇、0.01mM Ca(C2H3O2)2、0.05mM Mg(C2H3O2)2和0.1mg/mL BSA的激活培养基中用150V/mm 的单脉冲激活100μs。然后将激活的胚胎在含5μg/mL细胞松弛素B的PZM-3中，于38.5℃、5％CO2、 5％O2、90％N2和饱和湿度的培养箱中培养2小时，以进一步激活胚胎。最后将小部分重构胚移入PZM-3 培养基中，在38.5℃、5％CO2、5％O2、90％N2和饱和湿度的培养箱中培养2d和7d，分别检测胚胎卵裂率和囊胚发育率。大部分重构胚在激活后培养6h即可用于后续的胚胎移植。
(2)胚胎移植
选择6头处于发情期的杂交母猪(大白猪/长白猪)作为重构胚的代孕母猪，将激活后培养6h的重构胚移植到受体母猪的输卵管中，每头母猪移植300-350个重构胚，每次移植1-2头母猪。在胚胎移植后约23天，使用超声波扫描仪(HS-101V，日本本田电子)检查妊娠情况，确认受体母猪是否怀孕，克隆猪在胚胎移植后第116-117天左右出生。
4头成功怀孕的代孕母猪共生产6头克隆猪，该克隆猪即为pK19-hWNT1-hC2mE表达框纯合插入的胃癌模型猪。
PZM-3溶液配方见表8。
表8
成分 浓度 g/50mL
1 NaCl 108.00mM 0.3156g
2 KCl 10.00mM 0.0373g
3 KH2PO4 0.35mM 0.0024g
4 MgSO4·7H2O 0.40mM 0.0024g
5 NaHCO3 25.07mM 0.1055g
6 丙酮酸钠 0.20mM 0.0011g
7 乳酸钙·5H2O 2.00mM 0.0308g
8 肌醇 2.7756mM 0.0250
9 酚红(母液10mg/mL) 0.2656mM 0.5mL母液
10 L-谷氨酰胺* 1.00mM 0.0073g
11 亚牛磺酸* 5.00mM 0.0273g
12 BME必须氨基酸(50×)* 1× 1mL
13 MEM非必须氨基酸(100×)* 1× 0.5mL
14 超纯水 补足至50mL
*使用前添加
3、野生型对照克隆猪的制备
将同一来源的猪原代成纤维细胞代替重组细胞进行步骤2，得到克隆猪，即为野生型对照猪，其遗传背景除外源插入的靶基因外，其余与重组细胞所得到的模型猪完全一致。
二、胃癌模型猪WNT1、PTGS2和PTGES基因的转录水平检测
为了检测猪COL1A1安全港位点定点插入pK19-hWNT1-hC2mE表达框的模型猪能否表达人WNT1、 PTGS2和PTGES基因的mRNA，在pK19-hWNT1-hC2mE表达框内设计3对特异引物，分别采集出生 60天的胃癌模型猪和野生型对照克隆猪(相同细胞来源)的胃黏膜组织，提取总RNA，反转录成cDNA，用上述3对引物分别检测猪胃黏膜组织内人WNT1、PTGS2和PTGES基因的mRNA表达水平。以β-actin 为内参基因按照2-ΔCt法进行计算。详细步骤参照实施例3中的(四、GFP基因转录水平检测)。
引物信息见表9：
表9荧光定量PCR引物信息
用SPSS统计学软件进行数据分析，以(平均数±标准差)表示，采用单因素方差分析进行统计学分析。2-ΔCt值结果显示，胃癌模型猪胃黏膜组织的WNT1、PTGS2和PTGES基因的表达量均显著高于野生型对照克隆猪胃黏膜组织的相应基因的表达量，WNT1在野生型对照猪中也有较明显的表达(由于人和猪WNT1基因同源性较高，因此所设计的引物也能扩增出猪的WNT1的cDNA序列)，但其表达量要低于模型猪WNT1的表达量(图18)。
综上，根据实时荧光定量PCR的结果，WNT1、PTGS2和PTGES基因在所构建的胃癌模型猪的胃黏膜组织中有显著的表达。
三、FACS检测胃癌模型猪WNT1、COX-2和mPGES的蛋白表达水平
为了比较WNT1、COX-2和mPGES蛋白在模型猪及野生型对照猪胃黏膜上皮细胞中的表达情况，进行下述实验：
1、分别采集出生60天的模型猪及野生型对照猪的胃壁组织，放入HBSS液中，去除结缔组织， HBSS清洗3次，在HBSS中以眼科剪剪成2～3mm的小块，整个过程保持无菌；消化液以Ham’s F-12 培养液配制而成，含37.5mg/L胶原酶Ⅰ和0.18mg/mL透明质酸酶，剪碎后的小块组织于37℃震荡消化5min。加入适量完全培养液(含10％FBS的Ham’s F-12)稀释消化酶，再消化5min，然后以 200μm无菌尼龙网过滤，滤出液含成簇细胞，300×g离心4min，沉淀物以完全培养液洗涤3次，重悬接种。传代2次后，用0.25％胰酶消化收集胃黏膜上皮细胞。
2、完成步骤1后，用PBS缓冲液洗涤细胞，然后用-20℃预冷的90％甲醇水溶液充分重悬细胞，固定20min，离心并弃除固定液，然后加入3％BSA水溶液封闭1h，离心弃除封闭液，然后用完全培养基洗涤。
3、完成步骤2后，分别用人WNT1抗体(Invitrogen，MA5-15544，工作浓度为1:200稀释)、人 COX-2抗体(Invitrogen，35-8200，工作浓度为1:250稀释)和人mPGES抗体(Abcam，ab168621，工作浓度为1：100稀释)工作液重悬细胞，室温孵育2h，然后用完全培养基充分洗涤细胞。
4、完成步骤3后，加入山羊抗小鼠二抗(Invitrogen，A32723)工作液(二抗工作液稀释度为1： 1000)，室温孵育1h，然后用完全培养基充分洗涤细胞。
5、完成步骤4后，用500μL完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至流式管内，在BD FACSMelody 流式细胞仪的FITC通道内分别检测各抗体荧光信号，收集5×104个细胞进行分析。
结果如图19。结果显示在猪COL1A1安全港位点定点插入pK19-hWNT1-hC2mE表达框的模型猪胃黏膜上皮细胞中分别检测到明显的人WNT1、COX-2和mPGES的抗体荧光信号，而在野生型对照猪胃黏膜上皮细胞(WT)中仅可检测到WNT1的抗体荧光信号(WNT1在物种进化过程中高度保守，蛋白序列比对结果显示，人与猪WNT1的同源性高达99.46％)，但其信号强度比模型猪胃黏膜上皮细胞的要弱一些。在WT细胞中检测不到人COX-2和mPGES的抗体荧光信号，这说明所插入的 pK19-hWNT1-hC2mE表达框在胃癌模型猪的胃黏膜上皮细胞中有较高的表达，也进一步说明了胃癌模型猪被成功构建。
进一步的，本申请制备的胃癌模型猪可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、胃癌发病机制的研究等生物医药领域。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 一种胃癌模型猪的构建方法及应用
<130> 1
<160> 51
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200
ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080
taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140
acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200
agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260
ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320
cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440
taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980
aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040
tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700
ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880
ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940
atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500
ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460
tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484
<210> 2
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360
gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600
ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660
tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720
ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780
gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020
gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860
ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920
cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980
gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040
ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100
agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160
ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220
actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280
cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340
tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400
cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520
ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640
atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700
cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820
cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880
caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940
cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000
gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060
cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120
cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180
ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240
cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300
gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360
gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420
caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600
ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660
caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900
gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080
cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140
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cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260
aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320
catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440
taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500
agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560
catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620
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ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860
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caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100
ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160
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aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520
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cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700
cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820
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gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940
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cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060
caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120
gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180
cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240
ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300
ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360
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ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660
cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380
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tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680
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ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860
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ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100
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aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280
tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400
ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580
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gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880
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cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720
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cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840
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tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476
<210> 3
<211> 3120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
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catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
