CN109640946A - 通过基因编辑策略进行hiv-1的负反馈调节 - Google Patents

Abstract

一种CRISPR‑核酸内切酶基因编辑组合物，包括一种以用于被该核酸内切酶裂解的特异性病毒序列为靶向的向导RNA(gRNA)，该组合物诱导被该gRNA识别的双链DNA中的断裂。将基因编码Cas9置于最小启动子例如横跨该5'‑LTR的HIV的控制之下，导致由HIV‑1反式激活蛋白Tat造成的激活。例如HIV特异性的RNA的多倍体和核酸内切酶如Cas9在细胞中的共表达，导致病毒DNA片段的修饰及/或切除，从而在体外和体内根除该病毒。

Description

通过基因编辑策略进行HIV-1的负反馈调节

联邦资助研究的声明

本发明在政府支持下完成，受到美国国立健康研究所(National Institutes ofHealth)的资助，批准号分别为：P30MH092177(Khalili)、P01DA037830(Khalili)、R01MH092371(Khalili)、和R01NS087971(Khalili和Hu)。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明的具体实施例针对预防、治疗和根除受试者体内逆转录病毒感染的基因编辑复合物。尤其是，该基因编辑复合物包含成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶，该酶处于可由病毒转录调节因子有条件地激活的最小的病毒启动子的控制之下。

背景技术

在HIV-1感染后不久，该病毒基因组就变为被整合入宿主染色体内，并迅速在CD4⁺T细胞中表达。HIV-1复制导致CD4⁺T细胞的急剧耗尽(Alimonti,J.B.,etal.J.Gen.Virol.84,1649-1661(2003)；Okoye,A.A.,Picker,L.J.Immunol Rev 254,54-64(2013))。通常，在感染的急性期之后，该病毒进入被称为潜伏期的新阶段，在该阶段，被整合的前病毒DNA继续被表达且病毒复制以非常低的水平继续进行。在这些情况下，长期持续的病毒复制造成的免疫系统弱化朝着AIDS发展，且若不治疗，则广泛的机会感染的发展将最终导致患者在三年内死亡(3)。在分子层面，急性和慢性两种阶段的该病毒基因组的表达及其复制受控于横跨该5'-长末端区域(LTR)的450个核苷酸的病毒启动子(Garcia,J.A.,et al.EMBO J.8,765-778(1989)；Reddy,E.P.,Dasgupta,P.Pathobiology 60,219-224(1992))。识别位于该5'-LTR的U3区域内DNA序列的一系列细胞转录因子与该HIV-1即刻早期转录激活因子Tat之间出现协同作用，其中，Tat与位于该病毒转录本前导区内的TAR RNA序列相互作用。这些相互作用为从被整合的病毒DNA复本进行稳健的启动和有效延长的转录所需(Marcello,A.,et al.IUBMB Life 51,175-181(2001)；Roebuck,K.A.et al.,GeneExpr 8,67-84(1999))。尽管目前抗逆转录病毒药物已经有效地阻抑病毒感染周期，但该药物尚有待于含有某些在转录层面抑制病毒基因表达的组分，这一现象支持下述观点，即被整合的病毒复本可以继续在ART下在HIV-1+患者体内表达该病毒基因组，即使表达水平非常低(Hatano,H.,et al.AIDS 24,2535-2539(2010)；Pasternak,A.O.,etal.J.Clin.Microbiol.46,2206-2211(2008))。事实上，一旦中止ART，病毒基因的表达急剧提升，并产生病毒早期调节性蛋白如Tat以造成该病毒基因组的高效复制。

近年来，更多的注意力集中到研发指向治愈HIV-1/AIDS的有效且安全的策略上。在这方面，出现了几种途径，包括通过激活休眠病毒并促使免疫细胞产生作用而清除潜伏性感染的细胞，这一途径称为“先激活后绝杀”(shock and kill)策略。尽管这一策略最初备受期待，但已经显示出其效力有限且结果相悖(Archin,N.M.,et al.J.Infect.Dis.210,728-735(2014)；Manson McManamy,et al.Antivir.Chem.Chemother.23,145-149(2014)；Siliciano,J.D.et al.J.Allergy Clin.Immunol.134,12-19(2014))。最近，新颖的基因编辑技术的发现，促使多个实验室探索通过将突变引入病毒基因组及/或支持HIV-1感染的细胞基因的不同区域内而令病毒DNA失活的可能性(Khalili,K.,et al.J.Neurovirol.21,310-321(2015)；White,M.K.,et al.Discov.Med.19,255-262(2015)；Yin,C.,et al.AIDS30,1163-1170(2016))。

发明内容

本发明的具体实施例针对用于在再激活的早期对CRISPR/Cas进行有条件激活的组合物。通过在高效的病毒复制之前，移除该病毒基因的横跨该病毒启动子及/或病毒编码序列的片段，这些组合物完全且永久性地消除病毒复制。多种具体实施例中，组合物包含编码可操作地链接至最小的功能性病毒启动子的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶(CRISPR/Cas)的核酸序列，借助该核酸序列，该最小的病毒启动子处于即刻早期转录激活因子的控制之下，从而在病毒复制的早期有条件地激活CRISPR/Cas。该分离核酸进一步包含至少一个与该病毒中靶点核酸序列互补的向导RNA。该CRISPR/Cas切除病毒基因组的一个片段，例如，横跨病毒启动子及/或病毒编码序列的片段。这些具体实施例中，调整该组合物以切除任何病毒。某些具体实施例中，该病毒是逆转录病毒。

其它方面详述于后。

附图说明

图1A至1E显示，在gRNA的存在下，通过HIV-1 LTR启动子进行的Cas9表达受到导致该病毒启动子断裂的Tat的刺激。图1A是全长度HIV-1 LTR和增强子和核心区域内多种调节基序、以及部分Gag基因的示意图。说明被创建用于Cas9表达的突变体中LTR删除的程度。显示gRNA靶点序列的位置及它们彼此之间的距离。图1B显示，使用含有pX260-LTR-Cas9的全长度LTR(-454/+66)或其突变体(-120/+66或-80/+66)与表达Tat的质粒(pCMV-Tat)一起进行对TZM-bl的共转染，增加了Tat的产生水平，如通过西方墨点法所测(上图)。显示看家α-微管蛋白(中图)和Tat(下图)的表达。图1C显示，使用表达GFP或GFP Tat的腺病毒感染TZM-b1细胞，之后以通过LTR-80/+66启动子表达Cas9且通过U6启动子表达gRNA A/B的慢病毒在分别为2、4和8的三种不同的MOI转导，导致了TZM-b1细胞中被整合的HIV-1 LTR启动子DNA序列的裂解以及205bp DNA碎片的出现(如通过PCR和DNA凝胶分析所测)。图1D是SDS-PAGE，例示性说明如图1C中所示的在TZM-b1细胞中表达的Cas9、β-微管蛋白和Tat蛋白质。图1E是显示荧光素酶试验的图，例示性说明在经如图1C中所示的各种治疗后，被整合的HIV-1 LTR在TZM-b1细胞中的转录活性。

图2A至2C显示，当引入Cas9时，HIV-1感染刺激被整合的病毒DNA的裂解。使用HIV-1JRFL或HIV-1SF162感染以三种不同MOI(2、4、和8)的表达gRNA A/B的慢病毒(LV-gRNAA/B)或对照物(空LV)转导的LTR-80/+66-Cas9报告TZM-bl细胞系，48小时之后，收获细胞，并通过西方墨点法测定蛋白质表达(图2A)，通过PCR/DNA基因分析检测在病毒感染后引入Cas9时，被整合的HIV-1 LTR裂解的水平(图2B)，并通过荧光素酶报告基因试验评估被整合的HIV-1启动子的转录活性(图2C)。

图3A至3C显示，Cas9的Tat刺激作用裂解T细胞内处于潜伏期的涵盖该HIV-1报告基因的被整合的HIV-1 DNA。以对照物(空LV)或LV-gRNA A/B转导具有被整合的LTR-80/+66-Cas9基因复本的2D10细胞，之后以pCMV质粒或pCMV-Tat质粒转染。48小时后，通过西方墨点法测定各种所标示蛋白质的水平(图3A)。通过LTR特异性PCR测定用于评估被整合的HIV-1 DNA状态的基因组DNA，将切除效率测定为截短的扩增子相对于全长度扩增子的百分比，并以任意单位(AU)0至0.5表示(图3B)。通过流式细胞术评估被整合的病毒启动子在裂解后被再次激活的水平，并显示代表性的散点图(图3C)。从该分析中排除红色阳性的细胞、碘化丙啶标记的细胞、和死亡的细胞。

图4A至4C显示，以潜伏性反转药物处理细胞，诱导了Jurkat 2D10细胞内的Cas9表达和被整合的病毒DNA的裂解。如图所示，以对照物(空)或表达gRNA A/B的慢病毒处理表达LTR-80/+66-Cas9的2D10细胞，24小时后，以PMA(P)、TSA(T)、或两者(P/T)处理细胞16小时。通过西方墨点法确定对Cas9-Flag、α-微管蛋白和GFP(被整合的HIV-1基因组的标志)表达的蛋白质研究(图4A)。通过PCR评估用于检测通过Cas9和gRNA A/B进行的被整合LTR DNA内切除的水平的基因组DNA，并如图3B中说明所示，测定切除效率(图4B)。显示了通过流式细胞术进行的GFP报告基因试验以及代表性的散点图(图4C)。

图5A至5G显示，LTR-Cas9/gRNA的表达保护细胞不产生新HIV-1感染。图5A和5B：以LV-gRNA A/B和Lenti-LTR(-80/+66)-Cas9-Blast共转导Jurkat细胞。次日，以HIV-1NL4-3-GFP-P2A-Nef在MOI 0.01感染细胞。在感染的第3天和第5天，收获细胞，并通过LTR特异性PCR使用基因组DNA作为模板评估切除的水平(图5A)，并如图3B、3C中所示进行定量(图5B)。图5C：在TA载体中克隆并选择指定为truncLTR 1至10的10个克隆体后，进行对205bp DNA碎片的直接测序分析，例示性说明切除碎片相对于该对照NL4-3的位置。将gRNA的对应于LTRA序列、LTR B序列和PAM序列的位置、以及用于扩增该DNA的引物高亮表示。图5D：琼脂糖凝胶电泳图，说明在HIV-1感染3天和5天后，实验细胞中对应于UTR、Env、和对照β-肌动蛋白DNA的DNA片段的PCR分析结果。图5E：在感染后三个不同时间点对阳性细胞(病毒表达的标志)的百分比进行流式细胞术定量的结果。通过Taqman^TM进行对应于Gag序列的病毒DNA(图5F)和病毒RNA(图5G)的定量检测，其中，使用β-球蛋白(用于DNA检测)和β-肌动蛋白(用于RNA检测)作为参照物。

图6是通过CRISPR/Cas9对HIV-1进行负反馈调节的示意图。在病毒复制的早期阶段，病毒基因组的基础转录导致Tat蛋白的产生。Tat与病毒转录本中移动的前导序列内的TAR茎环结构的关联，造成对集中细胞调节蛋白的聚集，从而引导病毒转录(实线粗箭头)。在早期，Tat也刺激最小的病毒启动子(描述为ltr)，它驱动Cas9基因的转录。当该新合成的Cas9与多种HIV-1特异性gRNA关联时，该Cas9依次裂解该病毒基因组并通过切除病毒DNA的大片段而令LTR活性永久失活，因此终止HIV-1基因表达和复制。

图7显示，参照HIV-1 NL4-3基因组(SEQ ID NO:26)，该LTR(中灰色(绿色)为高亮，以深灰色(红色)为PAM)以及在TZM-b1和体外感染的Jurkat细胞基因组DNA的PCR中使用的LTR特异性引物(浅灰色(蓝色)为高亮)内，gRNA A/B靶点的位置和核苷酸序列。显示LTR特异性PCR产物((全长度(SEQ ID NO:27)和截短者(SEQ ID NO:30))和预计的被编辑碎片(SEQ ID NO:29)的序列和大小。

图8显示，在使用来自图3A至3C和图4A至4C的Jurkat 2D10报告细胞系的实验中，对用于定量Cas9/gRNA介导的LTR切除效率的LTR特异性PCR反应的代表性琼脂糖凝胶电泳分析结果。

图9A至9C显示，参照HIV-1 NL4-3基因组(SEQ ID NO:26)，LTR(中灰色为高亮(绿色)，PAM(深灰色(红色))和用来通过PCR在Jurkat 2D10细胞中分析切除效果的LTR特异性引物(浅灰色(蓝色)为高亮)内，gRNA A/B靶点的位置和核苷酸组成。显示扩增子((全长度(SEQ ID NO:31)和截短的LTR DNA(SEQ ID NO:34))和预计的被切除DNA碎片(SEQ ID NO:33)的核苷酸序列和大小。

图10A显示，在感染第5天，被转导/感染的Jurkat细胞的代表性荧光显微图像。BFP的表达以表达gRNA的载体的存在为标志。通过GFP的水平监控HIV-1感染。图10B是显示对多个时间点的对照物与经LTR-Cas9处理的实验样品间细胞数目进行定量比较的图。

图11A至11C是显示来自初代人类胎儿星形胶质细胞和小神经胶质细胞的结果的图，其中，以含有lenti-LTR(-80/+66)-Cas9(MOI 10)、lenti-KLV-BFP-LTR A、B(MOI各为3.3)的慢病毒鸡尾酒混合物转导该细胞。在转导3天后，以MOI 1的HIV-1NL4-3-GFP-P2A-Nef/VSV-G感染该细胞。在HIV-1感染一周后，收获细胞，在流式细胞术中通过GFP表达对病毒表达水平进行定量分析(图11A)，通过Taqman qPCR和qRT-PCR使用Gag基因特异性的引物组和探针定量病毒DNA水平(图11B)和病毒RNA水平(图11C)。

具体实施方式

本发明的具体实施例针对组合物及其在通过HIV-1转录激活因子Tat进行病毒再激活的早期阶段有条件地激活CRISPR/Cas9的方法中的用途。通过移除该病毒基因的横跨该病毒启动子及/或病毒编码序列的片段，这些组合物在病毒高效复制之前永久性地清除病毒复制。再者，这些组合物在本文中作为示例的方法中的使用，减轻了对可能由Cas9在细胞内不必要且持久的高水平表达造成的无法预见的并发症的顾虑。

定义

除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管任何与本文中揭示者类似或等效的方法和材料均可在用于测试本发明的实践中使用，但优选本文中揭示的材料和方法。在本发明的说明和主张中，将使用下述术语。

也应理解，本文中使用的术语仅用于揭示特定的具体实施例，而非试图限制。

本文中使用的冠词“一(a)”和“一(an)”指的是一个或超过一个(即至少一个)该冠词的语法宾语。举例而言，“一元件”意为一个元件或超过一个元件。因此，例如“一细胞”的表述包括相同类型的多个细胞。而且，就在详细说明书及/或权利要求书中使用的术语“包括”、“具有”、“具备”或其变体而言，这些术语意图以与术语“包含”相似的方式而囊括在内。

本文中所使用，关于被定义或揭示的项目、组合物、设备、方法、过程、系统等的元件而使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”或“包含(comprised)”及其变体，意为囊括性的或开放性的，允许存在其它元件，从而表明所定义或揭示的项目、组合物、设备、方法、过程、系统等包括那些具化的元件或其适合的等效物，可包括其它元件且仍落入所定义的项目、组合物、设备、方法、过程、系统等的范畴/定义内。

本文中使用的“约”，当指代可测量的值如量、时距等时，意为涵盖与所具体指明的值相距+/-20％、+/-10％、+/-5％、+/-1％、或+/-0.1％的偏差，盖因这些偏差对于实施所揭露的方法是适宜的。或者，尤其是对于生物学系统或过程，该术语可意为处于一值的5倍以及2倍的量级之内。若在申请书和权利要求书中揭示特定的值，则除非明确排除，否则该术语“约”意为应假定处于该特定值的适宜误差范围内。

本文中使用的术语“抗病毒剂”指的是用于治疗病毒的任何分子，且包括减轻与该病毒相关症状的剂，如退热剂、抗炎剂、化疗剂等。抗病毒剂包括而不限于：抗体、适配体、佐剂、反以寡核苷酸、趋化因子、细胞因子、免疫刺激剂、免疫调节剂、B细胞调节因子、T细胞调节因子、NK细胞调节因子、抗原呈递细胞调节因子、酶、siRNA、利巴韦林、蛋白酶抑制剂、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、神经氨酸苷酶抑制剂、核苷酸逆转录酶抑制剂、非核苷酸年转录酶抑制剂、嘌呤核苷酸、趋化因子受体拮抗剂、白介素、或其组合。

