CN107949424B

CN107949424B - Tat诱导的基于crispr/核酸内切酶的基因编辑

Info

Publication number: CN107949424B
Application number: CN201680029128.8A
Authority: CN
Inventors: K·哈利利
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2016-03-18
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2036-03-18
Also published as: SG11201707458VA; CA2980317A1; US20230193257A1; BR112017019966A2; MX2017011829A; WO2016154016A3; AU2016235472A1; KR20170137114A; ZA201706236B; US20180073019A1; SG10201908773UA; EA201792092A1; CN107949424A; EP3271021A4; IL254480A0; JP2018510219A; MA41382A; EP3271021A2; HK1254230A1; WO2016154016A2

Abstract

提供组合物和方法，用于通过至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域的截短的HIV LTR启动子进行的CRISPR相关核酸内切酶的Tat诱导型表达。该组合物可作为用于HIV的治疗和/预防的治疗性处理。

Description

TAT诱导的基于CRISPR/核酸内切酶的基因编辑

技术领域

本发明涉及特异性裂解逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)中靶标序列的组合物。这些可包括核酸的组合物可给药至患有HIV感染或处于HIV感染风险下的受试者，其中，该核酸编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶以及与人免疫缺陷病毒中靶标序列互补的向导RNA序列。

背景技术

自HIV-1发现以来，AIDS仍是世界范围内影响数百万人的主要公共健康问题。由于HIV-1永久性整合入宿主基因组中，AIDS尚不可治愈。目前，用于控制HIV-1感染和阻止AIDS发展的治疗(高活性的抗逆转录病毒治疗或HAART)极大地降低了细胞中支持HIV-1感染的病毒复制，并将血浆病毒血症降至最低水平。但HAART未能阻抑组织内低水平的病毒基因组表达和复制，且未能以被潜伏性感染的细胞如作为HIV-1积累池的休眠的记忆性T细胞、脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴样细胞为靶标。顽固性HIV-1感染也导致包括心脏和肾脏疾病、骨量减少、和神经障碍的并发症。对于以顽固性病毒储存库(reservoir)为靶标的有疗效的治疗策略存在持续需求。

HIV-1基因组的长度约为9.8kb，包括当整合入宿主基因组时位于两端的两个病毒长末端重复序列。该基因组也包括编码结构蛋白(Gag、Pol和Env)、调节蛋白(Tat和Rev)、以及辅助蛋白(Vpu、Vpr、Vif和Nef)的基因。HIV-1转录的反式激活因子(Tat)是一种多功能蛋白，已经发现其促成HIV-1感染的若干病理学后果。Tat不仅在病毒转录和复制中扮演重要角色，它也能诱导多种细胞基因的表达且能作为神经毒性蛋白而起作用。Tat蛋白由被HIV-1感染的细胞分泌，且通过扩散穿过细胞膜而起作用。它可作为隐藏的、可溶的神经毒素而起作用，且诱导被HIV-1感染的巨噬细胞和小胶质细胞释放神经毒性物质。Tat转录由HIV-1LTR启动子驱动，且为HIV的整体病毒复制所需。

HIV感染的临床进程可根据大量因素而变，该因素包括受试者的遗传背景、年龄、一般健康状况、营养情况、所接受的治疗、以及HIV亚型。通常，大多数个体在感染几周或几个月内发展出类似流感的症状。该症状可包括发热、头痛、肌痛、皮疹、发冷、咽喉痛、口腔或生殖器溃疡、淋巴结肿大、关节痛、盗汗、和腹泻。症状的强度可依据不同个体而从轻度到重度变化。在急性期过程中，HTV病毒颗粒被吸引至表达适宜的CD4受体分子的细胞并进入该细胞。一旦病毒进入宿主细胞，编码HIV的逆转录酶即生成HIV RNA的前病毒DNA副本，且该前病毒DNA副本变成被整合入该宿主细胞基因组DNA中。就是这一被该宿主细胞复制的HIV前病毒，导致了新的HIV病毒体的释放，该新的HIV病毒体可随后感染其它细胞。

初次HIV感染在数周至数月内平息，但典型地，其后为可能延续长达10年的长期临床“潜伏”阶段。这一潜伏期也指代为无症状的HIV感染或慢性HIV感染。受试者的CD4淋巴细胞数回升但未至感染前的水平，且大多数受试者在感染2至4周内进行血清转化，换言之，他们体内具有可检测水平的抗HIV抗体。这一潜伏期过程中，在周边血液单核细胞中可能不存在可检测的病毒复制，且在周边血液中可能存在少量或没有可培养的病毒。该潜伏期过程中，也指代为临床潜伏阶段，感染有HIV的人们可能不经历HIV有关症状，或仅经历轻度症状。但是，HIV病毒持续在非常低的水平上繁殖。在已经使用抗逆转录病毒治疗进行治疗的受试者体内，这一潜伏期可延续数十年甚至更久。然而，即使处于这一阶段的受试者正在接受抗逆转录病毒治疗，他们仍能将HIV传播至其他人，但抗逆转录病毒治疗降低了传播的风险。

CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)是含有短反复碱基序列的DNA基因座。每一反复后跟随从前病毒曝露至病毒的“间隔DNA”的短片段。CRISPR一般与Cas基因相关，该Cas基因编码与CRISPR相关的蛋白质。该CRISPR/Cas系统是原核生物免疫系统，其赋予对外来遗传成分如质粒和噬菌体的抗性，并提供一种获取免疫性的形式。CRISPR间隔以类似于真核生物有机体中RNAi的方式来识别并切割这些外源性遗传成分。

该CRISPR/Cas系统已经被用于多种有机体中的基因编辑(通过加入、中断或改变具体基因的序列)和基因调节。通过将该Cas9蛋白和适宜的向导RNA输送至细胞内，可在任何所希望的位置切割该有机体的基因组。使用CRISPR/Cas9系统的成功的治疗性基因编辑需要Cas9酶和向导RNA在靶标细胞中的有效且特异性的输送和表达。当组织或细胞集群中感受细胞的频率低时，如在某些被病毒感染的细胞的情境中，这尤其是一种挑战。

发明内容

本文提供一种在体内或体外将哺乳动物细胞内的人免疫缺陷病毒(HIV)灭活的方法。该方法包括将该哺乳动物细胞曝露于包括分离的核酸序列的组合物，分离的核酸序列编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。

具体实施例中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。该CRISPR相关核酸内切酶可被优化由于人细胞内表达。将该哺乳动物细胞曝露于该组合物可包括接触该细胞。该哺乳动物细胞可以是潜伏性感染的细胞，包括但不限于，CD4⁺T细胞、巨噬细胞、单核细胞、肠相关淋巴样细胞、小胶质细胞、和星形胶质细胞。该哺乳动物细胞可包括来自具有HIV感染的受试者的培养细胞、组织分离块、及/或细胞系。该HIV的灭活可在体内实施或间接体内实施。

具体实施例中，该分离的核酸可额外编码一种或多种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。该HIV中靶标核酸序列可指代位于HIV的编码区域及/或非编码区域及/或长末端重复序列内的序列。该非编码区域可包括HIV的长末端重复序列。该位于HIV的长末端重复序列内的序列可包括位于U3区、R区、或U5区内的序列，这些区域不包括该截短的HIV LTR启动子的任何序列。该组合物可包括编码核定位信号的序列。该组合物可额外包括编码反式激活小RNA(tracrRNA)的序列，且该tracrRNA可与一编码向导RNA的序列融合。该组合物亦可包括该HIV LTR启动子的增强子区域。

具体实施例中，该组合物可被可操作地链接至表达载体。该表达载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

本文提供一种分离的核酸序列，其包括编码CRISPR相关核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。

具体实施例中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。该CRISPR相关核酸内切酶可被优化用于人细胞内表达。

具体实施例中，该序列可额外编码一种或多种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。该HIV中靶标核酸序列可指代位于HIV的编码及/或非编码区域及/或长末端重复序列内的序列。该位于HIV的长末端重复序列内的序列可包括位于U3区、R区、或U5区内的序列，这些区域不包括该截短的HIV LTR启动子的任何序列。该分离的核酸序列亦可编码核定位信号及/或反式激活小RNA(tracrRNA)。该tracrRNA可与一编码向导RNA的序列融合。该分离的核酸序列亦可包括该HIV LTR启动子的增强子区域。

具体实施例中，该分离的核酸序列可被可操作地链接至表达载体。该表达载体可指代慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

本文提供一种包括编码CRISPR相关核酸内切酶的序列的药物组合物，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。该药物组合物也可包括药学可接受的载剂，包括但不限于，基于脂质的胶体或基于聚合物的胶体。该胶体可以是脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、或嵌段聚合物胶束。具体实施例中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。该CRISPR相关核酸内切酶可被优化用于人细胞内表达。

具体实施例中，该药物组合物可配制为用于外用及/或包含在避孕套中。

具体实施例中，该序列可额外编码一种或多种与HIV中靶标核酸序列互补的向导。该HIV中靶标核酸序列可指代位于HIV的编码及/或非编码区域内及/或长末端重复序列内的序列。该位于HIV的长末端重复序列内的序列可包括位于U3区、R区、或U5区内的序列，这些区域不包括该截短的HIV LTR启动子的任何序列。该序列可编码核定位信号。该药物组合物可额外包括编码tracrRNA的序列，且该tracrRNA可与编码向导RNA的序列融合。该序列亦可编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

具体实施例中，由该药物组合物提供的序列可被可操作地链接至表达载体。该表达载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

本文提供一种治疗具有HIV感染的受试者的方法。该方法方法包括向该受试者给药治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包括编码CRISPR相关核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。待治疗的HIV感染可以是潜伏性感染。该方法可进一步包括鉴别具有HIV感染的受试者。

具体实施例中，该序列可额外编码一种或多种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。一些例子中，该序列可编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

具体实施例中，可给药抗逆转录病毒剂。该抗逆转录病毒剂可包括，但不限于，非核苷酸逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、及进入抑制剂。该抗逆转录病毒剂可包括高活性的抗逆转录病毒治疗。该药物组合物可外用给药或肠胃外给药。

具体实施例中，该药物组合物可被可操作地链接至表达载体。该表达载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

本文中提供一种降低处于HIV感染风险下的受试者感染HIV的风险的方法。该方法可包括向该受试者给药治疗有效量的包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列的药物组合物，该酶可操作地链接至截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。具體实施例中，该受试者是性活跃者、医护人员及/或现场急救员。

具体实施例中，该CRISPR相关核酸内切酶可以是Cas9。该CRISPR相关核酸内切酶可以被优化用于人细胞内表达。一些例子中，该药物组合物可以被可操作地链接至表达载体。该表达载体可以是，而非限于，慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。具體实施例中，该序列也可编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

本文中提供一种降低HIV感染从感染HIV的妊娠期或哺乳期母亲向其子女传播的风险的方法。该方法包括向该受试者给药治疗有效量的包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列的药物组合物，该酶可操作地链接至截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。具體实施例中，该药物组合物在产前、围产期和产后的至少一个阶段给药。

具体实施例中，可给药抗逆转录病毒剂。该抗逆转录病毒及可以是，而非限于，非核苷酸逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、及进入抑制剂。该抗逆转录病毒剂可以是高活性的抗逆转录病毒治疗。具體实施例中，可将治疗有效量的该组合物给药至该子女。具體实施例中，该序列也可编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

本文中提供一种给药药物组合物以防止未感染的受试者感染HIV的方法。该方法可包括向该未感染的受试者给药治疗有效量的包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列的药物组合物，该酶可操作地链接至截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和HIV LTR启动子的TAR区域。

本文中提供一种包括测得量的组合物的试剂盒，该组合物包括分离的核酸序列，该分离的核酸序列包括编码CRISPR相关核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域；或编码该分离核酸的的载体；以及包装材料、包括使用说明书的包装插页、无菌流体、注射器、及无菌容器的至少一项。

如本发明中关于所揭露的物质组合物和方法所展望，一方面，本发明的具體实施例包含本文中揭露的组分及/或步骤。另一方面，本发明的具體实施例主要由本文中揭露的组分及/或步骤组成。再一方面，本发明的具體实施例由本文中揭露的组分及/或步骤组成。

附图说明

图1A是全长度HIV-1LTR(LTR(-454/+66))以及所创建的LTR截短变体LTR-120/+66、LTR-80/+66和LTR-38/+66的示意图。每一变体中含有的LTR元件从图中明显可见。

图1B是图1A的全长度HIV-1LTR和变体的PCR扩增的LTR序列的琼脂糖凝胶电泳图像。道次1：全长度HIV-1LTR(pLTR(-454/+66))。道次2：pLTR(-120/+66)。道次3：pLTR(-80/+66)。道次4：pLTR(-38/+66)。

图2是根据本发明的Cas9启动子置换过程的图解。使用pX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-Hl-短tracr-PGK-puro质粒(Addgene#42229)(标示为“CBh-Cas9”)作为Cas9基因源/模板。以图中所标注的酶进行限制酶消解而移除参考质粒中的原始CBh启动子，并替换为不同的HIV-1LTR启动子变体(共同标示为“LTR-Cas9”)。

图3A是在全长度HIV-1LTR(pLTR(-454/+66)-FLAG-Cas9)(10、50和250ng)的对照下，在使用不同量的表达FLAG标记的Cas9的质粒且使用或不使用Tat表达质粒(pCMV-Tat86,250ng)进行共转染的U87MG细胞中，Cas9、Tat和α-微管蛋白表达的蛋白质印迹(Western blot)图。道次1：pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng、pCMV 1000ng。道次2：pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng。道次3：pLTR(-454/+66)-Cas9 10ng、pCMV 1240ng。道次4：pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng、pCMV 750ng、pCMV-Tat86 250ng。道次5：pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng、pCMV 950ng、pCMV-Tat86 250ng。道次6：pLTR(-454/+66)-Cas9 10ng、pCMV990ng、pCMV-Tat86250ng。

图3B包含对应于Cas9且归一化至图3A蛋白质印迹图中α-微管蛋白表达的条带强度的图。上图显示Cas9水平归一化至有或无Tat的α-微管蛋白水平的蛋白质印迹图像定量。下图显示+Tat/无Tat比的蛋白质印迹图像定量。