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gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120
<210> 4
<211> 14138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgcgccct ctacctgctc tcggacccgt gggggtgggg ggtggaggaa ggagtggggg 60
gtcggtcctg ctggcttgtg ggtgggaggc gcatgttctc caaaaacccg cgcgagctgc 120
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ctgtgcccct agcggccacc agagggcacc aggacaccac tgcggtcggc tcagcggctc 480
ctgccctggt cagggggcgc caggtcctgc ccctcctggg gagggcgggg ggcgagaagg 540
gcgattttaa ttaacccacg tttcaacatg cacatcccag taatttggaa acattttgtt 600
tccaaagatt cacttaacat tggtttagca acatgaagct ttctatgcaa cccaaggact 660
cagtttttgg cctgttttag tgacaggcaa tcagcaacat gctgcatttc tctccagtgt 720
tgtaatcaaa gaaaccctcc catagcttta aatgatattc cttccccttc caattatgtg 780
gggggaaaac aaccctattc tccacccaga agtgttaact caagaattac attttcaaga 840
agtttccaga ttcgtaaaac cagaattaga tgtctttcac ctaaatgtct cggtgttgac 900
caaaggaaca cacaggtttc tcatttaact tttttaatgg gtctcaaaat tctgtgacaa 960
atttttggtc aagttgtttc cattaaaaag tactgatttt aaaaactaat aacttaaaac 1020
tgccacacgc aaaaaagaaa accaaagtgg tccacaaaac attctccttt ccttctgaag 1080
gttttacgat gcattgttat cattaaccag tcttttacta ctaaacttaa atggccaatt 1140
gaaacaaaca gttctgagac cgttcttcca ccactgatta agagtggggt ggcaggtatt 1200
agggataatg ctagcttact tgtacagctc gtccatgccg agagtgatcc cggcggcggt 1260
cacgaactcc agcaggacca tgtgatcgcg cttctcgttg gggtctttgc tcagggcgga 1320
ctgggtgctc aggtagtggt tgtcgggcag cagcacgggg ccgtcgccga tgggggtgtt 1380
ctgctggtag tggtcggcga gctgcacgct gccgtcctcg atgttgtggc ggatcttgaa 1440
gttcaccttg atgccgttct tctgcttgtc ggccatgata tagacgttgt ggctgttgta 1500
gttgtactcc agcttgtgcc ccaggatgtt gccgtcctcc ttgaagtcga tgcccttcag 1560
ctcgatgcgg ttcaccaggg tgtcgccctc gaacttcacc tcggcgcggg tcttgtagtt 1620
gccgtcgtcc ttgaagaaga tggtgcgctc ctggacgtag ccttcgggca tggcggactt 1680
gaagaagtcg tgctgcttca tgtggtcggg gtagcggctg aagcactgca cgccgtaggt 1740
cagggtggtc acgagggtgg gccagggcac gggcagcttg ccggtggtgc agatgaactt 1800
cagggtcagc ttgccgtagg tggcatcgcc ctcgccctcg ccggacacgc tgaacttgtg 1860
gccgtttacg tcgccgtcca gctcgaccag gatgggcacc accccggtga acagctcctc 1920
gcccttgctc accatggtgg cgtcgaccgt acgtcacgac acctgaaatg gaagaaaaaa 1980
actttgaacc actgtctgag gcttgagaat gaaccaagat ccaaactcaa aaagggcaaa 2040
ttccaaggag aattacatca agtgccaagc tggcctaact tcagtctcca cccactcagt 2100
gtggggaaac tccatcgcat aaaacccctc cccccaacct aaagacgacg tactccaaaa 2160
gctcgagaac taatcgaggt gcctggacgg cgcccggtac tccgtggagt cacatgaagc 2220
gacggctgag gacggaaagg cccttttcct ttgtgtgggt gactcacccg cccgctctcc 2280
cgagcgccgc gtcctccatt ttgagctccc tgcagcaggg ccgggaagcg gccatctttc 2340
cgctcacgca actggtgccg accgggccag ccttgccgcc cagggcgggg cgatacacgg 2400
cggcgcgagg ccaggcacca gagcaggccg gccagcttga gactaccccc gtccgattct 2460
cggtggccgc gctcgcaggc cccgcctcgc cgaacatgtg cgctgggacg cacgggcccc 2520
gtcgccgccc gcggccccaa aaaccgaaat accagtgtgc agatcttggc ccgcatttac 2580
aagactatct tgccagaaaa aaagcgtcgc agcaggtcat caaaaatttt aaatggctag 2640
agacttatcg aaagcagcga gacaggcgcg aaggtgccac cagattcgca cgcggcggcc 2700
ccagcgccca ggccaggcct caactcaagc acgaggcgaa ggggctcctt aagcgcaagg 2760
cctcgaactc tcccacccac ttccaacccg aagctcggga tcaagaatca cgtactgcag 2820
ccagtggaag taattcaagg cacgcaaggg ccataacccg taaagaggcc aggcccgcgg 2880
gaaccacaca cggcacttac ctgtgttctg gcggcaaacc cgttgcgaaa aagaacgttc 2940
acggcgacta ctgcacttat atacggttct cccccaccct cgggaaaaag gcggagccag 3000
tacacgacat cactttccca gtttaccccg cgccaccttc tctaggcacc ggttcaattg 3060
ccgacccctc cccccaactt ctcggggact gtgggcgatg tgcgctctgc ccactgacgg 3120
gcaccggagc cctagattcg attccctttg gggcaaaact caccgcctaa tcccctataa 3180
ctctaccggg gagcccggtg gagagcagac gggctgacgc tgccacctgc cggccatccc 3240
aggataggac cgccgtattc aagtcgccct caggaaggac cctcggggca ccagaggcct 3300
tcgaagcccc aatgagtgag gcaactgagg gtcgcgggtg ccattacaag gcccagccaa 3360
ggcctagagc caaggcttga accgtggggg acccccaagc cccacctgcc caggaacagc 3420
agacactggg acactttgtt tcaggtcctg cccaggcccc tcccactgtg aggctgggat 3480
ttgtcgccca gggtgcagat gagaagagtg gggaaagcag tcctgagcca ggaaattcta 3540
ccgggtaggg gaggcgcttt tcccaaggca gtctggagca tgcgctttag cagccccgct 3600
gggcacttgg cgctacacaa gtggcctctg gcctcgcaca cattccacat ccaccggtag 3660
gcgccaaccg gctccgttct ttggtggccc cttcgcgcca ccttctactc ctcccctagt 3720
caggaagttc ccccccgccc cgcagctcgc gtcgtgcagg acgtgacaaa tggaagtagc 3780
acgtctcact agtctcgtgc agatggacag caccgctgag caatggaagc gggtaggcct 3840
ttggggcagc ggccaatagc agctttgctc cttcgctttc tgggctcaga ggctgggaag 3900
gggtgggtcc gggggcgggc tcaggggcgg gctcaggggc ggggcgggcg cccgaaggtc 3960
ctccggaggc ccggcattct gcacgcttca aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc 4020
ttcctcatct ccgggccttt cgacctccta gggccaccat ggtgagcaag ggcgaggacg 4080
acaacatggc catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga 4140
acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga 4200
ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc 4260
ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact 4320
tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg 4380
gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga 4440
agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct 4500
gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc 4560
agaggctgaa gctgaaggac ggcggccact acgacgccga ggtcaagacc acctacaagg 4620
ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acaacgtcaa catcaagctg gacatcacct 4680
cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg cgccgagggc cgccactcca 4740
ccggcggcat ggacgagctg tacaagtgag gatccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 4800
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4860
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4920
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 4980
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaacccttct 5040
gaggcggaaa gaaccagctg ccttaatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta 5100
ttaggtctga agaggagttt acgtccagcc aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 5160
tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 5220
agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 5280
tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 5340
gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 5400
cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 5460
aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg tatatccatt ttcggcggcc gcgccaccat 5520
gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg 5580
caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg 5640
ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat 5700
cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag 5760
cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc 5820
ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc 5880
cgcgtggttc ctggccaccg tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag 5940
cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga 6000
gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga 6060
cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaga 6120
attcgcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga 6180
gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac 6240
gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac 6300
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 6360
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 6420
catgtctgta taccgctcga ctagagcttg cggaaccctt aatataactt cgtataatgt 6480
atgctatacg aagttattag gtccgctggc catctacgag ccaaagactt tcaaatcttt 6540
ggctgccttg gccagtagga ggcgacacga aggatttgct gctgccttgg gggatgggaa 6600
ggaacctgaa ggcatttttt ccagagtggt gcagtaccac tgaggactgt tgctgtattg 6660
attaggaaaa gagacagagt aatttgcagt ttgtttgatt tatactgggc tgcaggtcga 6720
gggatcttca taagagaaga gggacagcta tgactgggag tagtcaggag aggaggaaaa 6780
atctggctag taaaacatgt aaggaaaatt ttagggatgt taaagaaaaa aataacacaa 6840
aacaaaatat aaaaaaaatc taacctcaag tcaaggcttt tctatggaat aaggaatgga 6900
cagcaggggg ctgtttcata tactgatgac ctctttatag ccacctttgt tcatggcagc 6960
cagcatatgg catatgttgc caaactctaa accaaatact cattctgatg ttttaaatga 7020
tttgccctcc catatgtcct tccgagtgag agacacaaaa aattccaaca cactattgca 7080
atgaaaataa atttccttta ttagccagaa gtcagatgct caaggggctt catgatgtcc 7140
ccataatttt tggcagaggg aaaaagatct cagtggtatt tgtgagccag ggcattggcc 7200
acaccagcca ccaccttctg ataggcagcc tgcggtacct tacatggtgg cgaattcgtt 7260
tgccaaaatg atgagacagc acaataacca gcacgttgcc caggagctgt aggaaaaaga 7320
agaaggcatg aacatggtta gcagaggctc tagagccgcc ggtcacacgc cagaagccga 7380
accccgccct gccccgtccc ccccgaaggc agccgtcccc ctgcggcagc cccgaggctg 7440