本文中使用的术语对逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)的“根除”，意为该病毒不能复制，该基因组被删除、碎片化、降解、基因层面失活、或任何防止该病毒被传送至或感染任何其它细胞或受试者的其它物理学、生物学、化学或结构性表现，导致该病毒从体内清除。一些情形中，该病毒基因组的碎片可能是可检测的，但该病毒不能复制或感染等。

本文中使用的“有效量”，意为提供治疗性或预防性益处的量。

“编码”指的是多核苷酸的具体核苷酸序列如基因、cDNA或mRNA所固有的性质，令其作为模板而用于在生物过程中合成具有所定义的核苷酸序列(如，rRNA、tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列以及自其所得的生物学性质的其它聚合物和大分子。因此，如果mRNA对应于一基因的转录和转译在细胞或其它生物学系统中产生一蛋白质，则该基因编码该蛋白。其核苷酸序列与该mRNA序列相同且一般提供在序列表中的编码链、以及作为模板用于基因或cDNA转录的非编码链，两者均可称为编码该蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。

本文中使用的术语“表达”定义为，尤其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录及/或转译。

“表达载体”指的是包含重组多核苷酸的载体，其中该重组多核苷酸包含可操作地链接至待表达的核苷酸序列的控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；其它用于表达的元件可由宿主细胞或体外表达系统供应。表达载体包括所有该领域中已知的那些，如合并该重组多核苷酸的粘粒、质粒(如，裸质粒或脂质体中含有的质粒)和病毒(如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“分离的”意为从天然状态被改变或移除。例如，天然存在于活体动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与其天然状态下的共存材料分隔开来的同一核酸或肽就是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或可存在于非天然环境如宿主细胞中。

“分离核酸”指的是，已经与在其天然出现的状态下位于其侧翼的序列分隔开来的核酸片段或碎片，如已经从正常情况下与该碎片相邻的序列移除的DNA碎片，该相邻的序列是例如在该DNA碎片天然出现的基因组中与该碎片相邻的序列。该术语也用于已经基本上从其天然伴生组分纯化的核酸，该天然伴生组分为例如在细胞内与该核酸天然伴生的RNA或DNA或蛋白质。该术语因此包括，例如，并入载体内、自主复制的质粒或病毒内、或原核生物或真核生物的基因组DNA内的重组DNA，以及作为独立于其它序列的分子(如，作为通过PCR或限制性内切酶消解产生的cDNA或基因组DNA或cDNA碎片)而存在的重组DNA。该术语还包括：作为编码额外的多肽序列的杂交基因一部分的重组DNA、互补DNA(cDNA)、天然及/或经修饰单体或链接的线性或环状寡聚物或聚合物，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其经取代形式或α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯等。

该核酸序列可以是“嵌合的”，换言之，由不同的区域构成。在本发明的语境汇总，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其含有两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每个化学区域由至少一个单体单元如核苷酸构成。这些序列典型包含至少一个区域，其中，为了展现一种或多种所希望的性质而修饰该序列。

术语“靶点核酸”序列指的是该寡核苷酸被设计为与之特异性杂交的核酸(通常源自生物样品)。该靶点核酸具有与对应于针对该靶点的寡核苷酸的核酸序列互补的序列。该术语“靶点核酸”可指代该寡核苷酸所针对的较大核酸的特异性子序列或指代完整序列(如，基因或mRNA)。使用中的差异可从上下文获知。

在本发明的语境中，使用下述对一般出现的核酸碱基的缩写，“A”指腺苷，“C”指胞苷，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，而“U”指鸟苷。

除非具体排除，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此退化版本且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”亦可包括内含子，其包括程度为该编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中含有内含子。

产生免疫性的组合物的“肠胃外”给药包括，例如，皮下(s.c.)注射、静脉(i.v.)注射、肌肉(i.m.)注射、胸骨内注射、或输注给药。

术语“患者”或“个体”或“受试者”在本文中可互换使用，且指的是待治疗的哺乳动物受试者，优选人类患者。一些情形中，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用、和疾病动物模型的研发中，包括但不限于包括小鼠、大鼠和仓鼠在内的啮齿动物以及灵长类动物。

术语“多核苷酸”是核苷酸的链，也称为“核酸”。本文中，多核苷酸包括但不限于，所有通过该领域中可使用的任何手段获得的核酸序列，且包括天然核酸和合成核酸两类。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用，且指的是由通过肽键共价链接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，且对可包含在蛋白质或肽序列中的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何包含通过肽键将彼此接合在一起的两个或更多个氨基酸的肽或蛋白质。本文中，该术语指的是，例如，两种在该领域中一般还称为肽、寡肽和寡聚体的短链，以及在该领域中一般称为蛋白质的更长的链，该短链和长链以多种类型存在。“多肽”包括，例如，生物学活性的碎片、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白质等。该多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或其组合。

术语“转染”或“转化”或“转导”意为一种过程，通过该过程，外源性核酸被转移至或引入宿主细胞内。“被转染的”或“被转化的”或“被转导的”细胞是已经使用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。被转染/转化/转导的细胞包括受试者初代细胞及其后代。

“治疗”是以预防病变的病理或症状的发展或改变病变的病理或症状的干预措施。据此，“治疗”指的是治疗性的治疗以及预防或防止性的措施。“治疗”亦可具化为姑息治疗。那些需要治疗的个体包括已经罹患病变或待预防该病变的个体。据此，状态、病变或病症的“治疗”包括：(1)预防或延迟在可能苦于或易患该状态、病变或病症但尚未经历或显示该状态、病变或病症的临床或亚临床症状的人类或其它哺乳动物体内发展的状态、病变或病症的出现；(2)抑制该状态、病变或病症，即停止、减少或延迟该疾病或其复发(在维持性治疗的情形中t)或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)减轻该疾病，即造成该状态、病变或病症或其至少一种临床或亚临床症状的减退。给待治疗个体带来的益处对于该患者或医生来说是统计学显著的或至少是可察觉的。

“载体”是物质的组合物，其包含分离的核酸且可用来将该分离的核酸递送至细胞的内部。载体的实例包括但不限于，线性多核苷酸、与离子性或良性化合物关联的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还解释为包括促进将核酸转移至细胞内的非质粒化合物和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

术语“序列一致性百分比”或具有“序列一致性”指的是，任何给定的查询序列与受试者序列之间的一致性程度。

术语“外源性”表示该核酸或多肽是重组核酸构造的一部分或由该重组核酸构造编码，或并未处于其天然环境中。例如，外源性核酸可以是来自被引入一个物种中的另一物种的核酸，即异源性核酸。典型地，该外源性核酸经由重组核酸构造被引入其它物种中。外源性核酸也可以是有机体原生的但已经被重新引入该有机体的细胞内的序列。包括原生序列的外源性序列，往往可通过链接至该外源性核酸的非天然序列而与天然出现的序列区分开来，其中该非天然序列是例如位于重组核酸构造中原生序列侧翼的非天然调节序列。此外，经稳定转化的外源性核酸被整合在不同于该天然序列所出现处的位置。

术语“药学可接受的”(或“药理学可接受的”)指的是，当视需要给药至动物或人类时，不产生副作用、过敏反应或其它不良反应的分子实体。本文中使用的术语“药学可接受的载剂”包括可作为药学可接受物质的介质使用的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶剂、表面活性剂等。

若任何氨基酸序列被通过Swiss Prot.或GENBANK登录号具体指代，则该序列通过引用而并入本文。与该登录号相关的信息，如单个肽、胞外域、跨膜域、启动子序列和转译起始的鉴定，也通过引用而整体并入本文。

基因：本文中揭露的所有基因、基因名称、和基因产物试图与来自可应用本文中的组合物和方法的任何物种的同系物相对应。应理解，当来自特定物种的基因或基因产物被揭露时，这一揭露内容仅用于示例，而不理解为限制，除非在语境中明显指明其限制性含义。因此，举例而言，对于本文中揭露的基因或基因产物，试图涵盖来自其它物种的同源基因及/或直系同源基因以及基因产物。

范围：在本揭示内容通篇内容中，本发明的多个方法可表示为范围格式。应理解，以范围格式进行的阐述仅为简便起见，而不应视为对本发明范畴的刚性限制。据此，对范围的阐述应视为具有该范围内的具体揭露的所有可能的子范围以及个体数值。例如，从1至6的范围的产生应视为具有该范围内的具体揭露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的个体数字，如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。这一应用不考虑范围的宽度。

组合物

抗逆转录病毒疗法既不阻抑低水平的病毒基因组表达，也不有效地以潜伏性感染的细胞如静息的T记忆细胞、单核细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞、以及早前揭示的gut相关淋巴细胞为靶向。与在本发明之前可用的任何疗法形成对照，本文中揭露的方法和组合物可用于治疗并根除处于任何感染阶段的被感染的受试者体内的HIV，或用于处于HIV感染风险下的未感染的受试者。

据此，所揭露的方法和组合物可用于处于感染潜伏期的感染HIV的受试者。此外，如本文中所揭露，当向导RNA与可操作地链接至最小的Tat应答性HIV LTR启动子的CRISPR相关的核酸内切酶相关联时，可将该HIV基因组从宿主细胞切除并根除。当将该组合物作为核酸给药时或包含在表达载体内时，该CRISPR核酸内切酶可通过统一核酸或载体编码为该向导RNA序列。或者，或此外，该CRISPR核酸内切酶可在与向导RNA序列物理分隔的核酸中或在分隔的载体中被编码。

本发明人已经采用该CRISPR/Cas9技术，并研发了HIV-1特异性基因编辑分子，该分子首次将5'-LTR与3'-LTR之间的整个HIV-1基因组从潜伏性感染的细胞的宿主染色体中切除，并保护该细胞不被再次感染(Khalili,K.,et al.J.Neurovirol.21,310-321(2015)；Hu,W.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111,11461-11466(2014)；Kaminski,R.,etal.Sci.Rep.6:22555(2016))。该切除方法包括使用识别该5'-LTR DNA序列和3'-LTR DNA序列以及Cas9核酸内切酶的多个区域的多倍体特异性向导RNA，该向导RNA将断裂引入双链DNA的与该向导RNA互补的位点处(Hu,W.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111,11461-11466(2014)；Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))。移除病毒DNA之后，通过细胞DNA修复将剩余的细胞DNA再次接合(Khalili,K.,et al.J.Neurovirol.21,310-321(2015)；White,M.K.,et al.Discov.Med.19,255-262(2015)；Hu,W.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111,11461-11466(2014)；Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))。为了减轻与出现对初始gRNA治疗的抗性相关的任何顾虑，使用gRNA的多倍体通过CRISPR技术编辑HIV-1基因组尤为关键。最近，除了CRISPR/Cas9技术之外，也已经研发了具有编辑来自宿主基因组的HIV-1 DNA的能力的基于重组的过程(Karpinski,J.etal.Nat.Biotechnol.34,401-409(2016))。

负反馈调节：使用RNA引导的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶如Cas9，可从被HIV感染的细胞中消除被整合入被感染的宿主细胞基因组中的病毒基因组如HIV。使用CRISPR/Cas9酶和向导RNA进行成功的治疗性基因编辑需要Cas9酶和向导RNA在靶点细胞中的有效且特异性的递送和表达。当组织或细胞集落中的接纳者细胞浓度低时，如正在接受高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的患者体内的HIV感染细胞，这一需求难以实现。

根据本发明，将CRISPR相关的核酸内切酶如Cas9置于最小的Tat应答性HIV LTR启动子的控制之下。从而在含有该Tat蛋白质的细胞内激活该核酸内切酶表达。如本文中所示，当该核酸内切酶的表达处于最小的Tat应答性HIV LTR启动子的控制之下时，外源性提供的(如，通过转染提供)和内源性产生的(如，通过潜伏性病毒的再激活而产生)两种Tat均可激活细胞系中的(CRISPR)相关的核酸内切酶(如，Cas9)表达。在实施例部分中进一步详述的研究中，该组合物允许通过HIV-1转录激活因子Tat在病毒再激活的早期进行该CRISPR/Cas9的有条件激活。

通过移除整个病毒基因组或横跨该病毒启动子及/或该病毒编码序列的病毒基因片段，这一策略在高效病毒复制之前完全且永久性地清除病毒复制。

图1A是全长度HIV-1 LTR、增强子区域和核心区域内的多种调节基序、以及部分Gag基因的示意图。说明被创建用于Cas9表达的LTR删除突变体的程度。说明gRNA靶点序列的位置及其彼此之间的距离。HIV-1 LTR的长度为大约640bp，且分为U3区域、R区域、和U5区域。Transcription of the HIV-1基因组的转录受到一系列横跨该病毒基因组5'端长末端区域的顺式作用调节基序的控制。将该转录开始位点设为+1，该病毒启动子的U3区域占据-1至-454处的核苷酸且具有三个子区域：调节区域、增强子区域、和核心区域。该增强子区域含有NF-κB结合位点(-127至-80)。该核心结构域包含富GC区和TATA盒(-80至+1)。该LTR的R区域(+1至+98)包含TAR，因为该TAR，所表达的RNA形成茎环结构并提供用于病毒反式激活因子的结合位点(Krebs等人所著《慢病毒LTR定向表达、序列变异、疾病发病机制》(Lentiviral LTR-directed expression,sequence variation,diseasepathogenesis.Los Alamos National Laboratory HIV Sequence:Compendium,pp.29-70.2002))。

该LTR含有基因表达所需的全部信号，且牵涉入前病毒至宿主细胞基因组内的整合中。例如，该核心启动子、增强子和调节区域见于U3区域内，而TAR见于R区域内，如图1A中所示。TAR，用于Tat蛋白质和用于细胞蛋白质的结合位点，由HIV-1的病毒mRNA最前面的大约45个核苷酸组成并形成发夹茎环结构。在HIV-1中，该U5区域包括若干子区域，例如，包括牵涉入二聚体作用和基因组封装中的Poly A、PBS或引物结合位点、Psi或封装信号、以及DIS或二聚体起始位点。

通过CRISPR/Cas9进行的HIV-1的负反馈调节显示于图6中。在病毒复制的早期阶段，病毒基因组的基础转录导致Tat蛋白质的产生。Tat与该病毒转录本内移动中的前导序列内的TAR茎环结构的关联，造成若干细胞调节蛋白质的聚集，从而诱导病毒转录(实线粗箭头)。在该早期阶段，Tat还刺激最小的病毒启动子(描述为ltr)，该启动子驱动Cas9基因的转录。当与多种HIV-1特异性gRNA关联时，新合成的Cas9即裂解该病毒基因组，并通过切除病毒DNA的大片段而令LTR活性失活，从而终止HIV-1基因表达和复制。

最小的LTR启动子：根据本发明，提供一种包含编码CRISPR相关的核酸内切酶的分离核酸的组合物，其中，该酶可操作地链接至最小的HIV LTR启动子，且该最小的HIV LTR启动子至少包含HIV LTR启动子的核心区域和TAR(反式激活应答元件)。最小的HIV LTR启动子指的是，含有少于全长度HIV LTR启动子的可操作的功能性启动子。某些具体实施例中，该最小的启动子含有TAR区域。某些具体实施例中，该最小的启动子包含核心区域和TAR区域。某些具体实施例中，该最小的启动子包含核心区域和TAR区域，而完全不存在或基本上不存在该调节区域及/或增强子区域。另一具体实施例中，该最小的HIV LTR启动子包含该核心区域、该TAR区域、及全部或基本上全部的增强子区域，但不含有任何调节区域。某些具体实施例中，该最小的HIV LTR启动子包含一个或多个突变、修饰碱基、变体、锁核酸、及其组合。该最小的HIV LTR启动子可对Tat蛋白质产生应答。换言之，Tat可激活该可操作地链接至该最小的HIV LTR启动子的CRISPR相关的核酸内切酶如Cas9的表达。所揭露的组合物可用来在体内外根除宿主细胞内的HIV、令哺乳动物细胞内的HIV失活、治疗患有HIV感染的受试者、降低处于感染风险下的受试者感染HIV的风险、及/或降低HIV从感染HIV的母亲传播给其子女的风险。本文中揭露的治疗方法可联合其它抗逆转录病毒疗法如HAART而实施。该组合物可作为一部分而包括在用于诊断、研究、及/或治疗应用的试剂盒内。

