CN104651399A - 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：构建Cas9真核表达载体；构建gRNA表达载体；将目的基因靶序列插入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入gRNA表达载体用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。本发明的方法具有更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用的优点。

Description

一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法。

背景技术

传统的基因打靶技术，通过构建同源打靶载体，依赖同源重组(HR)来实现对内源基因的定点敲除，其效率非常低，这极大地限制了各类动物模型的建立及分子机制的研究。ZFN的研究，是基因编辑技术的一场革命。ZFN通过特异性地切割DNA，造成DSBs，从而引发细胞自身DNA修复途径——非同源性末端连接(NHEJ)，NHEJ通过随机而的删除/插入(Indel)修复DNA，使得目的基因发生突变。ZFN将传统基因打靶的效率从10^-6提高至20％，但是其结构的特殊性，及其靶点筛选、载体构建的复杂性，限制其在大范围内的使用。TALEN是继ZFN后出现的又一种基因编辑技术，其以高效、构建简单、靶点选择范围广等特点，而备受研究人员的亲睐。

TALEN的出现，使得各种基因敲除的动物及细胞系迅速涌现。而研究人员一直致力于寻找一种更为简易的方法，应用于基因工程。2013年1月份，SCIENCE同时刊登了两篇关于CRISPR/Cas在基因敲除上的应用的文章，这种构建快速、结构简单，高效的分子工具很快便被大家所接受。拟南芥，果蝇，斑马鱼，老鼠，人的细胞等等，各种基因敲除的个体或者细胞如雨后春笋般涌现。

CRISPR/Cas系统如图1所示，主要包括两部分：Cas9蛋白和crRNA:tracrRNA。Cas9蛋白的作用主要是对DNA实行切割，造成DSBs；而crRNA:tracrRNA主要是特异性结合DNA，并引导Cas9对DNA进行切割。crRNA:tracrRNA经过改造，形成更容易构建的嵌合体RNA，也称引导RNA(Guide RNA，gRNA)而其效率并不受影响。这门技术已经越来越广泛地被大家所接受和利用。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：

(1)、构建Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS；

(2)、构建gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA；

(3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA中；

(4)、将步骤(1)构建的pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS和步骤(3)的产物用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。

上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其中，步骤(1)的具体过程为：合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS。

上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其中，步骤(2)的具体过程为：

(a)、合成gRNA，合成的两条DNA链，溶解后，各取5μL，再加入1μL 10×LA PCRBuffer(Takara)，混匀，95℃加热10min，然后置于室温1h，形成带有两个粘性末端的DNA双链；

(b)、pSicoR-GFP载体用XhoI和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将步骤(1)所得DNA双链克隆到pSicoR-GFP中，得到pSicoR-GFP-gRNA；

(c)、以pSicoR-GFP-gRNA为模板，以T7-gRNA_F、T7-gRNA_R为引物进行PCR反应；将PCR产物，克隆至pMD18-T载体，得到pMD18-T-T7-gRNA；将pMD18-T-T7-gRNA和pSicoR-GFP载体同时用XhoI和BamHI进行酶切，回收120bp和7.5kb的DNA条带，然后将回收的两段DNA进行连接；连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大培养，提取质粒pSicoR-GFP-T7-gRNA。

上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其中，步骤(3)中目标基因序列为ATATGGGAAAATTCCAGCCA，步骤(3)的具体过程为：

①、将目的基因靶序列退火组装成DNA双链；

②、再将pSicoR-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，反应体系为：pEASY-hU6-gRNA质粒2μg，10×NEBBuffer3 2μL，0.5μL BsmBI，加水至20μL，55℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20℃，备用；

③、将步骤①和②的产物进行连接，连接体系：1μL T4 ligase(Fermentas)，2μL 10×T4 ligase Buffer(Fermentas)，BsmBI酶切的pEASY-hU6-gRNA载体30ng，靶序列及其互补序列形成的双链DNA 5μL，加水至20μL，16℃过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒，得到将目的基因靶序列插入pSicoR-GFP-T7-gRNA后的载体。

本发明具有以下有益效果：

1、所针对的物种不同，猪等大家畜哺乳动物，其基因组比低等的模式生物更加复杂，所以相对来说，要得到基因敲除的细胞或者胚胎比较困难，目前利用CRISPR/Cas9系统在大家畜上应用的报道还比较少；