图4A是在HIV-1截短的LTR变体pLTR(-120/+66)-FLAG-Cas9或HIV-1LTR变体pLTR(-80/+66)-FLAG-Cas9的对照下，在使用不同量的表达FLAG标记的Cas9的质粒(5ng或50ng)且使用或不使用Tat表达质粒(pCMV-Tat86,250ng)进行转染的U87MG细胞中，Cas9、Tat和α-微管蛋白表达的蛋白质印迹图。道次1：pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng。道次2：pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次3：pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng、pCMV 995ng、pCMV-Tat86 250ng。道次4：pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng、pCMV1200ng。道次5：pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次6：pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng、pCMV 950ng、pCMV-Tat86 250ng。道次7：pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng。道次8：pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次9：pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng、pCMV 995ng、pCMV-Tat86 250ng。道次10：pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng。道次1 1：pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次12：pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng、pCMV 950ng、pCMV-Tat86 250ng。

图4B包含对应于Cas9且归一化至图4A蛋白质印迹图中α-微管蛋白表达的条带强度的图。上图显示Cas9水平归一化至无Tat、有rTAT、或有经转染Tat的α-微管蛋白水平的蛋白质印迹图像定量。下图显示+Tat(经转染)/无Tat比的蛋白质印迹图像定量。

图5A至5E说明，在gRNA的存在下，通过HIV-1LTR启动子进行的Cas9表达受到Tat的刺激，导致病毒启动子的裂解。图5A：全长度HIV-1LTR、增强子区域和核心区域内的多种调节性基序、以及部分Gag基因的图式表述。描述了被创建用于Cas9表达的LTR缺失突变体的程度。显示了gRNA靶标序列的位置及其彼此间的距离。图5B：使用含有全长度LTR(-454/+66)或其突变体(-120/+66或-80/+66)的pX260-LTR-Cas9连同表达Tat的质粒(pCMV-Tat)一起对TZMbl细胞的共转染，增加了Tat生产的水平，如通过蛋白质印迹法所测(上图)。显示了看家α-微管蛋白的表达(中间图)和Tat的表达(下图)。图5C：使用表达Tat的腺病毒以两个不同的感染复数(MOI)感染TZMbl细胞，之后通过LTR_-80/+66启动子进行慢病毒介导的Cas9表达以及通过U6启动子进行gRNA A/B的表达，导致TZMbl细胞内所整合的HIV-1LTR启动子DNA序列的裂解以及205 bp DNA片段的出现(如通过PCR和DNA凝胶分析所测)。图5D：SDS-PAGE，例示性说明TZMbl细胞内表达的Cas9、β-微管蛋白和Tat蛋白的水平，如图5C图中所示。图5E：荧光素酶试验，例示性说明在多种治疗后，TZMbl细胞内所整合的HIV-1LTR的转录活性，如图5C中所示。

图6A至6C显示，在Cas9的诱导下，HIV-1感染刺激了所整合的病毒DNA的裂解。以表达gRNA A/B的慢病毒(LV-gRNA A/B)或对照物(空LV)转导LTR_-80/+66-Cas9报告TZMbl细胞系，使用三种不同MOI的HIV-1_JRFL或HIV-1_SF162感染该细胞系48小时后，收获细胞，通过蛋白质印迹法测定蛋白质表达(图6A)，通过PCR/DNA基因分型检测病毒感染后在Cas9诱导下所证实的HIV-1LTR裂解的水平(图6B)，且通过荧光素酶报告基因试验评估所整合的HIV-1启动子的转录活性(图6C)。

图7A至7C显示，在潜伏期，Tat对Cas9的刺激裂解了囊括HIV-1报告基因的T细胞内所整合的HIV-1DNA。以对照物(空LV)或LV-gRNA A/B转导含有LTR_-80/+66-Cas9基因的CD4⁺Jurkat T细胞2D10细胞，之后以pCMV或pCMV-Tat质粒转染。48小时后，通过蛋白质印迹法测定所描述的多种蛋白质的水平(图7A)。通过LTR特异性PCR测定用于评估所整合的HIV-1DNA状态的基因组DNA，并将切除效率测定为以百分比表示的截短的扩增子与全长度扩增子之比(图7B)。通过流式细胞术评估所整合的病毒启动子在裂解之后再次激活的水平，且显示了代表性散点图(图7C)。从该分析排除红色阳性的、碘化丙啶染色的、及死亡的细胞。

图8A至8C显示，以潜伏期逆转药物治疗细胞诱发了Jurkat 2D10细胞内的Cas9表达和所整合的病毒DNA的裂解。使用对照物(空)或表达gRNAs A/B的慢病毒治疗表达LTR_-80/+66-Cas9的2D10细胞，24小时后，使用PMA(P)、TSA(T)、或两者(P/T)治疗这些细胞16小时。通过蛋白质印迹法进行蛋白质研究，测定Cas9-Flag、α-微管蛋白和GFP(表示所整合的HIV-1基因组)的表达(图8A)。通过PCR评估用于检测通过Cas9和gRNA A/B进行的所整合LTR DNA的切除水平的基因组DNA，并如图7A至7C图例中所描述测定切除效率(图8B)。显示了通过流式细胞分析进行的GFP报告基因试验以及代表性散点图(图8C)。

图9是通过CRISPR/Cas9进行的HIV-1负反馈调节的图式表述。在再激活的早期，病毒基因组的基础转录允许Tat蛋白①的生产。当将TAT与病毒转录本②的移动序列(budgesequence)且吸收(recruitment)若干与TAR和位于RNA poly II很靠近转录起始位点处的其它转录因子的环圈联合的细胞型蛋白时，病毒RNA的转录一开始即被高度刺激，且更重要的是，该高度刺激一直延续③。在病毒激活时的基础产物也刺激最小病毒启动子Itr，驱动该Cas9基因③。当新合成的Cas9与多种HIV-1特异性gRNA联合时，前者裂解该病毒基因组，永久地灭活该LTR且终止HIV-1基因表达和复制。不存在Tat时，Itr-Cas9变为静默。Cas9的表达仅在Tat存在时可持续进行。

图10显示，参考HIV-1NL4-3基因组中，用于TZMbl基因组DNA(蓝色高亮)的PCR中的LTR(绿色高亮，PAM为红色)和LTR特异性引物内gRNA A/B靶标的位置和核苷酸序列。LTR特异性PCR产物(全长度和截短的)及预计被编辑的片段(SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10)的序列和大小。

图11显示代表性琼脂糖凝胶电泳结果，其分析在使用来自图7A至7C和8A至8C的Jurkat 2D10报告细胞系的实验中用于定量Cas9/gRNA介导的LTR切除效率的LTR特异性PCR反应。

图12显示，参考HIV-1NL4-3基因组中，用来分析通过PCR在Jurkat 2D10细胞内进行切除(蓝色高亮)的LTR gRNA A/B靶标(绿色高亮，PAM为红色)和LTR特异性引物的位置和核苷酸组成。显示了扩增子(全长度和截短的LTR DNA)和预计切除的DNA片段的核苷酸序列和大小(SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:21)。

定义

除非定义排除，本文中使用的全部科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解者相同的意义。尽管可使用与本文中揭示者相似或等效的任何方法和材料实践本发明，但优选的材料和方法揭示于本文中。将使用下述术语来描述和主张本发明。

还应理解，本文中使用的术语仅用于揭示特定具體实施例目的，而非予以限制。

本文中揭露的所有基因、基因名称、和基因产品旨在与来自可使用本文所揭露的组合物和方法的任何物种的同源染色体相对应。应理解，除非在上下文中明确表明，当来自特定物种的基因或基因产品被揭露时，这一揭露仅用于示例而不应视为限制。因此，举例而言，对于本文中揭露的基因或基因产品旨在涵盖来自其它物种的同源及/或直向同源基因和基因产品。

本文中的文字“一”用来指代一个或超过一个(即，至少一个)该文字的语法宾语。举例来说，“一元件”意为一个元件或超过一个元件。因此，举例而言，“一细胞”的表述包括相同类型的多个细胞。此外，就术语“包括”(including或includes)、“具有”(having或has)、“具备”(with)或其变体在详细说明书及/或权利要求书中的使用而言，这些术语应视为包容性的，其表述方式类似于术语“包含”。

本文中，关于项目、组合物、仪器、方法、过程、系统等的所定义或描述的元件，术语“包含”(comprising、comprise、或comprised)及其变体意为包容性的或开放性的，其准许额外元件的存在，从而表明所定义或描述的项目、组合物、仪器、方法、过程、系统等包括那些具体化的元件或，视情况而定，其等效物，且包括可被包括且仍落入所定义的项目、组合物、仪器、方法、过程、系统等的范畴/定义内的其它元件。

本文中，当指代可测量的值如量、时距等时，“约”意为涵盖所指定值+/-20％、+/-10％、+/-5％、+/-1％、或+/-0.1％的变更，而这些变更适合于实施所揭露的方法。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可意为处于值的5倍数量级内以及2倍数量级内。若在申请书和权利要求书中描述了特定的值，除非明确排除，否则应假定术语“约”意为处于该特定值的可接受的误差范围内。

本文中，“有效量”意为提供治疗性或预防性益处的量。

“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中适当固有的特异性序列，其作为模板而用于生物学过程中其它聚合物和大分子的合成，具有所定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列以及自其所得的生物学性质。因此，若对应于一基因的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物系统中生产蛋白质，则该基因编码该蛋白质。其核苷酸序列与该mRNA序列完全相同且一般提供于序列表中的编码链，以及用作基因或cDNA转录模板的非编码链，两者均可指代为编码该蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。

本文中，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录及/或转译。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含可操作地链接至待表达核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或体内外表达系统供给。表达载体包括该领域中已知的全部，如合并重组多核苷酸的粘粒、质粒(如，裸质粒或脂质体中含有的质粒)和病毒(如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、及腺病毒群)。

“分离的”意为自自然状态改变或移除。例如，自然存在于活体动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但与其自然状态的共存材料部分或完全分隔开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以实质上纯化的形式存在，或可存在于非原生环境如，举例而言，宿主细胞内。

“分离的核酸”是指核酸节段或片段，其已经与自然发生状态中位于其侧翼的序列分隔开来，即，已经从通常邻近该DNA片段的序列移除的DNA片段，该序列即该片段自然发生的基因组内邻近该片段的序列。该术语也应用于已经从自然伴随该核酸的其它组分实质上纯化的核酸，该其它组分即细胞中自然伴随该核酸的RNA或DNA或蛋白质。该术语因此包括，例如，重组DNA，其被并入载体内、被并入自主复制的质粒或病毒内、或被并入原核生物或真核生物的基因组DNA内，或其作为不依赖于其它序列的独立分子(即，作为通过PCR或限制酶消解生产的cDNA或基因组或cDNA片段)而存在。它还包括：作为编码额外核苷酸序列的杂交基因的一部分的重组DNA、互补DNA(cDNA)、天然及/或修饰单体或链接的线性或环状寡聚物或聚合物，该单体或链接包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其经取代的形式和α-端基异构形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯等。

当用于多核苷酸序列的上下文中时，术语“变体”可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这定义亦可包括，例如，“等位基因”变体、“剪接”变体、“物种”变体、或“多态性”变体。剪接变体可具有与参考分子的显着一致性，但由于在mRNA加工过程中的外显子的交替剪接，剪接变体通常会具有更多或更少数量的多核苷酸。相应的多肽可拥有额外的功能性域或缺少某些域。物种变体是从一个物种变为另一物种的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产品的变体。变体可导致该核酸序列中的至少一个突变，且可造成被改变的mRNA或造成其结构或功能可能被改变或未被改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可不具有等位基因形式、一种等位基因形式或多种等位基因形式。引发变体的常见突变性改变通常被归因于核苷酸的天然缺失、加入或替换。在给测序列中，这些类型的改变的每一种可一次或多次地单独出现或与其它改变组合出现。

本文中，术语“核酸序列”与“多核苷酸”通篇可互换使用，且包括互补DNA(cDNA)、天然及/或修饰单体或链接的线性或环状寡聚物或聚合物，该单体或链接包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其经取代的或α-端基异构形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯等。多核苷酸包括，但不限于，通过该领域中可用的任何手段获得的所有核酸序列，该手段包括而不限于，重组手段，即，使用常规克隆技术和PCR^TM等从重组库(library)或细胞基因组克隆核酸序列，以及合成手段。

核酸序列可以是“嵌合的”，换言之，由不同的区域构成。在本发明的上下文中，“嵌合的”化合物可以是寡核苷酸，其含有两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每一化学区域由至少一种单体单元即核苷酸所组成。这些序列典型包含至少一个区域，其中，为了展现一种或多种所希望的性质，该序列被修饰。

术语“靶标核酸”是指核酸(通常源自生物样品)，其是寡核苷酸被设计以特异性杂家的目标。靶标核酸的存在与否待检测，或该靶标核酸的量待定。靶标核酸的序列与被导向该靶标的相应寡核苷酸的核酸序列互补。术语“靶标核酸”可指代该寡核苷酸被导向的较大核酸的特异性子序列，或指代整体序列(如，基因或mRNA)。用法的不同从上下文中明显可见。

本发明的上下文中，使用下述用于常见核酸碱基的缩写，“A”指腺苷，“C”指胞苷，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，而“U”指尿苷。

除非具体排除，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此退化版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”也可包括内含子，其包含程度为该编码该蛋白质的核苷酸序列可以是含有内含子的一些版本。

本文中，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。就能够感染非分化细胞而言，慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的；它们能将大量的遗传信息输送至宿主细胞的DNA内，因此它们是基因输送载体的最有效方法之一。HIV、SIV、和FIV是慢病毒的全部实例。源自慢病毒的载体提供了实现高水平的体内基因转移的手段。免疫原性组合物的“肠胃外”给药包括，如，皮下(s.c)注射、静脉(i.v.)注射、肌肉(i.m.)注射、或胸骨内注射，或输液技术。

