CN112680444B

CN112680444B - 用于oca2基因突变的crispr系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用

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Publication number: CN112680444B
Application number: CN202011489465.XA
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 陶裴裴; 曾为俊; 刘璐; 王磊; 程锐; 马翔; 赵泽英; 黄彩云
Original assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN112680444A

Abstract

本发明公开了用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于OCA2基因编辑的gRNA，序列如SEQ ID NO：39所示。一种针对猪OCA2基因的gRNA表达载体，以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达所述的gRNA。一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和所述的针对猪OCA2基因的gRNA表达载体。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及用于OCA2基因突变的CRISPR/Cas9系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用。

背景技术

白化病(albinism)是由于黑色素合成减少或缺乏而导致的多种遗传性疾病的总称，主要表现为皮肤、毛发以及眼部的色素减退。多种基因的突变均可以导致白化病的症状。根据色素缺失的部位以及有无其他系统异常，可将白化病分为非综合征性白化病和综合征性白化病两大类。非综合征白化病又可再分为只有眼部色素缺乏的眼白化病(OA)和皮肤、毛发、眼睛均有色素缺失(即具有全身症状)的眼及皮肤白化病(OCA)。

眼及皮肤白化病(oculocutaneous albinism，OCA)是一组以眼、皮肤、毛发黑色素沉着减少或缺乏为主要临床表现的常染色体隐性遗传病。超过90％的白化病患者为OCA，一般是由黑色素合成或转运相关基因突变所引起的，主要临床表现为普遍色素沉着不足，眼部改变包括黄斑中心凹发育不良、屈光不正、视力低下、畏光、虹膜半透明、眼球震颤、眼底着色不足及视觉纤维通路异常等。OCAII型约占OCA的30-50％，是OCA2基因突变致使其编码的OCA2蛋白功能丧失引起的。已有研究结果表明，OCA2蛋白对于黑素小体的正常生物发生很重要，可能参与黑色素细胞内酪氨酸(黑色素合成的前体)的运输、调节黑素体的pH值和黑素体的成熟度、调节酪氨酸酶的翻译后加工(黑色素合成中的限速反应)等黑素小体蛋白正常加工和转运的过程。因此，基于OCA2基因突变构建眼及皮肤白化病动物模型将为研究及治疗人类相关疾病提供有力的实验工具。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因敲入到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于OCA2基因编辑的靶点gRNA及其表达载体。

本发明的另一目的是提供一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的又一目的是提供所述的gRNA表达载体、所述的CRISPR/Cas9系统在构建眼及皮肤白化病克隆猪核供体细胞中的应用。

一种用于OCA2基因编辑的靶点gRNA，序列如SEQ ID NO.21所示。

一种用于OCA2基因编辑的gRNA，序列如SEQ ID NO.39所示。

一种针对猪OCA2基因的gRNA表达载体，以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架，表达权利要求2所述的gRNA。

作为本发明的一种优选，所述的表达载体是将SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG-U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。

一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和权利要求3或4所述的针对猪OCA2基因的gRNA表达载体。

作为本发明的一种优选，所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。

作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

本发明所述的gRNA表达载体、所述的CRISPR/Cas9系统在构建眼及皮肤白化病克隆猪核供体细胞中的应用。

一种重组猪成纤维细胞，由所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建OCA2基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建OCA2基因敲除的眼及皮肤白化病克隆猪中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率较之原载体有极显著提高。

(3)本发明针对OCA2基因的不同靶点gRNA设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获单细胞克隆的基因型(双等位基因相同变异的纯合突变型、双等位基因不同变异的纯合突变型、杂合突变型或野生型)，获得纯合突变的概率为30％～50％，优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。