2、利用RGS-CR报告载体筛选有效的gRNA靶点序列，能够获得效果最佳的靶点序列，提高基因敲除的可行性；

3、突变检测的方法不同，一般文献所报道的检测CRISPR/Cas9系统引起的突变，都是利用T7核酸内切酶(T7E1)其价格比较昂贵，而利用本发明的检测方法，利用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用。

附图说明：

1、图1为CRISPR/Cas系统示意图；

2、图2为pCDNA3.1(+)-hSpCas9-NLS质粒结构示意图；

3、图3为pEASY-hU6-gRNA质粒结构示意图；

4、图4为pSicoR-GFP-T7-gRNA质粒结构示意图；

5、图5为1#靶点RGS-CR检测的荧光图；

6、图6为2#靶点RGS-CR检测的荧光图；

7、图7为单个胚胎PCR产物12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

8、图8为测序得到的靶基因的定点突变；

9、图9为单个胚胎PCR产物12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

10、图10为测序得到的靶基因的定点突变。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法作进一步的说明。

实验例1：一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法：

本发明提供了利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，通过将Cas9mRNA和特定的sgRNA注入猪的胚胎，得到基因突变的胚胎，包括以下步骤：

一、Cas9真核表达载体及嵌合体gRNA的构建：

1、Cas9真核表达载体的构建：

其中的Cas9是根据streptococcus pyogenes Cas9基因序列，进行人源密码子优化后，合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体，得到pCDNA3.1(+)-hSpCas9-NLS(结构示意图如图2所示)；本实施例中的pCDNA3.1(+)-hSpCas9-NLS由北京唯尚立德生物科技有限公司惠赠或从该公司购买获得；

2、嵌合体gRNA的构建：

(1)、将102bp的gRNA序列，及其互补链，gRNA序列及其互补链中均包括3’端的转录终止信号，两端分别包括XhoI和BamHI粘性末端(在gRNA合成时自动形成)，另外，在gRNA 5’端引入两个BsmBI酶切位点，用于靶序列的插入，送至生工生物工程(上海)股份有限责任公司合成，其中102bp的gRNA序列如SEQ No.ID1所示，其互补序列如SEQ No.ID2所示；

gRNA合成之后进行退火，得到DNA双链，将DNA双链克隆至pSicoR-GFP；具体步骤为：将合成的两条DNA链，溶解后，各取5μL，再加入1μL 10×LA PCR Buffer(Takara)，混匀，95℃加热10min，然后置于室温1h，形成带有两个粘性末端的DNA双链。将pSicoR-GFP载体用XhoI和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将gRNA双链克隆到pSicoR-GFP中，命名为pSicoR-GFP-gRNA。这一步的目的主要是为了获得大量的gRNA片段，使后面将hU6与gRNA连接在一起更为简单。

(2)、以人的基因组为模板，利用引物hU6_F(SEQ No.ID3所示)和hU6_R(SEQ No.ID4所示)，进行第一次PCR反应得到人的U6启动子序列，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到约250bp的DNA条带即为人的U6启动子序列；其中

PCR反应体系为：2×Premix LA Taq(Takara)10μL，hU6_F、hU6_R各1μL，人的基因组DNA 100ng，加超纯水至20μL；

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，再延伸3min；4℃终止反应；

(3)、然后以pSicoR-GFP-gRNA为模板，以gRNA_F(SEQ No.ID5所示)、gRNA_R(SEQNo.ID6所示)为引物，进行第二次PCR反应得到gRNA DNA片段；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到约100bp的DNA条带即为gRNA；其中

PCR反应体系为：2×Premix LA Taq(Takara)10μL，gRNA_F、gRNA_R各1μL，质粒pSicoR-GFP-gRNA 30ng，加超纯水至20μL；

PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸20sec，35个循环，再延伸3min，4℃终止反应；

(4)、以hU6_F和gRNA_R为引物，以步骤(2)和(3)的PCR产物为模板，各1μL，通过重叠PCR，将人的U6启动子和gRNA连接在一起，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到350bp的DNA片段(该片段即为hU6-gRNA，序列如SEQ No.ID7所示)，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根公司)回收，测定浓度，-20℃保存，备用；其中