本文中，输液“患者”或“个体”或“受试者”可互换使用，且指代待治疗的哺乳动物受试者，优选人类患者。一些例子中，本发明的方法在实验动物、兽医应用、及动物疾病模型的发展中找到了用途，包括但不限于，包括小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物以及灵长类动物。

术语“多核苷酸”是核苷酸的链，亦称“核酸”。本文中，多核苷酸包括但不限于，通过该领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，且包括天然核酸和合成核酸两类。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，且指代由通过肽键共价键结的氨基酸残基所构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，且蛋白质或肽序列中可包含的最大氨基酸数并无限制。多肽包括由通过肽键彼此结合的两个或更多个氨基酸所组成的任何肽或蛋白质。本文中，该术语指代该领域中一般指代为肽、寡肽和寡聚物的短链以及该领域中通常指代为蛋白质的长链，该短链和长链均存在多种类型。“多肽”包括，例如，生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽、或其组合。

术语“启动子”意为一种DNA序列，其被细胞合成器械(machinery)或引入的合成器械识别且为启动多核苷酸序列的特异性转录所需。“最小”启动子或“截短的”启动子或启动子的“功能性片段”包括启动子用于转录激活的所有必需元件，例如，可操作地链接的或受控于最小启动子的核酸序列。具體实施例中，截短的HIV长末端重复序列(LTR)启动子至少包含HIV LTR启动子的核心区域、反式激活响应元件(TAR)或其组合。

术语“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”意为将外源性核酸转移至或引入宿主细胞内的过程。“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”细胞是已经使用外源性核酸转染、转化或转化的细胞。经转染/转化/转化的细胞包括初代受试者细胞及其后代。

作为本文中使用的术语，“治疗”疾病意为降低该受试者所经历的疾病或病变的至少一种症状的频率或严重性。

“载体”是物质的组合物，其包含分离的核酸且可用来将该分离的核酸输送至细胞内部。载体的实例包括但不限于，线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物联合的多核苷酸、质粒、和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也视为包括促进将核酸转移至细胞内的非质粒化合物和非病毒化合物如，举例而言，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括，但不限于，腺病毒载体、腺病毒群载体、逆转录病毒载体等。

范围：贯穿本公开，本发明的多个方面可以范围格式呈现。应理解，范围格式的说明仅仅为了表述的方便和简洁，而不应视为本发明该范畴的刚性限制。据此，对范围的说明应视为具有具体揭露的所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，对范围如从1至6的说明应视为具有具体揭露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的个体数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。这一规则可无视该范围的广度而使用。

若通过Swiss Prot.或GENBANK登录号指代氨基酸序列，则该序列通过引用而并入本文。与该登录号相关联的信息，如信号肽、胞外域、跨膜域、启动子序列和转译开始的鉴定，也通过引用而以其整体并入本文。

术语“序列一致性百分比”指代任何给定的查询序列与目标序列之间的一致性的程度。

术语“外源性”表明，该核酸或多肽是重组核酸构造的一部分或由该重组核酸编码，或并非出于其自然环境中。例如，外源性核酸可以是来自被引入一种物种的另一物种的序列，即异源性核酸。典型地，这一外源性核酸经由重组核酸构造而被引入其它物种内。外源性核酸可以是一有机体原生的且已经被再次引入该有机体细胞内的序列。包括原生序列的外源性核酸通常可通过链接至该外源性核酸的非天然序列的存在而与天然出现的序列区分开来，该非天然序列例如重组核酸构造中位于原生序列侧翼的非原生调节性序列。此外，稳定转化的外源性核酸典型被整合在除发现原生序列处之外的位置。

术语“药学可接受的”(或“药理学可接受的”)是指，当酌情给药至动物或人时，不产生副作用、过敏反应或其它不良反应的分子整体和组合物。本文中使用的术语“药学可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散截止、涂层、抗菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等，它们可用作药学可接受的物质的介质。

本文中，术语“试剂盒”是指用于输送材料的任何输送系统。术语“试剂盒”所包括的是用于研究和临床应用的两类试剂盒。在反应试验情况下，这些输送系统包括允许反应试剂(如，置于适宜容器内的寡核苷酸、酶等)及/或支持材料(如，缓冲剂、用于实施该试验的书面说明书等)存储以及从一个地点向另一个地点运输或输送的系统。例如，试剂盒包括一个或多个含有相关反应试剂及/或支持材料的密封件(如，盒子)。本文中，术语“分散式试剂盒”是指包含两个或多个独立容器的输送系统，每一容器含有总试剂盒组分的小部分。该容器可被一起或单独输送至预定接收者。例如，第一容器可含有试验中使用的酶，而第二容器含有寡核苷酸或脂质体。术语“分散式试剂盒”倾向于涵盖含有分析质特异性试剂(ASR)但并不限于此的试剂盒，该试剂是联邦食品、药品及化妆品法案第520(e)条下规定的试剂。事实上，任何包含两个或更多个独立容器且每一容器含有总试剂盒组分的一部分的输送系统均包括在术语“分散式试剂盒”中。相反，“组合式试剂盒”是指在一个容器内含有反应试验所有组分(如，一个盒子内容纳每一所希望的组分)的输送系统。术语“试剂盒”包括分散式试剂盒和组合式试剂盒两种。

具体实施方式

以HIV-1感染后不久，该病毒基因组变为被整合入宿主染色体并迅速在CD4⁺T细胞内表达。HIV-1复制导致CD4⁺T细胞的剧烈损耗。通常，在感染的急性期后，该病毒进入被称为潜伏期的新阶段，在该阶段，被整合的前病毒DNA基序被表达，且病毒复制在非常低的水平进行。在这些情况下，由病毒持续复制所造成的被唤醒的免疫系统向AIDS发展，且发展出宽范围的机会性感染，而该感染若不经治疗，则最终导致在三年内死亡。在分子水平上，急慢性状态的病毒基因组的表达及其复制处于病毒启动子的控制下，而该病毒启动子跨越5'长末端区域(LTR)的450个核苷酸。一系列识别5'-LTR的U3区域内的DNA序列的细胞转录因子与HIV-1即刻早期转录活化因子Tat之间出现协同性，该Tat与位于该病毒转录本的前导区内的TAR RNA序列相互作用。这些相互作用为来自所整合的病毒DNA副本的强健启动和有效延伸所需。尽管目前抗逆转录病毒药物已经有效地阻抑了病毒感染循环，它们仍必须含有在转录水平上抑制病毒基因表达的任何组分，支持所整合的病毒副本可继续在进行活性抗逆转录病毒治疗(ART)的HIV-1阳性患者体内表达病毒基因组的概念，虽然表达的水平非常低。事实上，病毒基因的表达在ART中断时即剧烈提升，且允许病毒早期调节性蛋白如Tat的生产以统筹该病毒基因组的生产性复制。

据此，本发明的具體实施例指向用于在再激活的早期有条件地激活CRISPR/Cas的组合物。这些组合物在生产性病毒复制之前，通过移除该病毒基因的跨越该病毒启动子及/或病毒编码序列的片段而完全且永久地废除病毒复制。具体实施例中，组合物包含编码成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶(CRISPR Cas)的核酸序列，该酶可操作地链接至截短的功能性病毒启动子，借此，该截短的病毒启动子处于即刻早期转录活化因子的控制下，从而在病毒复制的早期有条件地激活CRISPR/Cas。该分离的核酸进一步包含至少一种与病毒内的靶标核酸序列互补的向导RNA。CRISPR/Cas切除病毒基因组的一段，例如，跨越病毒启动子及/或病毒编码序列的一段。这些具體实施例中，调整该组合物以适于切除任何病毒。某些具體实施例中，该病毒是逆转录病毒。

可以使用RNA引导的成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶如Cas9，将整合入被感染的宿主细胞基因组的病毒基因组如HIV从这些HIV感染的细胞中消除。使用CRISPR/Cas9酶和向导RNA的成功的治疗性基因编辑需要在靶标细胞内有效且特异性的输送和表达Cas9酶和向导RNA。当组织或细胞集群中感受细胞的频率较低时，如在进行高活性的抗逆转录病毒(HAART)治疗的患者体内的HIV感染细胞内，这难以进行。

根据本发明，将CRISPR相关核酸内切酶如Cas9置于截短的、响应Tat的HIV LTR启动子的控制下。因此在含有该Tat蛋白的细胞内激活该核酸内切酶的表达。如本文中所表明，当将该核酸内切酶的表达置于该截短的、响应Tat的HIV LTR启动子的控制下时，外源性提供的(如，通过转染)和内源性生产的(如，通过潜伏病毒的再激活)Tat可激活CRISPR相关核酸内切酶(如，Cas9)在细胞系内的表达。在具體实施例部分中进一步详细呈现的研究中，该组合物考虑到了在病毒再激活的早期通过HIV-1转录活化因子Tat有条件地激活CRISPR/Cas9。通过移除整体病毒基因组或该病毒基因的跨越病毒启动子及/或病毒编码序列的一段，这一策略在生产性病毒复制之前完全且永久地废除了病毒复制。

图1A显示了HIV LTR的示意图。其长度大约为640bp。HIV-1LTR分为U3区、R区、和U5区。通过一系列跨越该病毒基因组5'端的长末端区域的顺式作用调节性基序来控制HIV-1基因组的转录。将转录起始位点设为+1，则该病毒启动子的U3区占据了-1至-454核苷酸且具有三个子区域：调节性区域、增强子区域和核心区域。该增强子含有NF-κΒ结合位点(-127至-80)。该核心域包含该富GC区和TATA盒(-80至+1)。该LTR的R区(+1至+98)包含TAR，TAR是所表达的RNA形成茎环结构所用的且提供用于病毒反式激活因子的结合位点的区域(Krebs et al.,Lentiviral LTR-directed expression,sequence variation,diseasepathogenesis.Los Alamos National Laboratory HIVsequence:Compendium,pp.29-70.2002)。

LTR含有基因表达所需的所有信号，且牵涉入前病毒至宿主细胞基因组内的整合中。例如，发现核心启动子、增强子、和调节性区域处于U3内，而发现TAR处于R内，如图1A中所示。TAR，作为Tat蛋白或细胞蛋白的结合位点，大概由HIV-1的病毒mRNA的前45个核苷酸组成且形成发夹茎环结构。在HIV-1中，U5区包括若干子区域，例如，包括牵涉如二聚体化和基因组封装的Poly A、PBS或引物结合位点、Psi或封装信号、以及DIS或二聚体起始位点。

根据本发明，提供包含分离的核酸的组合物，该分离的核酸编码CRISPR相关核酸内切酶，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR(反式激活响应元件)区域。截短的HIV LTR启动子是指操作性功能性启动子，其含有的内容少于全长度HIV LTR启动子。该截短的启动子优选含有核心区域和TAR区域而实质上不含或完全不含调节性区域及/或增强子区域。另一具體实施例中，该截短的HIV LTR启动子含有核心区域、TAR区域、以及全部或实质上全部的增强子区域，但不含有调节性区域的任何部分。该截短的HIV LTR启动子可响应Tat蛋白。换言之，Tat可激活可操作地链接至截短的HIV LTR启动子的CRISPR相关核酸内切酶如Cas9的表达。所揭露的组合物可用来灭活哺乳动物细胞内的HIV、治疗具有HIV感染的受试者、降低处于HIV感染风险下的受试者感染HIV的风险、及/或降低HIV从感染HIV的母亲向其子女传播的风险。本文中揭露的治疗性方法可与其它抗逆转录病毒治疗如HAART合用。该组合物可被包括而作为用于诊断、研究、及/或治疗性应用的试剂盒的一部分。

抗逆转录病毒治疗既不阻抑低水平的病毒基因组表达，如早前所述，也未有效地以潜伏性感染的细胞如休眠记忆T细胞、单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、和肠相关淋巴样细胞为靶标。然而，本文揭露的方法和组合物一般可用于治疗任何感染阶段的感染HIV的受试者，或用于处于HIV感染风险下的未感染的受试者。特别地，所揭露的方法和组合物可用于处于感染潜伏期的感染HIV的受试者。此外，当将向导RNA与可操作地链接至截短的、响应Tat的HIV LTR启动子的CRISPR相关核酸内切酶相关联时，如本文所揭露，可从宿主细胞切除和消除该HIV基因组。

使用该组合物可实现若干优势，其中，该组合物含有编码CRISPR相关核酸内切酶的序列，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的启动子含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。该持续表达所造成的潜在的毒性效应风险，可通过将CRISPR相关核酸内切酶的表达限制在具有HIV基因表达及/或复制的细胞内而得以缓解及/或消除。例如，根据本发明，因为该核酸内切酶的低及/或间歇性表达，可以缓和缘于CRISPR相关核酸内切酶的免疫原性的诱导毒性的潜力，同时消除或造成被感染个体体内HIV基因组的自我毁灭。此外，因为CRISPR相关核酸内切酶的持续表达被最小化，本发明可提供用于处于风险下的个体的预防性策略。因此，由截短的、响应Tat的HIV LTR启动子所驱动的CRISPR相关核酸内切酶可用来提供对HIV感染者的安全治疗，以及用来对可能处于风险下的未感染个体注射疫苗。

一些具體实施例中，该启动子包含一个或多个突变、缺失、插入、变体、衍生物或其组合。该启动子亦可为嵌合的，包含一个化合物或嵌合化合物。

如本文所述，因为较小尺寸的核酸可以更容易地封装在适用于基因治疗的输送机制(如，逆转录病毒)内，将CRISPR相关核酸内切酶置于截短的HIV LTR启动子的控制下也具备优势。例如，由于包括该调节性区域的启动子构造的尺寸及/或对CRISPR相关核酸内切酶转录的可变效果，该启动子构造可能较不适用于基因治疗。再者，仅包括HIV LTR启动子的核心区域的TATA盒加上全TAR区域的组合物不能充分地表达Cas9(数据未显示)。包括该HIV-1LTR启动子的整个核心区域、TAR区域、以及任选的增强子(见图1A)的组合物能以剂量依赖方式驱动Tat诱导的Cas9表达。