(4)利用本发明所得到的纯合突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。

图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。

图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。

图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。

图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。

图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组DNA为模板分别采用OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R409(组1)、OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473(组2)、OCA2-E3g-F2/OCA2-E3g-R409(组3)、OCA2-E3g-F2/OCA2-E3g-R473(组4)组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组DNA为模板采用OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图12为实施例3中步骤3.6.4以基因组DNA为模板采用OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图13为实施例4中步骤4.4.4以基因组DNA为模板采用OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图14为实施例5中步骤5.4.4以基因组DNA为模板采用OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型的示例性测序峰图。

图17为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图18为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型的示例性测序峰图。

具体实施方式

实施例1、质粒的构建

1.1构建质粒pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)

原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO.1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO.1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

质粒pU6gRNAeEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQID NO.2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

pKG-GE3质粒构建方法如下：

(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列

质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO.4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO.5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。

(3)Cas9基因N端增加NLS序列

将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO.6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。

(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyAsignals

以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyAsignals的片段(SEQ ID NO.7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。

SEQ ID NO.2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO.2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

1.2构建pKG-U6gRNA载体

来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和gRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO.8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO.3)，SEQ ID NO.3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。所构建的pKG-U6gRNA载体图谱如图6。

实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.1靶点gRNA设计及构建

2.1.1使用Benchling对RAG1基因进行靶点gRNA设计

RAG1-g4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.9)

合成针对上述RAG1基因靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.10)

RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.11)

RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。

2.1.2设计用于扩增和检测包含RAG1 gRNA靶点片段的引物

RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO.12)

RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO.13)

2.1.3将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法

1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；

2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；

3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA Oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：

95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；

4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

37℃反应60min；

5)转化

按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。

2.1.4 gRNA载体构建

1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO.14所示的RAG1-gRNA4。

2.1.5 gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。

2.2猪原代成纤维细胞制备

2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除外部组织，75﹪酒精浸泡30-40s；

2.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；

其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。

2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL 0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；

2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。

其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基

(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。

2.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，使用1mL完全培养基重悬细胞以备下一步核转染实验。

2.3质粒配比优化

2.3.1共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.3.2共转染操作方法

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon)与Neon TM transfection system电转仪进行转染实验。

1)按照上述分组配制电转反应液，混匀过程中注意切勿产生气泡；

2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用PBS磷酸缓冲液(Solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

3)吸取10μL细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；

4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL E Buffer；

5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms 3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)的完全培养液；

6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；

7)电转后6-12h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

2.3.3基因编辑效率分析

提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

2.4质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.4.1共转染分组情况

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.4.2共转染操作方法

同本实施例中2.3.2。

2.4.3基因编辑效率分析

提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3针对OCA2基因筛选高效的靶点gRNA(第一次测试)

3.1基因组DNA的提取

使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01)分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。

3.2 OCA2基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

3.2.1猪OCA2基因信息

编码一种黑素体跨膜蛋白；位于15号染色体；GeneID为397171，Sus scrofa。猪OCA2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。已有研究结果表明OCA2在黑素小体的正常生物发生过程中起重要作用，在猪基因组DNA中，OCA2基因具有24个外显子，其中第3外显子在所有转录本中均占据重要位置(猪OCA2基因第3外显子序列，含部分第2和部分第3内含子序列如SEQ ID NO.16所示)。

3.2.2 OCA2基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计

根据查到的猪OCA2基因组序列

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010457.5？report＝genbank& from＝56657648&to＝56869920)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品OCA2基因外显子3的位点。

使用Oligo7软件进行引物设计，设计结果如下：

OCA2-E3g-F1：AGGGGTCTGTGATGTCAAGAAAG(SEQ ID NO.17)

OCA2-E3g-R473：TACACGCTGGTTTGCAGGAT(SEQ ID NO.18)

OCA2-E3g-F2：ACTACGGTGTCTGTGGTCCT(SEQ ID NO.19)

OCA2-E3g-R409：TTGGTAAGGATGTCATGAGGGTA(SEQ ID NO.20)