使用含有编码CRISPR相关的核酸内切酶的序列的组合物可实现多种优点，其中，该酶可操作地链接至最小的HIV LTR启动子，而该最小的HIV LTR启动子含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。由该持续表达造成的潜在的毒性效应风险，可通过限制具有HIV基因表达及/或复制的细胞的CRISPR相关的核酸内切酶表达而得以减轻及/或消除。例如，因为根据本发明的核酸内切酶的低及/或间歇性表达，可降低诱导由CRISPR相关的核酸内切酶的免疫原性造成的毒性的潜力，同时消除或造成HIV基因组在被感染个体内的自毁。此外，因为CRISPR相关的核酸内切酶的持久表达被最小化，本发明可提供用于处于风险中的个体的预防性策略。因此，由最小的、Tat应答性HIV LTR启动子驱动的CRISPR相关的核酸内切酶，可用来提供对感染HIV的受试者的安全治疗，且可用来给可能处于感染风险下的未感染个体接种疫苗。

该最小的HIV-1 LTR启动子可包含核酸，且该核酸包括该HIV-1 LTR启动子的位置-80至+66的核苷酸。一种具体实施例中，该最小的HIV-1 LTR启动子可包含核酸，且该核酸包括该HIV-1 LTR启动子的位置-120至+66的核苷酸。优选该最小的HIV-1 LTR启动子不含有来自调节区域的序列。一些具体实施例中，该启动子包含一个或多个突变、删除、插入、变体、衍生或其组合。该启动子也可以是包含一个或多个嵌合化合物的嵌合启动子。

如本文中所述将CRISPR相关的核酸内切酶置于最小的HIV LTR启动子的控制之下也是有利的，盖因体积较小的核酸可能更容易地封装在适用于基因疗法的递送机制(如，逆转录病毒)内。例如，包括该调节区域的启动子构造由于其大小及/或对CRISPR相关的核酸内切酶转录的效果易变，可能较不适用于基因疗法。

如上所述，该HIV基因组整合入感染HIV的个体的宿主基因组内。这一整合的序列随后被宿主复制。即使在潜伏期，该细胞也可生产Tat。本发明的组合物消除及/或减少宿主内前病毒多核苷酸的存在。因为CRISPR相关的核酸内切酶由根据本发明的Tat应答性启动子驱动，任何时候Tat均存在(如，通过被感染的细胞生产)，产生该核酸内切酶且该核酸内切酶降解初生的多核苷酸。当病毒不活动时，没有核酸内切酶产生。因此避免了核酸内切酶的持续表达可能对该细胞及/或宿主造成的潜在毒性效应。

CRISPR相关的核酸内切酶：本文中揭露的组合物可包括编码CRISPR相关的核酸内切酶如Cas9的核酸。一些具体实施例中，也可编码一种或多种与靶点HIV序列互补的向导RNA。在细菌中，该CRISPR/Cas基因座编码RNA引导的对抗迁移遗传元件(病毒、转位因子和接合质粒)的自适应免疫系统。已经确认了三种类型(I至III)的CRISPR系统。CRISPR簇含有间隔序列，该序列与前驱迁移元件互补。CRISPR簇被转录并加工至成熟的CRISPR RNA(crRNA)中。CRISPR相关的核酸内切酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统，且具有强烈的核酸内切酶活性以切割靶点DNA。Cas9由成熟的crRNA引导，该crRNA含有约20个碱基对(bp)的独特靶点序列(称为间隔序列)和用作pre-crRNA的核糖核酸酶III辅助加工的反式激活的小RNA(tracrRNA)。该crRNA:tracrRNA二倍体经由crRNA上的间隔序列与靶点DNA上的互补序列(称为前间区)之间的互补性碱基配对而将Cas9引导至该靶点DNA。Cas9识别一个三核苷酸(NGG)前间区序列邻近基序(PAM)以指定切割位点(自该PAM起第3个核苷酸)。该crRNA和tracrRNA可分开表达，或经由合成性茎环(AGAAAU)而工程化为人工融合小向导RNA(sgRNA)，以模拟天然crRNA/tracrRNA二倍体。可合成或体外转录该sgRNA如shRNA，用于引导RNA转染或从U6或H1启动的RNA表达载体表达，但该人工sgRNA的裂解效率低于crRNA和tracrRNA分开表达的系统。

该CRISPR相关的核酸内切酶可以是Cas9核酸酶。该Cas9核酸酶可具有与野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)序列一致的核苷酸序列。该CRISPR相关的核酸内切酶可以是来自其它物种如链球菌属(Streptococcus species)如嗜热菌(thermophiles)的序列。该Cas9核酸酶序列可源自其它物种，该物种包括但不限于：达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、蔷薇色链霉菌(Streptomyces roseum)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、微颤菌(Microscilla marina)、布氏杆菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌属(Polaromonas sp.)、阔叶狸藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热角军纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus desulforudis)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficle)、大芬格尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热性盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸球孢菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、等着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚消化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦松亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、外消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、林氏藻属(Lyngbyasp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp)、移动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、或海滨蓝藻菌(Acaryochloris marina)。绿脓假单胞菌(Psuedomona aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、或其它序列细菌和古生菌基因组、或其它原核微生物也可以是本文中揭露的具体实施例中所使用的Cas9序列的来源。

野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列可经修饰。该核酸序列可以是经优化用于在哺乳动物细胞内有效表达即“人源化”的密码子。该序列可以是，例如，由Genbank登录号KM099231.1 GI:669193757、KM099232.1 GI:669193761、或KM099233.1 GI:669193765中所列的任意表达载体编码的Cas9核酸酶序列。或者，该Cas9核酸酶序列可以是，例如，可商购的载体如来自Addgene(Cambridge,MA)的PX330或PX260中所含有的序列。一些具体实施例中，该Cas9核酸内切酶可具有一氨基酸序列，该序列是Genbank登录号KM099231.1 GI:669193757、KM099232.1 GI:669193761、或KM099233.1 GI:669193765的任何Cas9核酸内切酶序列或者PX330或PX260(Addgene,Cambridge,MA)Cas9氨基酸序列的变体或碎片。该Cas9核苷酸序列可经修饰，以编码Cas9的生物学活性变体，且这些变体可具有或可包括，例如，通过含有一个或多个突变(如，加成、删除、或替换突变或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。该替换突变中的一个或多个可以是替换(如，保守的氨基酸替换)。例如，Cas9多肽的生物学活性变体可具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与野生型Cas9多肽的序列一致性为至少或约50％(如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的序列一致性)。保守的氨基酸替换典型包括下述各组内的替换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。该Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然出现的氨基酸残基。天然出现的氨基酸残基包括天然地由遗传密码编码的那些氨基酸和非标准氨基酸(如，具有D-构型而非L-构型的氨基酸)。本发明的多肽亦可包括作为标准残基的经修饰版本的氨基酸残基(如，吡咯赖氨酸可替代赖氨酸使用，而硒代半胱氨酸可替代半胱氨酸使用)。非天然出现的氨基酸残基是那些未见于自然界中但符合该碱基结构式并可并入肽内的氨基酸残基。这些氨基酸残基包括D-别异亮氨酸((2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸)和L-环戊基甘氨酸((S)-2-氨基-2-环戊基乙酸)。至于其它实例，可查阅教科书或网站(目前由加州理工学院维持的一个站点，显示已经成功并入功能性蛋白质中的非天然氨基酸)。

向导RNA序列：本发明的组合物和方法可包括编码与HIV中靶点序列互补的向导RNA的序列。HIV的遗传变异性反映在已经揭示的多个组合子类型中。HIV序列库汇编在洛斯拉莫斯HIV数据库和概略(Los Alamos HIV databases and compendiums)中(即，序列数据库网站为http://www.hiv.lani.gov)。本发明的方法和组合物可应用于来自哪些组、子类型、和循环重组形式中的任一项的HIV。这些组、子类型和循环重组形式包括，例如，HIV-1主要组(一般称为M组)和次要组(N组、O组和P组)，以及但不限于，HIV的下述任何子类型：A、B、C、D、F、G、H、J和K组(例如但不限于，N组、O组和P组的任一组)。

该向导RNA可以是与编码序列或非编码序列(即，靶点序列)互补的序列。例如，该向导RNA可以是与HIV长末端重复序列(LTR)区域互补的序列，其中该区域是不同于下形成与可操作地链接至Cas9基因的最小的Tat应答性启动子中所使用者的部分。由于将会导致其自身构造的降解，从而潜在地去除通过由最小的HIV LTR启动子驱动的CRISPR相关的核酸内切酶造成的优势，该向导RNA不能以对应于如本文中揭露的最小的Tat应答性HIV-1LTR启动子的序列为靶向。因此，向导RNA可包括见于HIV-1 U3区域、R区域、及/或U5区域参考序列或共有序列内，而不选择作为该最小的Tat应答性HIV启动子一部分的序列。

一些具体实施例中，该向导RNA可以是与编码序列如编码一种或多种病毒结构蛋白(如，gag、pol、env、和tat)的序列。因此，该序列可与下述蛋白质内的序列互补：gag多蛋白如MA(基质蛋白p17)、CA(衣壳蛋白p24)、NC(核蛋白壳蛋白p7)、和P6蛋白；pol，如逆转录酶(RT)和RNase H、整合酶(IN)、和HIV蛋白酶(PR)；env，如gp160，或gp160的裂解产物如gp120或SU、以及gp4l或TM；或tat，如72个氨基酸的单外显子Tat或86至101个氨基酸的双外显子Tat。一些具体实施例中，该向导RNA可以是与编码辅助蛋白的序列互补的序列，包括，例如，vif、n willef(负调节因子)、vpu(病毒蛋白U)和tev。

一些具体实施例中，该向导RNA序列可能是与结构元件或调节元件(即，靶点序列)如RRE、PE、SLIP、CRS(顺式作用阻抑序列)、及/或INS互补的序列。RRE(Rev应答元件)是在HIV的env区域内编码的RNA元件，且包括大约200个核苷酸(从HIV-1转录起点计算，位置7710至8061，横跨gp120和gp4l的边界)。PE(Psi元件)对应于位于Gag起始密码子之前且与之重叠的一组4个茎环结构。SLIP是TTTTTT“滑位(slippery site)”，其后为一茎环结构。CRS(顺式作用阻抑序列)。INS(抑制性的/不稳定的RNA序列)可在例如HIV-1的gag区域内的核苷酸414至631处找到。

该向导RNA序列可以是正义序列或反义序列。该向导RNA序列通常包括PAM。该PAM的序列可依据所使用的CRISPR核酸内切酶的特异性需求而变。在源自酿脓链球菌(S.pyogenes)的CRISPR-Cas系统中，靶点DNA典型位于5'-NGG前间区相邻基序(PAM)之前并紧邻该PAM。因此，对于酿脓链球菌Cas9，该PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其它Cas9直系同源物可具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的Cas9需要用于CRISPR 1的5'-NNAGAA和用于CRISPR3的5'-NGGNG)，而来自脑膜炎奈瑟菌(Neiseriamenigiditis)的Cas9需要5'-NNNNGATT。该向导RNA的特异性序列可变，但不论何种序列，可用的向导RNA序列将是那些最小化脱靶效应、同时实现对基因上被整合的HIV前病毒的高效且完全的清除。该向导RNA序列的长度可从约20至约60或更多个核苷酸范围内变动，例如，约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。可用的选择方法鉴别在外来病毒基因组与包括内源性逆转录病毒DNA之间具有低同源性的区域，该方法包括使用12-bp+NGG靶点选择准则以排除脱靶人类转录组或(甚为罕见)未转译的基因组位点的生物信息学筛选；避免该HIV-1 LTR启动子内的转录因子结合位点(在宿主基因组中可能被保全)；选择针对LTR-A和LTR-B的30-bp向导RNA和反映原始细菌免疫机制的前-crRNA系统，以提升对基于20-bp向导RNA、嵌合crRNA-tracRNA的系统的特异性/效率；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR试验，以鉴别并排除潜在的脱靶效应。

该向导RNA序列可配制为单一序列或一种或多种不同序列的组合，如多倍体构型。多倍体构型可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个不同向导RNA的组合，例如，U3、R、或U5中的序列的组合，而不选择作为该最小的Tat应答性HIV启动子的一部分的序列。当将该组合物在表达载体中给药时，该向导RNA可由单个载体编码。或者，可将多个载体工程化为各自包括两个或更多个不同的向导RNA。可用的构型将导致裂解位点之间的病毒序列的切除，造成HIV基因组或HIV蛋白表达的清除。因此，使用两个或更多个不同的向导RNA促进在该CRISPR核酸内切酶识别的裂解位点之间的病毒序列的切除。被切除的区域大小可从一个核苷酸至几千个核苷酸范围内变动。

经修饰或突变的核酸序列：一些具体实施例中，任何该核酸序列均可经修饰或从天然核酸序列衍生化，例如，通过例如引入核酸碱基、骨架等的突变、删除、替换、修饰而完成。该核酸序列包括载体、基因编辑剂、gRNA等。预期用于本发明的一些经修饰的核酸序列的实例包括，那些包含经修饰的骨架如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、短链烷基或环烷基糖间链接或短链杂芳族或杂环类糖间链接的核酸序列。一些具体实施例中，经修饰的寡核苷酸包含那些具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和那些具有杂原子骨架、CH₂--NH--O--CH₂、CH、--N(CH₃)--O--CH₂[称为亚甲基(甲基亚胺基)或MMI骨架]、CH₂--O--N(CH₃)--CH₂、CH₂--N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂和O--N(CH₃)--CH₂--CH₂骨架的寡核苷酸，其中，天然磷酸二酯骨架表示为O--P--O—CH。De Mesmaeker et al.Acc.Chem.Res.1995,28:366-374)中揭露的酰胺骨架在本文中也有所体现。一些具体实施例中，该核酸序列具有吗啉基骨架结构(Summerton and Weller,US 5,034,506)；肽核酸(PNA)骨架，其中，寡核苷酸的磷酸二酯骨架替换为聚酰胺骨架，核酸碱基直接或间接地键结至该聚酰胺骨架的氮杂氮原子(Nielsenet al.Science 1991,254,1497)。该核酸序列还可包含一个或多个经取代的糖部分。该核酸序列也可具有替代呋喃戊糖基的糖模拟物，如环丁基。

该核酸序列还可额外包括或者可包括核酸碱基(该领域中一般简称为“碱基”)修饰或替换。本文中，“未修饰的”或“天然的”核酸碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核酸碱基包括在天然核酸中不常见的或仅瞬时存在的核酸碱基，如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶尤其是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’-去氧胞嘧啶且该领域中一般称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和二羰基HMC；以及合成核酸碱基，如2-胺基腺嘌呤、2-(甲胺基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基胺基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、N⁶-(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,pp75-77；Gebeyehu,G.,et al.Nucl.Acids Res.1987,15:4513。可包括该领域中已知的“通用”碱基，如肌苷。已经发现，5-Me-C替换将核酸二倍体稳定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,inCrooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。

对本发明的核酸序列的另一修饰牵涉将一个或多个提升该寡核苷酸的活性或细胞吸收的部分或偶联物化学链接至该核酸。此类部分包括但不限于，脂质部分，如胆固醇部分、胆甾醇基部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,6553)、胆酸(Manoharan et al.Bioorg.Med.Chem.Let.1994,4,1053)；硫醚，如己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan et al.Ann.N.Y.Acad.Sci.1992,660,306；Manoharan etal.Bioorg.Med.Chem.Let.1993,3,2765)；巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.AcidsRes.1992,20,533)；脂肪族链，如十二碳二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras etal.EMBO J.1991,10,111；Kabanov et al.FEBS Lett.1990,259,327；Svinarchuk etal.Biochimie 1993,75,49)；磷脂质，如二-十六烷基甘油或1,2-二-O-十六烷基-甘油-3-H-磷酸三乙铵(Manoharan et al.Tetrahedron Lett.1995,36,3651；Shea etal.Nucl.Acids Res.1990,18,3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.Nucleosides&Nucleotides 1995,14,969)；或金刚烷乙酸(Manoharan et al.Tetrahedron Lett.1995,36,3651)。不需要将给定核酸序列中所有位置全部均匀地修饰，事实上，超过一种上述修饰可并入单个核酸序列中，甚至并入核酸序列的单个核苷酸内。

