CN114958759B - 一种肌萎缩侧索硬化症模型猪的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达人FUS蛋白的猪细胞和由该猪细胞通过体细胞克隆技术获得的肌萎缩侧索硬化症模型猪及其构建方法和在生物医药领域的应用。其中，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞和肌萎缩侧索硬化症模型猪，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。本申请研究对象应用性好，猪细胞中目的基因的表达量高、基因编辑效率高。

Description

一种肌萎缩侧索硬化症模型猪的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种采用CRISPR/Cas9系统及同源重组技术构建的在基因组中的特定位置整合并由神经组织特异性表达Syn启动子驱动表达的缩短的人源FUS蛋白的猪重组细胞，该重组猪细胞被用于克隆生产肌萎缩侧索硬化症模型猪，该模型猪可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、肌萎缩侧索硬化症发病机制的研究等生物医药领域。
背景技术
肌萎缩性脊髓侧索硬化症，又名肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic LateralSclerosis，ALS)，是运动神经元疾病(Motor Neuron Disease，MND)的主要类型，俗称“渐冻人症”，其特征是脑和脊髓中的运动神经细胞(神经元)进行性退化。运动神经元控制着人体运动、说话、吞咽和呼吸时的肌肉活动，若其功能发生障碍，肌肉将逐渐萎缩退化，表现为肌肉逐渐无力以至瘫痪，说话、吞咽和呼吸功能减退，直至呼吸衰竭死亡。此病症未侵犯人体的感觉神经，所以并不影响患者的智力、记忆或感觉。病情的发展一般较迅速，从出现症状开始，平均寿命为3-5年，但因个体异质性波动较大。“渐冻人症”被世界卫生组织列为与艾滋病、癌症等并列的5大绝症之一，发病率大约为十万分之三，属于世界罕见病。
“渐冻人”协会国际联盟在2000年于丹麦举行的国际病友大会上确定每年的6月21日为“世界渐冻人日”，各地在这一天举行各类认识运动神经元疾病的相关活动，希望通过这种活动，引起人们对患有这种可怕疾病患者的重视和社会关爱。目前，ALS的病理生理机制尚不完全清楚，国内也尚无准确的ALS发病率的流行病学报道，但有关ALS的遗传因素影响已经得到广泛认可。约90％以上的ALS病例为散发性(sporadic ALS，SALS)，余下病例为家族遗传性(familial ALS，FALS)，已经确定超过30种基因和FALS有关。其中，最常见和研究最多的基因为ALS1(SOD1)、ALS10(TARDBP)、ALS6(FUS)、ALS10(TDP43)、FTDALS1(C9orf72)等，它们和ALS的某些特定临床特征包括起病年龄、部位及生存期有关。
2009年，人们发现RNA结合蛋白FUS/TLS(fused in sarcoma/translocated inliposarcoma)的突变是ALS早期发病的原因，约5％的FALS涉及该基因的突变。FUS基因编码的FUS蛋白是一种多功能RNA/DNA结合蛋白，主要定位于细胞核，但可以在细胞核与细胞质中穿梭，其功能涉及众多的细胞加工过程，包括细胞增殖、DNA修复、转录调节，以及RNA和micro-RNA的加工处理。有关FUS突变的致病机制目前尚未明确，比较可能的两种机制是FUS突变通过影响DNA和RNA代谢过程，或者突变FUS蛋白从细胞核异位到细胞质中，形成聚合物而获得毒性，导致神经元的损伤。
ALS疾病的发生发展机制及治疗研究均需要在相应的动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。而猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
因此，本申请采用基因编辑技术及人神经组织特异启动子Syn(hSyn)构建了神经组织特异表达缩短的人源FUS蛋白的猪重组细胞，然后用该重组细胞作为核移植细胞供体克隆生产ALS模型猪，本发明所得到的模型猪将成为研究ALS疾病发生机制和药物开发的有力工具。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种表达人FUS蛋白的猪细胞，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞。
优选的，所述的插入的编码人FUS蛋白的核苷酸序列可以为FUS基因的CDS序列或者cDNA序列。
优选的，所述的人FUS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
优选的，所述的插入的编码人FUS蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示。
优选的，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点
在本发明的一个具体实施方式中，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示。
进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点为COL1A1位点。
优选的，所述的编码人FUS蛋白的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为人Syn启动子。所述的人Syn启动子驱动编码人FUS蛋白的核苷酸序列在神经组织中特异表达。
人神经元内特异表达一种Synapsin I(Syn I)的蛋白，该蛋白由hSyn1基因编码，其启动子(即Syn启动子)作为神经元细胞的特异启动子，用来驱动外源基因仅在神经组织中表达。因此，Syn启动子是研究神经系统生理、病理功能的有力工具。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的编码人FUS蛋白的核苷酸序列在猪细胞中通过人Syn启动子驱动，所述的人Syn启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示。
优选的，所述的猪细胞为猪的体细胞。进一步优选可以用于体细胞核移植技术的任意猪的体细胞。
优选的，所述的猪细胞可以为乳腺细胞、神经细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞、体细胞、成纤维细胞、肌细胞、胶质细胞、脂肪细胞或生殖细胞等等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的猪细胞为猪成纤维细胞或神经细胞(优选为神经元细胞或神经胶质细胞)。
本发明的第二方面，提供了一种上述的猪细胞的构建方法，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞。
具体可以采用基于同源重组的基因编辑、基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术。
优选的，所述的构建方法包括使用安全港位点载体将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，所述的安全港位点载体包含编码人FUS蛋白的核苷酸序列和安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人FUS蛋白的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：
A)ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQID NO：6所示。优选的，所述的ROSA26安全港位点载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
B)AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQID NO：8所示。优选的，所述的AAVS1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为AAVS1的5’同源臂和3’同源臂。
C)H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ IDNO：10所示。优选的，所述的H11安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为H11的5’同源臂和3’同源臂。
或D)COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQ ID NO：12所示。优选的，所述的COL1A1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ IDNO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为COL1A1的5’同源臂和3’同源臂。
进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点载体骨架为COL1A1安全港位点载体骨架。
优选的，所述的安全港位点载体还包含启动子、信号分子以及编码EGFP蛋白、mCherry蛋白和puro抗性蛋白的核苷酸序列。其中，所述的启动子为EF-1α启动子、PGK启动子和/或pCAG启动子。所述的信号分子为EF-1αpoly(A)信号、bGH poly(A)信号和/或β-globin poly(A)信号。进一步优选还包含绝缘子区域。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的安全港位点载体骨架从5’至3’依次包括5’同源臂、绝缘子区域、EF-1αpoly(A)信号、编码EGFP的核苷酸序列、EF-1α启动子、绝缘子区域、PGK启动子、编码mCherry的核苷酸序列、bGH poly(A)信号、loxP-puro-loxP表达框区域、绝缘子区域、β-globin poly(A)信号、pCAG启动子、绝缘子区域、3’同源臂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的COL1A1安全港位点载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
优选的，使用sgRNA载体进行猪细胞的构建，所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：
靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
优选的，所述的sgRNA载体还包含骨架载体，所述的骨架载体的核苷酸序列为SEQID NO：3。
优选的，使用Cas载体进行猪细胞的构建，所述的Cas载体包含编码Cas蛋白、EGFP和Puro抗性蛋白的核苷酸序列，其中，所述的Cas载体还包含EF1a启动子、CMV增强子、WPRE元件和3’LTR序列元件，优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列从5’-3’依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信号，核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro抗性蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信号序列元件。所述的Cas蛋白选自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t、Cas5h、Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csy4、Csel、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Cscl、Csc2、Csa5、Csnl、Csn2、Csml、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、CsxlO、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Csdl、Csd2、Cstl、Cst2、Cshl、Csh2、Csal、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、C2cl、C2c2、C2c3、Cpfl、CARF、DinG、其同源物或其修饰形式，优选为Cas9。进一步优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或2所示，更进一步优选的，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
为了增加Cas9载体的基因编辑能力，本发明在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：
1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；
2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；
3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；
4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；
5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：
1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；
2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；
3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；
4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；
5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；
6)转录终止信号：bGHpolyA signal；
7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。
质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。
质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin抗性蛋白。
自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。
CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。
EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。
WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。
3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。
bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。
优选的，所述的安全港位点载体、sgRNA载体或Cas载体均为环状质粒。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至猪细胞。
本发明的第三方面，提供了一种包含上述的猪细胞的组织或器官。
优选的，所述的组织可以为神经组织。进一步优选为脑组织或海马组织或中枢神经组织或周围神经组织。
优选的，所述的器官为脑或脊髓。
本发明的第四方面，提供了一种表达人FUS蛋白的模型猪的构建方法，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的模型猪。
优选的，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点为COL1A1位点。
优选的，所述的构建方法还包括制备上述猪细胞的步骤。
优选的，所述的构建方法包括将上述的猪细胞移入去核的猪卵母细胞中，获得模型猪。在本发明的一个具体实施方式中，移入位置为去核的猪卵母细胞的卵周隙。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括提供上述的猪细胞或者采用上述的猪细胞构建方法获得猪细胞，然后将该猪细胞进行体细胞核移植动物克隆，获得表达人FUS蛋白的模型猪。
本发明的第五方面，提供了一种肌萎缩侧索硬化症模型猪的构建方法，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞。优选的，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点为COL1A1位点。
优选的，所述的构建方法包括将上述的猪细胞移入去核的猪卵母细胞中，获得模型猪。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括提供上述的猪细胞或者采用上述的猪细胞构建方法获得猪细胞，然后将该猪细胞进行体细胞核移植动物克隆，获得FUS基因纯合或杂合敲入的肌萎缩侧索硬化症模型猪。