3.2.3 OCA2基因组PCR扩增引物筛选

使用猪(雌性1)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游引物和两条下游引物分别组合，Max酶(Vazyme公司，货号：P505)进行PCR，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1为：引物OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R409；组2为：引物OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473；组3为：引物OCA2-E3g-F2/OCA2-E3g-R409；组4为：引物OCA2-E3g-F2/OCA2-E3g-R473，优选引物对OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473对目的片段进行扩增。

3.2.4 18只猪OCA2基因片段PCR扩增

分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473，Max酶进行OCA2基因组片段的扩增，产物(519bp)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。

3.2.5 OCA2基因序列保守性分析

以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的OCA2基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。

3.3靶点gRNA设计及构建

3.3.1使用Benchling进行靶点gRNA设计

设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：

https://benchling.com/

OCA2基因敲除靶点设计如下：

OCA2-E3-gRNA1：GGGAGAACAGCTCAGCTGAG

OCA2-E3-gRNA2：CAGCAGTGATGAACTCTGGA

OCA2-E3-gRNA3：TGCCAACTCTGTGCTCAGCA

OCA2-E3-gRNA4：GATCTGCCTCCACAGAGAAG

合成的OCA2基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

OCA2-E3-gRNA1-S：caccGGGAGAACAGCTCAGCTGAG

OCA2-E3-gRNA1-A：aaacCTCAGCTGAGCTGTTCTCCC

OCA2-E3-gRNA2-S：caccgCAGCAGTGATGAACTCTGGA

OCA2-E3-gRNA2-A：aaacTCCAGAGTTCATCACTGCTGc

OCA2-E3-gRNA3-S：caccgTGCCAACTCTGTGCTCAGCA

OCA2-E3-gRNA3-A：aaacTGCTGAGCACAGAGTTGGCAc

OCA2-E3-gRNA4-S：caccGATCTGCCTCCACAGAGAAG

OCA2-E3-gRNA4-A：aaacCTTCTCTGTGGAGGCAGATC

OCA2-E3-gRNA1-S、OCA2-E3-gRNA1-A、OCA2-E3-gRNA2-S、OCA2-E3-gRNA2-A、OCA2-E3-gRNA3-S、OCA2-E3-gRNA3-A、OCA2-E3-gRNA4-S、OCA2-E3-gRNA4-A均为单链DNA分子。

3.3.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法

同实施例2中2.1.3。

3.3.3 gRNA载体构建

1)将合成的OCA2-E3-gRNA1-S和OCA2-E3-gRNA1-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA1)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA1)将会表达OCA2-E3-gRNA1。OCA2-E3-gRNA1序列为:GGGAGAACAGCUCAGCUGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

2)将合成的OCA2-E3-gRNA2-S和OCA2-E3-gRNA2-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA2)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA2)将会表达OCA2-E3-gRNA2。OCA2-E3-gRNA2序列为：CAGCAGUGAUGAACUCUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3)将合成的OCA2-E3-gRNA3-S和OCA2-E3-gRNA3-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA3)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA3)将会表达OCA2-E3-gRNA3。OCA2-E3-gRNA3序列为：UGCCAACUCUGUGCUCAGCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

4)将合成的OCA2-E3-gRNA4-S和OCA2-E3-gRNA4-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA4)将会表达OCA2-E3-gRNA4。OCA2-E3-gRNA4序列为：GAUCUGCCUCCACAGAGAAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3.3.3 gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA1)、pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA2)、pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA3)和pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA4)载体均构建成功。

3.4猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

3.5使用构建好的gRNA质粒、Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞。

3.5.1共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA1)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA2)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA3)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

3.5.2共转染操作方法

同实施例2中2.3.2。

3.6 OCA2基因不同靶点gRNA的编辑效率分析

3.6.1分别向步骤3.5.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；

3.6.2采用前述针对OCA2基因E3引物OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473进行检测突变，PCR目的产物长度为519bp；

3.6.3使用常规PCR反应扩增OCA2靶点基因；

3.6.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出OCA2-E3-gRNA1、OCA2-E3-gRNA2、OCA2-E3-gRNA3、OCA2-E3-gRNA4不同靶点的编辑效率依次为1％、1％、0、1％。结果表明，4个gRNA的编辑效率均远低于20％，本次未筛选到较优的高效靶点gRNA。