一些具体实施例中，该RNA分子如crRNA、tracrRNA、gRNA经工程化以包含一个或多个经修饰的核酸碱基。例如，已知的对RNA分子的修饰可见于，例如，Lewis编撰的《基因VI》(Genes VI)第9章(“Interpreting the Genetic Code(基因密码的诠释)”)(1997,OxfordUniversity Press,New York)以及Grosjean和Benne编撰的《RNA的修饰和编辑》(Modification and Editing of RNA)(1998,ASM Press,Washington DC)。经修饰的RNA组分包括下列：2'-O-甲基胞苷、N⁴-甲基胞苷、N⁴-2'-O-二甲基胞苷、N⁴-乙酰胞苷、5-甲基胞苷、5,2'-O-二甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰胞苷、2'-O-甲基-5-甲酰胞苷、3-甲基胞苷、2-硫代胞苷、赖胞苷(lysidine)、2'-O-甲基尿苷、2-硫代尿苷、2-硫代-2'-O-甲基尿苷、3,2'-O-二甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、4-硫代尿苷、核糖基胸苷、5,2'-O-二甲基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、5-羟基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷-5-氧乙酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、5-羧甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-硫代尿苷、5-氨基甲酰基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯、5-氨甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺甲基尿苷、5-甲基胺甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺甲基-2-硒代尿苷、5-羧甲基胺甲基尿苷、5-羧甲基胺甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧甲基胺甲基-2-硫代尿苷、二氢尿苷、二氢核糖基胸腺嘧啶、2'-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N⁶N-甲基腺苷、N⁶,N⁶-二甲基腺苷、N⁶,2'-O-三甲基腺苷、2-甲硫基-N⁶N-异戊烯基腺苷、N⁶-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷、2-甲硫基-N⁶-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷、N⁶-甘氨酰基胺基甲酰基)腺苷、N⁶-苏氨酰基胺基甲酰基腺苷、N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基胺基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基胺基甲酰基腺苷、N⁶-羟基正缬氨酰基胺基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N⁶-羟基正缬氨酰基胺基甲酰基腺苷、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)、肌苷、2'-O-甲基肌苷、1-甲基肌苷、1,2'-O-二甲基肌苷、2'-O-甲基鸟苷、1-甲基鸟苷、N²-甲基鸟苷、N²,N²-二甲基鸟苷、N²,2'-O-二甲基鸟苷、N²,N²,2'-O-三甲基鸟苷、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)、7-甲基鸟苷、N²,7-二甲基鸟苷、N²,N²,7-三甲基鸟苷、怀俄苷(wyosine)、甲基怀俄苷、修饰不足的羟基怀丁苷、怀丁苷(wybutosine)、羟基怀丁苷、过氧怀丁苷、辫苷(queuosine)、环氧辫苷、半乳糖基辫苷、甘露糖基辫苷、7-氰基-7-去氮鸟苷、古嘌苷(arachaeosine)[亦称7-甲酰胺基-7-去氮鸟苷]、和7-氨基甲基-7-去氮鸟苷。

可通过标准技术生产分离的核酸分子。例如，PCR技术可用来获得含有本文中所述核苷酸序列的分离核酸，该核苷酸序列包括编码本文中所述多肽的核苷酸序列。PCR可用来从DNA和RNA扩增具体的序列，包括来自总基因组DNA或总分子RNA的序列。多种PCR方法揭示于Dieffenbach和Dveksler编撰的《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)中。通常，采用来自感兴趣区域的末端或超出该区域的序列信息来设计寡核苷酸，这些引物在序列上与待扩增的模板的相反链一致或相似。也可使用多种PCR策略，借由该策略，可将位点特异性核苷酸序列引入模板核酸中。

分离的核酸也可以化学合成为单个核酸分子(如，使用亚磷酰胺技术进行3'至5'方向的自动化DNA合成)或一系列寡核苷酸。例如，可合成含有所希望序列的一对或多对长的寡核苷酸(如，>50至100个核苷酸)，该寡核苷酸中的每一对含有互补性的短片段(如，约15个核苷酸)，因此当该寡核苷酸对解链时形成二倍体。使用DNA聚合酶延伸该寡核苷酸，从每一对寡核苷酸生成单个的双链核酸，该双链核酸随后结扎入载体中。本发明的分离核酸亦可通过例如Cas9编码DNA的天然出现部分的变异而得。

两个核酸或其编码的多肽可揭示为彼此具有某种程度的一致性。例如，Cas9蛋白质及其生物学活性变体可揭示为展现某种程度的一致性。通过定位蛋白质信息研究(PIR)网站(pir.georgetown.edu)中的短Cas9序列，之后使用NCBI网站(ncbi.nlm.nih.gov/blast)上的“几乎一致的短序列”局部序列排比检索基本工具(BLAST)算法进行分析，可完成比对。

可测定与Cas9的序列一致性百分比，并使用经鉴别的变体作为CRISPR相关的核酸内切酶及/或检验其作为药物组合物的功效。天然出现的Cas9可以作为查询序列，而Cas9蛋白质的碎片可以作为受试者序列。同样，Cas9蛋白质的碎片可以作为查询序列，而其生物学活性变体可以作为受试者序列是。为了测定序列一致性，可使用计算机程序ClustalW(1.83版，缺省参数)，将查询核酸或氨基酸序列分别与一个或多个核酸或氨基酸序列对准，该程序允许待执行的核酸或蛋白质序列在其整个长度上对准(全局对准)。见，Chenna et al.,Nucleic Acids Res.31:3497-3500,2003。

重组构造和递送媒介：本文中还提供重组构造，该重组构造能用来转化细胞，以在最小的Tat应答性HIV LTR启动子的控制下表达Cas9。重组构造同样可用来表达与HIV中的靶点序列互补的向导RNA。重组核酸构造包含编码Cas9的核酸及/或如本文中所述的与HIV中靶点序列互补的向导RNA，可操作地链接至适用于表达该Cas9及/或与细胞内HIV中靶点序列互补的向导RNA的调节区域。应了解，大量核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是该领域中周知的。对于多种氨基酸，存在超过一个的作用该氨基酸密码子的核苷酸三连组。例如，可使用适用于特定有机体的密码子偏倚表修饰Cas9编码序列中的密码子，因此获得在该有机体中的最优表达。

本文中揭示的核酸可包含在载体中。载体可包括，例如，复制的起源、支架附接区域(SAR)、及/或标志物。标志物基因可赋予宿主细胞以可选择的表型。例如，标志物可赋予杀生物剂抗性，如对抗生素(如，卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素)的耐药性。表达载体可包括被设计为促进对所表达的多肽的操控或检测(如，纯化或定位)的标签序列。标签序列，如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血细胞凝集素、或FlagTM标签(Kodak,New Haven,CT)序列，典型被表达为与所编码的多肽的融合物。此类标签可插入该多肽内的任意位置，包括羧基端或氨基端。

其它表达载体亦可包括，例如染色体DNA序列、非染色体DNA序列和合成DNA序列。适当的载体包括SV40衍生物和已知的细菌质粒，如大肠杆菌(E.coli)质粒col El、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物；质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体1的大量衍生物如NM989，以及其它噬菌体DNA如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，如2μ质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；源自质粒与噬菌体DNA的组合的载体，如已经修饰以采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒。

多种递送方法可与可操作地链接至Cas9基因的最小的Tat应答性HIV LTR启动子协作，用于体外(细胞培养物)和体内(动物和患者)系统。一种具体实施例中，可使用慢病毒基因递送系统。此类系统向具有广泛趋性和大DNA插入能力的分裂细胞和未分裂细胞中提供基因的稳定且长期的存在(Dull et al,J Virol,72:8463-84711998)。一种具体实施例中，腺相关病毒(AAV)可用作递送媒介。AAV是一种非致病性单链DNA病毒，近年来已经广泛用于在体外和体内系统中递送治疗剂(Choi et al,Curr Gene Ther,5:299-310,2005)。非病毒递送方法的实例可使用纳米颗粒技术。这一平台已经证明其作为体内药物的应用性。纳米技术改善了药物跨越致密的上皮和内皮屏障的转胞吞作用。它提供其负荷物以特异性的方式至细胞和组织的靶向递送(Allen and Cullis,Science,303:1818-1822,1998)。

该载体亦可包括调节区域。术语“调节区域”指的是核苷酸序列，其影响转录或转译起始和速率以及转录或转译产物的稳定性及/或移动性。调节区域包括而不限于，启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、可诱导元件、蛋白质结合序列、5'和3'未转译区域(UTR)、转录开始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号、和内含子。

术语“可操作地链接”指的是将调节区域和待转录的序列置于核酸内，从而影响该序列的转录或转译。例如，为了将编码序列带至启动子的控制之下，该多肽的转录阅读框的转录起始位点典型位于该启动子下游的1个至约50个核苷酸之间。但启动子可位于该转译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处，或位于该转录开始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子典型包含至少一核心(基础)启动子。启动子亦可包括至少一个控制元件，如增强子序列，它是一上游元件或上游激活区域(UAR)。选择待包括的启动子取决于若干因素，该因素包括但不限于，效率、可选择性、可诱导性、希望的表达水平、以及细胞或组装优先的表达。通过适宜地选择启动子和其它调节区域并相对于编码序列定位而调节编码区域的表达，对于该领域技术人员来说是常规手段。

载体包括，例如，病毒载体(如腺病毒Ad、AAV、慢病毒、以及水疱性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体和其它含有脂质的复合物、以及其它能介导多核苷酸至宿主细胞的递送的大分子复合物。载体也可包含进一步调节基因递送及/或基因表达或反而向靶点细胞提供有益性质的其它组分或功能性。如下文中更详细的揭示和例示，此类其它组分包括，例如，影响结合细胞或以细胞为靶向的组分(包括介导细胞类型或组装特异性结合的组分)；影响该载体核酸被该细胞吸收的组分；影响该多核苷酸被吸收后在该细胞内定位的组分(如核定位调节剂)；以及影响该多核苷酸表达的组分。此类组分也可包括标志物，如可检测的及/或可选择的标志物，该标志物可用来检测或选择已经吸收且正在表达通过该载体递送的核酸的细胞。此类组分可提供为该载体的天然特征(如使用某些具有介导结合和吸收的组分或功能性的病毒载体)，或可修饰载体以提供此类功能性。其它载体包括Chen etal；BioTechniques,34:167-171(2003)中揭示的那些载体。大量此类载体是该领域中已知的，且可通过常规方法获得。“重组病毒载体”指的是，包含一种或多种异源性基因产物或序列的病毒载体。由于多种病毒载体展现与封装相关的体积限制，该异源性基因产物或序列典型是通过替换该病毒基因组的一个或多个部分而引入的。此类病毒可变为具有复制缺陷，在病毒复制和衣壳化过程中需要提供(使用例如辅助病毒或携带复制及/或衣壳化所必需的基因产物的封装细胞系)其被删除的功能。先前也已经揭示了在其病毒颗粒外侧携带待递送的多核苷酸的经修饰的病毒载体(见，如，Curiel,D T,et al.PNAS 88:8850-8854,1991)。

其它载体包括病毒载体、融合蛋白和化学偶联物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和HIV系病毒。一种HIV系病毒载体包含至少两种载体，其中，该gag基因和pol基因来自HIV基因组，而env基因来自另一病毒。DNA病毒载体包括痘载体，如天花病毒载体或avipox载体；疱疹病毒载体，如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体[Geller,A.I.et al.,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.,et al.,in DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.et al.,ProcNatl.Acad.Sci.:U.S.A.:90 7603(1993)；Geller,A.I.,et al.,Proc Natl.Acad.SciUSA:87:1149(1990)]；腺病毒载体[LeGal LaSalle et al.,Science,259:988(1993)；Davidson,et al.,Nat.Genet.3:219(1993)；Yang,et al.,J.Virol.69:2004(1995)]；和腺相关病毒载体s[Kaplitt,M.G.,et al.,Nat.Genet.8:148(1994)]。

本文中揭露的多核苷酸可与微递送媒介如阳离子脂质体和腺病毒载体合用。关于对脂质体制备过程、靶向性和内容物的递送的回顾，见Mannino and Gould-Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)。也见Felgner and Holm,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):21(1989)和Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):25(1989)。

可根据已知技术生产具有复制缺陷的重组腺病毒载体。见，Quantin,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet,et al.,J.Clin.Invest.,90:626-630(1992)；和Rosenfeld,et al.,Cell,68:143-155(1992)。

另一种递送方法是使用产生单链DNA的载体，该载体可在细胞内产生所表达的产物。见，例如，Chen et al,BioTechniques,34:167-171(2003)，该文献通过引用而整体并入本文。

另一种递送方法是使用使用产生单链DNA的载体，该载体可在细胞内产生所表达的产物。见，例如，Chen et al,BioTechniques,34:167-171(2003)，该文献通过引用而整体并入本文。本文中中揭露的多核苷酸可与微递送媒介如阳离子脂质体和腺病毒载体合用。关于对脂质体制备过程、靶向性和内容物的递送的回顾，见Mannino and Gould-Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)。也见Felgner and Holm,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):21(1989)和Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):25(1989)。

本发明的某些具体实施例中，可使用非病毒载体实行转染。核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、人工病毒体、和DNA吸收增强剂。脂质转染揭示于例如美国专利US5,049,386、US 4,946,787和US 4,897,355中，而脂质转染试剂是商售的(如Transfectam和Lipofectin)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质，包括在Jessee拥有的美国专利US 7,166,298和Jesse拥有的美国专利US 6,890,554中揭示的脂质，其各自的内容通过引用并入本文。递送可以细胞为目的地(如体外或离体给药)或以组织为靶向(如体内给药)。

合成的载体典型基于能与带负电的核酸复合以形成直径为100nm量级的颗粒的阳离子脂质或聚合物。该复合物保护核酸不被核酸酶降解。而且，细胞递送策略和局部递送策略必须解决对于内化、释放和在适宜的亚细胞隔室中分布的需求。系统性递送策略遭遇额外的障碍，例如，阳离子递送媒介与血液成分的强烈的相互作用、网状内皮系统的吸收、肾过滤、毒性和载剂对于感兴趣的细胞的靶向能力。修饰该阳离子非病毒的表面，可最小化其与血液成分的相互作用，降低网状内皮系统吸收，降低它们的毒性并增加它们与靶点细胞的结合亲和性。血浆蛋白的结合(也称为调理素作用)是RES识别该循环纳米颗粒的主要机制。例如，巨噬细胞如肝脏中的Kupffer细胞，经由清道夫受体识别经调理素作用的纳米颗粒。

本发明的核酸序列可递送至受试者的适宜细胞。可使用例如聚合的、可降解的微粒或微胶囊递送媒介实现这一目的，其中该微粒或微胶囊的大小为优化吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用。例如，可使用直径为约1至10μm的PLGA(聚丙交酯-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸封装在这些微粒中，该微粒被巨噬细胞吸收并在该细胞内逐步生物降解，从而释放该多核苷酸。一旦被释放，该DNA即在该细胞内表达。第二种类型的为了并非意在为细胞所直接吸收，而是主要用作核酸的缓释蓄积池，该核酸仅在通过生物降解而从该微粒中释放时为细胞所吸收。因此，这些聚合的颗粒应足够大至排除吞噬作用(即，大于5μm，且优选大于20μm)。实现对该核酸的吸收的另一途径为使用通过标准方法制备的脂质体。该核酸可单独并入这些递送媒介中，或与组织特异性抗体如以一般作为HIV感染的潜伏性感染蓄积池的细胞类型为靶点的抗体一起并入。或者，可制备由通过静电力或共价力粘附至聚-L-赖氨酸的质粒或其它载体构成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合至一配体，而该配体结合至靶点细胞上的受体。将“裸DNA”(即，没有递送媒介)递送至肌肉内、皮内、或皮下的位点，是实现体内表达的另一手段。在相关的多核苷酸(如，表达载体)中，该核酸序列编码一分离的核酸序列，该分离的核酸序列包含一编码CRISPR/Cas的序列及/或与HIV的靶点序列互补的向导RNA，如上文所述。

一些具体实施例中，本发明的组合物可配制为纳米颗粒，例如，由高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)与DNA复合而形成的芯和环绕该芯的聚乙二醇改性(PEG化)低分子量LPEI壳构成的纳米颗粒。一些具体实施例中，该组合物可配制为封装本文中例示的组合物的纳米颗粒。L-PEI已经被用来在体内将基因有效地递送至大量器官如肺、脑、胰腺、视网膜、膀胱以及肿瘤内。L-PEI能有效地在体内外缩合、稳定化及递送核酸。

一些具体实施例中，载体的递送也可由外来体所介导。外来体是多种细胞类型释放的症状纳米媒介。它们通过在细胞之间运输核酸和蛋白质而介导细胞内通讯。外来体含有源自内吞途径的RNA、miRNA、和蛋白质。它们可通过内吞作用、融合或两种作用而被靶点细胞吸收。可约束外来体以将核酸递送至特定靶点细胞。

