CN108778343A - 利用cpf1进行rna向导的基因编辑的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

组合物包含Cpf1家族(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)的内切核酸酶；以及至少一个与基因中的靶序列互补的指导RNA(gRNA)，以在体外或体内将Cpf1内切核酸酶特异地引导至宿主细胞中的靶位点。治疗受试者的方法包括使用一种或多种此等组合物。

Description

利用CPF1进行RNA向导的基因编辑的方法和组合物
关于联邦资助的研究之声明
此项发明根据授权号R01MH093271，R01NS087971及国立卫生研究院授予的P30MH092177在美国政府支持下完成，美国政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明涉及用于在特定靶位点切割DNA的组合物及方法，以实现基因编辑。该组合物包含Cpf1家族(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)的内切核酸酶；以及至少一个与DNA中的靶序列互补的指导RNA(gRNA)，以将Cpf1内切核酸酶引导至宿主细胞中的靶位点，例如与整合在宿主细胞基因组中的HIV-1前病毒DNA相关的位点。
背景技术
于基因编辑的领域已取得极大的进展。近十年内用于基因编辑已被引入更准确和更简单的改进方法。一项重大创新是为称为CRISPR/Cas9(CRISPR，成簇规律间隔的短回文重复序列；Cas9，CRISPR相关蛋白9)的基因编辑系统的引进。CRISPR/Cas9系统最初被发现为某些细菌物种使用的抗病毒防御机制，以识别和切割噬菌体病毒的特征性DNA序列。CRISPR/Cas9系统已在广泛的生物体中操纵以执行基因编辑功能，所述生物体包含有酵母，果蝇，斑马鱼，C.线虫和小鼠，并已被多个实验室广泛用于对于人类疾病的体外和体内研究(Di Carlo J.E.等，Nucl Acids Res 41：4336-4346(2013)；Gratz S.J.等，Genetics 194,1029-1035(2013)；Hwang W.Y.等，Nature Biotech 31，227-229(2013)；Yu L.等人，OncoTargets Ther 8,37-44(2015)；Hu W.等人，Proc Natl Acad Sci USA 111,11461-11466(2014))。
于CRISPR/Cas9系统中，组装成基因编辑复合物。每个复合物都含有Cas9核酸酶及与于靶DNA中的靶序列互补的指导RNA(gRNA)。gRNA将Cas9核酸酶引导于靶序列处或附近接合并切割靶DNA。在没有进一步干预的情况下，切割产生钝双链断裂触发修复酶以重新连接或置换于切割位点处或附近的DNA序列。此等修复通常是有缺陷的，导致靶DNA的一个或多个突变，如核苷酸置换，插入和缺失。突变可以包含切除长链DNA，特别是当多个靶位点被同时切割时。若于编辑过程中导入所需DNA片段的复本，则可通过称为同源定向修复(HDR)的过程将它们拼接至切割位点(Sander J.D.和Joung L.K.，Nature Biotech 32,347-355(2014))。
近来，CRISPR/Cas9系统已进行修改，以能识别并切割复数个整合至人类基因组中的逆转录病毒的靶序列。HIV-1前病毒基因组是主要目标，因其HIV-1前病毒基因组整合至宿主T细胞中即代表潜伏性感染，所述的潜伏性感染可被激活以触发艾滋病症状。gRNA已开发用以识别位于HIV-1长末端重复(LTR)序列内的DNA序列。透过于CRISPR/Cas9系统中使用此等RNA，整合的HIV-1序列在人类T细胞，小神经胶质细胞和单核细胞中被失活且在大多数情况下完全根除。当以LTR中的不同位点的每个靶向使用至少两种gRNA产生最有效的切除。
CRISPR/Cas9组分的稳定表达赋予人类T细胞中进一步感染的抗性(Hu W.等，ProcNatl Acad Sci USA 111,11461-11466(2014)；Khalili等，2015，International Khalili等人的专利申请号WO2015/031775)。CRISPR/Cas系统也被开发用于使人类神经性JC病毒(JCV)失活。这种人类多瘤病毒感染神经系统细胞，引起致命的脱髓鞘性病变(WolleboH.S.等，Ann.Neurol.77：560-570(2015))。
CRISPR/Cas9系统有许多附加的用途。例如，至少一种人类遗传疾病已通过使用CRISPR/Cas9在动物模型中治愈。遗传性酪氨酸血症I型(HTI)是由延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)点突变所引起的致命遗传疾病，其中，该延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)是为一种蛋白质代谢必需的酶。单个NT的点突变引起该疾病。gRNA被设计为在含有突变的DNA片段邻近处引起双链断裂。将gRNA及Cas9注射入小鼠，以及编码与正常FAH基因相同的片段的199核苷酸单链供体DNA。藉由同源定向修复(HDR)，供体DNA被成功拼接以取代突变DNA。小鼠的肝细胞恢复其正常功能，小鼠亦治好了HTI(Yin H.等，Nature Biotech 32,551-554(2014))。
在另一个例子中，CRISPR/Cas9系统可以适用于将可侦测标记(例如荧光标记)附着到基因组中的特定靶位点。此应用程序可用于靶位点的荧光成像，该靶位点如HIV前病毒整合位点及反转录转座子。该应用程序也可用于全基因组测序技术(如该些采用IRYS单分子DNA测绘系统的技术)标记多个DNA基序。于此等标记系统中，使用催化缺陷型Cas9。该催化缺陷型Cas9能与gRNA形成一复合物，并与靶位点结合，但不能在该位点处切割DNA。通常用如扩展绿色荧光蛋白(EGFP)及/或红色荧光蛋白(RFP)等荧光蛋白标记催化缺陷型Cas9。该Cas9/gRNA复合物是定位于靶位点，并以荧光标记标记该位点。
遗憾的是，该CRISPR/Cas9系统存在限制其潜力的缺点。此等缺点大多是在多数系统中使用的化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9内切核酸酶中固有的。该Cas9内切核酸酶只能连接并切割与称为PAM(原型间隔区相邻基序)的短自然发生序列相邻的靶DNA序列。PAM通常包含三核苷酸NGG。因此，CRISPR/Cas9系统之用途限于与NGG PAM相邻的靶序列。
此外，Cas9是于双链DNA的两条链中的相同位点处切割，产生与“钝端”的断裂。该钝端不利于在切割位点精确插入所需的DNA序列。优选为交错切割，是于每条链中留下“单链突出端”。
Cas9的另一个缺点是其体积相对较大，难以渗入活细胞的细胞核内。最后，CRISPR/Cas9系统虽然比现有技术的系统更简单和更易于使用，但仍然很复杂。该gRNA实际上由两个较小的RNA的双链体组成，是为：成熟的CRISPR RNA(crRNA)及反式激活的小RNA(tracrRNA)。
基因编辑系统非常需要扩展潜在DNA靶位点的全部内容(repertiore)。特别是，亟需一种利于所需基因插入的基因编辑系统，并提供比CRISPR/Cas9系统更小，更简单的基因编辑复合体。
发明内容
本发明提供用于使宿主细胞基因组中的靶基因失活的组合物。该组合物包含编码Cpf1(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列，以及与靶基因中的靶DNA序列相互补的至少一种指导RNA(gRNA)。该gRNA将Cpfl内切核酸酶导向靶DNA序列。透过点突变引起、插入、缺失或完全切除含有靶基因的DNA片段，于DNA中产生双链断裂而使靶基因失活。本发明还提供使用此等组合物以使靶基因失活的方法。
本发明进一步提供用于使宿主细胞基因组中整合的病毒DNA失活的组合物。该组合物包含编码Cpf1内切核酸酶的单离核酸序列及至少一个与前病毒DNA中的靶DNA序列相互补的指导gRNA。在一些具体实施例中，靶序列是位于HIV的长末端重复序列(LTR)中，如HIV-1前病毒DNA。本发明还提供了使用此等组合物以使整合的病毒失活的方法。
本发明亦提供了用于使宿主细胞的基因组中的靶基因失活的表达载体。该载体诱导至少一种Cpf1内切核酸酶及至少一种与靶基因中的靶序列相互补的gRNA的表达。又尤以慢病毒表达载体为优选的载体。
本发明更提供预防有病毒感染风险的患者的宿主细胞的病毒感染的方法。该方法包含在宿主细胞中建立Cpfl内切核酸酶及至少一种与病毒基因组中的靶序列相互补的gRNA的稳定表达。HIV-1感染是为一例示性的病毒感染。
本发明还进一步提供用于使哺乳动物受试者细胞中的前病毒失活的药物组合物。该组合物包含编码Cpf1内切核酸酶的核酸序列，以及至少一种与前病毒DNA中的靶序列相互补的gRNA。于至少一个表达载体中是包含该单离核酸序列。本发明还提供使用此等药物组合物以使宿主细胞中的前病毒失活的方法。
本发明还提供了修正细胞中遗传疾病的方法。该方法可以应用于任何细胞，其细胞的DNA包含致病突变DNA序列。于此等方法中，该细胞被暴露于至少一种与致病性突变DNA序列邻近的靶位点相互补的gRNA。该gRNA导引Cpf1内切核酸酶以引起邻近靶位点的双链断裂。然后，将细胞暴露于单链供体寡核苷酸，该单链供体寡核苷酸包含对应于致病突变DNA序列的野生型DNA序列。以野生型DNA序列取代突变DNA序列，以及修正遗传疾病。
本发明还进一步提供用于侦测具有可侦测标记(例如荧光标记)的特定DNA序列的方法，达到诊断和基因组分析的目的。所述方法包含用具有切口酶活性的Cpfl突变体在DNA中靶位点切割，并在带切口的位点导入标记的核苷酸。
为了诊断和基因组分析的目的，本发明亦提供用于侦测特定DNA序列的组合物。该组合物包含催化缺陷的Cpf1，其可以gRNA导向特定的DNA序列，但不能在该序列处切割DNA。例如用荧光标签标记催化缺陷型Cpfl，导致标记特定的DNA序列。
本发明的所有组合物，所述的所有组合物皆含有CRISPR/Cpfl系统，理所当然能与CRISPR/Cas9系统组合，以获得Cpfl和Cas9内切核酸酶二者的益处。
于以下附图及叙述中阐述本发明的一个或多个具体实施例的细节。由说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征，目的及优点将会变得显而易见。
附图说明
于以下附图及叙述中阐述本发明的一个或多个具体实施例的细节。由说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征，目的及优点将会变得显而易见。
图1显示作用于靶DNA序列的Cpf1/gRNA复合物的示意图。
具体实施方式
本发明部分是基于细菌性CRISPR系统的发现，所述的细菌性CRISPR系统是利用不同于Cas9的内切核酸酶，且此等核酸酶中的部分可作为CRISPR系统中Cas9的替代方案，有时为优选替代方案。内切核酸酶家族Cpfl(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)的某些成员具有特殊的潜力(Zetsche等，2015)。到目前为止，已经证明两种Cpfl内切核酸酶于经培育的人类肾细胞系统的基因编辑是有效的，分别为：氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpf1及柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceaebacterium)ND2006 Cpfl。图1是绘示gRNA/Cpfl复合物的示意图。
定义
除非另有所指，否则本文使用的所有技术及科学术语皆具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在实务上用于本发明的测试可以使用与本文所述相似或等同的任何方法及材料，但仍优选本文所述的材料和方法。于叙述及要求本发明权利范围时使用底下术语。
应理解的是，于此使用的术语仅为用于描述特定实施例的目的，而非限制性。
于本文揭露的所有基因，基因名称及基因产物旨在对应于来自任何物种的同是物，该任何物种是指于本文揭露的组合物及方法所适用的任何物种。应理解的是，当揭露来自特定物种的基因或基因产物时，本揭露仅旨在作为示例，非作为限制，除非于其上下文清楚地表明。因此，举例言之，对于于本文揭露的基因或基因产物而言，意图涵盖来自其他物种的同源及/或种间同源的基因和基因产物。
本文所用的冠词“一(a)”和“一(an)”意指为该物品的语法对象的“一个”或“多于一个”(亦即，至少一个)。举例言之，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。因此，例如“一细胞”的叙述是包含多个相同类型的细胞。再者，于具体实施方式及/或权利要求书中使用术语“包含(including)”、“包含(includes)”、“具(having)”、“具(has)”、“具有”或其变化形式而言，此类术语旨在以类似于术语“包括”的方式包含。
如本文所述，关于项目、组成、装置、方法、过程、系统等的定义或描述的要素的术语“包括(comprising)”、“包括(comprise)”或“包括(comprised)”及其变体意味着是包含性的或开放式，即允许附加组件，由此表明，所定义或描述的项目、组成、设备、方法、过程、系统等包括该些指定的组件─或其合适物、相等物─以及可包括其他组件，且仍在所定义的项目、组成、设备、方法、过程、系统等的范围/定义内。
当涉及如量、持续时间等的可测量值时，本文所述的“约”意味着涵盖自特定值+/-20％、+/-10％、+/-5％、+/-1％或+/-0.1％的变化，如此变化是适于执行本揭露的方法。此外，特别是生物系统或过程，该术语可意指在数值的5倍以内及2倍以内。若于申请书及权利要求书中描述特定值，除非另有说明，否则应假定术语“约”在特定值的可接受的误差范围内。
如本文所用的术语“抗病毒剂”是指用于治疗病毒的任何分子，且包含减轻与病毒相关之任何症状的诸类试剂，如抗发热剂、抗炎剂、化学治疗剂、抗发热剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗寄生物剂、化学治疗剂、抗生素、免疫调节剂等。抗病毒剂包含，但不限于，：抗体、适配体、佐剂、反义寡核苷酸、趋化因子、细胞因子、免疫刺激剂、免疫调节剂、B细胞调节剂、T细胞调节剂、NK细胞调节剂、抗原呈递细胞调节剂、酶、siRNA、利巴韦林、核酶、蛋白酶抑制剂、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、嘌呤核苷、趋化因子受体拮抗剂、白细胞介素或其组合。免疫调节剂包括但不限于细胞因子、淋巴因子、T细胞共刺激配体、趋化因子、佐剂等。
如本文所用的术语“抗体”包括一个或多个病毒特异性结合域，其病毒特异性结合域结合并帮助病毒(如HIV)的免疫介导的破坏及清除。该抗体或其片段包含IgA、IgM、IgG、IgE、IgD或其组合。
如本文所用的术语“根除”病毒(如HIV)，意指病毒不能复制，即基因组被删除、片段化、降解、遗传失活或任何其他物理、生物、化学或结构表现，其阻止病毒传播或感染任何其他细胞或受试者导致体内该病毒的清除。于某些情况下，病毒基因组的片段是能可侦测的，但病毒不能复制或感染等。
如本文所用的“有效量”意指提供治疗或预防性益处的量。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸特定序列的固有性质，以作为用于在生物过程中其他聚合物及高分子的合成的模板，其具有明确的核苷酸序列(亦即，rRNA，tRNA和mRNA)或明确的氨基酸序列及由此而生的生物学特性。因此，若对应于在细胞或其他生物系统中该基因产生蛋白质的mRNA的转录和翻译，一基因是编码一蛋白质。所述编码链、与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列及用作基因或cDNA转录模板的非编码链，是皆可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
