WO2007057618A2 - Promoteurs inductibles - Google Patents

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WO2007057618A2
WO2007057618A2 PCT/FR2006/051195 FR2006051195W WO2007057618A2 WO 2007057618 A2 WO2007057618 A2 WO 2007057618A2 FR 2006051195 W FR2006051195 W FR 2006051195W WO 2007057618 A2 WO2007057618 A2 WO 2007057618A2
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hiv
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PCT/FR2006/051195
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Jean-Claude Lefebvre
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Centre Hospitalier Universitaire De Nice
Universite De Nice - Sophia Antipolis
Association Pour Le Developpement Du Diagnostic Des Maladies Virales
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Publication date
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • C12N2799/00—Uses of viruses
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Definitions

  • the present invention relates to sustainably inducible promoters.
  • the phenomenon of silencing transcriptional expression vectors comprising a retroviral promoter is generally explained as being imposed by the transduced cell which modifies the methylation of the provirus DNA and the acetylation of the nucleosomes which are associates.
  • Transcriptional silencing explains the usual evolution of retroviral strains towards post-integrative latency. This phenomenon is actively studied, especially in HIV-1 infection, because it is responsible for the long-term maintenance of proviruses in the infected subject despite the often spectacular results obtained by combined chemotherapy (HAART), and does not allow therefore not complete eradication of the infection.
  • retroviral vectors in cell or gene therapy, may encounter the same phenomenon that causes the expression of transgenes to be extinguished.
  • the development of inducible vectors by the Tat protein of HIV-1 may have the same drawback since the promoters used are precisely copied on that of HIV-1.
  • the present invention now provides promoters that make it possible to escape the transcriptional silencing-type negative regulation. These promoters offer a very strong transcriptional activity and are inducible in the long run, that is to say that the inducibility is maintained without silencing. They also have the advantage of being completely silent in the absence of inductor. This useful property in therapy, can also be appreciated in vitro in differential expression assays where the total absence of 'background' is desired.
  • the escape of these promoters into transcriptional silencing and their strong inducibility by Tat protein makes them particularly useful for controlling the expression of targeted therapeutic genes against HIV-type retroviruses.
  • the invention is based on the following observations.
  • the LAI HIV-1 strain (Bru) belongs to the subtype B (van Opijnen, et al, 2004).
  • the promoter of this subtype, present in the 2 LTRs is characterized by the presence of 2 NF-kB sites followed by 3 Sp1 sites activatable by the corresponding cellular transcription factors, and a TAR regulatory sequence specific to all the strains.
  • HIV-1 and controlled by Tat viral transactivator protein Jeeninga, et al, 2000; Centlivre, et al, 2005), ( Figure 1A).
  • each of the 2 LTRs of HIV-1 comprises, successively from 5 'to 3', the 3 segments U3, R and U5.
  • the NF-kB and SP1 sites are localized at 3 'of U3 and the TAR loop-rod or at 5' of R.
  • U3-R region of HIV-1 grouping all the reasons of the invention.
  • the HIV-1 LAI strain has been maintained in uninterrupted replication for more than three years. This continued replication was made possible by the regular addition, twice a week, of 20% of fresh parental lymphoblastoid CEM cells.
  • the present invention provides a transcriptional promoter, characterized in that it is a nucleic acid comprising at least two NF-kB sites (preferably at least three NF-kB sites), at least one site PEA3, at least three SP1 sites, and at least two TAR sites.
  • the invention also provides a vector comprising such a promoter, and a host cell transfected with said vector.
  • the promoter can be used in sequence expression methods of interest (coding sequence or siRNA), the expression being governed by this promoter having the advantage of being inducible by Tat protein, or even by other exogenous agents, and not to suffer from
  • the promoter of the invention comprises two or three NF-kB sites, a PEA3 site, three SP1 sites and two or three TAR sites.
  • said sites come from HIV-1.
  • a promoter sequence comprising three NF-kB sites, a PEA3 site, three SP1 sites and three TAR sites is presented in the appendix (SEQ ID NO: 1).
  • a promoter sequence comprising two NF- ⁇ B sites, a PEA3 site, three SP1 sites, and two TAR sites is shown in the appendix (SEQ ID NO: 36).
  • TAR site denotes a nucleotide sequence specifically recognized by and capable of binding the Tat transcription factor.
  • the transcription of the HIV-1 provirus comprises a first conventional phase of initiation under the dependence of cellular factors such as NF-KB, SP1, and Ets which bind to the corresponding nucleotide motifs present in the 5 'LTR upstream of the TATA. box.
  • the transcription thus initiated starts immediately at the foot of the TAR loop rod (FIG. 1A), a nascent structure that will cause the transcription to stop in the absence of the Tat viral protein.
  • the second phase of elonqation therefore takes place under the influence of this viral factor.
  • This viro-viral 'dependence' poses a problem of understanding that can be solved for some authors by admitting the 'leaky' character of the HIV-1 promoter. Priming a Efficient elongation could occur through 'leakage' transcription capable of producing the first indispensable Tat molecules. The subtle play of transcriptional regulation of HIV-1 established between cellular factors and viral factor is conserved in the type of promoter described here, during the initiation of transcription and then greatly amplified.
  • NF-kB site denotes a DNA sequence specifically recognized by the family of NF- ⁇ B transcription factors, the Sp1 transcription factor and the PEA3 transcription factor family , respectively.
  • NF-kB, Sp1 and PEA3 transcription factors are cellular transcription factors encoded by the genome of the host cell.
  • Nuclear factors in the NF-kB family are transcription factors involved in the control of a variety of cellular processes such as immune response, inflammatory response, development, cell growth, and apoptosis.
  • Activation by NF- ⁇ B appears to be an important component in the regulation of the HIV-1 promoter since the deletion of the NF- ⁇ B sites results in a lack of activation of the 5'LTR by the classical activators of this pathway; TNF- ⁇ , IL-1 or even T-cell mitogens.
  • Sp1 is a transcription factor containing 3 zinc finger structures required for interaction with promoters of a wide variety of genes containing a pattern called GC box.
  • the SP1 factor modulates the transcription of the HIV-1 genes by binding to the three GC boxes adjacent to the TATA sequence included in the 5 'LTR. The deletion of these binding sites results in the production of a deficient HIV-1 provirus, demonstrating the critical role of Sp1 in the function of the HIV-1 promoter.
  • the proteins belonging to the PEA3 group are transcription factors belonging to the Ets family and which are expressed in several normal and tumoral tissues. Their precise role has not yet been fully defined but their activation via the Ras pathway has been reported. Two factor binding sites of the Ets family were identified in the HIV-1 LTRs. These Ets sites can activate the transcription of HIV-1 genes.
  • the promoter of the invention may further comprise one or more element (s) conferring an inducibility to an exogenous agent different from a Tat protein.
  • TetO tetracycline operator
  • TetO 2 short sequence capable of blocking a classical eukaryotic promoter by fixing the TetR repressor, see Berens C and Hillen W. 2003
  • the exogenous agent then being the tetracycline or a tetracycline analogue.
  • the tetracycline analogs are the tetracycline-related compounds which bind the TetR repressor with a Ka of at least 10 6 M -1 , preferably at least 10 9 M -1 .
  • the promoter comprises several TetO 2 elements, preferably from five to nine elements, more preferably seven elements.
  • nucleic acid vector comprising a promoter as defined above, operably linked to a sequence of interest, which is a coding sequence or siRNA.
  • a sequence of interest which is a coding sequence or siRNA.
  • it may be a retroviral vector, preferably whose U3-R domain (s) have been modified by said promoter.
  • the insertion of the U3-R region, comprising the original motifs, in the 3 'LTR makes it possible to obtain its copy in the 5' LTR (promoter itself) during the first retrotranscription and its maintenance in the all viral offspring.
  • the coding sequence of interest may typically be any DNA sequence that encodes a protein of therapeutic interest.
  • the coding sequence of interest may encode an inhibitory protein of integration or replication of HIV.
  • the coding sequence may also encode an immunogen or any recombinant or natural protein capable of inhibiting the replication of a virus or destroying the virus particles and the cells that replicate them.
  • SiRNAs are double-stranded RNA molecules, typically about twenty nucleotides in length, that induce an endogenous mechanism called RNA interference, leading to the specific degradation of siRNA sequence-homologous mRNA molecules.
  • RNA interference an endogenous mechanism leading to the specific degradation of siRNA sequence-homologous mRNA molecules.
  • the vector preferably comprises a TetR expression element, in addition to the sequence of interest.
  • the vectors described above are useful for transfecting host cells, that is to say transferring the nucleic acid they carry, transiently, or, preferably, stable (by integration into the genome of the cell host).
  • the host cell is preferably a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell.
  • Typical host cells are CHO, HeLa, 293T cells (human kidney cells), and NIH 3T3.
  • the host cells may also be patient cells. In this case, it may be more precisely hematopoietic progenitors taken from the host, transformed by ex vivo transgenesis and reintroduced into the host.
  • a particular aspect of the invention is an in vitro or ex vivo method of expression of a sequence of interest (coding sequence or siRNA), said method comprising the cultivation of a host cell comprising a vector such as defined above, under conditions allowing the induction of the promoter and the expression of the sequence of interest.
  • a sequence of interest coding sequence or siRNA
  • the cell is thus cultured in the presence of Tat protein molecules.
  • the Tat protein expressed by an infected cell is partly secreted. It can then be internalized by other neighboring cells and translocated into the nucleus. Being a descending cell of a precursor transformed using a cassette under the control of a promoter described in the present invention, the expression of the sequence of interest can then be induced either by infection of the transformed cell itself or via the Tat protein expressed by an infected neighborhood cell, and internalized by the transformed cell.
  • the protein of interest or siRNA the expression of which is under the control of a promoter activatable by the Tat protein, may act on the transformed cell itself and / or on neighboring cells.
  • a host cell comprising a vector whose promoter comprises TetO.sub.2 elements, said vector further comprising a TetR expression element, is cultured in the presence of tetracycline or a tetracycline analogue.
  • the host cell comprising a vector, whose promoter comprises TetO 2 elements, is transfected or cotransfected with a vector comprising a TetR expression element, and is cultured in the presence of tetracycline or a tetracycline analogue.
  • the host cell comprising a vector whose promoter comprises three NF-KB sites and two or three TAR sites, as well as seven TetO2 elements, is transfected or cotransfected with a vector comprising a TetR expression element. and is cultured in the presence of the Tat protein as well as tetracycline or a tetracycline analogue.
  • compositions comprising a vector as defined above, in association with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • vectors are particularly useful for the expression in vivo of the sequences of interest (coding or siRNA sequences), in the context of gene therapy, because of the total absence of background, of their very high level of expression. in the presence of inducer and the maintenance of their long-term inducibility without transcriptional silencing.
  • an inducibility agent tetracycline if appropriate
  • the inductibility is maintained without silencing.
  • a particular therapeutic application is anti-HIV therapy.