本发明的表达构造亦可通过纳米线团方式递送。纳米线团是茧样的DNA纳米复合体(Sun,et al.,J.Am.Chem.Soc.2014,136:14722-14725)。它们可负载用于被靶点细胞吸收的核酸并将其释放在靶点细胞的细胞质中。构建纳米线团、令它们负载、以及设计释放分子的方法可见于Sun,et al.(Sun W,et al.,J.Am.Chem.Soc.2014,136:14722-14725；SunW,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2015:12029-12033)。

该核酸和载体也可应用在装置(如，导管)表面或包含在泵、贴剂或任何其它药物递送装置中。本文中揭露的核酸和载体可单独给药、以混合物形式给药、在药学可接受的赋形剂或载剂(如，生理盐水)的存在下给药。基于给药模式和路径而选择该赋形剂或载剂。使用药物配方的适当药物载剂以及药学必需品揭示于本领域周知的参考书《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin))和USP/NF(《美国药典和国家处方集》(United States Pharmacopeia and the National Formulary))中。

本发明的一些具体实施例中，使用脂质体执行细胞或组织的转染。核酸的脂质体配方的药理学很大程度上由核酸被封装在该脂质体双层内部的程度所决定。被封装的核酸得到保护而被核酸酶降解，而那些仅与该脂质体表面关联的核酸不受保护。被封装的核酸享有完整脂质体的延长的循环寿命和生物分布，而那些仅与表面关联的核酸一旦从该脂质体解离，则保留裸核酸的药理学特性。可使用传统的被动负载技术如乙醇点滴方法(如SALP中)、逆相蒸发方法、和乙醇吸收方法(如SNALP中)将核酸入陷在脂质体内。

脂质体递送系统提供稳定的制剂，提供改善的药代动力学和对组织的“被动”或“生理学”靶向的程度。亲水性材料和疏水性材料如潜在的化疗剂的封装是已知的。见，例如，Schneider拥有的美国专利US 5,466,468，该专利揭露可经肠胃外给药的包含合成脂质的脂质体制剂；Hostetler等人拥有的US 5,580,571，该专利揭露偶联至磷脂质的核苷酸类似物；Nyqvist拥有的US 5,626,869，该专利揭露药物组合物，其中，药学活性化合物是位于包含至少一种两亲性和极性脂质成分和至少一种非极性脂质成分的所界定脂质系统内的肝素或其碎片。

脂质体和聚合体可含有多种溶液和化合物。某些具体实施例中，本发明的复合物与聚合体偶联并封装在后者中。作为一类人工媒介，聚合体是其内密封溶液的微小中空球，使用两亲性合成嵌段共聚物制作以形成媒介膜。常用的聚合体在其芯中含有水性溶液，且可用于封装并保护敏感的分子，如药物、酶、其它蛋白质和肽、以及DNA和RNA碎片。该聚合体膜提供将所封装材料与外部材料如见于生物系统中的材料分离的物理屏障。聚合体可通过已知技术从复乳液生成，见，Lorenceau et al.,2005,Generation of Polymerosomesfrom Double-Emulsions,Langmuir 21(20):9183-6。

本发明的一些具体实施例中，修饰非病毒载体以执行靶向递送和转染。PEG化(即，使用聚乙二醇修饰表面)是用来降低非病毒载体的调理素作用和凝聚的卓越方法，该方法最小化由网状内皮系统造成的清除，从而延长静脉(i.v.)给药后的循环寿命。PEG化的纳米颗粒因此往往成为“潜行”纳米颗粒。未被快速从循环中清除的纳米颗粒将具有遭遇被感染细胞的机会。

本发明的一些具体实施例中，使用对组织的独特环境和外部刺激产生应答的靶向控释系统。金纳米棒在近红外区域具有强吸收谱带，且所吸收的光能随后通过金纳米棒转化为热能，即所谓“光热效应”。因为近红外光能穿入组织深处，将以核酸修饰金纳米棒表面而用于控释。当以近红外光辐射经修饰的金纳米棒时，由于光热效应诱导的热变性，核酸被释放。所释放的核酸的量取决于光辐射的功率和曝露时间。

无论组合物作为核酸给药或作为多肽给药，它们均以促进被哺乳动物细胞吸收的途径配制。可用的载体系统和配方揭示在上文中。一些具体实施例中，该载体可将该组合物递送至特定细胞类型。但本发明并不限于这些，还设想其它DNA递送方法，如使用例如磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂质复合物、表面活性剂和全氟化学液体的化学转染，以及物理递送方法如电穿孔、显微注射、弹道粒子和“基因枪”系统。

其它具体实施例中，该组合物包含已经使用一种或多种CRISPR/Cas载体和gRNA转化或转染的细胞。一些具体实施例中，本发明的方法可以离体途径应用。换言之，可从身体移除受试者的细胞，以该组合物在培养基中处理该细胞以切除例如HIV序列，并将处理过的细胞返回该受试者身体内。该细胞可以是受试者的细胞，或他们可以是单体型匹配的细胞或是细胞系。可辐射该细胞以防止其复制。一些具体实施例中，该细胞是人类白细胞抗原(HLA)匹配的细胞、自体同源细胞、细胞系、或其组合。其它具体实施例中，该细胞可以是干细胞，例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。已经从包括人类在内的多个物种建立胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导多能干细胞，iPS细胞)。因为这些类型的多能干细胞能通过对其分化的适宜诱导而分化为几乎所有器官，同时保留其主动分裂的能力并保持多能性，这些细胞将会是用于再生医学的最有用的细胞来源。尤其是iPS细胞可从自源性体细胞建立，因此，与通过摧毁胚胎而生产的ES细胞相比，iPS细胞几乎不造成伦理和社会问题。再者，iPS细胞是自源性细胞，这令其可能避免排异反应，而排异反应是再生医学或移植疗法的最大障碍。

根据所建立的方法，制备用于再灌注的经转导的细胞。培养约2至4周时间后，该细胞的数目可为1×10⁶至1×10¹⁰之间。就此而言，不同患者之间和不同细胞类型之间的生长特征彼此不同。在将所转导的细胞再灌注之前约72小时，取等量小样进行表型分析并测定表达该治疗剂的细胞的百分比。对于给药，本发明的细胞可以通过该细胞类型的LD₅₀以及不同浓度的该细胞类型对所应用的患者体重和整体健康情况的副作用确定的速率给药。盖因可经由单剂或多剂实施。成体干细胞亦可使用经外源性给药的因子而固定化，该因子刺激干细胞的产生以及从组织或空间产出，该组织或空间可包括但不限于骨髓或脂肪组织。

药物组合物

如上所述，可以该领域技术人员已知的多种途径制备本发明的组合物。无论本文中揭露的组合物从何种来源或以何种方式获得，它们均可根据其用途配制。例如，上述核酸和载体可配制在用于组织培养中的细胞或用于给药至患者或受试者的组合物中。任何本发明的药物组合物均可配制为用于药物制剂中，尤其是用于下文治疗语境中所指出的用途中，如对患有HIV感染的患者或处于接触HIV和HIV感染风险下的患者的治疗。当用作药剂时，任何核酸和载体均可以药物组合物的形式给药。这些组合物可通过制药领域周知的方式制备，且可通过多种途径给药，取决于所希望的是局部或系统性治疗以及待治疗的区域。给药可以是外用给药(包括眼部给药以及给药至黏膜，包括鼻内给药、阴道给药和直肠给药)、肺部给药(如，通过粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器给药；气管内给药、鼻内给药、表皮给药和透皮给药)、眼部给药、口服给药或肠胃外给药。眼部递送的方法可包括外部给药(滴眼液)、结膜下注射、眼周注射、玻璃体内注射、或通过气泡式导管或经外科手术放置在结膜囊内眼科植入物引入。肠胃外给药包括静脉、动脉、皮下、腹膜、肌肉注射或输液；或颅内给药，如鞘内或心室内给药。肠胃外给药可以单次快速灌注方式进行，或通过例如连续输液泵进行。用于外用给药的药物组合物和配方可包括透皮贴剂、油膏、洗剂、乳清剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂、粉剂等。传统的药物载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或所希望的。

该药物组合物可含有，作为活性成分，本文中揭示的核酸和载体，该核酸和载体与一种或多种药学可接受的载剂合用。在本发明的足额恒温的制作中，典型将该活性成分与赋形剂混合、通过赋形剂稀释该活性成分、或将该活性成分密封在该载剂中，该载剂的形式为，例如，胶囊、片、袋、纸、或其它容器。当该赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料(如，生理盐水)，并作为该活性成分的媒介、载剂或介质而发挥作用。因此，该组合物的形式可以是片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、袋装剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳液、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或处于液体介质中)、洗剂、乳清剂、油膏剂、凝胶剂、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌注射溶液、和无菌封装粉末。如该领域中所知，稀释剂的类型可依据预期的给药途径而变。所得组合物可包括额外的剂，如防腐剂。一些具体实施例中，该载剂可以是或可以包括基于液体的或基于聚合物的胶体。一些具体实施例中，该载剂材料可以是配制为脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、或嵌段共聚物胶束的胶体。注意，该载剂材料可形成胶囊，且该材料可以是基于聚合物的胶体。

本发明的核酸序列可被递送至受试者的适宜细胞。可通过例如使用聚合性的、可生物降解的微粒或微胶囊递送媒介实现这一目的，该递送媒介的大小设定为最适合通过吞噬性细胞如巨噬细胞进行吞噬作用。例如，可使用直径为大约1至10μm的PLGA(聚丙交酯-共-乙交酯)微粒。将该多核苷酸封装在这些微粒中，而这些微粒被巨噬细胞吸收并在该细胞内逐步降解，从而释放该多核苷酸。该DNA一旦被释放，即在该细胞内表达。第二种类型的微粒预期不被细胞直接吸收，而是主要用作核酸的缓释蓄积池，该核酸仅在通过生物降解而从该微粒中释放时才被细胞吸收。因此，这些聚合性颗粒应大至足以妨碍吞噬作用(即，大于5μm，且优选大于20μm)。实现对该核酸的吸收的另一途径是使用通过标准方法制备的脂质体。该核酸可单独并入这些递送媒介中，或与组织特异性抗体共同并入这些递送媒介中，该抗体是，例如，以作为HIV感染的常见潜伏性感染蓄积池的靶点细胞类型如脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞、和肠相关淋巴细胞。护着，可制备由质粒或通过静电力或共价力附接至聚-L-赖氨酸的其它载体组成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合一配体，且该配体可接合至靶点细胞上的受体。将“裸DNA”(即，没有递送介质)递送至肌肉内、皮内、或皮下的位点，是实现体内表达的另一种手段。在相关的多核苷酸(如，表达载体)中，编码包含编码CRISPR相关的核酸内切酶的序列的分离核酸且视需要包含向导RNA的核酸序列，被可操作地链接至最小的Tat应答性HIV LTR启动子，如上文所述。

一些具体实施例中，本发明的组合物可配制为纳米颗粒，例如，由芯和环绕该芯的壳组成的纳米颗粒，其中，该芯是与DNA复合的高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)，而该壳是聚乙二醇改性(PEG化)的低分子量LPEI。

该核酸和载体可应用在装置(如，导管)的表面或包含在泵、贴、或其它药物递送媒介中。本文中揭露的核酸和载体可单独给药，或以存在药学可接受的赋形剂或载剂(如，生理盐水)的混合物形式给药。基于给药的模式和途径而选择赋形剂或载剂。适当的药学载剂以及药物配方中使用的药学必需品，揭示于该领域中周知的参考书《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin))和USP/NF(《美国药典和国家处方集》(United States Pharmacopeia and the National Formulary))中。

一些具体实施例中，该可配制为用于阻断HIV的性传播的外用凝胶。可在性活动之前，将该外用凝胶直接应用于男性或女性生殖区域的皮肤或黏膜。或者，或此外，该外用凝胶可应用于男用或女用避孕套或隔膜的表面上或内部。

一些具体实施例中，该组合物可配制为其内封装有编码可操作地链接至最小的HIV LTR启动子的Cas9或变体Cas9的核酸的纳米颗粒。该核酸还可额外编码与靶点HIV互补的向导RNA序列。

本发明的配方可囊括编码Cas9和与靶点HIV互补的向导RNA序列的载体。该向导RNA序列可包括与单一靶点区域互补的序列，或可包括任何与多个靶点区域互补的多个序列的组合，如早前所述。或者，该编码由最小的HIV LTR启动子驱动的Cas9的序列和编码该向导RNA序列的序列可位于独立的载体上。

本文中揭露的组合物普遍地且在各方面均可用于治疗患有HIV感染的受试者。该方法可用于以任何HIV如HIV-1和HIV-2以及SIV剂其任何循环重组形式为靶向。每当出现临床有益的结果，则受试者被有效地治疗。这可能意味着，例如，疾病症状的完全解决、疾病症状严重性的下降、或疾病进展的减缓。这些方法可极影包括下述步骤：a)鉴别患有HIV感染的受试者(如，患者，且更具体地，人类患者)；以及b)向该受试者提供一组合物，其中，该组合物包含编码处于最小的Tat应答性HIV LTR启动子控制之下的CRISPR相关的核酸酶如Cas9。该方法可进一步包括，向该受试者提供编码与HIV靶点序列如HIV LTR互补的向导RNA的序列。

可使用标准临床测试如用以检测HIV抗体或HIV多肽p24在受试者血清中的存在的免疫测定，或通过HIV核酸扩增试验，鉴别受试者。将一定量的该组合物提供至该受试者并导致感染症状的完全解决、感染症状的严重性下降、或感染进展的减缓，则认为是治疗有效的量。本发明的方法亦可包括一监控步骤，以优化给药剂量和给药时间以及预知的后果。在本发明的一些方法中，可首先确定患者是否患有潜伏性HIV感染，随后做出是否使用本文中揭示的一种或多种组合物治疗该患者的决定。监控也可用来检测耐药性的出现，以及用来快速区分有应答的患者和无应答的患者。一些具体实施例中，该方法可进一步包括下述步骤：确定该患者所携带的特定HIV的核酸序列，随后设计与这些特定序列互补的向导RNA。例如，可确定患者的LTR U3区、R区、或U5区的核酸序列，随后设计一种或多种与该患者的序列精确互补的向导RNA，仍然不选择作为该最小的Tat应答性HIV启动子的一部分的序列。

该组合物可作为治疗手段，如预防性治疗手段，用于处于罹患逆转录病毒感染如HIV感染风险下的受试者。这些方法可进一步包括下述步骤：a)鉴别处于罹患HIV风险下的受试者；b)向该受试者提供一组合物，其中，该组合物包含编码处于最小的Tat应答性HIV-1LTR启动子控制之下的CRISPR相关的核酸酶如Cas9的核酸。该序列还可编码与HIV靶点序列如HIV LTR互补的向导RNA。处于罹患HIV感染的风险下的受试者可以是，例如，任何参与不安全性行为的性活跃个体，即进行性活动而不使用避孕套的个体；患有另一种性传播感染的性活跃个体；静脉注射毒品使用者；或未受割礼的男性。处于罹患HIV感染的风险下的受试者可以是，例如，其职业可能将他或她带至与感染HIV的群体接触的个体，如医护人员或现场急救人员。处于罹患HIV感染的风险下的受试者可以是，例如，同处于监禁场所内的人员、或性工作者即通过性活动获取收入或非货币性物品如食品、药物或庇护所等的个体。

亦可将该组合物给药至具有HIV感染的妊娠期或哺乳期女性，以降低从母亲到其子女的HIV传播的可能性。感染HIV的妊娠女性可在子宫内经胎盘将病毒传递至其子女，在分娩时通过产道或在分娩后通过乳汁将病毒传递至其子女。可在哺乳期或产前、围产期以及产后或上述阶段的任何组合，将本文中揭露的组合物给药至感染HIV的母亲。在给药该组合物的同时，可对该母亲进行下文揭示的标准抗逆转病毒治疗。一些具体实施例中，本发明的组合物也可在分娩后立即给药至婴儿，且在一些具体实施例中，在产后一定时间后给药至婴儿。该婴儿也可接受标准抗逆转录病毒治疗。

该组合物可给药至未感染HIV的个体以预防HIV感染。该组合物可包括递送治疗有效量的药物组合物。该药物组合物可包括编码CRISPR相关的核酸内切酶的序列以及至少包括HIV LTR启动子的核心区域以及该最小的Tat应答性HIV LTR启动子的TAR区域，如上文所述。