反应体系为：2×Premix LA Taq(Takara)10μL，引物hU6_F和gRNA_R各1μL，步骤(2)和(3)的PCR产物各1μL，加超纯水至20μL；

反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸50sec，35个循环，再延伸5min，4℃终止反应；

(5)、按照全式金生物技术有限公司pEASY-T1克隆载体的使用说明书的步骤将步骤(4)得到的人的U6启动子和gRNA连接在一起的DNA片段克隆到pEASY-T1克隆载体中，得到pEASY-hU6-gRNA(结构示意图如图3所示)；

具体步骤：将1μL的pEASY-T1载体，加入4μL的纯化的DNA片段，25℃反应15min，再进行转化，将细菌扩大培养后，提取质粒，对质粒进行测序，确定人的hU6启动子和gRNA连接在一起；

3、为了体外转录得到gRNA的单链gRNA(sgRNA)序列，将gRNA克隆到pSicoR-GFP中，在gRNA5’端插入一段T7启动子序列，将gRNA 3’端转录终止信号换成限制性内切酶PsiI位点，命名为pSicoR-GFP-T7-gRNA(结构示意图如图4所示)。(pSicoR-GFP-T7-gRNA在gRNA的5’，加入了一个T7启动子，用于体外转录。)具体步骤为：

(1)、利用引物，T7-gRNA_F，和T7-gRNA_R引物序列分别为5’-CTCGAGTAATACGACTCACTATAGGAGAGACGGACGTCTCAGTT-3’(SEQ No.ID8所示，引物5’包括一个XhoI酶切位点)和5’-GGATCCTTATAAAGCACCGACTCGGTGCCA-3’(SEQNo.ID9所示，引物3’含有一个BamHI酶切位点和PsiI酶切位点),以pSicoR-GFP-gRNA为模板，进行PCR，得到T7-gRNA(序列如SEQ No.ID10)；

PCR体系：1010μL 2×Premix LA Taq(Takara)，上下游引物各1μL，模板0.3μL；

反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃退火30sec,72℃延伸30sec，72℃再延伸3min，4℃终止反应；

(2)、将PCR产物，克隆至pMD18-T载体，得到pMD18-T-T7-gRNA，并进行测序；

(3)、将pMD18-T-T7-gRNA和pSicoR-GFP载体同时用XhoI和BamHI进行酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，并利用天根胶回收试剂盒回收目的片段，pMD18-T-T7-gRNA和pSicoR-GFP分贝回收120bp和7.5kb的DNA条带。然后将回收的两段DNA进行连接，连接体系及条件根据Fermentas DNA T4Ligase kit说明书进行操作。将连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大培养，提取质粒pSicoR-GFP-T7-gRNA，再进行测序，测序正确后，用于下一步实验。

二、目的基因靶序列的确定及在293T细胞中目的基因不同靶序列活性的筛选(针对同一基因设计不同的靶序列，在多条靶序列中，筛选出效率最高的一条靶序列)：

(a)、在目的基因的外显子序列中，找到N₍₂₀₎NGG特征序列，N₍₂₀₎即为目的基因的靶点序列。本发明中选择的是猪的GDF8基因，1#靶点序列为5’-ATCAAAGCTTTAGATGAGAA-3’(SEQ No.ID11)；2#靶点序列为5’-ATATGGGAAAATTCCAGCCA-3’(SEQ No.ID12)。1#靶点序列的RGS-CR报告载体(购自于ToolGen)序列为5’-ATCAAAGCTTTAGATGAGAATGG(PAM)-3’(SEQ No.ID13)，命名为1#RGS；2#靶点序列的RGS-CR报告载体(购自于ToolGen)序列为5’-ATATGGGAAAATTCCAGCCATGG(PAM)-3’(SEQ No.ID14)，命名为2#RGS；