术语“外源的”表示该核酸或该多肽是重组核酸构建体的一部分、或由重组核酸构建体编码、或不在其天然环境中。举例言之，外源核酸是可来自导入另一物种的一种物种的序列，亦即异源核酸。通常，藉由重组核酸构建体将此类外源核酸是导入至其他物种中。外源核酸也可为一序列，该序列对生物体是原生的且已被重新导入到该生物体的细胞中。包含原生序列的外源核酸通常可通过与外源核酸连接的非自然序列的存在区别自然发生序列，例如于重组核酸构建体中原生序列旁侧的非原生调控序列。此外，稳定转化的外源核酸典型地整合于不同于所发现的原生序列处的位置。
如本文所用的术语“表达”是定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录及/或翻译。
“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用组件；用于表达的其他组件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包含本领域所周知的所有该些，如粘粒、质粒(如裸露的或含于脂质体中的)及导入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺伴随病毒)。
术语“免疫调节”或“免疫细胞调节剂”或“免疫调节剂”意指免疫原性(亦即刺激或增加免疫应答)或免疫抑制(亦即减少或抑制免疫应答)的化合物、组合物或物质。“免疫系统的细胞”或“免疫细胞”意指包含免疫系统的任何细胞，其可以被分析或参与免疫应答，包含，但不限于，B淋巴细胞(也称为B细胞)、T淋巴细胞(也称为T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NK)细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、郎格罕氏细胞、干细胞、树突细胞、外周血单核细胞、肿瘤浸润(TIL)细胞、包含杂交瘤的基因修饰免疫细胞、药物修饰免疫细胞及上述细胞类型的衍生物、前体或祖细胞。对抗原的功能或应答可以任何类型的测定来测量，如RIA、ELISA、FACS、免疫印迹(Western blotting)等。
术语“诱导或增强免疫应答”意指相对于尚未施用肽、多肽或蛋白质的对照样品引起统计可测量的诱导或免疫应答的增加。相反地，免疫应答的“抑制”是指免疫应答的可测量的减少，甚于施用了肽、多肽或蛋白质的对照样品，举例言之，如同在自体免疫应答中的免疫应答抑制情况。优选地，免疫应答的诱导或增强导致对象的预防或治疗应答。免疫应答的实例是增加I型IFN的产生，增加对病毒和其他病原体感染的其他类型的抗性。该增强对病毒的免疫反应(抗病毒反应)或开发疫苗以预防病毒感染或根除现有病毒。
“单离”是指改变或从自然状态中移除。举例言之，自然存在于活体动物中的核酸或肽不是“单离的”，但是与其自然状态的共存物质部分地或完全地单离的相同核酸或肽是“单离的”。单离的核酸或蛋白质可以实质纯化的形式存在，或可存在于非原生环境中，如宿主细胞。
“单离核酸”是指已从自然存在状态的旁侧序列单离的核酸区段或片段，即从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段，亦即是与自然存在的基因组中的片段相邻的序列。该术语也适用于已从自然伴随核酸的其他组分实质纯化的核酸(亦即于细胞中与其自然伴随的RNA或DNA或蛋白质)。因此，该术语包含如重组DNA，该重组DNA是被导入于载体中、自主复制质粒或病毒中或原核生物或真核生物的基因组DNA中或作为独立于其他序列的单独分子(亦即作为cDNA或透过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)存在。其术语还包含：重组DNA，该重组DNA是作为编码附加多肽序列的杂合基因的部分、互补DNA(cDNA)、自然及/或修饰单体或连接的线性或环状寡聚物或聚合物，其包含脱氧核糖核苷、核糖核苷、经取代及其α-端基异构形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。
核酸序列可以是“嵌合的”，即由不同的区域组成。在本发明的上下文中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其寡核苷酸含有两个或更多个化学区域，例如DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每个化学区域是由至少一个单体单元(即核苷酸)所组成。此等序列通常包括至少一个区域，其中，该序列是经修饰以展现一种或多种期望的性质。
术语“靶核酸”序列是指经寡核苷酸设计为特异性杂交的核酸(通常源自生物样品)。靶核酸具有与针对靶的相应寡核苷酸的核酸序列相互补的序列。术语靶核酸可指寡核苷酸指向的较大核酸的特定子序列或整体序列(如基因或mRNA)。其使用的差异将从上下文中显而易见。
在本发明的上下文中，使用以下缩写表示通常存在的核酸碱基，“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，以及“U”是指尿苷。
除非另外指明，否则“编码核苷酸序列”的氨基酸序列包含彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码一蛋白质或一RNA的短语核苷酸序列还可包含内含子，以至于编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可以含有内含子。
免疫原性组合物的“肠胃外”投药包含例如皮下(s.c)，静脉内(i.v.)，肌肉内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”或“个体”或“受试者”在本文中可互换使用，并且指待治疗的哺乳动物受试者，以人类患者为优选。于部分情况下，本发明的方法可用于实验动物，兽医应用及疾病动物模型的开发，包含，但不限于，啮齿动物包含小鼠，大鼠和仓鼠及灵长类动物。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，且意指以肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，且未限制可包括有蛋白质或肽序列的氨基酸最大数目。多肽包含任何肽或蛋白质，该肽或蛋白质是包括以肽键彼此连接的两个或多个氨基酸。如本文所述，该术语是指两条短链，其在本领域中通常也称为肽，寡肽和寡聚物，并且指长链，其通常在本领域中称为蛋白质，其蛋白质中存在有很多种类。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包含自然肽、重组肽、合成肽或其组合。
术语“百分比序列一致性”或具“序列一致性”是指任何给定的查询序列和主题序列之间的一致性程度。
术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指适当时在施用于动物或人时不产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体及组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包含可以使用作为药学可接受物质之介质的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂等渗剂及吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。
术语“多核苷酸”是核苷酸链，也称为“核酸”。如本文所用的多核苷酸包含，但不限于，通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，并包含自然发生的核酸及合成的核酸。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”意指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已使用外源核酸转染，转化或转导的细胞。该转染的/转化的/转导的细胞包含主要受试细胞及其后代。
本文所用的术语“治疗”疾病意指降低受试者所罹患的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
“载体”是包括一单离核酸且可用于将单离核酸递送至细胞内部的物质的组合物。载体的实例包含，但不限于，线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包含自主复制质粒或病毒。该术语还被解释为包含促进核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包含，但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
其中任何氨基酸序列由Swiss Prot特别提及或GENBANK登录号，该序列通过引用并入本文。与登录号相关的信息，诸如信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域、启动子序列和翻译起始的鉴定，也通过引用其整体并入本文。
范围：贯穿本揭露，本发明的各方面可以范围形式呈现。应理解的是，该范围形式的描述仅仅是为求方便和简洁，且不应被解释为非弹性限制本发明范围。因此，范围的描述应被视为实质揭露所有可能的子范围及该范围内的单个数值。例如，将从1至6的范围的描述应视为具有特定揭露的子范围，例如从1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论该范围的上下限是都适用。
用于细胞或受试者中的逆转录病毒根除的组合物
本发明的具体例涉及包括内切核酸酶及至少一个指导RNA(gRNA)序列的组合物，所述指导RNA与靶基因中的靶核酸序列相互补。于部分具体例中，本文揭露的组合物是包含编码内切核酸酶(如Cas9)的核酸。在某些具体例中，组合物包含编码Cpf1(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列，以及与靶基因中的靶DNA序列相互补的至少一种指导RNA(gRNA)。该gRNA将Cpfl内切核酸酶导向靶DNA序列。透过点突变引起、插入、缺失或完全切除含有靶基因的DNA片段，于DNA中产生双链断裂而使靶基因失活。
于其他具体例中，可用的核酸酶系统包含，但不限于，锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)，兆核酸酶或任何其他可用于降解或干扰病毒核酸而不干扰宿主遗传物质的正常功能。
本发明亦提供使用此等组合物使靶基因失活并根除宿主中的病毒感染的方法。本发明的方法可用于从宿主生物体中去除病毒或其他外来遗传物质，而不干扰宿主遗传物质的完整性。核酸酶可用于靶病毒核酸，从而干扰病毒复制或转录，甚至从宿主基因组中切除病毒遗传物质。当病毒核酸作为颗粒存在于细胞内或当其被整合至宿主基因组中时，核酸酶可特定地靶向以仅去除病毒核酸而不作用于宿主材料。该组合物可用于以任何形式或在病毒生命周期的任何阶段靶向病毒核酸。该靶病毒核酸可作为独立颗粒存在于宿主细胞中。于一优选的具体例中，病毒感染是潜伏的且病毒核酸是被整合至宿主基因组中。可以将任何合适的病毒核酸靶向用于切割及消化。
基因编辑剂：本发明的组合物包含至少一种基因编辑剂，其基因编辑剂包括CRISPR相关核酸酶，例如Cas9及Cpfl gRNA、内切核酸酶的Argonaute家族、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、兆核酸酶、其他内切或外切核酸酶或其组合。参见Schiffer，2012，J Virol 88(17)：8920-8936，通过引用并入本文。
如上所述，Argonaute是另一种潜在的基因编辑系统。亚科蛋白(Argonautes)是使用5'磷酸化的短单链核酸作为切割靶标的引导的内切核酸酶家族(Swarts，D.C.等人，Theevolutionary journey of Argonaute proteins.Nai.Struct.Mol.Biol.21,743-753(2014))。类似于Cas9，亚科蛋白在基因表达抑制及抗外源核酸的防御中具有关键作用(Swarts，D.C.等人，Nat.Struct.Mol.Biol.21,743-753(2014)；Makarova，K.S.等人，Biol.Direct 4,29(2009).Molloy,S.Nat.Rev.Microbiol.11,743(2013)；Vogel，J.Sciences，344,972-973(2014)，Swarts，D.C.等人，Nature 507,258-261(2014)；Olovnikov，I.等人，Mol.Cell 51,594-605(2013))。然而，亚科蛋白在许多方面与Cas9不同(Swarts，D.C.等人,The evolutionary journey of Argonauteproteins.Nai.Struct.Mol.Biol.21,743-753(2014))。Cas9仅存在于原核生物中，而亚科蛋白通过进化被保存并存在于几乎所有的生物体中；尽管多数亚科蛋白与单链(ss)RNA相关且在RNA沉默具有核心作用，但部分亚科蛋白结合ssDNA并切割靶DNA(Swarts，D.C.等人Nature 507,258-261(2014)；Swarts，D.C.等人Nucleic Acids Res.43,5120-5129(2015))。指导RNAs必须具有3'RNA-RNA杂交结构以获得正确的Cas9结合，而亚科蛋白结合不需要指导的特定共有二级结构；而Cas9只能切割PAM的目标上游，对于亚科蛋白所需的目标没有特定的序列。一旦亚科蛋白和引导物结合，它们影响彼此的物理化学特性并作为与核酸结合蛋白的更典型的动力学性质的整体一起作用(Salomon，W.E.等，Cell 162,84-95(2015))。
该组合物还可包含C2c2-第一自然存在的CRISPR系统，该C2c2-第一自然存在的CRISPR系统是仅靶向RNA。第II类型VI-A CRISPR-Cas效应物“C2c2”是展示RNA引导的RNase功能。源自沙氏纖毛菌(Leptotrichia shahii)的C2c2提供对RNA噬菌体的干扰。体外生化分析显示C2c2是由单个crRNA引导，并且可以被编程以切割携带相互补原头间隔子的ssRNA靶标。于细菌中，C2c2可以被编程以敲减特定的mRNA。经由两个保守HEPN结构域中的催化残基介导切割，其中，突变产生催化失活的RNA结合蛋白。此等结果证明了C2c2作为新的RNA靶向工具的能力。C2c2可被编程以切割细菌细胞中的特定RNA序列。C2c2的RNA聚焦作用补充CRISPR-Cas9系统，该系统以DNA为靶，用于细胞识别及功能的基因组蓝图。有助于执行基因组指导的仅靶向RNA的能力，是提供以高通量方式特定性操纵RNA且更广泛地操纵基因功能的能力。
在一些具体例中，还可编码一种或多种指导RNA，该指导RNA是与HIV的靶序列相互补。因此，于部分具体例中，用于使整合至潜伏性感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的宿主细胞的基因组中的前病毒DNA失活的组合物，所述组合物是包括至少一种单离核酸序列，其单离核酸序列是编码成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)相关的内切核酸酶及至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA具有与原病毒HIV DNA的长末端重复序列(LTR)中的靶序列相互补的间隔序列。
