JP2018510219A - Ｔａｔ誘導性ｃｒｉｓｐｒ／エンドヌクレアーゼに基づく遺伝子編集 - Google Patents

Ｔａｔ誘導性ｃｒｉｓｐｒ／エンドヌクレアーゼに基づく遺伝子編集 Download PDF

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Abstract

ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターによる、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのＴａｔ誘導性発現のための組成物および方法を提供する。当該組成物は、ＨＩＶの治療および／または予防のための治療的処置に使用することができる。

Description

本発明は、レトロウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））中の標的配列を、特異的に切断する組成物に関する。上記組成物は、（i）規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、および、（ii）ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列、をコードしている核酸を含み得る。また上記組成物は、ＨＩＶに感染している被験体、または感染するリスクのある被検体に投与することができる。
ＨＩＶ−１の発見以来、エイズは、世界中で何百万人もの人々に影響する大きな公衆衛生問題であり続けている。ＨＩＶ−１は宿主ゲノムに永続的に組み込まれることから、エイズは不治のままである。ＨＩＶ−１の感染を制御し、エイズの発達を遅らせる昨今の治療法（強力な抗レトロウイルス療法；ＨＡＡＲＴ）によって、ＨＩＶ−１に感染した細胞におけるウイルスの複製は著しく減少し、血漿ウイルス血症は最小レベルに抑えられる。しかしながら、ＨＡＡＲＴでは、組織中における、低レベルのウイルスゲノムの発現および複製を抑制することができない。そして、ＨＩＶ−１の保有体として機能する潜伏感染細胞（例えば、休眠期記憶Ｔ細胞、脳マクロファージ、小膠細胞および星状膠細胞、腸関連リンパ系細胞）を、標的にすることができない。持続性ＨＩＶ−１感染症は、心臓および腎臓疾患、オステオペニア、および神経障害を含む共存症にも関連している。持続性ウイルス保有体を標的とする、効果のある治療的戦略が望まれ続けている。
ＨＩＶ−１ゲノムの長さは約９．８ｋｂであり、宿主ゲノムに組み込まれたときに両端に位置する、２つのウイルス長末端反復を含む。上記ゲノムには、構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）、および補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、およびＮｅｆ）をコードしている遺伝子も含まれている。ＨＩＶ−１の転写トランス活性型因子（Ｔａｔ）は、ＨＩＶ−１感染症のいくつかの病理的結果に寄与することが提唱されてきた、多機能タンパク質である。Ｔａｔは、ウイルスの転写および複製において、重要な役割を果たす。さらにＴａｔは、神経毒性タンパク質として作用することに加えて、様々な細胞性遺伝子の発現を誘導することもできる。Ｔａｔタンパク質は、ＨＩＶ−１感染細胞によって分泌され、細胞膜を通過して拡散することで作用する。Ｔａｔタンパク質は、分泌された可溶性神経毒として作用することができる。また、Ｔａｔタンパク質は、ＨＩＶ−１に感染したマクロファージおよび小膠細胞に、神経毒性物質の放出を誘導することができる。Ｔａｔの転写は、ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターによって促進され、ＨＩＶのウイルス全体を複製するために必要となる。
ＨＩＶ感染症の臨床経過は、被検体の遺伝的背景、年齢、全体的な健康状態、栄養摂取、受けた治療、およびＨＩＶサブタイプを含む、多数の要因によって異なり得る。一般的に、ほとんどの個体は、感染から数週間または数カ月以内にインフルエンザ様症状を発症する。症状としては、発熱、頭痛、筋肉痛、発疹、悪寒、咽頭痛、口内炎または生殖器潰瘍、リンパ腺の腫れ、関節痛、寝汗、および下痢が挙げられる。症状の強さは、個体によって軽度から重度まで異なり得る。急性期においては、ＨＩＶウイルス粒子は、固有のＣＤ４受容体分子を発現している細胞に誘引され、侵入する。一旦ウイルスが宿主細胞に侵入すると、ＨＩＶにコードされている逆転写酵素はＨＩＶ ＲＮＡのプロウイルスＤＮＡコピーを生成し、プロウイルスＤＮＡは宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。宿主細胞によって複製されるのは、このＨＩＶプロウイルスである。その結果、他の細胞に感染し得る、新たなＨＩＶウイルス粒子が放出される。
一次ＨＩＶ感染症は数週間から数カ月以内に沈静化し、通常はその後、最長１０年間にも及ぶことのある、長期臨床「潜伏」期間がある。潜伏期間は、無症候性ＨＩＶ感染症または慢性ＨＩＶ感染症とも呼ばれる。被検体のＣＤ４リンパ球数は回復するが、感染前のレベルまでは戻らず、ほとんどの被検体では血清反応の反転が生じる（つまり、感染から２〜４週間以内だけ、血液中に検知可能なレベルの抗ＨＩＶ抗体が見られる）。この潜伏期間中は、末梢血の単核球における検知可能なウイルス複製が無い。また、末梢血において培養可能なウイルスが、少ししか無いか、全く無い場合がある。潜伏期間（臨床潜伏期とも呼ばれる）中は、ＨＩＶに感染した人々にＨＩＶ関連の症状が見られないか、ほんの軽度なものである場合がある。しかし、ＨＩＶウイルスは、非常に低いレベルで繁殖し続けている。抗レトロウイルス療法を施された被検体では、この潜伏期間が数十年以上にも及ぶことがある。しかしながら、抗レトロウイルス療法は伝染のリスクを低減することができるが、このステージの被検体は、抗レトロウイルス療法を受けている最中であったとしても、依然としてＨＩＶを他者に伝染させることができる。
ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）は、短い反復の塩基配列を含む、ＤＮＡの座位である。それぞれの反復には、ウイルスに対する過去の曝露に由来する「スペーサーＤＮＡ」の、短いセグメントが続く。ＣＲＩＳＰＲはしばしば、ＣＲＩＳＰＲに関連するタンパク質をコードしている、Ｃａｓ遺伝子と関連付けられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、外来遺伝因子（プラスミドおよびファージなど）に対する抵抗を与える原核性免疫システムであり、獲得免疫の一形態を提供する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物のＲＮＡｉに類似した方法で、これら外来性遺伝因子を認識し、切断する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々な生物において、遺伝子編集（特定の遺伝子配列を追加、破壊、または変更することによる）、および遺伝子調節に使用されてきた。Ｃａｓ９タンパク質および適当なガイドＲＮＡを細胞中に送達することにより、任意の所望の位置において、その生物のゲノムを切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用する治療的遺伝子編集を上首尾に行うためには、標的細胞における、Ｃａｓ９酵素およびガイドＲＮＡの能率的で特異的な送達および発現が必要となる。これは、組織または細胞集団中の受容細胞の割合が少ない場合（特定のウイルス感染細胞の場合など）には、特に困難である。
本発明は、哺乳動物細胞中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を、インビボまたはインビトロで不活性化する方法を提供する。当該方法は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている単離核酸配列を含む組成物に、哺乳動物細胞を曝露する工程を含む。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されていてもよい。哺乳動物細胞を組成物に曝露する工程は、細胞を接触させる工程を含んでもよい。哺乳動物細胞は、潜伏感染細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、単球、腸関連リンパ系細胞、小膠細胞、および星状膠細胞を含むが、これらに限定されない）であってもよい。哺乳動物細胞は、（i）ＨＩＶに感染した被検体に由来する培養細胞、（ii）組織外植片、および／または（iii）細胞株を含んでもよい。ＨＩＶの不活性化は、インビボまたはエクスビボで行ってもよい。
特定の実施形態において、単離核酸はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な、１つ以上のガイドＲＮＡをコードしていてもよい。ＨＩＶ中の標的核酸配列とは、ＨＩＶのコード領域内の配列、および／またはＨＩＶの非コード領域内の配列、および／またはＨＩＶの長末端反復内の配列を意味し得る。非コード領域は、ＨＩＶの長末端反復を含んでもよい。ＨＩＶの長末端反復内の配列は、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの配列を全く含まない配列であって、Ｕ３領域内、Ｒ領域内またはＵ５領域内の配列である配列を含んでもよい。組成物は、核局在化シグナルをコードしている配列を含んでもよい。組成物は、トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしている配列をさらに含んでもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合していてもよい。組成物はまた、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域を含んでもよい。
特定の実施形態において、組成物は、発現ベクターと操作可能に結合していてもよい。発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。
本発明は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む、単離核酸配列を提供する。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されていてもよい。
特定の実施形態において、配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な、１つ以上のガイドＲＮＡをコードいてしてもよい。ＨＩＶ中の標的核酸配列とは、ＨＩＶのコード領域内の配列、および／またはＨＩＶの非コード領域内の配列、および／またはＨＩＶの長末端反復内の配列を意味し得る。ＨＩＶの長末端反復は、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの配列を全く含まない配列であって、Ｕ３領域内、Ｒ領域内またはＵ５領域内の配列である配列を含んでもよい。単離核酸配列はまた、核局在化シグナルおよび／またはトランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合していてもよい。単離核酸配列は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域も含んでいてもよい。
特定の実施形態において、単離核酸配列は、発現ベクターと操作可能に結合していてもよい。発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを意味し得る。
本発明は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物はまた、薬学的に許容される担体（脂質系コロイドまたは重合体系コロイドを含むが、これらに限定されない）も含んでもよい。コロイドは、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルであってもよい。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されていてもよい。
特定の実施形態において、薬学的組成物は、局所適用用に製剤されてもよく、および／またはコンドーム内に収容されていてもよい。
特定の実施形態において、配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な１つ以上のガイドＲＮＡをコードしていてもよい。ＨＩＶ中の標的核酸配列は、ＨＩＶのコード領域内の配列、および／またはＨＩＶの非コード領域内の配列、および／またはＨＩＶの長末端反復内の配列を意味し得る。ＨＩＶの長末端反復内の配列は、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの配列を全く含まない配列であって、Ｕ３領域内、Ｒ領域内またはＵ５領域内の配列である配列を含んでもよい。配列は、核局在化シグナルをコードしていてもよい。薬学的組成物はさらに、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードしている配列を含んでもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合していてもよい。配列はまた、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしていてもよい。
特定の実施形態において、薬学的組成物によって提供される配列は、発現ベクターと操作可能に結合していてもよい。発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。
本発明は、ＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法を提供する。当該方法は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む薬学的組成物を、被検体に治療上有効な量投与する工程を含む。治療されるＨＩＶ感染症は、潜伏感染症であってもよい。当該方法はさらに、ＨＩＶ感染症を患う被検体を特定する工程を含んでもよい。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されていてもよい。
特定の実施形態において、配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な１つ以上のガイドＲＮＡをコードしていてもよい。場合によっては、配列は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしていてもよい。
特定の実施形態において、抗レトロウイルス剤を投与してもよい。抗レトロウイルス剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および侵入阻害剤を含んでもよいが、これらに限定されない。抗レトロウイルス剤は、強力な抗レトロウイルス療法を含んでもよい。薬学的組成物は、局所的または非経口的に投与されてもよい。
特定の実施形態において、薬学的組成物は、発現ベクターと操作可能に結合してもよい。発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。
本発明は、ＨＩＶ感染症のリスクがある被検体における、ＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法を提供する。当該方法は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む薬学的組成物を、被検体に治療上有効な量投与する工程を含んでもよい。一実施形態において、被検体は、現在性交渉のある者、医療従事者、および／または初期対応者である。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されていてもよい。場合によっては、薬学的組成物は、発現ベクターと操作可能に結合していてもよい。発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターであってもよいが、これらに限定されない。一実施形態において、配列はまた、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしていてもよい。