该截短的HIV-1LTR启动子可包含核酸，而该核酸包括HIV-1LTR启动子的位置-80至+66的核苷酸。具體实施例中，该截短的HIV-1LTR启动子可包含核酸，而该核酸包括该HIV-1LTR启动子的位置-120至+66。优选地，该截短的HIV-1LTR启动子并不含有来自该调节性区域的序列。

如本文中揭露，通过使用pNL4-3HIV载体(NIH AIDS反应物程序#114)作为模板和下表中所示引物的PCR获得全长度的和截短的HIV-1LTR启动子序列：

序列栏中加粗的核苷酸对应于各自引物名栏中加粗的限制酶。每一引物用来生成如图1A中所示的不同尺寸的HIV-1LTR启动子序列段。例如，LTR-454/+66包括整个U3区和该R区的一部分。相比之下，LTR-80/+66对应于U3的核心区域和R的TAR区域。最为对Tat的响应，LTR-38/+66核苷酸序列能充分驱动可检测水平的Cas9表达(数据未显示)。

本发明的截短的HIV-1LTR启动子对应于含有U3的核心区域以及TAR的节段。该核心区域包括TATA盒和富GC区域，它可以是SP1的靶标。一些构型中，该截短的HIV-1LTR启动子可包括如图1A所示的位于位置-120至-80的增强子。

截短的HIV-1LTR启动子可用来驱动CRISPR相关核酸内切酶如Cas9的表达。这些核酸内切酶揭示在2014年8月29日提交且在2015年3月5日公开的PCT国际申请PCT/US 2014/053441(WO 2015/031775)中，该申请的整体公开内容通过引用而并入本文。如上所述，HIV基因组整合入被HIV感染的个体的宿主基因组中。随后，这一整合的序列被宿主复制。设置在潜伏期内，Tat即可由细胞生产。本发明的组合物消除及/或降低了宿主体内前病毒多核苷酸的存在。因为CRISPR相关核酸内切酶由根据本发明的响应Tat(Tat-responsive)的启动子驱动，在Tat存在(如，由被感染的细胞生产)的任何时间内，该核酸内切酶被生产出来并降解初生的多核苷酸。当病毒不活动时，没有核酸内切酶产生。因此，核酸内切酶的连续表达可能施加于该细胞及/或宿主的潜在毒性效应得以避免。

此外，所生产的核酸内切酶的量与存在的Tat的量成正比，如下文中关于图3和图4所述。

某些具體实施例中，分离的核酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:21的任一者的序列相似性为至少50％。

某些具體实施例中，分离的核酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:21的任一者的序列相似性为至少70％。某些具體实施例中，分离的核酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:21的任一者的序列相似性为至少75％。

某些具體实施例中，分离的核酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17的任一者的序列相似性为至少85％，至与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:21的任一者的序列相似性为约95％、96％、97％、98％、或99％。

某些具體实施例中，分离的核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:21的任一者或其组合。

本文中揭露的组合物可包括编码CRISPR相关核酸内切酶如Cas9的核酸。一些具體实施例中，一种或多种与HIV靶标序列互补的向导RNA也可以被编码。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码RNA引导的对抗可动遗传因子(病毒、转位因子和接合质粒)的适应性免疫系统。已经鉴别了三种类型(I至III)的CRISPR系统。CRISPR簇含有间隔序列，与前驱可动因子互补的序列。CRISPR簇被转录和发展为成熟的CRISPR RNA(crRNA)。CRISPR相关核酸内切酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统，且具有强烈的切割靶标DNA的核酸内切酶活性。Cas9由成熟的crRNA引导，该成熟的crRNA含有约20个碱基对(bp)的独特靶标序列(称为间隔序列)和用作前crRNA的核糖核酸酶III辅助加工导引的反式激活的小RNA(tracrRNA)。该crRNA:tracrRNA双链引导Cas9经由crRNA上该间隔序列与靶标DNA上该互补序列(称为前间隔序列)之间的互补性碱基配对而以该DNA为靶标。Cas9识别三核苷酸(NGG)前间隔序列邻近基序(PAM)以指定切割位点(自PAM起的第3个核苷酸)。该crRNA和tracrRNA可独立被表达，或经由合成性茎环(AGAAAU)而被加工为人工融合小向导RNA(sgRNA)以模拟天然crRNA/tracrRNA双链。这种sgRNA如shRNA可经合成、或体外转录以引导RNA转染或从U6或H1促进的RNA表达载体表达，然而仍sgRNA的裂解效率低于独立表达crRNA和tracrRNA的系统的裂解效率。

CRISPR相关核酸内切酶可以是Cas9核酸酶。Cas9核酸酶可具有与野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)序列完全一致的核苷酸序列。CRISPR相关核酸内切酶可以是来自其它物种例如其它链球菌种如嗜热菌的序列。Cas9核酸酶序列可以源自其它物种，该其它物种包括但不限于：达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、淡红链霉菌(Streptomyces roseum)、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)、微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderialesbacterium)、萘降解单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌属(Polaromonassp.)、海洋固氮蓝藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热角军纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus desulforudis)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficle)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、异着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、海洋亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacterracemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大螺旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶螺旋藻(Arthrospira platensis)、节螺藻属(Arthrospirasp.)、林氏藻属(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、或深海单细胞蓝细菌(Acaryochloris marina)。绿脓假单胞菌(Psuedomonaaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、或其它测序的细菌基因组和古生菌、或其它原核微生物也可以是本文中揭露的具體实施例中使用的Cas9序列的来源。

野生型酿脓链球菌Cas9序列可经修饰。该核酸序列可以是经优化用于在哺乳动物细胞内有效表达即“人源化”的密码子。该序列可以是，例如，由Genbank登录号KM099231.1GI:669193757、KM099232.1GL669193761、或KM099233.1GI:669193765中所列的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。或者，该Cas9核酸酶序列可以是，例如，可商购的载体如来自Addgene(Cambridge,MA)的PX330或PX260内含有的序列。一些具體实施例中，Cas9核酸内切酶可具有氨基酸序列，该氨基酸序列是Genbank登录号KM099231.1GI:669193757、KM099232.1GI:669193761、或KM099233.1GI:669193765的任何Cas9核酸内切酶序列或PX330或PX260的Cas9氨基酸序列(Addgene,Cambridge,MA)的变体或片段。可修饰Cas9核苷酸序列以编码Cas9的生物学活性变体，且这些变体可具有或可包括，例如，凭借含有一个或多个突变(如，加入、缺失、或取代突变，或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的序列。一个或多个取代突变可以是取代(如，保守氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物学活性变体可具有一氨基酸序列，该序列与野生型Cas9多肽的序列一致性为至少或约50％(如，序列一致性为至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％)。保守氨基酸取代典型包括下述组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰氨、谷氨酰氨、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非自然出现的氨基酸残基。自然出现的氨基酸残基包括那些有遗传密码自然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(如，具有替代L-构型的D-构型的氨基酸)。本发明的肽也可包括作为标准残基的修饰版本的氨基酸残基(如，吡咯赖氨酸可用来替代赖氨酸，而硒半胱氨酸可用来替代半胱氨酸)。非自然出现的氨基酸残基是那些自然界未发现但遵循氨基酸基本分子式且可并入肽中的氨基酸残基。这些非自然出现的氨基酸包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。至于其它实例，可查阅手册或网站(目前由加州理工学院维护的网站，其显示已经被成功并入功能性蛋白质的非自然氨基酸的结构)。

本发明的组合物和方法可包括编码与HIV中靶标序列互补的向导RNA的序列。HIV的遗传变异性体现在已经揭示的多个组和亚型中。许多HIV序列收集在Los Alamos HIV数据库和纲要中(即，序列数据库网址为hitp://www.hiv.lani.gov)。本发明的方法和组合物可用于来自哪些各种组别、亚型和循环重组形式的任何HIV。这些HIV包括，例如，HIV-1主要组别(一般指代为M组)的HIV和次要组别的N组、0组和P组HIV，以及，但不限于，下述任何亚型：A、B、C、D、F、G、H、J和K组(例如，但不限于，N组、0组和P组中任何组)的HIV。

该向导RNA可以是与编码序列或非编码序列(即，靶标序列)互补的序列。例如，该向导RNA可以是与HIV长末端重复序列(LTR)区域互补的序列，其中该HIV长末端重复序列(LTR)区域不同于使用在通知(inform)该可操作地链接至Cas9基因的截短的、响应Tat启动子的部分。因为将会造成其自身构造的降解，该向导RNA不能以对应于本文中揭露的截短的、响应Tat的HIV-1LTR启动子的序列为靶标，从而潜在地移除了通过由截短的HIV LTR启动子驱动CRISPR相关核酸内切酶所获得的优势。因此，向导RNA可包括在HIV-1U3、R、及/或U5区域参考序列或共有序列中发现的序列，而不选择作为该截短的、响应Tat的HIV启动子的一部分的序列。

一些具體实施例中，该向导RNA可以是与编码序列如编码一种或多种病毒结构蛋白(如，gag、pol、env、和tat)的序列互补的序列。因此，该序列可与gag多蛋白如MA(基质蛋白，p17)、CA(衣壳蛋白，p24)、NC(核壳蛋白，p7)、和P6蛋白；pol如逆转录酶(RT)和RNase H、整合酶(IN)、及HIV蛋白酶(PR)；env如g 160、或gp160的裂解产物如gp120或SU、以及gp41或TM；或tat如72个氨基酸一个外显子的Tat或86至101个氨基酸两个外显子的Tat内的序列互补。一些具體实施例中，该向导RNA可以是与编码辅助蛋白的序列互补的序列，该辅助蛋白包括，例如，vif、n willef(负因子)、vpu(病毒蛋白U)和tev。

一些具體实施例中，该向导RNA序列可以是与结构性或调节性元件(即，靶标序列)如RRE、PE、SLIP、CRS(顺式作用阻抑性序列)、及/或INS互补的序列。RRE(Rev响应元件)是在HIV的env区域内被编码的RNA元件，且包括大约200个核苷酸(HIV-1中从转录起始计的位置7710至8061，跨越gp120与gp41的边界)。PE(Psi元件)对应于处在该Gag起始密码子之前且与该密码子重叠的一组4个茎环结构。SLIP是其后跟随有茎环结构的TTTTTT“湿滑位点”(slippery site)。CRS(顺式作用阻抑性序列)。例如，INS(抑制性/不稳定性RNA序列)可见于HIV-1的gag区域中的核苷酸414至631。

该向导RNA序列可以是正义序列或反义序列。该向导RNA序列通常包括PAM。该PAM的序列可依据所使用的CRISPR核酸内切酶的特异性需求而变。在源自酿脓链球菌的CRISPR-Cas系统中，靶标DNA典型位于紧邻5'-NGG前间隔相邻基序(PAM)之前的位置。因此，对于酿脓链球菌Cas9，该PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其它Cas9直系同源物可具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌的Cas9需要5'-NNAGAA用于CRISPR 1且需要5'-NGGNG用于CRISPR3；以及，来自脑膜炎奈瑟氏菌(Neiseria menigiditis)的Cas9需要5'-NNNNGATT。该向导RNA的特异性序列可变，但无论该序列如何改变，可用的向导RNA序列将是那些最小化脱靶效应同时高效且完全废除基因组地整合的HIV前病毒的序列。该向导RNA序列的长度可从约20至约60或更多个核苷酸变化，例如，约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。可用的选择方法鉴定了具有极低的外来病毒基因组与包括内源性逆转录病毒DNA的宿主细胞基因组之间的同源性的区域，该方法包括使用12-bp+NGG靶标选择准则进行生物信息学筛选，以排除脱靶人转录组或(甚至罕见地)未转译的基因组位点；避免HIV-1LTR启动子(潜在地保全于宿主基因组内)内的转录因子结合位点；选择LTR-A-和-B-指向的、30-bp向导RNA以及选择反映原始细菌免疫机制的前-crRNA系统，以提升对比基于20-bp向导RNA、嵌合crRNA-tracRNA的系统的特异性/有效性；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR试验，以鉴定且排除潜在的脱靶效应。

该向导RNA序列的构型可以是单一序列，或一种或多种不同序列的组合，如多态构型。多态构型可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多中向导RNA的组合，例如，U3、R或U5内序列的组合，而不选择作为该截短的、响应Tat的HIV启动子的一部分的序列。当该组合物于表达载体内给药时，该向导RNA可由单一载体编码。或者，可将多个载体加工为各自包括两种或更多种不同的向导RNA。可用的构型将导致裂解位点之间的病毒序列的切除，导致HIV基因组或HIV蛋白表达的废除。因此，使用两种或更多种不同的向导RNA，促进了被CRISPR核酸内切酶识别的裂解位点之间的病毒序列的切除。被切除区域的尺寸可从一个核苷酸至几千个核苷酸内改变。例示性的被切除区域揭示于具體实施例中。