gagatggaga aggggacggc ggcgcggcga cgcacgaagg ccctccccgc ccatttcctt 7500
cctgccggcg ccgcaccgct tcgcccgcgc ccgctagagg gggtgcggcg gcgcctccca 7560
gatttcggct ccgccagatt tgggacaaag gaagtccctg cgccctctcg cacgattacc 7620
ataaaaggca atggctgcgg ctcgccgcgc ctcgacagcc gccggcgctc cggggccgcc 7680
gcgcccctcc cccgagccct ccccggcccg aggcggcccc gccccgcccg gcacccccac 7740
ctgccgccac cccccgcccg gcacggcgag ccccgcgcca cgccccgcac ggagccccgc 7800
acccgaagcc gggccgtgct cagcaactcg gggagggggg tgcagggggg ggttacagcc 7860
cgaccgccgc gcccacaccc cctgctcacc cccccacgca cacaccccgc acgcagcctt 7920
tgttcccctc gcagcccccc cgcaccgcgg ggcaccgccc ccggccgcgc tcccctcgcg 7980
cacacgcgga gcgcacaaag ccccgcgccg cgcccgcagc gctcacagcc gccgggcagc 8040
gcgggccgca cgcggcgctc cccacgcaca cacacacgca cgcacccccc gagccgctcc 8100
cccccgcaca aagggccctc ccggagccct ttaaggcttt cacgcagcca cagaaaagaa 8160
acgagccgtc attaaaccaa gcgctaatta cagcccggag gagaagggcc gtcccgcccg 8220
ctcacctgtg ggagtaacgc ggtcagtcag agccggggcg ggcggcgcga ggcggcgcgg 8280
agcggggcac ggggcgaagg caacgcagcg actcccgccc gccgcgcgct tcgcttttta 8340
tagggccgcc gccgccgccg cctcgccata aaaggaaact ttcggagcgc gccgctctga 8400
ttggctgccg ccgcacctct ccgcctcgcc ccgccccgcc cctcgccccg ccccgccccg 8460
cctggcgcgc gccccccccc cccccgcccc catcgctgca caaaataatt aaaaaataaa 8520
taaatacaaa attgggggtg gggagggggg ggagatgggg agagtgaagc agaacgtggg 8580
gctcacctcg acccatggta atagcgatga ctaatacgta gatgtactgc caagtaggaa 8640
agtcccataa ggtcatgtac tgggcataat gccaggcggg ccatttaccg tcattgacgt 8700
caataggggg cgtacttggc atatgataca cttgatgtac tgccaagtgg gcagtttacc 8760
gtaaatagtc cacccattga cgtcaatgga aagtccctat tggcgttact atgggaacat 8820
acgtcattat tgacgtcaat gggcgggggt cgttgggcgg tcagccaggc gggccattta 8880
ccgtaagtta tgtaacgcgg aactccatat atgggctatg aactaatgac cccgtaattg 8940
attactatta ataactagtc aataatcaat gtcgtaaatg tcgtaaatgt ctcagctagt 9000
caggtagtaa aaggtgtcaa ctaggcagtg gcagagcagg attcaaattc agggctgttg 9060
tgatgcctcc gcagactctg agcgccacct ggtggtaatt tgtctgtgcc tcttctgacg 9120
tggaagaaca gcaactaaca cactaacacg gcatttacta tgggccagcc attgtacgcg 9180
ttgcttaacc tgattcttgg gcgttgtcct gcaggggatt gagcaggtgt acgaggacga 9240
gcccaatttc tctatattcc cacagtcttg agtttgtgtc acaaaataat tatagtgggg 9300
tggagatggg aaatgagtcc aggcaacacc taagcctgat tttatgcatt gagactgcgt 9360
gttattacta aagatctttg tgtcgcaatt tcctgatgaa gggagatagg ttaaaaagca 9420
cggatctact gagttttaca gtcatcccat ttgtagactt ttgctacacc accaaagtat 9480
agcatctgag attaaatatt aatctccaaa ccttaggccc cctcacttgc atccttacgg 9540
tcagataact ctcactcata ctttaagccc attttgtttg ttgtacttgc tcatccagtc 9600
ccagacatag cattggcttt ctcctcacct gttttaggta gccagcaagt catgaaatca 9660
gataagttcc accaccaatt aacactaccc atcttgagca taggcccaac agtgcattta 9720
ttcctcattt actgatgttc gtgaatattt accttgattt tcattttttt ctttttctta 9780
agctgggatt ttactcctga ccctattcac agtcagatga tcttgactac cactgcgatt 9840
ggacctgagg ttcagcaata ctccccttta tgtcttttga atacttttca ataaatctgt 9900
ttgtattttc attagttagt aactgagctc agttgccgta atgctaatag cttccaaact 9960
agtgtctctg tctccagtat ctgataaatc ttaggtgttg ctgggacagt tgtcctaaaa 10020
ttaagataaa gcatgaaaat aactgacaca actccattac tggctcctaa ctacttaaac 10080
aatgcattct atcatcacaa atgtgaaaaa ggagttccct cagtggacta accttatctt 10140
ttctcaacac ctttttcttt gcacaatttt ccacacatgc ctacaaaaag tacttatgcg 10200
gccgccataa aagttttgtt actttataga agaaattttg agtttttgtt ttttttaata 10260
aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat 10320
aataaaactt aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaac 10380
acatgcgtca attttacaca tgattatctt taacgtacgt cacaatatga ttatctttct 10440
agggttaatc tagctgcgtg ttctgcagcg tgtcgagcat cttcatctgc tccatcacgc 10500
tgtaaaacac atttgcaccg cgagtctgcc cgtcctccac gggttcaaaa acgtgaatga 10560
acgaggcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 10620
cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 10680
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct 10740
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 10800
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 10860
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 10920
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 10980
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 11040
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 11100
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 11160
ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 11220
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 11280
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 11340
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 11400
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 11460
tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 11520
cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 11580
actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 11640
aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 11700
tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 11760
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 11820
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 11880
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 11940
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 12000
tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tggttcacgc ggtatcattg cagcactggg 12060
gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 12120
ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 12180
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 12240
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 12300
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 12360
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 12420
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 12480
gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 12540
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 12600
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 12660
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 12720
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 12780
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 12840
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 12900
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 12960
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 13020
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 13080
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 13140
tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 13200
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 13260
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 13320
cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcgcgcc cgccgggtaa ctcacggggt 13380
atccatgtcc atttctgcgg catccagcca ggatacccgt cctcgctgac gtaatatccc 13440
agcgccgcac cgctgtcatt aatctgcaca ccggcacggc agttccggct gtcgccggta 13500
ttgttcgggt tgctgatgcg cttcgggctg accatccgga actgtgtccg gaaaagccgc 13560
gacgaactgg tatcccaggt ggcctgaacg aacagttcac cgttaaaggc gtgcatggcc 13620
acaccttccc gaatcatcat ggtaaacgtg cgttttcgct caacgtcaat gcagcagcag 13680
tcatcctcgg caaactcttt ccatgccgct tcaacctcgc gggaaaaggc acgggcttct 13740
tcctccccga tgcccagata gcgccagctt gggcgatgac tgagccggaa aaaagacccg 13800
acgatatgat cctgatgcag ctagattaac cctagaaaga tagtctgcgt aaaattgacg 13860
catgcattct tgaaatattg ctctctcttt ctaaatagcg cgaatccgtc gctgtgcatt 13920
taggacatct cagtcgccgc ttggagctcc cgtgaggcgt gcttgtcaat gcggtaagtg 13980
tcactgattt tgaactataa cgaccgcgtg agtcaaaatg acgcatgatt atcttttacg 14040
tgacttttaa gatttaactc atacgataat tatattgtta tttcatgttc tacttacgtg 14100
ataacttatt atatatatat tttcttgtta tagatatc 14138
<210> 5
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcgcgccct ctacctgctc tcggacccgt gggggtgggg ggtggaggaa ggagtggggg 60
gtcggtcctg ctggcttgtg ggtgggaggc gcatgttctc caaaaacccg cgcgagctgc 120
aatcctgagg gagctgcagt ggaggaggcg gagagaaggc cgcacccttc tccgcagggg 180
gaggggagtg ccgcaatacc tttatgggag ttctctgctg cctccttttc ctaaggaccg 240
ccctgggcct agaaaaatcc ctccctcccc cgcgatctcg tcatcgcctc catgtcagtt 300
tgctccttct cgattatggg cgggattctt ttgccctggc gcgcc 345
<210> 6
<211> 1012
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttaacctga ttcttgggcg ttgtcctgca ggggattgag caggtgtacg aggacgagcc 60
caatttctct atattcccac agtcttgagt ttgtgtcaca aaataattat agtggggtgg 120
agatgggaaa tgagtccagg caacacctaa gcctgatttt atgcattgag actgcgtgtt 180
attactaaag atctttgtgt cgcaatttcc tgatgaaggg agataggtta aaaagcacgg 240
atctactgag ttttacagtc atcccatttg tagacttttg ctacaccacc aaagtatagc 300
atctgagatt aaatattaat ctccaaacct taggccccct cacttgcatc cttacggtca 360
gataactctc actcatactt taagcccatt ttgtttgttg tacttgctca tccagtccca 420