本发明的第六方面，提供了一种安全港位点载体，所述的安全港位点载体包含编码人FUS蛋白的核苷酸序列和安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人FUS蛋白的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：
A)ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQID NO：6所示。优选的，所述的ROSA26安全港位点载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
B)AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQID NO：8所示。优选的，所述的AAVS1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为AAVS1的5’同源臂和3’同源臂。
C)H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ IDNO：10所示。优选的，所述的H11安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ ID NO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为H11的5’同源臂和3’同源臂。
或D)COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQ ID NO：12所示。优选的，所述的COL1A1安全港位点载体骨架的核苷酸序列为将SEQ IDNO：4中ROSA26的5’同源臂和3’同源臂替换为COL1A1的5’同源臂和3’同源臂。
进一步优选的，所述的猪最佳安全港位点载体骨架为COL1A1安全港位点载体骨架。
优选的，所述的安全港位点载体还包含启动子、信号分子以及编码EGFP蛋白、mCherry蛋白和puro抗性蛋白的核苷酸序列。其中，所述的启动子为EF-1α启动子、PGK启动子和/或pCAG启动子。所述的信号分子为EF-1αpoly(A)信号、bGH poly(A)信号和/或β-globin poly(A)信号。进一步优选还包含绝缘子区域。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的安全港位点载体骨架从5’至3’依次包括5’同源臂、绝缘子区域、EF-1αpoly(A)信号、编码EGFP的核苷酸序列、EF-1α启动子、绝缘子区域、PGK启动子、编码mCherry的核苷酸序列、bGH poly(A)信号、loxP-puro-loxP表达框区域、绝缘子区域、β-globin poly(A)信号、pCAG启动子、绝缘子区域、3’同源臂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的COL1A1安全港位点载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
本发明的第七方面，提供了一种上述的安全港位点载体、上述的cas载体、上述的sgRNA载体或者上述的sgRNA在制备猪细胞、模型猪中的应用。
本发明的第八方面，提供了一种上述的猪细胞、上述的构建方法获得的猪细胞在制备肌萎缩侧索硬化症动物模型中的应用，或者在筛选治疗肌萎缩侧索硬化症的药物及药效评价中的应用，或者在基因及细胞治疗中的应用，或者在研究肌萎缩侧索硬化症的发病机制中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种上述的组织或器官或者上述的构建方法获得的模型猪在筛选治疗肌萎缩侧索硬化症的药物及药效评价中的应用，或者在基因及细胞治疗中的应用，或者在研究肌萎缩侧索硬化症的发病机制中的应用。
本发明所述的肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)，又称渐冻人症，可以为散发性(sporadic ALS，SALS)，也可以为家族遗传性(familial ALS，FALS)。
术语“载体”是细胞内能够在自身控制下复制的多核苷酸，或者通过插入到宿主细胞染色体进行复制和/或表达的遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、细菌噬菌体和粘粒。
本发明所述的“gRNA”，也称指导RNA，是由sgRNA载体在细胞中转录得到的，对细胞中的靶序列具有特异性并且可与Cas蛋白形成复合体的RNA。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。
而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。
(3)本发明针对猪基因组进行了4个安全港位点基因敲入后表达情况的摸索，从中筛选出了最佳的供外源基因插入的猪基因组安全港位点，可有效改善基因敲入后目的基因的表达情况。
(4)本发明采用神经组织特异启动子hSyn来驱动外源基因在神经组织中的特异表达，将使外源基因在靶组织特异地发挥作用，同时避免外源基因高水平泛表达对机体造成的影响。
(5)利用本发明所得到的hSyn-hFUS表达框纯合敲入的单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到hSyn-hFUS表达框纯合敲入的克隆猪，并且该纯合插入基因可稳定遗传。进一步的，可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、ALS发病机制的研究等生物医药领域。
在小鼠模型制作中，通常采用受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植，因其直接获得基因敲入后代的概率非常低(低于1％)，同时需要进行后代的杂交选育来筛选纯合敲入的个体，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，然后再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应模型猪，可大大缩短模型猪制作周期，并节省人力、物力、财力。
本发明通过基因编辑及体细胞克隆技术获得了高度类似人ALS疾病发展进程的FUS模型猪，将有助于研究并揭示由FUS突变导致ALS的发病机制，并可用于进行药物筛选、药效检测、基因及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为预防和治疗人类ALS提供有力的实验手段。本发明对于人类ALS的发病机制研究、治疗药物的研发及临床前试验均具有重大应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1为质粒pX330的结构示意图。
图2为质粒pKG-GE3的结构示意图。
图3为pU6gRNA载体的结构示意图。
图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成能结合靶序列的gRNA)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。
图5为含ROSA26插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图6为含AAVS1插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图7为含H11插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图8为含COL1A1插入位点的荧光donor质粒的结构示意图。
图9为含COL1A1插入位点的pKG-hSyn-hFUS Donor质粒的结构示意图。
图10为质粒配比优化测试的测序结果。
图11为质粒pX330和质粒pKG-GE3编辑效果的测序结果。
图12为不同安全港位点调控GFP绿色荧光表达图。
图13为不同安全港位点调控GFP转录水平荧光定量PCR结果。
图14为不同安全港位点调控GFP蛋白表达的FACS检测结果。
图15为鉴定猪COL1A1安全港插入位点5’端hSyn-hFUS表达框是否重组成功的电泳图，其中，WT为野生型对照，Blank为空白对照，sh4代表安全港位点COL1A1，Lr代表5’同源臂，1414或5965代表检测位点信息。
图16为鉴定猪COL1A1安全港插入位点3’端hSyn-hFUS表达框是否重组成功的电泳图，其中，WT为野生型对照，Blank为空白对照，sh4代表安全港位点COL1A1，Rr代表3’同源臂，282或4723代表检测位点信息。
图17为鉴定hSyn-hFUS表达框是否纯合插入猪COL1A1安全港位点的电泳图，其中，WT为野生型对照，Blank为空白对照，sh4代表安全港位点COL1A1，JDF代表鉴定引物F，JDR代表鉴定引物R，1085或1560代表检测位点信息。
图18为猪COL1A1安全港位点调控人源FUS基因转录水平荧光定量PCR结果，其中2-ΔCt代表相对荧光定量，其中，ΔCt为靶基因的Ct值-内参基因的Ct值，hFUS-WT为野生型对照猪脑组织的hFUS表达量，hFUS-hFUS代表人FUS基因插入的ALS模型猪脑组织的hFUS表达量。
图19为猪COL1A1安全港位点调控人源FUS蛋白表达的FACS检测结果，其中，WT代表野生型对照猪的神经元细胞，hFUS代表hFUS基因插入的ALS模型猪的神经元细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
制备猪原代成纤维细胞的方法：从初生从江香猪的耳组织制备猪原代成纤维细胞。
①取猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 0.1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液，用于进行后续电转实验。
实施例1、载体的构建
一、Cas9高效表达载体(简称pKG-GE3)的构建
出发商品质粒为：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，简称质粒pX330，如SEQID NO：1所示。
以pX330质粒为基础，构建质粒pU6gRNAeEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3，如SEQ ID NO：2所示。
质粒pX330和质粒pKG-GE3均为环形质粒。
质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
质粒pKG-GE3的结构示意图见图2。SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin抗性蛋白(简称PuroR蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和T2A的存在，融合蛋白自发被裂解成三个独立的蛋白，即Cas9蛋白、EGFP蛋白和Puro抗性蛋白。
与质粒pX330相比，所构建的质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予真核细胞荧光及嘌呤霉素抗性双重筛选标记；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
二、pKG-U6gRNA表达载体的构建
以pUC57为出发质粒，构建pKG-U6gRNA载体，结构示意图见图3，序列如SEQ ID NO：3所示。SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
三、构建含GFP基因的不同安全港位点Donor载体
构建质粒PB-1G 2R 3-puro-ROSA26、PB-1G 2R 3-puro-AAVS1、PB-1G 2R 3-puro-H11和PB-1G 2R3-puro-COL1A1。
质粒PB-1G 2R 3-puro-ROSA26结构示意图见图5。SEQ ID NO：4中，第1-345位核苷酸组成ROSA26安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH1左臂，如SEQ ID NO：5所示)，第9184-10195位核苷酸组成ROSA26安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH1右臂，如SEQ ID NO：6所示)，第346-546、3132-3531、6506-6706、8975-9175位核苷酸分别组成4个不同的绝缘子区域，第1954-3131位核苷酸组成EF-1α启动子，第1216-1935位核苷酸编码EGFP蛋白，第637-1209位核苷酸组成EF-1αpoly(A)信号,第3543-4042位核苷酸组成PGK启动子，第4059-4769位核苷酸编码mCherry蛋白，第4791-5015位核苷酸组成bGH poly(A)信号，第5054-6504位核苷酸为loxP-puro-loxP表达框区域，第7259-8974位核苷酸组成pCAG启动子，第6969-7233位核苷酸组成β-globin poly(A)信号。
质粒PB-1G 2R 3-puro-AAVS1结构示意图见图6。仅将SEQ ID NO：4中的第1-345位核苷酸替换为AAVS1安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH2左臂)，见SEQ ID NO：7；将SEQID NO：4中的第9184-10195位核苷酸替换为AAVS1安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH2右臂)，见SEQ ID NO：8。其他序列与SEQ ID NO：4一致。
质粒PB-1G 2R 3-puro-H11结构示意图见图7。仅将SEQ ID NO：4中的第1-345位核苷酸替换为H11安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH3左臂)，见SEQ ID NO：9；将SEQ IDNO：4中的第9184-10195位核苷酸替换为H11安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH3右臂)，见SEQ ID NO：10。其他序列与SEQ ID NO：4一致。
质粒PB-1G 2R 3-puro-COL1A1结构示意图见图8。仅将SEQ ID NO：4中的第1-345位核苷酸替换为COL1A1安全港插入位点5’端猪基因组区域(SH4左臂)，见SEQ ID NO：11；将SEQ ID NO：4中的第9184-10195位核苷酸替换为COL1A1安全港插入位点3’端猪基因组区域(SH4右臂)，见SEQ ID NO：12。其他序列与SEQ ID NO：4一致。
四、构建pKG-hSyn-hFUS Donor载体
构建质粒pKG-hSyn-hFUS，结构示意图见图9。SEQ ID NO：13中，第9-880位核苷酸为猪基因组COL1A1安全港插入位点5’端同源序列，第887-1087位核苷酸为绝缘子1(Insulator 1)序列，第1088-1535位核苷酸为人hSyn基因启动子序列，第1585-2661位核苷酸为缩短的人源FUS蛋白的编码序列(全基因合成于生工生物，其编码的氨基酸序列如SEQID NO：14所示),第2707-2931位核苷酸为bGH Poly(A)序列，第3038-3367位核苷酸为SV40启动子序列，第3416-4012位核苷酸为Puromycin抗性蛋白(简称PuroR蛋白)编码序列，第4192-4313位核苷酸为SV40 Poly(A)序列，第2962-2995及4358-4391位核苷酸分别为方向相同的LoxP序列，第4400-4600位核苷酸为绝缘子2(Insulator 2)序列，第4621-5367位核苷酸为猪基因组COL1A1安全港插入位点3’端同源序列。
实施例2、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
选择位于RAG1基因的高效gRNA靶点：
RAG1-gRNA4的靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：15)。
用于扩增包含靶点的片段的引物如下：
RAG1-nF126：5’-CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA-3’(SEQ ID NO：16)；
RAG1-nR525：5’-TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：17)。
一、构建RAG1基因gRNA重组质粒
对质粒pKG-U6gRNA用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。分别合成RAG1-4S和RAG1-4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
RAG1-4S：5’-caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：18)；
RAG1-4A：5’-aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc-3’(SEQ ID NO：19)。
RAG1-4S和RAG1-4A均为单链DNA分子。
二、质粒配比优化
1、质粒共转染猪原代成纤维细胞