实施例4针对OCA2基因筛选高效的靶点gRNA(第二次测试)

4.1靶点gRNA设计及构建

4.1.1使用Benchling进行靶点gRNA设计

https://benchling.com/

OCA2基因敲除靶点设计如下：

OCA2-E3-g5：CAGAAGCTCCCCCTTCTCTG(SEQ ID NO.21)

OCA2-E3-g6：TCAGCTGAGCTGTTCTCCCA(SEQ ID NO.22)

OCA2-E3-g7：AGCTCAGCTGAGTGGGAGGG(SEQ ID NO.23)

OCA2-E3-g8：GGAGAACAGCTCAGCTGAGT(SEQ ID NO.24)

OCA2-E3-g9：TCATCACTGCTGATGAACCT(SEQ ID NO.25)

OCA2-E3-g10：AGCCCTGCTGAGCACAGAGT(SEQ ID NO.26)

合成的OCA2基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

OCA2-E3-gRNA5-S：caccgCAGAAGCTCCCCCTTCTCTG(SEQ ID NO.27)

OCA2-E3-gRNA5-A：aaacCAGAGAAGGGGGAGCTTCTGc(SEQ ID NO.28)

OCA2-E3-gRNA6-S：caccgTCAGCTGAGCTGTTCTCCCA(SEQ ID NO.29)

OCA2-E3-gRNA6-A：aaacTGGGAGAACAGCTCAGCTGAc(SEQ ID NO.30)

OCA2-E3-gRNA7-S：caccgAGCTCAGCTGAGTGGGAGGG(SEQ ID NO.31)

OCA2-E3-gRNA7-A：aaacCCCTCCCACTCAGCTGAGCTc(SEQ ID NO.32)

OCA2-E3-gRNA8-S：caccGGAGAACAGCTCAGCTGAGT(SEQ ID NO.33)

OCA2-E3-gRNA8-A：aaacACTCAGCTGAGCTGTTCTCC(SEQ ID NO.34)

OCA2-E3-gRNA9-S：caccgTCATCACTGCTGATGAACCT(SEQ ID NO.35)

OCA2-E3-gRNA9-A：aaacAGGTTCATCAGCAGTGATGAc(SEQ ID NO.36)

OCA2-E3-gRNA10-S：caccgAGCCCTGCTGAGCACAGAGT(SEQ ID NO.37)

OCA2-E3-gRNA10-A：aaacACTCTGTGCTCAGCAGGGCTc(SEQ ID NO.38)

OCA2-E3-gRNA5-S、OCA2-E3-gRNA5-A、OCA2-E3-gRNA6-S、OCA2-E3-gRNA6-A、OCA2-E3-gRNA7-S、OCA2-E3-gRNA7-A、OCA2-E3-gRNA8-S、OCA2-E3-gRNA8-A、OCA2-E3-gRNA9-S、OCA2-E3-gRNA9-A、OCA2-E3-gRNA10-S、OCA2-E3-gRNA10-A均为单链DNA分子。

4.1.2将gRNA序列克隆到pKG-U6gRNA骨架载体上的方法

同实施例2中2.1.3。

4.1.3 gRNA载体构建

1)将合成的OCA2-E3-gRNA5-S和OCA2-E3-gRNA5-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA5)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA5)将会表达SEQ ID NO.39所示的OCA2-E3-gRNA5。

SEQ ID NO.39：

CAGAAGCUCCCCCUUCUCUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

2)将合成的OCA2-E3-gRNA6-S和OCA2-E3-gRNA6-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA6)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA6)将会表达SEQ ID NO.40所示的OCA2-E3-gRNA6。

SEQ ID NO.40：

UCAGCUGAGCUGUUCUCCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3)将合成的OCA2-E3-gRNA7-S和OCA2-E3-gRNA7-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA7)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA7)将会表达SEQ ID NO.41所示的OCA2-E3-gRNA7。