  • it is the Tat protein produced by the infected cells of the patient that induces the activation of the promoter and the expression of the sequence of interest, which is preferably a coding sequence for an inhibitory protein of integration. or HIV replication, or capable of destroying the virus and / or the cells that replicate it.
  • the induction of the promoter of the invention which drives this gene may require the simultaneous use of the two inducers Tat and Tetracycline.
  • the expression vector can be administered in naked form (see EP 465,529). Techniques of microinjection, electroporation, formulations using nanocapsules or liposomes are other techniques available.
  • the expression vector may also be in the form of a recombinant virus.
  • the viral vector may for example be chosen from an adenovirus, a retrovirus, in particular a lentivirus, as well as an adeno-associated virus (AAV), a herpes virus (HSV), a cytomegalovirus (CMV), a virus vaccinia, etc.
  • AAV adeno-associated virus
  • HSV herpes virus
  • CMV cytomegalovirus
  • virus vaccinia etc.
  • the recombinant virus is a defective virus.
  • FIG. 1A represents a diagram of the motifs of the U3-R domain of the wild-type HIV-1 Bru (LAI) strain, which surround the transcription start nucleotide +1;
  • FIG. 1B represents a sequence alignment of the domains
  • FIG. 1C represents a sequence alignment of the U3-R domains of the Bru (LAI) and 2xNF-kB + PEA3 + 3xSP1 + 2xTAR strains (SEQ ID NO: 36);
  • FIG. 2 represents the sequence of plasmid pBlue-
  • FIG. 3 represents the alignment of the 3 original TAR sequences (SEQ ID NO: 3, 4, and 5) of the 3 ⁇ N-3 ⁇ T promoter with the TAR sequence of the historical HIV-1 Bru (LAI) strain (SEQ ID NO: 6), and their secondary structuring into 3 successive loop stems.
  • the bottom of Figure 3 also shows the sequence of 3 NF-kB sites of the 3xN-3xT promoter.
  • the 3xN-3xT set was discovered in a variant strain that evolved spontaneously in vitro from the historical strain HIV-1 Bru (LAI);
  • FIG. 4 is a construction scheme of subclones pNL4.3
  • FIG. 5 is a comparative photograph of the immunofluorescence revelation of the intracellular p24 viral protein produced by CEM cells infected with the recombinant NL4.3NF 3 -TAR 3 and the wild-type pNL4.3;
  • 3N3T infected with the subclone whose U3-R was permuted with NL4.3NF 3 -TAR 3 );
  • FIG. 7 shows restriction maps of Clontech pRevTRE and pMSCVpuro vectors
  • Figure 8 shows restriction maps of pcDNA3 and pMV7-H-ras vectors
  • FIG. 9 represents a flow cytometry showing induction by Tat of inducible CEM cells
  • FIG. 10 represents a flow cytometry showing the induction by HIV-1LAI of the CEM cells transfected with pcPM ⁇ U3TAR 3 -tetO-CD24 or pMV7 ⁇ U3TAR 3 -tet0-CD24.
  • Each retroviral provirus LTR promoter contains the sequence U3-R-U5.
  • the provirus transcription initiation codon corresponds to the nucleotide (nt) +1 of the LTR5 'R-domain TAR-loop.
  • the length of the domain R is 97 nt, of which the first 59 for TAR).
  • the U3 region contains all the cellular polymerase II regulatory sequences and is therefore not present at the 5 'level of the viral RNAs transcribed from the provirus, which are encapsidated to give the infectious particles. After infection, proviruses are obtained after retrotranscription of the viral RNA.
  • the retrotranscription process necessarily involves a copying phase of the U3 domain of the LTR3 'to reconstruct the LTR5' starting with the repeated region R which, present at 5 'of the infectious RNA, can hybridize with the same region also present. 3 'of infectious RNA (Telesnitsky, A., and S. Goff. 1997).
  • This U3 domain contains all the regulatory sequences of the retroviral promoter. It is thus possible to make modifications to the LTR5 promoter by introducing them into the LTR3 'of the proviral molecular clone pNL4.3, knowing that they are necessarily copied during the first retrotranscription. As seen in FIG.
  • the region of the LTR3 'which contains the NF-KB, PEA3, SP1 and TAR sites is flanked by the Mrol and AfIII sites which are also found in the LTR5'.
  • the use of these sites to make the permutations thus makes it necessary to previously isolate the LTR3 'in an intermediate vector.
  • the pNL4.3 clone has the particularity of having been constructed from the 5 'half of the HIV-1 NY5 genome ligated to the 3' half of the HIV-1 BRU and to include different cell genomic sequences from both sides. other viral genome (Adachi, et al, 1986). Possibly, pNL4.3 contains the unique XhoI and NcoI sites located on either side of the single LTR3 '( Figure 4A).
  • the XhoI-NcoI segment of pNL4.3 was transferred into a specially prepared pGL2-Basic vector (Promega). The latter was previously deleted a large fragment between Xhol (located in the MCS) and BamHI (in the luciferase gene, useless in the developed application) to replace it with a linker containing an Ncol site ( Figure 4B), with the aid of the 2 primers: ⁇ '-TCGAGCATATGTCGCGAACTAGTCCATG-S '(SEQ ID NO: 7) and 5'-GATCCATGGACTAGTTCGCGACATATGC-3' (SEQ ID NO: 8) to give the linker represented below, comprising several sites of restriction in addition to Ncol, and otherwise useful: 1 J CGAG CA 1 JA 1 JG 1 J CG CG AA C 1 JAG 1 . 1 C CA 1 JG
  • This procedure also makes it possible to delete the 2 unwanted Mrol sites from the luciferase gene (FIG. 4B).
  • the different Mrol-AfIII segments (FIG. 4A, segments b, c, d, e), obtained by PCR, were exchanged with their homolog of pNL4.3 (FIG. 4A, segment a) to give as many infectious variant subclones. .
  • These clones are transfected into HEK-cells 293 using the MBS MAMMALIAN TRANSFECTION KIT (Stratagene). A single complete cycle of replication, generating infectious particles, then takes place in these cells, and the culture supernatants allow to infect CEM T cells whose viral production has been monitored quantitatively and over time.
  • NL4.3NF3-TAR3 constructed with the U3-R segment containing 3 NF-KB sites + 1 PEA3 site + 3 SP1 sites + 3 TAR domains (NL4.3NF3-TAR3) have the following original properties:
  • A-NL4.3NF3-TAR3 drives a very increased expression of viral proteins.
  • the demonstration was made by the intracellular detection of the viral gag protein. The cells were washed twice with PBS and then treated with 1% paraformaldehyde solution in PBS for 20 minutes.
  • the 7xtetO 2 motif was constructed in pBlueScript (Stratagene) by successive addition of the unit sequence TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO: 13) or its multiples.
  • the oligonucleotides (synthesized by Proligo): 5'-CTAGGTCCCTATCAGTGATAGAGACTAGTCACGTG-3 '(SEQ ID NO: 14) and ⁇ '-GATCCACGTGACTAGTCTCTATCACTGATAGGGAC-S' (SEQ ID NO: 15) give the double strand tetO2 (in bold in the diagram below). below), framed by restriction sites useful for the formation of tandems: 5 '-CTAGGTCCCTATCAGTGATAGAGACTAGI 1 CACGI 1 G- 3'
  • CAG the double strand tet ⁇ 2 designated above, and which has the 5 'and 3' BamHI cohesive ends, can be ligated between the Spel and BamHI sites of pBlueScript, with the consequence that the Spel site of pBlueScript is lost. in 5 '. It then becomes possible to ligate a new TetO 2 segment between the Spe site 3 'of the previous TetO 2 and the Bam HI site of pBlueScript. The operation can be repeated with the double strand TetO2 or with multiples of the latter. From 2xtetO 2 , it is possible to build 3xtetO 2 .
  • a set of 4xtetO 2 is obtained by taking a 2xtetO 2 from a pBlueScript by Xbal (located immediately upstream of the original Spel site) and BamHI, and by religating it in another 2xtetO 2 construct opened by Spel and BamHI, in knowing that Xbal is also compatible (TCTAGA) with Spel. According to the same procedure, a set of 7xtetO 2 is finally obtained by associating a 3xtetO 2 with a 4xtetO 2 . The resulting construction is called pBlue-tetO. Note: Multiple cloning site of pBlueScript:
  • retroviral vectors The interest of retroviral vectors is well established. Their own promoter (LTR5 ') is usually the one used for the transcription of the gene or genes of interest inserted into the vector. When the use of an exogenous promoter is envisaged, it is necessary to inactivate the own promoter of the vector. The strategy of the self-inactivating retrovirus is then exploited. To obtain a retroviral vector of the self-inactivating type, it is necessary to delete as much as possible of the U3 domain of its LTR3 '. This domain indeed contains all the enhancer motifs of the LTR promoter. In doing so, the conserved LTR5 'will be functional to ensure the transcription of the long infectious retroviral RNAs that will be produced in the packaging cells.
  • the 2 LTRs of pRevTRE have the same restriction sites. To delete the U3 domain of LTR3 ', it is therefore necessary to isolate it in an intermediate plasmid, which is carried out here during the 1st step.
  • 1st step Modification of pRevTRE (Clontech): deletion of the fragment LTR5 '+ ⁇ + Hygro + pCMVtetO, by Sspl + HpaI + XhoI cuts, religation and transformation in the bacteria to obtain by amplification the single half-plasmid containing CoIEI and the only LTR3 '(p ⁇ RevTRE).
  • 2nd step Deletion of almost the entire U3 segment of the LTR3 'from pDRevTRE by Nhel-BssHII (366 nt), and religation by inserting a linker containing the unique Notl, PmII and Muni sites, using the 2 oligos:
  • the XmnI-Clal fragment is extracted from pMSCVpuro (LTR5 + MC + Ppkg + Puro r ) and inserted into p ⁇ RevTRE modified and cleaved with the same endonucleases, to give pcSIN ⁇ U3.
  • 2nd step Flanking the U3-R + 7xtetO 2 block, 2 BstUI sites are present, one upstream of Notl and the other downstream of Apal (see the MCS note of pBlueScript), but absent from the block. This is thus extracted from the vector pBlue-U3TAR3tetO using BstUI (CGiCG) at 5 'and Apal at 3', and ligated between Hpal and Apal in the PCM of pcPM ⁇ U3 to give the pcPM ⁇ U3TAR 3 -tet0. Construction of the self-inactivating vector pMV7 2xinductible
  • 3rd step Deletion of the NheI-SacI segment of LTR3 'in pcDNAD3-LTR and religation using a linker constituted by hybridization of the 2 oligonucleotides 5OTAGCTGACTGACTGACGAGCT-3' (SEQ ID NO: 20) and
  • 4th step Reinsertion of the LTR3 'deleted in pMV7 between Sspl and RsrII, to give pMV7 ⁇ U3.
  • 5th step Extension of the multiple cloning site pMV7 between EcoRI and HindIII with the effect of eliminating the H-ras gene.