本発明は、ＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供への、ＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法を提供する。当該方法は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む薬学的組成物を、被検体に治療上有効な量投与する工程を含む。一実施形態において、薬学的組成物は、出産前、周産期、および出産後の１つ以上の期間中に投与される。
特定の実施形態において、抗レトロウイルス剤を投与してもよい。抗レトロウイルス剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および侵入阻害剤であってもよいが、これらに限定されない。抗レトロウイルス剤は、強力な抗レトロウイルス療法であってもよい。一実施形態において、治療上有効な量の組成物は、子供へと投与されてもよい。一実施形態において、配列はまた、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしていてもよい。
本発明は、ＨＩＶによる感染症を予防するために、薬学的組成物を非感染被検体に投与する方法を提供する。当該方法は、少なくとも（i）ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのコア領域、および（ii）ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む薬学的組成物を、非感染被検体に治療上有効な量投与する工程を含んでもよい。
本発明は、
（i）ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を有する単離核酸配列、または、（ii）単離核酸をコードしているベクター、を含む一定量の組成物、ならびに、
包装材料、使用方法説明を含む添付文書、無菌液、注射器、および無菌容器の内の１つ以上、を備えるキットを提供する。
開示されている物質の組成および方法について、本発明において予見されるように、本発明の実施形態の一様態では、本明細書に記載の成分および／または工程が含まれる。別の一様態においては、本発明の実施形態は、本質的に、本明細書に記載の成分および／または工程からなる。さらに別の一様態において、本発明の実施形態は、本明細書に記載の成分および／または工程からなる。
図１Ａは全長ＨＩＶ−１ ＬＴＲ（ＬＴＲ（−４５４／＋６６））、ならびに作製したＬＴＲ短縮バリアント（ＬＴＲ−１２０／＋６６、ＬＴＲ−８０／＋６６、およびＬＴＲ−３８／＋６６）の模式図である。各バリアントに含まれるＬＴＲ要素は、同図から明らかである。 図１Ｂは、図１Ａにおける全長ＨＩＶ−１ ＬＴＲおよびバリアントに関する、ＰＣＲで増幅させたＬＴＲ配列を示す、アガロースゲル電気泳動像である。レーン１：全長ＨＩＶ−１ ＬＴＲ（ｐＬＴＲ（−４５４／＋６６））。レーン２：ｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）。レーン３：ｐＬＴＲ（−８０／＋６６）。レーン４：ｐＬＴＲ（−３８／＋６６）。 図２は、本発明に係るＣａｓ９プロモーターの交換手順を示す図である。pX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-H1-shorttracr-PGK-puroプラスミド（Addgene#42229）（「ＣＢｈ−Ｃａｓ９」と表示）を、Ｃａｓ９遺伝子ソース／テンプレートとして用いた。参照元のプラスミド中の、本来のＣＢｈプロモーターは、図示した酵素による制限酵素消化によって取り除いた。そして、種々のＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターバリアント（総称して「ＬＴＲ−Ｃａｓ９」と表示）に置き換えられた。 図３Ａは、Ｕ８７ ＭＧ細胞におけるＣａｓ９、Ｔａｔ、およびα−チューブリンの発現を示すウェスタンブロットである。上記Ｕ８７ ＭＧ細胞は、全長ＨＩＶ−１ ＬＴＲ（ｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９）の制御下においてＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９を発現する、異なる量のプラスミド（１０ｎｇ、５０ｎｇ、および２５０ｎｇ）によって、共トランスフェクションされている。Ｔａｔ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６、２５０ｎｇ）は、用いたサンプルと、用いなかったサンプルがある。レーン１：２５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、１０００ｎｇのｐＣＭＶ。レーン２：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ。レーン３：１０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４０ｎｇのｐＣＭＶ。レーン４：２５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、７５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。レーン５：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、９５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。レーン６：１０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、９９０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。 図３Ｂは、図３Ａのウェスタンブロットにおいて、Ｃａｓ９に対応するバンド強度（α−チューブリン発現で標準化した）を示すグラフである。上部は、α−チューブリンレベルで標準化したＣａｓ９レベルの、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す（Ｔａｔ有り、またはＴａｔ無し）。下部は、Ｔａｔ有り／Ｔａｔ無しの比率の、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す。 図４Ａは、Ｕ８７ ＭＧ細胞における、Ｃａｓ９、Ｔａｔ、およびα−チューブリンの発現を示すウェスタンブロットである。上記Ｕ８７ ＭＧ細胞は、短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲバリアントｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９またはＨＩＶ−１ ＬＴＲバリアントｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９の制御下においてＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９を発現する、異なる量のプラスミド（５ｎｇまたは５０ｎｇ）によってトランスフェクションされている。Ｔａｔ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６、２５０ｎｇ）は、用いたサンプルと、用いなかったサンプルがある。レーン１：５ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ。レーン２：５ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。レーン３：５ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、９９５ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。レーン４：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ。レーン５：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。レーン６：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、９５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。レーン７：５ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ。レーン８：５ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。レーン９：５ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、９９５ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。レーン１０：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ。レーン１１：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。レーン１２：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、９５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。 図４Ｂは、図４Ａのウェスタンブロットにおいて、Ｃａｓ９に対応するバンド強度（α−チューブリン発現で標準化した）を示すグラフである。上部は、α−チューブリンレベルで標準化したＣａｓ９レベルの、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す（Ｔａｔ無し、ｒＴａｔ有り、またはＴａｔトランスフェクション有り）。下部は、Ｔａｔトランスフェクション有り／Ｔａｔ無しの比率の、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す。 図５Ａ〜図５Ｅは、ＴａｔによってＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターによるＣａｓ９の発現が刺激され、ｇＲＮＡ存在下におけるウイルスプロモーターの切断を引き起こすことを示す。図５Ａ：全長ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、エンハンサー領域内およびコア領域内の様々な調節モチーフ、ならびにＧａｇ遺伝子の一部を示す模式図である。Ｃａｓ９の発現のために作製された、ＬＴＲ欠失変異体の長さを示す。ｇＲＮＡ標的配列の位置、およびそれらの間の距離を示す。図５Ｂ：（i）全長ＬＴＲ（−４５４／＋６６）またはその様々な変異体（−１２０／＋６６または−８０／＋６６）を含むｐＸ２６０−ＬＴＲ−Ｃａｓ９、および（ii）Ｔａｔを発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｔａｔ）により、ＴＺＭｂ１細胞を共トランスフェクションした。これにより、ウェスタンブロットによって試験された通り、Ｔａｔ産生レベルが増加した（上部）。α−チューブリンの構成的な発現（中央部）、およびＴａｔの発現（下部）を示す。図５Ｃ：２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で、ＴＺＭｂ１細胞に、Ｔａｔを発現するアデノウイルスを感染させた。続けて、レンチウイルスを媒介して、（i）ＬＴＲ−８０／＋６６プロモーターによりＣａｓ９を、（ii）Ｕ６プロモーターによりｇＲＮＡ Ａ／Ｂを、発現させた。これによって、組み込まれていたＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターのＤＮＡ配列が切断され、ＴＺＭｂ１細胞中に２０５ｂｐのＤＮＡフラグメントが表れた（ＰＣＲおよびＤＮＡゲル分析によって試験した）。図５Ｄ：図５Ｃに記載のＴＺＭｂ１細胞において発現している、Ｃａｓ９、β−チューブリン、およびＴａｔタンパク質のレベルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図５Ｅ：図５Ｃに記載の様々な処置の後のＴＺＭｂ１細胞における、組み込みＨＩＶ−１ ＬＴＲの転写活性を示すルシフェラーゼ・アッセイである。 図６Ａ〜図６Ｃは、Ｃａｓ９誘導時に、ＨＩＶ−１への感染により、組み込みウイルスＤＮＡの切断が刺激されることを示す。ｇＲＮＡ Ａ／Ｂ（ＬＶ−ｇＲＮＡ Ａ／Ｂ）を発現するレンチウイルスまたは対照（何も含まないＬＶ）によって、ＬＴＲ−８０／＋６６−Ｃａｓ９レポーターＴＺＭｂ１細胞株に形質導入した。上記細胞株を、３つの異なるＭＯＩで、ＨＩＶ−１ＪＲＦＬまたはＨＩＶ−１ＳＦ１６２に感染させた。４８時間後、細胞を回収して、ウェスタンブロットによってタンパク質の発現を判定した（図６Ａ）。ウイルス感染後のＣａｓ９の誘導時における、組み込みＨＩＶ−１ ＬＴＲの切断レベルを、ＰＣＲ／ＤＮＡ遺伝子分析によって検出した（図６Ｂ）。組み込みＨＩＶ−１プロモーターの転写活性を、ルシフェラーゼレポーター・アッセイによって評価した（図６Ｃ）。 図７Ａ〜図７Ｃは、Ｃａｓ９のＴａｔ刺激によって、潜伏期のＨＩＶ−１レポーターを含むＴ−細胞における、組み込みＨＩＶ−１のＤＮＡが切断されることを示す。ＬＴＲ−８０／＋６６−Ｃａｓ９遺伝子を含むＣＤ４＋ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ−細胞（２Ｄ１０細胞）に、対照（何も含まないＬＶ）またはＬＶ−ｇＲＮＡ Ａ／Ｂを用いて形質導入した。その後、ｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ−Ｔａｔプラスミドを用いて、トランスフェクションを行った。４８時間後、図示する通り、様々なタンパク質のレベルをウェスタンブロットによって判定した（図７Ａ）。 組み込みＨＩＶ−１ＤＮＡの状態を評価するために、ゲノムＤＮＡをＬＴＲ特異的ＰＣＲによって判定した。切断効率を、短縮されたアンプリコン対全長アンプリコンの百分比として判定した（図７Ｂ）。 切断後の組み込みウイルスプロモーターの再活性化レベルを、フローサイトメトリーによって評価した。代表的な散布図を示す（図７Ｃ）。赤色色素が陽性の細胞（ヨウ化プロピジウム染色された細胞であり、死細胞）は分析の対象外とした。 図８Ａ〜図８Ｃは、潜伏ウイルス再活性化薬による細胞の処理によって、Ｊｕｒｋａｔ ２Ｄ１０細胞における、Ｃａｓ９の発現および組み込みウイルスＤＮＡの切断が誘導されることを示す。ＬＴＲ−８０／＋６６−Ｃａｓ９を発現する２Ｄ１０細胞を、対照（何も含まない）またはｇＲＮＡ Ａ／Ｂを発現するレンチウイルスを用いて処理した。２４時間後、これらの細胞を、ＰＭＡ（Ｐ）、ＴＳＡ（Ｔ）、または両方（Ｐ／Ｔ）によって１６時間処理した。Ｃａｓ９−フラグの発現、α−チューブリンの発現、およびＧＦＰの発現（組み込みＨＩＶ−１ゲノムを示す）について、調査対象のタンパク質をウェスタンブロットによって判定した（図８Ａ）。 Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ Ａ／Ｂによる組み込みＬＴＲ ＤＮＡの切断レベルを検出するために、ゲノムＤＮＡをＰＣＲによって評価した。図７Ａ〜図７Ｃの説明に記載の通りに、切断効率を判定した（図８Ｂ）。 フローサイトメトリーによるＧＦＰレポーター・アッセイ、および代表的な散布図を示す（図８Ｃ）。 図９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による、ＨＩＶ−１の負のフィードバック制御を示す模式図である。（再活性化）の初期段階では、ウイルスゲノムの基底状態の転写によって、Ｔａｔタンパク質が産生される（丸１）。（i）ＴＡＴとウイルス転写物のバッジ配列(budge sequence)とが結合し（丸２）、さらに、（ii）いくつかの細胞タンパク質が漸増し、転写開始部位に近接するＲＮＡポリメラーゼＩＩにおいてＴＡＴのループおよび他の転写因子と結合したとき、ウイルスＲＮＡの転写開始が強く刺激される。またより重要なことに、ウイルスＲＮＡの伸長も強く刺激される（丸３）。ウイルスが活性化した際の基底的な産物は、最小ウイルスプロモーターｌｔｒも刺激し、Ｃａｓ９遺伝子を駆動する（丸３）。新たに合成されたＣａｓ９（様々なＨＩＶ−１特異的ｇＲＮＡと結合している）は、ウイルスゲノムを切断し、ＬＴＲを永久的に不活性化し、ＨＩＶ−１遺伝子の発現および複製を停止させる。