本文中揭露的方法可应用于多个物种，如人类、非人灵长动物(如，猴)、马或其它家畜、狗、猫、雪貂或其它作为宠物的哺乳动物、大鼠、小鼠、或其它实验室动物。

本发明的方法可表达为药物的制备。据此，本发明涵盖本文中揭示的药剂和组合物在药物制备中的用途。本文中揭示的化合物可用于治疗性组合物和方案中，或用于制造用于治疗本文中揭示的疾病或病症的药物。

本文中揭示的任何组合物均可给药至宿主身体的任何部分，并随后被递送至靶点细胞。组合物可被递送至而不限于哺乳动物的脑、脑脊液、关节、鼻黏膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹腔。就递送途径而言，组合物可通过静脉注射、颅内注射、腹膜注射、肌肉注射、皮下注射、肌肉注射、直肠注射、阴道注射、鞘内注射、气管内注射、皮内注射或透皮注射给药，通过口腔或鼻腔给药，或通过随时间逐步灌注给药。进一步的实例中，可通过吸入将组合物的气雾剂制剂给药至宿主。

所需要的剂量将取决于给药途径、配方特性、患者疾病特性、患者体积、体重、表面积、年龄和性别、其它正在服用的药物、以及主治医生的判断。鉴于细胞靶点的多样性和不同给药途径的效率差异，可预期所需剂量的广泛变动。这些剂量水平的变动可使用如该领域技术人员所充分理解的标准的经验优化途径判断。给药可以是单次或多次(如，2倍或3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、或更多倍)。将该化合物封装在适当的递送媒介(如，聚合性微粒或可移植的装置)中，可增加递送效率。

使用本文中提供的任何组合物进行治疗的持续时间可以是短至一天到长达贯穿宿主寿命(如，多年)的任何长度。例如，化合物的给药频率可为每周一次(持续如4周至多月或多年)；每月一次(持续如3至12个月或多年)；或每年一次，持续5年、10年或更久。还应注意，治疗的频率是可变的。例如，本发明的化合物可每天、每周、每月或每年给药一次(或两次、三次等)。

可将有效量的本文中提供的任何组合物给药至需要进行治疗的个体。可通过评估患者在给药已知量的特定组合物后的应答而确定有效量。此外，若存在任何毒性，则毒性的水平可通过评估患者在给药已知量的特定组合物之前和之后的临床症状而确定。注意，给药至患者的特定组合物的有效量可根据所希望的后果以及患者的应答和毒性水平而判断。依据包括而不限于该患者疾病状态、年龄、和对副作用的耐受性的多种因素，每一患者的有效毒性可能不同。

可使用该领域技术人员所知的任何方法确定特定的应答是否被诱导。可使用可评估特定疾病状态程度的临床方法来确定应答是否被诱导。用以评价应答的特定方法将取决于患者病变的特性、患者的年龄和性别、正在服用的其它药物、和主治医生的判断。

该组合物亦可与其它治疗剂如在HAART中使用的抗逆转录病毒剂、化疗剂、HIV转录激活因子如PMA、TSA等合用。抗逆转录病毒剂可包括逆转录酶抑制剂(如，核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、齐多夫定(zidovudine)、恩曲他滨(emtricitibine)、拉米夫定(lamivudine)和特诺菲韦(tenoifvir)；以及非核苷逆转录酶抑制剂如efavarenz、奈韦拉平(nevirapine)、利匹韦林(rilpivirine))；蛋白酶抑制剂，如替匹拉韦(tipiravir)、地瑞那韦、茚地那韦；进入抑制剂，如马拉维诺(maraviroc)；融合抑制剂，如恩福维里肽(enfuviritide)；或整合酶抑制剂，如雷特格列韦(raltegrivir)、度鲁特韦(dolutegravir)。抗逆转录病毒剂亦可包括多类别的组合剂，例如，恩曲他滨(emtricitabine)、依法韋侖(efavarenz)和特诺菲韦(tenofivir)的组合；恩曲他滨、利匹韦林和特诺菲韦的组合；或埃替拉韦(elvitegravir)、可比司他(cobicistat)、恩曲他滨和特诺菲韦的组合。

此外，一种或多种缓解任何可能与该病毒感染相关的其它症状如发热、发冷、头痛、二次感染的剂，可与该药物组合物协同给药、或作为该药物组合物的一部分给药或在不同时间分开给药。这些剂包含而不限于，退热剂、抗炎剂、化疗剂、或其组合。

某些具体实施例中，该抗病毒剂包含治疗有效量的抗体、适配体、佐剂、反义寡核苷酸、趋化因子、细胞因子、免疫刺激剂、免疫调节分子、B细胞调节因子、T细胞调节因子、NK细胞调节因子、抗原呈递分子调节因子、酶、siRNA、干扰素、利巴韦林(ribavirin)、蛋白酶抑制剂、反义寡核苷酸、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、神经氨酸苷酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂、嘌呤核苷、趋化因子受体拮抗剂、白介素、疫苗或其组合。

该免疫调节分子包含但不限于细胞因子、淋巴因子、T细胞共刺激配体等。免疫调节分子积极地及/或消极地影响体液免疫系统及/或细胞免疫系统，尤其是其细胞及/或非细胞组分、其功能、及/或其与其它生理系统的相互作用。该免疫调节分子可从包含细胞因子、趋化因子、巨噬细胞游走抑制因子(MIF；尤其如在Bernhagen(1998),Mol Med 76(3-4)；151-61或Metz(1997),Adv Immunol 66,197-223中所揭示)、T细胞受体或可溶性MHC分子的组中选择。此类免疫调节效应分子是该领域中周知的，且尤其揭示于Paul所著《基础免疫学》(Fundamental immunology,Raven Press,New York(1989))中。特别地，已知的细胞因子和趋化因子揭示于Meager所著《细胞因子的分子生物学》(The Molecular Biology ofCytokines(1998),John Wiley&Sons,Ltd.,Chichester,West Sussex,England)、Bacon(1998).Cytokine Growth Factor Rev 9(2):167-73、Oppenheim(1997).Clin Cancer Res12,2682-6、Taub,(1994)Ther.Immunol.1(4),229-46或Michiel,(1992).Semin CancerBiol 3(1),3-15)中。

可测量的免疫细胞活性包括但不限于：(1)通过测量DNA复制而测量的细胞增殖；(2)细胞因子产生量的增加，包括对细胞因子如IFN-γ、GM-CSF、或TNF-α的特异性测量；(3)细胞介导的靶向杀死或细胞溶解；(4)细胞分化；(5)免疫球蛋白的产生；(6)表型的改变；(7)趋药性因子或趋药性的产生，意味着对具有趋药性的趋化素产生应答的能力；(8)通过抑制一些其它免疫细胞类型而进行的免疫抑制；以及，(9)细胞凋亡，指的是被激活的免疫细胞在某些情况下的破碎，是不正常激活的标志。

还感兴趣的是存在于被细胞毒性T淋巴细胞或LAK细胞递送至其靶点的细胞溶解封装中存在的酶。穿孔素——一种形成孔的蛋白质、和Fas配体是这些细胞中的主要细胞溶解分子(Brandau et al.,Clin.Cancer Res.6:3729,2000；Cruz et al.,Br.J.Cancer 81:881,1999)。CTL也表达名为颗粒酶的由至少11种丝氨酸蛋白酶组成的酶家族，颗粒酶具有四种主要底物特异性(Kam et al.,Biochim.Biophys.Acta 1477:307,2000)。低浓度的链球菌溶血素O和肺炎球菌溶血素促进颗粒酶B依赖性的细胞凋亡(Browne et al.,Mol.CellBiol.19:8604,1999)。

其它适当的效应子编码具有下述活性的多肽，该多肽自身不对细胞造成毒性，但通过在代谢层面改变该细胞或将非毒性的前药变为致死性的药物而令该细胞对非毒性的化合物敏感。例示的效应子为胸苷激酶(tk)，如可以是源自单纯疱疹病毒且在催化层面上等效的变体。该HSV tk将抗疱疹病毒基更昔洛韦(ganciclovir(GCV))转化为在细胞增殖中干扰DNA复制的毒性产物。

将两种或更多种药物同时给药并不需要将这些剂在同一时间通过同一途径给药，只要该剂发挥其疗效的时间段有所重叠即可。预期为同步或依序给药，如在不同的日期或周内给药。该治疗剂可以周期方案给药，如连续给药低剂量的治疗剂。

可通过标准药学过程在细胞培养物或实验动物体内测定该组合物的剂量、毒性和疗效，如测定LD₅₀(将群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(对群体的50％产生疗效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比称为治疗指数，可表达为LD₅₀/ED₅₀比。

从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于推定在人体中使用的范围和剂量。这些组合物的剂量优选处于包括具有低毒或无毒的ED₅₀在内的循环浓度范围内。在此范围内，该剂量可依据所采用的剂型和所使用的给药途径而变。对于任何用于本发明方法中的组合物，最初可从细胞培养试验估算治疗有效剂量。可在动物模型中推定实现包括在细胞培养中所测IC₅₀(即，测试化合物实现对症状的半数最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度的剂量。这一信息可用来更准确地确定可用于人体的剂量。例如，可通过高效液相色谱测量血浆中的水平。

如上所述，治疗有效量的组合物(即，治疗剂量)意味着足以产生所希望的治疗性(如，临床)结果的量。给组合物可以每天一次或多次至每周一次或多次的频率给药；包括每两天一次。该领域技术人员应明了，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的给药剂量和给药时间，该因素包括但不限于疾病或病变的严重性、先期治疗、该受试者的一般健康状况及/或年龄、以及存在的其它疾病。此外，以治疗有效量的本发明组合物治疗受试者，可包括单一治疗或一系列治疗。

本文中揭示的组合物适用于上文所述的多种药物递送系统。此外，为了延长所给药化合物的体内血清半衰期，可将该组合物封装入胶囊内、引入脂质体的内腔、制备为胶体，或可采用延长该组合物血清半衰期的其它传统技术。多种方法可用于制备脂质体，如在Szoka等人的US 4,235,871、US 4,501,728和US 4,837,028中揭示的方法，前述专利各自通过引用并入本文。而且，药物可在靶向药物递送系统中给药，例如，在涂覆有组织特异性抗体的脂质体中。该脂质体将以器官为靶向并被该器官选择性地吸收。

还提供令哺乳动物细胞内的逆转录病毒如慢病毒如人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、猫科动物免疫缺陷病毒、或牛科动物免疫缺陷病毒失活的方法。该人类免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。该人类免疫缺陷病毒可以是染色体层面上整合的前病毒。该哺乳动物细胞可以是被HIV感染的任何类型的细胞，包括但不限于，CD4⁺淋巴细胞、巨噬细胞、纤维母细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀手细胞、树突细胞如朗格汉斯(Langerhans)细胞和滤泡性树突细胞、造血干细胞、内皮细胞、脑小神经角质细胞、星形胶质细胞和胃肠上皮细胞。这些细胞类型包括在初次感染中典型被感染的那些细胞类型，例如，CD4⁺淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞或朗格汉斯细胞，以及那些形成潜伏性HIV蓄积池的细胞类型，即潜伏性感染的细胞。

该方法可包括将该细胞曝露于组合物及/或令该细胞与该组合物接触，其中，该组合物包含编码可操作地链接至最小的HIV LTR启动子的CRISPR相关的核酸内切酶的分离核酸，且该最小的HIV LTR启动子含有该HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。该Fenix的核酸可进一步编码一种或多种向导RNA，其中，该向导RNA与逆转录病毒中的靶点核酸序列互补。该接触步骤可在体内进行，换言之，该组合物可直接给药至罹患HIV感染的受试者。但该方法并不限于此，该接触步骤也可以离体方式进行。例如，可从罹患HIV感染的受试者体内移除一个或多个细胞或组织外植体并培养该细胞或组织外植体，随后令其与一包含可操作地链接至最小的HIV LTR启动子的CRISPR相关的核酸内切酶且视情况包含向导RNA的组合物接触，其中该向导RNA与HIV中的核酸序列互补。如上所述，药物组合物可包括编码可操作地链接至最小的Tat应答性HIV LTR启动子的CRISPR相关的核酸内切酶的核酸。

该组合物可以促进其被哺乳动物细胞吸收的方式配制。可使用的载体系统和配方揭示于上文中。一些具体实施例中，该载体可将该组合物递送至特定的细胞类型。但本发明并不限于此，其它DNA递送方法如使用诸如磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂质复合物、表面活性剂和全氟化学液体的化学转染方法以及物理递送方法如电穿孔、显微注射、弹道粒子和“基因枪”系统也在预期之内。

标准方法，例如，用以检测CRISPR相关的核酸内切酶的免疫测定或用以检测该向导RNA的基于核酸的测定方法如PCR，可用来证实细胞已经吸收及/表达被引入该细胞内的蛋白质。如下文所述，经工程化的细胞随后可再次引入该细胞所来自的受试者体内。

其它具体实施例中，该组合物包含已经使用一种或多种Cas9/最小的Tat应答性HIV LTR启动子载体转化或转染的细胞。一些具体实施例中，本发明的方法可以离体方式应用。换言之，可从受试者体内移除细胞，并在培养中使用该组合物处理以切除HIV序列，再将处理后的细胞返回至该受试者体内。该细胞可以是该受试者的细胞，或者它们可以是单体型匹配的细胞或是细胞系。该细胞可经辐射以防止其复制。一些具体实施例中，该细胞是人类白细胞抗原(HLA)匹配的细胞、自体同源细胞、细胞系、或其组合。其它具体实施例中，该细胞可以是干细胞，例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。已经从包括人类在内的多个动物物种建立了胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导多能干细胞，iPS细胞)。因为这些类型的多能干细胞能通过对其分化的适当诱导而分化为几乎全部器官，并在维持其多能性的同时保留其主动分裂的能力，它们将会是再生医学最有用的细胞来源。尤其是iPS细胞可从自源性体细胞建立，因此，与通过摧毁胚胎而生产的ES细胞相比，iPS细胞几乎不造成伦理和社会问题。再者，iPS细胞是自源性细胞，这令其可能避免排异反应，而排异反应是再生医学或移植疗法的最大障碍。

本文中揭示的组合物可封装在具有标记的容器中，例如，用作治疗罹患逆转录病毒感染如HIV感染的受试者或处于接触逆转录病毒感染如HIV感染风险下的受试者的治疗剂。该容器可包括一组合物，如早前所述，该组合物包含编码CRISPR相关的核酸内切酶如Cas9核酸内切酶的核酸序列以及最小的Tat应答性HIV LTR启动子。该序列还可编码与HIV中靶点序列互补的向导RNA，该组合物或还可视用途而酌情包含编码该核酸的载体，以及适当的稳定剂、载剂分子、芳香剂等中的一种或多种。据此，封装的产品(如，含有一种或多种本文中揭示的组合物的无菌容器和用于储存、运输、或以浓缩或即用型浓度封装的容器)和试剂盒，包括至少一种所揭露的组合物。产品可包括含有一种或多种本发明组合物的容器(如，小瓶、罐、瓶、袋等)。此外，制造的物品可进一步包括，例如，封装材料、使用说明书、注射器、递送装置、缓冲剂或用于治疗或监控预防或治疗所需条件的其它控制试剂。一些具体实施例中，该试剂盒可包括一种或多种额外的抗逆转录病毒剂，例如，逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂或进入抑制剂。该额外的剂可与核酸序列或载体一起封装在同一容器中，其中该核酸序列编码可操作地链接至最小的HIV LTR启动子的CRISPR相关核酸内切酶如Cas9核酸内切酶以及视情况的与HIV中靶点序列互补的向导RNA，而该载体编码该核酸，或它们可独立封装。

该产品还可包括说明(如，揭示该产品用途的印刷标签或插页或其它媒体(如，录音带或录影带))。该说明可与该容器关联(如，黏贴在该容器上)，且可揭示该容器内的组合物的给药方式(如，给药频率和途径)、其适应症、和其它用途。该组合物可以是已经做好给药准备(如，以剂量适宜的单位存在)，且可包括一种或多种额外的药学可接受的佐剂、载剂或其它稀释剂及/或额外的治疗剂。或者，该组合物可提供为具有稀释剂和稀释说明书的浓缩形式。

尽管上文已经揭示了本发明的多种具体实施例，但应理解，它们仅作为示例之用而非限制。根据本文揭露的内容，可对所揭露的具体实施例做出各种改变而不悖离本发明的精神或范畴。因此，本发明的广度和范畴不应为上文揭示的具体实施例所限。

本文中提及的所有文献均通过引用并入本文。处于所有目的而在本申请书中引用的所有出版物和专利文献，均以与独立表示各独立出版物或专利文献相同的程度通过引用并入本文。通过在本文献中引用多篇参考文献，申请人不承认任何特定参考文献为其发明的“现有技术”。