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：1：1。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：2：1。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：3：1。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染至猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。
电泳后回收目的条带并进行测序，测序结果见图10。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第三组的基因编辑效率依次为9％、53％、66％。第四组不发生基因编辑。结果表明，第三组编辑效率最高，确定单gRNA质粒与Cas9质粒最适配比为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。
三、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较
1、共转染
RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。
RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330，即两种DNA的摩尔比为3:1。
RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3，即两种DNA的摩尔比为3:1。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。
通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。RAG1-B组不发生基因编辑。RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率依次为28％、68％。测序结果示例性峰图见图11。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。
实施例3、筛选供外源基因定点插入的猪基因组最佳安全港位点
一、猪基因组ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1安全港位点gRNA重组载体的构建及高效切割靶点筛选
通过前期筛选，ROSA26、H11、AAVS1、COL1A1安全港位点的高效切割靶点分别为sgRNAROSA26-g3(切割效率38％)、sgRNAAAVS1-g4(切割效率30％)、sgRNAH11-g1(切割效率60％)、sgRNACOL1A1-g3(切割效率56％),靶点序列如下：
sgRNAROSA26-g3靶点：5’-GAAGGAGCAAACTGACATGG-3’(SEQ ID NO：20)；
sgRNAAAVS1-g4靶点：5’-TGCAGTGGGTCTTTGGGGAC-3’(SEQ ID NO：21)；
sgRNAH11-g1靶点：5’-TTCCAGGAACATAAGAAAGT-3’(SEQ ID NO：22)；
sgRNACOL1A1-g3靶点：5’-GCAGTCTCAGCAACCACTGA-3’(SEQ ID NO：23)。
这4个gRNA靶点对应的gRNA质粒分别为pKG-U6gRNA(ROSA26-g3)、pKG-U6gRNA(AAVS1-g4)、pKG-U6gRNA(H11-g1)、pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)，其中，骨架载体均为pKG-U6gRNA(SEQ ID NO：3)，质粒构建方法同实施例2。
二、含不同安全港插入位点两侧同源臂的荧光Donor载体(即包含外源基因GFP的不同安全港位点载体)、sgRNA载体和Cas9载体混合电转猪原代成纤维细胞
分别将PB-1G 2R 3-puro-不同安全港插入位点荧光载体与对应的高效sgRNA载体以及高效Cas9表达载体共转染猪原代成纤维细胞。使用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪进行电转实验(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。
共转染质粒组合及配比：
第一组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-ROSA26、质粒pKG-U6gRNA(ROSA26-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G2R 3-puro-ROSA26、0.82μg质粒pKG-U6gRNA(ROSA26-g3)：0.92μg质粒pKG-GE3,即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第二组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-AAVS1、质粒pKG-U6gRNA(AAVS1-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G 2R 3-puro-AAVS1、0.82μg质粒pKG-U6gRNA(AAVS1-g4)：0.92μg质粒pKG-GE3,即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第三组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-H11、质粒pKG-U6gRNA(H11-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G 2R 3-puro-H11、0.82μg质粒pKG-U6gRNA(H11-g1)：0.92μg质粒pKG-GE3,即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第四组：将质粒PB-1G 2R 3-puro-COL1A1、质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1.26μg质粒PB-1G2R 3-puro-COL1A1、0.82μg质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)：0.92μg质粒pKG-GE3,即3种DNA的摩尔比为：1：3：1。
第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加任何质粒进行电转操作。
具体实施方法：
细胞：电转前猪原代成纤维细胞融合度达到60％，0.25％胰蛋白酶消化，台盼蓝染色计数，取等量细胞进行五组电转。
猪原代细胞电转：
(1)将细胞用胰酶消化，得到的细胞悬液用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用58μL电转基本溶液R buffer重悬细胞(11μL/个)，重悬过程中要避免气泡的产生；
(2)吸取10μL细胞悬液与质粒电转反应液混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；
(3)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL Buffer E；
(4)用电转枪吸取10μL步骤(2)得到的混合液，插入电击杯内，选择电转程序(1450V 10ms 3pulse)，电击转染后立即将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL的完全培养液(15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio))；
(5)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；
(6)电转12-24h换液，电转48h使用嘌呤霉素加压，筛选阳性细胞。
三、嘌呤霉素加压筛选及细胞GFP荧光强度检测
细胞经质粒电转48h，加入1.5μg/mL嘌呤霉素筛选，每两天更换含有相同浓度嘌呤霉素的培养基，同时进行GFP绿色荧光拍照，连续筛选两周，待细胞内质粒完全降解后再继续加压筛选一周。通过GFP荧光表达的强弱判断安全港位点表达外源基因效率的高低。
嘌呤霉素筛选一周后，ROSA26、COL1A1安全港位点实验组荧光强度明显强于AAVS1、H11实验组；嘌呤霉素筛选两周后，荧光强度由强到弱依次为：COL1A1>ROSA26>H11>AAVS1，其中H11组荧光强度不太均一,ROSA26组整体荧光强度较均一,且荧光强度较高,AAVS1组细胞荧光表达最弱,COL1A1组荧光细胞数最多,荧光最强；嘌呤霉素继续筛选三周后，荧光强度由强到弱依次为：COL1A1>ROSA26>H11>AAVS1，结果如图12。
四、GFP基因转录水平检测
为了比较GFP基因整合入四个不同安全港位点后mRNA转录水平的差异性，能否参与GFP的表达调控及对表达量的影响。在GFP基因外显子处设计一对引物，取嘌呤霉素筛选三周后的细胞，提取总RNA,反转录成cDNA,用于检测原代细胞在四个不同安全港位点整合GFP基因后的转录水平，同时用野生型原代细胞即第五组的细胞(无质粒的对照电转组)所得到的定量结果作为对照。以GAPDH为内参基因按照2-ΔCt法进行计算。
(1)引物信息(表1)
表1：荧光定量PCR引物信息
(2)细胞总RNA提取
根据Bio Flux的Simply P总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA提取
(3)cDNA第一链获得
根据Vazyme反转录试剂盒II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(R211-01/02)说明书合成cDNA第一链，具体步骤和程序如下：
1)配制第一链cDNA合成反应液
在RNase-free离心管中配制如下表2混合液
表2
用移液枪轻轻吹打混匀。
2)按下列条件进行第一链cDNA合成反应，反应条件见表3。
表3
产物立即用于qPCR反应，或存放于-80℃保存，避免反复冻融。
(4)荧光定量PCR
利用实时荧光定量PCR法检测插入四组不同安全港位点(ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1)猪原代成纤维细胞中GFP的表达量，GAPDH作为内参基因。操作步骤及程序如下:
1)反应体系配制见表4
表4
2)qPCR反应程序如下表5
表5
3)统计与分析
用SPSS统计学软件进行数据分析，以(平均数±标准差)表示，采用双因素方差分析进行统计学分析。2-ΔCt值结果显示嘌呤霉素筛选三周后AAVS1、H11组GFP表达量较低，ROSA26、COL1A1组GFP表达量较高，且COL1A1组和ROSA26组相对于AAVS1和H11组GFP转录水平差异极显著(P<0.01)，2-ΔCt值见表6，差异显著性分析结果如图13。
表6：2-ΔCt值信息
综上，根据培养细胞三周后的荧光信号强度与GFP基因实时荧光定量PCR的结果，可以得出如下结论，在ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1这四个基因组安全港位点中，COL1A1位点插入外源基因后表达效果最好。
五、GFP基因的蛋白表达水平FACS检测
为了比较GFP基因整合入四个不同安全港位点后GFP蛋白的表达情况。分别用胰蛋白酶消化嘌呤霉素筛选三周后的电转细胞，400g离心4min后，弃上清。以1mL完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液分别转移至流式管内。在BD FACSMelody流式细胞仪的FITC通道内检测GFP信号，并以野生型细胞作为阴性对照，收集5×104个细胞进行分析，结果如图14所示。结果显示GFP荧光信号COL1A1>ROSA26>H11>AAVS1。
因此，综合上述结果，COL1A1位点是ROSA26、AAVS1、H11、COL1A1四个安全港位点中最高效表达外源基因的猪原代细胞安全港位点。
实施例4、制备hSyn-hFUS定点插入猪COL1A1安全港位点的单细胞克隆
一、共转染
将质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)、质粒pKG-GE3和质粒pKG-hSyn-hFUS(如SEQ IDNO：13所示)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.89μg质粒pKG-U6gRNA(COL1A1-g3)：0.99μg质粒pKG-GE3：1.12μg质粒pKG-hSyn-hFUS,即3种DNA的摩尔比为：3：1：1。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)进行转染。采用完全培养液培养电转后的细胞16-18小时，更换新的完全培养液进行培养，培养总时间为48小时，然后更换为含抗生素的培养基进行阳性转化细胞的筛选。
二、嘌呤霉素加压筛选及单细胞分选
1.嘌呤霉素筛选hSyn-hFUS表达框阳性插入细胞
细胞经质粒电转48h后，加入1.5μg/mL嘌呤霉素筛选，每天更换含有相同浓度嘌呤霉素的培养基，连续筛选一周后野生型对照孔细胞全部死亡，因电转效率较低，pKG-hSyn-hFUS质粒电转孔筛选一周后细胞也出现大量死亡；继续加入嘌呤霉素筛选一周，细胞只有零星死亡，部分阳性克隆开始分裂增殖，细胞数不断增多；继续加压筛选一周使细胞内质粒降解完全以排除假阳性细胞克隆。加压筛选三周后停止加压，采用不含嘌呤霉素的完全培养液恢复培养2代(每2天1代)，让细胞恢复至良好状态用于下一步的单细胞分选。
2.单细胞分选，放大培养
(1)将嘌呤霉素筛选三周后的群体细胞，进行单细胞分选，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到96孔板中(每孔预先加入100μl不含嘌呤霉素的完全培养液)，每组细胞挑取一板96孔单细胞，每孔一个细胞，放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，培养2天后，更换为含1.5μg/mL嘌呤霉素的完全培养液，之后每2～3天更换一次细胞培养液(含1.5μg/mL嘌呤霉素)，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；
(2)待96孔板的孔中细胞长满孔底(大约2周左右)，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3细胞收集在1.5mL离心管中用于下一步的基因型检测；
(3)待6孔板细胞长至50％丰满度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
三、猪COL1A1安全港位点定点插入hSyn-hFUS表达框的单细胞克隆基因组水平鉴定
为了检测猪COL1A1安全港位点是否成功定点插入了hSyn-hFUS表达框，取嘌呤霉素加压筛选完毕后的单细胞克隆，提取基因组DNA，进行PCR扩增(分别采用sh4-Lr-JDF1414和sh4-Lr-JDR5965组成的引物对、sh4-Rr-JDF282和sh4-Rr-JDR4723组成的引物对、sh4-wt-JDF1085和sh4-wt-JDR1560组成的引物对)，然后进行电泳。将猪原代脂肪干细胞作为野生型对照。sh4-Lr-JDF1414和sh4-Lr-JDR5965组成的引物对用来鉴定猪COL1A1安全港插入位点5’端hSyn-hFUS表达框是否重组成功(靶序列为4552bp)；sh4-Rr-JDF282和sh4-Rr-JDR4723组成的引物对用来鉴定猪COL1A1安全港插入位点3’端hSyn-hFUS表达框是否重组成功(靶序列为4442bp)；sh4-wt-JDF1085和sh4-wt-JDR1560组成的引物对用来鉴定猪COL1A1安全港位点定点插入的hSyn-hFUS表达框为纯合型还是杂合型(野生型基因组可扩增出476bp片段，外源插入片段太大无法扩增；因此，如果不显示扩增产物，说明细胞为插入hSyn-hFUS表达框的纯合型；如果显示476bp扩增产物，说明细胞为插入hSyn-hFUS表达框的杂合型或者是野生型)。
sh4-Lr-JDF1414：CCTGCTGTAAGTGCCGTAGT(SEQ ID NO：28)
sh4-Lr-JDR5965：CTAGGGGCACAGCACGTC(SEQ ID NO：29)
sh4-Rr-JDF282：AAGTTATTAGGTCTGAAGAGGAGTTT(SEQ ID NO：30)
sh4-Rr-JDR4723:CCCATCATTCCGTCCCAGAG(SEQ ID NO：31)
sh4-wt-JDF1085:TGCTGAGTTCTGGCTTCCTG(SEQ ID NO：32)
sh4-wt-JDR1560:TCTACCAAGAGAGTGACCAGCAG(SEQ ID NO：33)
电泳图分别见图15、图16和图17。通过电泳的结果，我们初步判定编号为1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、26、28、29、30的单细胞克隆为成功在猪COL1A1安全港位点定点插入hSyn-hFUS的克隆，其中9、11、15、29号单细胞克隆为纯合定点插入，1、2、3、5、6、7、8、10、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、25、26、28、30为杂合定点插入(表7)。
表7 hSyn-hFUS表达框定点插入猪COL1A1安全港位点单细胞克隆的基因型
/>
将表7中编号为hSyn-hFUS-9(纯合定点插入)的单细胞克隆株进行步骤四的体细胞核移植生产疾病模型克隆猪。