Cpfl内切核酸酶
Cas9由含有约20个独特靶序列(称为间隔区)的碱基对(bp)的成熟crRNA，及作为pre-crRNA的核糖核酸酶III辅助处理指导的反式激活小RNA(tracrRNA)。该crRNA：tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔区及该靶DNA上的互补靶序列(也称为原型间隔区)之间的互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA。Cas9识别富含鸟嘌呤的三核苷酸(NGG)原型间隔区相邻基序(PAM)以指定切割位点(源自PAM的第3个核苷酸)。该PAM与靶序列的3'末端相邻。
相反地，Cpfl识别具有共有序列TTN的富含胸腺嘧啶的PAM，且该PAM位于靶序列的第5'末端。此CRISPR/Cpfl系统提供自CRISPR/Cas9系统的不同目标库，扩大了可用基因编辑目标的范围。
Cpf1介导的切割有利于基因编辑
如前所述，Cas9在双链DNA中进行钝端切割。此促进了易错修复和遗传失活，但不利于将期望的DNA片段拼接到切割位点。相反地，Cpfl进行交错切割，在每条DNA链中留下5个核苷酸突出端。此为引入所需DNA片段的有利切点，例如透过同源定向修复的方式。此外，切割位点位于靶位点的远端，远离确定目标专一性最重要的区域，即靠近PAM的“种子”序列。于该种子序列保持不变的情况下，可以进行多轮编辑。
Cpfl系统较Cas9系统更简易又更小
为起作用，CRISPR/Cas9系统需要两种取代的RNA、crRNA及tracrRNA的处理及装配，该crRNA是含有间隔区序列。该crRNA和tracrRNA已被改造成杂交分子，称为单个小指导RNA(sgRNA)，该小指导RNA是提供了一个更简易但仍庞大且复杂的系统。相反地，Cpfl的所有结合和酶促功能仅需要单一指导RNA，称为gRNA。此种简易性有利于CRISPR/Cpfl系统的设计和使用。
Cpfl亦缺少Cas9中所发现的两个核酸酶结构域之一者。作为一小分子，该Cpfl应更易于运输，例如通过核孔，到达目标位置。
CRISPR/Cpfl系统的优点是适用于本发明的各种目的。
CRISPR/Cpfl组合物
本发明涵盖用于使宿主细胞基因组中的靶基因失活的组合物，所述组合物包含至少一种Cpfl内切核酸酶及至少一种gRNA，其中，所述至少一种gRNA与靶基因中的靶序列相互补。当将gRNA描述为与靶DNA序列相互补时，应理解的是，该gRNA是实际上与靶DNA序列互补的gRNA的间隔序列。
Cpfl的优选具体例是源自氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpf1及柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006。此等Cpfl家族成员已充分表征，且已显示是为大致相当效力于编辑人类肾细胞中的DNMT1基因的Cas9(Zetsche B.等，Cell 163,1-13October 22,2015)。
本发明的gRNA的序列取决于选择用于编辑的特定靶位点的序列。一般来说，预测gRNA与序列5'TTN的靶DNA序列相互补，该靶DNA序列是紧接3'至富含胸腺嘧啶的PAM。该gRNA序列可为有义或反义序列。该gRNA序列可包含或不包含PAM序列的互补序列。该gRNA序列可包含附加的5'及/或3'序列，其可不与靶序列互补。该gRNA序列可与靶序列具有小于100％的互补性，如95％的互补性。该gRNA核酸序列具有与一编码或一非编码的靶序列互补的序列。该gRNA序列可以多重构型使用，其多重构型是包含二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多种不同gRNA的组合。已在CRISPR/Cas9系统中建立使用靶向HIV-1 LTR中的位点的两种不同gRNA的双链体“双切”策略，可引起切割位点间的整个DNA片段切除(Hu W.等人，ProcNatl Acad Sci USA 111,11441-11466(2014))。于HIV和其他逆转录病毒中，双链体gRNA构型在HIV-1基因组及其他靶DNA中的CRISPR/Cpfl系统中产生的切除亦具效力。
于某些具体例中，Cpf1核酸酶及gRNA在单离核酸序列中编码，其被递送至包括用于原位表达的靶基因的细胞。该单离核酸序列可包含在任何合适的表达载体中，用于在特定细胞类型中表达。或者，该单离核酸序列可在任何合适的体内或体外翻译系统中表达为多肽，且在微量递送载体中(如脂质体等)递送至宿主细胞。该多肽可以多种方法产生，是包含如重组技术或化学合成。一旦经生成，可通过本领域习知的方法将多肽单离并纯化至任何期望的程度。举例言之，可使用如反相(优选)或正相HPLC或在多糖凝胶介质(如SephadexG-25)上的分子排阻或分配色谱法来冷冻干燥。以标准方法、氨基酸测序或FAB-MS技术降解肽后，通过氨基酸分析可确认最终多肽的组成。包含多肽氨基的酸盐、酯、酰胺及N-酰基衍生物的盐可以使用本领域已知的方法制备，且此等肽可用于本发明的上下文中。
本发明的Cpf1内切核酸酶可具有与野生型氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6或柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006相同的核苷酸序列。(Zetsche B.等人，Cell 163,1-13 October 22,2015)。或者，若可显示在特定细胞类型或个体动物中的基因编辑所指导的介导gRNA，则可以利用任何物种的Cpf1。
可以修饰野生型氨基酸球菌(Acidaminococcus)或柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)Cpfl序列以编码Cpfl的生物活性变体，且此等变体可具有或可包含如凭含有一个或多个突变(如新增、缺失或置换突变或此等突变的组合)而不同于野生型Cpfl的氨基酸序列。可修饰Cpf1核苷酸序列以编码Cpfl的生物活性变体，且此等变体可具有或可包含如凭含有一个或多个突变(如新增、缺失或置换突变或此等突变的组合)而不同于野生型Cpfl的氨基酸序列。一个或多个置换突变可以是置换(如保守型氨基酸置换)。举例言之，Cpf1多肽的生物活性变体可有与野生型Cpfl多肽具有至少或约50％序列一致性(例如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列一致性)的胺基酸序列。保守型氨基酸取代典型包含以下组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸，组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。Cpf1氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非自然发生的氨基酸残基。自然发生的氨基酸残基包含由遗传密码自然编码的氨基酸残基，以及非标准氨基酸(如具有D-构型而非L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包含氨基酸残基，其氨基酸残基是标准残基的修饰形式(如吡咯赖氨酸可用来代替赖氨酸，硒代半胱氨酸可用来代替半胱氨酸)。非自然发生的氨基酸残基是在自然界中未被发现的氨基酸残基，但符合氨基酸的基本分子式并可导入肽中。此等包含D-异亮氨酸(2R，3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。于其他实施例，可以咨询教科书或全球网站(目前由加利福尼亚理工学院维护的一网站，且该网站是教示已成功并入功能性蛋白质的非自然氨基酸的结构)。
例如，为在哺乳动物细胞中有效表达(即“人源化”)可以对Cpfl的核酸序列进行密码子优化(Zetsche等，2015)。可以修饰Cpfl内切核酸酶以作为“切口酶”。
Cpf1核酸酶序列可以突变而表现为“切口酶”，其切口而非切割DNA，以产生单链断裂。在Cas9中，切口酶活性通过保守的HNH及RuvC结构域中的突变来完成，所述突变参与链特定性切割。举例言之，RuvC催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)切口而非切割DNA以产生单链断裂(Sander J.D.和Joung L.K.，NatureBiotech 32,347-355(2014))。氨基酸球菌(Acidaminococcus)和柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)的Cpf1缺乏HNH结构域，但包含RuvC结构域，因此可能通过与Cas9中使用的突变类似的突变产生切口酶Cpfl。可以本领域普通技术人员已知的方式评估突变体Cpfl的生物活性，且包含，但不限于，体外切割测定或功能测定。
Cpfl核酸酶序列也可被突变以产生催化缺陷型Cpfl。可以RuvC结构域的适宜突变来产生催化缺陷型Cpfl，如同为Cas9所完成的(Gilbert L.A.等，Cell 154,442-51(2013))。催化缺陷型Cpfl可用于将荧光标记或调节蛋白定位于DNA分子上的特定靶位点。
相较于野生型Cpfl，Cpf1核酸酶序列可被突变以产生具有改善的靶向效率的Cpfl及/或防止分子的靶向脱靶。Cpfl分子可在Cpf1核酸酶序列中包括一个或多个突变，其包含，但不限于，缺失、取代、修饰的核碱基、锁定的核酸、肽核酸等。
本发明还包括跨所有种类的细菌和古细菌的Cpf1的所有同是物和直是同源物，例如包含如图2(Haft D.H.等人，PLoS Comput Biol1,04740-0483(2005))所示的系统发生学中的物种。如前所述，此等同是物和直是同源物也包括在变体和突变体形式中。Cpfl直是同源物包含例如来自氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6和柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND 2006的Cpfl(分别为AsCpfl和LbCpfl)。此等直是同源物通常识别位于原型间隔子5'的TTTN PAM。
指导核酸序列
根据本发明的指导RNA序列可以是有义或反义序列。gRNA的特定序列可能会有所不同，但无论序列如何，有用的指导RNA序列都是该些能够实现脱靶效应最小化，同时实现基因组整合HIV-1原病毒的高效和完全根除的序列。指导RNA序列的长度可以从约20至约60或更多个核苷酸变化，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。
指导RNA序列可配置为单个序列或一个或多个不同序列(如多重构型)的组合，例如多路复用配置。多重构型可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的指导RNA的组合。
本发明的组合物和方法可包含编码指导RNA的序列，其指导RNA与HIV中的靶序列是相互补。HIV的遗传变异反映在已经描述的多个组和亚型中。在洛斯阿拉莫斯艾滋病毒(Los Almos HIV)数据库和纲要中汇编了一是列艾滋病毒序列(即，序列数据库网站的网址是http://www.hiv.lani.gov)。本发明的方法和组合物可应用于来自任何该些不同组、亚型和循环重组形式的HIV。此等包含如HIV-1主要组(通常称为M组)和次要组(N、O和P组)以及但不限于以下任何亚型A、B、C、D、F、G、H、J和K或HIV的组(如但不限于以下N、O和P任何一组)。
指导RNA可以是与编码序列或非编码序列(即靶序列)互补的序列。举例言之，指导RNA可以是与HIV长末端重复序列(LTR)区域互补的序列。根据本发明的gRNA序列可以与靶序列的有义链或反义链互补。该gRNA序列可以包含附加的5'及/或3'序列，其附加的5'及/或3'序列可与靶序列互补或不互补。该附加的5'及/或3'序列可与靶序列具有小于100％的互补性，例如75％的互补性。当本发明的组合物作为单离核酸施用或包含在表达载体内时，可以与gRNA序列相同的核酸或载体编码Cpfl内切核酸酶。或者，或另外，Cpf1内切核酸酶可与gRNA序列在物理单离的核酸中或在独立的载体中编码。
单离核酸序列
单离核酸分子可通过标准技术生产。举例言之，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于获得含有本文所述核苷酸序列的单离核酸，包括编码本文所述多肽的核苷酸序列。PCR可用于扩增来自DNA以及RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。例如，在PCR Primer：A Laboratory Manual，Dieffenbach及Dveksler eds.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1995中，描述了各种PCR方法。通常，从感兴趣的区域或更远的区域的末端利用序列信息来设计寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物与待扩增的模板的相反链序列相同或相似。各种PCR策略也可用于将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸。
单离核酸也可以化学合成，作为单个核酸分子(例如，使用亚磷酰胺技术在3'至5'方向使用自动化DNA合成)或作为一是列寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一对或多对长寡核苷酸(例如，>50-100个核苷酸)，每对含有短片段的互补性(例如约15个核苷酸)，使得当寡核苷酸对退火时形成双链体。DNA聚合酶用于延伸寡核苷酸，从而产生每个寡核苷酸对的单个双链核酸分子，然后可以将其单个双链核酸分子载入载体中。本发明的单离核酸也可通过如Cas9编码的DNA(例如根据上述公式)的自然发生部分诱变来获得。
应將理解的是，本发明的所有CRISPR/Cpfl组合物或方法可以与CRISPR/Cas9系统的该些组合以获得两种系统的靶序列谱。
修饰的或突变的核酸序列
在一些具体例中，本文中体现的任何核酸序列(例如突变的Cpf1以提高靶效率及/或预防脱靶效应)可以被修饰或衍生自原生核酸序列，例如，通过引入突变、缺失、取代、核碱基、骨架等的修饰。核酸序列包含载体、基因编辑剂、单离核酸、gRNA、tracrRNA等。本发明的核酸序列还包括变体，其变体中不同碱基存在于一个或多个化合物中的核苷酸位置。例如，若第一个核苷酸为腺苷，则可以在该位置产生含有胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这可以在单离核酸序列的任何位置进行。本发明的核酸序列可具有对核碱基或骨架的修饰。为本发明设想的部分修饰的核酸序列的实例包含该些包括修饰的骨架的核酸序列，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。在一些具体例中，修饰的寡核苷酸包含具有硫代磷酸酯骨架和该些具有杂原子骨架的寡核苷酸，即CH2-NH-O-CH2，CH，-N(CH3)-O-CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架),(CH2)-O-N(CH3)-CH2，CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和0-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中，原生磷酸二酯主链表示为O-P-O-CH)。由De Mesmaeker等人,Acc.Chem.Res.1995,28：366-374中揭露的酰胺骨架也体现于本文中。在一些具体例中，具有吗啉代骨架结构的核酸序列(Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)、肽核酸(PNA)骨架，其中，该寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代，核碱基被结合直接或间接地与聚酰胺骨架的氮杂氮原子相连(Nielsen等，Science1991,254,1497)。核酸序列还可以包含一个或多个取代的糖部分。核酸序列还可以具有糖模拟物，例如环丁基代替戊呋喃糖基。