SEQ ID NO.41：

AGCUCAGCUGAGUGGGAGGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

4)将合成的OCA2-E3-gRNA8-S和OCA2-E3-gRNA8-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA8)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA8)将会表达SEQ ID NO.42所示的OCA2-E3-gRNA8。

SEQ ID NO.42：

GGAGAACAGCUCAGCUGAGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

5)将合成的OCA2-E3-gRNA9-S和OCA2-E3-gRNA9-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA9)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA9)将会表达SEQ ID NO.43所示的OCA2-E3-gRNA9。

SEQ ID NO.43：

UCAUCACUGCUGAUGAACCUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

6)将合成的OCA2-E3-gRNA10-S和OCA2-E3-gRNA10-A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA10)。质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA10)将会表达SEQ ID NO.44所示的OCA2-E3-gRNA10。

SEQ ID NO.44：

AGCCCUGCUGAGCACAGAGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

4.1.3gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA5)、pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA6)、pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA7)、pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA8)、pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA9)和pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA10)载体均构建成功。

4.2猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

4.3使用构建好的gRNA质粒、Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞。

4.3.1共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA5)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA5)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA5)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA6)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA6)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA6)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA7)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA7)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA7)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA8)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA8)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA8)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA9)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA9)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA9)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第六组：将质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA10)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA10)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(OCA2-E3-gRNA10)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第七组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

4.3.2共转染操作方法

同实施例2中2.3.2。

4.4 OCA2基因不同靶点gRNA的编辑效率分析

4.4.1分别向步骤4.3.2中收集在1.5mL离心管中的7组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；

4.4.2采用前述针对OCA2基因E3引物OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473进行检测突变，PCR目的产物长度为519bp；

4.4.3使用常规PCR反应扩增OCA2靶点基因；

4.4.4将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图13，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出OCA2-E3-gRNA5、OCA2-E3-gRNA6、OCA2-E3-gRNA7、OCA2-E3-gRNA8、OCA2-E3-gRNA9、OCA2-E3-gRNA10不同靶点的编辑效率依次为32％、14％、2％、0、5％、3％。结果表明，OCA2-E3-gRNA5编辑效率最高，优选为最优靶点。

实施例5构建OCA2基因敲除的从江香猪单细胞克隆

5.1猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

5.2使用构建好的OCA2-E3-gRNA5质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞

同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

5.3 OCA2基因敲除单细胞克隆株的筛选

5.3.1将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单克隆转移到100μL完全培养基的96孔板中；

5.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；

5.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中；

5.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

5.4 OCA2基因敲除的细胞鉴定

5.4.1将步骤5.3收集在1.5mL离心管中得到的细胞，然后在细胞中加入10μLKAPA2G裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存；

5.4.2采用前述针对OCA2基因E3引物OCA2-E3g-F1/OCA2-E3g-R473进行检测突变，PCR目的产物长度为519bp；

5.4.3使用PCR常规反应扩增OCA2靶点基因；

5.4.4将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图14，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收PCR扩增产物并测序。

5.4.5将测序结果与OCA2靶点信息进行比对，从而判断该重组细胞是否为OCA2基因敲除。

编号为5、7、8、14、16、17的单细胞克隆的基因型为双等位相同变异的纯合突变型。编号为6的单细胞克隆的基因型为双等位不同变异的纯合突变型。编号为2、3、13、15、19的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为1、4、9、10、11、12、18、20的单细胞克隆的基因型为纯合野生型。得到的OCA2基因编辑单细胞克隆的比率为60％。

示例性的测序比对结果如图15至图18，其中图15是克隆号为OCA2-1的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图16是克隆号为OCA2-5的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为双等位相同变异的纯合突变型；图17是克隆号为OCA2-2的正向测序与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变；图18是克隆号为OCA2-6的正向测序和反向测序同时与已公布序列的比对结果，判定为双等位不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，OCA2各单细胞克隆基因型如表1：