当该组合物作为核酸而给药或包含在表达载体内时，CRISPR核酸内切酶和该向导RNA序列者可由相同的核酸或载体编码。或者或此外，CRISPR核酸内切酶可在与该向导RNA序列物理上分离的核酸中或独立的载体中被编码。一些具體实施例中，将RNA分子如crRNA、tracrRNA、gRNA加工为包含一个或多个修饰核酸碱基。例如，已知的对RNA分子的修饰可见于Lewis编撰的《基因VI》第9章“遗传密码的诠释”(Genes VI,Chapter 9,Interpretingthe Genetic Code)(1997,Oxford University Press,New York)以及Grosjean和Benne编撰的《RNA的修饰与编辑》(Modification and Editing of RNA)(1998,ASM Press,Washington DC)。经修饰的RNA组分包括下列：2'-O-甲基胞苷；N⁴-甲基胞苷；N⁴-2'-O-二甲基胞苷；N⁴-乙酰胞苷；5-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-羟甲基胞苷；5-甲酰胞苷；2'-O-甲基-5-甲酰胞苷；3-甲基胞苷；2-硫胞苷；赖胞苷(lysidine)；2'-O-甲基尿苷；2-硫尿苷；2-硫-2'-O-甲基尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷；4-硫尿苷；核糖基胸苷；5,2'-O-二甲基尿苷；5-甲基-2-硫尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；尿苷-5-氧乙酸；尿苷-5-氧乙酸甲酯；5-羧甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2'-硫尿苷；5-氨甲酰基甲基尿苷；5-氨甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5-氨基甲基-2-硫尿苷；5-甲基氨基甲基尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷；5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷；5-羧甲基氨基甲基尿苷；5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷；5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷；二氢尿苷；二氢核糖基胸腺嘧啶；2'-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N⁶,N-甲基腺苷；N⁶,N⁶-二甲基腺苷；N⁶,2'-O-三甲基腺苷；2-甲基硫-N⁶,N-异戊烯基腺苷；N⁶-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷；2-甲基硫-N⁶-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷；N⁶-(环氧丙基氨基甲酰基)-腺苷；N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；2-甲基硫-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；N⁶-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷；2-甲基硫-N⁶-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；肌苷；2'-O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1,2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N²-甲基鸟苷；N²,N²-二甲基鸟苷；N²,2'-O-二甲基鸟苷；N²,N²,2'-O-三甲基鸟苷；2'-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-甲基鸟苷；N²,7-二甲基鸟苷；N²,N²,7-三甲基鸟苷；怀俄苷(wyosine)；甲基怀俄苷；修饰不足的羟基怀丁苷；怀丁苷(wybutosine)；羟基怀丁苷；过氧怀丁苷；辫苷(queuosine)；环氧辫苷；半乳糖基辫苷；甘露糖基辫苷；7-氰基-7-去氮鸟苷；古生菌苷(arachaeosine)[亦称7-甲酰氨基-7-去氮鸟苷]；和7-氨基甲基-7-去氮鸟苷。

可通过标准技术生产分离的核酸分子。例如，PCR技术可用来获取含有本文中揭示的核苷酸序列的分离的核酸，包括编码本文中揭示的多肽的核苷酸序列。PCR可用来扩增来自DNA以及RNA的特异性序列，包括来自全基因组DNA或总细胞RNA的序列。多种PCR方法揭示于例如Dieffenbach和Dveksler编撰的《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)。通常，采用来自感兴趣区域或超出该区域的末端的序列信息来设计寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物在序列上与待扩增目标的相反链一致或相似。可使用多种PCR策略，通过该策略，可将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。

分离的核酸也可化学合成为单一核酸分子(如，使用亚磷酰氨技术在3'至5'方向进行自动DNA合成)或合成为一系列寡核苷酸。例如，可将一对或多对长寡核苷酸(如，>50至100个核苷酸)合成为含有所希望的序列，且每一对含有互补性短节段(如，约15个核苷酸)，因此，当将该寡核苷酸对退火时形成双螺旋链。使用DNA聚合酶来延伸该寡核苷酸，每对寡核苷酸得到单个的双链核酸分子，随后，该双链核酸分子被连接(ligate)入载体内。本发明的分离的核酸亦可通过诸如Cas9编码DNA的自然出现部分的突变(例如，根据上式)而获得。

两个核酸或它们编码的多肽可揭示为彼此具有某种程度的一致性。例如，Cas9蛋白及其生物学活性变体可揭示为展现某种程度的一致性。通过将短Cas9序列在蛋白质信息研究(PIR)网站(http://pir.georgetown.edu)内检索而获得检索结果，之后通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.mh.gov/blast)上的“短近乎一致序列”局部序列排比检索基本工具(BLAST)算法进行分析。

可测定相对于Cas9的序列一致性百分比，且所鉴别的变体可用作CRISPR相关核酸内切酶及/或可试验其作为药物组合物的功效。自然出现的Cas9可以是查询序列，而Cas9蛋白的片段可以是受试序列。

同样，Cas9蛋白的片段可以是查询序列，而其生物学活性变体可以是受试序列。为了测测序列一致性，可使用计算机程序ClustalW(版本1.83，默认参数)，将存疑核酸或氨基酸序列分别对准一个或多个受试核酸或氨基酸序列，该程序令核酸或蛋白质序列的对准在其整体长度上进行(全局对准)。见Chenna et al.,Nucleic acids Res.31:3497-3500,2003。

为了在截短的、响应Tat的HIV LTR启动子控制下表达Cas9，本文中也提供重组构造，该重组构造可用来转化细。重组构造可类似地用来表达与HIV中靶标序列互补的向导RNA。重组核酸构造包含如本文中揭示的编码Cas9的核酸及/或与HIV中靶标序列互补的向导RNA，可操作地链接至适用于在细胞内表达Cas9及/或与HIV中靶标序列互补的向导RNA的调节性区域。可获知，大量核酸可编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的退化是该领域中广为人知的。对于多数氨基酸，存在不止一个用作氨基酸密码子的核苷酸三元组。例如，可使用适宜的用于特定有机体的密码子偏移表来修饰Cas9编码序列中的密码子，因此获得在该有机体内的优化表达。

本文中揭示的核酸可包含在载体中。载体可包括，例如，复制的起源、核骨架附着区域(SAR)、及/或标记物。标记物基因可赋予宿主细胞以可选择的表型。例如，标记物可赋予杀生物剂抗性，如对抗生素(如，卡那霉素、G418、博来霉素、或潮霉素)的耐药性。表达载体可包括被设计来促进操控或检测(如，纯化或定位)所表达的多肽的标签序列。标签序列，如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血细胞凝集素、或FlagTM标签(Kodak,New Haven,CT)序列，典型被表达为与所编码的多肽融合。这些标签被插入该多肽内的任意处，包括羧基端或氨基端。

也可包括额外的表达载体，例如，染色体系列、非染色体序列或合成DNA序列的节段。适当的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物，质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体1许多衍生物如NM989，以及其它噬菌体DNA如M13和丝状单链DNA；酵母质粒，如2μ质粒或其衍生物；可用于真核细胞内的载体，如可用于昆虫或哺乳动物细胞内的载体；源自质粒与噬菌体DNA的组合的载体，如已经被修饰以采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒。

若干输送方法可与该可操作地链接至Cas9基因的截短的、响应Tat的HIV LTR启动子联合用于体外(细胞培养物)和体内(动物和患者)系统。具體实施例中，可使用慢病毒基因输送系统。这一系统在具有广泛趋向性和大DNA插入能力的分裂细胞和非分裂细胞中提供稳定、长期的基因存在(Dull et al.,J Virol,72:8463-8471 1998)。具體实施例中，腺病毒群(AAV)可用作输送方法。AAV是非病原性的单链DNA病毒，近年来，已经被积极地用于在体外和体内系统中输送治疗性基因(Choi et al.,Cnrr Gene Ther,5:299-310,2005)。一种例示性的非病毒输送方法可使用纳米颗粒技术。这一平台已经表明其作为体内药物的实用性。纳米技术已经改善了药物跨越紧密的上皮与内皮屏障的转胞吞作用。该技术提供以特异性方式进行其负载至细胞的靶向输送(Allen and Cullis,Science,303:1818-1822,1998)。

该载体亦可包括调节性区域。术语“调节性区域”是指影响转录或转译启动和速率、以及转录或转译产物的稳定性及/或移动性的核苷酸序列。调节性区域包括而不限于，启动子序列、增强子序列、响应元件、蛋白质识别位点、可诱导的元件、蛋白质结合序列、5'和3'未转译区域(UTR)、转录开始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号、以及内含子。

术语“可操作地链接”是指将核酸中的调节性区域和待转录的序列定位，从而影响该序列的转录或转译。例如，为了将编码序列置于启动子的控制下，典型将该多肽的转译阅读框的转译起始位点定位在该启动子下游的一个至约50个核苷酸之间。然而，可将启动子定位在该转译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处或定位在转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子典型包含至少一个核心(基础)启动子。启动子亦可包括至少一个控制元件，如增强子序列，其是上游元件或上游激活区域(UAR)。对待包括的启动子的选择取决于若干因素，包括但不限于，效率、可选择性、可诱导性、所希望的表达水平、以及细胞或组织优先性表达。通过适宜地选择并定位启动子和与编码序列相关的其它调节性区域而调节该编码序列的表达，是该领域技术人员的基本常识。

载体包括，例如，病毒载体(如，腺病毒Ad、AAV、慢病毒、以及水泡性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体和其它含有脂质的络合物，以及能介导多核苷酸至宿主细胞的输送的其它大分子络合物。载体也可包含其它进一步调节基因输送和/或基因表达的组分或功能性，或反而对靶标细胞提供有益性质的组分或功能性。如下文中更详细揭示和说明，这些其它组分包括，例如，影响结合至细胞或以细胞为靶向的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取该载体核酸的组分；影响该多核苷酸在被细胞摄取后在该细胞内丁烷的组分(如，介导核定位的剂)；以及影响该多核苷酸表达的组分。这些组分亦可包括标记物，如可用来检测或选择已经摄取并表达该载体所输送的核酸的细胞的可检测及/或可选择的标记物。这些组分可提供作为该载体的天然特征(如，使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能性的病毒载体)，或可修饰载体以提供这些功能性。其它载体包括Chen et al.,BioTechniques,34:167-171(2003)中揭示的那些。各种各样的此类载体是该领域中已知且通常可用的。“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源性基因产物或序列的病毒载体。由于很多病毒载体展现了与封装相关联的尺寸约束性，典型通过替换该病毒基因组的一个或多个部分而引入该异源性基因产物或序列。这些病毒可变为具有复制缺陷，需要在病毒复制和衣壳化过程中被反向提供所缺失的功能(如，通过使用携带复制及/或衣壳化所必需的基因产物的辅助病毒或封装细胞系)。也已经揭示了待输送的多核苷酸被携带在病毒载体外侧的经修饰的病毒颗粒(见，如，Curiel,D T,et al.PNAS 88:8850-8854,1991)。

另外的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学接合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一个基于HIV的病毒载体包含至少两个载体，其中，gag基因和pol基因来自HIV基因组，而env基因来自另一病毒。DNA病毒载体包括痘病毒载体，如天花病毒载体或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体如I型单纯性疱疹病毒(HSV)载体[Geller,A.I.et al.,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.,et al.,in DNA Cloning:MammalianSystems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.etal.,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.:90 7603(1993)；Geller,A.I.,et al.,ProcNatl.Acad.Sci USA:87:1 149(1990)]；腺病毒载体[LeGal LaSalle et al.,Science,259:988(1993)；Davidson,et al.,Nat.Genet.3:219(1993)；Yang,et al.,J.Virol.69:2004(1995)]；以及腺病毒群载体[Kaplitt,M.G.,et al.,Nat.Genet.8:148(1994)]。

本文中揭露的多核苷酸可与微输送载具如阳离子脂质体和腺病毒载体合用。关于对脂质体制备、靶向和内容为输送的综述，见Mannino and Gould-Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)。也见，Feigner and Holm,Bethesda Res.Lab.Focus,1 1(2):21(1989)和Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,1 1(2):25(1989)。

可根据已知技术生产复制缺陷型重组腺病毒载体。见，Quantin,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet,et al.,J.Clin.Invest.,90:626-630(1992)；和Rosenfeld,et al.,Cell,68:143-155(1992)。

另一输送方法是使用生产单链DNA的载体，该载体可生产在细胞内表达的产物。见，例如，Chen et al.,BioTechniqiies,34:167-171(2003)，该文献通过引用而以其整体并入本文。

如上所述，可以该领域技术人员所知的多种途径制备本发明的组合物。无论其原始来源或获得途径如何，可根据其用途配制本文中揭露的组合物。例如，上述核酸和载体可配制在应用于组织培养的细胞中或用于给药至患者或受试者的组合物中。本发明的任何药物组合物可配制为用于药剂的制备中，且特别用途为下述治疗情况中所表明，如，对具有HIV感染的受试者或处于接触HIV和HIV感染风险下的受试者的治疗。当作为药物而使用时，任何该核酸和载体均可以药物组合物的形式给药。这些组合物可以制药领域广为人知的方式制备，且可通过多种途径给药，给药途径取决于所需者是否为局部或全身治疗以及待治疗的面积。给药可以是外用给药(包括眼部给药和给药至粘膜，包括经鼻腔输送、经阴道输送、和经直肠输送)、肺部给药(如，通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷雾器给药；气管内、鼻腔、上皮、和透皮给药)、眼部给药、口服给药或肠胃外给药。用于眼部输送的方法可包括外用给药(滴眼液)，结膜下、眼周或玻璃体内注射，或通过以外科手术置于结膜囊内的气囊导管或眼科插入物引入。肠胃外给药包括静脉、动脉、皮下、腹膜、或肌肉注射或输液；或颅内如鞘内或心室内给药。肠胃外给药可以是单次推注剂量(single bolus dose)的形式，或可以是，例如，通过连续灌流泵给药。用于外用给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳液、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液剂、粉剂等。传统的药学载剂、水性的、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或所希望的。

该药物组合物可含有，作为活性成分，本文中揭示的核酸和载体与一种或多种药学可接受的载剂合用。在作成本发明的组合物时，该或形成的典型与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或密封在例如胶囊、片剂、小袋、纸张或其它容器形式的载剂内。当该赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料(如，生理盐水)，其用作该活性成分的载具、载剂或介质。因此，该组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、袋剂、小锭剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶(作为固体或处于液体介质中)、洗剂、乳液、软膏剂、凝胶剂、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌注射液、和无菌封装粉末的形式。如该领域已知的，稀释剂的类型可依据预设的给药途径而变。所得组合物可包括另外的剂，如防腐剂。一些具體实施例中，该载剂可以是或可包括基于脂质的胶体或基于聚合物的胶体。一些具體实施例中，该载剂材料可以是配制为脂质体、水凝胶、微颗粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束的胶体。如标注，载剂材料可形成胶囊，且该材料可以是基于聚合物的胶体。