(b)、将1#靶点序列连同限制性内切酶BsmBI 4个碱基的粘性末端5’-ACCGATCAAAGCTTTAGATGAGAA-3’(SEQ No.ID15)及其互补序列连同限制性内切酶BsmBI 4个碱基的粘性末端5’-AAACTTCTCATCTAAAGCTTTGAT-3’(SEQ No.ID16)，以及2#靶点序列连同限制性内切酶BsmBI 4个碱基的粘性末端5’-ACCGATATGGGAAGATTCCAGCCA-3’(SEQ No.ID27)及其互补序列连同限制性内切酶BsmBI 4个碱基的粘性末端5’-AAACTGGCTGGAATCTTCCCATAT-3’(SEQ No.ID28)送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

合成的靶序列及其互补序列分别用水溶解，浓度为100mM/mL；分别取100mM/mL的靶序列和互补序列各5μL置于200μL的PCR反应管，再加入1μL的2×LA Taq PCR Buffer(Takara)，然后将PCR反应管置于PCR仪，95℃加热10min，再在室温条件下静止1h，使靶序列及其互补序列通过碱基互补配对，形成DNA双链，然后置于4℃备用；

将pEASY-hU6-gRNA载体用限制性内切酶BsmBI(NEB)酶切，反应体系为：pEASY-hU6-gRNA质粒2μg，10×NEBBuffer3 2μL，0.5μL BsmBI，加水至20μL，55℃孵育3h。孵育后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，分离目的片段，约4000bp，将目的DNA片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)回收，用微量紫外分光光度计测定浓度，存于-20℃备用；

将靶序列及其互补序列形成的双链DNA克隆至经限制性内切酶BsmBI酶切的pEASY-hU6-gRNA载体中，连接体系：1μL T4 ligase(Fermentas)，2μL 10×T4 ligase Buffer(Fermentas)，BsmBI酶切的pEASY-hU6-gRNA载体30ng，靶序列及其互补序列形成的双链DNA 5μL，加水至20μL，16℃过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒，再进行测序；

构建好的靶序列1#和2#的gRNA表达载体分别命名为pEASY-hU6-gRNA 1#和pEASY-hU6-gRNA 2#。

(c)、将1#和2#靶点的RGS报告载体序列1#RGS和2#RGS及他们的互补序列连同限制性内切酶EcoRI和BamHI的四个碱基的粘性末端送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，1#RGS序列连同EcoRI的粘性末端序列为5’-AATTCATCAAAGCTTTAGATGAGAATGG(PAM)-3’(SEQ No.ID17),其互补序列连同BamHI粘性末端序列为5’-GATCCCATTCTCATCTAAAGCTTTGATG-3’(SEQ No.ID18)；2#RGS序列连同EcoRI的粘性末端序列为5’-AATTCATATGGGAAAATTCCAGCCATGG(PAM)-3’(SEQ No.ID19),其互补序列连同BamHI粘性末端序列为5’-GATCCGATCC CATGGCTGGAATCTTCCCATATG-3’(SEQ No.ID20)；

序列合成后，溶解，并处理合成双链DNA，4℃保存，备用，处理方法同上述步骤(b)，然后将RGS-CR报告载体用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，酶切体系为：RGS-CR载体2μg，EcoRI和BamHI(Fermentas)各0.5μL，10×Tango Buffer 2μL，加水至20μL，37℃消化3h。酶切消化后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约5400bp的目的DNA片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)回收，并用紫外分光光度计测定浓度，-20℃保存备用；