四、利用体细胞核移植技术克隆生产ALS模型猪
1、卵母细胞体外成熟
从屠宰场采集新鲜的离体猪卵巢，卵巢在含75mg/mL青霉素和50mg/mL链霉素的0.9％(w/v)氯化钠溶液中保存，于25–30℃温度下运输至实验室。从直径3～6mm的卵泡中抽取卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)，选择至少具有三层致密卵丘细胞的COCs，接种至4孔板中，每孔装有200μL猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养基(即以TCM-199培养基为基础，内含0.1mg/mL丙酮酸、0.1mg/mL盐酸半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子、10％(v/v)猪卵泡液、75mg/mL青霉素，50mg/mL链霉素，10IU/mLeCG和hCG)，每孔接种50个，每次移植需培养300-400个COCs。将含COCs的培养板在38.5℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中培养42-44小时。
2、体细胞核移植(SCNT)与胚胎移植
(1)体细胞核移植
体外成熟42小时后，用0.1％(w/v)透明质酸酶反复吹打去除COCs的扩张卵丘细胞。将具有完整膜且含排出的第一极体的卵母细胞在含有0.1mg/mL地美可辛、0.05M蔗糖和4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的NCSU23培养基中培养0.5-1h，促使卵母细胞核突起，然后使用尖部倾斜的显微注射针(直径约20μm)在含有10μm HEPES、0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、10％FBS，0.1mg/mL地美可辛和5mg/mL细胞松弛素B的Tyrode乳酸培养基中去除突起的细胞核和极体。以纯合插入靶基因的单细胞克隆株(hSyn-hFUS-9)作为核供体，将单个供体细胞注入去核卵母细胞的卵周隙。使用胚胎细胞融合仪(ET3，Fujihira Industry)在含有0.25MD-山梨醇、0.05mM Mg(C2H3O2)2、20mg/mL BSA和0.5mM HEPES(acid-free)的融合培养基中用200V/mm的直流脉冲将供体细胞与受体卵母细胞融合20μs。将重构胚在PZM-3溶液(配方如下)中培养2h以允许细胞核重编程，然后在含有0.25M D-山梨醇、0.01mM Ca(C2H3O2)2、0.05mM Mg(C2H3O2)2和0.1mg/mL BSA的激活培养基中用150V/mm的单脉冲激活100μs。然后将激活的胚胎在含5μg/mL细胞松弛素B的PZM-3中，于38.5℃、5％CO2、5％O2、90％N2和饱和湿度的培养箱中培养2小时，以进一步激活胚胎。最后将小部分重构胚移入PZM-3培养基中，在38.5℃、5％CO2、5％O2、90％N2和饱和湿度的培养箱中培养2d和7d，分别检测胚胎卵裂率和囊胚发育率。大部分重构胚在激活后培养6h即可用于后续的胚胎移植。
(2)胚胎移植
选择5头处于发情期的杂交母猪(大白猪/长白猪)作为重构胚的代孕母猪，将激活后培养6h的重构胚移植到受体母猪的输卵管中，每头母猪移植300-350个重构胚，每次移植1-2头母猪。在胚胎移植后约23天，使用超声波扫描仪(HS-101V，日本本田电子)检查妊娠情况，确认受体母猪是否怀孕，克隆猪在胚胎移植后第116-117天左右出生。
3头成功怀孕的代孕母猪共生产5头克隆猪，该克隆猪即为hFUS基因纯合插入的ALS模型猪。
PZM-3溶液配方见表8。
表8
*使用前添加
3、野生型对照克隆猪的制备
将同一来源的猪原代成纤维细胞代替重组细胞进行步骤2，得到克隆猪，即为野生型对照猪，其遗传背景除外源插入的靶基因外，其余与重组细胞所得到的模型猪完全一致。
五、ALS模型猪FUS基因的转录水平检测
为了检测猪COL1A1安全港位点定点插入hSyn-hFUS表达框的模型猪能否表达人FUS基因的mRNA，在hSyn-hFUS表达框内设计一对引物，分别采集出生120天的ALS模型猪(核供体为hFUS基因纯合插入的细胞株hSyn-hFUS-9)和野生型对照克隆猪(相同细胞来源)的脑组织，提取总RNA，反转录成cDNA，用于检测猪脑组织内人FUS基因的mRNA表达水平。以β-actin为内参基因按照2-ΔCt法进行计算。详细步骤参照实施例3中的(四、GFP基因转录水平检测)。
引物信息见表9：
表9荧光定量PCR引物信息
用SPSS统计学软件进行数据分析，以(平均数±标准差)表示，采用单因素方差分析进行统计学分析。2-ΔCt值结果显示，ALS模型猪脑组织的FUS基因的表达量显著高于野生型对照克隆猪脑组织的FUS基因的表达量(图18)。
综上，根据实时荧光定量PCR的结果，人FUS基因在所构建的ALS模型猪的脑组织中有显著的表达
六、ALS模型猪中人FUS基因的蛋白表达水平FACS检测
为了比较人FUS基因在模型猪及野生型对照猪神经元细胞中的表达情况，进行下述实验：
1、分别采集出生120天后的ALS模型猪和野生型对照猪脑组织的海马组织，去除脑膜和血管后，用含3％(v/v)青霉素/链霉素(母液为100×)的PBS洗涤3次，然后再用PBS洗涤1次，充分剪碎后，放入含0.25％(w/v)胰酶、0.1％(w/v)IV型胶原酶、1％(v/v)青霉素/链霉素(母液为100×)的DMEM消化液中，37℃震荡消化30min，然后用含10％FBS的DMEM细胞培养基中和消化酶，过200目的细胞筛，收集滤液，300g离心5min，去上清，获得神经元细胞沉淀。
2、完成步骤1后，用PBS缓冲液洗涤细胞，然后用-20℃预冷的90％甲醇水溶液充分重悬细胞，固定20min，然后离心并弃除固定液，然后加入3％BSA水溶液封闭1h，然后离心弃除封闭液，然后用完全培养基洗涤。
3、完成步骤2后，用特异性的人FUS抗体(Invitrogen,MA3-089)工作液重悬细胞(工作液稀释度为1：500)，室温孵育2h，然后用完全培养基充分洗涤细胞。
4、完成步骤3后，加入山羊抗小鼠二抗(Invitrogen，A32723)工作液(二抗工作液稀释度为1：1000)，室温孵育1h，然后用完全培养基充分洗涤细胞。
5、完成步骤4后，用500μL完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至流式管内，在BD FACSMelody流式细胞仪的FITC通道内检测人FUS抗体荧光信号，收集5×104个细胞进行分析。
结果如图19。结果显示在ALS模型猪的神经元细胞(hFUS)中检测到明显的人FUS的抗体荧光信号，而在野生型对照猪的神经元细胞(WT)中没有检测到人FUS抗体荧光信号，这说明所插入的人FUS基因在ALS模型猪的神经元细胞中有较高的表达，也进一步说明了ALS模型猪被成功构建。
进一步的，本申请制备的ALS模型猪可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、ALS发病机制的研究等生物医药领域。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 一种肌萎缩侧索硬化症模型猪的构建方法及应用
<130> 1
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140
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ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260
ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320
ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080
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acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200
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cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440
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tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700
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tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180
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agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300
cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360
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atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020
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tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140
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ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260
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ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440
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cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620
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actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740
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cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160
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gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280
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caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460
tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484
<210> 2
<211> 10476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
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gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540
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gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840
cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900
cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960
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gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080
cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140
cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200
cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260
cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320
cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380
agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440
ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500
ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560
cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620
ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680
caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740
gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800
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cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460
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ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580
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cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760
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caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480
cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540
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caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720
cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780
gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840
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gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960
ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020
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catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380
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tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040
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acgtcattat tgacgtcaat gggcgggggt cgttgggcgg tcagccaggc gggccattta 8880
ccgtaagtta tgtaacgcgg aactccatat atgggctatg aactaatgac cccgtaattg 8940
attactatta ataactagtc aataatcaat gtcgtaaatg tcgtaaatgt ctcagctagt 9000