[实施例]

下述非限制性实施例用来例示性说明所选择的本发明的具体实施例。应明了，所显示的组分元素的比例变化和替代选择对于该领域技术人员是显而易见的，且处于本发明的具体实施例的范畴内。

实施例1：通过基因编辑进行HIV-1的负反馈调节

在此处提出的研究中，细化基因编辑技术并研发允许通过HIV-1转录激活因子Tat在病毒再激活的早期阶段进行CRISPR/Cas9的有条件的激活的新策略。这一新策略通过移除横跨该病毒启动子及/或病毒编码序列的片段，在病毒有效复制之前永久性地消除病毒复制。再者，这一策略减轻了出于可能由Cas9在细胞内的非必需且持续的表达导致的无法预期的并发症而造成的顾虑。

材料和方法

质粒制备：通过使用pNL4-3HIV载体(NIH AIDS试剂项目#114)作为模板的PCR获得全长度的和截短的LTR启动子序列，引物列于表1(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4)中。PCR产物经凝胶纯化，直接在TA载体(Invitrogen)内进行亚克隆，随后使用Kpn1或Xba1和Nco1限制性内切酶切除，并结扎入经Kpn1-Nco1或Xba1-Nco1消解的pX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-H1-短tracr-PGK-puro质粒(Addgene#42229)中。结果，pX260质粒中的原始Cbh启动子(Xba1-Kpn1-Cbh-Nco1)被移除并替换为一种LTR启动子(Xba1-或Kpn1-LTR-Nco1)。为了创建慢病毒LTR-Cas9构造，使用Nhe1/Xba1处理lentiCas9-Blast(Addgene#52962)，结果，EFS启动子序列被移除并被替换为经Nhe1-LTR-80/+66-Xba1消解的PCR产物，创建Lenti-LTR-80/+66-Cas9-Blast质粒(表1；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)。先前已经揭示了pKLV-U6-LTR A/B-PGKpuro2ABFP慢病毒质粒(Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))。pcDNA3.1控制载体购自Invitrogen，而先前已经揭示了pCMV-Tat86(Gallia,G.L.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,11572-11577(1999))。通过以pMDLg/pRRE(Addgene 12251)、pRSV-Rev(Addgene 12253)和pCMV-VSV-G(Addgene 8454)共转染HEK293T细胞，将pKLV-U6-LTR A/B-PGKpuro2ABFP封装在慢病毒颗粒中。对于将Cas9封装入慢病毒颗粒中，使用下述载体：Lenti-LTR-80/+66-Cas9-Blast、psPAX2(Addgene 12260)和pCMV-VSV-G(Addgene 8454)。

细胞培养：从美国国立健康研究院(National Institutes of Health(NIH))国立过敏症和传染病研究所AIDS部门的AIDS试剂项目部(AIDS Reagent Program,Division ofAIDS,National Institute of Allergy and Infectious Diseases,NIH.)获得TZM-bl报告细胞系，从ATCC(TIB-152^TM and CRL1593.2^TM)购得Jurkat克隆体E6-1和U937，而先前已经揭示了Jurkat 2D10报告细胞系(Pearson,R.,et al.J.Virol.82:12291-12303(2008))。在以10％FBS和庆大霉素(10μg/ml)补充的高葡萄糖DMEM中培养TZM-bl细胞。在含有10％FBS和庆大霉素(10μg/ml)的RPMI培养基中培养Jurkat细胞和Jurkat 2D10细胞。从费城天普大学(Temple University in Philadelphia)路易斯卡茨医学院(Lewis Katz Schoolof Medicine)神经系统科学系综合NeuroADIS中心(Comprehensive NeuroAIDS Center(CNAC))的组织培养核心(Tissue Culture Core)设施获得人类星形胶质细胞和小神经胶质细胞的初代培养。

稳定的细胞系和亚克隆：将TZM-bl细胞以1×10⁵细胞/孔置于6孔板中，并使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)以1μg的pX260-LTR_(-80/+66)-Cas9质粒转染。次日，将细胞转移至100-mm培养皿内，在浓度为1μg/ml的嘌呤霉素(Sigma)的存在下培养。2周后，使用克隆柱(Corning)分离存活的克隆体。以10μg的pX260-LTR_(-80/+66)-Cas9质粒(Neon系统,Invitrogen,3×10ms/1350V脉冲)对两百万个Jurkat 2D10细胞进行电穿孔。48小时后，将培养基替换为含有嘌呤霉素0.5μg/ml的培养基。1周后，移除嘌呤霉素，令细胞再生长1周。之后，将细胞稀释至10细胞/ml的浓度，以50μl/孔的密度置于96孔板中，培养2周。在使用对照pCMV-空质粒(pcDNA3.1)或pCMV-Tat质粒转染后，通过西方墨点法进行TZM-bl和Jurkat2D10两种pX260-LTR_(-80/+66)-Cas9单细胞克隆体的Cas9-FLAG表达筛选。扩增在对照条件下具有不可检出/非常低水平的Cas9但在Tat过表达时具有非常高水平的Cas9的单细胞克隆体，并用于下一步实验中。

慢病毒封装：使用CaPO₄沉淀方法，在氯喹(50μM)的存在下，以30μg总DNA/2.5×10⁶细胞/100mm培养皿的封装慢病毒载体共转染HEK 293T细胞。次日替换培养基，在24小时和48小时后收集上清液，以3000RPM澄清10分钟，经0.45μm过滤，并通过超速离心法(2h，25000RPMI，20％蔗糖缓冲垫)浓缩。通过轻柔搅动过夜将慢病毒团块再次悬浮在HBSS中，等分并测定其在HEK 293T细胞中的滴度。通过FLAG免疫细胞化学测定Lenti-LTR_(-80/+66)Cas9-Blast慢病毒滴度，并通过BFP荧光显微镜检查测定pKLV-U6-LTR A/B-PGKpuro2ABFP慢病毒滴度。

病毒原液：对于HIV-1_{NL4-3-EFGP-p2A-Nef}的创建，使用融合PCR(Heckman,K.L.,etal.Nat.Protoc.2,924-932(2007))来扩增EGFP基因、P2A自裂解肽(Kim,J.H.,et al.PLoSOne 6,e18556(2011))、和位于框内的具有最初用于HIV-1Nef表达的HIV-1剪接受体的HIV-1 Nef N端。随后将DNA克隆入HIV-1前病毒克隆体pNL4-3的BamHI和XhoII限制行为点(Adachi,A.,et al.J.Virol.59,284-291(1986))。来自猪捷申病毒-1的位于GFP与Nef之间的自裂解P2A肽，令HIV-1 Nef以全长度表达(Edmonds,T.G.,et al.PBMC.Virology 408,1-13(2010))。为了生成pEcoHIV-NL4-3-EGFP，将HIV-1NL4-3中gp120的编码区域替换为从pHCMV-EcoEnv进行PCR扩增而得的来自嗜亲性鼠白血病的gp80(Sena-Esteves,M.,etal.J.Virol.Methods 122,131-139 2004；Addgene质粒15802)，之后进行先期公开的工程化策略(Potash,M.J.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,3760-3765(2005))。

通过加工为慢病毒原液(见上文)并通过GFP-FACS在Jurkat细胞系中测定滴度的pNL4-3-EGFP-P2A-Nef质粒(匹兹堡大学药学院(University of Pittsburgh School ofMedicine))转染HEK 293T细胞，制备HIV-1_{NL4-3-EGFP-P2A-Nef}报告病毒。以HIV-1转染PBMC 6天，上清液以3000RPM澄清10分钟，经0.45μm过滤，制备HIV-1JRFL和SF162粗制原液。使用Gagp24ELISA测定病毒滴度。

体外HIV-1感染：通过在32℃的含有8μg/ml聚凝胺(polybrene)的500μl接种体中以2700RPM离心孵化(spinoculation)2h，随后再次悬浮并放置4h，再加入500μl的生长培养基，感染Jurkat细胞和U937细胞。次日，细胞以PBS洗涤3次，再次悬浮于生长培养基中。对于星形胶质细胞和小神经胶质细胞的感染，通过使用稀释于Opti-MEM培养基中的病毒原液在聚凝胺(8μg/ml)的存在下孵化4h，随后加入1ml的生长培养基并放置过夜，转导/感染初代人胎脑细胞。次日，细胞以PBS洗涤3次，并加入新鲜的生长培养基。

HIV-1 DNA检测和定量：使用NucleoSpin组织试剂盒(Macherey-NagelInc.Bethlehem,PA)，根据制造商的建议，从细胞分离基因组DNA。对于LTR特异性PCR(见表1；SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14；正向(F)和反向(R)β-肌动蛋白分别为SEQ ID NO:15和SEQID NO:16)，使用FailSafe^TM PCR试剂盒和缓冲剂D(Epicentre Technologies Corp.,Madison,WI)，令100ng所提取的DNA在下述PCR条件下进行PCR：98℃，5分钟，30次循环(98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)；72℃，7分钟；并在2％琼脂糖凝胶中拆分。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶予以纯化，克隆入TA载体(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中，并送样进行Sanger测序(Genewiz Global,South Plainfield,NJ)。使用对于HIV-1 5'-UTR和Env基因为特异性的TaqManTMqPCR，并使用细胞β-球蛋白基因作为参照物(见表1，SEQ IDNO:17至SEQ ID NO:25)，对HIV-1 DNA定量。在qPCR之前，将来自被感染的细胞的基因组DNA稀释至10ng/μl，随后每孔取5μl(＝50ng)进行反应。使用Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)，根据简化过程(Liszewski,M.K.,et al.Methods 47,254-260(2009))，制备反应混合物。由于U1细胞基因组DNA的逐级稀释物中每二倍体基因组含有的HIV-1前病毒的两种单拷贝的数目等于β-球蛋白拷贝数，自该逐级稀释物制备标样。qPCR条件：98℃，5分钟，45次循环(98℃，15s；62℃，30s，同时撷取；72℃，1分钟)。实施反应，并使用LightCycler480^TM(Roche Holding AG,Basel,Switzerland)分析数据。

逆转录和PCR：使用具备柱上DNAse I消解的RNeasy试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从细胞中提取总RNA。接着，使用1μg的RNA进行M-MLV逆转录反应(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)。稀释cDNA，以与基因组DNA相同的方案且以细胞β-肌动蛋白基因为参照，并使用对于HIV-1Gag和Env基因特异性的TaqMan^TM qPCR(表1，SEQ ID NO:17至SEQ IDNO:25)进行定量，但使用相对定量模式进行分析。

流式细胞术：使用Guava EasyCyte迷你型流式细胞仪(Guava Technologies,Inc.,Billerica,MA)在活体细胞内进行Jurkat 2D10中GFP表达的定量。首先，将经HIV-1_{NL4-3-GFP-P2A-Nef}转染的Jurkat细胞在2％多聚甲醛中固定10分钟，随后在PBS中洗涤3次。使用碘化丙啶染色评价细胞存活率。将PI溶液加入200μl的活体细胞悬浮液中，直至PI最终浓度为10μg/ml。将样品在黑暗中于室温孵化5分钟。孵化后，使用Guava EasyCyte迷你型流式细胞仪撷取样品。

西方墨点法：通过在置于冰上的TNN缓冲液[50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、1％Nonidet P-40、5mM EDTA pH 8、1X用于哺乳动物细胞的蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合物(Sigma)]中将Jurkat细胞孵化30分钟，随后在4℃以最大速度旋转10分钟而预澄清，制备全细胞裂解液。将50微克裂解液在1X Laemli缓冲液中变性，通过在Tris-甘氨酸缓冲液中的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，之后转移至硝基纤维素膜(Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA)上。将该膜在5％牛奶/PBST中阻断1h，随后使用鼠抗-flag M2单克隆抗体(1:1000,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)或鼠抗-α-微管蛋白单克隆抗体(1:2000)孵化。以PBST洗涤之后，使用偶联山羊抗鼠抗体(1:10,000)在室温孵化该膜1h。使用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)扫描该膜并分析。

结果

将对应于该Cas9基因的编码DNA序列置于pX260表达载体中，该载体含有三个不同的横跨5'-LTR的U3区域和R区域的HIV-1启动子片段，以鉴别该病毒启动子的最小的DNA要素，该要素保留对于Tat的应答但缺少对应于最初用于编辑HIV-1 DNA的gRNA A和gRNA B(图1A)。通过对每一构造进行DNA测序而证实这一克隆策略后，在以pX260或pX260-LTR-Cas9和CMV-Tat共转染的TZM-bl细胞中检查每一载体对Cas9的表达及其对于Tat的应答水平。西方墨点法结果证实，包括涵盖位于位置-80至+66之间的最小DNA启动子序列的质粒在内的全部三种构造均激活Cas9表达(图1B)。由于该启动子序列停留在对应于gRNA A和gRNAB的DNA序列之外，上述结果对于研究来说尤为重要(图1B)。之后，将对应于LTR_(-80/+66)-Cas9的DNA碎片克隆入慢病毒载体(LV)中并用来转导TZM-bl细胞，以评价Tat蛋白质在编辑被整合的表达该荧光素酶报告基因的HIV-1 DNA拷贝上的效果。该LTR的PCR结果证实，在表达gRNA A、gRNA B和Tat蛋白质的细胞中检测到205bp DNA碎片(图1C，将1至5泳道与6至8泳道比较)。用于PCR扩增的引物的位置和预计的扩增子例示性说明于图1A(也见图7)。Cas9、Tat和α-微管蛋白(相等负载的对照物)的表达显示于图1D。

之后，通过荧光素酶试验检查病毒DNA切除对于病毒启动子活性的影响。结果显示，当Cas9被Tat激活时，荧光素酶活性逐渐下降，证实了DNA试验的结果，表明DNA的裂解造成对这些细胞中病毒启动子活性的抑制(图1E)。在随访研究中，探究了TZMb1细胞被HIV-1感染时的Cas9激活。为了这一目的，通过LV-gRNA A/B转导LTR_(-84/+66)-Cas9报告TZMb-1细胞24小时，此后，以三种不同MOI的HIV-1_JRFL或HIV-1_SF162感染细胞。48小时后，收获细胞，通过PCR评估DNA切除，通过荧光素酶试验评估所整合的启动子序列的表达，以及通过西方墨点法评估Cas9的表达。这些实验的结果显示，在使用HIV-1_JRFL和HIV-1_SF162感染的细胞中检测到裂解后的205bp DNA碎片，表明通过HIV-1_JRFL和HIV-1_SF162反式激活LTR(-80/+66)启动子产生了Tat以及在这些细胞中产生了Cas9(图2A)。再者，荧光素酶试验的结果表明，该细胞中的荧光素酶活性显著降低，再次证实了通过在以HIV-1_JRFL或HIV-1_SF162感染时产生的Tat进行的Cas9激活在终止被整合的HIV-1荧光素酶基因中的有效性。被感染的细胞中Cas9的诱导显示于图2B。西方墨点法的结果显示，当以HIV-1_JRFL和HIV-1_SF162感染细胞时，截短的LTR启动子——LTR_(-80/+66)被激活，导致在该细胞中产生Cas9蛋白(图2C)。

在随访实验中，在人类T淋巴细胞系2D10中，测试Tat介导的LTR-Cas9以及gRNA A/B的激活在消除HIV-1基因组的能力(Pearson,R.,et al.J.Virol.82:12291-12303(2008))。这些细胞携带潜伏状态的单轮HIV-1_NL4-3的整合拷贝，其基因组缺少Gag基因部分和Pol基因部分，而Nef基因被替换为编码报告绿色荧光蛋白(GFP)的基因。这些细胞中Tat蛋白的水平和Cas9激活的水平提升(显示于图3A)，造成当通过LV-gRNA A/B转导的细胞中Cas9被激活时，编辑该病毒LTR(如3B，也见图8中泳道1至8)。据此，在Tat的存在下，检测到GFP阳性细胞数显著减少(图3C)，表明Tat的激活消除了被裂解的启动子在表达病毒DNA中的能力，这在后来造成对这些细胞中的GFP的抑制。对于该gRNA位置的DNA序列、DNA碎片的切除和PCR引物显示在图9A至9C中，即SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:40。基础水平的Cas9表达和病毒DNA切除可能归因于Tat在潜伏性2D10细胞系中的基本但最低程度的表达。