gacatagcat tggctttctc ctcacctgtt ttaggtagcc agcaagtcat gaaatcagat 480
aagttccacc accaattaac actacccatc ttgagcatag gcccaacagt gcatttattc 540
ctcatttact gatgttcgtg aatatttacc ttgattttca tttttttctt tttcttaagc 600
tgggatttta ctcctgaccc tattcacagt cagatgatct tgactaccac tgcgattgga 660
cctgaggttc agcaatactc ccctttatgt cttttgaata cttttcaata aatctgtttg 720
tattttcatt agttagtaac tgagctcagt tgccgtaatg ctaatagctt ccaaactagt 780
gtctctgtct ccagtatctg ataaatctta ggtgttgctg ggacagttgt cctaaaatta 840
agataaagca tgaaaataac tgacacaact ccattactgg ctcctaacta cttaaacaat 900
gcattctatc atcacaaatg tgaaaaagga gttccctcag tggactaacc ttatcttttc 960
tcaacacctt tttctttgca caattttcca cacatgccta caaaaagtac tt 1012
<210> 7
<211> 1073
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgctgagtc cttttcccat cccacccacc tggagctccc ctcttccagt cctgagccac 60
ttgaactggc ctggtttttg ccatcctgcg ctgccctctc tccggactcg agccactgct 120
gagggcctca ggccagtcca tcctcgtctt gtctctttcg ccctgctctt tccccacctt 180
gagcgctctt aaccagcctg gcccgtgcca cctctactct gccatcgaat gctgccccac 240
tttctcgagt ccgccacttc tcccagcttc accggtaccc actgtttccc ctagtccagg 300
caggtaccac tttccctgag cgtcctcctc ctctctcctg ggcctgtgct gcttcttttc 360
ccgctctctg gcctgggccg tttcttcggc cagcccccga gccttccatg ccctttcctt 420
caggtttctg ctcttcatcc ttggtctctg ccatctgttg ccatgtaagg gtgctctttc 480
ctgagccatc gccctcaagg cgctctgctc ctcaagtgga tgcttccctc gcctggctca 540
cctcctgctc tctctcctgc ccccttcacc tgcgtgccct cctcattctc cctctgtgcc 600
acctctggcc ttgcactgta ggctctctct tggggatgtt tctccttctc cacacacttc 660
tctttcactc tgtcctcttg ctttgtgtgg gcctgcagcg ttaccctttt ttctgggcac 720
actcagagca ccctcctctt tctggttctg ggccacctgt ctgtcctcgg gtcatcttgc 780
tctctctgcc tggatgccct cctgtggctt tgggcagctt ctccctcctt cagagtgcac 840
cgccagttct cctaggcccg gtcacttccc cttcccaggg gacctagagc cctgctaggt 900
cctctctctc cacaacctgg gcccccaaac ctttccaaaa caccttgctt tctgcctcca 960
ttggtcttgt gttccagagc cagagtcact atatgtccca gaaccaggat tccctctggt 1020
tctgagggct tttatcgcat cccctgcctg gctgcagtgg gtctttgggc gcc 1073
<210> 8
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacaggccac agaagagcct ctactcctcc ctctgtcccc gaggctgtct ccctcccagt 60
cttcccagct caggccagtc cccaggcctc tcttccctgc cagagcccgt caggttcggt 120
tactttgggg cccagagagg accctgtgaa ggaagcgtgg gtaggggcac gggaatgggg 180
aggatgcctg aagaggcccc cttagccaga agaggagcag aagaggagca ggtacccaga 240
agaggagcag ttcagggaaa 260
<210> 9
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaatacccac gtttattggg acaaaagttg ttagggaaaa tggggcctca gagttatgat 60
tcaagtcata attctttcca tttataattt cactcgagac tctgttaact gattccttgt 120
gtgttgtatc ttactcctca gctcacaatt acttttagtt attcacctta actgtatgaa 180
taacagtgga gaaaaggatt ctaccagaat actctaatta tggttttgag tcccctttcc 240
agactgaaga tttttcagtc tttttgatct gaggtgattt ttcagtcttt tcgatctgag 300
gtgacagtct caagctcctc aattcaccca gtctcttgat acttgtccat ttagggccac 360
caaagctact ttgacttcat actagagagt caattaatga ggccattctc tgatggacag 420
gtgaagcagg caaggtgact atattttgac taaacggtag aaaacagcct gagtgttaac 480
agtgtagcct ataaaaccca gagctgccca ccctgatcta aacttccagg aacataagaa 540
cgcgcc 546
<210> 10
<211> 1009
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtaggtcac atttcagtaa aacctggctt tgtggattga gcatggtctg tctcttcctg 60
gtacttcatt agtcccctaa gtgggatttg ctgagcaaga ctcctcaatt acagaaatac 120
tccagtttag aattctcgca aaggcttttt gtttccacaa gtagaatcta gaaagcaatc 180
tcaagtaaca acagcagaga cctgaatccc aatccatctt tcctgtgtgt cctcttttac 240
ctccttccct ttcatgttga accaacagtc ctttttcagt ctagaagcta gtacgaaaga 300
aatgtacaga tgtaggtacc aagcaaagcc attagccaat aactggtgag atggagctaa 360
gaggaaataa aagtgttcct aagaatagca cagcagaagc tagatccaca gatcttaaaa 420
caattttggt tgagtaagag tagaggcaaa agaggaagct aataatgcag tttttaggag 480
ctaagagcca gataaagggt aagggcagga ggaagtgcta tctcagctaa cgagatacat 540
gaaacaacgg tggaagtcca gcaggcacaa gatgagttga gaagcaatca gggccagaag 600
gatgtgcaag gcctcaaaat aaaaaagcac agggccacag ggaaccttat ggaaattaaa 660
aggaagagga tgcagtcagg agaggaaaaa atagtgctcc ctcccccatg cccaaggaag 720
cagctgagca gccagtactt gggaagttag tagtaataag ttggtaagag ggagttctgt 780
tcgtggctca atggttaaca aatcagacta gaaaccgtga ggttgcgggt ttgatccctg 840
gccttgctca gtgggttaag gatccggcat tgccgtgacc tgtggtgtag gtcacagacg 900
tggctcagtt cccgcattcc tgtggctctg gtgtaggctg gtggctacag ctctgattag 960
acccctaggc tgggaacctc catatgccct ggaagtggcc gtagaaaag 1009
<210> 11
<211> 878
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggatggggac tcatgtgaat tttctaaagg tgctatttaa acggggggca cgagtgccgg 60
ctttggacag ggccgctcgc tctccaccct ttcttcttcc ccctcggccg cctctcaccc 120
cctgaggcct ctctcccccc acgacctcct ctctctcctc tgaaaccctc tcctcctcag 180
ctgcatccca ccctcgtggc ctctctctct ctctgtctgt cctgtgtcct ctctcactgg 240
gtttcagagc acagatgccc aaagcacaaa agcagttttc ccctggggtg ggaggaagca 300
agagactttg tacctatttt gtatgtgtat aataatttga gatgttttta attattttga 360
ttgctggaat aaagcatgtg gaaatgaccc aaaccaatct tgcactggcc tcctgatttc 420
cttccttgga gacggaggga gggggagacc tgggggaggg cgcttggggg ggggtgggct 480
ctcttctttc tgcgctcccc ccccccacct ccaacacctt gacgacccct cctgcttccg 540
cttgcctttc tcaggcttta acactttctc ctcgccctct cagcatgcgc atgcgcgtgc 600
ctctacctcc cccgcacatc ctggcctgcc caccctgaat ggcctggccc agcgatgcca 660
ccaactctct cgctccgtcc acggctgggg aggggggcac tctgcagggt tggggggcac 720
tgggaggctg ggttgggtga gggaggggtg cctgggcccc caccccccag caagttctct 780
ccctaggcga actggagggt cgtctggcct cttgagcctt gttgctggct ctgagctcta 840
ccaagagagt gaccagcagg accgcaccat cacgcgcc 878
<210> 12
<211> 727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtggttgctg agactgcgtg ggggcccaag gagacctgga gaaaggaatg cttcctgctc 60
cttcttctgg ggccccagga gagccttccc agggccttgg agaggtgctg tccagggact 120
aaccctgtgc tctaggaagg ctgcaggccc tgaccagctg ggcaggtcct gggtccctcc 180
tggccttcta agttccccaa acatgagacc tctgggtgtg gggtggcctg gggaggtcat 240
tttgcccagg ccctacctcc tgcccattcc taaccctttt taaaaatctg tgcgtcctct 300
tcttccttct tctccctccc ttcccttttc gctcaccctc tgctgctggc ctgagagccg 360
gaggccccca gggggaaggc gactggtctc ctccccagtc tcagggaagg gagacagaga 420
atccaggaag ccagaactca gcagacgaag cacccaggga cctagagatg ggttgaaaag 480
ttgacagctg tcccacctgc ctcccaaggt ctcagggcct aaacctccaa ggcaggaaag 540
gcccctgtcc ctccctgggg tccatagaaa gagggacaag tctgcacgga ccatttgctg 600
taatattaac accttggctg tcattaggta gtcttggctg ttaattatgt cctgtgataa 660
tgtattatta gcacgccgac cacatagggt agggaactgc agctagtaaa caaaagtttg 720
ttcctat 727
<210> 13
<211> 13378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcgcgccgg atggggactc atgtgaattt tctaaaggtg ctatttaaac ggggggcacg 60
agtgccggct ttggacaggg ccgctcgctc tccacccttt cttcttcccc ctcggccgcc 120
tctcaccccc tgaggcctct ctccccccac gacctcctct ctctcctctg aaaccctctc 180
ctcctcagct gcatcccacc ctcgtggcct ctctctctct ctgtctgtcc tgtgtcctct 240
ctcactgggt ttcagagcac agatgcccaa agcacaaaag cagttttccc ctggggtggg 300
aggaagcaag agactttgta cctattttgt atgtgtataa taatttgaga tgtttttaat 360
tattttgatt gctggaataa agcatgtgga aatgacccaa accaatcttg cactggcctc 420
ctgatttcct tccttggaga cggagggagg gggagacctg ggggagggcg cttggggggg 480
ggtgggctct cttctttctg cgctcccccc ccccacctcc aacaccttga cgacccctcc 540
tgcttccgct tgcctttctc aggctttaac actttctcct cgccctctca gcatgcgcat 600
gcgcgtgcct ctacctcccc cgcacatcct ggcctgccca ccctgaatgg cctggcccag 660
cgatgccacc aactctctcg ctccgtccac ggctggggag gggggcactc tgcagggttg 720
gggggcactg ggaggctggg ttgggtgagg gaggggtgcc tgggccccca ccccccagca 780
agttctctcc ctaggcgaac tggagggtcg tctggcctct tgagccttgt tgctggctct 840
gagctctacc aagagagtga ccagcaggac cgcaccatca cgcgccccag acccgggcct 900
ggggggcaag tcggggggcg gggggaggtc gggcagggtc ccctgggagg atggggacgt 960
gctgtgcccc tagcggccac cagagggcac caggacacca ctgcggtcgg ctcagcggct 1020
cctgccctgg tcagggggcg ccaggtcctg cccctcctgg ggagggcggg gggcgagaag 1080
ggcgattaca gaaagctcca gaagccaagg gaacacagaa cacagctatt tccctagcac 1140
tgttattcgt cctagcctct gtttctggat ccaaagttcc tttctaagac ccaccagtca 1200
ggcctgagta acaggggcag gcctggattt aaagcatagt aacaaactat ctggccaatc 1260
tcttccttca cctcccccag ggagcaggcc tcctcttaag gccagataag gaatgactca 1320
cagtggctag ctaactctgg ccactaaaac ctttatgaag cttcaaccac accctatttc 1380
ctgactggct tggggctccc tagagtcctt ctaccactga ttccctaatt tatagtcact 1440
catggaaggt gtgtgtgtgt gtatgtgcaa atgtgtgcaa gtcaaatgtg tgtgcatgta 1500
tatataaata tgtgtgtgtg tgtaagtgca tgtgtgtata tgtgtgtgtg caagtcaagt 1560
gtgtgtgcat gtgtatataa atgtatataa gtgtgtaagt gtgtgcctag gtgtgtttgt 1620
atgtgtgtgt atatgtgtaa gtgtgtacat gtgtaggtgt gtgcataagt gtgtgcatgt 1680
gtatatgtgt gtgtatgtgt acgtgtgtgc aatttgtgta taagtgtgtg tgcatgtgta 1740
tatgtgtgtg cgtgtgtgta tgtatgtaaa agtactgttg ctaccttctt cctagagagg 1800
atggtggcta gaagacagtg ctgggtttta gaagatcaaa ttctttatat agtcatagaa 1860