  • the NotI-HpaI-Nsil extension is carried out using the two oligonucleotides:
  • pMV7 ⁇ U3MCS The same extension of the multiple cloning site is carried out on the original pM7 vector, not deleted from the U3-LTR3 ', to obtain the pMV7MCS which is used to express the Tat protein.
  • Step 6 Construction of the 3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR + 7xtetO 2 block, taken out of pBlue-U3TAR 3 tet0 by NotI + EcoRV (blunt), and inserted between NotI and Hpal in pMV7 ⁇ U3MCS, to give pMV7 ⁇ U3TAR 3 -tet0. Construction of the self-inactivating CMV-Tet-inducible vector
  • IRES Internai Ribosomal Entry Sequence
  • Construction of the IRES-TAT block 1st step Excision of the Tk-NeoR block of the pMV7MCS vector by CIaI cleavage and religation.
  • PCR 1 cDNA of Poliovirus serotype 1 IRES (Pelletier, J., and N. Sonenberg, 1988) on viral RNAs, obtained at the virology laboratory of the Nice University Hospital from a strain isolated from a patient , by RT-PCR using the OneStep kit from QIAGEN Company, with the primers: IRES- ⁇ '-GAATTCTAACTTAGACGCACAAAACCAAGTT-S '(EcoRI site underlined) (SEQ ID NO: 26) and
  • IRES-AS ⁇ '-TATGATACAATTGTCTGATTGAAATAACTGTT-S '(SEQ ID NO: 27) - PCR 2 TAT cDNA by RT-PCR on the mRNAs of the CEM line infected with the HIV-1 LAI strain and producing for more than three years interview, with the leaders:
  • IRES / TAT-S ⁇ '-CAGACAATTGTATCATAATGGAGCCAGTAGATCC-a '(SEQ ID NO: 28) (The underlined double segment at 5' corresponds to the 3 'end of TIRES, the underlined single segment corresponds to the end 5 'of TAT, these 2 welded segments will link TIRES to TAT in final PCR) and TAT-AS 5'-GTTAACCCTTCTTCTTCTATTCCTTCGGG-S' (Hpal site underlined) (SEQ ID NO: 29).
  • RT-PCR 1 and 2 a 3rd PCR is carried out with the primers IRES-S and TAT-AS.
  • the two types of amplicons are lengthened during the first cycles of PCR and then amplified.
  • 3rd step the IRES-TAT amplicons are subcloned into the PCRII-TOPO vector and sequenced.
  • the IRES-TAT segments are taken up by EcoRI and HpaI cleavages to be inserted between the same sites in pMV7MCS deleted from its Tk-NeoR block, to give pMV7MCS-IRES-Tat.
  • IRES2-S 5'-ATGCATG ACACTCCACCATGAATCACTCC-3 '(Nsil underlined site) (SEQ ID NO: 30) and IRES-AS 5'-GATGCACGGTCTACGAGACCTCC-3' (SEQ ID NO: 31).
  • the IRES-NeoR segments are taken up by Nsil and HindIII cleavages to be inserted between the same sites in pMV7MCS-IRES-Tat, downstream of the IRES-TAT block, to give the pMV7-2xlRES-Tat-NeoR.
  • HEK-293 cells are transfected with the pMV7-2xlRES-Tat-NeoR construct, and then selected by G418. TAT mRNA production is controlled by RT-PCR (One-Step). Expression of the Tat protein is verified by Western-Blot on cell extracts using the polyclonal HIV-1 antibody BH10 Tat Antiserum kindly provided by the AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH). Construction of the inducible Tat + Tet vector in the pECE plasmid vector (pcPECE-TAR 3 -tet0)
  • the pECE vector (Ellis, et al., 1986) contains an SV40 promoter and SV40 polyadenylation promoter array flanking the BglII-HindIII-SalI-KpnI-SmaI-EcoRI-SstI-Xbal cloning site.
  • the SV40 promoter was deleted by the Pvull (blunt) + BglII cuts and replaced by block U3-R block (3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR) taken from pBlue-U3TAR 3 tet0 by EcoRV (blunt) + BamHI cleavage (compatible with BgIII). 2xinducible promoter constructs + murine CD24 reporter gene
  • BamHI was inserted into the pcPM ⁇ U3TAR 3 -tet0 and into the pcPM ⁇ U3CMV-tetO, downstream of the promoter between the same sites.
  • the murine CD24 (mCD24), a membrane glycoprotein of the lymphocyte, also called Heat-Stable Antigen (HSA) was chosen because of its total neutrality on the behavior of the T lymphoblast. This marker is widely used as a reporter gene in control tests. of HIV production or expression of lentiviral vectors
  • MCD24 was revealed in two steps using the anti-mouse monoclonal antibody CD24 5BD (Biosciences Pharmingen) diluted 1: 100, followed by FITC-conjugated anti-rat rabbit immunoglobulin reagent.
  • the TAR 3 -tetO promoter is not subjected to transcriptional silencing.
  • EMCs pcPM ⁇ U3TAR 3 -tet0-CD24 were maintained in culture for more than 10 months without any inducer. The lack of expression of the CD24 marker was monitored throughout this period.
  • HIV-1 induction Infection of the EMFs pcPM ⁇ U3TAR 3 -tet0-CD24 or pMV7 ⁇ U3TAR 3 -tet0-CD24 by the HIV-1 LAI itself produced an induction much more important, progressive, and maximal from the 6th day after infection.
  • Example 3 Analysis of the 2xNF-kB + PEA3 + 3xSP1 + 2xTAR Promoter (also referred to as NF 2 -PEA3-TAR 2 ).
  • U3-R region of pNL4.3 was replaced by U3-R NF2-PEA3-TAR2 to give the NL4.3NF2-PEA3-TAR2 construct.
  • These two LTRs have a PEA3 site, but NL4.3NF2-PEA3-TAR2 has only two NF-KB sites like the original Bru strain.
  • the retroviral vectors modified in their LTRs and described in the present invention can be used to specifically target the cells infected by the various HIV, HCV, Dengue ... viruses whose envelope glycoprotein is decorated with high mannose type oligosaccharides, and to also target tumor cells that express Lewis-x and / or Lewis-y type oligosaccharides.
  • These different oligosaccharides are recognized by the DC-SIGN lectin, a membrane receptor naturally expressed by dendritic cells that use it to internalize HIV, or by hepatic endothelial sinusoidal cells for HCV.
  • DC-SIGN lectin a membrane receptor naturally expressed by dendritic cells that use it to internalize HIV
  • hepatic endothelial sinusoidal cells for HCV Among the various strategies for preparing retroviral vectors, it is common to resort to the practice of pseudotyping.
  • the cDNA referred to herein as DC-COMP, was cloned into pCRII-Topo (Invitrogen) and sequenced (see SEQ ID No. 39). The sequence of the complete isoform obtained was 100% similar as deposited in GenBank under N 0 AF290886.
  • the nonapeptide was inserted into the original DC-SIGN sequence by removing alanine (between the 2 helices of the lectin domain), downstream of glycine at position 288 on the human sequence of DC-SIGN (Mummidi et al., 2001 ) and by inserting 2 prolines downstream of the nonapeptide itself, so as to restore the environment of the nonapeptide present in the Tat protein.
  • the two primers PoIyB-DC defined below, partially hybridize with each other, and both with the connection sequences of the DC-SIGN, according to the above representation.
  • DC-COMP and DC-COMP-NONA were inserted into the pcDNA3 vector (Invitrogen) between the HindIII and XbaI sites (clones pc-DC and pc-DC-NONA). They were transfected into GP2-293 (CLONTECH) packaging cells.
  • Vpr Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R
  • DC-SIGN1 membrane-bound and soluble cell-specific dendritic ICAM-3-nonintegrin graft grabbing 1
  • DC-SIGN2 DC-SIGN2 isoforms. Inter-individual variation in expression of DC-SIGN transcripts. J. Biol. Chem. 276: 33196-33212. Pelletier, J., and N. Sonenberg. 1988. Introduction to translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature 334: 320-325.
  • Human immunodeficiency virus type 1 subtypes has a distinct long terminal repeat that determines the replication rate in a host-cell-specific manner. J. Viral. 78: 3675-3683.

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Abstract

L'invention concerne un promoteur transcriptionnel, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un acide nucléique comprenant au moins deux sites NF-kB, au moins un site PEA3, au moins trois sites SP1 et au moins deux ou trois sites TAR, accessoirement sept éléments TetO<SUB>2</SUB>, ce promoteur permettant l'expression inductible de séquences d'intérêt.

Description

Promoteurs inductibles
La présente invention a trait à des promoteurs à inductibilité maintenue. Le phénomène de mise sous silence ('silencing') transcriptionnel des vecteurs d'expression comportant un promoteur rétroviral est généralement expliqué comme étant imposé par la cellule transduite qui modifie la méthylation de l'ADN du provirus et l'acétylation des nucléosomes qui lui sont associés. Le silencing transcriptionnel explique l'évolution habituelle des souches rétrovirales vers la latence de type post-intégrative. Ce phénomène est activement étudié, en particulier dans l'infection par le HIV-1 , car il est responsable du maintien au long cours des provirus chez le sujet infecté malgré les résultats souvent spectaculaires obtenus par la chimiothérapie combinée (HAART), et ne permet donc pas l'éradication complète de l'infection. L'utilisation de vecteurs rétroviraux, en thérapie cellulaire ou génique, peut se heurter à ce même phénomène qui provoque l'extinction de l'expression des transgènes. La mise au point de vecteurs inductibles par la protéine Tat du HIV-1 peut présenter le même inconvénient puisque les promoteurs utilisés sont précisément copiés sur celui du HIV-1. La présente invention fournit maintenant des promoteurs qui permettent d'échapper à la régulation négative de type silencing transcriptionnel. Ces promoteurs offrent une très forte activité transcriptionnelle et sont inductibles au long cours, c'est-à-dire que l'inductibilité est maintenue sans mise sous silence. Ils ont de plus l'avantage d'être totalement silencieux en l'absence d'inducteur. Cette propriété utile en thérapie, peut également être appréciée in vitro dans les essais d'expression différentielle où l'absence totale de 'bruit de fond' est souhaitée.
L'échappement de ces promoteurs au silencing transcriptionnel et leur forte inductibilité par la protéine Tat les rend particulièrement utiles pour contrôler l'expression de gènes thérapeutiques ciblés contre des rétrovirus du type HIV. L'invention est basée sur les observations suivantes. La souche HIV-1 LAI(Bru) appartient au sous-type B (van Opijnen, et al, 2004). Le promoteur de ce sous-type, présent dans les 2 LTR, est caractérisé par la présence de 2 sites NF-kB suivis de 3 sites Sp1 activables par les facteurs transcriptionnels cellulaires correspondants, et d'une séquence régulatrice TAR propre à toutes les souches HIV-1 et contrôlée par la protéine transactivatrice virale Tat (Jeeninga, et al, 2000 ; Centlivre, et al, 2005), (Figure 1A).