鉴于早前的观察表明了PMA及/或TSA刺激2D10细胞中前病毒DNA的整合拷贝的能力(Pearson,R.,et al.J.Virol.82:12291-12303(2008))，在潜伏性感染的T细胞模型中评估PMA和TSA对Cas9激活的影响。如图4A中所见，单独或联合使用PMA和TSA处理2D10细胞，增加了Cas9表达的水平。在平行实验中，实施PCR分析以检测LTR DNA，结果显示了病毒DNA切除水平的明显增加(图4B)，如通过205bp DNA碎片的出现所证实(见图8，泳道9至14)。通过使用西方墨点法测量细胞中GFP的水平而检查病毒激活，或通过荧光显微检查将病毒激活的标志绿色荧光细胞定量(图4C)，发现病毒基因表达的水平急剧降低。因此，当通过在静默前病毒DNA再激活时被表达的Tat或通过PMA和TSA激活该最小的病毒启动子(-88/+60)时所造成的Cas9产生，可能导致对含有gRNA A和gRNA B的细胞中的病毒DNA整合拷贝的编辑，并可能对该细胞中潜伏性病毒基因组的表达产生负面影响。

下一系列实验中，检查了HIV-1在含有LTR-Cas9的Jurkat T细胞中的复制水平。以表达gRNA A、gRNA B、和LTR_-88/+60-Cas9的慢病毒载体(LV)转导细胞。24小时后，以HIV-1_{NL4-3-EGFP-P2A-Nef}感染被转导的细胞，在3天和5天后，收获细胞，并测试病毒DNA中横跨gRNA A和gRNA B靶点序列的190bp DNA碎片的切除。如图5A和图5B中所见，以HIV-1感染细胞造成在第3天出现205bp扩增子，其强度在感染第5天得以增加(图5A和图5B)。这一观察结果提供了与图3A至3C中所示结果类似的证据：Tat水平在HIV-1过程中的增加刺激LTR-Cas9表达，并因此刺激LTR DNA的裂解。对在第5天所见的205bp谱带的直接测序表明了LTR内被造成一定范围内突变的Cas9/gRNA A和Cas9/gRNA B裂解的位点，该位点可在5'融合位点和3'融合位点的接合中检出(图5C)。检查对应于均位于该5'LTR与3'LTR之间的5-UTR(nt+97至+235)和衣壳(env)基因(nt+5828至+5977)的病毒DNA片段，结果显示，分别对应于5'-UTR和env基因的139bp扩增子和150bp扩增子在第5天的强度与第3天相比，存在实质性下降(图5D)。这些观察结果证实，当通过Cas9/gRNA A(在5'LTR处)和Cas9/gRNA B(在3'-LTR处)裂解时出现的该HIV-1基因组的横跨5'LTR与3'LTR之间的较大DNA片段的切除，在使用Cas9和gRNA A及gRNA B处理该细胞时也可能出现，先前已经报导了这一事件(Hu,W.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111,11461-11466(2014)；Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))。对例示性说明病毒基因激活的标志物——报告GFP表达的流式细胞分析结果的定量分析显示，在第3天出现对GFP阳性细胞的实质性抑制(64％)，而在第5天和第8天甚至更高，分别达到84％和88％。通过荧光显微镜检查来监控携带编码gRNA的基因和标记物BFP的慢病毒的存在和该细胞中GFP的表达，并通过相显微镜检查测试细胞培养物的质量(图10A)。定量分析显示，细胞的总数保持不变，表明与先前的观察结果类似(Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))，没有毒性与这一切除策略相关联。根据PCR凝胶分析的结果(显示于图5D)，qPCR和qRT-PCR的结果显示，对应于Gag基因的病毒DNA拷贝数显著下降，即，在感染后第3天下降55％，在第5天下降84％；而RNA水平在第3天下降91％，在第5天下降96％(图5F和图5G)。还在人类小神经胶质细胞和星形胶质细胞的初代培养物中实施了一组类似的研究。这些研究的结果显示，在以表达LTR-Cas9和gRNA的LV转导的HIV-1感染细胞中，病毒基因表达和病毒DNA呈递被显著阻抑(如图11A至11C所示)。总而言之，这些观察结果证实，采用包括Tat在内的病毒蛋白的新颖自身调节事件，以启动使用CRISPR/Cas9通过切除病毒基因组并永久性地阻抑病毒复制而进行的编辑策略，是可用的。

讨论

自1985年发现Tat以来(Arya,S.K.,et al.Science 229:69-73(1985)；Sodroski,J.,et al.Science 227,171-173(1985))，已经发现，由于HIV-1的Tat反式激活因子蛋白在病毒基因组以转录水平表达中扮演的就是及其对未感染的细胞的致病影响，该蛋白是关键的调节蛋白。在机制上，Tat与位于转录起始位点下游的RNA序列(核苷酸+1至+59)即所谓转录应答区域或TAR向关联。Tat与TAR的这一关联触发一系列分子事件和生化事件，导致在转录开始位点(核苷酸+1)附近形成起始前复合物和转录起始复合物。这一复合物包括一系列细胞蛋白，其具有将该复合物的包括pTEF和RNA蛋白酶II在内的组分磷酸化或乙酸化的能力，因此促进RNA的转录延伸(综述见Mbonye,U.,et al.Virology 454-455,328-339(2014)；Taube.R.,et al.Viruses 5,902-927(2013))。此外，Tat与包括NF-κB在内(Taylor,J.P.,Khalili,K.Adv.Neuroimmunol.4,291-303(1994))、p300/CBP和GCN5(ColmE.,et al.J.Biol.Chem.276,28179-28184(2001)；Kiernan,R.E.,et al.EMBO J.18,6106-6118(1999)；Ott,M.,et al.Curr.Biol.9,1489-1492(1999))的多种转录因子的相互作用，可能影响其它病毒基因和细胞基因的转录；所有这些全部有贡献于HIV-1阳性AIDS患者体内可见的疾病谱(Gibellini,D.,et al.New Microbiol.28,95-109(2005))。一旦再激活的病毒启动子被转录以导致病毒转录和Tat产生的最初循环，则蓄积池内的潜伏性病毒即被有效复制，Tat也在这一过程中扮演主要角色。Tat在HIV-1复制和AIDS发病机制中独一无二的重要性，提供了其作为药物发现以及疫苗研发的潜在靶点的强有力的理论基础。事实上，多种潜在的抑制剂已经显示了不同程度的影响HIV-1复制的效率，其中一些具备干扰Tat-TAR相互作用的能力，而其它则具备防止Tat与其细胞伙伴交流的能力(Tabarrini.O.,etal.Future Med Chem 8,421-442(2016))。本研究中使用的策略为，聚集Tat以刺激Cas9表达、促进对病毒基因组片段的切除、以及永久性地清除具有生产性或潜伏性HIV-1的细胞内的HIV-1基因转录和复制。此处涉及HIV-1的自杀途径，该途径通过Tat触发且包括使用CRISPR/Cas9技术编辑该病毒基因组(例示性说明于图6)。根据这一途径，Tat在该细胞内产生除了刺激具有全长度5'-LTR序列的其自身的启动子外，还通过横跨该富GC区域、TATA盒区域、和TAR(-80至+66)区域的截短的最小启动子序列以相同机制加强Cas9表达。Cas9的产生及其与设计为以位于该(-80至+66)外的LTR DNA序列为靶向的gRNA的关联，诱导该全长度病毒启动子内的InDel突变并通过切除该基因片段，可永久性地根除该细胞内的HIV-1。除了预料中的呈递该全长度LTR序列的417bp DNA碎片之外，LTR DNA的短范围扩增结果还显示了第二DNA碎片，该第二DNA碎片仅见于表达Tat的细胞中且大小为227bp。通过Cas9/gRNA A在5'-LTR或3'-LTR裂解之后，将残留的5'-LTR与剩余的3'-LTR接合在一起，生成该227b p DNA碎片。也可能是在通过Cas9/gRNA裂解之后，来自5'-LTR的剩余DNA碎片与来自3'-LTR的碎片之间的结扎创建了用于基因扩增的新模板并出现了类似大小(227bp)的扩增子，如先前所报导(Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))。

近年来，由于该CRISPR/Cas9基因编辑策略精确且高效编辑基因组的非凡能力及其实施的简便性和灵活性，该策略已经在生物医药研究中受到关注。但是，存在多个需要密切关注的领域。例如，重要的是设计最具特异性且最有效的gRNA以避免脱靶效应。本文中研发的策略，已经被用来最大化特异性并避免脱靶编辑，这一点已经为全基因组超深测序和多种其它测试所证实，如先前所述(Hu,W.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111,11461-11466(2014)；Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016))。使用单个RNA处理该细胞，可导致作为裂解位点处不准确NHEJ修复结果的突变HIV-1的发展，且可潜在地导致突变病毒的出现，而突变病毒则可能具备对于初始单个gRNA的抗性(Wang,G.,et al.Mol.Ther.24,522-526(2016a)；Wang,Z.,et al.Cell Rep.15,481-489(2016b))。采用通过将其引入多倍体双链而令HIV-1基因组基因组断裂的多倍体gRNA，造成病毒DNA的较大片段从宿主基因组中切除，减轻这一顾虑并永久性地消除具备复制能力的病毒的任何出现机会(Khalili,K.,et al.J.Neurovirol.21,310-321(2015)；Hu,W.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111,11461-11466(2014)；Kaminski,R.,et al.Sci.Rep.6:22555(2016)；Ebina,H.,etal.Sci.Rep.3,2510(2013)；Liao,H.K.,et al.Nature Comm.6,6413(2015))。第二课题涉及Cas9的受控表达，以避免可能非特异性地造成宿主基因组长期损伤及/或诱导免疫应答的该蛋白质的非必要的持续表达。本文中用于Cas的条件下表达的通过HIV-1Tat进行的策略，将会提供一种用于刺激静默基因编辑分子，以令其被表达以及在病毒再激活的早期阶段切除HIV-1 DNA的新颖途径。

Claims (45)

1.一种药物组合物，包含：编码成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的分离核酸序列，该核酸内切酶可操作地链接至最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含转录反式激活因子(Tat)应答元件HIVLTR；及/或

至少一种编码至少一种向导RNA的分离核酸，其中，该至少一种向导RNA与HIV中的靶点核酸序列互补。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子进一步包含核心区域。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含核酸序列，该核酸序列与从约位置-120至约位置+66的核酸序列的序列一致性为至少约75％。

4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-120至约位置+66的核酸。

5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-80至约位置+66的核酸。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其中，该HIV中的靶点核酸序列包含位于HIV的编码区域或非编码区域内的序列。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中，该非编码区域包含HIV的长末端重复序列或位于该HIV的长末端重复序列内的序列。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中，该位于该HIV的长末端重复序列内的序列包含位于U3区域、R区域或U5区域内的序列，该序列不包括该最小的HIV LTR启动子的任何序列。

9.如权利要求1至8任一项所述的药物组合物，其中，进一步包含与HIV的多个靶点核酸序列互补的多个向导RNA核酸序列。

10.如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中，该CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9。

11.如权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中，该CRISPR相关的核酸内切酶经优化用于在人类细胞中表达。

12.如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，进一步包含编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列，其中，该tracrRNA融合至编码向导RNA的序列。

13.如权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中于，该分离核酸序列可操作地链接至表达载体，该表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。

14.一种分离核酸序列，包含编码成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，该启动子包含该HIV LTR启动子的反式激活应答元件(TAR)。

15.如权利要求14所述的分离核酸序列，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子进一步包含核心区域。

16.如权利要求15所述的分离核酸序列，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含核酸序列，该核酸序列与从约位置-120至约位置+66的核酸序列的序列一致性为至少约75％。

17.如权利要求15所述的分离核酸序列，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-120至约位置+66的核酸。

18.如权利要求15所述的分离核酸序列，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-80至约位置+66的核酸。

19.如权利要求14至18中任一项所述的分离核酸序列，其中，该CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9。

20.如权利要求14至19中任一项所述的分离核酸序列，其中，该CRISPR相关的核酸内切酶经优化用于在人类细胞中表达。

21.如权利要求14至20中任一项所述的分离核酸序列，其中，该分离核酸序列可操作地链接至表达载体，其中该表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。

22.一种治疗患有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的受试者的方法，该方法包含：

向该受试者给药组合物，该组合物包含编码成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的分离核酸序列，该核酸内切酶可操作地链接至最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含该HIV LTR启动子的转录反式激活因子(Tat)应答元件；及/或

至少一种编码至少一种向导RNA的分离核酸，其中，该至少一种向导RNA与HIV基因组中的靶点核酸序列互补。

23.如权利要求22所述的方法，其中，该HIV是活动性感染或潜伏性感染。

24.如权利要求22所述的方法，其中，该药物组合物外用给药或非肠道给药。

25.如权利要求22所述的方法，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子进一步包含核心区域。

26.如权利要求22所述的方法，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含核酸序列，该核酸序列与从约位置-120至约位置+66的核酸序列的序列一致性为至少约75％。

27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-120至约位置+66的核酸。

28.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含核酸序列，该核酸序列与从约位置-80至约位置+66的核酸序列的序列一致性为至少约75％。

29.如权利要求22至28中任一项所述的方法，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-80至约位置+66的核酸。

30.如权利要求22至29中任一项所述的方法，其中，该CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9。

31.如权利要求22至30中任一项所述的方法，其中，该CRISPR相关的核酸内切酶经优化用于在人类细胞内表达。

32.如权利要求22至31中任一项所述的方法，其中，表达载体包含编码可操作地链接至该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子的CRISPR相关的核酸内切酶的分离核酸序列以及至少一个编码至少一个向导RNA的分离核酸，其中，该至少一个向导RNA与HIV基因组中的靶点核酸序列互补。

33.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中，第一表达载体包含编码可操作地链接至该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子的CRISPR相关的核酸内切酶的分离核酸序列，以及第二表达载体编码至少一个向导RNA的分离核酸，其中，该至少一个向导RNA与HIV基因组中的靶点核酸序列互补。

34.如权利要求33所述的方法，其中，该第一表达载体和第二表达载体在体外或体内在宿主细胞内共表达。

35.如权利要求32或33所述的方法，其中，该表达载体包含：慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。

36.如权利要求32或33所述的方法，其中，表达载体编码多个向导RNA及/或多种表达载体各自编码一个或多个向导RNA。

37.如权利要求22至37中任一项所述的方法，进一步包含给药Tat激活因子、抗病毒剂、或其组合中的一种或多种。

38.一种用于根除整合入被人类免疫缺陷病毒(HIV)潜伏性感染的体外或体内宿主细胞基因组中的HIV核酸序列的表达载体，其中，该表达载体包含至少一个编码成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的分离核酸序列，该核酸内切酶可操作地链接至最小的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，其中，该启动子包含该HIV LTR启动子的转录反式激活因子(Tat)应答元件；及/或，

至少一个向导RNA(gRNA)，该gRNA与用于根除被整合入潜伏性感染的宿主细胞的基因组中的HIV的前病毒DNA中的靶点序列互补。

39.如权利要求38所述的表达载体，其中，该gRNA核酸序列包括至少一个与前病毒DNA中的第一靶点序列互补的第一gRNA；以及与该前病毒DNA中的第二靶点序列互补的第二gRNA。

40.如权利要求38所述的表达载体，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含核酸序列，该核酸序列与从约位置-80至约位置+66的核酸序列的序列一致性为至少约75％。

41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中，该最小的人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子包含从约位置-80至约位置+66的核酸。

42.一种分离核酸序列，编码可操作地链接至最小的功能性病毒启动子的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶(CRISPR/Cas)，藉由该分离核酸序列，该最小的病毒启动子处于即刻早期转录激活因子的控制之下。

43.一种组合物，包含编码可操作地链接至最小的功能性病毒启动子的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶(CRISPR/Cas)的分离核酸序列，藉由该分离核酸序列，该最小的病毒启动子处于即刻早期转录激活因子的控制之下；及/或，

包含至少一个向导RNA的分离核酸，该向导RNA与该病毒中的靶点核酸序列互补。

44.如权利要求42所述的组合物，进一步包含编码该分离核酸序列的表达载体，该分离核酸序列包含可操作地链接至该最小的病毒启动子的CRISPR相关的核酸内切酶以及至少一个编码至少一个向导RNA的分离核酸，其中，该至少一个向导RNA与病毒基因组中的靶点核酸序列互补。

45.如权利要求42所述的组合物，其中，第一表达载体包含编码可操作地链接至该最小的病毒HIV长末端重复序列(LTR)启动子的CRISPR相关的核酸内切酶的分离核酸序列，且第二表达载体包含至少一个编码至少一个向导RNA的分离核酸，其中，该至少一个向导RNA与该病毒基因组中的靶点核酸序列互补。