caggtagtaa aaggtgtcaa ctaggcagtg gcagagcagg attcaaattc agggctgttg 9060
tgatgcctcc gcagactctg agcgccacct ggtggtaatt tgtctgtgcc tcttctgacg 9120
tggaagaaca gcaactaaca cactaacacg gcatttacta tgggccagcc attgtacgcg 9180
ttgcttaacc tgattcttgg gcgttgtcct gcaggggatt gagcaggtgt acgaggacga 9240
gcccaatttc tctatattcc cacagtcttg agtttgtgtc acaaaataat tatagtgggg 9300
tggagatggg aaatgagtcc aggcaacacc taagcctgat tttatgcatt gagactgcgt 9360
gttattacta aagatctttg tgtcgcaatt tcctgatgaa gggagatagg ttaaaaagca 9420
cggatctact gagttttaca gtcatcccat ttgtagactt ttgctacacc accaaagtat 9480
agcatctgag attaaatatt aatctccaaa ccttaggccc cctcacttgc atccttacgg 9540
tcagataact ctcactcata ctttaagccc attttgtttg ttgtacttgc tcatccagtc 9600
ccagacatag cattggcttt ctcctcacct gttttaggta gccagcaagt catgaaatca 9660
gataagttcc accaccaatt aacactaccc atcttgagca taggcccaac agtgcattta 9720
ttcctcattt actgatgttc gtgaatattt accttgattt tcattttttt ctttttctta 9780
agctgggatt ttactcctga ccctattcac agtcagatga tcttgactac cactgcgatt 9840
ggacctgagg ttcagcaata ctccccttta tgtcttttga atacttttca ataaatctgt 9900
ttgtattttc attagttagt aactgagctc agttgccgta atgctaatag cttccaaact 9960
agtgtctctg tctccagtat ctgataaatc ttaggtgttg ctgggacagt tgtcctaaaa 10020
ttaagataaa gcatgaaaat aactgacaca actccattac tggctcctaa ctacttaaac 10080
aatgcattct atcatcacaa atgtgaaaaa ggagttccct cagtggacta accttatctt 10140
ttctcaacac ctttttcttt gcacaatttt ccacacatgc ctacaaaaag tacttatgcg 10200
gccgccataa aagttttgtt actttataga agaaattttg agtttttgtt ttttttaata 10260
aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat 10320
aataaaactt aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaac 10380
acatgcgtca attttacaca tgattatctt taacgtacgt cacaatatga ttatctttct 10440
agggttaatc tagctgcgtg ttctgcagcg tgtcgagcat cttcatctgc tccatcacgc 10500
tgtaaaacac atttgcaccg cgagtctgcc cgtcctccac gggttcaaaa acgtgaatga 10560
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cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 10680
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct 10740
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 10800
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 10860
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 10920
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 10980
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 11040
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 11100
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 11160
ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 11220
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 11280
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 11340
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 11400
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 11460
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cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 11580
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tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 11760
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 11820
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 11880
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 11940
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 12000
tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tggttcacgc ggtatcattg cagcactggg 12060
gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 12120
ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 12180
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 12240
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 12300
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gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 12720
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aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 12900
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acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 13020
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 13080
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tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 13200
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 13260
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 13320
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agcgccgcac cgctgtcatt aatctgcaca ccggcacggc agttccggct gtcgccggta 13500
ttgttcgggt tgctgatgcg cttcgggctg accatccgga actgtgtccg gaaaagccgc 13560
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tgacttttaa gatttaactc atacgataat tatattgtta tttcatgttc tacttacgtg 14100
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcgcgccct ctacctgctc tcggacccgt gggggtgggg ggtggaggaa ggagtggggg 60
gtcggtcctg ctggcttgtg ggtgggaggc gcatgttctc caaaaacccg cgcgagctgc 120
aatcctgagg gagctgcagt ggaggaggcg gagagaaggc cgcacccttc tccgcagggg 180
gaggggagtg ccgcaatacc tttatgggag ttctctgctg cctccttttc ctaaggaccg 240
ccctgggcct agaaaaatcc ctccctcccc cgcgatctcg tcatcgcctc catgtcagtt 300
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<210> 6
<211> 1012
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttaacctga ttcttgggcg ttgtcctgca ggggattgag caggtgtacg aggacgagcc 60
caatttctct atattcccac agtcttgagt ttgtgtcaca aaataattat agtggggtgg 120
agatgggaaa tgagtccagg caacacctaa gcctgatttt atgcattgag actgcgtgtt 180
attactaaag atctttgtgt cgcaatttcc tgatgaaggg agataggtta aaaagcacgg 240
atctactgag ttttacagtc atcccatttg tagacttttg ctacaccacc aaagtatagc 300
atctgagatt aaatattaat ctccaaacct taggccccct cacttgcatc cttacggtca 360
gataactctc actcatactt taagcccatt ttgtttgttg tacttgctca tccagtccca 420
gacatagcat tggctttctc ctcacctgtt ttaggtagcc agcaagtcat gaaatcagat 480
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gtctctgtct ccagtatctg ataaatctta ggtgttgctg ggacagttgt cctaaaatta 840
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<210> 7
<211> 1073
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgctgagtc cttttcccat cccacccacc tggagctccc ctcttccagt cctgagccac 60
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ctgagccatc gccctcaagg cgctctgctc ctcaagtgga tgcttccctc gcctggctca 540
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cctctctctc cacaacctgg gcccccaaac ctttccaaaa caccttgctt tctgcctcca 960
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tctgagggct tttatcgcat cccctgcctg gctgcagtgg gtctttgggc gcc 1073
<210> 8
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacaggccac agaagagcct ctactcctcc ctctgtcccc gaggctgtct ccctcccagt 60
cttcccagct caggccagtc cccaggcctc tcttccctgc cagagcccgt caggttcggt 120
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aggatgcctg aagaggcccc cttagccaga agaggagcag aagaggagca ggtacccaga 240
agaggagcag ttcagggaaa 260
<210> 9
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaatacccac gtttattggg acaaaagttg ttagggaaaa tggggcctca gagttatgat 60
tcaagtcata attctttcca tttataattt cactcgagac tctgttaact gattccttgt 120
gtgttgtatc ttactcctca gctcacaatt acttttagtt attcacctta actgtatgaa 180
taacagtgga gaaaaggatt ctaccagaat actctaatta tggttttgag tcccctttcc 240
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agtgtagcct ataaaaccca gagctgccca ccctgatcta aacttccagg aacataagaa 540
cgcgcc 546
<210> 10
<211> 1009
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtaggtcac atttcagtaa aacctggctt tgtggattga gcatggtctg tctcttcctg 60
gtacttcatt agtcccctaa gtgggatttg ctgagcaaga ctcctcaatt acagaaatac 120
tccagtttag aattctcgca aaggcttttt gtttccacaa gtagaatcta gaaagcaatc 180
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ctccttccct ttcatgttga accaacagtc ctttttcagt ctagaagcta gtacgaaaga 300
aatgtacaga tgtaggtacc aagcaaagcc attagccaat aactggtgag atggagctaa 360
gaggaaataa aagtgttcct aagaatagca cagcagaagc tagatccaca gatcttaaaa 420
caattttggt tgagtaagag tagaggcaaa agaggaagct aataatgcag tttttaggag 480
ctaagagcca gataaagggt aagggcagga ggaagtgcta tctcagctaa cgagatacat 540