将1#RGS和2#RGS的DNA双链克隆至RGS-CR载体，连接方法及体系同上述步骤(b)。将最终得到的载体分别命名为1#RGS-CR和2#RGS-CR。

(d)、载体构建完成后，将pCDNA-hSpCas9-NLS表达载体、pEASY-hU6-gRNA 1#、1#RGS-CR和pCDNA-hSpCas9-NLS表达载体、pEASY-hU6-gRNA 2#、2#RGS-CR，分别共转293T细胞，同时将没有靶序列的pEASY-hU6-gRNA分别与pCDNA-hSpCas9-NLS、1#RGS-CR及pCDNA-hSpCas9-NLS、2#RGS-CR共转作为阴性对照。转染过程，首先将293T细胞传至5个35mm的培养皿，待其汇合度生长至70～80％的时候进行转染。取5个1.5ml的离心管，编号为1～5，每个管分别加入200μL的含10％FBS的DMEM，在添加质粒。1号管的质粒为pCDNA-hSpCas9-NLS表达载体1μg、pEASY-hU6-gRNA 1#0.5μg、1#RGS-CR0.5μg；2号管的质粒为pCDNA-hSpCas9-NLS表达载体1μg、pEASY-hU6-gRNA0.5μg、1#RGS-CR0.5μg；3号管的质粒为pCDNA-hSpCas9-NLS表达载体1μg、pEASY-hU6-gRNA 2#0.5μg、2#RGS-CR0.5μg；4号管的质粒为pCDNA-hSpCas9-NLS表达载体1μg、pEASY-hU6-gRNA 0.5μg、2#RGS-CR0.5μg，5号管不添加质粒。质粒添加完之后，分别在5个管中加入4μL的罗氏转染试剂，混匀，室温静止15min后，将混合液分别加入5个35mm的培养皿，再放入37℃、5％CO₂培养箱，转染后24h换液，48h观察荧光表达情况(附图5和附图6)。荧光显示，pEASY-hU6-gRNA2#的绿色荧光的表达明显多于pEASY-hU6-gRNA1#，也就是说pEASY-hU6-gRNA2#更能有效地引起DSBs，造成基因突变，所以在这里选择2#靶点序列继续后面的实验。(pCDNA-hSpCas9-NLS和pEASY-hU6-gRNA载体由前面步骤所构建，RGS-CR报告载体购自与ToolGen)

三、将Cas9mRNA和sgRNA注入猪的胚胎实行基因敲除：

(ⅰ)将之前合成的带有BsmBI粘性末端的2#靶点序列退火组装成DNA双链，方法同步骤(b)；

(ⅱ)、再将pSicoR-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，反应体系及方法同步骤(b)。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20℃，备用；

(ⅲ)、将步骤(ⅰ)和(ⅱ)的产物进行连接，连接与转化体系同步骤(b)，将克隆的到的载体命名为pSicoR-GFP-T7-gRNA2#；

(ⅳ)、用限制性内切酶DraIII和PsiI分别将pCDNA-hSpCas9-NLS质粒和pSicoR-GFP-T7-gRNA2#质粒线性化；其中，

pCDNA-hSpCas9-NLS质粒的酶切反应体系为：pCDNA-hSpCas9-NLS质粒10μg，限制性内切酶DraIII 5μL(Fermentas)，10×Buffer G 10μL，加超纯水至100μL；酶切反应条件为37℃反应6h；

pSicoR-GFP-T7-gRNA2#质粒的酶切反应体系为pSicoR-GFP-T7-gRNA2#质粒10μg，限制性内切酶PsiI(NEB)5μL，10×CutSmart Buffer 10μL，加超纯水至100μL，酶切反应条件为37℃反应6h；

(ⅴ)、将线性化的质粒经过乙醇沉淀后，用于体外转录；乙醇沉淀步骤：在酶切产物中，加入0.1倍体积的醋酸钠(3M，PH＝5.2)，混匀；再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于-20℃30min；12,000×g离心10min，去除上清，加入1ml 70％乙醇，12,000g离心2min，去除上清，置于超净工作台风干，加超纯水溶解4h以上，备用；

再用体外转录试剂盒mMESSAGET7Kit(Ambion)和MEGAshortscript^TM T7 Kit(Ambion)，根据试剂盒提供的操作步骤，分别体外转录得到Cas9的mRNA及gRNA的sgRNA。以Cas9：gRNA＝100:50的比例，将二者的混合物注入孤雌激活胚胎和IVF胚胎。共注射孤雌胚胎80个，注射IVF胚胎52个。

四、突变胚胎的检测：

此步主要是检测CRISPR/Cas系统介导的猪胚胎GDF8基因的敲除效率，具体步骤为：

注射Cas9-gRNA mRNA和sgRNA的胚胎，培养7天后，将发生卵裂的胚胎，单个分别放入装有8μL纯水的PCR管中，利用巢式PCR，扩增靶点附近～300bp的DNA片段；

巢式反应的步骤为：

第一次PCR反应体系：10μL 2×Premix LA Taq(Takara)，上下游引物各1μL。反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃退火30sec,72℃延伸30sec，72℃再延伸3min，4℃终止反应。

第二次PCR取第一次PCR产物1μL，第二次PCR引物上下游各1μL，10μL2×PremixLA Taq(Takara)，加水至20μL，反应程序与第一次PCR程序一致。所用引物如下：