本发明的核酸序列可输送至受试者的适宜细胞。这可通过例如使用聚合物的、生物可降解微颗粒或微胶囊输送载具而实现，其中，该载具的尺寸为适于吞噬细胞如巨噬细胞吞噬的最佳尺寸。例如，可使用直径约为1至10μm的PLGA(聚-丙交酯-共-乙交酯)微颗粒。该多核苷酸被封装在这些微颗粒内，该微颗粒被巨噬细胞摄取并在该细胞里逐渐被生物降解，从而释放该多核苷酸。一旦被释放，该DNA即在该细胞内表达。第二种类型的微颗粒倾向于不被细胞直接摄取，但主要用作核酸的缓释蓄积容器，该核酸仅在通过生物降解从该微颗粒中释放时才被细胞摄取。这些聚合性颗粒应因此足够大，以阻碍吞噬作用(即，大于5μm，且优选大于20μm)。另一实现该核酸的摄取的途径是使用通过标准方法制备的脂质体。该核酸可单独并入其输送载具中，或与组织特异性抗体一起并入载具中，该抗体为例如以一般作为HIV感染的潜伏性感染蓄积容器的细胞类型为靶标的抗体，该细胞为例如脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、和肠相关淋巴样细胞。或者，可制备由通过静电力或共价力附着至聚-L-赖氨酸的质粒或其它载体构成的分子络合物。聚-L-赖氨酸结合配体，而该配体可结合至靶标细胞上的受体。“裸DNA”(即没有输送载具)至肌肉内、真皮内或皮下位点的输送，是另一实现体内表达的手段。如上文所述，在相关的多核苷酸(如，表达载体)中，编码分离的核酸序列的核酸序列被可操作地链接至该截短的、响应Tat-的HIV LTR启动子，其中，该分离的核酸序列包含编码CRISPR相关核酸内切酶和人选向导RNA的序列。

一些具體实施例中，本发明的组合物可配制为纳米颗粒，例如，由与DNA络合的高分子量线性聚乙烯亚氨(LPEI)核心和环绕该核心的聚乙二醇修饰(PEG化)的低分子量LPEI外壳构成的纳米颗粒。

该核酸和载体也可应用于装置(如，导管)的表面，或包含在泵、贴、或其它药物输送装置内。在药学可接受的赋形剂或载剂(如，生理盐水)的存在下，本文中揭露的核酸和载体可单独给药或以混合物形式给药。该赋形剂或载剂是基于给药模式和途径选择的。用于药学制剂的适当的药学载剂以及药学必需品揭示于本领域广为人知的参考书《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin))中以及USP/NF(《美国药典和国家处方集》(United States Pharmacopeia and the National Formulary))中。

一些具體实施例中，该组合物可配制为用于阻断HIV的性传播的外用凝胶。该外用凝胶可在性活动之前，直接施加至男性或女性生殖器区域的皮肤或黏膜上。或者或此外，该外用凝胶可施加至男用或女用避孕套或隔膜的表面上或其内部。

一些具體实施例中，该组合物可配制为纳米颗粒，该纳米颗粒内封装有编码可操作地链接至截短的HIV LTR启动子的Cas9或Cas9变体的核酸。该核酸还可编码与靶标HIV互补的向导RNA序列。

本发明的制剂可囊括编码Cas9和与靶标HIV互补的向导RNA序列的载体。该向导RNA序列可包括与单一靶标区互补的序列，或其可包括任何与早前揭示的多个靶标区互补的序列的任意组合。或者，该编码由截短的HIV LTR启动子驱动的Cas9的序列与编码该向导RNA序列的序列可以位于分开的载体上。

本文中揭露的组合物通常且在多方面可用于治疗具有HIV感染的受试者。该方法可用于以任何HIV如HIV-1和HIV-2、SIV、及其任何循环重组形式为靶向。每当临床有益的结果发生时，则受试者被有效治疗。这可能意味着，例如，疾病症状的完全消退、疾病症状的严重性下降、或疾病进展的减慢。这些方法可进一步包括步骤：a)鉴别具有HIV感染的受试者(如，患者，且更具体而言，人类患者)；和b)向该受试者提供包含核酸的组合物，其中，该核酸编码处于截短的、响应Tat的HIV LTR启动子控制下的CRISPR相关核酸酶如Cas9。该方法可进一步包括向该受试者提供编码与HIV靶标序列如HIV LTR互补的向导RNA的序列。

可使用标准临床测试鉴别受试者，例如，使用免疫试验来检测该受试者血清内是否存在HIV抗体或HIV多肽p24，或通过HIV核酸扩增试验进行测试。将提供至该受试者且造成感染症状完全消退、感染的严重性下降、或感染的进程减缓的该组合物的量视为治疗有效量。本发明的方法亦可包括监控步骤，以帮助优化剂量、给药时间表、以及预期成果。本发明的一些方法中，可首先测定患者是否具有潜伏性的HIV感染，随后测定是否以一种或多种本文中揭示的组合物治疗该患者。监控也可用来检测耐药性的发作，以及快速区分敏感患者与不明患者。一些具體实施例中，该方法可进一步包括检测该患者携带的特定HIV的核酸序列，以及随后设计待与那些特测序列互补的向导RNA的步骤。例如，可测定受试者的LTRU3、R、或U5区域的核酸序列，并随后设计与该患者的序列精确互补的一种或多种向导RNA，再一次地，无需选择作为该截短的、响应Tat的HIV启动子的一部分的序列。

该组合物亦可用于对处于逆转录病毒感染如HIV感染的风险下的受试者的治疗，例如，作为对该受试者的预防性治疗。这些方法可进一步包括步骤：a)鉴别具有HIV感染的受试者；和b)向该受试者提供包含核酸的组合物，其中，该核酸编码处于截短的、响应Tat的HIV LTR启动子控制下的CRISPR相关核酸酶如Cas9。该序列可额外地编码与HIV靶标序列如HIV LTR互补的向导RNA。处于HIV感染的风险下的受试者可以是，例如，任何参与不安全性行为的性活跃个体，即参与不使用避孕套的性活动者；具有另一性传播感染的性活跃个体；静脉吸毒者；或未受割礼的男性。处于HIV感染的风险下的受试者可以是，例如，其职业可能令其与感染HIV的群体接触的个体，如医护工作者或现场急救员。处于HIV感染的风险下的受试者可以是，例如，监狱环境的同被收容者或性工作者，换言之，使用性活动获得收益或非货币项目如食品、药品或庇护所的个体。

该组合物亦可给药至具有HIV感染的怀孕期或哺乳期妇女，以减轻HIV从母亲向其子女传播的可能性。在通过产道分娩时，感染有HIV的孕妇可经胎盘将病毒传递至子宫内的子女，或在分娩后，通过乳汁将病毒传递至子女。本文中揭露的组合物可在产前、围产期、或产后的哺乳期给药至感染HIV的母亲，或以产前、围产期、或产后给药的任意组合给药。该组合物可与下文揭示的标准抗逆转录病毒疗法一起给药。一些具體实施例中，本发明组合物也在分娩后立即给药至婴儿，以及，一些具體实施例中，在其后不时地给药。该婴儿也可接受标准抗逆转录病毒治疗。

该组合物可给药至未感染HIV的个体，以防止其感染HIV。该组合物可包括输送治疗有效量的药物组合物。该药物组合物可包括编码CRISPR相关核酸内切酶的序列，以及至少上述HIV LTR启动子的核心区域和该截短的、响应Tat的HIV LTR启动子的TAR区域。

本文中揭露的方法可施加至多个物种，如人类、非人灵长类(如，猴子)、马或其它家畜、狗、猫、雪貂或其它作为宠物豢养的哺乳动物、大鼠、小鼠、或其它实验室动物。

本发明的方法可表示为医药制剂。据此，本发明涵盖本文中揭示的剂和组合物在医药制剂中的用途。本文中揭示的化合物可用于治疗性组合物和方案中，或可用于制造治疗本文中揭示的疾病或病症的医药制品。

本文中揭示的任何组合物可给药至宿主身体的任何部位，以进行后续至靶标细胞的输送。组合物可输送至而非限于，哺乳动物的脑、脑脊液、关节、鼻黏膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤、或腹膜腔。就输送途径而言，组合物可通过静脉、颅内、腹膜、肌肉、皮下、肌肉、直肠、阴道、鞘内、气管内、皮内、或透皮注射给药，通过口服或鼻腔给药，或通过随时间渐变的灌注给药。其它实例中，可通过吸入将组合物的气溶胶制剂给至宿主。

所需的剂量将取决于给药途径；制剂的特性；患者疾病的特性；患者的身高、体重、表面积、年龄和性别；正在给药的其它药物；以及临床主治医生的判断。就细胞靶标的多样性和多种给药途径的不同效率而言，预期所需的剂量变化范围广。可使用标准经验性优化途径如该领域中广为人知的途径，调节这些剂量水平的变化。给药可以是单剂或多剂(如，2倍或3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、或更多倍)。将化合物封装在适当地输送载具(如，聚合物微颗粒或可植入的装置)中可增加输送效率。

使用本文中提供的任何组合物进行治疗的持续时间可以是从短至一天到长达宿主整个寿命(如，很多年的任意长度的时间。例如，化合物可给药每周一次(共给药例如4周至很多月或很多年)；每月一次(共给药例如3至12个月或很多年)；或每年一次，给药5年、10年或更长的时间。也应注意，治疗的频率可变。例如，本发明的化合物可每天、每周、每月、或每年给药一次(或两次、三次等)。

可将有效量的本文中提供的任何组合物给药至需要治疗的个体。可通过评估患者在给药已知量的特定组合物后的响应来测定有效量。此外，若有毒性，则可通过评估患者在给药已知量的特定组合物之前和之后的临床症状而测定该毒性的水平。注意，给药至患者的特定组合物的有效量可根据所希望的结果以及患者的响应和毒性水平进行调节。对于每一特定患者的重大毒性可能有变化，且该变化取决于多种因素，包括但不限于，该患者的疾病状态、年龄以及对副作用的耐受性。

该领域中已知的任何方法均可用来测定是否诱发了特定的响应。可评估特定疾病状态的程度的临床方法可用来测定是否诱发了响应。用来估量响应的特定方法将取决于该患者病变的特性、患者的年龄和性别、正在服用的其它药物、以及主治医生的判断。

该组合物也可与其它治疗剂如用于HAART中的抗逆转录病毒剂一起给药。抗逆转录病毒剂可包括逆转录酶抑制剂(如，核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂、齐多夫定、恩曲他滨(emtricitibine)、拉米夫定和替诺福韦(tenoifvir)；以及非核苷逆转录酶抑制剂如依法韦仑(efavarenz)、奈韦拉平、利匹韦林(rilpivirine))；蛋白酶抑制剂，如替匹拉韦(tipiravir)、地瑞那韦(darunavir)、茚地那韦；进入抑制剂，如马拉维若(maraviroc)；融合抑制剂，如恩夫韦地(enfuviritide)；或整合酶抑制剂，如雷特格韦(raltegrivir)、度鲁特韦(dolutegravir)。抗逆转录病毒剂亦可包括该剂的多类别组合，例如，恩曲他滨、依法韦仑与替诺福韦的组合；恩曲他滨、利匹韦林与替诺福韦的组合；或埃替拉韦(elvitegravir)、可比司他(cobicistat)、恩曲他滨与替诺福韦的组合。

两种或多种治疗剂的并行给药并不需要将该等剂在相同时间或通过相同途径给药，只要在该等剂发挥其治疗功效的时间段存在重叠即可。同步或依序给药预计为在不同日或不同周内给药。该治疗剂可以节奏性方案给药，如持续给药低剂量的治疗剂。

可通过标准药学过程在细胞培养物中或实验动物中测定这些组合物的剂量、毒性和疗效，如测定LD₅₀(将群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(对群体的50％治疗上有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比是治疗指数，且可表示为LD₅₀/ED₅₀比。

从细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于制订在人体中使用的剂量范围。这一组合物的剂量优选处于包括具有低毒或无毒的ED₅₀的循环浓度范围内。该剂量可依据所采取的剂型和所使用的给药途径在这一范围内变化。对于在本发明方法中使用的任何组合物，最初可从细胞培养试验中估算治疗有效剂量。可在动物模型中制订剂量，以实现包括在细胞培养物中测得的IC₅₀(即，测试化合物实现对症状的半最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。这一信息可用来更准确地测定可在人体内使用的剂量。可例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。

如上所述，治疗有效量的组合物(即，有效剂量)意为足以产生治疗上(如，临床上)所希望结果的量。该组合物的给药频率为每天一次或多次至每周一次或多次；包括每两天一次。该领域技术人员应了解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，该因素包括但不限于，疾病或病症的严重性、先前治疗、该受试者的一般健康状况及/或年龄、以及存在的其它疾病。此外，使用治疗有效量的本发明的组合物治疗受试者可包括单一治疗或一系列治疗。

本文中揭示的组合物适用于上揭的多种药物输送系统。另外，为了提升所给药化合物的体内血清半衰期，该组合物可将胶囊化、引入脂质体内腔、制备为胶体，或可采用向该组合物提供延长的半衰期的其它传统技术。多种方法可用于制备脂质体，如在Szoka等人的美国专利US 4,235,871、US 4,501,728和US 4,837,028中揭示的，这些专利各自通过引用而并入本文。再者，人们可在靶向药物输送系统中给药该药物，例如，在涂覆有组织特异性抗体的脂质体中给药。该脂质体将会以某一器官为靶向并被该器官选择性地摄取。

还提供令哺乳动物细胞中的逆转录病毒如慢病毒如人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒失活的方法。该人免疫缺陷病毒可以是HIV-1或HIV-2。该人免疫缺陷病毒可以是染色体整合的前病毒。该哺乳动物细胞可以是被HIV感染的任何细胞类型，包括但不限于，CD4⁺淋巴细胞、巨噬细胞、纤维母细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀手细胞、树突细胞如朗格汉斯细胞和滤泡树突细胞、造血干细胞、内皮细胞、脑小胶质细胞、星形胶质细胞和胃肠上皮细胞。这些细胞类型包括那些典型在初次感染过程中被感染的细胞类型，例如，CD4⁺淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞或朗格汉斯细胞，以及那些组成潜伏性HIV逆转录病毒的细胞类型，即潜伏性感染细胞。