aaccctgctg ataatgtgaa gacaagagga ctgactttga acactcttca tttcacaggg 1920
ggaaactgag gcctttgagc taggaagtgg ttggcccatc tccctgttcc caatccccct 1980
ctcaggacac acagggtttc tgtcctcaga cagagacagc tctgacaaaa aagaaggtac 2040
tgcgggccac cactaaggac tgttgagatg gggtggtcag gaatttcggg gtgaagctat 2100
cgaagtaccc ctatagtggg tatcaggggg tccggcccaa gggaaagatc cagaaagatc 2160
tggaattgtt gcactgcagg ctgggagtgg agaagggctc cttccattat gaagatgtcc 2220
cactctgtgc tgctgacttt agctcactct ctccttcacc tctgctctag gagggttctg 2280
aggtcccctg gattcagcct gcagcctttt aatacctcct caggactgct caagggggac 2340
agcttctgtg ccatttctgt ctctgggtgg aaggtgccaa atgccttatg ggcaggtgat 2400
ctgcctcagc caggctgaga gtcctcatct ccggcttatt aaagaaactc aattagaggt 2460
cttgttaagt gcgtcttgag acttgggcag ggaagggtgg aggtgtcttg gtgggggtga 2520
gggtcgagtt tctgagctgg gtcagccatg cttcagattg agcatttagc aggagtgtaa 2580
agaagccact ttggtggcct agtgttccct gcagctgtac ctattgccac ctaggacatt 2640
gtggcagcag ggtggggcaa ccttgtctca gaaagtcagg aagcctggag cttaactgca 2700
cgaattatta tcacaaggag ggagggattt attaacatta ttccagaggg ggcactctca 2760
gagtaagtca ctgagttggg gctcagaggg gtgtgatttc taagggtgtc aaattcctgg 2820
aggttttaaa gggccagagt gatatcgtca ctccggaagt tagagttgtc taagcctgtg 2880
tagtaagggg ctgaagggcc agaaaaggga cgtgacatgt tggcagtagc tttggagtgg 2940
gctggggcgg ggcagctctg ggaaggactg agacctctgg ctcctgggag gggagaggta 3000
ggagcagaat cgccaggaat tgaccaatgg ggaaagagcc catatttgca ctctgggagc 3060
ttggaaattt ctgatacccg ccccttcaac atctccatcc cccttcccgc cccgggcata 3120
aaaagccaca ggtgagggcc ttgtcactcc tcctgcggcc agcagttctc agacctgcgt 3180
ccctttttcc ttcgcgccac catggggcac tgggcgctgt tgcctggctg ggtttctgct 3240
acgctgctgc tggcgctggc cgctctgccc gcagccctgg ctgccaacag cagtggccga 3300
tggtggggta ttgtgaacgt agcctcctcc acgaacctgc ttacagactc caagagtctg 3360
caactggtac tcgagcccag tctgcagctg ttgagccgca aacagcggcg tctgatacgc 3420
caaaatccgg ggatcctgca cagcgtgagt ggggggctgc agagtgccgt gcgcgagtgc 3480
aagtggcagt tccggaatcg ccgctggaac tgtcccactg ctccagggcc ccacctcttc 3540
ggcaagatcg tcaaccgagg ctgtcgagaa acggcgttta tcttcgctat cacctccgcc 3600
ggggtcaccc attcggtggc gcgctcctgc tcagaaggtt ccatcgaatc ctgcacgtgt 3660
gactaccggc ggcgcggccc cgggggcccc gactggcact gggggggctg cagcgacaac 3720
attgacttcg gccgcctctt cggccgggag ttcgtggact ccggggagaa ggggcgggac 3780
ctgcgcttcc tcatgaacct tcacaacaac gaggcaggcc gtacgaccgt attctccgag 3840
atgcgccagg agtgcaagtg ccacgggatg tccggctcat gcacggtgcg cacgtgctgg 3900
atgcggctgc ccacgctgcg cgccgtgggc gatgtgctgc gcgaccgctt cgacggcgcc 3960
tcgcgcgtcc tgtacggcaa ccgcggcagc aaccgcgctt cgcgggcgga gctgctgcgc 4020
ctggagccgg aagacccggc ccacaaaccg ccctcccccc acgacctcgt ctacttcgag 4080
aaatcgccca acttctgcac gtacagcgga cgcctgggca cagcaggcac ggcagggcgc 4140
gcctgtaaca gctcgtcgcc cgcgctggac ggctgcgagc tgctctgctg cggcaggggc 4200
caccgcacgc gcacgcagcg cgtcaccgag cgctgcaact gcaccttcca ctggtgctgc 4260
cacgtcagct gccgcaactg cacgcacacg cgcgtactgc acgagtgtct gggcagcggc 4320
gccacaaact tctctctgct aaagcaagca ggtgatgttg aagaaaaccc cgggcctatg 4380
ctcgcccgcg ccctgctgct ctgcgctgcc gtgtcgctct gcactgcagc aaatccttgc 4440
tgttcccacc catgtcaaaa ccgaggtgta tgtatgagtg tgggatttga ccagtataag 4500
tgcgattgta cccggacagg attctatgga gaaaactgct caacaccgga atttttgaca 4560
agaataaaat tatttctgaa acccactcca aacacagtgc actacatact tacccacttc 4620
aagggatttt ggaacgttgt gaataacatt cccttccttc gaaatgcaat tatgagttat 4680
gtgttgacat ccagatcaca tttgattgac agtccaccaa cttacaatgc tgactatggc 4740
tacaaaagct gggaagcctt ctctaacctc tcctattata ctagagccct tcctcctgtg 4800
cctgatgatt gcccgactcc cttgggtgtc aaaggtaaaa agcagcttcc tgattcaaat 4860
gagattgtgg aaaaattgct tctaagaaga aagttcatcc ctgatcccca gggctcaaac 4920
atgatgtttg cattctttgc ccagcacttc acgcatcagt ttttcaagac agatcataag 4980
cgagggccag ctttcaccaa cgggctgggc catggggtgg acttaaatca tatttacggt 5040
gaaactctgg ctagacagcg taaactgcgc cttttcaagg atggaaaaat gaaatatcag 5100
ataattgatg gagagatgta tcctcccaca gtcaaagata ctcaggcaga gatgatctac 5160
cctcctcaag tccctgagca tctacggttt gctgtggggc aggaggtctt tggtctggtg 5220
cctggtctga tgatgtatgc cacaatctgg ctgcgggaac acaacagagt atgcgatgtg 5280
cttaaacagg agcatcctga atggggtgat gagcagttgt tccagacaag caggctaata 5340
ctgataggag agactattaa gattgtgatt gaagattatg tgcaacactt gagtggctat 5400
cacttcaaac tgaaatttga cccagaacta cttttcaaca aacaattcca gtaccaaaat 5460
cgtattgctg ctgaatttaa caccctctat cactggcatc cccttctgcc tgacaccttt 5520
caaattcatg accagaaata caactatcaa cagtttatct acaacaactc tatattgctg 5580
gaacatggaa ttacccagtt tgttgaatca ttcaccaggc aaattgctgg cagggttgct 5640
ggtggtagga atgttccacc cgcagtacag aaagtatcac aggcttccat tgaccagagc 5700
aggcagatga aataccagtc ttttaatgag taccgcaaac gctttatgct gaagccctat 5760
gaatcatttg aagaacttac aggagaaaag gaaatgtctg cagagttgga agcactctat 5820
ggtgacatcg atgctgtgga gctgtatcct gcccttctgg tagaaaagcc tcggccagat 5880
gccatctttg gtgaaaccat ggtagaagtt ggagcaccat tctccttgaa aggacttatg 5940
ggtaatgtta tatgttctcc tgcctactgg aagccaagca cttttggtgg agaagtgggt 6000
tttcaaatca tcaacactgc ctcaattcag tctctcatct gcaataacgt gaagggctgt 6060
ccctttactt cattcagtgt tccagatcca gagctcatta aaacagtcac catcaatgca 6120
agttcttccc gctccggact agatgatatc aatcccacag tactactaaa agaacgttcg 6180
actgaactgg gctccggcga gggcagggga agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa 6240
aatcccggcc caatgcctgc ccacagcctg gtgatgagca gcccggccct cccggccttc 6300
ctgctctgca gcacgctgct ggtcatcaag atgtacgtgg tggccatcat cacgggccaa 6360
gtgaggctgc ggaagaaggc ctttgccaac cccgaggatg ccctgagaca cggaggcccc 6420
cagtattgca ggagcgaccc cgacgtggaa cgctgcctca gggcccaccg gaacgacatg 6480
gagaccatct accccttcct tttcctgggc ttcgtctact cctttctggg tcctaaccct 6540
tttgtcgcct ggatgcactt cctggtcttc ctcgtgggcc gtgtggcaca caccgtggcc 6600
tacctgggga agctgcgggc acccatccgc tccgtgacct acaccctggc ccagctcccc 6660
tgcgcctcca tggctctgca gatcctctgg gaagcggccc gccacctgtg aggccgcgac 6720
tctagagtcg gggcggccgg ccgcttcgag cagacatgac tgtgccttct agttgccagc 6780
catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 6840
tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 6900
tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 6960
ctggggatgc ggtgggctct atggaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt 7020
cagggggagg tgtgggaggt ctgaggcgga aagaaccagc tgccttaata taacttcgta 7080
taatgtatgc tatacgaagt tattaggtct gaagaggagt ttacgtccag ccaattctgt 7140
ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 7200
aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 7260
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 7320
cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 7380
ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt 7440
gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca 7500
ttttcggcgg ccgcgccacc atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg 7560
acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc 7620
gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc 7680
tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg 7740
cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc 7800
gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg 7860
cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc 7920
accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg 7980
ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc 8040
tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga 8100
cccgcaagcc cggtgcctga gaattcgcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc 8160
gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg 8220
cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct 8280
ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 8340
tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 8400
caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgctc gactagagct tgcggaaccc 8460
ttaatataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt aggtccgctg gccatctacg 8520
agccaaagac tttcaaatct ttggctgcct tggccagtag gaggcgacac gaaggatttg 8580
ctgctgcctt gggggatggg aaggaacctg aaggcatttt ttccagagtg gtgcagtacc 8640
actgaggact gttgctgtat tgattaggaa aagagacaga gtaatttgca gtttgtttga 8700
tttatactgt ggttgctgag actgcgtggg ggcccaagga gacctggaga aaggaatgct 8760
tcctgctcct tcttctgggg ccccaggaga gccttcccag ggccttggag aggtgctgtc 8820
cagggactaa ccctgtgctc taggaaggct gcaggccctg accagctggg caggtcctgg 8880
gtccctcctg gccttctaag ttccccaaac atgagacctc tgggtgtggg gtggcctggg 8940
gaggtcattt tgcccaggcc ctacctcctg cccattccta acccttttta aaaatctgtg 9000
cgtcctcttc ttccttcttc tccctccctt cccttttcgc tcaccctctg ctgctggcct 9060
gagagccgga ggcccccagg gggaaggcga ctggtctcct ccccagtctc agggaaggga 9120
gacagagaat ccaggaagcc agaactcagc agacgaagca cccagggacc tagagatggg 9180