Ｔａｔが無い場合、ｌｔｒ−Ｃａｓ９は発現しない。Ｃａｓ９の発現は、Ｔａｔの存在下でのみ継続する。 図１０は、参照元のＨＩＶ−１ ＮＬ４−３ゲノムにおいて、（i）ＬＴＲ内（緑のハイライト部、ＰＡＭは赤）の、ｇＲＮＡ Ａ／Ｂ標的の位置およびヌクレオチド配列、ならびに、（ii）ＴＺＭｂ１のゲノムＤＮＡをＰＣＲする際に用いた、ＬＴＲ特異プライマー（青のハイライト部）を示す。ＬＴＲ特異的ＰＣＲの産物（全長および短縮）の、配列および大きさ、ならびに予測される編集フラグメント（配列番号：６〜１０）。 図１１は、ＬＴＲ特異的ＰＣＲ反応の代表的なアガロースゲル分析を示す。これは、図７Ａ〜図７Ｃおよび図８Ａ〜図８Ｃの、Ｊｕｒｋａｔ ２Ｄ１０レポーター細胞株を用いた実験において、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを媒介したＬＴＲ切断効率を定量化するために用いたものである。 図１２は、参照元のＨＩＶ−１ ＮＬ４−３ゲノムにおいて、（i）ＬＴＲｇＲＮＡ Ａ／Ｂ標的（緑のハイライト部、ＰＡＭは赤）の位置およびヌクレオチド組成、ならびに、（ii）Ｊｕｒｋａｔ ２Ｄ１０細胞中のＰＣＲによる切断の分析に用いた、ＬＴＲ特異的プライマー（青のハイライト部）を示す。アンプリコン（全長および短縮されたＬＴＲＤＮＡ）のヌクレオチド配列および大きさ、ならびに予測される切除されたＤＮＡフラグメントを示す（配列番号：１１〜２１）。 図１２は、参照元のＨＩＶ−１ ＮＬ４−３ゲノムにおいて、（i）ＬＴＲｇＲＮＡ Ａ／Ｂ標的（緑のハイライト部、ＰＡＭは赤）の位置およびヌクレオチド組成、ならびに、（ii）Ｊｕｒｋａｔ ２Ｄ１０細胞中のＰＣＲによる切断の分析に用いた、ＬＴＲ特異的プライマー（青のハイライト部）を示す。アンプリコン（全長および短縮されたＬＴＲＤＮＡ）のヌクレオチド配列および大きさ、ならびに予測される切除されたＤＮＡフラグメントを示す（配列番号：１１〜２１）。 図１２は、参照元のＨＩＶ−１ ＮＬ４−３ゲノムにおいて、（i）ＬＴＲｇＲＮＡ Ａ／Ｂ標的（緑のハイライト部、ＰＡＭは赤）の位置およびヌクレオチド組成、ならびに、（ii）Ｊｕｒｋａｔ ２Ｄ１０細胞中のＰＣＲによる切断の分析に用いた、ＬＴＲ特異的プライマー（青のハイライト部）を示す。アンプリコン（全長および短縮されたＬＴＲＤＮＡ）のヌクレオチド配列および大きさ、ならびに予測される切除されたＤＮＡフラグメントを示す（配列番号：１１〜２１）。 図１２は、参照元のＨＩＶ−１ ＮＬ４−３ゲノムにおいて、（i）ＬＴＲｇＲＮＡ Ａ／Ｂ標的（緑のハイライト部、ＰＡＭは赤）の位置およびヌクレオチド組成、ならびに、（ii）Ｊｕｒｋａｔ ２Ｄ１０細胞中のＰＣＲによる切断の分析に用いた、ＬＴＲ特異的プライマー（青のハイライト部）を示す。アンプリコン（全長および短縮されたＬＴＲＤＮＡ）のヌクレオチド配列および大きさ、ならびに予測される切除されたＤＮＡフラグメントを示す（配列番号：１１〜２１）。
〔定義〕
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本発明を試験するための実施において、本明細書に記載のものと類似または同様の、任意の方法および材料を使用することができる。しかし、本明細書に記載の材料および方法を使用することが好ましい。本発明を説明および請求するにあたり、下記の用語を使用する。
本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を説明するという目的でのみ使用され、限定する意図は無いということも理解されたい。
本明細書に記載の全ての遺伝子、遺伝子の名称、および遺伝子産物は、本明細書に記載の組成物および方法が適用可能な任意の種に由来する相同体に対応することが、意図される。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、本開示はただの例示を意図しているに過ぎず、文脈から明示されていると取れる場合を除き、限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子産物に関しては、他の種に由来する、相同および／またはオーソロガスな遺伝子および遺伝子産物を包含することを意図している。
本明細書にて使用される冠詞「a」および「an」は、当該冠詞の文法的目的語が１つまたは１つ以上（つまり、少なくとも１つ）であることを示す。例として、「an element（要素）」は１つの要素または１つより多い要素を意味する。したがって、「a cell（細胞）」という記載は、例えば、同じ種類の複数の細胞を含む。また、用語「含んでいる（including）」、「含む（includes）」、「有している（having）」、「有する（has）」、「共に（with）」、またはそれらの異形が、詳細な説明および／または請求項にて使用される範囲において、そのような用語は、「備えている（comprising）」という用語と同様に、包括的であることを意図している。
本明細書に使用されるとき、用語「備えている（comprising）」「備える（comprise）」または「備えられた（comprised）」およびそれらの変形は、関連する事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などの定義または記載された要素が、包括的またはオープンエンドであることを意味する。これらには追加の要素も認められるので、定義されたまたは記載された事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などは、その特定された要素（または、適宜、その同等物）を含み、他の要素が含まれてもよいことを示す。また、他の要素が含まれても、依然として、定義された事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などの範囲／定義にも該当することを示す。
本目最初において、測定可能な値（量や時間の長さなど）を指して使用される「約」は、特定の値の＋／−２０％、＋／−１０％、＋／−５％、＋／−１％、または＋／−０．１％の変動を包含することを意味する。これにより、変動値が、本開示の方法を実施するために適当であることを意味する。または、特に生物学的システムまたはプロセスにおいて、当該用語は、５倍以内のオーダー、および２倍以内のオーダーの値も意味し得る。本願および請求項にて特定の値が記載されている場合、特に断りのない限り、用語「約」は、特定の値にとって許容できる誤差の範囲以内であることを意味するものとする。
本明細書に使用されるとき、「有効量、有効な量(effective amount)」は、治療的または予防的に利益を提供する量を意味する。
「コードしている」とは、ポリヌクレオチド（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど）におけるヌクレオチドの特異的配列に固有の性質を指す。上記性質とは、（i）ヌクレオチドの定義された配列（つまり、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他の重合体および高分子の合成用テンプレートとして機能すること、ならびに、（ii）これに起因する生物学的性質、である。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的システム中でタンパク質を産生する場合には、当該遺伝子はタンパク質をコードしていると言える。コーディング鎖（自身のヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通例配列表に記載されている）、および非コーディング鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写用テンプレートとして用いられる）の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡの、タンパク質または他の産物をコードしている、と言うことができる。
用語「発現」は、本明細書に使用されるとき、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳（そのプロモーターによって駆動される）、として定義される。
「発現ベクター」とは、組み換えポリヌクレオチド（発現すべきヌクレオチド配列と操作的に結合している、発現調節配列を有する）を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいし、または、インビトロ発現システム中に存在してもよい。発現ベクターは当該技術分野で知られているあらゆるものを含む。その例としては、組み換えポリヌクレオチドが組み込まれた、コスミド、プラスミド（例えば、そのままの、またはリポソームに格納された）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などが挙げられる。
「単離された」とは、天然状態から変化したか、または取り去られたことを意味する。例えば、動物の生体中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共在物質から部分的または完全に分離した同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離核酸または単離タンパク質は、実質的に純化された形態で存在してもよく、または、天然状態でない環境（例えば宿主細胞など）に存在してもよい。
「単離核酸」は、自然発生状態において隣接する配列から単離した、核酸セグメントまたはフラグメントを指す。つまり、通常ならば上記フラグメントが隣接している配列（つまり、上記フラグメントが自然発生するゲノムにおいて、当該フラグメントに隣接している配列）から取り除かれた、ＤＮＡフラグメントである。当該用語は、通常は核酸を伴う他の成分（つまり、通常は細胞中において核酸を伴う、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、当該用語は、例えば、（i）ベクターに組み込まれた組み換えＤＮＡ、（ii）自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに組み込まれた組み換えＤＮＡ、または（iii）原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組み換えＤＮＡ、または（iv）他の配列から独立した単離分子（つまり、ｃＤＮＡまたは、ＰＣＲもしくは制限酵素消化によって作製されたゲノムフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメント）としての組み換えＤＮＡ、を含む。また、追加のポリペプチド配列をコードしている、ハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡ；相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；天然および／または修飾されたモノマーまたはリンケージ（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換形態およびαアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアート、およびメチルホスホナートなども含む）の、直鎖状または環状のオリゴマーまたは重合体も含まれる。
ポリヌクレオチド配列の文脈で使用する場合、用語「バリアント」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義は、例えば、「対立遺伝子の」バリアント、「スプライス」バリアント、「種」バリアント、または「多形」バリアントも含み得る。スプライスバリアントは、参照元の分子との有意な同一性を持ち得るが、一般的には、より多いかまたはより少ない数のポリヌクレオチドを有する。これは、ｍＲＮＡプロセシング中に、異なるエクソンのスプライシングが行われるためである。対応するポリペプチドは、追加の機能ドメインを有するか、またはドメインの欠落を有し得る。種バリアントは、ある種と別の種との間で異なっている、ポリヌクレオチド配列である。野生型遺伝子産物のバリアントが、本発明において特に有用である。バリアントは、核酸配列中の少なくとも１つの突然変異に起因してよく、異なるｍＲＮＡまたはポリペプチドが生じる（これらの構造または機能は、変化していてもよいし、変化していなくてもよい）。任意の天然遺伝子または組み換え遺伝子は、対立遺伝子の形態をまったく有さないか、または１つ以上の対立遺伝子の形態を有してもよい。バリアントを引き起こす一般的な突然変異は、一般的に、ヌクレオチドの自然的欠失、付加、または置換に起因している。これらの変化のそれぞれは、特定の配列中に、１回または複数回、単独または他との組み合わせで、起こり得る。
本明細書に使用されるとき、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、明細書を通じて互換的に使用され、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；天然および／または修飾されたモノマーまたはリンケージ（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換形態およびαアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアート、およびメチルホスホナートなども含む）の、直鎖状または環状のオリゴマーまたは重合体も含まれる。ポリヌクレオチドには、本分野において利用可能な任意の手段によって得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。上記手段には、組み換え手段（つまり、一般的なクローニング技術およびＰＣＲ（登録商標）などを用いて、組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングする手段）、および合成的手段、が含まれるが、これらに限定されない。
核酸配列は「キメラ」であり得る。つまり、異なる領域から構成され得る。本発明の文脈において、「キメラ」化合物は、２つ以上の化学領域を含む（例えば、ＤＮＡ領域、ＲＮＡ領域、ＰＮＡ領域などからの）、オリゴヌクレオチドである。化学領域のそれぞれは、少なくとも１つのモノマーユニット（つまり、ヌクレオチド）から構成されている。これらの配列は、一般的に少なくとも１つの領域を含み、上記配列は、１つ以上の所望の性質を示すように修飾されている。
用語「標的核酸」は、核酸（多くの場合、生体試料に由来する）を指し、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズされるようになっている。標的核酸の有無が検出されるか、または、標的核酸の量が定量化される。標的核酸は、標的に向けられている、対応するオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的な配列を有する。標的核酸という用語は、オリゴヌクレオチドが向けられている、より大きな核酸の特異的部分列または配列全体（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）を意味し得る。使用される意味の違いは、文脈から明白である。
本発明の文脈において、通常の核酸塩基について、以下の略語が使用される：「Ａ」はアデノシンを意味し、「Ｃ」はシトシンを意味し、「Ｇ」はグアノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味し、「Ｕ」はウリジンを意味する。
特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンの関係にあり、同じアミノ酸配列をコードしている、全てのヌクレオチド配列を含む。「タンパク質またはＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列」という語は、上記タンパク質をコードしているヌクレオチド配列のいくつかのバージョンがイントロンを含みうる程度に、イントロンを含んでもよい。
本明細書に使用されるとき、「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を意味する。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染可能であるという点で、レトロウイルスの中でも独特である。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝子情報を送達できることから、遺伝子送達ベクターの最も能率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、高レベルのインビボ遺伝子送達を達成する手段を提供する。