Selon l'organisation générale de tous les rétrovirus, chacun des 2 LTRs de HIV-1 comporte, successivement de 5' en 3', les 3 segments U3, R et U5. Les sites NF-kB et SP1 sont localisés en 3' de U3 et la ou les tiges-boucles TAR en 5' de R. Dans le contexte de la présente demande, il est fait référence à la région U3-R de HIV-1 regroupant l'ensemble des motifs propres à l'invention. La souche HIV-1 LAI a été maintenue en réplication ininterrompue pendant plus de trois ans. Cette réplication continue a été rendue possible grâce à l'ajout régulier, 2 fois par semaine, de 20% de cellules lymphoblastoïdes CEM parentales fraîches. En effet, sans ce type de précaution, la réplication du HIV-1 diminue progressivement après infection de cellules neuves, et s'arrête complètement après quelques semaines seulement de réplication (Li, et al, 1996 ; Song, et al, 1996 ; Lassen, et al, 2004). Il s'agit du phénomène bien connu de l'entrée en latence. Le séquençage des LTR de la souche LAI, tout au long de son maintien en réplication, a montré une évolution tout à fait inattendue. Une puis deux séquences TAR complètes ont été trouvées insérées dans la continuité immédiate de la séquence TAR originelle; de plus, un troisième site NF-KB supplémentaire a également été trouvé inséré entre les 2 sites NF-KB originels (Figure 1 B). Les 3 sites SP1 ont été constamment retrouvés. Enfin, un site PEA3 (AGGAAG), inhabituel dans les LTR HIV-1 , généré par une mutation G->A dans le site SP1-III a régulièrement été retrouvé dans les LTR des variants LAI après trois années de culture (Figures 1 , 2, 3). Les différentes combinaisons, listées ci-dessous, ont pu être détectées par sous-clonage à différents temps de la culture continue: 2xNF-KB + 3xSP1 + IxTAR
2xNF-KB + 3xSP1 + 2xTAR
2xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR
3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + IxTAR 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 2xTAR
3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR
De façon inattendue, il a été observé qu'après 3 années de réplication, l'entrée en latence de la souche LAI n'était plus obtenue, même après plus de 20 mois de culture sans ajout de cellules CEM parentales. Or dans les conditions habituelles d'infection de ces cellules CEM, l'extinction de la réplication est observée après quelques semaines seulement de production virale (Song, et al, 1996). Toutes les séquences LTR obtenues par PCR sur les souches obtenus après trois années de culture continue contenaient 3 sites NF- KB, 1 site PEA3 ainsi que 2 ou 3 séquences TAR. L'apparition des nouveaux variants s'accompagnait d'une surproduction virale importante, appréciée par l'évaluation du taux de protéine virale p24 en intra- et extra-cellulaire, ainsi que par l'augmentation de la production virale proprement dite dans les surnageants de culture, mesurée à plus de 102 fois supérieure à celle observée avec la souche LAI sauvage. Les sous-clonages ont été poursuivis et un nouveau type de promoteur a pu être clone; sa région U3-R contient la combinaison de sites suivante:
2xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 2xTAR
Comme le montre le nouveau promoteur détecté, contenant 2xNF-KB + 1xPEA3 + 3xSP1 + 2xTAR, l'adjonction du site PEA3 sur la séquence Bru sauvage permet, de manière inattendue, d'expliquer à elle seule l'augmentation de la transcription de fuite.
Sur cette base, la présente invention fournit un promoteur transcriptionnel, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un acide nucléique comprenant au moins deux sites NF-kB (de préférence au moins trois sites NF-kB), au moins un site PEA3, au moins trois sites SP1 , et au moins deux sites TAR. L'invention fournit également un vecteur comprenant un tel promoteur, et une cellule hôte transfectée avec ledit vecteur.
Le promoteur peut être mis à profit dans des procédés d'expression de séquence d'intérêt (séquence codante ou siRNA), l'expression étant gouvernée par ce promoteur présentant l'avantage d'être inductible par la protéine Tat, voire aussi par d'autres agents exogènes, et de ne pas subir de phénomène de
« mise sous silence ». De plus, en l'absence d'inducteur, le promoteur reste totalement muet. Enfin, après induction, le niveau de transcription est extrêmement élevé. Ces propriétés peuvent être mises à profit pour le contrôle de l'expression de gènes d'intérêt dans les systèmes d'étude in vitro ainsi que dans les procédures de transgénèse ex vivo ou in vivo.
Eléments du promoteur
De préférence, le promoteur de l'invention comprend deux ou trois sites NF-kB, un site PEA3, trois sites SP1 et deux ou trois sites TAR.
Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites proviennent de HIV- 1. Une séquence de promoteur comprenant trois sites NF-kB, un site PEA3, trois sites SP1 et trois sites TAR est présentée en annexe (SEQ ID NO :1). Une séquence de promoteur comprenant deux sites NF-kB, un site PEA3, trois sites SP1 , et deux sites TAR est représentée en annexe (SEQ ID NO :36).
On désigne par « site TAR » une séquence nucléotidique reconnue spécifiquement par, et capable de fixer, le facteur de transcription viral Tat. La transcription du provirus HIV-1 comporte une première phase classique d'initiation sous la dépendance de facteurs cellulaires tels que NF-KB, SP1 , et Ets qui se fixent sur les motifs nucléotidiques correspondants présents dans le LTR 5' en amont de la TATA box. La transcription ainsi initiée démarre immédiatement au pied de la tige boucle TAR (Figure 1A), structure naissante qui va provoquer l'arrêt de la transcription en l'absence de la protéine virale Tat. La deuxième phase d'élonqation se déroule donc sous la dépendance de ce facteur viral. Cette 'auto-dépendance' viro-virale pose un problème de compréhension que l'on peut résoudre pour certains auteurs en admettant le caractère 'de fuite' (« leaky ») du promoteur HIV-1. L'amorçage d'une élongation efficace pourrait se produire grâce à une transcription 'de fuite' capable de produire les premières molécules Tat indispensables. Le jeu subtil de régulation de la transcription du HIV-1 établi entre facteurs cellulaires et facteur viral est conservé dans le type de promoteur décrit ici, au cours de l'amorçage de la transcription puis considérablement amplifié.
Les expressions «site NF-kB», «site SP1 » et «site PEA3» désignent une séquence d'ADN reconnue spécifiquement par la famille de facteurs de transcription NF-kB, le facteur de transcription Sp1 et la famille de facteurs de transcription PEA3, respectivement. Les facteurs de transcription NF-kB, Sp1 et PEA3 sont des facteurs de transcription cellulaires codés par le génome de la cellule hôte.
Les facteurs nucléaires de la famille NF-kB sont des facteurs de transcription impliqués dans le contrôle d'une variété de processus cellulaires tels que la réponse immunitaire, la réponse inflammatoire, le développement, la croissance cellulaire et l'apoptose. L'activation par NF-kB semble être une composante importante dans la régulation du promoteur de HIV-1 puisque la délétion des sites NF-kB entraîne une absence d'activation du LTR 5' par les activateurs classiques de cette voie, c'est à dire le TNF-α, l'IL-1 ou encore les mitogènes des cellules T. Sp1 est un facteur de transcription contenant 3 structures en doigt de zinc requises pour l'interaction avec les promoteurs d'une grande variété de gènes contenant un motif appelé boîte GC. Le facteur SP1 module la transcription des gènes de HIV-1 par liaison aux trois boîtes GC adjacentes à la séquence TATA comprises dans le LTR 5'. La délétion de ces sites de liaison a pour résultat la production d'un provirus HIV-1 déficient, ce qui démontre le rôle critique de Sp1 dans la fonction du promoteur de HIV-1.
Les protéines membres du groupe PEA3 sont des facteurs de transcription appartenant à la famille Ets et qui sont exprimées dans plusieurs tissus normaux et tumoraux. Leur rôle précis n'a pas encore été complètement défini mais leur activation par la voie Ras a été rapportée. Deux sites de liaison aux facteurs de la famille Ets ont été identifiés dans les LTR de HIV-1. Ces sites Ets peuvent activer la transcription des gènes de HIV-1. Selon un mode de réalisation particulier, le promoteur de l'invention peut en outre comprendre un ou plusieurs élément(s) conférant une inductibilité à un agent exogène différent d'une protéine Tat.
Il peut s'agir notamment d'éléments TetO (opérateur tétracycline) ou TetO2 (courte séquence capable de bloquer un promoteur eucaryote classique en fixant le répresseur TetR, voir Berens C and Hillen W. 2003), l'agent exogène étant alors la tétracycline ou un analogue de tétracycline. Les analogues de tétracycline sont les composés apparentés à la tétracycline et qui lient le répresseur TetR avec un Ka d'au moins 106 M"1, de préférence d'au moins 109 M"1 . Des exemples d'analogues de tétracycline sont connus (voir notamment Hlavka and Boother, "The Tetracyclines," IN: Handbook of Expérimental Pharmacology 78, R. K. Blackwood et al. (eds.), Springer-Verlag, Berlin-N.Y., 1985). De préférence, le promoteur comprend plusieurs éléments Tetθ2, de préférence de cinq à neuf éléments, de préférence encore sept éléments.
Vecteurs
Un autre aspect de l'invention vise un vecteur d'acide nucléique, comprenant un promoteur tel que défini ci-dessus, lié de manière opérante à une séquence d'intérêt, qui est une séquence codante ou un siRNA. Selon un mode de réalisation particulier, il peut s'agir d'un vecteur rétroviral, de préférence dont le ou les domaines U3-R ont été modifiés par ledit promoteur. Dans ce cas, l'insertion de la région U3-R, comportant les motifs originaux, dans le LTR 3' permet d'obtenir sa copie dans le LTR 5' (promoteur proprement dit) au cours de la première rétrotranscription et son maintien dans toute la descendance virale. Alternativement, et préférentiellement, il peut s'agir d'un vecteur rétroviral autoinactivant (dont la séquence U3-R du LTR 3' a été délétée et non remplacée), dans lequel le promoteur de l'invention est inséré en situation médiane, en dehors des LTR. Il est ainsi possible de supprimer l'éventuelle activité promotrice du LTR 3' sur des gènes cellulaires de proximité. La séquence codante d'intérêt peut être typiquement toute séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt thérapeutique. Par exemple, la séquence codante d'intérêt peut coder pour une protéine inhibitrice de l'intégration ou de la réplication de HIV. La séquence codante peut aussi coder pour un immunogène ou pour toute protéine recombinante ou naturelle capable d'inhiber la réplication d'un virus ou de détruire les particules virales et les cellules qui les répliquent. Les siRNA sont des molécules ARN doubles brins, typiquement d'environ une vingtaine de nucléotides en longueur, qui provoquent l'induction d'un mécanisme endogène appelé ARN interférence, conduisant à la dégradation spécifique des molécules des ARNm homologues en séquence aux siRNA. Ce système original est maintenant largement reconnu et utilisé comme outil de biologie moléculaire du fait de son efficacité et de sa spécificité d'action.