核酸序列还可以附加或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的“未修饰”或“自然”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括在自然核酸中仅很少或瞬时发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶，且在本领域中通常被称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和生长激素HMC，以及合成核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。(Kornberg，A.，DNA Replication，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，1980，pp75-77；Gebeyehu，G.等人，Nucl.Acids Res.1987,15：4513)。可包括本领域已知的“通用”碱基，如肌苷。透过0.6-1.2℃已显示5-Me-C取代提升核酸双链体的稳定性。(Sanghvi，Y.S.，inCrooke，S.T.和Lebleu，B.eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press，BocaRaton，1993，pp.276-278)。
本发明核酸序列的另一种修饰涉及化学连接核酸序列的一个或多个增强寡核苷酸活性或细胞摄取的部分或缀合物。此部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,653)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.1994,4,1053)、硫醚，如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.1992,660,306；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.1993,3,2275)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nul.Acids Res.1992,20,533)、脂族链，如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.1991,10,111；Kabanov等，FEBS Lett.1990，259,327；Svinarchuk等，Biochimie 1993,75,49)、磷脂，如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-丙三醇-3-H-膦酸酯(Manoharan等，TetrahedronLett.1995,36,3651；Shea等，Nucl.Acids Res.1990,18,3777)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides 1995,14,969)或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.1995,36,3651)。
在另一个优选的具体例中，单离核酸序列(例如Cpf1)包含硫代磷酸酯核苷酸间键联和至少一个选自由烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯，烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及/或其组合组成的组的核苷酸间键的组合。在另一个优选的具体例中，单离核酸序列任选地包含至少一个修饰的核碱基，所述修饰的核碱基包含肽核酸、锁核酸(LNA)分子、其类似物、衍生物及/或其组合。
对于给定的核酸序列中的所有位置均不需要被均匀修饰，且实际上可以将一个以上的上述修饰导入单个核酸序列中或者甚至在核酸序列内的单个核苷内。
本发明的某些优选的单离核酸序列是嵌合分子。在本发明的上下文中，“嵌合分子”或“嵌合体”是单离核酸序列，其含有两个或更多个化学性不同的区域，各区域由至少一个核苷酸组成。此等单离核酸序列通常含有至少一个修饰的核苷酸区域，其修饰的核苷酸区域赋予一种或多种有益特性(例如增加的核酸酶抗性，提高的细胞吸收，提高的对靶标的结合亲和力)和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶标的切割，从而大幅地提升基因表达的反义调节效率。因此，当使用嵌合单离核酸序列时，相较于相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸，使用较短的单离核酸序列通常可以获得可比较的结果。
本发明的嵌合单离核酸序列可形成为如上所述的两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸及/或寡核苷酸模拟物的复合结构。此本领域中化合物也被称为杂化体或间隙体。教示制备此混合结构的代表美国专利，包括但不限于美国专利号5,013,830；5,149,797；5，220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其中，每一篇通过引用并入本文。
在另一具体例中，经修饰的单离核酸序列的区域包含在糖的2'位置修饰的至少一个核苷酸，最优选为2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟修饰的核苷酸。在另一具体例中，单离核酸序列也可被修饰以增强核酸酶抗性。细胞含有多种可降解核酸的外切核酸酶和内切核酸酶。使许多核苷酸和核苷修饰导入的核酸序列已显示比原生寡脱氧核苷酸更耐核酸酶消化。核酸酶抗性通常透过以细胞提取物或单离的核酸酶溶液培育单离核酸序列，并通常以凝胶电泳测量随时间保留的完整寡核苷酸的程度来测量。经修饰以增强其核酸酶抗性的单离核酸序列比未修饰的单离核酸序列完整地存活更长时间。多种寡核苷酸修饰已被证实能增强或赋予核酸酶抗性。单离核酸序列可含有至少一个硫代磷酸酯修饰。在部分情况下，增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也能独立地增强核酸酶抗性。部分理想的修改可由De Mesmaeker等人,Acc.Chem.Res.1995,28:366-374的文献中找到。
在一些具体例中，RNA分子例如crRNA、tracrRNA、gRNA被设计以包含一个或多个修饰的核碱基。例如，RNA分子的已知修饰可见于例如Genes VI，第9章("Interpreting theGenetic Code")，Lewis，ed.(1997,Oxford University Press,New York)以及Modification and Editing of RNA,Grosjean and Benne,eds.(1998,ASM Press,Washington DC)。修饰的RNA组分包含以下：2'-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4-2'-O-二甲基胞苷；N4-乙酰胞苷；5-甲基胞苷；5,2'-0-二甲基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；2'-O-甲基-5-甲酰基胞苷；3-甲基胞苷；2-硫代胞苷；赖胞苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；2-硫代2'-O-甲基尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷；4-硫代尿苷；核糖基胸腺嘧啶；5,2'-0-二甲基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；尿苷5-羟乙酸；尿苷5-氧代乙酸甲酯；5-羧甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-1,2'-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-1,2'-硫代尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基-1'-O-甲基尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5-氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒吩尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；5-羧甲基氨基甲基-1,2'-O-甲基-尿苷；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷；二氢尿苷；二氢核糖基胸腺嘧啶；2'-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N6N甲基腺苷；N6,N6-二甲基腺苷；N6，2'-O-三甲基腺苷；2-甲硫基-N6N异戊烯腺苷；N6-(顺式羟基异戊烯)腺苷；2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷；N6-甘氨酰氨基甲酰基)腺苷；N6苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；2-甲硫基-N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N6-羟基神经氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲硫基-N6-羟基降冰片基氨基甲酰基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸)；肌苷；2'O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1；2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；N2，N2-二甲基鸟苷；N2，2'-O-二甲基鸟苷；N2，N2，2'-O-三甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸)；7-甲基鸟苷；N2；7-二甲基鸟苷；N2；N2；7-三甲基鸟苷；怀俄苷；甲基怀俄苷；未改性的羟基果糖苷；怀丁苷；羟基怀丁苷；过氧怀丁苷；辫苷；环氧辫苷；半乳糖-辫苷；甘露糖基-辫苷；7-氰基-7-脱氮；古菌苷(arachaeosine)[也称7-甲酰氨基-7-脱氮鸟苷]；和7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷。
在其他具体例中，RNA修饰包括在RNA的3'末端的嘧啶，无碱残基或反向碱基的核糖上的2'-氟、2'-氨基和2'O-甲基修饰。通常将此等修饰导入寡核苷酸中，并且已经显示此等寡核苷酸较针对给定靶标的2'-脱氧寡核苷酸具有更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。
预防和治疗病毒感染的方法
主要的HIV-1感染会在几周到几个月内消退，通常会伴随一个长达10年的临床“潜伏期”。受试者的CD4淋巴细胞数量回跳，但非达感染前的水平，且多数受试者进行血清转化，即在感染的2至4周内，他们的血液中具有可侦测水平的抗HIV-1抗体。在潜伏期(也称为临床潜伏期)期间，感染艾滋病毒的人可能没有感染艾滋病毒相关症状，或只有轻微感染。但是，HIV-1病毒继续以非常低的水平繁殖。在用抗逆转录病毒疗法治疗的受试者中，该潜伏期可能延续数十年或更长时间。然而，即使接受抗逆转录病毒治疗，此阶段的受试者仍能够将HIV传播给其他人，尽管抗逆转录病毒疗法可降低传播风险。抗逆转录病毒疗法无法抑制低水平的病毒基因组表达，也无法有效靶向潜伏感染的细胞，如静息记忆T细胞、脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴样细胞。
整合病毒的潜伏感染是逆转录病毒的特征，并且在许多其他类型的病毒中也可见，包括多瘤病毒、疱疹病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒。必需使宿主细胞基因组中的整合前病毒DNA失活或切除，或先防止前病毒DNA整合的治疗。
因此，本发明包含用于在体外或体内使宿主细胞基因组中整合的前病毒DNA失活的组合物。该组合物包含至少一种编码Cpfl内切核酸酶的单离核酸序列和至少一种gRNA。该至少一种gRNA与前病毒DNA中的靶DNA序列互补。
本发明还包括在体外或体内使宿主细胞基因组中整合的前病毒DNA失活的方法，包括以下步骤：以至少一种编码Cpf1内切核酸酶的单离核酸序列来处理宿主细胞；以编码gRNA的至少一种单离核酸序列来处理宿主细胞，该至少一种gRNA与前病毒DNA中的靶序列相互补；以及使前病毒DNA失活。
本发明还提供了预防有逆转录病毒感染风险的患者的宿主细胞的病毒感染的方法。该方法包括以下步骤：确定患者的宿主细胞有被病毒感染的风险；将患者的宿主细胞暴露于有效量的表达载体组合物及至少一种指导RNA(gRNA)，所述表达载体组合物包含编码Cpfl内切核酸酶的单离核酸，其指导RNA(gRNA)是与该病毒基因组中的靶序列相互补；在宿主细胞中稳定表达该Cpf1内切核酸酶及该至少一种gRNA；以及防止病毒感染宿主细胞。
对于整合的HIV(如HIV-1)，已开发出有效的gRNA，该gRNA是与HIV-1LTR的U3、R或U5区互补(Hu W.等，Proc Natl Acad Sci USA 111,11461-11466(2014))。该gRNA在根除整合的前病毒HIV-1方面是有效的。该gRNA的稳定表达及Cas9的稳定表达防止了HIV-1对T细胞的新感染(Hu W.等人，Proc Natl Acad Sci USA 111,11461-11466(2014))。所开发的gRNA是与Cas9一起使用，但可能该与Cpfl PAM相邻的靶序列互补的gRNA也能有效地根除或预防潜伏的HIV-1感染。
与Cpfl的PAM相邻的HIV-1 LTR中的例示性靶序列是揭露于实施例1中。相似地，可通过在其他病毒中gRNA相邻的Cpfl PAM来鉴定gRNA，所述其他病毒包括但不限于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)、人类嗜T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)和JC病毒(JCV)。从宿主少突神经胶质细胞中使JCV失活或切除将在治疗进行性多灶性白质脑病(PML)中有很大的用途。