该方法可包括将细胞暴露于及/或接触包含编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸的组合物，其中该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，且该截短的启动子含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域。该分离的核酸可进一步编码一种或多种向导RNA，其中，该向导RNA与该逆转录病毒中的靶标核酸序列互补。该接触步骤可发生在体内，换言之，该组合物可直接给药至具有HIV感染的受试者。但该方法并非受限于此，且该接触步骤可以间接体内方式发生。例如，可从具有HIV感染的受试者移除一个细胞或多个细胞、或组织外植体并培养，随后令其与一组合物接触，其中，该组合物包含可操作地链接至截短的HIVLTR启动子的CRISPR相关核酸内切酶以及任选的向导RNA，其中该向导RNA与HIV中的核酸序列互补。如上所述，药物组合物可包括编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸，其中该酶可操作地链接至截短的、响应Tat的HIV LTR启动子。

该组合物以促进其被哺乳动物细胞摄取的方式配制。可用的载体系统和制剂如上所述。一些具體实施例中，载体可将该组合物输送至特异的细胞类型。但本发明并不限于此，也可采用其它DNA输送方法如使用诸如磷酸钙、DEAE右旋糖酐、脂质体、脂质复合体、表面活性剂和全氟化学液体的化学转染，以及物理输送方法如电穿孔系统、微量注射系统、弹道颗粒(ballistic particle)系统、及“基因枪”系统。

可使用标准方法如，用以检测CRISPR相关核酸内切酶的免疫试验、或用以检测向导RNA的基于核酸的试验如PCR，来证实细胞已经摄取及/或表达已经被引入该细胞内的蛋白。随后，如下所示，所加工的细胞可再次引入作为其来源的受试者体内。

其它具體实施例中，该组合物包含已经使用一种或多种Cas9/截短的、响应Tat的HIV LTR启动子载体转化或转染的细胞。一些具體实施例中，本发明的方法可以间接体内方式应用。换言之，受试者的细胞可自其身体移除，并使用该组合物在培养中除了以切除HIV序列，再将治疗后的细胞送回该受试者身体内。该细胞可以是受试者的细胞，或它们可以是单体型匹配的细胞或细胞系。可辐射该细胞以防止复制。一些具體实施例中，该细胞是人白细胞抗原(HLA)匹配的细胞、自体细胞、细胞系、或其组合。其它具體实施例中，该细胞可以是干细胞。例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS cell))。已经评价了来自很多动物物种包括人类的胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导多能干细胞，iPS细胞)。这些类型的多能干细胞将会是用于再生医学的最有用的细胞来源，因为这些细胞能通过对其分化的适宜诱导而分化为几乎全部器官，且在维持其多能性的同时保留其旺盛的分化能力。特别地，与通过摧毁配体而生产的ES细胞相比，iPS细胞可从自源体细胞建立且因此不太可能造成伦理和社会问题。再者，作为自源性细胞，iPS细胞可能避免排异反应，而配以反映是再生医学或移植治疗的最大障碍。

本文中揭示的组合物可保证在适当的标记容器内，例如，用于作为治疗来处理逆转录病毒感染如HIV感染的受试者或处于逆转录病毒感染如HIV感染风险下的受试者。该容器可包括组合物，该组合物包含早前揭示的编码CRISPR相关核酸内切酶如Cas9核酸内切酶的核酸序列以及截短的、响应Tat的HIV LTR启动子。该序列可额外地编码与HIV中靶标序列互补的向导RNA，或编码该核酸的载体、以及适用于预期用途的一种或多种适当的稳定剂、载剂分子、芳香剂(flavoring)等。据此，包装的产品(如，含有本文中揭示的一种或多种组合物的无菌容器，并被包装用于储存、运输或以浓缩或易于使用的浓度销售)以及试剂盒包括至少一种所揭露的组合物。产物可包括含有一种或多种本发明组合物的容器(如，小瓶、罐、瓶、袋等)。此外，可进一步包括加工件，例如，封装材料、使用说明书、注射器、输送装置、缓冲剂或用于处理或监控预防或治疗所需条件的其它控制试剂。一些具體实施例中，该试剂盒可包括一种或多种额外的抗逆转录病毒剂，例如，逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、或进入抑制剂。该额外的剂可与核酸序列或编码该核酸的载体一起封装在相同容器内，或它们可单独封装，其中，该核酸编码可操作地链接至截短的HIV LTR启动子的CRISPR相关核酸内切酶如Cas9以及任选的与HIV中靶标序列互补的向导RNA。

该产品亦可包括图例(如，描述该产品用途的印刷标记或插页或其它介质(如，录音带或录影带))。该图例可与该容器关联(如，粘附于该容器)，且可揭示该容器内的组合物应采取的给药方式(如，给药频率和途径)、其说明、及其它用途。该组合物可易于给药(如，以剂量适当的单元形式存在)，且可包括一种或多种额外的药学可接受的佐剂、载剂或其它稀释剂、及/或额外的治疗剂。或者，该组合物可提供为具有稀释剂和稀释说明的浓缩形式。

通过下述非限制性实施例对本发明实践进行例示性说明。

[实施例]

实施例1：LTR-Cas9变体的克隆

使用pNL4-3HIV载体(NIH AIDS试剂程序#114)作为模板和下述引物(限制位点加粗标注)的PCR获得全长度的和多种截短的LTR启动子序列：

Kpnl-LTR(-454)-S 5'-GGTACCTGGAAGGGCTAATTTGG-3'(SEQ ID NO:1)

Kpnl-LTR(-120)-S 5'-GGTACCTCGAGCTTTCTACAAGG-3'(SEQ ID NO:2)

Xbal-LTR(-80)-S 5'-TCTAGAGGAGGTGTGGCCTGGGC-3'(SEQ ID NO:3)

Kpnl-LTR(-38)-S 5'-GGTACCAGATGCTACATATAAGC-3'(SEQ ID NO:4),or

LTR(+66)-Ncol-AS 5'-CC ATGGTAAGC AGTGGGTTCC-3'(SEQ ID NO:5).

参照LTR的U3区、R区和U5区以及LTR增强子元件、核心元件、TAR(反射激活响应)元件和TATA盒元件，截短的HIV-1LTR启动子变体的由来概略地显示于图1A中。图1B显示经PCR扩增的LTR截断变体的琼脂糖凝胶电泳图像。

PCR产物经凝胶纯化并直接在TA载体(Invitrogen)中亚克隆，随后使用Kpnl或Xbal及Ncol限制性内切酶切除并连接入作为Cas9基因来源及/或模板的经Kpnl-Ncol或Xbal-Ncol消解的pX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-Hl-短shorttracr-PGK-puro质粒(Addgene#42229)(后文称“pX260”质粒)中。pX260质粒含有Cbh启动子(Xbal-Kpnl-Cbh-Ncol)。作为该操作的结果，pX260质粒中的原始Cbh启动子被移除并替换为一种LTR启动子(Xbal-或Kpnl-LTR-Ncol)。图2中显示的原始pX260质粒结构的蓝图被认定为“Cbh-Cas9”(来自www.Addagene.org和Cong et al.,Science(2013)339(6121):819-23)。经修饰质粒的蓝图作为“LTR-Cas9”显示在图2中。

实施例2：用于诱导Cas9表达的LTR/Tat比的优化

为了找到并优化具有最佳反式激活效果的Tat与LTR启动子的比值，在具有或不具有Tat表达质粒(pCMV-Tat86,250ng)的全长度HIV-1LTR(pLTR(-454/+66)-FLAG-Cas9)质粒(10、50和250ng)的对照下，使用具有不同量的表达FLAG标记Cas9的Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)共转染人初代成胶质细胞瘤细胞系U87MG的细胞。U87MG是HIV-1潜伏细胞系。以空pCMV质粒(pcDNA3.1)平衡DNA的总量。48小时后，在TNN缓冲液(50mM Tris pH 7.4、100mM NaCl、5mM EDTA、1％NP 40)中裂解细胞。随后通过蛋白质印迹法检查Cas9、Tat和α微管蛋白的表达。结果显示于图3A中(U87MG WCE 50μg/孔)。道次1：pLTR(-454/+66)-Cas9250ng、pCMV l000ng。道次2：pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng。道次3：pLTR(-454/+66)-Cas9l0ng、pCMV 1240ng。道次4：pLTR(-454/+66)-Cas9 250ng、pCMV 750ng、pCMV-Tat86 250ng。道次5：pLTR(-454/+66)-Cas9 50ng、pCMV 950ng、pCMV-Tat86 250ng。道次6：pLTR(-454/+66)-Cas9l0ng、pCMV 990ng、pCMV-Tat86 250ng。

分析并使用ImageJ软件比较对应于Cas9和α-微管蛋白(用作载荷对照)的谱带的强度。结果显示于图3B中。上图显示归一化至α-微管蛋白水平的具有或不具有Tat的Cas9水平的蛋白质印迹图像定量。下图显示+Tat/无Tat比的蛋白质印迹图像定量。结果表明，以1:5的pLTR-Cas9:pCMVTat86(50ng:250ng)比获得了对Cas9表达的最大(5.3x)诱导。

实施例3：多种截短的LTR启动子在诱导Cas9表达中的比较

为了测试和比较截短的LTR启动子，在使用或不使用表达Tat的质粒(pCMV-Tat86,250ng)下，使用不同量的在HIV-1截短的LTR变体pLTR(-120/+66)-FLAG-Cas9或HIV-1截短的LTR变体pLTR(-80/+66)-FLAG-Cas9的控制下表达FLAG标记的Cas9的质粒(5ng或50ng)转染U87MG细胞。48小时后，制备全细胞裂解液并通过蛋白质印迹法分解。分析并使用ImageJ软件比较对应于Cas9和α-微管蛋白(用作载荷对照)的谱带的强度。结果显示于图4A中。道次1：pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng。道次2：pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng、pCMV1245ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次3：pLTR(-120/+66)-Cas9 5ng、pCMV 995ng、pCMV-Tat86250ng。道次4：pLTR(-120/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng。道次5：pLTR(-120/+66)-Cas950ng、pCMV 1200ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次6：PLTR(-120/+66)-Cas9 50ng、pCMV 950ng、pCMV-Tat86 250ng。道次7：pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng。道次8：pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng、pCMV 1245ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次9：pLTR(-80/+66)-Cas9 5ng、pCMV995ng、PCMV-Tat86 250ng。道次10：pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng。道次11：pLTR(-80/+66)-Cas9 50ng、pCMV 1200ng、+rTat蛋白2.5μg/ml。道次12：pLTR(-80/+66)-Cas950ng、pCMV 950ng、PCMV-Tat86 250ng。

分析并使用ImageJ软件比较对应于Cas9和α-微管蛋白(用作载荷对照)的谱带的强度。结果显示于图4B中。上图显示归一化至α-微管蛋白水平的不具有Tat、具有rTAT、或具有经转染Tat的Cas9水平的蛋白质印迹图像定量。下图显示+Tat(经转染)/无Tat比的蛋白质印迹图像定量。结果表明，移除LTR的调节区域及/或增强子区域(那些区域按照图式表示在图1A中)并未显着影响Tat介导的反式激活的Cas9表达。Tat介导的表达从pLTR(-80/+66)-FLAG-Cas9质粒明显可见，该质粒含有该核心元件和TAR LTR启动子元件而不含有增强子区域和调节区域。

实施例4：通过基因编辑策略对HIV-1的负反馈调节

在本文呈递的研究中，该基因编辑组合物允许在病毒再次激活的早期，通过HIV-1转录活化因子Tat对CRISPR/Cas9进行有条件的激活。这一新策略在生产性病毒复制之前，通过移除该病毒基因的跨越该病毒启动子及/或该病毒编码序列的节段，完全且永久地废除了病毒复制。再者，这一策略减轻了由于可能由Cas9在细胞内的非必要且持续的高水平表达引起的意料之外的并发症而获得关注的点。

结果

将对应于Cas9基因的编码DNA序列置于含有该HIV-1启动子的跨越5'-LTR的U3区和R区的三个不同节段的pX26表达载体质粒内，以鉴别病毒启动子的最小DNA元件，该最小DNA元件保留对Tat的响应性但缺少对应于最初用于编辑HIV-1DNA的gRNA A和gRNA B的序列(图5A)。在通过对每一构造进行DNA测序而核实这一克隆策略后，检测通过每一载体进行的Cas9表达以及在pX26或pX26-LTR-Cas9和CMV-Tat共转染的TZMbl细胞中对Tat的响应性水平。蛋白质印迹结果显示，全部三种包括该涵盖位于-80至+66之间位置的最小DNA启动子序列的质粒的构造均激活了Cas9的表达(图5B)。由于该启动子序列处于与gRNA A和gRNA B相对应的DNA序列之外，这一激活对于这些研究尤为重要(图5B)。此后，将对应于LTR_(-80/+66)-Cas9的DNA片段克隆入慢病毒载体(LV)内并用来转导TZMb1细胞，以评估Tat蛋白在编辑表达荧光素酶报告基因的整合HIV-1DNA复本上的效果。LTR的PCR扩增结果显示，检测表达gRNA A和gRNA B以及Tat蛋白的细胞内的205bp DNA片段的结果(图5C，将道次1至5与道次6至8相比较)。图5A(也见图10)中例示性说明了用于PCR扩增的引物的位置和预期的扩增子。测序结果证实，一旦Tat在通过LV-LTR_(-80/+66)-Cas9加上LV-gRNA A/B转导的细胞内被表达，190bp DNA片段即被切除。Cas9、Tat和α-微管蛋白(作为相同负载的对照)的表达显示在图5D中。

此后，通过荧光素酶试验检查病毒DNA切除对病毒启动子活性的影响。结果显示，当通过Tat激活Cas9时，荧光素酶活性逐步下降，证实了DNA试验的结果，表明DNA的裂解造成了对这些细胞内病毒启动子活性的抑制(图5E)。随访研究中，考察了TZMb1细胞被HIV-1感染时的Cas9的激活。为了这一目的，细胞以LV-LTR_(-80/+66)-Cas9和LV-gRNA A/B转导24小时，之后，使用HIV-1_JRFL或HIV-1_SF162以三种不同的MOI感染细胞。48小时后，收获细胞，通过PCR评估DNA切除，通过荧光素酶试验评估整合启动子序列的表达，并通过蛋白质印迹法评估Cas9的表达。这些实验的结果显示，在以HIV-1_JRFL和HIV-1_SF162感染的细胞内检测出裂解后的205bp DNA片段，表明在这些细胞中，通过HIV-1_JRFL和HIV-1_SF162反式激活LTR_(-80/+66)启动子产生了Tat，以及Cas9在这些细胞中的产生(图6A)。再者，荧光素酶试验的结果显示，这些细胞内荧光素酶活性显着降低，再次证实通过Tat激活的Cas9对于关闭所整合的HIV-1荧光素酶基因的有效性，而Tat是通过HIV-1_JRFL或HIV-1_SF162感染时产生的。将Cas9引入被感染细胞的动作显示于图6B中。蛋白质印迹法的结果显示，当使用HIV-1_RFL和HIV-1_SF162感染细胞时，截短的LTR启动子LTR_(-80/+66)被激活，导致该细胞内产生Cas9蛋白(图6C)。