Lorsque le promoteur comprend un élément TetO2, le vecteur comprend de préférence un élément d'expression TetR, en plus de la séquence d'intérêt.
Cellules hôtes
Les vecteurs décrits ci-dessus sont utiles pour transfecter des cellules hôtes, c'est-à-dire transférer l'acide nucléique qu'ils portent, de manière transitoire, ou, de préférence, stable (par intégration dans le génome de la cellule hôte).
La cellule hôte est de préférence une cellule eucaryote, de préférence de mammifère. Des cellules hôtes typiques sont les cellules CHO, HeLa, 293T (cellules rénales humaines), et NIH 3T3.
Les cellules hôtes peuvent être aussi des cellules de patients. Dans ce cas, il peut s'agir plus précisément de progéniteurs hématopoïétiques prélevés chez l'hôte, transformées par transgénèse ex vivo et réintroduits chez l'hôte.
Expression in vitro ou ex vivo
Un aspect particulier de l'invention est un procédé in vitro ou ex vivo d'expression d'une séquence d'intérêt (séquence codante ou siRNA), ledit procédé comprenant la culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant l'induction du promoteur et l'expression de la séquence d'intérêt.
Ces conditions impliquent notamment soit l'utilisation d'un agent d'inductibilité exogène, soit la production d'un agent d'inductibilité par la cellule hôte elle-même. De préférence, la cellule est ainsi cultivée en présence de molécules de protéine Tat. La protéine Tat, exprimée par une cellule infectée est en partie sécrétée. Elle peut être ensuite internalisée par d'autres cellules de voisinage et être transloquée dans le noyau. S'agissant d'une cellule descendant d'un précurseur transformé à l'aide d'une cassette sous contrôle d'un promoteur décrit dans la présente invention, l'expression de la séquence d'intérêt peut alors être induite soit par infection de la cellule transformée elle- même ou par l'intermédiaire de la protéine Tat exprimée par une cellule de voisinage infectée, et internalisée par la cellule transformée. De même, la protéine d'intérêt ou le siRNA, dont l'expression est sous la dépendance d'un promoteur activable par la protéine Tat, peut agir sur la cellule transformée elle- même et/ou sur les cellules de voisinage.
On peut aussi utiliser d'autres agents exogènes. Selon un mode de réalisation particulier, une cellule hôte comprenant un vecteur, dont le promoteur comprend des éléments Tetθ2, ledit vecteur comprenant en outre un élément d'expression TetR, est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. De manière alternative, la cellule hôte comprenant un vecteur, dont le promoteur comprend des éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément d'expression TetR, et est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule hôte comprenant un vecteur, dont le promoteur comprend trois sites NF-KB et deux ou trois sites TAR, ainsi que sept éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément d'expression TetR, et est cultivée en présence de la protéine Tat ainsi que de la tétracycline ou d'un analogue de tétracycline.
Applications thérapeutiques L'invention fournit également des compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur tel que défini précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ces vecteurs sont particulièrement utiles pour l'expression in vivo des séquences d'intérêt (séquences codantes ou siRNA), dans le cadre de thérapie génique, en raison de l'absence totale de bruit de fond, de leur très haut niveau d'expression en présence d'inducteur et du maintien de leur inductibilité au long cours sans silencing transcriptionnel.
L'administration d'un agent d'inductibilité (la tétracycline le cas échéant), provoque l'expression des séquences portées par le vecteur. L'inductibilté est maintenue sans mise sous silence.
Une application thérapeutique particulière est la thérapie anti-HIV. Dans ce cas, c'est la protéine Tat produite par les cellules infectées du patient qui induit l'activation du promoteur et l'expression de la séquence d'intérêt, qui est de préférence une séquence codant pour une protéine inhibitrice de l'intégration ou de la réplication de HIV, ou capable de détruire le virus et/ou les cellules qui le répliquent.
En fonction du gène d'intérêt, et en particulier de sa séquence nucléotidique, l'induction du promoteur de l'invention qui pilote ce gène peut nécessiter l'utilisation simultanée des deux inducteurs Tat et Tétracycline.
Le vecteur d'expression peut être administré sous forme nue (voir EP 465 529). Des techniques de microinjection, électroporation, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. Le vecteur d'expression peut également être sous la forme d'un virus recombinant. Le vecteur viral peut être par exemple choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès (HSV), un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légendes des figures :
- La figure 1 A représente un schéma des motifs du domaine U3-R de la souche HIV-1 Bru (LAI) sauvage, qui encadrent le nucléotide +1 de départ de transcription; - La figure 1B représente un alignement de séquences des domaines
U3-R des souches Bru(LAI) et 3xN-3xT (SEQ ID NO :1 );
- La figure 1C représente un alignement de séquences des domaines U3-R des souches Bru (LAI) et 2xNF-kB+PEA3+3xSP1+2xTAR (SEQ ID NO :36); - La figure 2 représente la séquence du plasmide pBlue-
U3TAR3tetO (SEQ ID NO :2);
- La figure 3 représente l'alignement des 3 séquences TAR originales (SEQ ID NO : 3, 4, et 5) du promoteur 3xN-3xT avec la séquence TAR de la souche HIV-1 Bru (LAI) historique (SEQ ID NO :6), et leur structuration secondaire en 3 tiges boucles successives. Le bas de la Figure 3 montre également l'enchaînement des 3 sites NF-kB du promoteur 3xN-3xT. L'ensemble 3xN-3xT a été découvert dans une souche variante ayant évolué spontanément in vitro à partir de la souche historique HIV-1 Bru (LAI);
- La figure 4 est un schéma de construction des sous-clones pNL4.3 ; - La figure 5 est une photographie comparative de la révélation par immunofluorescence de la protéine virale p24 intracellulaire produite par des cellules CEM infectées avec le recombinant NL4.3NF3-TAR3 et le pNL4.3 sauvage ;
- La Figure 6 montre une cytométrie de flux (contrôle = CEM non infectées ; pNL4.3 = infectées par le clone moléculaire sauvage ; pNL
3N3T = infectées par le sous-clone dont le U3-R était permuté avec NL4.3NF3-TAR3) ;
- La Figure 7 montre des cartes de restriction des vecteurs pRevTRE et pMSCVpuro de Clontech ; - La Figure 8 montre des cartes de restriction des vecteurs pcDNA3 et pMV7-H-ras ; - La Figure 9 représente une cytométrie de flux montrant l'induction par Tat de cellules CEM inductibles ;
- La Figure 10 représente une cytométrie de flux montrant l'induction par le HIV-1LAI des cellules CEM transfectées par pcPMΔU3TAR3- tetO-CD24 ou pMV7ΔU3TAR3-tet0-CD24.
Exemples :
Exemple 1 : Démonstration moléculaire du rôle joué par le promoteur 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR dans le maintien de la réplication sans évolution vers le silencing transcriptionnel
Afin de démontrer le rôle précis joué par le bloc promoteur comportant les sites 3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR, cet assemblage ainsi que les séquences apparentées ont été analysés en les construisant dans le clone moléculaire HIV-1 infectieux pNL4.3 (Adachi, et al, 1986). Ainsi, un même génome HIV-1 se trouvait être modifié dans sa seule région U3-R, permettant donc d'analyser les effets induits par cette seule région.
Matériels et méthodes
Chaque promoteur LTR de provirus rétroviral contient l'enchaînement U3-R-U5 . Le codon d'initiation de transcription du provirus correspond au nucléotide (nt) +1 de la tige-boucle TAR du domaine R du LTR5'. La longueur du domaine R est de 97 nt dont les 59 premiers pour TAR). La région U3 contient toutes les séquences régulatrices de la polymérase II cellulaire et n'est donc pas présente au niveau 5' des ARN viraux transcrits à partir du provirus, et qui sont encapsidés pour donner les particules infectieuses . Après infection, les provirus sont obtenus après rétrotranscription de l'ARN viral . Le processus de rétrotranscription comporte obligatoirement une phase de copie du domaine U3 du LTR3' pour reconstruire le LTR5' en commençant par la région répétée R qui, présente en 5' de l'ARN infectieux, peut s'hybrider avec la même région présente également en 3' de l'ARN infectieux (Telesnitsky, A., et S. Goff. 1997). Ce domaine U3 contient toutes les séquences régulatrices du promoteur rétroviral. Il est ainsi possible d'apporter des modifications au promoteur LTR5' en les introduisant dans le LTR3' du clone moléculaire proviral pNL4.3, sachant qu'elles sont obligatoirement copiées au cours de la première rétrotranscription. Comme on le voit sur la figure 4A, la région du LTR3' qui contient les sites NF-KB, PEA3, SP1 et TAR est encadrée par les sites Mrol et AfIII que l'on retrouve également dans le LTR5'. La mise à profit de ces sites pour réaliser les permutations rend donc nécessaire l'isolement préalable du LTR3' dans un vecteur intermédiaire. Le clone pNL4.3 a la particularité d'avoir été construit à partir de la moitié 5' du génome HIV-1 NY5 ligué à la moitié 3' du HIV-1 BRU et de comporter des séquences génomiques cellulaires différentes de part et d'autre du génome viral (Adachi, et al, 1986). Opportunément, pNL4.3 contient les sites uniques Xhol et Ncol situés de part et d'autre du seul LTR3' (Figure 4A). Le segment Xhol-Ncol de pNL4.3 a été transféré dans un vecteur pGL2-Basic (Promega) spécialement préparé. Ce dernier a été préalablement délété d'un grand fragment compris entre Xhol (situé dans le MCS) et BamHI (dans le gène luciférase, inutile dans l'application développée) pour le remplacer par un linker contenant un site Ncol (Figure 4B), à l'aide des 2 amorces: δ'-TCGAGCATATGTCGCGAACTAGTCCATG-S' (SEQ ID NO :7) et 5'- GATCCATGGACTAGTTCGCGACATATGC-3' (SEQ ID NO :8) pour donner le linker représenté ci-dessous, comportant plusieurs sites de restriction en plus du Ncol, et utiles par ailleurs: 1J CGAG CA1JA1JG1J CG CG AA C1JAG1.1 C CA1JG
CG1JA1JA CAG CG C1J1JGA1J C1AGG1JA C C1JAG Xr-^ l I\ ;ie l IM i l f.pe l Hcol _Srt"ιU i
Cette procédure permet également de déléter les 2 sites Mrol indésirables du gène luciférase (Figure 4B). Les différents segments Mrol-Aflll (Figure 4A, segments b, c, d, e), obtenus par PCR, ont été échangés avec leur homologue de pNL4.3 (Figure 4A, segment a) pour donner autant de sous- clones variants infectieux. Ces clones sont transfectés dans des cellules HEK- 293 à l'aide du MBS MAMMALIAN TRANSFECTION KIT (Stratagene). Un cycle unique complet de réplication, générant des particules infectieuses, se déroule alors dans ces cellules, et les surnageants de cultures permettent d'infecter des cellules T CEM dont la production virale a été suivie en quantitatif et au cours du temps.