ttgaaaagtt gacagctgtc ccacctgcct cccaaggtct cagggcctaa acctccaagg 9240
caggaaaggc ccctgtccct ccctggggtc catagaaaga gggacaagtc tgcacggacc 9300
atttgctgta atattaacac cttggctgtc attaggtagt cttggctgtt aattatgtcc 9360
tgtgataatg tattattagc acgccgacca catagggtag ggaactgcag ctagtaaaca 9420
aaagtttgtt cctatatgcg gccgccataa aagttttgtt actttataga agaaattttg 9480
agtttttgtt ttttttaata aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat 9540
tagtatgtaa gtgtaaatat aataaaactt aatatctatt caaattaata aataaacctc 9600
gatatacaga ccgataaaac acatgcgtca attttacaca tgattatctt taacgtacgt 9660
cacaatatga ttatctttct agggttaatc tagctgcgtg ttctgcagcg tgtcgagcat 9720
cttcatctgc tccatcacgc tgtaaaacac atttgcaccg cgagtctgcc cgtcctccac 9780
gggttcaaaa acgtgaatga acgaggcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 9840
ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 9900
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 9960
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 10020
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 10080
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 10140
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 10200
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 10260
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 10320
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 10380
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt 10440
cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 10500
ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 10560
agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 10620
tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 10680
gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 10740
gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 10800
attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 10860
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 10920
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 10980
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 11040
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 11100
gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 11160
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 11220
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tggttcacgc 11280
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 11340
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 11400
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 11460
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 11520
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 11580
ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 11640
ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 11700
actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc 11760
caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 11820
gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 11880
ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 11940
cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 12000
cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 12060
acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 12120
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 12180
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 12240
tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 12300
accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 12360
cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 12420
gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 12480
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cgccgggtaa ctcacggggt atccatgtcc atttctgcgg catccagcca ggatacccgt 12660
cctcgctgac gtaatatccc agcgccgcac cgctgtcatt aatctgcaca ccggcacggc 12720
agttccggct gtcgccggta ttgttcgggt tgctgatgcg cttcgggctg accatccgga 12780
actgtgtccg gaaaagccgc gacgaactgg tatcccaggt ggcctgaacg aacagttcac 12840
cgttaaaggc gtgcatggcc acaccttccc gaatcatcat ggtaaacgtg cgttttcgct 12900
caacgtcaat gcagcagcag tcatcctcgg caaactcttt ccatgccgct tcaacctcgc 12960
gggaaaaggc acgggcttct tcctccccga tgcccagata gcgccagctt gggcgatgac 13020
tgagccggaa aaaagacccg acgatatgat cctgatgcag ctagattaac cctagaaaga 13080
tagtctgcgt aaaattgacg catgcattct tgaaatattg ctctctcttt ctaaatagcg 13140
cgaatccgtc gctgtgcatt taggacatct cagtcgccgc ttggagctcc cgtgaggcgt 13200
gcttgtcaat gcggtaagtg tcactgattt tgaactataa cgaccgcgtg agtcaaaatg 13260
acgcatgatt atcttttacg tgacttttaa gatttaactc atacgataat tatattgtta 13320
tttcatgttc tacttacgtg ataacttatt atatatatat tttcttgtta tagatatc 13378
<210> 14
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Gly His Trp Ala Leu Leu Pro Gly Trp Val Ser Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Ala Asn Ser Ser Gly
20 25 30
Arg Trp Trp Gly Ile Val Asn Val Ala Ser Ser Thr Asn Leu Leu Thr
35 40 45
Asp Ser Lys Ser Leu Gln Leu Val Leu Glu Pro Ser Leu Gln Leu Leu
50 55 60
Ser Arg Lys Gln Arg Arg Leu Ile Arg Gln Asn Pro Gly Ile Leu His
65 70 75 80
Ser Val Ser Gly Gly Leu Gln Ser Ala Val Arg Glu Cys Lys Trp Gln
85 90 95
Phe Arg Asn Arg Arg Trp Asn Cys Pro Thr Ala Pro Gly Pro His Leu
100 105 110
Phe Gly Lys Ile Val Asn Arg Gly Cys Arg Glu Thr Ala Phe Ile Phe
115 120 125
Ala Ile Thr Ser Ala Gly Val Thr His Ser Val Ala Arg Ser Cys Ser
130 135 140
Glu Gly Ser Ile Glu Ser Cys Thr Cys Asp Tyr Arg Arg Arg Gly Pro
145 150 155 160
Gly Gly Pro Asp Trp His Trp Gly Gly Cys Ser Asp Asn Ile Asp Phe
165 170 175
Gly Arg Leu Phe Gly Arg Glu Phe Val Asp Ser Gly Glu Lys Gly Arg
180 185 190
Asp Leu Arg Phe Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Thr
195 200 205
Thr Val Phe Ser Glu Met Arg Gln Glu Cys Lys Cys His Gly Met Ser
210 215 220
Gly Ser Cys Thr Val Arg Thr Cys Trp Met Arg Leu Pro Thr Leu Arg
225 230 235 240
Ala Val Gly Asp Val Leu Arg Asp Arg Phe Asp Gly Ala Ser Arg Val
245 250 255
Leu Tyr Gly Asn Arg Gly Ser Asn Arg Ala Ser Arg Ala Glu Leu Leu
260 265 270
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Pro Ala His Lys Pro Pro Ser Pro His Asp
275 280 285
Leu Val Tyr Phe Glu Lys Ser Pro Asn Phe Cys Thr Tyr Ser Gly Arg
290 295 300
Leu Gly Thr Ala Gly Thr Ala Gly Arg Ala Cys Asn Ser Ser Ser Pro
305 310 315 320
Ala Leu Asp Gly Cys Glu Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr
325 330 335
Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys Thr Phe His Trp Cys
340 345 350
Cys His Val Ser Cys Arg Asn Cys Thr His Thr Arg Val Leu His Glu
355 360 365
Cys Leu
370
<210> 15
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Leu Ala Arg Ala Leu Leu Leu Cys Ala Ala Val Ser Leu Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ala Asn Pro Cys Cys Ser His Pro Cys Gln Asn Arg Gly Val Cys
20 25 30
Met Ser Val Gly Phe Asp Gln Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly
35 40 45
Phe Tyr Gly Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg Ile Lys
50 55 60
Leu Phe Leu Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr Ile Leu Thr His
65 70 75 80
Phe Lys Gly Phe Trp Asn Val Val Asn Asn Ile Pro Phe Leu Arg Asn
85 90 95
Ala Ile Met Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu Ile Asp Ser
100 105 110
Pro Pro Thr Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe
115 120 125
Ser Asn Leu Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala Leu Pro Pro Val Pro Asp Asp
130 135 140
Cys Pro Thr Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gln Leu Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asn Glu Ile Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe Ile Pro Asp
165 170 175
Pro Gln Gly Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gln His Phe Thr
180 185 190
His Gln Phe Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn
195 200 205
Gly Leu Gly His Gly Val Asp Leu Asn His Ile Tyr Gly Glu Thr Leu
210 215 220
Ala Arg Gln Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr
225 230 235 240
Gln Ile Ile Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gln
245 250 255
Ala Glu Met Ile Tyr Pro Pro Gln Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala
260 265 270
Val Gly Gln Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala
275 280 285
Thr Ile Trp Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gln
290 295 300
Glu His Pro Glu Trp Gly Asp Glu Gln Leu Phe Gln Thr Ser Arg Leu
305 310 315 320
Ile Leu Ile Gly Glu Thr Ile Lys Ile Val Ile Glu Asp Tyr Val Gln
325 330 335
His Leu Ser Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu
340 345 350
Phe Asn Lys Gln Phe Gln Tyr Gln Asn Arg Ile Ala Ala Glu Phe Asn
355 360 365
Thr Leu Tyr His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gln Ile His
370 375 380
Asp Gln Lys Tyr Asn Tyr Gln Gln Phe Ile Tyr Asn Asn Ser Ile Leu
385 390 395 400