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tcgtggctca atggttaaca aatcagacta gaaaccgtga ggttgcgggt ttgatccctg 840
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tggctcagtt cccgcattcc tgtggctctg gtgtaggctg gtggctacag ctctgattag 960
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<210> 11
<211> 878
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggatggggac tcatgtgaat tttctaaagg tgctatttaa acggggggca cgagtgccgg 60
ctttggacag ggccgctcgc tctccaccct ttcttcttcc ccctcggccg cctctcaccc 120
cctgaggcct ctctcccccc acgacctcct ctctctcctc tgaaaccctc tcctcctcag 180
ctgcatccca ccctcgtggc ctctctctct ctctgtctgt cctgtgtcct ctctcactgg 240
gtttcagagc acagatgccc aaagcacaaa agcagttttc ccctggggtg ggaggaagca 300
agagactttg tacctatttt gtatgtgtat aataatttga gatgttttta attattttga 360
ttgctggaat aaagcatgtg gaaatgaccc aaaccaatct tgcactggcc tcctgatttc 420
cttccttgga gacggaggga gggggagacc tgggggaggg cgcttggggg ggggtgggct 480
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ctctacctcc cccgcacatc ctggcctgcc caccctgaat ggcctggccc agcgatgcca 660
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ccaagagagt gaccagcagg accgcaccat cacgcgcc 878
<210> 12
<211> 727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtggttgctg agactgcgtg ggggcccaag gagacctgga gaaaggaatg cttcctgctc 60
cttcttctgg ggccccagga gagccttccc agggccttgg agaggtgctg tccagggact 120
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gcccctgtcc ctccctgggg tccatagaaa gagggacaag tctgcacgga ccatttgctg 600
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tgtattatta gcacgccgac cacatagggt agggaactgc agctagtaaa caaaagtttg 720
ttcctat 727
<210> 13
<211> 9270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcgcgccgg atggggactc atgtgaattt tctaaaggtg ctatttaaac ggggggcacg 60
agtgccggct ttggacaggg ccgctcgctc tccacccttt cttcttcccc ctcggccgcc 120
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aggaagcaag agactttgta cctattttgt atgtgtataa taatttgaga tgtttttaat 360
tattttgatt gctggaataa agcatgtgga aatgacccaa accaatcttg cactggcctc 420
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ggtgggctct cttctttctg cgctcccccc ccccacctcc aacaccttga cgacccctcc 540
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cgatgccacc aactctctcg ctccgtccac ggctggggag gggggcactc tgcagggttg 720
gggggcactg ggaggctggg ttgggtgagg gaggggtgcc tgggccccca ccccccagca 780
agttctctcc ctaggcgaac tggagggtcg tctggcctct tgagccttgt tgctggctct 840
gagctctacc aagagagtga ccagcaggac cgcaccatca cgcgccccag acccgggcct 900
ggggggcaag tcggggggcg gggggaggtc gggcagggtc ccctgggagg atggggacgt 960
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cctgccctgg tcagggggcg ccaggtcctg cccctcctgg ggagggcggg gggcgagaag 1080
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ggctatggac agcagaacca gtacaacagc agcagtggtg gtggaggtgg aggtggaggt 2100
ggaggtaact atggccaaga tcaatcctcc atgagtagtg gtggtggcag tggtggcggt 2160
tatggcaatc aagaccagag tggtggaggt ggcagcggtg gctatggaca gcaggaccgt 2220
ggaggccgcg gcaggggtgg cagtggtggc ggcggcggcg gcggcggtgg tggttacaac 2280
cgcagcagtg gtggctatga acccagaggt cgtggaggtg gccgtggagg cagaggtggc 2340
atgggcggaa gtgaccgtgg tggcttcaat aaatttggtg gccctcggga ccaaggatca 2400
cgtcatgact ccgaacagga taattcagac aacaacacca tctttgtgca aggcctgggt 2460
gagaatgtta caattgagtc tgtggctgat tacttcaagc agattggtat tattaagaca 2520
aacaagaaaa cgggacagcc catgattaat ttgtacacag acagggaaac tggcaagctg 2580
aagggagagg caacggtctc ttttgatgac ccaccttcag ctaaagcagc tattgactgg 2640
tttgatggta aagaattctc cagcggccgc tcgagcatgc atctagagct cgctgatcag 2700
cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 2760
tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 2820
attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 2880
aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gtctgaggcg 2940
gaaagaacca gctgccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 3000
ctgaagagga gtttacgtcc agccaattct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa 3060
gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac 3120
caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 3180
ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag 3240
ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc 3300
cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt 3360
ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcggc ggccgcgcca ccatgaccga 3420
gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg tacgcaccct 3480
cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc gtcgatccgg accgccacat 3540
cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa 3600
ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga 3660
agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct 3720
ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg 3780
gttcctggcc accgtcggag tctcgcccga ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt 3840
cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggagacctc 3900
cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga 3960
ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct gagaattcgc 4020
gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 4080
gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 4140
tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt 4200
attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 4260
tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 4320
tgtataccgc tcgactagag cttgcggaac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta 4380
tacgaagtta ttaggtccgc tggccatcta cgagccaaag actttcaaat ctttggctgc 4440
cttggccagt aggaggcgac acgaaggatt tgctgctgcc ttgggggatg ggaaggaacc 4500
tgaaggcatt ttttccagag tggtgcagta ccactgagga ctgttgctgt attgattagg 4560
aaaagagaca gagtaatttg cagtttgttt gatttatact gtggttgctg agactgcgtg 4620
ggggcccaag gagacctgga gaaaggaatg cttcctgctc cttcttctgg ggccccagga 4680
gagccttccc agggccttgg agaggtgctg tccagggact aaccctgtgc tctaggaagg 4740
ctgcaggccc tgaccagctg ggcaggtcct gggtccctcc tggccttcta agttccccaa 4800
acatgagacc tctgggtgtg gggtggcctg gggaggtcat tttgcccagg ccctacctcc 4860
tgcccattcc taaccctttt taaaaatctg tgcgtcctct tcttccttct tctccctccc 4920
ttcccttttc gctcaccctc tgctgctggc ctgagagccg gaggccccca gggggaaggc 4980
gactggtctc ctccccagtc tcagggaagg gagacagaga atccaggaag ccagaactca 5040
gcagacgaag cacccaggga cctagagatg ggttgaaaag ttgacagctg tcccacctgc 5100
ctcccaaggt ctcagggcct aaacctccaa ggcaggaaag gcccctgtcc ctccctgggg 5160
tccatagaaa gagggacaag tctgcacgga ccatttgctg taatattaac accttggctg 5220
tcattaggta gtcttggctg ttaattatgt cctgtgataa tgtattatta gcacgccgac 5280
cacatagggt agggaactgc agctagtaaa caaaagtttg ttcctatatg cggccgccat 5340
aaaagttttg ttactttata gaagaaattt tgagtttttg ttttttttaa taaataaata 5400
aacataaata aattgtttgt tgaatttatt attagtatgt aagtgtaaat ataataaaac 5460
ttaatatcta ttcaaattaa taaataaacc tcgatataca gaccgataaa acacatgcgt 5520
caattttaca catgattatc tttaacgtac gtcacaatat gattatcttt ctagggttaa 5580
tctagctgcg tgttctgcag cgtgtcgagc atcttcatct gctccatcac gctgtaaaac 5640
acatttgcac cgcgagtctg cccgtcctcc acgggttcaa aaacgtgaat gaacgaggcg 5700
cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 5760
aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 5820
gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc 5880
gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 5940
ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 6000
cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 6060
gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 6120
gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 6180
ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 6240
tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa 6300
atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 6360
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 6420
tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 6480
ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 6540
taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 6600
gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 6660
aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 6720
gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 6780
ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 6840
ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 6900
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 6960
taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 7020
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 7080
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 7140
ataaatctgg agccggtgag cgtggttcac gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 7200
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 7260
gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 7320
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 7380
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 7440
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 7500
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 7560
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 7620
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 7680
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 7740
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 7800
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 7860
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 7920
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 7980
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 8040
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 8100
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 8160
ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 8220
gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 8280
cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 8340
gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 8400
ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 8460
acagctatga ccatgattac gccaagcgcg cccgccgggt aactcacggg gtatccatgt 8520
ccatttctgc ggcatccagc caggataccc gtcctcgctg acgtaatatc ccagcgccgc 8580
accgctgtca ttaatctgca caccggcacg gcagttccgg ctgtcgccgg tattgttcgg 8640
gttgctgatg cgcttcgggc tgaccatccg gaactgtgtc cggaaaagcc gcgacgaact 8700
ggtatcccag gtggcctgaa cgaacagttc accgttaaag gcgtgcatgg ccacaccttc 8760
ccgaatcatc atggtaaacg tgcgttttcg ctcaacgtca atgcagcagc agtcatcctc 8820
ggcaaactct ttccatgccg cttcaacctc gcgggaaaag gcacgggctt cttcctcccc 8880
gatgcccaga tagcgccagc ttgggcgatg actgagccgg aaaaaagacc cgacgatatg 8940
atcctgatgc agctagatta accctagaaa gatagtctgc gtaaaattga cgcatgcatt 9000
cttgaaatat tgctctctct ttctaaatag cgcgaatccg tcgctgtgca tttaggacat 9060
ctcagtcgcc gcttggagct cccgtgaggc gtgcttgtca atgcggtaag tgtcactgat 9120
tttgaactat aacgaccgcg tgagtcaaaa tgacgcatga ttatctttta cgtgactttt 9180
aagatttaac tcatacgata attatattgt tatttcatgt tctacttacg tgataactta 9240
ttatatatat attttcttgt tatagatatc 9270
<210> 14
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gln Gln Ala Thr Gln Ser Tyr Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Pro Thr Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Pro
20 25 30
Tyr Gly Gln Gln Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Thr Asp Thr Ser
35 40 45
Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Gln Ser Gln Asn Ser
50 55 60
Tyr Gly Thr Gln Ser Thr Pro Gln Gly Tyr Gly Ser Thr Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Gly Ser Ser Gln Ser Ser Gln Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Ser Ser Tyr
85 90 95
Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Pro Ala Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ser Tyr
100 105 110
Gly Ser Ser Ser Gln Ser Ser Ser Tyr Gly Gln Pro Gln Ser Gly Ser
115 120 125
Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Tyr Gly Gly Gln Gln Gln Ser Tyr Gly Gln
130 135 140
Gln Gln Ser Tyr Asn Pro Pro Gln Gly Tyr Gly Gln Gln Asn Gln Tyr
145 150 155 160
Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Tyr
165 170 175
Gly Gln Asp Gln Ser Ser Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Tyr Gly Asn Gln Asp Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly
195 200 205
Gln Gln Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Arg Ser Ser Gly Gly Tyr Glu Pro
225 230 235 240
Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Met Gly Gly Ser
245 250 255
Asp Arg Gly Gly Phe Asn Lys Phe Gly Gly Pro Arg Asp Gln Gly Ser
260 265 270
Arg His Asp Ser Glu Gln Asp Asn Ser Asp Asn Asn Thr Ile Phe Val
275 280 285
Gln Gly Leu Gly Glu Asn Val Thr Ile Glu Ser Val Ala Asp Tyr Phe
290 295 300
Lys Gln Ile Gly Ile Ile Lys Thr Asn Lys Lys Thr Gly Gln Pro Met
305 310 315 320
Ile Asn Leu Tyr Thr Asp Arg Glu Thr Gly Lys Leu Lys Gly Glu Ala
325 330 335
Thr Val Ser Phe Asp Asp Pro Pro Ser Ala Lys Ala Ala Ile Asp Trp
340 345 350
Phe Asp Gly Lys Glu Phe Ser
355
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agttatggca gaactcagtg 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccccatccaa agtttttaaa gga 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtggcagat gtcacagttt agg 23
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caccgagtta tggcagaact cagtg 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaccactga gttctgccat aactc 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggagcaa actgacatgg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgcagtgggt ctttggggac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttccaggaac ataagaaagt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcagtctcag caaccactga 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtcggagtg aacggatttg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccatttgatg ttggcgggat 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agatccgcca caacatcgag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtccatgccg agagtgatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctgctgtaa gtgccgtagt 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctaggggcac agcacgtc 18
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagttattag gtctgaagag gagttt 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cccatcattc cgtcccagag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgctgagttc tggcttcctg 20
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctaccaaga gagtgaccag cag 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cacgccatcc tgcgtctgga 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agcaccgtgt tggcgtagag 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcagtagcca gagctcccaa tcg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgctggctg tagctcccac tct 23
<210> 38
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atggcctcaa acgattatac ccaacaagca acccaaagct atggggccta ccccacccag 60
cccgggcagg gctattccca gcagagcagt cagccctacg gacagcagag ttacagtggt 120
tatagccagt ccacggacac ttcaggctat ggccagagca gctattcttc ttatggccag 180
agccagaaca gctatggaac tcagtcaact ccccagggat atggctcgac tggcggctat 240
ggcagtagcc agagctccca atcgtcttac gggcagcagt cctcctaccc tggctatggc 300
cagcagccag ctcccagcag cacctcggga agttacggta gcagttctca gagcagcagc 360
tatgggcagc cccagagtgg gagctacagc cagcagccta gctatggtgg acagcagcaa 420
agctatggac agcagcaaag ctataatccc cctcagggct atggacagca gaaccagtac 480
aacagcagca gtggtggtgg aggtggaggt ggaggtggag gtaactatgg ccaagatcaa 540
tcctccatga gtagtggtgg tggcagtggt ggcggttatg gcaatcaaga ccagagtggt 600
ggaggtggca gcggtggcta tggacagcag gaccgtggag gccgcggcag gggtggcagt 660
ggtggcggcg gcggcggcgg cggtggtggt tacaaccgca gcagtggtgg ctatgaaccc 720
agaggtcgtg gaggtggccg tggaggcaga ggtggcatgg gcggaagtga ccgtggtggc 780
ttcaataaat ttggtggccc tcgggaccaa ggatcacgtc atgactccga acaggataat 840
tcagacaaca acaccatctt tgtgcaaggc ctgggtgaga atgttacaat tgagtctgtg 900
gctgattact tcaagcagat tggtattatt aagacaaaca agaaaacggg acagcccatg 960
attaatttgt acacagacag ggaaactggc aagctgaagg gagaggcaac ggtctctttt 1020
gatgacccac cttcagctaa agcagctatt gactggtttg atggtaaaga attctcc 1077