表1 OCA2基因敲除从江香猪成纤维细胞的单细胞克隆基因型鉴定

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> 用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

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caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720

ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900

cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960

caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020

gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560

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agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220

gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280

aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000

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cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480

ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720

caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780

tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840

tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900

gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960

tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020

tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080

gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140

cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860

gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280

tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175

<210> 5

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360

gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540

caccatggac tata 554

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120

ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180

caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240

cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300

catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360

ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420

gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447

<210> 7

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60

ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120

ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900

gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320

tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220

gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700

tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agttatggca gaactcagtg 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccgagtta tggcagaact cagtg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaccactga gttctgccat aactc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccccatccaa agtttttaaa gga 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtggcagat gtcacagttt agg 23

<210> 14

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 15

<211> 845

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 15

Met Arg Leu Glu Asn Arg Glu Gly Arg Pro Thr Ser Gly Val Leu Glu

1 5 10 15

Met Glu Leu Pro Gln Ala Ser Ala Pro Ser Arg Ala Gly Leu Gly Ser

20 25 30

Leu Gly Leu Val Gly Leu Asp Ser Ser Asn His Arg Pro Gln Gln Gly

35 40 45

Gly Ser Lys Ala Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Leu Ser Gly Ala Ala Gly

50 55 60

Gln Ser Cys Trp Val Pro Met Asp Gln Asp Phe Gly Pro Phe Leu Thr

65 70 75 80

Glu Arg Arg Ser His Cys Pro Phe Pro Lys His Phe Ser Ser Arg Ser

85 90 95

Lys Asp Pro Cys Phe Thr Glu Asn Thr Pro Leu Leu Gly Ser Phe Ser

100 105 110

Gln Glu Glu Gly Ser Arg Cys Met Pro Val Tyr His Pro Glu Phe Ile

115 120 125

Thr Ala Asp Glu Pro Trp Glu Asn Ser Ser Ala Glu Trp Glu Gly Gly

130 135 140

Ala Leu Leu Ser Thr Glu Leu Ala Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Thr

145 150 155 160

Glu Lys Gly Glu Leu Leu Asp Ser Ala His Ile Arg Cys His Leu Ser

165 170 175

Lys Leu Arg Cys Cys Val Gln Trp Leu Lys Val Ser Gly Leu Phe Val

180 185 190

Phe Val Val Leu Cys Ser Ile Leu Phe Ser Leu Tyr Pro Asp Gln Gly

195 200 205

Lys Phe Trp Gln Leu Leu Ala Val Ser Pro Leu Glu Ser Tyr Ser Val

210 215 220

Asn Leu Ser Ser His Ala Asp Ser Met Leu Leu Gln Val Asp Leu Ala

225 230 235 240

Gly Ala Leu Val Ala Ser Gly Pro Ser His Leu Gly Lys Glu Glu His

245 250 255

Val Ala Val Glu Val Thr Gln Ala Asn Ala Pro Gly Ser Arg Arg Arg

260 265 270

Arg Pro Gln Gln Val Thr His Asn Trp Thr Ile Phe Leu Asn Pro Ser

275 280 285

Gly Gly Glu His Thr Val Met Ser Arg Thr Phe Glu Val Leu Ser Arg

290 295 300

Glu Pro Val Ser Ile Asn Ile Arg Ala Ser Leu Gln Gln Thr Gln Ile

305 310 315 320

Val Pro Leu Leu Met Ala His Gln Tyr Leu Arg Ala Ser Ile Glu Ala

325 330 335

Gln Val Thr Ile Ala Ala Val Ile Leu Ala Gly Val Tyr Val Leu Ile

340 345 350

Ile Phe Glu Ile Val His Arg Thr Leu Ala Ala Met Leu Gly Ser Leu

355 360 365

Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Val Ile Gly Asp Arg Pro Thr Leu Thr