Leu Glu His Gly Ile Thr Gln Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gln Ile
405 410 415
Ala Gly Arg Val Ala Gly Gly Arg Asn Val Pro Pro Ala Val Gln Lys
420 425 430
Val Ser Gln Ala Ser Ile Asp Gln Ser Arg Gln Met Lys Tyr Gln Ser
435 440 445
Phe Asn Glu Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe
450 455 460
Glu Glu Leu Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu
465 470 475 480
Tyr Gly Asp Ile Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu
485 490 495
Lys Pro Arg Pro Asp Ala Ile Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly
500 505 510
Ala Pro Phe Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly Asn Val Ile Cys Ser Pro
515 520 525
Ala Tyr Trp Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Gln Ile
530 535 540
Ile Asn Thr Ala Ser Ile Gln Ser Leu Ile Cys Asn Asn Val Lys Gly
545 550 555 560
Cys Pro Phe Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu Ile Lys Thr
565 570 575
Val Thr Ile Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp Ile Asn
580 585 590
Pro Thr Val Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu
595 600
<210> 16
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Pro Ala His Ser Leu Val Met Ser Ser Pro Ala Leu Pro Ala Phe
1 5 10 15
Leu Leu Cys Ser Thr Leu Leu Val Ile Lys Met Tyr Val Val Ala Ile
20 25 30
Ile Thr Gly Gln Val Arg Leu Arg Lys Lys Ala Phe Ala Asn Pro Glu
35 40 45
Asp Ala Leu Arg His Gly Gly Pro Gln Tyr Cys Arg Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Val Glu Arg Cys Leu Arg Ala His Arg Asn Asp Met Glu Thr Ile Tyr
65 70 75 80
Pro Phe Leu Phe Leu Gly Phe Val Tyr Ser Phe Leu Gly Pro Asn Pro
85 90 95
Phe Val Ala Trp Met His Phe Leu Val Phe Leu Val Gly Arg Val Ala
100 105 110
His Thr Val Ala Tyr Leu Gly Lys Leu Arg Ala Pro Ile Arg Ser Val
115 120 125
Thr Tyr Thr Leu Ala Gln Leu Pro Cys Ala Ser Met Ala Leu Gln Ile
130 135 140
Leu Trp Glu Ala Ala Arg His Leu
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccccatccaa agtttttaaa gga 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtggcagat gtcacagttt agg 23
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caccgagtta tggcagaact cagtg 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaaccactga gttctgccat aactc 25
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaggagcaa actgacatgg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgcagtgggt ctttggggac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttccaggaac ataagaaagt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagtctcag caaccactga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtcggagtg aacggatttg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccatttgatg ttggcgggat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtccatgccg agagtgatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctaggggcac agcacgtc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aagttattag gtctgaagag gagttt 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
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<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgctgagttc tggcttcctg 20
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tctaccaaga gagtgaccag cag 23
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
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<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agcaccgtgt tggcgtagag 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agtggccgat ggtggggtat tg 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgctgtgca ggatccccgg at 22
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
attatgagtt atgtgttgac a 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aggaggaagg gctctagtat aa 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctggtcatca agatgtacgt gg 22
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tccatgtcgt tccggtgggc cct 23
<210> 44
<211> 1110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
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gcctcctcca cgaacctgct tacagactcc aagagtctgc aactggtact cgagcccagt 180
ctgcagctgt tgagccgcaa acagcggcgt ctgatacgcc aaaatccggg gatcctgcac 240
agcgtgagtg gggggctgca gagtgccgtg cgcgagtgca agtggcagtt ccggaatcgc 300
cgctggaact gtcccactgc tccagggccc cacctcttcg gcaagatcgt caaccgaggc 360
tgtcgagaaa cggcgtttat cttcgctatc acctccgccg gggtcaccca ttcggtggcg 420
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cacgggatgt ccggctcatg cacggtgcgc acgtgctgga tgcggctgcc cacgctgcgc 720
gccgtgggcg atgtgctgcg cgaccgcttc gacggcgcct cgcgcgtcct gtacggcaac 780
cgcggcagca accgcgcttc gcgggcggag ctgctgcgcc tggagccgga agacccggcc 840
cacaaaccgc cctcccccca cgacctcgtc tacttcgaga aatcgcccaa cttctgcacg 900
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gcgctggacg gctgcgagct gctctgctgc ggcaggggcc accgcacgcg cacgcagcgc 1020
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acgcacacgc gcgtactgca cgagtgtctg 1110
<210> 45
<211> 1812
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
atgctcgccc gcgccctgct gctctgcgct gccgtgtcgc tctgcactgc agcaaatcct 60
tgctgttccc acccatgtca aaaccgaggt gtatgtatga gtgtgggatt tgaccagtat 120
aagtgcgatt gtacccggac aggattctat ggagaaaact gctcaacacc ggaatttttg 180
acaagaataa aattatttct gaaacccact ccaaacacag tgcactacat acttacccac 240
ttcaagggat tttggaacgt tgtgaataac attcccttcc ttcgaaatgc aattatgagt 300
tatgtgttga catccagatc acatttgatt gacagtccac caacttacaa tgctgactat 360
ggctacaaaa gctgggaagc cttctctaac ctctcctatt atactagagc ccttcctcct 420
gtgcctgatg attgcccgac tcccttgggt gtcaaaggta aaaagcagct tcctgattca 480
aatgagattg tggaaaaatt gcttctaaga agaaagttca tccctgatcc ccagggctca 540
aacatgatgt ttgcattctt tgcccagcac ttcacgcatc agtttttcaa gacagatcat 600
aagcgagggc cagctttcac caacgggctg ggccatgggg tggacttaaa tcatatttac 660
ggtgaaactc tggctagaca gcgtaaactg cgccttttca aggatggaaa aatgaaatat 720
cagataattg atggagagat gtatcctccc acagtcaaag atactcaggc agagatgatc 780
taccctcctc aagtccctga gcatctacgg tttgctgtgg ggcaggaggt ctttggtctg 840
gtgcctggtc tgatgatgta tgccacaatc tggctgcggg aacacaacag agtatgcgat 900
gtgcttaaac aggagcatcc tgaatggggt gatgagcagt tgttccagac aagcaggcta 960
atactgatag gagagactat taagattgtg attgaagatt atgtgcaaca cttgagtggc 1020
tatcacttca aactgaaatt tgacccagaa ctacttttca acaaacaatt ccagtaccaa 1080
aatcgtattg ctgctgaatt taacaccctc tatcactggc atccccttct gcctgacacc 1140
tttcaaattc atgaccagaa atacaactat caacagttta tctacaacaa ctctatattg 1200
ctggaacatg gaattaccca gtttgttgaa tcattcacca ggcaaattgc tggcagggtt 1260
gctggtggta ggaatgttcc acccgcagta cagaaagtat cacaggcttc cattgaccag 1320
agcaggcaga tgaaatacca gtcttttaat gagtaccgca aacgctttat gctgaagccc 1380
tatgaatcat ttgaagaact tacaggagaa aaggaaatgt ctgcagagtt ggaagcactc 1440
tatggtgaca tcgatgctgt ggagctgtat cctgcccttc tggtagaaaa gcctcggcca 1500
gatgccatct ttggtgaaac catggtagaa gttggagcac cattctcctt gaaaggactt 1560
atgggtaatg ttatatgttc tcctgcctac tggaagccaa gcacttttgg tggagaagtg 1620
ggttttcaaa tcatcaacac tgcctcaatt cagtctctca tctgcaataa cgtgaagggc 1680
tgtcccttta cttcattcag tgttccagat ccagagctca ttaaaacagt caccatcaat 1740
gcaagttctt cccgctccgg actagatgat atcaatccca cagtactact aaaagaacgt 1800
tcgactgaac tg 1812
<210> 46
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
atgcctgccc acagcctggt gatgagcagc ccggccctcc cggccttcct gctctgcagc 60
acgctgctgg tcatcaagat gtacgtggtg gccatcatca cgggccaagt gaggctgcgg 120
aagaaggcct ttgccaaccc cgaggatgcc ctgagacacg gaggccccca gtattgcagg 180
agcgaccccg acgtggaacg ctgcctcagg gcccaccgga acgacatgga gaccatctac 240
cccttccttt tcctgggctt cgtctactcc tttctgggtc ctaacccttt tgtcgcctgg 300
atgcacttcc tggtcttcct cgtgggccgt gtggcacaca ccgtggccta cctggggaag 360
ctgcgggcac ccatccgctc cgtgacctac accctggccc agctcccctg cgcctccatg 420
gctctgcaga tcctctggga agcggcccgc cacctgtga 459
<210> 47
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aataaatgca ctgttgggcc tatgctcaag atgggtagtg ttaattggtg gtggaactta 60
tctgatttca tgacttgctg gctacctaaa acaggtgagg agaaagccaa tgctatgtct 120
gggactggat gagcaagtac aacaaacaaa atgggcttaa agtatgagtg agagttatct 180
gaccgtaagg atgcaagtga gggggcctaa ggtttggaga ttaatattta atctcagatg 240
ctatactttg gtggtgtagc aaaagtctac aaatgggatg actgtaaaac tcagtagatc 300
cgtgcttttt aacctatctc ccttcatcag gaaattgcga cacaaagatc tttagtaata 360
acacgcagtc tcaatgcata aaatcaggct taggtgttgc ctggactcat ttcccatctc 420
caccccacta taattatttt gtgacacaaa ctcaagactg tgggaatata gagaaattgg 480
gctcgtcctc gtacacctgc tcaatcccct gcaggacaac gcccaagaat caggttaagc 540
cagggcaaaa gaatcccgcc cataatcgag aaggagcaaa ctgacatgga ggcgatgacg 600
agatcgcggg ggagggaggg atttttctag gcccagggcg gtccttagga aaaggaggca 660
gcagagaact cccataaagg tattgcggca ctcccctccc cctgcggaga agggtgcggc 720
cttctctccg cctcctccac tgcagctccc tcaggattgc agctcgcgcg ggtttttgga 780