Résultats
Le recombinant pNL4.3 construit avec le segment U3-R contenant 3 sites NF-KB + 1 site PEA3 + 3 sites SP1 + 3 domaines TAR (NL4.3NF3-TAR3) possèdent les propriétés originales suivantes:
A- NL4.3NF3-TAR3 pilote une expression très accrue des protéines virales. La démonstration en a été faite par la détection intracellulaire de la protéine virale gag. Les cellules étaient lavées deux fois en PBS puis traitées par une solution de paraformaldéhyde 1% en PBS, pendant 20 minutes. La révélation était ensuite menée en 2 temps: (i) incubation de 30 minutes dans le mélange PBS, 0,1% triton X100, 5% sérum de veau foetal, anticorps anti-HIV-1 «gag» p24/p54 dilué 1 :100 (ARGENE, Varilhes, France) (ii) après 2 lavages en PBS, incubation de 30 minutes avec le conjugué immunoglobulines de lapin anti-souris /FITC dilué 1 :100 (DAKO, Danemarque). Après deux derniers lavages, les cellules étaient photographiées et analysées en cytométrie de flux (FACScan, Becton Dickinson, San José, CA). La Figure 5 permet de comparer l'intensité de fluorescence obtenue avec le recombinant NL4.3NF3-TAR3 et le pNL4.3 sauvage par rapport aux cellules parentales CEM non infectées. L'intensité moyenne de fluorescence était évaluée par cytométrie de flux (Figure 6, contrôle = CEM non infectées, pNL4.3 = infectées par le clone moléculaire sauvage, pNL 3N3T = infectées par le sous-clone dont le U3-R était permuté avec NL4.3NF3-TAR3). Sur 5 essais parallèles menés sur des lots différents de cellules infectées. Les valeurs obtenues étaient normalisées par rapport à la fluorecence basale produite par les cellules parentales pour donner: 12,02 ± 02 pour les cellules CEM infectées par la souche sauvage NL4.3 et 118,4 ± 8,3 pour les CEM infectées par la souche recombinante NL4.3NF3-TAR3. B- NL4.3NF3-TAR3 confère à la souche recombinante la propriété d'échapper au silencing transcriptionnel. Après infection, trois lots de cellules CEM infectées par la souche sauvage NL4.3 et trois autres lots par la souche recombinante NL4.3NF3-TAR3 ont été entretenues sans ajout de cellules CEM parentales. Les lots CEM-NL4.3 ont cessé toute production virale dans un délai compris entre 4 et 6 semaines. Les lots CEM- NL4.3NF3-TAR3 sont toujours producteurs après 8 mois d'entretien et au même niveau que celui de l'infection initiale.
Exemple 2 : Préparation du vecteur
Promoteur U3-R HIV-1 original
La séquence originale U3-R (3xNF-KB + PEA3 + 3xSP1 + 3xTAR), présente en 3' dans les ARN viraux encapsidés, a été obtenue par PCR nichée (nested PCR) en utilisant les ARN viraux extraits à partir des virions de surnageants de culture CEMLAI entretenue sur plus de trois années, avec la paire d'amorces δ'-GGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATC-S' (sens) (SEQ ID NO :9) et δ'-GCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-S' (antisens) (SEQ ID NO : 10), pour la première RT-PCR, et la paire 5'- GCGGCCGCGCTAGCACTTCAAGAACTGCTGAC-3' (sens, site Notl double souligné et site Nhel souligné, tous deux ajoutés à la séquence virale) (SEQ ID NO :11 ) et 5'- CTTAAGCAGTGGGTTCCC-3' (antisens, site AfIII souligné, présent dans le LTR viral) (SEQ ID NO :12) pour la seconde PCR. La même technique a été utilisée pour sous-cloner toutes les séquences U3-R. Motif 7xtetO2
Le motif 7xtetÛ2 a été construit dans pBlueScript (Stratagene) par ajout successif de la séquence unitaire TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO :13) ou de ses multiples. Les oligonucléotides (synthétisés par Proligo): 5'- CTAGGTCCCTATCAGTGATAGAGACTAGTCACGTG-3' (SEQ ID NO :14) et δ'-GATCCACGTGACTAGTCTCTATCACTGATAGGGAC-S' (SEQ ID NO : 15) hybrides donnent le double brin tetO2 (en gras sur le schéma ci-dessous), encadré par des sites de restriction utiles à la formation des tandems: 5 ' -CTAGGTCCCTATCAGTGATAGAGACTAGI1CACGI1G- 3 '
CAGGGATAGTCACTATCTCTGATCAGTGCACCTAG- 5 '
1U rH Tt"tn 2 Spd l>nι11 Biml [ ] [
Les sites Spel (ACTAGT) et Avril (CCTAGG) étant compatibles
(CTAG), le double strand tetθ2 désigné ci-dessus, et qui possède les extrémités cohésives 5' Avril et 3' BamHI, peut être ligué entre les sites Spel et BamHI de pBlueScript, avec comme conséquence la perte du site Spel de pBlueScript en 5'. Il devient ensuite possible de liguer un nouveau segment Tetθ2 entre le site Spel en 3' du Tetθ2 précédent et le site BamHI de pBlueScript. L'opération peut être répétée avec le double brin Tetθ2 ou avec des multiples de ce dernier. A partir de 2xtetO2, il est possible de construire 3xtetO2. Un ensemble de 4xtetO2 est obtenu en sortant un 2xtetO2 d'un pBlueScript par Xbal (situé immédiatement en amont du site Spel d'origine) et BamHI, et en le religant dans une autre construction 2xtetO2 ouverte par Spel et BamHI, en sachant que Xbal est également compatible (TCTAGA) avec Spel. Selon la même procédure, un ensemble de 7xtetO2 est finalement obtenu en associant un 3xtetO2 à un 4xtetO2. La construction ainsi obtenue est appelée pBlue-tetO. Note: Site multiple de clonage de pBlueScript:
BssHII Sacl Bstxl Sacll (BstUI) Notl Eagl Xbal Spel BamHI Smal Pstl EcoRI EcoRV Hindlll CIaI SaII Xhol Apal Knpl (BstUI) BssHII
Construction d'un vecteur rétroviral murin auto-inactivant (pcPMΔU3) à partir de 2 demi-vecteurs CLONTECH
L'intérêt des vecteurs rétroviraux n'est plus à démontrer. Leur promoteur propre (LTR5') est habituellement celui utilisé pour la transcription du ou des gènes d'intérêt insérés dans le vecteur. Lorsque l'utilisation d'un promoteur exogène est envisagé, il est nécessaire d'inactiver le propre promoteur du vecteur. La stratégie du rétrovirus auto-inactivant est alors mise à profit. Pour obtenir un vecteur rétroviral de type auto-inactivant, il est nécessaire de déléter la plus grande partie possible du domaine U3 de son LTR3'. Ce domaine contient en effet tous les motifs enhancers du promoteur LTR. Ce faisant, le LTR5' conservé sera fonctionnel pour assurer la transcription des longs ARN rétroviraux infectieux qui seront produits dans les cellules d'encapsidation. Au cours de la première rétrotranscription de ces ARN, le domaine U3 du LTR3' est recopié pour donner le U3 du LTR5'. On obtient ainsi un vecteur rétroviral infectieux dont le promoteur LTR5' est inactivé. La construction proposée repose sur l'assemblage de deux demi- plasmides pRevTRE et pMSCV (Clontech).
Comme pour tous les rétrovirus, les 2 LTR de pRevTRE possèdent les mêmes sites de restriction. Pour déléter le domaine U3 du LTR3', il est donc nécessaire de l'isoler dans un plasmide intermédiaire, ce qui est réalisé ici au cours de la 1ère étape.
1ère étape: Modification de pRevTRE (Clontech): délétion du fragment LTR5' + ψ+ Hygro + pCMVtetO, par coupures Sspl + Hpal + Xhol, religation et transformation dans les bactéries pour l'obtention par amplification du seul demi-plasmide contenant CoIEI et le seul LTR3' (pΔRevTRE).
2ème étape: Délétion de la presque totalité du segment U3 du LTR3'de pDRevTRE par Nhel-BssHII (366 nt), et religation en insérant un linker contenant les sites uniques Notl, PmII et Muni, à l'aide des 2 oligos:
5'-CTAGCGGCCGCACGTGCAATTG-3' (SEQ ID NO :16) et 5'- CGCGCAATTGCACGTGCGGCCG-3' (SEQ ID NO :17) qui après hybridation, donnent le double brin suivant avec les extrémités cohésives 5'Nhel et 3'BssHII:
Ξ ' - CTAGCGGCCGCACJGTGCAATTG - 3 '
GCCGGCGTGCACGTTAACGCGC - Ξ r Nh^ -. ΓJ.V.. _ jr ~i_ _ xiin . ii& f.π_ - 3ème étape: Le fragment Xmnl-Clal est extrait de pMSCVpuro (LTR5' + ψ + MCS + Ppkg + Puror) et inséré dans pΔRevTRE modifié et clivé par les mêmes endonucléases, pour donner le pcSINΔU3.
4ème étape: Enrichissement du site multiple de clonage de pcSINΔU3 (MCS de l'ex-pMSCV), à l'aide des 2 oligonucléotides: 5'- AACGGGCCCTAGGATCCTTCGAATGATCATCGCG-3' (SEQ ID NO :18) et
5'-AATTCGCGATGATCATTCGAAGGATCCTAGGGCCCGTT-S' (SEQ ID NO :19) pour insertion entre les sites Hpal et EcoRI du MCS.
B ' - AACGGGCCCTAGGATC CTTCGAATGATCATCGCG- 3 '
3 ' - TTGCCCGGGATGCTAGGAAGCTTACTAGTAGCGCTTAA- 5 ' V.ΏΆZ Ap S I Avri l 2âmJII Sz .il BcI I XruI ïïcoF.I
Construction du vecteur auto-inactivant Tat + Tet 2xinductible (pcPMΔU3TAR3-tet0) 1ère étape: Le promoteur U3-R (3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR) est extrait du vecteur de clonage par coupure Notl + AfIII et ligué dans pBlue-tetO en amont du motif 7xtetO2 entre les sites disponibles Notl et Xbal (CiACGTG) qui est partiellement compatible avec AfIII (CiAATTG), pour donner pBlue- U3TAR3tetO. 2ème étape: Flanquant le bloc U3-R+7xtetO2, 2 sites BstUI sont présents dont l'un en amont de Notl et l'autre en aval de Apal (voir la note MCS de pBlueScript), mais absent du bloc. Celui-ci est ainsi extrait du vecteur pBlue- U3TAR3tetO à l'aide de BstUI (CGiCG) en 5' et Apal en 3', et ligué entre Hpal et Apal dans le MCS de pcPMΔU3 pour donner le pcPMΔU3TAR3-tet0 . Construction du vecteur auto-inactivant pMV7 2xinductible
(pMV7ΔU3TAR3-tet0)
Le vecteur rétroviral pMV7 (Kirschmeier, et al, 1988), aimablement fourni par le Professeur Nicolas Glaichenhaus, a ainsi pu être modifié pour le rendre « auto-inactivant » (Figure 8). 1ère étape: Le LTR3' de pMV7 a été excisé entre les 2 sites uniques
Sspl et Rsrll. 2ème étape: Ouverture du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) par les 2 endonucléases Sspl et Rsrll (sites uniques) et insertion du LTR3' pour donner pcDNAΔU3-LTR. La région du pcDNA3 conservée Ampicillin-R + CoIEI permet l'amplification et les manipulations du LTR3'.