370 375 380

Gln Val Val Glu Trp Ile Asp Phe Glu Thr Leu Ala Leu Leu Phe Gly

385 390 395 400

Met Met Ile Leu Val Ala Ile Phe Ser Glu Thr Gly Phe Phe Asp Tyr

405 410 415

Cys Ala Val Lys Ala Tyr Gln Leu Ser Arg Gly Arg Val Trp Ala Met

420 425 430

Ile Ile Met Leu Cys Leu Ile Ala Ala Val Leu Ser Ala Phe Leu Asp

435 440 445

Asn Val Thr Thr Ala Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Ile Arg Leu Cys

450 455 460

Glu Val Leu Asn Leu Asp Pro Arg Gln Val Leu Ile Ala Glu Val Ile

465 470 475 480

Phe Thr Asn Ile Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ile Gly Asp Pro Pro Asn

485 490 495

Val Ile Ile Val Ser Asn Gln Glu Leu Arg Lys Met Gly Leu Asp Phe

500 505 510

Ala Gly Phe Thr Ala His Met Phe Ala Gly Ile Cys Phe Val Leu Leu

515 520 525

Phe Ser Phe Pro Leu Leu Arg Leu Leu Tyr Trp Asn Arg Lys Leu Tyr

530 535 540

Asn Lys Glu Pro Ser Glu Ile Val Glu Leu Lys His Glu Ile His Val

545 550 555 560

Trp Arg Leu Thr Ala Gln Arg Ile Ser Pro Ala Ser His Glu Glu Thr

565 570 575

Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Glu Lys Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu

580 585 590

Leu Ala Arg Arg Leu His Ser Phe His Arg Gln Ile Ser Gln Glu Asp

595 600 605

Lys Asn Trp Glu Thr Asn Ile Gln Glu Leu Gln Lys Lys His Arg Ile

610 615 620

Ser Asp Arg Thr Leu Leu Thr Lys Cys Val Thr Val Leu Gly Leu Val

625 630 635 640

Ile Phe Met Phe Phe Leu Asn Ser Phe Val Pro Gly Val His Leu Asp

645 650 655

Leu Gly Trp Ile Ala Ile Leu Gly Ala Ile Trp Leu Leu Ile Leu Ala

660 665 670

Asp Ile His Asp Phe Glu Ile Ile Leu His Arg Val Glu Trp Ala Thr

675 680 685

Leu Leu Phe Phe Ala Ala Leu Phe Ile Leu Met Glu Ala Leu Ala His

690 695 700

Leu His Leu Ile Glu Tyr Val Gly Glu Gln Thr Ala Leu Leu Ile Lys

705 710 715 720

Met Val Pro Glu Asp Gln Arg Leu Ala Ala Ala Ile Ile Val Val Val

725 730 735

Trp Val Ser Ala Ile Ala Ser Ser Leu Ile Asp Asn Ile Pro Phe Thr

740 745 750

Ala Thr Met Ile Pro Val Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Pro Glu Ile

755 760 765

Ser Leu Pro Ala Pro Pro Leu Met Tyr Ala Leu Ala Leu Gly Ala Cys

770 775 780

Leu Gly Gly Asn Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Ala Asn Val Val Cys