重组构建体和运载工具
包含在药物组合物中的例示性表达载体包括质粒载体和慢病毒载体，但是本发明不限于此等载体。多种宿主/表达载体组合可用于表达本文所述的核酸序列。合适的表达载体包括但不限于衍生自例如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的质粒和病毒载体。许多载体和表达系统可从Novagen(Madison，WI)、Clontech(Palo Alto，CA)、Stratagene(La Jolla，CA)和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad，CA)等公司购得。标记基因可赋予宿主细胞选择性表型。举例言之，标记可赋予抗生物剂抗性，例如抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)。表达载体可以包括标签序列，该标签序列被设计为便于对表达的多肽进行操作或侦测(例如纯化或定位)。诸如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血凝素或FLAGTM标签(Kodak，New Haven，CT)的标签序列通常表达为与编码的多肽的融合。如此的标签可以插入多肽内的任何位置，包括在羧基或氨基末端。载体还可以包括复制起点、支架附着区(SAR)、调节区等。术语“调节区”是指影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性及/或移动性的核苷酸序列。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答组件、蛋白质识别位点、诱导型组件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号及内含子。术语“可操作地连接”是指将调节区和待转录的序列置于核酸中以影响这种序列的转录或翻译。举例言之，为了使编码序列处于启动子的控制之下，多肽的翻译读框的翻译起始位点通常位于启动子下游的一个和约五十个核苷酸之间。然而，启动子可位于翻译起始位点上游约5,000个核苷酸处或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子通常包含至少一个核心(基础)启动子。启动子还可以包括至少一个控制组件，诸如增强子序列、上游组件或上游活化区域(UAR)。待包含的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、选择性、诱导性、期望的表达水平以及细胞或组织优先表达。本领域技术人员通过适当选择和定位相对于编码序列的启动子和其他调节区来调节编码序列的表达是常规问题。可以使用的合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和在Miller等人，Biotechniques，Vol.7，No.9,980-990(1989)中叙述的人巨细胞病毒(CMV)启动子或任何其他启动子(例如，如真核细胞启动子包括但不限于组蛋白，pol III和β-肌动蛋白启动子的细胞启动子)。可以使用的其他病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、TK启动子和B19细小病毒启动子。
可通过本领域已知的任何启动子/增强子组件来控制Cpf1/指导核酸序列的表达，但是此等调控组件必须在选择用于表达的宿主中起作用。可用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号5,385,839和5,168,062)，SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)，Rous肉瘤病毒的3'长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，Cell 22：787-797,1980)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:1441-1445,1981)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，Nature 296：39-42,182)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731,1978)或tac启动子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25,1983)；还参见Scientific American，242：74-94,1980中的“来自重组细菌的有用的蛋白质”；来自酵母或其他真菌的启动子组件，如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；及表现组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，Cell 38：639-646,1984；Ornitz等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol 50：399-409,1986；MacDonald，Hepatology 7：425-515,1987)；(Hanahan，Nature 315：115-122,1985)，在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，Cell 38：647-658,1984；Adames等人，Nature 318：533-538,1985；Alexander等，Mol.Cell Biol.7：1436-1444,1987)，在睾丸、乳房、淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等，Cell 45:485-495,1986)，在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，Genes and Devel.1:268-276,1987)，α-甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，Mol.Cell Biol.5：1639-1648,1985；Hammer等，Science 235：53-58,1987)，在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，Genes and Devel.1:161-171,1987)，在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等，Nature 315:338-340,1985；Kollias等，Cell 46:89-94,1986)，髓鞘碱性亲(Readhead等人，Cell 48:703-712,1987)，肌球蛋白轻链-2基因控制区域，其在骨骼肌中有活性(Sani，Nature 314:283-286,1985)以及在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等，Science 234：1372-1388,1986)。
在另一具体例中，本发明包含诱导型启动子。此一启动子是四环素控制的反式激活因子(tTA)─响应性启动子(tet系统)，其是一种适用于哺乳动物细胞的原核诱导型启动子系统。tet系统被组织在逆转录病毒载体中，使得高水平的组成型产生的tTA mRNA不仅用于产生tTA蛋白，而且还通过反义抑制降低响应单元的基础表达。参见Paulus，W.等人，“Self-Contained，Tetracycline-Regulated Retroviral Vector System for GeneDelivery to Mammalian Cells”，J.of Virology，January.1996，Vol.70，No.1，pp.62-67。根据本文包含的教导，对于本领域技术人员来说，合适的启动子的选择将是显而易见的。
本发明提供了用于使宿主细胞基因组的靶基因失活的表达载体。每种表达载体包括至少一种编码Cpf1内切核酸酶的单离核酸序列和至少一种(gRNA)，其中，至少一种gRNA与靶基因中的靶序列互补。编码至少一种Cpf1内切核酸酶的核酸序列和编码至少一种gRNA的核酸序列可包含在单一表达载体中或分开的载体中。
由于其高转导效率和低毒性，用于在哺乳动物细胞中表达Cpfl系统的优选载体是慢病毒载体。其他合适的表达载体包括但不限于衍生自例如噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒(“Ad”)、腺伴随病毒(AAV)和水泡性口炎病毒(VSV)的质粒和病毒载体，以及痘病毒载体如禽痘病毒或正痘病毒载体。另外的表达载体也可以包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物；质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体1的许多衍生物，例如NM989，及其它噬菌体DNA，如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；以及源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，如已被修饰为使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒。
许多载体和表达系统可从Novagen(Madison，WI)，Clontech(Palo Alto，CA)，Stratagene(La Jolla，CA)和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad，CA)等公司购得。合适的启动子和增强子可以包含在载体中，通过本领域众所周知的实验方法根据希望表达的细胞类型进行选择。
本发明的多核苷酸还可以与微量递送载体例如阳离子脂质体和腺病毒载体一起使用。关于脂质体制备，靶向和内容物递送的程序的综述，参见Mannino和Gould-Fogerite，BioTechniques，6：682(1988)。另见Feigner和Holm，Bethesda Res.Lab.Focus，11(2)：21(1989)和Maurer，R.A.，Bethesda Res.Lab.Focus，1 1(2)：25(1989)。
因此，本发明涵盖用于使整合至潜伏HIV感染的宿主细胞的基因组中的前病毒DNA失活的慢病毒载体组合物。该组合物包含编码内切核酸酶的单离核酸及编码至少一种指导gRNA的至少一种单离核酸，所述指导gRNA包含与原病毒HIV DNA中的靶序列互补的间隔序列，单离核酸包含在至少一个慢病毒表达载体。慢病毒表达载体诱导宿主细胞中内切核酸酶和至少一种gRNA的表达。
所有单离的核酸都可包含在单个慢病毒表达载体中，或者可以将核酸分成任何合适的慢病毒载体组合。例如，可将内切核酸酶导入第一慢病毒表达载体中，可将第一种gRNA导入第二慢病毒表达载体中，并将第二种gRNA导入第三慢病毒表达载体中。当使用多种表达载体时，它们都不是慢病毒载体。
本文还提供重组构建体并可用于转化细胞。重组核酸构建体包含编码与本文所述的HIV中的靶序列互补的Cpf1及/或指导RNA的核酸，其可操作地连接至适于表达Cpf1的调节区及/或与Cpf1互补的指导RNA细胞中HIV的靶序列。应理解，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性在本领域中是众所周知的。对于许多氨基酸，存在不止一个核苷酸三联体作为氨基酸的密码子。例如，可以修饰Cpfl的编码序列中的密码子，从而使用该生物体的适当密码子偏好表获得特定生物体中的最佳表达。
几种递送方法可以与体内(细胞培养)和体内(动物和患者)系统中体现的分子结合使用。在一具体例中，可以使用慢病毒基因递送系统。此系统在分裂和非分裂细胞中提供稳定，长期的基因存在，具有广泛的向性和强大DNA插入的能力。(Dull等，J Virol，72：8463-8471 1998)。在一具体例中，腺伴随病毒(AAV)可以用作递送方法。AAV是近年来积极用于在体外和体内系统中递送治疗性基因的非致病性单链DNA病毒(Choi等，Curr GeneTher，5：299-310,2005)。
在本发明的某些具体例中，可以使用非病毒载体来实现转染。非病毒递送核酸的方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人造病毒体和增强剂的DNA摄取。叙述于美国专美国专利号5,049,386,4,946,787；和4,897,355的脂质转染和脂质转染试剂是可购得的(如Transfectam和Lipofectin)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质，是包含叙述于授予Jesse的美国专利第7,166,298号或Jesse的美国专利第6,890,554号中描述的该些阳离子和中性脂质，其内容通过引用并入本文。可递送至细胞(如在体外或离体投药)或靶组织(如体内投药)。
合成载体通常基于阳离子脂质或可与带负电荷的核酸复合以形成直径约100nm的颗粒的聚合物。该复合物保护核酸免于被核酸酶降解。此外，细胞和局部递送策略必须为内化、释放和分布的需要在适当的亚细胞区室中处理。全身递送策略遇到了其他的障碍，例如，阳离子递送载体与血液成分的强烈相互作用、网状内皮系统的吸收、肾脏过滤、毒性和载体对感兴趣细胞的靶向能力。修饰阳离子非病毒的表面可以使其与血液成分的相互作用最小化，减少网状内皮系统摄取，降低其毒性并增加其与靶细胞的结合亲和力。血浆蛋白结合(也称为调理)是RES识别循环纳米颗粒的主要机制。例如，巨噬细胞(例如肝脏中的库普弗细胞)通过清道夫受体识别调理的纳米颗粒。
本发明的核酸序列可以被递送至受试者的适当细胞。这可通过如聚合的、生物可降解的微粒或微胶囊递送载体的使用来实现，其尺寸为优化吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用。例如，可以使用直径约1-10μm的PLGA(聚乳酸-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸封装在此等微粒中，此等微粒被巨噬细胞摄取并在细胞内逐渐生物降解，由此释放多核苷酸。一旦释放，DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒将不被细胞直接摄取，而是主要用作核酸的缓释储库，其仅在通过生物降解从微粒释放时才被细胞吸收。因此，此等聚合物颗粒应大得足以阻止吞噬作用(即，大于5μm且优选大于20μm)。实现核酸吸收的另一种方式是使用透过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独导入此等递送载体中或与组织特异性抗体共同导入，例如靶向通常潜伏感染HIV感染储库的细胞类型的抗体。或者，可以通过静电或共价力制备由质粒或与聚-L-赖氨酸连接的其他载体组成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合可结合靶细胞受体的配体。将“裸DNA”(即不含递送载体)递送到肌内，皮内或皮下部位是实现体内表达的另一种手段。如上所述，在相关多核苷酸(例如表达载体)中，编码包含编码Cpf1的序列的单离核酸序列及/或与HIV的靶序列互补的指导RNA的核酸序列。