3ème étape: Délétion du segment Nhel-Sacl du LTR3' dans pcDNAD3-LTR et religation à l'aide d'un linker constitué par hybridation des 2 oligonucléotides 5OTAGCTGACTGACTGACGAGCT-3' (SEQ ID NO :20) et
5'-CGTCAGTCAGTCAG-3' (SEQ ID NO :21 )
- '-' AG C1GA C1JGA C1GA CGAG C
GA C1GA C1GA C1G C Nhel Sael
4ème étape: Réinsertion du LTR3' délété dans pMV7 entre Sspl et Rsrll, pour donner pMV7ΔU3. 5ème étape: Extension du site multiple de clonage pMV7 entre EcoRI et Hindlll avec pour effet : élimination du gène H-ras. L'extension Notl-Hpal- Nsil est réalisée à l'aide des 2 oligonucléotides:
5'. AATTCGCGGCCGCGTTAACATGCATA-3' (SEQ ID NO :22) et 5'- AGCTTATGCATGTTAACGCGGCCGCG-3' (SEQ ID NO :23)
AA1.".1 CG CGG C CG CG1I11JAA CA1JG CA1JA
I aMl SnU Elμϋl Nsil l lind lll
pour donner pMV7ΔU3MCS. La même extension du site multiple de clonage est réalisée sur le vecteur pM7 d'origine, non délété du U3-LTR3', pour obtenir le pMV7MCS qui est utilisé pour exprimer la protéine Tat.
6ème étape: Construction du bloc 3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR + 7xtetO2, sorti de pBlue-U3TAR3tet0 par Notl + EcoRV (blunt), et inséré entre Notl et Hpal dans pMV7 ΔU3MCS, pour donner pMV7ΔU3TAR3-tet0. Construction du vecteur auto-inactivant CMV-Tet-inductible
(pcPMΔU3CMV-tetO). 1ère étape: Le promoteur CMV a été obtenu par PCR en utilisant l'ADN total de cellules fibroblastiques humaines MRC5 infectées par la souche AD 169 du Cytomégalovirus, à l'aide des amorces:
5'- GCGGCCGCATGTTGACATTAGATCTATTGACTAGT -3' (site Notl souligné, site BgIII double souligné, bases modifiées/ajoutées en gras) (SEQ ID NO :24) et δ'-CAGGCGATCTAGACGGTTCACTAAACGAGCT-S' (site Xbal souligné et base ajoutée en gras) (SEQ ID NO :25). Le segment amplifié était clone dans le vecteur pZero-Bluntll (Invitrogen), séquence, puis extrait par les coupures Notl et Xbal pour être ligué dans pBlue-tetO en amont du motif
7xtetO2 entre les mêmes sites.
2ème étape: Le bloc CMVprom+7xtetO2 était extrait par BgIII et Xbal pour être ligué dans le MCS de pcPMΔU3 pour donner le pcPMΔU3CMVp-tetO
Construction et expression d'un vecteur IRES-T AT-IRES-NéoR dans les cellules HEK-293
Principe: Le but poursuivi était de s'assurer de pouvoir sélectionner des clones cellulaires producteurs, et d'obtenir une expression forte de la protéine Tat du HIV-1. Il a ainsi été décidé de construire l'ADNc TAT avec un 1RES (Internai Ribosomal Entry Séquence) fusionné en 5' de l'ADNc, l'ensemble en amont du gène de résistance NéoR et séparé de lui par un deuxième 1RES. Il était ainsi attendu que les clones cellulaires transduits avec cette construction et sélectionnés par le G418 exprimaient bien un transcrit complet comportant l'ARN messager TAT et que cet ARNm était bien traduit.
Construction du bloc IRES-TAT 1ère étape: Excision du bloc Tk-NéoR du vecteur pMV7MCS par coupure CIaI et religation.
2ère étape: Obtention du bloc IRES-TAT par PCR en chevauchement:
- PCR 1 : ADNc de l'IRES du Poliovirus sérotype 1 (Pelletier, J., et N. Sonenberg. 1988) sur les ARN viraux, obtenus au laboratoire de virologie du CHU de Nice à partir d'une souche isolée chez un patient, par RT-PCR à l'aide du kit OneStep de la Société QIAGEN , avec les amorces: IRES-S δ'-GAATTCTAACTTAGACGCACAAAACCAAGTT-S' (site EcoRI souligné) (SEQ ID NO :26) et
IRES-AS δ'-TATGATACAATTGTCTGATTGAAATAACTGTT-S' (SEQ ID NO :27) - PCR 2: ADNc TAT par RT-PCR sur les ARNm de la lignée CEM infectée par la souche HIV-1 LAI et productrice au delà de trois ans d'entretien, avec les amorces:
IRES/TAT-S δ'-CAGACAATTGTATCATAATGGAGCCAGTAGATCC-a' (SEQ ID NO :28) (Le segment double souligné en 5', correspond à l'extrémité 3' de TIRES; le segment simple souligné correspond, lui, à l'extrémité 5' de TAT; ces 2 segments soudés permettront de lier TIRES à TAT dans la PCR finale) et TAT-AS 5'-GTTAACCCTTCTTCTTCTATTCCTTCGGG-S' (site Hpal souligné) (SEQ ID NO :29).
- PCR finale: sur le mélange des 2 types d'amplicons obtenus par les
RT-PCR 1 et 2, une 3ème PCR est menée avec les amorces IRES-S et TAT- AS. Les 2 types d'amplicons sont allongés au cours des premiers cycles de PCR puis amplifiés.
3ème étape: les amplicons IRES-TAT sont sous-clonés dans le vecteur PCRII-TOPO et séquences.
4ème étape: les segments IRES-TAT sont repris par coupures EcoRI et Hpal pour être insérés entre les mêmes sites dans pMV7MCS délété de son bloc Tk-NéoR, pour donner pMV7MCS-IRES-Tat.
Construction du bloc IRES-NéoR 1 ère étape: PCR par chevauchement
- PCR1 : les segments 1RES Hépatite C sont obtenus comme ci- dessus, mais avec les amorces:
IRES2-S 5'-ATGÇATG ACACTCCACCATGAATCACTCC-3' (site Nsil souligné) (SEQ ID NO :30).et IRES-AS 5'-GATGCACGGTCTACGAGACCTCC-3'(SEQ ID NO :31 ).
- PCR2: selon le même principe que ci-dessus, les amorces IRES/NéoR-S δ'-CTCGTAGACCGTGCATCATGATTGAACAAGATGG-a' (SEQ ID NO :32).
(segment double souligné = 3' 1RES; segment simple souligné = 5' NéoR) et NéoR-AS 5'-AAGCTTCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3'
(SEQ ID NO :33). (site Hindlll souligné) servent à amplifier le gène NéoR en utilisant, comme matrice, le pMV7 non délété.
- PCR finale: sur le mélange des 2 types d'amplicons obtenus, une 3ème PCR est menée avec les amorces IRES2-S et NéoR-AS. 3ème étape: les amplicons IRES-NéoR sont sous-clonés dans le vecteur PCRII-TOPO et séquences.
4ème étape: les segments IRES-NéoR sont repris par coupures Nsil et Hindlll pour être insérés entre les mêmes sites dans pMV7MCS-IRES-Tat, en aval du bloc IRES-TAT, pour donner le pMV7-2xlRES-Tat-NéoR. Enchaînement final sur le pMV7-2xlRES-Tat-NéoR:
LTR5' EcoRI-IRES-TAT-Hpal-Nsil-IRES-NéoR-Hindlll LTR3'
Expression de la protéine Tat
Des cellules HEK-293 sont transfectées avec la construction pMV7- 2xlRES-Tat-NéoR, puis sélectionnées par le G418. La production des ARNm TAT est contrôlée par RT-PCR (One-Step). L'expression de la protéine Tat est vérifiée par Western-Blot sur les extraits cellulaires à l'aide de l'anticorps polyclonal HIV-1 BH10 Tat Antiserum gracieusement fourni par le AIDS Research and Référence Reagent Program (NIH). Construction du vecteur Tat + Tet 2xinductible dans le vecteur plasmidique pECE (pcPECE-TAR3-tet0)
Le vecteur pECE (Ellis, et al, 1986) contient un ensemble promoteur SV40 et séquence de polyadénylation SV40 encadrant le site multiple de clonage BglII-Hindlll-Sall-Kpnl-Smal-EcoRI-Sstl-Xbal. Le promoteur SV40 a été délété par les coupures Pvull (blunt) + BgIII et remplacé par bloc le bloc U3-R (3xNF-KB + 3xSP1 + 3xTAR) prélevé sur pBlue-U3TAR3tet0 par coupures EcoRV (blunt) + BamHI (compatible avec BgIII). Constructions promoteur 2xinductible + gène reporter CD24 murin
1- L'ADNc du CD24 murin (mCD24) a été obtenu par PCR one-step (Quiagen) sur des ARNm extraits de la lignée myélomateuse murine MOPC 315 (ATCC TIB-23) avec les amorces
5'-AACATCTCGAGAGTCGCGCC-3' (site Xhol site sousligné) (SEQ ID NO :34) et δ'-TCTAGAGACGTTTCCAGGCCTGAG-S' (sites Xbal and Stul soulignés) (SEQ ID NO :35). Sous-clonés dans le vecteur pZero-Blunt (Invitrogen), les fragments se sont trouvés encadrés par de nouveaux sites de restriction.
2- L'ADNc du mCD24, extrait de pZero-Blunt par coupures EcoRV (blunt) + Sstl, a été inséré dans le pPECE-TAR3-tetO en aval du promoteur entre les sites Smal (blunt) et Sstl. 3- L'ADNc du mCD24, extrait de pZero-Blunt par coupures Apal +
BamHI, a été inséré dans le pcPMΔU3TAR3-tet0 et dans le pcPMΔU3CMV- tetO, en aval du promoteur entre les mêmes sites.
4- L'ADNc du mCD24, extrait de pZero-Blunt par coupures Nsil + Hindlll, a été inséré dans le pMV7ΔU3TAR3-tetO, en aval du promoteur entre les mêmes sites.