gaacatgcgc ctcccaccca caagccagca ggaccgaccc cccactcctt cctccacccc 840
ccacccccac gggtccgaga gcaggtagag ggctagtctc gtccttcagg cggcggacgc 900
ccagggcgga gccgcagtca ccaccaccca gaagcctcgg cccggcagcc cgcccccgcc 960
tcctgcgcgc gcttcctgcc acgttgcgca ggggcgaggg gccagacact gcggcgctgg 1020
cctcggggag ggccgtacca aagaccgcct ccctgccgac tcgcgtagtg gtttcgctca 1080
tttgggaccc aagccaataa caag 1104
<210> 48
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgctctctct cctgccccct tcacctgcgt gccctcctca ttctccctct gtgccacctc 60
tggccttgca ctgtaggctc tctcttgggg atgtttctcc ttctccacac acttctcttt 120
cactctgtcc tcttgctttg tgtgggcctg cagcgttacc cttttttctg ggcacactca 180
gagcaccctc ctctttctgg ttctgggcca cctgtctgtc ctcgggtcat cttgctctct 240
ctgcctggat gccctcctgt ggctttgggc agcttctccc tccttcagag tgcaccgcca 300
gttctcctag gcccggtcac ttccccttcc caggggacct agagccctgc taggtcctct 360
ctctccacaa cctgggcccc caaacctttc caaaacacct tgctttctgc ctccattggt 420
cttgtgttcc agagccagag tcactatatg tcccagaacc aggattccct ctggttctga 480
gggcttttat cgcatcccct gcctggctgc agtgggtctt tggggacagg ccacagaaga 540
gcctctactc ctccctctgt ccccgaggct gtctccctcc cagtcttccc agctcaggcc 600
agtccccagg cctctcttcc ctgccagagc ccgtcaggtt cggttacttt ggggcccaga 660
gaggaccctg tgaaggaagc gtgggtaggg gcacgggaat ggggaggatg cctgaagagg 720
cccccttagc cagaagagga gcagaagagg agcaggtacc cagaagagga gcagttcagg 780
gaaatagaag agtcccgagc tctttttttt tttttttttt atttcttttc ttttcttttc 840
tttttatggc agcatccgtg gtatatggag gttcccagcc taggggtcag atcatacctg 900
caactgccag cctacaccac agccacagca ctcaggatcc gagctgcatc tgcggcttac 960
gccacaggtc acagcaacgc tggatcctta acccactgaa tgaggccagg gattgaacct 1020
gcaacctcat gcacactatg ctggggtctt aatcgg 1056
<210> 49
<211> 1108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acttcctcct gcccttaccc tttatctggc tcttagctcc taaaaactgc attattagct 60
tcctcttttg cctctactct tactcaacca aaattgtttt aagatctgtg gatctagctt 120
ctgctgtgct attcttagga acacttttat ttcctcttag ctccatctca ccagttattg 180
gctaatggct ttgcttggta cctacatctg tacatttctt tcgtactagc ttctagactg 240
aaaaaggact gttggttcaa catgaaaggg aaggaggtaa aagaggacac acaggaaaga 300
tggattggga ttcaggtctc tgctgttgtt acttgagatt gctttctaga ttctacttgt 360
ggaaacaaaa agcctttgcg agaattctaa actggagtat ttctgtaatt gaggagtctt 420
gctcagcaaa tcccacttag gggactaatg aagtaccagg aagagacaga ccatgctcaa 480
tccacaaagc caggttttac tgaaatgtga cctactttct tatgttcctg gaagtttaga 540
tcagggtggg cagctctggg ttttataggc tacactgtta acactcaggc tgttttctac 600
cgtttagtca aaatatagtc accttgcctg cttcacctgt ccatcagaga atggcctcat 660
taattgactc tctagtatga agtcaaagta gctttggtgg ccctaaatgg acaagtatca 720
agagactggg tgaattgagg agcttgagac tgtcacctca gatcgaaaag actgaaaaat 780
cacctcagat caaaaagact gaaaaatctt cagtctggaa aggggactca aaaccataat 840
tagagtattc tggtagaatc cttttctcca ctgttattca tacagttaag gtgaataact 900
aaaagtaatt gtgagctgag gagtaagata caacacacaa ggaatcagtt aacagagtct 960
cgagtgaaat tataaatgga aagaattatg acttgaatca taactctgag gccccatttt 1020
ccctaacaac ttttgtccca ataaacgtgg gtatttgttt gggagaaact atcatataca 1080
tgattaccca gtaaacagac tgtttact 1108
<210> 50
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
actttgtacc tattttgtat gtgtataata atttgagatg tttttaatta ttttgattgc 60
tggaataaag catgtggaaa tgacccaaac caatcttgca ctggcctcct gatttccttc 120
cttggagacg gagggagggg gagacctggg ggagggcgct tggggggggg tgggctctct 180
tctttctgcg ctcccccccc ccacctccaa caccttgacg acccctcctg cttccgcttg 240
cctttctcag gctttaacac tttctcctcg ccctctcagc atgcgcatgc gcgtgcctct 300
acctcccccg cacatcctgg cctgcccacc ctgaatgtcc tggcccagcg atgccaccaa 360
ctctctcgct ccgtccacgg ctggggaggg gggcactctg cagggttggg gggcactggg 420
aggctgggtt gggtgaggga ggggtgcctg ggcccccacc ccccagcaag ttctctccct 480
aggcgaactg gagggtcgtc tggcctcttg agccttgttg ctggctctga gctctaccaa 540
gagagtgacc agcaggaccg caccatcagt ggttgctgag actgcgtggg ggcccaagga 600
gacctggaga aaggaatgct tcctgctcct tcttctgggg ccccaggaga gccttcccag 660
ggccttggag aggtgctgtc cagggactaa ccctgtgctc taggaaggct gcaggccctg 720
accagctggg caggtcctgg gtccctcctg gccttctaag ttccccaaac atgagacctc 780
tgggtgtggg gtggcctggg gaggtcattt tgcccaggcc ctacctcctg cccattccta 840
acccttttta aaaatctgtg cgtcctcttc ttccttcttc tccctccctt cccttttcgc 900
tcaccctctg ctgctggcct gagagccgga ggcccccagg gggaaggcga ctggtctcct 960
ccccagtctc agggaaggga gacagagaat ccaggaagcc agaactcagc agacgaagca 1020
cccagggacc tagagatggg ttgaaaagtt gacagctgtc ccacctgcct cccaaggtct 1080
cagggccta 1089
<210> 51
<211> 2017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aagttccttt ctaagaccca ccagtcaggc ctgagtaaca ggggcaggcc tggatttaaa 60
gcatagtaac aaactatctg gccaatctct tccttcacct cccccaggga gcaggcctcc 120
tcttaaggcc agataaggaa tgactcacag tggctagcta actctggcca ctaaaacctt 180
tatgaagctt caaccacacc ctatttcctg actggcttgg ggctccctag agtccttcta 240
ccactgattc cctaatttat agtcactcat ggaaggtgtg tgtgtgtgta tgtgcaaatg 300
tgtgcaagtc aaatgtgtgt gcatgtatat ataaatatgt gtgtgtgtgt aagtgcatgt 360
gtgtatatgt gtgtgtgcaa gtcaagtgtg tgtgcatgtg tatataaatg tatataagtg 420
tgtaagtgtg tgcctaggtg tgtttgtatg tgtgtgtata tgtgtaagtg tgtacatgtg 480
taggtgtgtg cataagtgtg tgcatgtgta tatgtgtgtg tatgtgtacg tgtgtgcaat 540
ttgtgtataa gtgtgtgtgc atgtgtatat gtgtgtgcgt gtgtgtatgt atgtaaaagt 600
actgttgcta ccttcttcct agagaggatg gtggctagaa gacagtgctg ggttttagaa 660
gatcaaattc tttatatagt catagaaaac cctgctgata atgtgaagac aagaggactg 720
actttgaaca ctcttcattt cacaggggga aactgaggcc tttgagctag gaagtggttg 780
gcccatctcc ctgttcccaa tccccctctc aggacacaca gggtttctgt cctcagacag 840
agacagctct gacaaaaaag aaggtactgc gggccaccac taaggactgt tgagatgggg 900
tggtcaggaa tttcggggtg aagctatcga agtaccccta tagtgggtat cagggggtcc 960
ggcccaaggg aaagatccag aaagatctgg aattgttgca ctgcaggctg ggagtggaga 1020
agggctcctt ccattatgaa gatgtcccac tctgtgctgc tgactttagc tcactctctc 1080
cttcacctct gctctaggag ggttctgagg tcccctggat tcagcctgca gccttttaat 1140
acctcctcag gactgctcaa gggggacagc ttctgtgcca tttctgtctc tgggtggaag 1200
gtgccaaatg ccttatgggc aggtgatctg cctcagccag gctgagagtc ctcatctccg 1260
gcttattaaa gaaactcaat tagaggtctt gttaagtgcg tcttgagact tgggcaggga 1320
agggtggagg tgtcttggtg ggggtgaggg tcgagtttct gagctgggtc agccatgctt 1380
cagattgagc atttagcagg agtgtaaaga agccactttg gtggcctagt gttccctgca 1440
gctgtaccta ttgccaccta ggacattgtg gcagcagggt ggggcaacct tgtctcagaa 1500
agtcaggaag cctggagctt aactgcacga attattatca caaggaggga gggatttatt 1560
aacattattc cagagggggc actctcagag taagtcactg agttggggct cagaggggtg 1620
tgatttctaa gggtgtcaaa ttcctggagg ttttaaaggg ccagagtgat atcgtcactc 1680
cggaagttag agttgtctaa gcctgtgtag taaggggctg aagggccaga aaagggacgt 1740
gacatgttgg cagtagcttt ggagtgggct ggggcggggc agctctggga aggactgaga 1800
cctctggctc ctgggagggg agaggtagga gcagaatcgc caggaattga ccaatgggga 1860
aagagcccat atttgcactc tgggagcttg gaaatttctg atacccgccc cttcaacatc 1920
tccatccccc ttcccgcccc gggcataaaa agccacaggt gagggccttg tcactcctcc 1980
tgcggccagc agttctcaga cctgcgtccc tttttcc 2017

Claims (6)

1.一种猪细胞的构建方法，其特征在于，将编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的WNT1、SEQ ID NO：15所示的COX-2和SEQ IDNO：16所示的mPGES的猪细胞，所述的猪细胞为猪的体细胞，所述的编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为pK19，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点；
所述的构建方法包括将安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至猪细胞；
所述的安全港位点载体包含编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列以及安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人WNT1、COX-2和mPGES的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：
A）ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQ IDNO：6所示；
B）AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQ IDNO：8所示；
C）H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ ID NO：10所示；
或D）COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQID NO：12所示；
所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：
靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；
所述的Cas载体包含编码Cas蛋白的核苷酸序列，所述的Cas蛋白为Cas9；
所述的Cas载体的核苷酸序列从5’-3’依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信号、核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro抗性蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信号序列元件。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：47所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：49所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ IDNO：50所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的pK19的核苷酸序列如SEQ IDNO：51所示。
5.一种胃癌模型猪的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括采用权利要求1-4任一所述的构建方法制备猪细胞，将所述猪细胞移入去核的猪卵母细胞中，获得胃癌模型猪。
6.一种权利要求1-4任一所述的构建方法在制备胃癌动物模型中的应用。
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猪转基因友好整合位点的筛选与应用;马林媛;中国博士学位论文全 文数据库 农业科技辑(第5期);D050-15 *

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