785 790 795 800

Ala Gly Ile Ala Glu Gln His Gly Tyr Gly Phe Ser Phe Met Glu Phe

805 810 815

Phe Arg Leu Gly Phe Pro Met Met Ile Val Ser Cys Met Val Gly Met

820 825 830

Cys Tyr Leu Leu Val Ala His Val Val Met Gly Trp Asn

835 840 845

<210> 16

<211> 1500

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 16

ataagtactg aaggagttgt tcagaagccc agggagtcaa ccaaaagtaa atggatgcat 60

ccacatggaa ttctgataaa agtttatgat tctccttgat tcatccttct aaatataagt 120

cctgtcttgg gcccatctaa tccagaacta atgttcccca ctcctgctca tgtttgtgtg 180

gatttttggt aagaaaccag gtagactacc tttcccacag ctccattaca gaaagatacc 240

tacacagagg aggaaaggct gagactactc actgtacttt ggggtgagta tagcagaacc 300

aggtattgag aactcagaga caatcaaaga gaaagcaaaa aatgaaatga gctggagctg 360

gtctcagctg gaaacagttc cagactcaga acaagctgat gtttcttgaa ggtctacaat 420

ttattttgaa gattgagtga tcccctggaa gatctccctc aggagccagg ggtctgtgat 480

gtcaagaaag actcactccc accagtttga cagtactacg gtgtctgtgg tcctatttca 540

tactcaccgc tatgatgaaa tgttgttttg gagatgctac tatttctgtg aaaataacca 600

caaagcctcg atttccaggt cacggtgcat gcctgtttac cgtccagagt tcatcactgc 660

tgatgaacct tgggagaaca gctcagctga gtgggaggga ggagccctgc tgagcacaga 720

gttggcagtt tcttctggat ctgcctccac agagaagggg gagcttctgg acagcgctca 780

catcaggtgc catctttcca agctaaggta ggaagacttg gagagccacc cttgacacag 840

ggctgagggt cttaccctca tgacatcctt accaaggaca gggtagaaat aaggaagaag 900

gctaggtagt actttactgg aaggtaatct tccttttctc caggtcctgg aagacagatc 960

taaggtatcc tgcaaaccag cgtgtagccc cagaggctac tagaagccca attacagacc 1020

aaaatgattc acatcctgta ttcctctcct tcctattgtg tggctgagat cacgcccatg 1080

aggtttgcta atggtattca ttcgtttcaa cagccttcgt ggtgttttag aagttggtat 1140

tagcagtgat tagaaggggt ctgcaacagg cggtggaaaa gttctttacc ggctgcaggg 1200

ggcgtgggtg gggctgcaag aggttacggc tacgcatgca gaggtgggtg cgcatgcgca 1260

ggggacctga gctctttttg tagagcgtgg tcagaatgtg ttcaccctgc tttgcccgct 1320

gggacttcca tgtgaccgtt tacgtgacgg aagggttctc ttgagatctg tgtttgaaag 1380

tggcatttcc aggaacagaa taaggcttgg ggaccaggac caccaaggtc cccattctgt 1440

atctaccctg aggtatctga ggacccagca gggccaggca tgtcctccgc aactatctcc 1500

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggggtctgt gatgtcaaga aag 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tacacgctgg tttgcaggat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序类(Artificial Sequence)

<400> 19

actacggtgt ctgtggtcct 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttggtaagga tgtcatgagg gta 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagaagctcc cccttctctg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcagctgagc tgttctccca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agctcagctg agtgggaggg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggagaacagc tcagctgagt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcatcactgc tgatgaacct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agccctgctg agcacagagt 20

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caccgcagaa gctccccctt ctctg 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaaccagaga agggggagct tctgc 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caccgtcagc tgagctgttc tccca 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aaactgggag aacagctcag ctgac 25

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caccgagctc agctgagtgg gaggg 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaacccctcc cactcagctg agctc 25

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

caccggagaa cagctcagct gagt 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aaacactcag ctgagctgtt ctcc 24

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caccgtcatc actgctgatg aacct 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aaacaggttc atcagcagtg atgac 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

caccgagccc tgctgagcac agagt 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaacactctg tgctcagcag ggctc 25

<210> 39

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cagaagcucc cccuucucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 40

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ucagcugagc uguucuccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 41

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

agcucagcug agugggaggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 42

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ggagaacagc ucagcugagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 43

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ucaucacugc ugaugaaccu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 44

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

agcccugcug agcacagagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims

1.一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪OCA2基因的gRNA表达载体；所述的针对猪OCA2基因的gRNA表达载体以全序列如SEQ IDNO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架，将SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG-U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.39所示的gRNA，该gRNA的靶点序列如SEQ IDNO.21所示；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体；所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为3:1。

2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在构建眼、皮肤白化病克隆猪核供体细胞中的应用。