免疫原性組成物の「非経口的」投与は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内(intrasternal)への、注射または注入技術を含む。
「患者」または「個体」または「被検体」という用語は、本明細書中において互換的に用いられ、治療される哺乳類の被検体を意味し、ヒト患者であることが好ましい。場合によっては、本発明の方法は、実験動物、獣医学への応用、および疾患動物モデル（マウス、ラット、ハムスターを含む齧歯類、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されない）の開発に供される。
用語「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの鎖を指し、「核酸」としても知られている。本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドは、本分野において利用可能な任意の手段によって得られる全ての核酸配列を含み、天然核酸および合成核酸の両方を含むが、これらに限定されない。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を意味する。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を必須に含み、タンパク質の配列またはペプチドの配列に含まれ得るアミノ酸の最大数は限定されない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を有する、任意のペプチドまたはタンパク質を含んでいる。本明細書に使用されるとき、当該用語は、短鎖（本発明の分野において、例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーを、通常は指す）、および、長鎖（本発明の分野において、多数の種類があるタンパク質を一般的に指す）、の両方を意味する。その中でも「ポリペプチド」は、例えば、生物活性のあるフラグメント、実質的に相同的なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
用語「プロモーター」は、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を意味し、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始するのに必要となる。「最小」プロモーターまたは「短縮型」プロモーターまたはプロモーターの「機能的フラグメント」は、転写（例えば、最小プロモーターと操作可能に結合しているか、または最小プロモーターの制御下にある、核酸配列の転写）を活性化させるプロモーターの、全ての本質的要素を含む。一実施形態において、短縮型ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターは、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのうち少なくとも、コア領域、トランス活性型応答要素（ＴＡＲ）、またはそれらの組み合わせを含む。
「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」という用語は、外来性の核酸が、宿主細胞に移動または導入されるプロセスを意味する。「トランスフェクション」細胞または「形質転換」細胞または「形質導入」細胞とは、外来性の核酸と共にトランスフェクション、形質転換、または形質導入された細胞である。トランスフェクション細胞／形質転換細胞／形質導入細胞は、一次被検体細胞およびその子孫を含む。
本明細書において使用されるとき、疾患を「治療する」という用語は、被検体が経験する疾患または障害の、少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重篤度を、低減することを意味する。
「ベクター」とは、単離核酸を含む物質の組成物であり、細胞の内部に単離核酸を送達するのに使用することができる。ベクターの例としては、線状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。当該用語は、核酸の細胞への移動を促進する、非プラスミド化合物および非ウイルス性化合物（例えば、ポリリシン化合物およびリポソームなど）を含むとも解釈される。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、などが含まれるが、これらに限定されない。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な様態を、範囲の形式で示すことができる。範囲の型式による記載は、単に便宜および簡潔さのためのものであることを理解されたい。また、このような記載は、本発明の範囲における変更できない限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、具体的に開示された全ての取り得る部分範囲も含むと考えられるべきである。例えば、「１から６」という範囲の記載は、その範囲内の個々の数値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６）だけでなく、具体的に開示された部分範囲（１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６など）も含むと考えられるべきである。このことは、範囲の広さを問わず適用される。
任意のアミノ酸配列について、スイスプロットまたはＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号によって具体的に言及する場合、当該配列は参照によって本開示に援用される。シグナルペプチドの特定、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、プロモーター配列、および翻訳開始点などの寄託番号に関連する情報も、参照により全て本開示に援用される。
用語「パーセント配列同一性」は、任意のクエリ配列と対象配列との間の、同一性の程度を意味する。
用語「外来性」は、核酸またはポリペプチドが組み換え核酸コンストラクトの一部であるか、もしくは組み換え核酸コンストラクトにコードされていること、または、核酸またはポリペプチドがその自然環境にはないことを指す。例えば、外来性の核酸とは、ある種から別の種へ導入される配列（つまり、異種核酸）であり得る。典型的には、そのような外来性の核酸は、組み換え核酸コンストラクトを介して別の種へと導入される。外来性の核酸は、ある生物に固有の配列であって、その生物の細胞に再導入された配列であってもよい。外来性の核酸と結合した非天然配列（例えば、組み換え核酸コンストラクトにおいて、ネイティブ配列に隣接する非ネイティブ制御配列）の存在により、ネイティブ配列を含む外来性の核酸は、しばしば天然に存在する配列と区別されることがある。さらに、安定して形質転換された外来性の核酸は、一般的に、ネイティブ配列の位置とは別の位置に組込まれる。
「薬学的に許容できる」（または「薬理学的に許容できる」）という用語は、動物またはヒトに適宜投与されたときに、有害反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を起こさない、分子的実体および組成物を意味する。本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容できる物質の媒体として使用され得る、溶媒、分散媒、媒体、被膜、抗菌剤、等張性薬剤、および吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤、などのいずれかおよび全てを含む。
本明細書に使用されるとき、用語「キット」は、物質を送達する任意の送達システムを意味する。「キット」という用語は、研究用および臨床用の、両方の用途のキットを含む。反応分析の文脈において、そのような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器に入れられた、オリゴヌクレオチド、酵素、など）および／または補助的な物質（例えば、緩衝液、分析を行うための説明書、など）を、ある場所から別の場所へ保管、移送、または配達することを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助的な物質を格納する、１つ以上の格納容器（例えば、ボックス）を備えている。本明細書に使用されるとき、「分裂キット(fragmented kit)」という用語は、２つ以上の分離容器を備えており、それぞれが全キット構成要素の一部を格納している送達システムを意味する。当該容器は、対象とする受取人へ、一緒にまたは別々に届けられてもよい。例えば、第１の容器が分析に使用される酵素を格納し、一方、第２の容器がオリゴヌクレオチドまたはリポソームを格納してもよい。「分裂キット」という用語は、米連邦食品・医薬品・化粧品法のセクション５２０（ｅ）において規制される検体特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含することを意図しているが、これに限定されない。実際には、２つ以上の分離容器を備えており、それぞれが全キット構成要素の一部を格納している任意の送達システムは、「分裂キット」という用語に含まれる。対照的に、「結合キット(combined kit)」とは、１つの容器に反応分析用の全ての構成要素を格納している送達システム（例えば、所望の構成要素のそれぞれを格納する、１つのボックス）を意味する。「キット」という用語は、分裂キットおよび結合キットの両方を含む。
〔発明の詳細な説明〕
ＨＩＶ−１に感染した後すぐに、ウイルスゲノムは宿主の染色体に組み込まれ、ＣＤ４＋Ｔ−細胞において急速に発現する。ＨＩＶ−１の複製によって、ＣＤ４＋Ｔ−細胞は劇的に減少する。多くの場合、感染症の急性期の後、ウイルスは潜伏と呼ばれる新たな段階に入る。潜伏期においては、組み込みプロウイルスＤＮＡは発現し続け、ウイルス複製は非常に低いレベルで進行する。こうした状況下で、持続性のウイルス複製によって弱まった免疫システムはエイズへと進行し、多岐にわたる日和見感染症への罹患を引き起こし、治療されなければ最終的に３年以内に死に至る。分子レベルでは、急性期および慢性期の両方におけるウイルスゲノムの発現およびその複製は、５’長末端領域（ＬＴＲ）の４５０ヌクレオチドに及ぶウイルスプロモーターによって制御される。（i）５’−ＬＴＲのＵ３領域内のＤＮＡ配列を認識する、一連の細胞性転写要因と、（ii）ＨＩＶ−１の最初期転写活性化因子である、Ｔａｔ（ウイルス転写物のリーダー領域内に位置するＴＡＲ ＲＮＡ配列と相互に作用する）との間に、協働が生じる。これらの相互作用は、ウイルスＤＮＡの組み込みコピーからの転写を、能率的に開始および伸長させるために必要である。昨今の抗レトロウイルス性薬物は、ウイルス感染サイクルの抑制に有効であった。一方、それらは転写レベルでのウイルス性遺伝子の発現を抑制する、何らの成分も含んではいない。したがって、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）で施療中のＨＩＶ−１陽性患者において、非常に低いレベルではあるが、ウイルスの組み込みコピーがウイルスゲノムを発現し続けている可能性がある、という考えが支持されている。確かに、ウイルス性遺伝子の発現はＡＲＴの停止によって劇的に上昇し、それによって、ウイルス性の初期調節タンパク質（Ｔａｔなど）が産生され、併せてウイルスゲノムの増殖的複製も発生する。
したがって、本発明の実施形態は、再活性化の初期における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの条件つき活性化のための組成物に関する。これらの組成物は、ウイルス性遺伝子のセグメント（ウイルスプロモーターおよび／またはウイルスコーディング配列に及ぶ）を取り除くことにより、増殖性ウイルス複製に先立って、ウイルスの複製を完全かつ永久に除去する。実施形態において、組成物は、短縮された機能的ウイルスプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）をコードしている核酸配列を含む。ここで、上記短縮型ウイルスプロモーターは、最初期転写活性化因子に制御されており、そのためウイルス複製の初期段階において、制限的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを活性化する。単離核酸はさらに、ウイルスの標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ウイルスゲノムのセグメント（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはウイルスコーディング配列に及ぶセグメント）を切除する。これらの実施形態において、組成物は、任意のウイルスを切除するように構成される。特定の実施形態において、ウイルスはレトロウイルスである。
ウイルスゲノム（例えば、感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたＨＩＶ）は、ＲＮＡによって誘導された規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）を利用して、そのようなＨＩＶ感染細胞から除去され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素およびガイドＲＮＡを用いて治療的な遺伝子編集を成功させるためには、能率的および特異的な送達、ならびに標的細胞におけるＣａｓ９酵素およびガイドＲＮＡの発現が必要である。このことは、組織内または細胞集団内における受容細胞の割合が低い場合（強力な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を受けている患者のＨＩＶ感染細胞など）、困難である。
本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）は、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下に置かれる。エンドヌクレアーゼの発現は、したがって、Ｔａｔタンパク質を含む細胞において活性化される。本明細書において証明されるように、エンドヌクレアーゼの発現が短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下に置かれる場合、外来性Ｔａｔ（例えば、トランスフェクションによる）および内因性Ｔａｔ（例えば、潜伏ウイルスの再活性化による）の両方が、細胞株における（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の発現を活性化することができる。実施例の項でより詳しく記載した研究では、組成物によって、Ｔａｔ（ＨＩＶ−１トランス活性型因子）によるウイルスの再活性化の初期において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、条件つきで活性化される。本戦略では、（i）全ウイルスゲノムを除去するか、または（ii）ウイルスプロモーターおよび／またはウイルスコーディング配列に及ぶウイルス性遺伝子のセグメントを除去することによって、増殖性ウイルス複製に先立って、ウイルスの複製を完全かつ永久に除去する。
図１ＡはＨＩＶ ＬＴＲを示す模式図である。長さは約６４０ｂｐである。ＨＩＶ−１ ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域に分けられる。ＨＩＶ−１ゲノムの転写は、ウイルスゲノムの５’末端の長末端領域に広がる、一連のシス作用性調節モチーフによって制御される。ウイルスプロモーターのＵ３領域は、−１〜−４５４のヌクレオチドを占めており（転写開始点を＋１とする）、３つの下位領域（調節部位、エンハンサー、およびコア）を有している。エンハンサーはＮＦ−κＢ結合部位（−１２７〜−８０）を有している。コアドメインは、高ＧＣボックスおよびＴＡＴＡボックス（−８０〜＋１）を有している。ＬＴＲのＲ領域（＋１〜＋９８）はＴＡＲ、（発現したＲＮＡがステム−ループ構造を形成し、ウイルス性トランス活性型因子のための結合部位を提供する領域）を有している（Krebs et al, Lentiviral LTR-directed expression, sequence variation, disease pathogenesis. Los Alamos National Laboratory HIV Sequence: Compendium, pp. 29-70.2002）。