在一些具体例中，载体的递送也可以由外来体介导。外来体是许多细胞类型释放的脂质纳米囊泡。该外来体通过在细胞间转运核酸和蛋白质介导细胞间通讯。外来体含有RNA、miRNA和来自内吞途径的蛋白质。其外来体可能被内吞作用、融合或两者共同作用于靶细胞。可以利用外来体将核酸递送至特定的靶细胞。
本发明的表达构建体也可以通过纳米螺旋来传递。纳米孔是茧状DNA纳米复合材料(Sun等，J.Am.Chem.Soc.2014,136：14722-14725)。该纳米孔可以装载核酸供靶细胞摄取并释放到靶细胞的细胞质中。在Sun等人的文章中可以找到构建纳米螺旋，装载它们和设计释放分子的方法。(Sun W等人，J.Am.Chem.Soc.2014,136：14722-14725；Sun W等人，Angew.Chem.Int.Ed.2015：12029-12033)。
核酸和载体还可以施加到装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴片或任何其他药物递送装置内。本文揭露的核酸和载体可以在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)的存在下单独或以混合物的形式施用。根据投药方式和途径来选择赋形剂或载体。在本领域众所周知的参考文献Remington's Pharmaceutical Sciences(EW Martin)和USP/NF(United States Pharmacopeia and the National Formulary)中描述了合适的药物载体以及用于药物制剂的药物必需品)。
在本发明的部分具体例中，使用脂质体实现转染到细胞或组织中。核酸脂质体制剂的药理学主要取决于核酸在脂质体双层内的封装程度。封装的核酸被保护免于核酸酶降解，而仅与脂质体表面相关的该些核酸不受保护。封装的核酸具有延长的完整脂质体的循环寿命和生物分布，而与表面相关的核酸一旦与脂质体单离，就采用裸核酸的药理学。通过常规的被动加载技术，如乙醇滴注法(如在SALP中)，反相蒸发法和乙醇稀释法(如在SNALP中)，核酸可以被包载在脂质体内。
脂质体递送系统提供稳定的制剂，提供改善的药代动力学，以及对组织的一定程度的“被动”或“生理学”靶向。亲水和疏水材料(例如潜在的化疗剂)的封装是已知的。例如参见授予Schneider的美国专利第5,466,468号，其揭露了包含合成脂质的肠胃外可施用的脂质体制剂；授予Hostetler等人的美国专利号5,580,571，其揭露了与磷脂缀合的核苷类似物；授予Nyqvist的美国专利第5,626,869号，其揭露了药物组合物，其中，药物活性化合物是包含在限定的脂质体是中的肝素或其片段，所述脂质体是包含至少一种两亲脂族和极性脂质组分以及至少一种非极性脂质组分。
脂质体和聚合物体可含有多种溶液和化合物。在某些具体例中，本发明的复合物偶联或封装在聚合物囊泡中。作为一类人工囊泡，聚合物囊泡是封闭溶液的小空心球体，由两亲性合成嵌段共聚物制成，形成囊泡膜。常见的聚合物囊泡在其核心含有水溶液，可用于封装和保护敏感分子，如药物，酶，其他蛋白质和肽以及DNA和RNA片段。聚合物多孔膜提供物理屏障，将封装材料与外部材料(例如生物系统中发现的材料)隔离。可以通过习知技术由双重乳液产生聚合物体，参见Lorenceau等，2005，Generation of Polymerosomes fromDouble-Emulsions，Langmuir 21(20)：9183-6，通过引用并入本文。
在本发明的部分具体例中，修饰非病毒载体以实现靶向递送和转染。聚乙二醇化(即用聚乙二醇修饰表面)是用于减少非病毒载体的调理及聚集，并使用网状内皮系统清除最小化的主要方法，导致静脉内(i.v.)投药后延长的循环寿命。因此聚乙二醇化的纳米颗粒通常被称为“隐形”纳米颗粒。未从循环中快速清除的纳米颗粒将有机会遇到感染的细胞。
在本发明的部分具体例中，利用了对组织和外部刺激的独特环境作出响应的靶向控释系统。金纳米棒在近红外区域具有强吸收带，吸收的光能被金纳米棒转化为热量，即所谓的“光热效应”。由于近红外光可以深入组织，金纳米棒的表面可以被核酸修饰以控制释放。当修饰的金纳米棒被近红外光照射时，核酸由于光热效应引起的热变性而释放。释放的核酸量取决于光照射的功率和暴露时间。
无论组合物是作为核酸还是多肽施用，该组合物都以促进哺乳动物细胞摄取的方式配制。以上描述了有用的载体系统和制剂。在一些具体例中，载体可以将组合物递送至特定的细胞类型。然而，本发明不限于此，还考虑了其他DNA递送方法，例如使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂质体复合物、表面活性剂和全氟化学液体的化学转染，其如同物理递送方法，例如电穿孔，微注射，弹道颗粒和“基因枪”系统。
在其他具体例中，组合物包含已经用一种或多种Cpf1编码载体和gRNA转化或转染的细胞。在一些具体例中，本发明的方法可以离体应用。也就是说，受试者的细胞可以从体内去除，且是用培养物中的组合物来处理以切除，例如HIV序列，并且该经处理的细胞返回到受试者的身体。细胞可以是受试者的细胞，或者可以是单体型匹配或细胞是。细胞可以被照射以防止复制。在一些具体例中，细胞是人类白细胞抗原(HLA)匹配的、自体的、细胞是或其组合。在其他具体例中，细胞可以是干细胞。例如，胚胎干细胞或人造多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。已经从包括人在内的许多动物物种建立了胚胎干细胞(ES细胞)和人造多能干细胞(诱导多能干细胞、iPS细胞)。此等类型的多能干细胞将成为再生医学细胞的最有用的来源，因为此等细胞能够通过适当诱导其分化而分化为几乎所有的器官，同时在保持其多能性的同时保持积极分裂的能力。特别是iPS细胞可以由自体衍生的体细胞建立，因此相较于通过破坏胚胎产生的ES细胞，不可能引起伦理和社会问题。此外，iPS细胞是自体衍生细胞，可以避免排斥反应，这是再生医学或移植治疗的最大障碍。
根据已建立的方法制备转导细胞用于回输。培养约2-4周后，细胞的数量可以在1×106至1×1010之间。在这方面，细胞的生长特征因患者而异，细胞类型也不同。在回输转导的细胞前约72小时，取等分试样以分析表型和表达治疗剂的细胞的百分比。对于投药，本发明的细胞可以由细胞类型的LD50确定的速率投药，以及在应用于患者的大众和整体健康时以不同浓度的细胞类型的副作用投药。可以通过单次或分次剂量完成投药。成体干细胞也可以使用外源性投药的因子来动员，所述外源性投药的因子刺激其从可能包含，但不限于，骨髓或脂肪组织的组织或空间中产生和排出。
因此，本发明涵盖使整合至受潜伏HIV感染的离体培养宿主细胞的基因组的前病毒DNA的方法，其中，原病毒HIV DNA整合至宿主细胞基因组中。该方法包括获得受潜伏感染HIV的宿主细胞群体的步骤；体外培养宿主细胞；以包含Cpf1内切核酸酶的组合物处理宿主细胞，以及在原病毒HIV DNA的LTR中与靶序列相互补的至少一种gRNA；并从宿主细胞基因组中根除前病毒DNA。当增加以下附加步骤时，相同的方法步骤对于治疗受潜伏感染的宿主细胞群体的供体也是有用的：产生HIV根除的T细胞群体；将HIV消根除的T细胞群注入患者体内；并治疗病人。
已经证明有效用于受潜伏感染的T细胞的离体处理的组合物和方法，若通过一种或多种合适的表达载体递送，则很可能在体内有效。因此，本发明涵盖用于使哺乳动物受试者细胞中的整合HIV DNA失活的药物组合物，所述药物组合物包括编码内切核酸酶的单离核酸序列和编码至少一种gRNA的至少一种单离核酸序列，其gRNA是与原病毒HIV DNA中的靶序列互补。优选地，包括gRNA分子的组合。药物组合物还优选包含至少一种表达载体，于其表达载体中编码单离核酸序列。
药物组合物
鉴于之前所述的CRISPR/Cpf1在使潜伏病毒失活的应用，本发明还提供了用于使哺乳动物受试者细胞中的整合前病毒失活的药物组合物。该组合物包含编码Cpfl内切核酸酶的单离核酸序列；和至少一种单离核酸序列，其编码与原病毒前病毒DNA中的靶序列互补的至少一种指导RNA(gRNA)。优选地，单离核酸序列被包括在至少一个表达载体中。
本发明还提供治疗受病毒感染的哺乳动物受试者的方法。该方法包括以下步骤：确定哺乳动物受试者受病毒感染，向受试者施用有效量的前述药物组合物，以及治疗受试者的病毒感染。
在其他具体例中，提供了在细胞或受试者中抑制逆转录病毒(如HIV)复制的方法，是包括使所述细胞接触或给予所述受试者药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的编码Cpfl内切核酸酶的单离核酸序列；至少一个指导RNA(gRNA)，所述gRNA与逆转录病毒基因组、抗病毒剂或其组合中的靶核酸序列互补。在某些具体例中，根除细胞或受试者中的逆转录病毒基因组的方法，是包括使细胞接触或给予受试者包括治疗有效量的基因编辑剂的药物组合物；至少一个指导RNA(gRNA)，所述gRNA与逆转录病毒基因组、抗病毒剂或其组合中的靶核酸序列相互补。此外，一种或多种缓解可能与病毒感染有关的其他症状的治疗剂，例如，发烧、寒战、头痛、继发感染可以与药物组合物一起或作为药物组合物的一部分或在不同的时间施用。此等试剂包括但不限于解热剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗寄生物剂、化学治疗剂，抗生素、免疫调节剂或其组合。
组合物的治疗有效量(即有效剂量)是指足以产生治疗(例如临床)期望结果的量。该组合物可以每天一次或多次一次或每周一次或多次投药；包含隔日一次。本领域技术人员将认识到，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或失调的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康及/或年龄以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一是列治疗。
本发明的药物组合物可以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。无论其起始来源或获得的方式如何，本发明的组合物都可以根据其用途来配制。例如，可将上述核酸和载体配制在组合物中以施用于组织培养中的细胞或施用于患者或受试者。可以配制本发明的任何药物组合物用于制备药物，并且具体用途在下文中在治疗的背景下指出，例如治疗患有HIV感染或处于感染风险和HIV感染的患者感染。当用作药物时，任何核酸和载体可以药物组合物的形式施用。此等组合物可以制药领域熟知的方式制备，并且可以通过各种途径投药，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。投药可以是局部的(包括眼内和粘膜包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、眼部、口服或肠胃外。用于眼部递送的方法可以包括局部施用(滴眼剂)，结膜下、眼周或玻璃体内注射或通过球囊导管或手术放置在结膜囊中的眼科插入物引入。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内投药，例如鞘内或心室内投药。肠胃外投药可以是单次推注剂量的形式，或者可以是例如连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。
本发明还包括药物组合物，其含有作为活性成分的本文所述的核酸和载体以及一种或多种药学上可接受的载体。所用术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)来表示当适当地施用于动物或人时不会产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括可以使用的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等作为药学上可接受的物质的介质。在制备本发明的组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或封闭在例如胶囊、片剂、小袋、纸或其他容器形式的载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料(例如生理盐水)，其作为活性成分的载体、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、作为固体或在液体介质中的气雾剂、洗剂、乳膏剂、软膏剂、凝胶、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末。如本领域所知，稀释剂的类型可以根据预期的投药途径而变化。所得到的组合物可以包含其他试剂，例如防腐剂。在一些具体例中，载体可以是或可以包括基于脂质或聚合物的胶体。在一些具体例中，载体材料可以是配制为脂质体、水凝胶、微粒、纳米粒子或嵌段共聚物胶束的胶体。如上所述，载体材料可以形成胶囊，并且该材料可以是基于聚合物的胶体。
本发明的核酸序列可以被递送至受试者的适当细胞。这可以通过例如使用聚合的，生物可降解的微粒或微胶囊递送载体来实现，其尺寸被设计为优化吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用。例如，可以使用直径约1至10μm的PLGA(聚乳糖-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸封装在此等微粒中，此等微粒被巨噬细胞摄取并在细胞内逐渐生物降解，由此释放多核苷酸。一旦释放，DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒意图不被细胞直接摄取，而是主要用作核酸的缓释储库，其仅在通过生物降解从微粒释放时才被细胞吸收。因此此等聚合物颗粒应大得足以阻止吞噬作用(即，大于5μm并且优选大于20μm)。实现核酸吸收的另一种方式是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独导入此等递送载体中或与组织特异性抗体共同导入，例如靶向通常受潜伏感染HIV感染储库的细胞类型的抗体，例如脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠道-相关的淋巴细胞。或者，可以通过静电或共价力制备由质粒或与聚-L-赖氨酸连接的其他载体组成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合可结合靶细胞受体的配体。将“裸DNA”(即不含递送载体)递送到肌内、皮内或皮下部位是实现体内表达的另一种手段。在相关多核苷酸(例如表达载体)中，编码包含编码CRISPR相关内切核酸酶和指导RNA的序列的单离核酸序列的核酸序列与启动子或增强子-启动子组合有效连接。上面描述了启动子和增强子。
在一些具体例中，本发明的组合物可以配制成纳米颗粒，例如，由与DNA复合并且被聚乙二醇修饰(聚乙二醇化)低的壳包围的高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)的核心组成的纳米颗粒分子量LPEI。
核酸和载体也可以应用于装置(例如导管)的表面或包含在泵，贴片或其他药物递送装置内的表面。本发明的核酸和载体可以在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)存在下单独或以混合物形式投药。根据投药方式和途径来选择赋形剂或载体。在本领域众所周知的参考文献Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin)和USP/NF(United States Pharmacopeia and the National)中描述了合适的药物载体以及用于药物制剂的药物必需品处方)。