序列21：TTTTGGATGGGACTGGATTATT(SEQ No.ID21)

序列22：TTATTGTATGATTTGTTTTGATGGT(SEQ No.ID22)

序列23：TGGATGGGACTGGATTATTGC(SEQ No.ID23)

序列24：GCCAACCATTGCATATATTCTCT(SEQ No.ID24)

序列25：CAAAAATACCCTCACACTCATCT(SEQ No.ID25)

序列26：AAGTGACTGTAGCATACTCCAGG(SEQ No.ID26)

巢式反应的步骤步骤中，孤雌激活的胚胎检测时第一次PCR反应的上游引物为序列21、下游引物为序列22；第二次PCR反应的上游引物为序列23、下游引物为序列24；

IVF胚胎检测时第一次PCR反应的上游引物为序列23、下游引物为序列24；第二次PCR反应的上游引物为序列25、下游引物为序列26。孤雌激活胚胎和IVF胚胎两次检测的反应体系及程序除引物不同外，其余均一样。

取上述巢式PCR反应的5μL PCR产物，直接用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压150V，时间约2h。在PCR过程当中，当有野生型和突变型两种模板链存在的情况下，最后得到的PCR产物，有一部分会形成杂合链，杂合链有一定的高级结构，这使得其在电泳过程中，其迁移的速率比纯合链要慢，利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以分辨出杂合链，从而鉴定是否有突变发生。将疑似突变的PCR产物，回收，连接，转化，挑取单克隆，进行测序。共收集检测80个孤雌激活的胚胎，突变3个，突变率为3.75％。检测了52个IVF胚胎，突变12个，突变率为23％。

Cas9-gRNA mRNA注射孤雌激活胚胎突变检测结果见图7和图8，其中图7为单个胚胎PCR产物12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图8为测序得到的靶基因的定点突变。

Cas9-gRNA mRNA注射IVF胚胎突变检测结果见图9和图10，其中图9为单个胚胎PCR产物12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图10为测序得到的靶基因的定点突变。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：

(1)、构建Cas9真核表达载体pCDNA3.1-hCas9-NLS；

(2)、构建gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA；

(3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA中；

(4)、将步骤(1)构建的pCDNA3.1-hCas9-NLS和步骤(3)的产物用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其特征在于：步骤(1)的具体过程为：合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3.1真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3.1-hCas9-NLS。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其特征在于，步骤(2)的具体过程为：

(a)、合成gRNA，合成的两条DNA链，溶解后，各取5μL，再加入1μL 10×LA PCRBuffer(Takara)，混匀，95℃加热10min，然后置于室温1h，形成带有两个粘性末端的DNA双链；

(b)、pSicoR-GFP载体用XhoI和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将步骤(1)所得DNA双链克隆到pSicoR-GFP中，得到pSicoR-GFP-gRNA；

(c)、以pSicoR-GFP-gRNA为模板，以T7-gRNA_F、T7-gRNA_R为引物进行PCR反应；将PCR产物，克隆至pMD18-T载体，得到pMD18-T-T7-gRNA；将pMD18-T-T7-gRNA和pSicoR-GFP载体同时用XhoI和BamHI进行酶切，回收120bp和7.5kb的DNA条带，然后将回收的两段DNA进行连接；连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大培养，提取质粒pSicoR-GFP-T7-gRNA。

4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其特征在于，步骤(3)中目标基因序列为ATATGGGAAAATTCCAGCCA，步骤(3)的具体过程为：

①、将目的基因靶序列退火组装成DNA双链；

②、再将pSicoR-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，反应体系为：pEASY-hU6-gRNA质粒2μg，10×NEBBuffer3 2μL，0.5μL BsmBI，加水至20μL，55℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20℃，备用；

③、将步骤①和②的产物进行连接，连接体系：1μL T4 ligase(Fermentas)，2μL 10×T4 ligase Buffer(Fermentas)，BsmBI酶切的pEASY-hU6-gRNA载体30ng，靶序列及其互补序列形成的双链DNA 5μL，加水至20μL，16℃过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒，得到将目的基因靶序列插入pSicoR-GFP-T7-gRNA后的载体。