ＬＴＲは、遺伝子発現に必要な全てのシグナルを含み、宿主細胞のゲノムへのプロウイルスの組み込みに関連している。例えば、図１Ａに示す通り、コアプロモーター、エンハンサー、および調節領域はＵ３内にあり、ＴＡＲはＲ内にある。ＴＡＲ（Ｔａｔタンパク質および細胞性タンパク質の結合部位）は、ＨＩＶ−１におけるウイルス性ｍＲＮＡの最初の約４５個のヌクレオチドからなり、ヘアピン型ステム−ループ構造を形成する。ＨＩＶ−１において、Ｕ５領域はいくつかの下位領域を含む。例えば、ポリＡ（二量化およびゲノムパッケージングに関連する）、ＰＢＳまたはプライマー結合部位、Ｐｓｉまたはパッケージングシグナル、およびＤＩＳまたは二量体開始部位が挙げられる。
本発明によれば、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの少なくともコア領域およびＴＡＲ（トランス活性型応答要素）領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている単離核酸を含む組成物が提供される。短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターとは、全長よりも短いＨＩＶ ＬＴＲプロモーターを含む、有効な機能的プロモーターを意味する。短縮型プロモーターは、好ましくは、コア領域およびＴＡＲ領域を含み、調節領域および／またはエンハンサー領域の全て、または実質的に全てを含んでいない。他の実施形態において、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターは、コア領域、ＴＡＲ領域、および全てのまたは実質的に全てのエンハンサー領域を含み、調節領域は含まない。短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターは、Ｔａｔタンパク質に応答する。つまり、Ｔａｔは、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）の発現を、活性化することができる。本開示の組成物は、哺乳動物細胞におけるＨＩＶの不活性化、ＨＩＶ感染症を患う被検体の治療、感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクの低減、および／またはＨＩＶに感染した母からその子供へのＨＩＶの伝染リスクの低減、に利用することができる。本明細書に記載の治療方法は、他の抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴなど）と関連付けて行われてもよい。組成物は、診断用、研究用、および／または治療用のキットの一部として含まれていてもよい。
上述したように、抗レトロウイルス療法は、低いレベルのウイルスゲノム発現は抑制せず、潜伏感染細胞（休眠期記憶Ｔ細胞、単球、マクロファージ、小膠細胞、星状膠細胞、および腸関連リンパ系細胞など）を能率的に標的にしない。しかしながら、本明細書に記載の方法および組成物は一般に、あらゆる感染段階のＨＩＶ感染被検体の治療、またはＨＩＶ感染症のリスクのある非感染被検体にとって有用である。特に、本開示の方法および組成物は、感染症が潜伏期間にあるＨＩＶ感染被検体にとって有用である。また、本明細書に記載するように、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼにガイドＲＮＡが関連付けられている場合、ＨＩＶゲノムが宿主細胞から切断され、除去され得る。
ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターに操作可能に結合している、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む組成物によって、いくつかの有利な効果が実現され得る。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの発現を、ＨＩＶ遺伝子が発現している細胞および／または複製されている細胞に限定することによって、継続的な発現に起因する毒性作用の潜在リスクを、緩和および／または解消することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの免疫原性に起因する毒性を誘導する可能性は、本発明に係るエンドヌクレアーゼの低レベルおよび／または断続的な発現によって、軽減することができる。それと同時に、感染個体におけるＨＩＶゲノムの、除去または自壊を引き起こすことができる。さらに、本発明では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの持続的な発現が最小限に抑えられるため、リスクをかかえる個体のための予防的戦略を提供することができる。このように、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターによって駆動されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＨＩＶ感染被検体に対する安全な治療の提供、および感染症のリスクのある非感染個体の免疫化において利用することができる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは１つ以上の突然変異、欠失、挿入、バリアント、誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。プロモーターはキメラであってもよく、１つまたはキメラ化合物(one or chimeric compounds)を含んでいてもよい。
サイズの小さい核酸は、遺伝子療に適した送達機構（例えば、レトロウイルス）に格納しやすい。このことも、本明細書に記載のように、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下に置くことが有用である理由である。調節領域を含むプロモーターコンストラクトは、例えば、そのサイズおよび／またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの転写の変異効果(variable effects)のために、遺伝子療法にはあまり適さない可能性がある。さらに、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのうち、コア領域のＴＡＴＡボックスおよび全ＴＡＲ領域のみを含む組成物は、Ｃａｓ９を適切に発現することができない（データ示さず）。ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの全コア領域、ＴＡＲ領域、および任意にエンハンサーを含む組成物（図１Ａ参照）は、投与量に依存する形で、Ｔａｔ誘導性のＣａｓ９の発現を促進することができる。
短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの−８０〜＋６６の位置のヌクレオチドを有する核酸を含んでもよい。一実施形態において、短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターは、ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの−１２０〜＋６６の位置を有する核酸を含んでもよい。好ましくは、短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターは調節領域に由来する配列を含まない。
本明細書に記載の通り、全長および短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーター配列は、ｐＮＬ４−３ＨＩＶベクター（NIH AIDS Reagent program #114）を用いたＰＣＲによって得た。テンプレートおよびプライマーを下記の表に示す。
Figure 2018510219
配列の列において太字のヌクレオチドは、それぞれ、プライマー名の列において太字で示されている制限酵素の、切断箇所に対応する。図１Ａに示すように、各プライマーを利用してＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーター配列の、異なる大きさのセグメントを作製した。例えば、ＬＴＲ−４５４／＋６６は、Ｕ３領域の全部およびＲ領域の一部を含む。対照的に、ＬＴＲ−８０／＋６６は、Ｕ３のコア領域およびＲのＴＡＲ領域に対応する。ＬＴＲ−３８／＋６６ヌクレオチド配列は、Ｔａｔに対する応答におけるＣａｓ９の発現を、検知可能なレベルで十分に駆動することができなかった（データ示さず）。
本発明の短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターは、Ｕ３のコア領域、およびＴＡＲを含むセグメントに対応する。コア領域は、ＴＡＴＡボックス、および高ＧＣ領域（ＳＰ１の標的になり得る）を含む。いくつかの構成において、図１Ａに示すように、短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターは、−１２０〜−８０の位置のエンハンサーを含んでもよい。
短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）の発現を駆動するのに利用されてもよい。そのようなエンドヌクレアーゼは、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５３４４１号（ＷＯ２０１５／０３１７７５）（２０１４年８月２９日出願；２０１５年３月５日公開）に記載されている（その全ての開示は、参照により本開示に援用される）。上述した通り、ＨＩＶゲノムは、ＨＩＶに感染した個体の宿主ゲノムに組み込まれる。この組み込み配列は、その後、宿主によって複製される。潜伏期間であっても、Ｔａｔは細胞によって産生され得る。本発明の組成物は、宿主におけるプロウイルス性ポリヌクレオチドの存在を、除去および／または低減する。本発明に係るＴａｔ応答プロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを駆動するため、Ｔａｔが存在する場合にはいつでも（例えば、感染細胞によって産生される場合）、エンドヌクレアーゼが産生され、新生ポリヌクレオチドを分解する。ウイルスが活性状態にない場合、エンドヌクレアーゼは産生されない。このようにして、エンドヌクレアーゼの継続的な発現によって細胞および／または宿主に対する及ぼされ得る、潜在的毒性作用が回避される。また、産生されるエンドヌクレアーゼの量は、図３および図４について後述する通り、存在するＴａｔの量に比例する。
特定の実施形態において、単離核酸配列は、配列番号１〜２１の何れか１つに対して少なくとも５０％の配列類似性を有する。
特定の実施形態において、単離核酸配列は、配列番号１〜２１の何れか１つに対して少なくとも７０％の配列類似性を有する。
特定の実施形態において、単離核酸配列は、配列番号１〜２１の何れか１つに対して少なくとも７５％の配列類似性を有する。
特定の実施形態において、単離核酸配列は、配列番号１〜１７の何れか１つに対して少なくとも８５％の配列類似性を有し、配列番号１〜２１の何れか１つに対して約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列類似性を有する。
特定の実施形態において、単離核酸配列は、配列番号１〜２１の何れか１つまたはそれらの組み合わせを有する。
本明細書に記載の組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）をコードしている核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＨＩＶの標的配列に相補的な１つ以上のガイドＲＮＡもコードされていてもよい。細菌において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は可動遺伝因子（ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド）に対する、ＲＮＡ誘導性の適応免疫システムをコードしている。３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが特定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー（以前に経験した可動因子に相補的な配列）を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写およびプロセシングを経て、成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）となる。Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、切断標的のＤＮＡに対して強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、（i）成熟ｃｒＲＮＡ（約２０塩基対（ｂｐ）の固有の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を有する）、および（ii）トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（前駆体ｃｒＲＮＡの、リボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングのためのガイドとして機能する）によって誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡのスペーサーと標的ＤＮＡの相補的な配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的な塩基対合を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡへ誘導する。Ｃａｓ９はトリヌクレオチド（ＮＧＧ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、切断箇所（ＰＡＭからの３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別々に発現してもよい。または、合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工的に融合された小型ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成して、天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖と同様に作用させてもよい。そのようなｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡのように、（i）合成してもよいし、（ii）ＲＮＡを直接トランスフェクションするために、インビトロで転写してもよいし、または、（iii）Ｕ６もしくはＨ１をプロモーターとするＲＮＡ発現ベクターによって発現させてもよい。しかしながら、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現するシステムのものよりも低い。