在一些具体例中，组合物可以配制成用于阻断HIV的性传播的局部凝胶。局部凝胶可以在性行为之前直接应用于男性或女性生殖器区域的皮肤或粘膜。或者，或另外，可以将局部凝胶施用于表面或包含在男性或女性避孕套或隔膜内。
本发明还包括治疗受HIV感染的哺乳动物受试者的方法，其包括以下步骤：确定哺乳动物受试者受HIV感染，向受试者施用有效量的前述药物组合物，以及治疗受试者的HIV感染。
根据本发明的药物组合物可以以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。例如，上述核酸和载体可以配制在组合物中以施用于组织培养中的细胞或施用于患者或受试者。此等组合物可以制药领域熟知的方式制备，并且可以通过各种途径投药，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。投药可以是局部的(包括眼科和粘膜包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂、包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、眼部、肠道。用于眼部递送的方法可以包括局部施用(滴眼剂)，结膜下、眼周或玻璃体内注射或通过球囊导管或手术放置在结膜囊中的眼科插入物引入。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内施用。肠胃外投药可以是单次推注剂量的形式，或者可以是例如连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。
本发明还包括药物组合物，其含有作为活性成分的本文所述的核酸和载体以及一种或多种药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指适当时在施用于动物或人时不产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括可以使用的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等作为药学上可接受的物质的介质。在制备本发明的组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或封闭在例如胶囊、片剂、小袋、纸或其他容器形式的载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料(例如生理盐水)，其作为活性成分的载体、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、作为固体或在液体介质中的气雾剂、洗剂、乳膏剂、软膏剂、凝胶、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末。如本领域所知，稀释剂的类型可以根据预期的投药途径而变化。所得到的组合物可以包含其他试剂，例如防腐剂。在一些具体例中，载体可以是或可以包括基于脂质或聚合物的胶体。在一些具体例中，载体材料可以是配制为脂质体、水凝胶、微粒、纳米粒子或嵌段共聚物胶束的胶体。如上所述，载体材料可以形成胶囊，并且该材料可以是基于聚合物的胶体。
在一些具体例中，本发明的组合物可以配制成纳米颗粒，例如纳米颗粒，其由与DNA复合并且被聚乙二醇改性(聚乙二醇化)低分子量壳体包围的高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)的核心组成LPEI。在一些具体例中，组合物可以配制为封装本文中包含的组合物的纳米粒子。L-PEI已被用于将基因体内有效地递送到各种器官，如肺、脑、胰腺、视网膜、膀胱以及肿瘤。L-PEI能够在体外和体内有效地浓缩，稳定和递送核酸。
核酸和载体还可以施加到装置(例如导管)的表面或包含在泵，贴片或任何其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可以在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)存在下单独或以混合物形式投药。根据投药方式和途径来选择赋形剂或载体。在本领域众所周知的参考文献Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin)和USP/NF(United States Pharmacopeia and the National Formulary)中描述了合适的药物载体以及用于药物制剂的药物必需品，。
在一些具体例中，组合物可以配制为封装编码Cpf1或变体Cpf1的核酸和与靶HIV互补的至少一个gRNA序列的纳米颗粒；或者其可包括编码此等组件的载体。或者，可以将组合物配制成封装内切核酸酶及/或由本发明的一种或多种核酸组合物编码的多肽的纳米粒子。
在治疗HIV感染的方法中，可以使用标准临床测试来识别受试者，例如免疫测定以侦测受试者血清中HIV抗体或HIV多肽p24的存在，或通过HIV核酸扩增测定。提供给受试者的此组合物的量，该组合物的量为导致完全根除感染症状、减轻感染症状的严重程度或减缓感染进展的量被认为是治疗有效量。本方法还可以包括监测步骤以帮助优化投药和调度以及预测结果。在本发明的一些方法中，可以首先确定患者是否受潜伏的HIV感染，然后确定是否用本文所述的一种或多种组合物治疗患者。
当在潜在的宿主细胞中稳定表达时，本发明的组合物减少或防止了HIV的新感染。因此，本发明涵盖预防有HIV感染风险的患者的T细胞的HIV感染的方法。该方法包括确定患者有被HIV感染的风险的步骤；将患者的T细胞暴露于有效量的表达载体组合物，所述表达载体组合物包含编码内切核酸酶的单离核酸及编码至少一种与HIV DNA中的靶序列互补的gRNA的至少一种单离的核酸；在T细胞中稳定表达内切核酸酶及至少一种gRNA；以及预防T细胞的HIV感染。
举例言之，具有HIV感染风险的受试者可以是无进行保护的性行为的任何性行为活跃的人，即不使用避孕套进行性行为；患有另一种性传播感染的性活跃的个体；静脉注射吸毒者；或一个未受割礼的人。例如，具有HIV感染风险的受试者也可以是其职业可能使其与HIV感染人群(例如医疗保健工作者或第一响应者)接触的个体。处于感染艾滋病毒风险的受试者可以是例如惩教机构的囚犯或性工作者，即将性活动用于收入性就业或非货币性项目如食品、药品或住所的个人。
用于治疗遗传疾病的CRISPR/Cpfl组合物
众所周知，CRISPR/Cas9系统不仅能产生DNA序列的断裂或切除，而且能产生所需DNA序列的后续剪接(参见例如Doudna和Charpentier，Science 346,1258096-11258096-9(2014))。存在于Cas9介导的切割附近的单链寡核苷酸可以通过同源定向修复插入切割位点。该过程已被证实可成功修正小鼠模型中的遗传缺陷(Yin H.等，Nature Biotech 32,551-554(2014))。若CRISPR/Cas系统及其钝端切割可用于修正遗传疾病，则CRISPR/Cpfl系统将在断裂处留下粘性末端，这将证明更加有用。
因此，本发明提供了用于修正细胞中的遗传疾病的方法。该方法包括以下步骤：提供一细胞，其细胞的DNA包含致病突变DNA序列；将细胞暴露于至少一种与致病突变DNA序列邻近的靶位点相互补的gRNA；将细胞暴露于Cpfl内切核酸酶；以至少一种gRNA将Cpfl内切核酸酶导向靶位点；以Cpfl内切核酸酶引起与致病突变DNA序列相邻的DNA中的双链断裂；将细胞暴露于单离的单链供体寡核苷酸，所述单链供体寡核苷酸包含对应于致病突变DNA序列的野生型DNA序列；以野生型DNA序列取代引起致病突变DNA序列；以及修正遗传疾病。
通过适当设计的gRNA，CRISPR/Cdfl系统可以有效修正遗传疾病，特别是单突变引起的疾病，包含，但不限于，囊性纤维化、严重联合免疫缺陷、腺苷脱氨酶缺乏症、慢性肉芽肿病、血友病、戈谢病和雷特综合征。
用于基因组测序和诊断的CRISPR/Cpfl组合物和方法
荧光成像和图像分析方面的最新进展已经导致用于诊断疾病和遗传分析的更快、更简单、更容易获得的技术，包括全基因组分析。通过特定DNA序列或基序的荧光标记，可以对整合的HIV-1和其他整合病毒进行可视化和定量分析；测量可通过重复TTAGGG序列识别的基因组DNA中的端粒长度；计数基因的拷贝数和核苷酸重复，例如PolyQ疾病的特征性重复；定位和定量与DNA损伤和癌症风险相关的逆转录转座子；并用诸如系统等仪器对整个染色体进行测序，该系统将整条染色体线性化并根据标记的DNA基序的位置进行测序。
CRISPR/Cas9系统已成功修改为标记而不是剪切DNA链上的特定靶序列。一种策略涉及使用先前描述的催化缺陷型Cas9和至少一种gRNA将催化缺陷型Cas9结合至特定的靶DNA序列。用荧光多肽或其他可侦测信号标记催化缺陷的Cas9，从而使其与靶序列标签结合，所述标签序列用于侦测。或者，或另外，还可以借助于附着于gRNA的一个或多个环的适体来标记一种或多种gRNA。适体可以结合二聚体噬菌体外壳蛋白MS2、MS2又可以与一种单一或多种荧光蛋白例如EGFP融合。
另一种策略涉及使用如前所述的Cas9切口酶形式之一。切口酶通过合适的gRNA导向靶序列，以在单链DNA中产生切口。在该位点提供荧光团标记的核苷酸以及DNA聚合酶。以荧光团标记的核苷酸修复该缺口，在靶序列处产生可侦测的标记。
如前所述，使用类似于用于Cas9的策略可能产生催化缺陷和Cpfl切口酶突变体。因此CRISPR/Cpfl系统将大幅地扩展基因组标记的可能性，因为该CRISPR/Cpfl系统识别与CRISPR/Cas9识别的该些序列几乎没有重叠的一组靶序列。
因此，本发明提供了用于缺口标记基因组中靶位点处的DNA序列的方法。该方法包括将DNA基因组暴露于Cpf1内切核酸酶的切口酶突变体的步骤；将该DNA基因组暴露于至少一种指导gRNA，所述至少一种指导gRNA与位于靶位点内的靶序列互补；以至少一种gRNA将切口酶突变体Cpfl导向靶序列；切割该靶序列；产生一个带切口靶序列；将该带切口的靶序列暴露于至少一种标记的核苷酸(NT)；将标记的NT导入带切口的靶序列中；以及标记基因组中靶位点的DNA序列。
本发明还包含用于在基因组中的靶位点标记DNA序列的组合物。该组合物包含至少一种催化缺陷的Cpf1内切核酸酶以及至少一种指导RNA(gRNA)，其中，所述至少一种gRNA与靶位点处的靶DNA序列互补。将可侦测标记如荧光标记导入至少一种催化缺陷的Cpf1内切核酸酶、至少一种gRNA或两者中。
试剂盒
本发明还包括一种试剂盒，以便于应用先前所述的治疗和预防HIV感染的方法。所述试剂盒包括测量含量的组合物，所述组合物包含至少一种编码内切核酸酶的单离核酸序列和至少一种编码一种或多种gRNA的核酸序列，其中，每种gRNA包含互补于靶序列的间隔序列HIV原病毒。该试剂盒还包括一种或多种选自包装材料、包含使用说明书的包装插页、无菌流体、注射器和无菌容器的物品。在一优选的具体例中，核酸序列被包括在表达载体中。该试剂盒还可以包含合适的稳定剂、载体分子、调味剂等，适用于预期用途。
在其他具体例中，试剂盒进一步包含一种或多种减轻可能与黄病毒(flavivirus)感染相关的一些症状或继发细菌感染的抗病毒剂及/或治疗剂。因此，包装的产品(例如含有一种或多种本文所述的组合物并被包装用于以浓缩或即用型浓度储存、运输或销售的无菌容器)和包括本发明的至少一种组合物的试剂盒编码内切核酸酶例如Cpf1内切核酸酶的核酸序列和与逆转录病毒中的靶序列互补的指导RNA或编码该核酸的载体和使用说明也在本发明的范围内。
产品可以包括含有一种或多种本发明组合物的容器(例如，小瓶、罐子、瓶子、袋子等)。另外，制品还可以包括例如包装材料、使用说明书、注射器、递送装置、缓冲液或其他控制试剂，用于治疗或监测需要预防或治疗的病症。产品还可以包括图例(例如，印刷标签或插入物或描述产品使用的其他介质(例如音频或录像带))。该图例可以与容器(例如固定在容器上)相关联，并且可以描述其中应该施用组合物的方式(例如施用频率和途径)、其适应症和其他用途。组合物可以准备投药(例如以剂量合适的单位存在)，并且可以包含一种或多种另外的药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂及/或另外的治疗剂。或者，组合物可以以稀释剂和稀释说明书的浓缩形式提供。虽然以上已经描述了本发明的各种实施例，但应理解的是，它们仅作为示例呈现，而非限制。在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以根据本文的揭露对所揭露的实施例进行各种改变。因此，本发明的广度和范围不应该受到任何上述实施例的限制。
本文提及的所有文件通过引用并入本文。本申请中引用的所有出版物和专利文献通过引用并入用于所有目的，就如同各别出版物或专利文献被如此独立地表示一样。通过引用本文件中的各种参考文献，申请人不承认任何特定的参考文献是其发明的“现有技术”。
实施例
通过以下具体实例进一步说明本发明。提供此等实施例仅用于说明，不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1：用于失活和根除潜伏HIV-1的CRISPR/Cpfl系统
已确定，整合至人类T细胞和其他宿主细胞中的潜伏HIV-1可以通过Cas9/gRNA系统失活并且在许多情况下可以从宿主基因组中彻底根除。特别有效的是gRNA与前病毒HIV-1的长末端重复(LTR)中的靶序列互补，特别是U3区中的靶序列。在一些具体例中，具有对不同靶序列特异性的每个成员的gRNA对特别有效地引起在5'和3'LTR之间延伸的整个DNA片段的切除(Hu W.等人，Proc Natl Acad Sci USA 111,1141-111466(2014)；Khalili等，2015，国际专利申请WO2015/031775)。
如前所述，还已知源自氨基酸球菌(Acidaminococcus)和柳螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)的Cpf1内切核酸酶是由gRNA所引导，其gRNA与自共有PAM5'-TTN的延伸约24个核苷酸3'的靶序列相互补(Zetsche B.等，Cell 163,1-13 October 22,2015)。因此，HIV-1LTR中的此等核苷酸序列可能作为Cpf/gRNA系统的靶序列。也就是说，与人类HIV-1LTR中至少一部分靶序列互补的gRNA将于与Cpf1复合时引起潜伏前病毒HIV-1的失活及/或根除。表1列出在人类HIV-1LTR中定义的一组靶序列。靶序列来源于Khalili等人的国际专利申请号WO2015/031775的图18中所揭露的HIV-LTR核苷酸序列。根据每个序列的PAM(如括号中所示)所处的LTR区域对序列进行分类。
表1.人HIV-1LTR中的Cpfl/gRNA靶序列
本发明包括与表1中列出的每个靶序列互补的gRNA。本发明的gRNA可以包括或不包括与靶序列的PAM序列互补的序列。gRNA可以与所列序列的截短变体互补，例如在3'末端被截短了1、2、3或更多个核苷酸的序列。gRNA可以与表1中列出的靶序列小于100％互补。例如，gRNA可以与列出的靶序列75％互补，或者与列出的靶序列80％互补，85％或90％或95％、96％、97％、98％、99％与列出的靶序列互补。本发明包括与每个列出的靶序列的反义链互补的gRNA，或95％互补的，或与被1,2,3或更多个核苷酸截短的反义序列互补的gRNA。应理解，表1仅包括HIV-1LTR中靶序列的代表性样品。与不同PAMS相邻的其他序列也可以存在，并且也在本发明的范围内。