随访研究中，测试了Tat介导的激活LTR-Cas9连同gRNA A/B一起消除人T-淋巴细胞系2D10中的HIV-1基因组的能力。这些细胞荷有潜伏状态的单边HIV-1PNLA4-3的整合复本，该单边HIV-1PNLA4-3的基因组缺失了Gag基因和Pol基因的部分，且Nef基因被替换为编码绿色荧光报告蛋白的基因(GFP)。这些细胞内Tat蛋白质水平的提升和Cas9的活化(显示于图7A中)造成，在通过LV-gRNA A/B转导的细胞内的Cas9被激活时，编辑该病毒LTR(图7B，亦见图11，道次1至8)。据此，检测到了Tat存在时GFP阳性细胞数目的显着下降，说明Tat的激活消除了被裂解的启动子表达病毒DNA的能力，而反过来造成对这些细胞中GFP的阻抑。对应于gRNA位置、DNA片段的切除、以及PCR引物的DNA序列显示于图12中。

鉴于早前的观察表明了PMA及/或TSA在刺激2D10细胞内前病毒DNA整合复本中的能力，对PMA和TSA对潜伏性感染的T细胞模型中Cas9的激活的影响进行评估。如图8A中所见，以单独或组合形式的PMA和TSA处理2D10细胞，增加了Cas9表达的水平。平行实验中，进行用于检测LTR DNA的PCR分析，该PCR分析显示了病毒DNA切除水平的明显增加(图8B)，这被205bp DNA片段的出现所证明(见图11，道次9至14)。通过使用蛋白质印迹法测量细胞内GFP的水平而检查病毒的激活，或通过荧光显微镜对标识着病毒激活的绿色荧光细胞进行定量(图8C)，显示了病毒基因表达水平的显着下降。因此，通过由静默前病毒被再次激活时产生的Tat或直接通过产生Cas9的PMA和TSA对最小病毒启动子(-88/+60)的激活，可能对于含有gRNA A和gRNA B的细胞内的潜伏性整合病毒基因组的表达具有负面影响。

探讨

自1985年被发现以来，由于HIV-1的Tat蛋白在病毒基因组以转录水平表达中及其对未感染细胞的致病性冲击中的关键角色，该蛋白已经收到重大关注。机理上，Tat与位于转录起始位点下游的RNA序列(核苷酸+1至+59)即所谓的转录响应区域或TAR相关联。Tat与TAR的关联触发一系列分子事件和生化事件，导致接近转录起始位点(核苷酸1)的转录起始复合物的启动前和启动。这一复合物包括一系列具有令该复合物的组分磷酸化或乙酰化的能力的细胞蛋白，包括pTEF和RNA聚合酶II，因此促进RNA的转录延伸。此外，Tat与多种转录因子的相互作用可影响其它病毒和细胞基因的转录；其中，该转录因子包括NF-κΒ、p300/CBP和GCN5，且所有因子均促成见于HIV-1阳性AIDS患者体内的疾病谱。一旦来自再次激活的病毒启动子的转录导致了病毒转录和Tat产生的初始循环，则储存库内潜伏性病毒即进行生产性复制，而Tat也在此过程中扮演重要角色。Tat在HIV-1复制和AIDS发病机理中独一无二的重要性，提供了用作病毒输送以及疫苗研发的潜在靶标的强有力的基本原理。事实上，若干潜在的抑制剂，一些具有干扰Tat-TAR相互作用的能力，而其它具有防止Tat与其细胞性伙伴通讯的能力，已经显示了多种程度的影响HIV-1复制的效能。

本研究中使用的策略是采用Tat来切除病毒基因组的节段并永久性地废除具有生产性或潜伏性HIV-1的细胞内的HIV-1基因转录和复制。这里，设计了一种用于HIV-1的由Tat触发的自杀路径，该路径包括使用CRISPR/Cas9技术编辑病毒基因组(在图9中说明)。根据这一途径，Tat在细胞内的产生，除了刺激其具有全长度5'-LTR序列的自身启动子外，还通过相同机理借由跨越该富GC、TATA盒和TAR(-80至+66)区域的截短的最小启动子序列而加强Cas9的表达。借由切除基因节段，Cas9的产生极其与gRNA的联合可永久性地根除细胞内的HIV-1，其中，该gRNA设计为以(-80至+66)外的诱发全长度病毒启动子内的InDel突变的LTR DNA序列为靶标。除了所预期的代表全长度LTR序列的417bp DNA片段之外，LTR DNA的短范围扩增结果还显示了仅存在于表达Tat的细胞内的体积为227bp的DNA片段。通过将残留的5'-LTR与通过Cas9/gRNA A裂解5'-LTR或3'-LTR后而保留的3'-LTR结合，生成该227bp DNA片段。也可能是，来自通过Cas9/gRNA裂解后的5'-LTR的保留DNA片段与来自3'-LTR的DNA片段连接，创建了新的用于基因扩增和小体积(227bp)扩增子呈现的模板。使用以LTR加上Gag基因内一区域为靶标的多工gRNA(gRNA A)，且具有gRNA A与gRNA Gag之间的DNA片段被移除的预期。

近年来，由于该CRISPR/Cas9基因编辑策略在以高精度和高效率编辑基因组方面的非凡能力及其实施的简单性和灵活性，该策略已经在生物医学研究中受到关注。但是，若干方面需要密切关注。例如，设计最具特异性且有效的gRNA以避免脱靶效应是重要的。通过全基因组的超深度测序和多种其它测试，证实本文所采用的策略可用于最大化特异性且避免脱靶编辑。第二课题涉及Cas9的受控表达，以避免可能非特异性地造成宿主基因组长期受损及/或诱导免疫响应的蛋白质的非必要存在。本策略被发展用于Cas仅在HIV-1Tat存在下的有条件的表达，其提供一种用于在HIV-1呈上升趋势时激活和静默用于根除该病毒的基因编辑的新颖途径。

本文中引用的每一专利、专利申请案和公开案的内容通过引用而以其整体并入本文。该领域技术人员将轻易了解，本发明很好地适应了实践并获得所提及的结果和优点及该实践所固有的结果和优点。尽管本发明是参考具体实施例而揭露的，但很明显，该领域技术人员可设计本发明的其它具體实施例和变更而不悖离本发明实践中所使用的真实精神和范畴。倾向于将所附权利要求书解释为包括全部具體实施例及等效变更。

Claims

1.一种分离的核酸序列，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA的序列，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

2.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中，该HIV中的靶标核酸序列包含位于HIV编码区域或非编码区域内的序列。

3.如权利要求2所述的分离的核酸序列，其中，该非编码区域包含HIV的长末端重复序列或位于该HIV长末端重复序列内的序列。

4.如权利要求3所述的分离的核酸序列，其中，该位于HIV长末端重复序列内的序列包含位于U3区、R区、或U5区内的序列，而这些区域不包括该截短的HIV LTR启动子的任何序列。

5.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

6.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。

7.如权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包含编码tracrRNA的序列。

8.如权利要求7所述的分离的核酸序列，其中，该tracrRNA与编码向导RNA的序列融合。

9.如权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包含编码核定位信号的序列。

10.如权利要求1所述的分离的核酸序列，其中，该分离的核酸序列可操作地链接至表达载体。

11.如权利要求10所述的分离的核酸序列，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、及腺病毒群载体。

12.如权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包含该HIV LTR启动子的增强子区域。

13.一种药物组合物，其包含编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA的核酸序列，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

14.如权利要求13所述的药物组合物，进一步包含药学可接受的载剂。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中，该药学可接受的载剂包含基于脂质的胶体或基于聚合物的胶体。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其中，该胶体是脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、或嵌段共聚物胶束。

17.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该药物组合物配制为外用。

18.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该药物组合物包含在避孕套内。

19.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该HIV中靶标核酸序列包含位于HIV的编码区域或非编码区域内的序列。

20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，该非编码区域包含HIV的长末端重复序列。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其中，该靶标核酸序列包含位于该HIV长末端重复序列内的序列。

22.如权利要求21所述的药物组合物，其中，该位于HIV长末端重复序列内的序列包含位于U3区、R区、或U5区内的序列，而这些区域不包括该截短的HIV LTR启动子的任何序列。

23.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

24.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。

25.如权利要求13所述的药物组合物，进一步包含编码tracrRNA的核酸序列。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其中，该tracrRNA与编码向导RNA的序列融合。

27.如权利要求13所述的药物组合物，进一步包含编码核定位信号的序列。

28.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该药物组合物可操作地链接至表达载体。

29.如权利要求28所述的药物组合物，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

30.如权利要求13所述的药物组合物，其中，该序列进一步编码该HIV-1LTR启动子的增强子区域。

31.一种治疗有效量的包含核酸序列的药物组合物在制备用于治疗具有HIV感染的受试者的药物的用途，其中，该核酸序列编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

32.如权利要求31所述的用途，其中，该HIV感染是潜伏性感染。

33.如权利要求31所述的用途，其中，该药物组合物是外用给药或肠胃外给药。

34.如权利要求31所述的用途，进一步包含给药抗逆转录病毒剂。

35.如权利要求34所述的用途，其中，该抗逆转录病毒剂选自非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和进入抑制剂所组成的群组。

36.如权利要求35所述的用途，其中，该抗逆转录病毒剂包含高活性的抗逆转录病毒治疗。

37.如权利要求31所述的用途，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

38.如权利要求31所述的用途，其中，该药物组合物可操作地链接至表达载体。

39.如权利要求38所述的用途，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

40.如权利要求31所述的用途，其中，该序列进一步编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

41.一种治疗有效量的包含核酸序列的药物组合物在制备用于降低处于HIV感染风险下的受试者感染HIV的风险的药物的用途，其中，该核酸序列编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

42.如权利要求41所述的用途，其中，该受试者是性活跃者、医护人员或现场急救员。

43.如权利要求41所述的用途，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是Cas9。

44.如权利要求41所述的用途，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。

45.如权利要求41所述的用途，其中，该药物组合物可操作地链接至表达载体。

46.如权利要求45所述的用途，其中，该表达载体选自下列所组成的群组：慢病毒载体、腺病毒载体、和腺病毒群载体。

47.如权利要求41所述的用途，其中，该序列进一步编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

48.一种治疗有效量的包含核酸序列的药物组合物在制备用于降低HIV感染从感染HIV的妊娠期或哺乳期母亲向其子女传播的风险的药物的用途，其中，该核酸序列编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

49.如权利要求48所述的用途，其中，该药物组合物在产前、围产期和产后的至少一个阶段给药。

50.如权利要求48所述的用途，进一步包含给药抗逆转录病毒剂。

51.如权利要求50所述的用途，其中，该抗逆转录病毒剂选自非核苷逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、和进入抑制剂所组成的群组。

52.如权利要求51所述的用途，其中，该抗逆转录病毒剂包含高活性的抗逆转录病毒治疗。

53.如权利要求48所述的用途，进一步包含向该子女给药治疗有效量的该组合物。

54.如权利要求48所述的用途，其中，该序列进一步编码该HIV LTR启动子的增强子区域。

55.一种治疗有效量的包含核酸序列的药物组合物在制备用于给药药物组合物以防止未感染的受试者感染HIV的药物的用途，其中，该核酸序列编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

56.一种包含核酸序列的组合物，该核酸序列编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子至少含有HIV LTR启动子的核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在。

57.如权利要求56所述的组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶被优化用于人细胞内表达。

58.如权利要求56所述的组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是CRISPR/Cas。

59.如权利要求58所述的组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶是CRISPR/Cas9。

60.如权利要求58所述的组合物，其中，该CRISPR/Cas处于最小HIV LTR启动子的控制下。

61.如权利要求60所述的组合物，其中，在HIV复制的早期，该最小截短的HIV LTR启动子被即刻早期转录激活因子激活，从而有条件地激活CRISPR/Cas。

62.如权利要求56所述的组合物，进一步包含至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA。

63.如权利要求56所述的组合物，其中，该组合物进一步包含编码tracrRNA的序列。

64.如权利要求63所述的组合物，其中，该tracrRNA与编码向导RNA的序列融合。

65.如权利要求58所述的组合物，其中，该CRISPR/Cas切除病毒基因组的一段，该段跨越病毒启动子及/或病毒编码序列。

66.一种包含核酸序列的组合物，该核酸序列编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与病毒中靶标核酸序列互补的向导RNA，其中，该酶可操作地链接至截短的病毒启动子且该靶标核酸序列在该截短的病毒启动子中不存在，借此，在病毒复制的早期，该截短的病毒启动子处于即可早期转录活化在的控制下，从而有条件地激活CRISPR相关核酸内切酶。

67.如权利要求66所述的组合物，其中，该CRISPR相关核酸内切酶切除病毒基因组的一段，该段跨越病毒启动子及/或病毒编码序列。

68.一种试剂盒，其包含被测量的组合物，该组合物包含分离的核酸序列，该分离的核酸序列包含编码CRISPR相关核酸内切酶及至少一种与HIV中靶标核酸序列互补的向导RNA的序列，其中，该酶可操作地链接至截短的HIV LTR启动子，而该截短的HIV LTR启动子含有HIV LTR启动子的至少核心区域和TAR区域，以及其中，该靶标核酸序列在该截短的HIV LTR启动子中不存在，或该组合物包含编码该分离的核酸序列的载体；以及选自包装材料、包含使用说明书的包装插页、无菌流体、注射器、及无菌容器所组成群组的至少一项。