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであってもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Streptococcus pyogenesの配列と、同一のヌクレオチド配列を有してもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種に由来する配列であってもよく、例えば、他のStreptococcus sp.（thermophilesなど）に由来してもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、下記に挙げる他の種に由来するものであってもよいが、これらに限定されない：Nocardiopsis dassonvillei、Streptomyces pristinaespiralis、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces roseum、Alicyclobacillus acidocaldarius、Bacillus pseudomycoides、Bacillus selenitireducens、Exiguobacterium sibiricum、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus salivarius、Microscilla marina、Burkholderiales bacterium、Polaromonas naphthalenivorans、Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、Cyanothece sp.、Microcystis aeruginosa、Synechococcus sp.、Acetohalobium arabaticum、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus desulforudis、Clostridium botulinum、Clostridium difficle、Finegoldia magna、Natranaerobius thermophilus、Pelotomaculum thermopropionicum、Acidithiobacillus caldus、Acidithiobacillus ferrooxidans、Allochromatium vinosum、Marinobacter sp.、Nitrosococcus halophilus、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、Anabaena variabilis、Nodularia spumigena、Nostoc sp.、Arthrospira maxima、Arthrospira platensis、Arthrospira sp.、Lyngbya sp.、Microcoleus chthonoplastes、Oscillatoria sp.、Petrotoga mobilis、Thermosipho africanus、またはAcaryochloris marina、Psuedomona aeruginosa、Escherichia coli。または、配列が決定された他の細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物も、本明細書に記載の実施形態において利用されるＣａｓ９配列の起源となり得る。
野生型Streptococcus pyogenesのＣａｓ９配列は、修飾されていてもよい。核酸配列は、哺乳動物細胞における能率的な発現のために、コドン最適化（つまり、「ヒト化」）されていてよい。配列は、例えば、以下のＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号である発現ベクターのいずれかによってコードされている、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列であってもよい：ＫＭ０９９２３１．１ ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１ ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１ ＧＩ：６６９１９３７６５。別の場合として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、市販のベクター（例えば、Addgene(Cambridge, MA)製のＰＸ３３０またはＰＸ２６０など）内に含まれる配列であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、以下のいずれかのＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列の、バリアントまたはフラグメントであるアミノ酸配列を有してもよい：ＫＭ０９９２３１．１ ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１ ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１ ＧＩ：６６９１９３７６５。または、ＰＸ３３０もしくはＰＸ２６０（Addgene, Cambridge, MA）のＣａｓ９アミノ酸配列の、バリアントまたはフラグメントであるアミノ酸配列を有していてもよい。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物学的に活性なバリアントをコードしているように、修飾されてもよい。これらのバリアントは、例えば、１つ以上の変異（例えば、付加変異、欠失変異、もしくは置換変異、またはそのような変異の組み合わせ）を含むという点で、野生型Ｃａｓ９とは異なっているアミノ酸配列を有していてもよいし、または含んでいてもよい。１つ以上の置換変異は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）であってもよい。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して、少なくとも５０％または約５０％の配列同一性（例えば、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有していてもよい。保存的アミノ酸置換は、一般的に、以下の群の中における置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。Ｃａｓ９アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基であってもよい。天然アミノ酸残基は、遺伝暗号によって天然にコードされたものに加えて、標準的でないアミノ酸（例えば、Ｌ型ではなくＤ型のアミノ酸）も含む。本発明のペプチドは、標準的な残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基も含んでもよい（例えば、ピロリジンをリジンの代わりに使用してもよく、セレノシステインをシステインの代わりに使用してもよい）。非天然アミノ酸残基は、天然に存在しないが、アミノ酸の基本式に合致するものであり、ペプチドに組み込まれることができる。これらには、Ｄ−アロイソロイシン（（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル吉草酸）およびＬ−シクロペンチルグリシン（（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸）が含まれる。他の例は、教科書またはワールドワイドウェブで調べることができる（現在カリフォルニア工科大学が運営しているサイトでは、機能タンパク質に正常に組み込まれた非天然アミノ酸の構造が公開されている）。
本発明の組成物および方法は、ＨＩＶにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードしている配列を含んでもよい。ＨＩＶの遺伝的変異は、すでに記載した複数のグループおよびサブタイプにおいて反映される。ＨＩＶ配列のコレクションは、ロスアラモスＨＩＶデータベースおよび一覧表（つまり、配列データベースウェブサイト：hitp://www.hiv.lani.gov）にまとめられている。本発明の方法および組成物は、上述の様々なグループ、サブタイプ、および組み換え流行株のうち、任意のＨＩＶに適用可能である。これらには、例えば、ＨＩＶ−１メジャーグループ（グループＭとも称される）およびマイナーグループ（グループＮ、０、およびＰ）、さらに、以下の任意のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、および、Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＨＩＶのグループ（例えば、以下の任意のグループＮ、０、およびＰがあるが、これらに限定されない）も挙げられる。
ガイドＲＮＡは、コーディングまたは非コーディング配列（つまり、標的配列）に好意的な配列(sequence complimentary to)であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ＨＩＶの長末端反復（ＬＴＲ）領域に相補的な配列であってもよい（ただし、Ｃａｓ９遺伝子と操作可能に結合している短縮型Ｔａｔ応答プロモーターに提示するのに利用される部分を除く配列）。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載のような短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターに対応する配列を、標的にすることはできない。その理由は、それがコンストラクト自体の分解につながり、それ故、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターによって駆動されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼから与えられる利点が、損なわれる恐れがあるからである。したがって、ガイドＲＮＡは、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶプロモーターの一部である配列は選択せずに、ＨＩＶ−１のＵ３領域、Ｒ領域、および／またはＵ５領域のレファレンス配列またはコンセンサス配列中の配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、コーディング配列（１つ以上のウイルス性構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、およびｔａｔ）をコードしている配列など）に相補的な配列であってもよい。したがって、配列は、以下のタンパク質中の配列に相補的であってもよい：ｇａｇポリタンパク質、例えば、ＭＡ（マトリクスタンパク質、ｐ１７）；ＣＡ（カプシドタンパク質、ｐ２４）；ＮＣ（ヌクレオカプシドタンパク質、ｐ７）；およびＰ６タンパク質；ｐｏｌ、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮアーゼＨ、インテグラーゼ（ＩＮ）、およびＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）；ｅｎｖ、例えば、ｇｐ１６０、またはｇｐ１６０の切断産物（例えば、ｇｐ１２０またはＳＵ）、およびｇｐ４ｌまたはＴＭ；またはｔａｔ、例えば、７２アミノ酸・１エクソンＴａｔまたは８６−１０１アミノ酸・２エクソンＴａｔ。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、補助タンパク質（例えば、ｖｉｆ、ｎ ｗｉｌｌｅｆ（ネガティブ因子）、ｖｐｕ（ウイルスタンパク質Ｕ）およびｔｅｖを含む）をコードしている配列に相補的な配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列は、構造要素または調節要素（ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ（シス作用性抑制配列）、および／またはＩＮＳなど）に相補的な配列（つまり、標的配列）であってもよい。ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）は、ＨＩＶのｅｎｖ領域内にコードされているＲＮＡ要素であり、約２００ヌクレオチドが含まれる（ＨＩＶ−１の転写開始点から７７１０番目〜８０６１番目に位置し、ｇｐ１２０およびｇｐ４ｌの境界に広がっている）。ＰＥ（Ｐｓｉ要素）は、Ｇａｇ開始コドンに先行および重複している、４組のステム−ループ構造に対応する。ＳＬＩＰは、ステム−ループ構造の上流にあるＴＴＴＴＴＴ（「スリッパリー部位」）である。ＣＲＳ（シス作用性抑制配列）。ＩＮＳ（阻害／不安定ＲＮＡ配列）は、例えば、ＨＩＶ−１のｇａｇ領域における４１４番目〜６３１番目のヌクレオチドに見られる。
ガイドＲＮＡ配列は、センス配列またはアンチセンス配列であってもよい。一般的に、ガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭを含む。ＰＡＭの配列は、使用されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異的な要請に応じて、変わり得る。S. pyogenesに由来するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいては、標的ＤＮＡは、一般的に５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する。したがって、S. pyogenesＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列はＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ、またはＧＧＧであり得る。他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ特異性を有し得る。例えば、S. thermophilusに由来するＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１に対して５’−ＮＮＡＧＡＡ、ＣＲＩＳＰＲ３に対して５’−ＮＧＧＮＧが必要である。Neiseria menigiditisに由来するＣａｓ９は、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴが必要である。ガイドＲＮＡの具体的な配列は変わり得る。しかし有用なガイドＲＮＡ配列とは、配列に関係なく、オフターゲット効果を最小限にしつつ、高効率を達成し、ゲノム的に組み込まれたＨＩＶプロウイルスの除去を完遂する配列である。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０から約６０ヌクレオチド、またはそれ以上いずれかであり、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０ヌクレオチド、またはそれ以上である。外来ウイルスゲノムと宿主細胞ゲノム（内因性レトロウイルスＤＮＡを含む）との相同性が非常に低い領域を特定する有用な選別方法としては、１２ｂｐ＋ＮＧＧの標的選択規準を用いた生物情報的スクリーニングにより、オフターゲットのヒトトランスクリプトームまたは（稀ではあるが）非翻訳ゲノム部位を除外する方法；ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーター（宿主ゲノム中に潜在的に保存されている）内の、転写因子結合部位を避ける方法；（i）ＬＴＲ−Ａ−およびＬＴＲ−Ｂ−に特異的な、３０ｂｐのガイドＲＮＡおよび元来の細菌免疫システムを反映している前駆ｃｒＲＮＡシステムを選択して、２０ｂｐのガイドＲＮＡおよびキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃＲＮＡ系システムに対する特異性／効率を向上させる。（ii）ＷＧＳ、サンガーシーケンシング、およびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって、潜在的なオフターゲット効果を特定し、除去する方法；が挙げられる。
ガイドＲＮＡ配列は１つの配列として構成されてもよく、または１つ以上の異なる配列の組み合わせ（例えば、多重構造）として構成されてもよい。多重構造は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の異なるガイドＲＮＡの組み合わせを含んでもよい。例えば、Ｕ３、Ｒ、またはＵ５中の配列（ただし、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶプロモーターの一部である配列を選択しない）の組み合わせを含んでもよい。発現ベクターによって組成物を投与する場合、ガイドＲＮＡは１つのベクターによってコードされてもよい。または、複数のベクターを、それぞれが２つ以上の異なるガイドＲＮＡを含むように設計してもよい。有用な構成によって、切断箇所の間のウイルス性配列を切除することができる。その結果、ＨＩＶゲノムまたはＨＩＶタンパク質発現を、除去することができる。このように、２つ以上の異なるガイドＲＮＡを使用することによって、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって認識された切断箇所の間における、ウイルス性配列の切除が促進される。切除された領域の大きさは、１ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまで、様々であり得る。切除された領域の典型例は、実施例に記載する。