在某些具体例中，用于在体外或体内使宿主细胞基因组中的靶基因失活的组合物包含至少一种编码Cpfl(来自普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列，以及至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA与靶基因中的靶序列具有至少75％的互补序列一致性。在某些具体例中，所述至少一种gRNA包含与靶基因中的靶序列至少95％的互补序列一致性。在其他具体例中，所述至少一种gRNA与靶基因中的靶序列互补。在某些具体例中，靶基因包含逆转录病毒基因组(例如人类免疫缺陷病毒(HIV))的编码和非编码核酸序列。在某些具体例中，非编码区包含HIV的长末端重复序列或HIV长末端重复序列内的序列。在其他具体例中，HIV的长末端重复序列内的序列包含U3，R或U5区域内的序列。
该gRNA在某些具体例中处于多重构型，或者由相同的载体编码或者物理单离的载体编码。每个载体可以编码单个gRNA或多个gRNA，该多个gRNA具有与一个或多个靶序列互补序列一致性的组合。因此，在某些具体例中，组合物包含与人类免疫缺陷病毒的多个靶核酸序列互补的多个指导RNA核酸序列。
在一些具体例中，靶基因在与具有SEQ ID NOS：1至33的任一序列包括有至少75％的序列一致性。在其他具体例中，靶基因包括具有SEQ ID NOS：1至33的任一序列。
如上所述，在某些具体例中，编码Cpfl(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)内切核酸酶的一种单离核酸序列和编码至少一种指导RNA(gRNA)的单离核酸序列由相同的载体表达。在其他具体例中，编码Cpfl(来自普氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1的CRISPR)内切核酸酶的一种单离核酸序列由第一载体表达，并且编码所述至少一种指导RNA(gRNA)的单离核酸序列由第二载体表达。
在其他具体例中，组合物任选地包含一种或多种抗病毒剂、化学治疗剂、抗真菌剂、抗寄生物剂、抗菌剂、抗炎剂、免疫调节剂或其组合。在其它具体例中，此等药剂中的任何一种或多种可投药予有此需要的受试者于共治疗结合施用，此等药剂中的一种或多种可在施用在本文中体现的组合物同时施用，此等药剂中的一种或多种可于施用本文中体现的组合物前施用，或可于施用本文中体现的组合物后施用，或作为正常治疗策略的一部分。
本发明的gRNA一般依据Zetsche B.等人，Cell 163,1-13 October 2015,2015所述合成。将gRNA的复制至用于在宿主细胞中表达的载体中，如于Hu等人，2014，及Khalili等人的WO2015/031775的文献中所述，此二全文并入参考。藉由基因组分析、Surveyor分析以及病毒的感染、活化和表达的分析，来筛选用于基因编辑活性的Cpf1/gRNA组合，如Hu W.等，Proc Natl Acad Sci USA 111,1 1461-11466(2014)以及授予Khalili等人的WO2015/031775的文献中所揭露。
本发明已经说明性方式描述，并应理解，所用的术语旨在具有描述性文字的性质，而非限制性的。显而易见地，鉴于上述教导，本发明的许多修改和变化是可能的。因此，应理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以与实质描述不同的方式实施。

Claims (40)

1.一种用于在体外或体内使宿主细胞基因组中的靶基因失活的组合物，其包括：
至少一种编码Cpf1(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列,以及
至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA与所述靶基因中的靶序列具有至少75％的互补序列一致性。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包括与所述靶基因中的靶序列具有至少95％的互补序列一致性。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA与所述靶基因中的靶序列相互补。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述靶基因包括逆转录病毒基因组的编码和非编码核酸序列。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述逆转录病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)。
6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述非编码区包括HIV的长末端重复序列或所述HIV长末端重复序列内的序列。
7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述HIV长末端重复序列中的序列包括U3，R或U5区域内的序列。
8.如权利要求1所述的组合物，更包括与人类免疫缺陷病毒的复数个靶核酸序列互补的复数个指导RNA核酸序列。
9.如权利要求1所述的组合物，其中，所述靶基因与具有SEQ ID NO：1至33的任一序列包括有至少75％的序列一致性。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述靶基因包括具有SEQ ID NO：1至33的任一序列。
11.如权利要求1所述的组合物，其中，所述编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的一单离核酸序列，及编码所述至少一种指导RNA(gRNA)的一单离核酸序列皆是通过载体来表达。
12.如权利要求1所述的组合物，其中，该编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的一单离核酸序列是以第一载体来表达，且编码所述至少一种指导RNA(gRNA)的一单离核酸序列是以第二载体来表达。
13.如权利要求1所述的组合物，其任选地包括一种或多种的：抗病毒剂、化学治疗剂、抗真菌剂、抗寄生物剂、抗菌剂、抗炎剂、免疫调节剂或其组合。
14.一种用于在体外或体内使宿主细胞基因组中的靶基因失活的组合物，其包括：
至少一种编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列，
至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA至少一种gRNA与靶基因中的靶序列相互补。
15.一种使宿主细胞基因组中的靶基因失活的方法，包含以下步骤：
以至少一种编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列来处理所述宿主细胞；
以编码指导RNA(gRNA)的至少一种单离核酸序列来处理所述宿主细胞，所述至少一种gRNA与所述靶基因中的靶序列相互补；以及
使所述靶基因失活。
16.一种用于使宿主细胞基因组中整合的前病毒DNA失活的组合物，其包含：
至少一种编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列，以及
至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA与前病毒DNA中的靶序列相互补。
17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述前病毒DNA包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的前病毒DNA、人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)、人类嗜T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或JC病毒(JCV)。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，所述前病毒DNA是HIV-1DNA，且所述至少一种gRNA与HIV-1DNA中的靶序列相互补。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA与HIV-1DNA的长末端重复序列(LTR)中的靶序列相互补。
20.一种使宿主细胞基因组中整合的前病毒DNA失活的方法，包含以下步骤：
以至少一种编码Cpf1(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列来处理具有整合的前病毒DNA的宿主细胞；
以编码至少一种指导RNA(gRNA)的至少一种单离核酸序列来处理所述宿主细胞，所述至少一种gRNA与前病毒DNA中的靶序列相互补；以及
使前所述病毒DNA失活。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述前病毒DNA包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的前病毒DNA、人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)、人类嗜T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或JC病毒(JCV)。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述靶序列位于前病毒HIV-1DNA中。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述位于HIV-1前病毒DNA中的靶序列是位于所述前病毒HIV-1DNA的长末端重复序列(LTR)中的靶序列。
24.一种用于在体外或体内使宿主细胞的基因组中的靶基因失活的载体组合物，其包括：
至少一种编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列，以及
至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA与所述靶基因中的靶序列相互补；
所述编码所述至少一种Cpf1内切核酸酶的所述至少一种单离核酸序列及所述至少一种gRNA，其gRNA被包含于至少一种表达载体中，
其中，所述至少一种表达载体在宿主细胞中诱导所述至少一种Cpf1内切核酸酶及所述至少一种gRNA的表达。
25.如权利要求24所述的载体组合物，其中，所述至少一种表达载体包含慢病毒表达载体。
26.一种预防有病毒感染风险的患者的宿主细胞的病毒感染的方法，包括以下步骤：
确定患者有被病毒感染的风险；
将所述处于感染风险的患者的宿主细胞暴露于有效量的表达载体组合物及至少一种指导RNA(gRNA)，所述表达载体组合物包含编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸，其指导RNA(gRNA)是与所述病毒的基因组中的靶序列相互补；
在宿主细胞中稳定表达该Cpfl内切核酸酶及该至少一种gRNA；以及
防止所述病毒感染所述宿主细胞。
27.如权利要求26的方法，其中，所述病毒是选自人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)、人类嗜T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或JC病毒(JCV)。
28.一种用于使哺乳动物受试者细胞中的整合的前病毒失活的药物组合物，其包括：
编码Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的单离核酸序列；以及
编码至少一种指导RNA(gRNA)的至少一种单离核酸序列，其指导RNA(gRNA)与前病毒DNA中的靶序列相互补；所述单离核酸序列被包含在至少一个表达载体中。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中，所述前病毒包括：人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人类嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)、人类嗜T淋巴细胞病毒II型(HTLV-II)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或JC病毒(JCV)。
30.如权利要求28所述的药物组合物，更包括一种或多种的：抗病毒剂，化学治疗剂，抗真菌剂，抗寄生物剂，抗菌剂，抗炎剂，免疫调节剂或其组合。
31.一种用于治疗受病毒感染的哺乳动物受试者的方法，其包含以下步骤：确定哺乳动物受试者是受病毒感染，向所述受试者施用有效量的如权利要求28所述的药物组合物，以及治疗所述受试者的病毒感染。
32.一种用于修正细胞中的遗传疾病的方法，包含以下步骤：
提供细胞，其细胞的DNA包含致病突变的DNA序列；
将所述细胞暴露于至少一种与所述致病突变DNA序列邻近的靶位点相互补的指导RNA(gRNA)；
将细胞暴露于Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶；
以至少一种gRNA将Cpfl内切核酸酶导向靶位点；
以所述Cpfl内切核酸酶引起与所述致病突变DNA序列邻近的DNA中的双链断裂；
将所述细胞暴露于单离的单链供体寡核苷酸，所述单链供体寡核苷酸包含对应于与致病突变DNA序列的野生型DNA序列；
以同源定向修复以野生型DNA序列取代所述致病突变DNA序列；以及
修正所述遗传疾病。
33.一种用于侦测DNA基因组中的靶序列的方法，包含以下步骤：
将DNA基因组暴露于Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶的切口酶突变体；
将所述DNA基因组暴露于至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA与位于靶位点内的靶序列互补；
以所述至少一种gRNA将所述切口酶突变体Cpfl导向所述靶序列；
切割所述靶序列；
产生带切口的靶序列；
将所述带切口的靶序列暴露于至少一种标记的核苷酸(NT)；
将所述标记的NT导入带切口的靶序列中；
标记基因组中靶位点的DNA序列；以及
侦测所述基因组中的靶序列。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述至少一种标记的NT是荧光标记的NT。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述靶位点是位于选自前病毒逆转录病毒的DNA，端粒或逆转录转座子的位置内。
36.一种用于侦测基因组中的靶位点处的靶DNA序列的组合物，其包括：
至少一种催化缺陷型Cpfl(来自普氏菌和弗朗西斯菌1的CRISPR)内切核酸酶，以及
至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA与靶位点处的靶序列相互补；
其中，所述至少一种催化缺陷的Cpf1内切核酸酶、所述至少一种gRNA或所述至少一种催化缺陷的Cpf1内切核酸酶和所述至少一种gRNA二者皆包含可侦测的标记。
37.如权利要求36所述的组合物，其中，所述至少一种催化缺陷型Cpfl包含所述可侦测的标记。
38.如权利要求37所述的组合物，其中，所述可侦测的标记是荧光多肽。
39.如权利要求38所述的组合物，其中，所述荧光多肽是选自扩展绿色蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
40.如权利要求39所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包含所述可侦测的标记，所述可侦测的标记利用适配体与所述至少一种gRNA连接。
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