<210> 39
<211> 448
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga 60
ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga 120
gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg 180
gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc 240
gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg 300
cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg 360
cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg 420
aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcag 448
<210> 40
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aataaatgca ctgttgggcc tatgctcaag atgggtagtg ttaattggtg gtggaactta 60
tctgatttca tgacttgctg gctacctaaa acaggtgagg agaaagccaa tgctatgtct 120
gggactggat gagcaagtac aacaaacaaa atgggcttaa agtatgagtg agagttatct 180
gaccgtaagg atgcaagtga gggggcctaa ggtttggaga ttaatattta atctcagatg 240
ctatactttg gtggtgtagc aaaagtctac aaatgggatg actgtaaaac tcagtagatc 300
cgtgcttttt aacctatctc ccttcatcag gaaattgcga cacaaagatc tttagtaata 360
acacgcagtc tcaatgcata aaatcaggct taggtgttgc ctggactcat ttcccatctc 420
caccccacta taattatttt gtgacacaaa ctcaagactg tgggaatata gagaaattgg 480
gctcgtcctc gtacacctgc tcaatcccct gcaggacaac gcccaagaat caggttaagc 540
cagggcaaaa gaatcccgcc cataatcgag aaggagcaaa ctgacatgga ggcgatgacg 600
agatcgcggg ggagggaggg atttttctag gcccagggcg gtccttagga aaaggaggca 660
gcagagaact cccataaagg tattgcggca ctcccctccc cctgcggaga agggtgcggc 720
cttctctccg cctcctccac tgcagctccc tcaggattgc agctcgcgcg ggtttttgga 780
gaacatgcgc ctcccaccca caagccagca ggaccgaccc cccactcctt cctccacccc 840
ccacccccac gggtccgaga gcaggtagag ggctagtctc gtccttcagg cggcggacgc 900
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tcctgcgcgc gcttcctgcc acgttgcgca ggggcgaggg gccagacact gcggcgctgg 1020
cctcggggag ggccgtacca aagaccgcct ccctgccgac tcgcgtagtg gtttcgctca 1080
tttgggaccc aagccaataa caag 1104
<210> 41
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgctctctct cctgccccct tcacctgcgt gccctcctca ttctccctct gtgccacctc 60
tggccttgca ctgtaggctc tctcttgggg atgtttctcc ttctccacac acttctcttt 120
cactctgtcc tcttgctttg tgtgggcctg cagcgttacc cttttttctg ggcacactca 180
gagcaccctc ctctttctgg ttctgggcca cctgtctgtc ctcgggtcat cttgctctct 240
ctgcctggat gccctcctgt ggctttgggc agcttctccc tccttcagag tgcaccgcca 300
gttctcctag gcccggtcac ttccccttcc caggggacct agagccctgc taggtcctct 360
ctctccacaa cctgggcccc caaacctttc caaaacacct tgctttctgc ctccattggt 420
cttgtgttcc agagccagag tcactatatg tcccagaacc aggattccct ctggttctga 480
gggcttttat cgcatcccct gcctggctgc agtgggtctt tggggacagg ccacagaaga 540
gcctctactc ctccctctgt ccccgaggct gtctccctcc cagtcttccc agctcaggcc 600
agtccccagg cctctcttcc ctgccagagc ccgtcaggtt cggttacttt ggggcccaga 660
gaggaccctg tgaaggaagc gtgggtaggg gcacgggaat ggggaggatg cctgaagagg 720
cccccttagc cagaagagga gcagaagagg agcaggtacc cagaagagga gcagttcagg 780
gaaatagaag agtcccgagc tctttttttt tttttttttt atttcttttc ttttcttttc 840
tttttatggc agcatccgtg gtatatggag gttcccagcc taggggtcag atcatacctg 900
caactgccag cctacaccac agccacagca ctcaggatcc gagctgcatc tgcggcttac 960
gccacaggtc acagcaacgc tggatcctta acccactgaa tgaggccagg gattgaacct 1020
gcaacctcat gcacactatg ctggggtctt aatcgg 1056
<210> 42
<211> 1108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acttcctcct gcccttaccc tttatctggc tcttagctcc taaaaactgc attattagct 60
tcctcttttg cctctactct tactcaacca aaattgtttt aagatctgtg gatctagctt 120
ctgctgtgct attcttagga acacttttat ttcctcttag ctccatctca ccagttattg 180
gctaatggct ttgcttggta cctacatctg tacatttctt tcgtactagc ttctagactg 240
aaaaaggact gttggttcaa catgaaaggg aaggaggtaa aagaggacac acaggaaaga 300
tggattggga ttcaggtctc tgctgttgtt acttgagatt gctttctaga ttctacttgt 360
ggaaacaaaa agcctttgcg agaattctaa actggagtat ttctgtaatt gaggagtctt 420
gctcagcaaa tcccacttag gggactaatg aagtaccagg aagagacaga ccatgctcaa 480
tccacaaagc caggttttac tgaaatgtga cctactttct tatgttcctg gaagtttaga 540
tcagggtggg cagctctggg ttttataggc tacactgtta acactcaggc tgttttctac 600
cgtttagtca aaatatagtc accttgcctg cttcacctgt ccatcagaga atggcctcat 660
taattgactc tctagtatga agtcaaagta gctttggtgg ccctaaatgg acaagtatca 720
agagactggg tgaattgagg agcttgagac tgtcacctca gatcgaaaag actgaaaaat 780
cacctcagat caaaaagact gaaaaatctt cagtctggaa aggggactca aaaccataat 840
tagagtattc tggtagaatc cttttctcca ctgttattca tacagttaag gtgaataact 900
aaaagtaatt gtgagctgag gagtaagata caacacacaa ggaatcagtt aacagagtct 960
cgagtgaaat tataaatgga aagaattatg acttgaatca taactctgag gccccatttt 1020
ccctaacaac ttttgtccca ataaacgtgg gtatttgttt gggagaaact atcatataca 1080
tgattaccca gtaaacagac tgtttact 1108
<210> 43
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
actttgtacc tattttgtat gtgtataata atttgagatg tttttaatta ttttgattgc 60
tggaataaag catgtggaaa tgacccaaac caatcttgca ctggcctcct gatttccttc 120
cttggagacg gagggagggg gagacctggg ggagggcgct tggggggggg tgggctctct 180
tctttctgcg ctcccccccc ccacctccaa caccttgacg acccctcctg cttccgcttg 240
cctttctcag gctttaacac tttctcctcg ccctctcagc atgcgcatgc gcgtgcctct 300
acctcccccg cacatcctgg cctgcccacc ctgaatgtcc tggcccagcg atgccaccaa 360
ctctctcgct ccgtccacgg ctggggaggg gggcactctg cagggttggg gggcactggg 420
aggctgggtt gggtgaggga ggggtgcctg ggcccccacc ccccagcaag ttctctccct 480
aggcgaactg gagggtcgtc tggcctcttg agccttgttg ctggctctga gctctaccaa 540
gagagtgacc agcaggaccg caccatcagt ggttgctgag actgcgtggg ggcccaagga 600
gacctggaga aaggaatgct tcctgctcct tcttctgggg ccccaggaga gccttcccag 660
ggccttggag aggtgctgtc cagggactaa ccctgtgctc taggaaggct gcaggccctg 720
accagctggg caggtcctgg gtccctcctg gccttctaag ttccccaaac atgagacctc 780
tgggtgtggg gtggcctggg gaggtcattt tgcccaggcc ctacctcctg cccattccta 840
acccttttta aaaatctgtg cgtcctcttc ttccttcttc tccctccctt cccttttcgc 900
tcaccctctg ctgctggcct gagagccgga ggcccccagg gggaaggcga ctggtctcct 960
ccccagtctc agggaaggga gacagagaat ccaggaagcc agaactcagc agacgaagca 1020
cccagggacc tagagatggg ttgaaaagtt gacagctgtc ccacctgcct cccaaggtct 1080
cagggccta 1089

Claims (10)

1.一种表达人FUS蛋白的猪细胞的构建方法，其特征在于，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞，所述的编码人FUS蛋白的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为人Syn启动子，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点；
所述的构建方法包括将安全港位点载体、sgRNA载体和Cas载体共转染至猪细胞，所述的Cas载体包含编码Cas9蛋白、EGFP和Puro抗性蛋白的核苷酸序列；
所述的安全港位点载体包含编码人FUS蛋白的核苷酸序列和安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5’同源臂和3’同源臂，所述的编码人FUS蛋白的核苷酸序列位于5’同源臂与3’同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：
A）ROSA26安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：5所示，3’同源臂如SEQ IDNO：6所示；
B）AAVS1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：7所示，3’同源臂如SEQ IDNO：8所示；
C）H11安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：9所示，3’同源臂如SEQ ID NO：10所示；
或D）COL1A1安全港位点载体骨架，其5’同源臂如SEQ ID NO：11所示，3’同源臂如SEQID NO：12所示；
所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：
靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；
所述的Cas载体还包含EF1a启动子、WPRE元件和3’LTR序列元件；
所述的Cas载体的核苷酸序列从5’-3’依次为：CMV增强子、EF1a启动子、核定位信号、核定位信号、编码Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信号，核定位信号、编码自剪切多肽P2A的核苷酸序列、编码EGFP的核苷酸序列、编码自裂解多肽T2A的核苷酸序列、编码Puro抗性蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信号序列元件。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的插入的编码人FUS蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ IDNO：43所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人Syn启动子驱动编码人FUS蛋白的核苷酸序列在神经组织中特异表达。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人Syn启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的猪细胞为猪成纤维细胞或神经细胞。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的Cas载体的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
8.一种肌萎缩侧索硬化症的模型猪的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将权利要求1-7任一所述的构建方法获得的猪细胞移入去核的猪卵母细胞中，获得模型猪。
9.一种权利要求1-7任一所述的构建方法获得的猪细胞在制备肌萎缩侧索硬化症动物模型中的应用。
10.一种权利要求8所述的构建方法获得的模型猪在筛选治疗肌萎缩侧索硬化症的药物及药效评价中的应用，或者在研究肌萎缩侧索硬化症的发病机制中的应用。
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