Résultats d'activité transcriptionnelle des promoteurs originaux pilotant le mCD24
Parmi les différentes constructions décrites ci-dessus, les résultats les plus déterminants ont été obtenus avec les 2 vecteurs rétroviraux auto- inactivants pilotant le mCD24: pcPMΔU3TAR3-tet0-CD24 et pMV7ΔU3TAR3- tetO-CD24. Ces constructions ont été transfectées dans les cellules d'encapsidation GP2-293 (CLONTECH), en utilisant le MBS MAMMALIAN TRANSFECTION KIT. Plusieurs clones de transfectants stables ont ensuite été sélectionnés par le G418 ou la puromycine. A ce stade, une seconde transfection transitoire par le VSV-G (glycoprotéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire) permettait d'obtenir des surnageants capables d'infecter des cellules CEM. Une nouvelle sélection par antibiotique permettait d'obtenir plusieurs clones avec chaque construction.
Révélation du mCD24. Le CD24 murin (mCD24), glycoprotéine membranaire du lymphocyte, encore appelé Heat-Stable Antigen (HSA) a été choisi en raison de sa totale neutralité sur le comportement du lymphoblaste T. Ce marqueur est largement utilisé comme gène reporter dans les essais de contôle de production HIV ou d'expression de vecteurs lentiviraux
(He, et al, 1995). Le mCD24 était révélé en deux temps, à l'aide de l'anticorps monoclonal de rat anti-souris CD24 5BD (Biosciences Pharmingen) dilué 1 :100, puis du réactif Immunoglobulines de lapin anti-rat conjuguées au FITC
(Dako) dilué 1 :50. Les cellules étaient ensuite analysées en cytométrie de flux sur un FACScan (Becton Dickinson).
Induction Tat. Un système de co-culture séparée par membrane semi-perméable (CeII Culture Insert, porosité = 1 micron, Becton Dickinson) a été développé pour permettre cette induction. Des cellules de lignées HEK-293 exprimant la protéine Tat (HIV-1 LAI) établies au laboratoire étaient déposées dans le compartiment inférieur et les CEM pcPMΔU3TAR3-tetO-CD24 ou pMV7ΔU3TAR3-tet0-CD24 dans le compartiment supérieur.
L'induction était progressivement obtenue au cours du temps, et maximale à 96h.
Notoirement, l'absence de bruit de fond sur les cellules non-induites est totale (Figure 9).
Le promoteur TAR3-tetO n'est pas soumis au silencing transcriptionnel. Les CEM pcPMΔU3TAR3-tet0-CD24 ont été entretenues en culture pendant plus de 10 mois sans aucun inducteur. L'absence d'expression du marqueur CD24 a été contrôlée durant toute cette période.
Environ chaque mois, l'inductibilité a été contrôlée grâce au test de co-culture séparée par membrane semi-perméable. L'expression du marqueur CD24 s'est chaque fois révélée positive à un très haut niveau. Induction HIV-1. L'infection des CEM pcPMΔU3TAR3-tet0-CD24 ou pMV7ΔU3TAR3-tet0-CD24 par le HIV-1 LAI lui-même produisait une induction beaucoup plus importante, progressive, et maximale à partir du 6ème jour après infection.
Ici encore, il faut noter l'absence totale de bruit de fond dans les cellules CEM transduites mais non-induites (Figure 10).
Exemple 3 : Analyse du promoteur 2xNF-kB+PEA3+3xSP1+2xTAR (aussi désigné NF2-PEA3-TAR2).
La région U3-R de pNL4.3 a été remplacée par le U3-R NF2-PEA3- TAR2 pour donner la construction NL4.3NF2-PEA3-TAR2. Celle-ci a permis d'obtenir des résultats identiques à ceux propres au NL4.3NF3-TAR3: expression HIV très accrue et échappement au silencing transcriptionnel. Ces deux LTR possèdent un site PEA3, mais le NL4.3NF2-PEA3-TAR2 ne possède que deux sites NF-KB comme la souche Bru d'origine.
Exemple 4 : Pseutotypage de vecteurs rétroviraux
Les vecteurs rétroviraux modifiés dans leurs LTR et décrits dans la présente invention peuvent être utilisés pour cibler spécifiquement les cellules infectées par les différents virus HIV, HCV, Dengue...dont la glycoprotéine d'enveloppe est décorée par des oligosaccharides de type high mannose, et pour cibler également les cellules tumorales qui expriment les oligosaccharides de type Lewis-x et/ou Lewis-y. Ces différents oligosaccharides sont reconnus par la lectine DC-SIGN, récepteur membranaire exprimé naturellement par les cellules dendritiques qui l'utilisent pour internaliser le HIV, ou par les cellules sinusoïdales endothéliales hépatiques pour le HCV. Parmi les différentes stratégies de préparation de vecteurs rétroviraux, il est courant de recourir à la pratique du pseudotypage. Celle-ci consiste à remplacer la glycoprotéine d'enveloppe du vecteur viral sauvage afin de lui conférer des nouvelles propriétés de ciblage. Le plus souvent, la glycoprotéine d'un autre virus est utilisée. II est ici proposé de pseudotyper les vecteurs rétroviraux décrits dans la présente invention avec l'isoforme membranaire de la DC-SIGN (Mummidi, et al, 2001 ; Soilleux et al., 2001 ), afin de restreindre leur spécificité d'hôte aux cellules infectées par les virus HIV, HCV, Dengue..., et aux cellules tumorales qui expriment les oligosaccharides de type Lewis reconnus par la DC-SIGN. Afin de faciliter lïnternalisation des particules pseudotypées DC-SIGN, il a semblé avantageux d'utiliser la DC-SIGN modifiée par l'insertion du nonapeptide RKKRRQRRR dérivé de la protéine Tat du HIV-1 et connu pour ses propriétés d'intemalisation (Silhol, et al, 2002). Cette construction a été réalisée au cours des étapes suivantes:
1- Clonage d'un DNAc DC-SIGN (isoforme membranaire) complet Cet ADNc a été obtenu par PCR sur les ARNm de cellules KG1 activées par
PMA (selon Soilleux et al, 2000). Les amorces utilisées étaient:
Amorce DC-comp-S
AAGCTTATGAGTGACTCCAAGGAACCAAG (SEQ ID N°37)
Site Hindlll souligné Amorce DC-AS (située à distance du codon stop pour des raisons de Tm)
TCTAGAAAGGAACTGTAGCTTAAAAGGGGG (SEQ ID N°38)
Site Xbal souligné
L'ADNc, appelé ici DC-COMP, a été clone dans pCRII-Topo (Invitrogen) et séquence (voir SEQ ID N°39). La séquence de l'isoforme complète obtenue était 100% similaire à celle déposée dans GenBank sous le N0 AF290886.
2- Insertion du nonapeptide RKKRRQRRR entre 2 hélices alpha du domaine lectine de DC-COMP
Le nonapeptide a été inséré dans la séquence DC-SIGN originelle en éliminant une alanine (entre les 2 hélices du domaine lectine), en aval de la glycine en position 288 sur la séquence humaine de la DC-SIGN (Mummidi et al., 2001) et en insérant 2 prolines en aval du nonapeptide proprement dit, de manière à restituer l'environnement du nonapeptide présent dans la protéine Tat. Les deux amorces PoIyB-DC, définis ci-dessous, s'hybrident partiellement entre elles, et l'une et l'autre avec les séquences de raccordement de la DC- SIGN, selon la représentation ci-dessus.
Amorce PoIyB-DC-AS
5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCCACTTCTTT-3' (SEQ ID NO :40) Amorce PoIyB-DC-S
5'-AGACAGCGACGAAGACCTCCTCAGCTCGTCGTA-3' (SEQ ID NO :41 ) Deux PCR séparées sont menées sur l'ADNc DC-COMP l'une avec le couple d'amorces DC-COMP-S et PoIyB-DC-AS, l'autre avec le couple PoIyB-DC-S et DC-AS. Une PCR par chevauchement est ensuite réalisée sur le mélange des deux types d'amplicons obtenus et avec la paire de primers DC-comp-S et DC- AS. Le clonage des amplicons DC-COMP-NONA permet de vérifier leur séquence (SEQ N°42).
DC-COMP et DC-COMP-NONA ont été insérés dans le vecteur pcDNA3 (Invitrogen) entre les sites Hindlll et Xbal (clones pc-DC et pc-DC-NONA). Ils ont été transfectés dans les cellules d'encapsidation GP2-293 (CLONTECH).
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Claims

Revendications
1. Promoteur transcriptionnel, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un acide nucléique comprenant au moins deux sites NF-κB, au moins un site
PEA3, au moins trois sites SP1 et au moins deux sites TAR.
2. Promoteur selon la revendication 1 , comprenant deux ou trois sites NF- KB, un site PEA3, trois sites SP1 , et deux ou trois sites TAR.
3. Promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel lesdits sites proviennent de HIV-1.
4. Promoteur selon l'une des revendications précédentes, comprenant en outre un élément conférant une inductibilité à un agent exogène différent d'une protéine Tat.
5. Promoteur selon la revendication 4, l'élément conférant l'inductibilité étant un ou plusieurs éléments TetO2.
6. Promoteur selon la revendication 3, comprenant la séquence SEQ ID NO :1.
7. Vecteur d'acide nucléique, comprenant un promoteur tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, lié de manière opérante à une séquence d'intérêt, qui est une séquence codante ou un siRNA.
8. Vecteur selon la revendication 7, qui est un vecteur retroviral dont les domaines U3-R sont modifiés par ledit promoteur.
9. Vecteur selon l'une des revendications 7 ou 8, comprenant un promoteur tel que défini à la revendication 5 ou 6 comprenant des éléments Tetθ2, une séquence d'intérêt, et un élément TetR.
10. Vecteur selon l'une des revendications 7 à 9, dans lequel la séquence d'intérêt code pour une protéine inhibitrice de l'intégration ou de la réplication de HIV, ou capable de détruire le virus et/ou les cellules qui le répliquent.
11. CeIIuIe hôte comprenant un vecteur tel que défini à l'une des revendications 7 à 10.
12. Cellule hôte selon la revendication 11 , ledit vecteur étant intégré dans le génome de la cellule de manière stable.
13. Procédé in vitro ou ex vivo d'expression d'une séquence codante d'intérêt, ledit procédé comprenant la culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini à l'une des revendications 7 à 10, dans des conditions permettant l'induction du promoteur et l'expression de la séquence d'intérêt.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule est cultivée en présence d'une protéine Tat.
15. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 7 à 10, dont le promoteur comprend des éléments Tetθ2, ledit vecteur comprenant en outre un élément TetR, est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline.
16. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini l'une des revendications 7 à 10, dont le promoteur comprend des éléments Tetθ2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément TetR, et est cultivée en présence de tétracycline ou d'un analogue de tétracycline.
17. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la cellule hôte comprenant un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 7 à 10, contenant un promoteur comprenant trois sites NF-KB et deux ou trois sites TAR, ainsi que sept éléments TetO2, est transfectée ou cotransfectée avec un vecteur comprenant un élément TetR, et est cultivée en présence de la protéine Tat ainsi que de la tétracycline ou d'un analogue de tétracycline.
18. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur selon l'une des revendications 7 à 10, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
19. Utilisation d'un vecteur selon la revendication 10, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection par le virus HIV.
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