組成物が核酸として投与されるかまたは発現ベクター内に含まれる場合、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ配列と同じ核酸またはベクターによってコードされていてもよい。他の場合（または、これに加えて）、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ配列から物理的に分離した核酸においてコードされていてもよいし、または分離したベクター中にコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、１つ以上の修飾核酸塩基を含むように設計される。例えば、ＲＮＡ分子の公知の修飾としては、例えば、Genes VI, Chapter 9 ("Interpreting the Genetic Code")、Lewis, ed. (1997, Oxford University Press, New York)、およびModification and Editing of RNA, Grosjean and Benne, eds. (1998, ASM Press, Washington DC)に記載されている。修飾されたＲＮＡ成分としては、以下が挙げられる：２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４−２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；５−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−ホルミルシチジン；２’−Ｏ−メチル−５−ホルマイルシチジン；３−メチルシチジン；２−チオシチジン；リシジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；４−チオウリジン；リボシルチミン；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メトキシウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；５−カルボキシメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−チオウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２’−メチルアデノシン；２−メチルアデノシン；Ｎ６Ｎメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；２メチルチオ−Ｎ６Ｎイソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；Ｎ６−（グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）；イノシン；２’Ｏ−メチルイノシン；１−メチルイノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）；７−メチルグアノシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；ワイオシン；メチルワイオシン；修飾中ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；クエオシン；エポキシクエオシン；ガラクトシル−クエオシン；マンノシル−クエオシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アラカエオシン［７−ホルムアミド−７−デアザグアノシンとも呼ばれる］；および７−アミノメチル−７−デアザグアノシン。
単離核酸分子は、標準的な技術によって作製することができる。例えば、本明細書に記載のヌクレオチド配列（本明細書に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む）を有する単離核酸は、ＰＣＲ技術を用いて得ることができる。ＤＮＡおよびＲＮＡ由来の特異的な配列（全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡから得られる配列を含む）を、ＰＣＲを用いて増幅することができる。様々なＰＣＲ方法が、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。一般的に、対象領域の末端またはその先の領域の配列情報を用いて、増幅すべきテンプレートの逆側の鎖と配列が同一または類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。様々なＰＣＲ戦略も利用することができ、これによって、部位特異的ヌクレオチド配列修飾をテンプレート核酸に導入できる。
単離核酸は、１つの核酸分子として化学合成されてもよいし（例えば、ホスホラミダイト法を用いた、３’から５’方向の自動ＤＮＡ合成を用いて）、または一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成されてもよい。例えば、１つ以上の長鎖オリゴヌクレオチド対（例えば、５０超〜１００ヌクレオチド）を、目的の配列を有するように合成してもよい。上記合成においては、それぞれのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングされたときに二本鎖となる領域を形成するような、相補的な短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を有している。ＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドの伸長に使用され、その結果、各オリゴヌクレオチド対につき１つの二本鎖核酸分子が得られる。そして、この二本鎖核酸分子は、ベクター内にライゲーションされ得る。本発明の単離核酸は、例えば、Ｃａｓ９をコードしているＤＮＡの天然状態の領域に対する、突然変異の発生によっても得られる（例えば、上述の方式に基づいて）。
２つの核酸またはそれらがコードしているポリペプチドは、互いにある程度の同一性を有するものとして記載され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびその生物活性を有するバリアントは、ある程度の同一性を示すものとして記載され得る。短いＣａｓ９配列をProtein Information Research（ＰＩＲ）のサイト（http://pir.georgetown.edu）に入力すれば、アラインメントを組み立てられる。続けて、ＮＣＢＩのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）で、Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）のアルゴリズム"short nearly identical sequences"を用いて分析を行うことができる。
Ｃａｓ９とのパーセント配列同一性を判定することが可能である。特定されたバリアントは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとして利用されてもよいし、および／または、その薬学的組成物としての有効性を分析されてもよい。天然のＣａｓ９をクエリ配列とし、Ｃａｓ９タンパク質のフラグメントを対象配列としてもよい。同様に、Ｃａｓ９タンパク質のフラグメントがクエリ配列とし、その生物活性を有するバリアントを対象配列としてもよい。配列同一性を判定するために、クエリ核酸配列またはクエリアミノ酸配列を、コンピュータプログラムClustalW（バージョン１．８３、標準のパラメータ）を用いて、それぞれ１つ以上の対象核酸配列または対象アミノ酸配列と整列させてもよい。これにより、核酸配列またはタンパク質配列の全長にわたるアラインメントが得られる（グローバル・アラインメント）。Chenna et al., Nucleic Acids Res. 31:3497-3500, 2003を参照せよ。
本発明では、組み換えコンストラクトも提供される。この組み換えコンストラクトは、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下においてＣａｓ９を発現させるための、細胞の形質転換に使用することができる。同様に、組み換えコンストラクトは、ＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現させるために利用されてもよい。組み換え核酸コンストラクトは、本明細書に記載のように、Ｃａｓ９および／またはガイドＲＮＡ（ＨＩＶにおける標的配列に相補的な）をコードしている核酸であって、Ｃａｓ９および／またはガイドＲＮＡ（ＨＩＶにおける標的配列に相補的な）を細胞中で発現させるのに適した調節領域と操作可能に結合している核酸を含む。多数の核酸により特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得ることが、理解されるであろう。遺伝コードの縮重が、当該技術分野でよく知られている。多くのアミノ酸では、１つより多いヌクレオチド・トリプレットが、アミノ酸のコドンとして機能している。例えば、特定の生物において最適な発現が得られるように、その生物にとって適切なコドンバイアス表を用いて、Ｃａｓ９をコードしている配列中のコドンを変更してもよい。
本明細書に記載の核酸は、ベクターに含まれていてもよい。ベクターは、例えば、複製開始点、足場付着領域（ＳＡＲ）、および／またはマーカーを含んでいてもよい。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選別が可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）に対する抵抗性などの、殺生物剤抵抗性を与えることができる。発現ベクターは、発現するポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計された、タグ配列を含んでもよい。タグ配列（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦｌａｇ（登録商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）配列など）は、一般的に、コードされているポリペプチドと融合した状態で発現する。そのようなタグは、ポリペプチド中のどの場所に挿入されてもよい（カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかをも含む）。
また、追加の発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ配列のセグメント、非染色体ＤＮＡ配列のセグメント、および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含んでもよい。好適なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌性プラスミドの誘導体（例えば、E. coliプラスミドであるｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド）；ファージＤＮＡ（例えば、ファージ１の多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９）、および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３）、および線維状一本鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（２μプラスミドなど）またはその誘導体、真核細胞において有用なベクター（昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなど）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから得られるベクター（ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミドなど）が挙げられる。
インビトロ系（培養細胞）およびインビボ系（動物および患者）のために、Ｃａｓ９遺伝子と操作可能に結合している短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと、いくつかの送達方法とを組み合わせて利用してもよい。一実施形態において、レンチウイルス性遺伝子送達システムを利用してもよい。そのようなシステムによって、幅広い親和性および大きなＤＮＡを挿入する余地を備えつつ、分裂細胞および非分裂細胞において、遺伝子が安定的に長期間存在することができる（Dull et al, J Virol, 72:8463-8471 1998）。一実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を送達方法として利用してもよい。ＡＡＶは非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスであり、インビトロ系およびインビボ系における治療的遺伝子の送達に、近年積極的に採用されている（Choi et al, Curr Gene Ther, 5:299-310, 2005）。非ウイルス性の送達方法の例としては、ナノ粒子技術を利用してもよい。このプラットホームは、インビボにおいて、医薬としての有用性を示した。ナノテクノロジーによって、強固な上皮性関門および内皮性関門を通過する、薬物のトランスサイトーシスが向上した。ナノテクノロジーによって、特異的に、その搭載薬物が目的の細胞および組織へ送達される（Allen and Cullis, Science, 303:1818-1822, 1998）。
ベクターは、調節領域も含んでもよい。「調節領域」という用語は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写産物または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を意味する。調節領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導要素、タンパク質結合配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、およびイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。
「操作可能に結合している」という用語は、調節領域および転写される配列が、当該配列が配列の転写または翻訳に影響を及ぼすように、核酸中に位置していることを意味する。例えば、コーディング配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始点は、一般的に、プロモーターから１〜約５０ヌクレオチドに下流に位置する。しかしながら、プロモーターは翻訳開始点から約５，０００ヌクレオチドも上流に位置してもよく、または、転写開始点から約２，０００ヌクレオチドも上流に位置してもよい。プロモーターは、一般的に、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターは、少なくとも１つの制御要素（エンハンサー配列、上流要素、または上流活性化領域（ＵＡＲ）など）も含み得る。含まれるプロモーターは、いくつかの要因に合わせて選択される。当該要因としては、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、ならびに細胞または組織優先的な発現が挙げられるが、これらに限定されない。コーディング配列に関連するプロモーターおよび他の調節領域を、適宜選択および配置することによりコーディング配列の発現を調節することは、当業者にとっては通常の事項である。
ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスＡｄ、ＡＡＶ、レンチウイルス、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびレトロウイルスなど）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびにポリヌクレオチドの宿主細胞への送達を仲介できる他の高分子複合体、が挙げられる。ベクターは、他の要素または機能性も備えてもよい。当該他の要素または機能性としては、（i）遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節するもの、または（ii）その他の有益な性質を標的細胞に与えるもの、が挙げられる。下記に詳細に記載・説明する通り、そのような他の要素としては、例えば、細胞に対する結合または標的化に影響を及ぼす要素（細胞型または組織特異的な結合を媒介する要素を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす要素；取り込み後、細胞内におけるポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす要素（核局在化を仲介する薬剤など）；および、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす要素、が挙げられる。そのような要素としてはまた、マーカーも含まれ得る。このようなマーカーには、ベクターによって送達された核酸を取り込み発現している細胞の検知または選別に使用できる、検知可能および／または選別可能なマーカーが挙げられる。上記の要素はベクターに本来備わっている性質として得られてもよく（結合および取り込みを仲介する要素または機能性を有する、特定のウイルスベクターの使用など）、または、上記の機能性が得られるようにベクターを修飾してもよい。他のベクターとしては、Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)に記載のものが挙げられる。そのようなベクターは、様々な種類が当該技術分野で知られており、一般的に入手可能である。「組み換えウイルスベクター」とは、１つ以上の異種遺伝子産物または配列を含んでいる、ウイルスベクターを意味する。多くのウイルスベクターは格納物に関して大きさの制約があるので、異種遺伝子産物または配列は、一般的に、ウイルスゲノムの１つ以上の部分を置換することによって導入される。そのようなウイルスは複製欠損性であることがあり、ウイルス複製およびカプシド形成に際して、欠失した機能をトランスに提供される必要がある（例えば、複製および／またはカプシド形成に必要な遺伝子産物を輸送する、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を用いて）。送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側に配置されている、改変ウイルスベクターも記載されている（例えば、Curiel, D T, et al. PNAS 88: 8850-8854, 1991を参照）。
さらなるベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学複合体が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、Moloneyマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶ系ウイルスが挙げられる。あるＨＩＶ系ウイルスベクターは、少なくとも２つのベクターを含み、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノムから得られ、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルスから得られる。ＤＮＡウイルスベクターとしては、ポックスベクター（orthopoxベクターまたはavipoxベクターなど）、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクターなど）［Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)］、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)］、およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M.G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)］がある。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ送達ビヒクル（カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなど）と共に使用されてもよい。リポソームの調製、標的化、および内容物の送達の手順としては、Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988)を参照。また、Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989)およびMaurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)も参照。
複製欠損性組み換えアデノウイルスベクターは、公知の技術によって作製することができる。Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992);およびRosenfeld, et al., Cell, 68:143-155 (1992)を参照。
別の送達方法では、細胞内で発現産物を産生されられる、一本鎖ＤＮＡ産生ベクターを用いる。例えば、Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)を参照（その全てが参照により本開示に援用される）。
上述した通り、本発明の組成物は、当業者に公知の様々な方法によって調製することができる。その原材料またはそれを得る方法にかかわらず、本明細書に記載の組成物は、その用途に合わせて製剤され得る。例えば、上述した核酸およびベクターは、組織培養の細胞に適用するための組成物、または、患者もしくは被検体に投与するための組成物として、製剤できる。本発明の薬学的組成物はいずれも、医薬品の調製への使用のために製剤され得る。特定の用途は、治療（例えば、ＨＩＶ感染症を患う被検体またはＨＩＶ感染症のリスクがある被検体の治療）という文脈の中で後述されている。医薬として用いられる場合、任意の核酸およびベクターを、薬学的組成物の形態で投与してもよい。それらの組成物は、薬学の分野において周知の方法で調製することが可能である。また、局所的治療と全身治療のいずれが望まれるかに応じて、さらに治療される部位に応じて、様々な経路で投与することができる。投与としては、局所投与（点眼および粘膜（鼻腔、膣、および直腸を含む）への送達を含む）、肺内投与（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送（噴霧器によるものを含む）による；気管内、鼻腔内、表皮、および経皮）、点眼投与、経口投与、または非経口投与が挙げられる。目への送達方法としては、（i）局所投与（点眼）、（ii）結膜下、眼周囲もしくは硝子体内への注射、または（iii）バルーンカテーテルもしくは手術により結膜嚢に配置された眼内挿入物による導入、が挙げられる。非経口投与としては、（i）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは注入、または（ii）頭蓋内投与（例えば、クモ膜下投与またはは脳室内投与）が挙げられる。非経口投与は、単回のボーラス投与の形態で行われてもよい。または、例えば、連続潅流ポンプによって行われてもよい。局所投与用の薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴薬、座薬、スプレー、液体、粉末、などが挙げられる。従来の薬学的担体（水系、粉末系または油系の基剤、増粘剤など）が、必要であるかまたは望ましい場合がある。
薬学的組成物は、本明細書に記載の核酸およびベクターを有効成分として含み、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。本発明の組成物を調製する際、当該有効成分は一般的に賦形剤と混合され、（i）賦形剤によって希釈されるか、または（ii）担体（例えば、カプセル、錠剤、小袋、紙包み、またはその他の容器の形態である）の中に封入される。賦形剤が希釈剤として機能する場合、当該賦形剤は、固体、半固体、または液体（例えば、生理食塩水）であってもよく、有効成分用のビヒクル、担体、または媒体としての役割を果たす。したがって、組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ、エアロゾル（固体または液体媒体中の）、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、ならびに無菌包装粉末の形態であり得る。当該技術分野で知られている通り、希釈剤の種類は、目的とする投与経路に合わせて変わり得る。得られる組成物は、追加の薬剤（防腐剤など）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、担体は、脂質系もしくは重合体系コロイドであるか、またはこれらを含んでもよい。いくつかの実施形態において、担体物質は、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルとして製剤された、コロイドであってもよい。上述の通り、担体物質はカプセルを形成してもよく、その材料は重合体系コロイドであってもよい。
本発明の核酸配列は、被検体の適切な細胞へと送達され得る。これは、例えば、食細胞（マクロファージなど）による食作用に最適な大きさの、高分子送達媒体、生物分解性微粒子送達媒体、またはマイクロカプセル送達媒体を用いることで達成し得る。例えば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微粒子を、使用することができる。ポリヌクレオチドはこれらの微粒子内に格納され、マクロファージによって取り込まれて、細胞内で徐々に生分解される。これによって、ポリヌクレオチドが放出される。ポリヌクレオチドが放出されると、細胞内でＤＮＡが発現する。第２の種類の微粒子は細胞によって直接取り込まれず、主に核酸の徐放性保有体として機能する。上記核酸は、生分解を通じて微粒子から放出されたときのみ、細胞によって取り込まれる。したがって、これらの高分子粒子は、食作用を妨げるために、十分な大きさであるべきである（つまり、５μｍより大きく、好ましくは２０μｍより大きい）。核酸を能動的に取り込む別の方法では、リポソーム（標準的な方法で調製される）を使用する。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で組み込まれてもよく、組織特異的抗体と共に組み込まれてもよい。当該組織特異的抗体としては、例えば、ＨＩＶ感染症の一般的な潜伏感染保有体である、細胞型（例えば、脳マクロファージ、小膠細胞、星状膠細胞、および腸関連リンパ系細胞）を標的にする抗体が挙げられる。別の場合としては、電気的にまたは共有結合によってポリ−Ｌ−リジンに結合している、プラスミドまたは他のベクターから構成される分子複合体を調製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞の受容体に結合し得るリガンドに、結合する。インビボでの発現を実現する別の手段では、「そのままのＤＮＡ」（つまり、送達媒体を含まない）を、筋肉内、皮膚内または皮下の部位へ送達する。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、上述したように、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（および任意構成でガイドＲＮＡ）をコードしている配列を含む単離核酸配列をコードしている核酸配列は、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合する。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ナノ粒子として製剤されてもよい。当該ナノ粒子は、例えば、（i）ＤＮＡと複合体を形成している、高分子量の線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）からなるコアを有し、さらに（ii）ポリエチレングリコールによって修飾された（ＰＥＧ化された）低分子量のＬＰＥＩからなるシェルによって覆われている、ナノ粒子である。
核酸およびベクターは、器具（例えば、カテーテル）の表面に適用されてもよく、またはポンプ、パッチ、または他の薬物送達装置内に含まれていてもよい。本明細書に記載の核酸およびベクターは単独で投与されてもよいし、薬学的に許容できる賦形剤または担体（例えば、生理的食塩水）の存在下において混合物として投与されてもよい。賦形剤または担体は、投与の方法および経路に基づいて選択される。好適な薬学的担体は、医薬製剤における使用のための医薬必需品と共に、当該分野においてよく知られた参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)およびUSP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formulary)に記載されている。
いくつかの実施形態において、組成物は、ＨＩＶの性感染を防止する局所ゲルとして製剤されてもよい。局所ゲルは、性交に先立って、男性器または女性器の皮膚または粘膜に直接塗布することができる。他の場合（またはそれに加えて）、局所ゲルは、男性用または女性用のコンドームまたはペッサリーの表面に塗布されるか、またはそれらの中に収容されていてもよい。
いくつかの実施形態において、組成物は、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合しているＣａｓ９（またはバリアントＣａｓ９）をコードしている核酸を内包している、ナノ粒子として製剤されてもよい。核酸は、標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列をさらにコードしていてもよい。
本発明の製剤は、Ｃａｓ９および標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列をコードしているベクターを包含し得る。ガイドＲＮＡ配列は、前述したとおり、１つの標的領域に相補的な配列を含んでもよく、または、複数の標的領域に相補的な配列の任意の組み合わせを含んでもよい。他の場合として、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターによって駆動されるＣａｓ９をコードしている配列と、ガイドＲＮＡ配列をコードしている配列とは、別々のベクターに含まれる配列であってもよい。
本明細書に記載の組成物は、概して、ＨＩＶ感染症を患う被検体の治療にとって、様々な形で有用である。当該方法は、任意のＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ＳＩＶ、およびそれらの組み換え流行株を標的とするのに有用である。臨床的に有益な結果が得られる場合は常に、被検体は効果的に治療されている。これは、例えば、疾患の症状の完全な解消、疾患の症状の重篤度の低減、または疾患の進行の減速を意味し得る。これらの方法はさらに、以下の工程を含んでもよい：ａ）ＨＩＶ感染症を患う被検体を特定する工程（例えば患者、より具体的にはヒト患者）；およびｂ）短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下にあるＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をコードしている核酸を含む組成物を被検体に与える工程。当該方法はさらに、ＨＩＶ標的配列（例えばＨＩＶ ＬＴＲ）に相補的なガイドＲＮＡをコードしている配列を、被検体に与える工程を含んでもよい。
被検体は、標準的な臨床テストを用いて特定することができる。当該標準的な臨床テストとしては、例えば、被検体の血清におけるＨＩＶ抗体またはＨＩＶポリペプチドｐ２４の存在を検知するイムノアッセイ、またはＨＩＶ核酸増幅分析が挙げられる。被験体に与えられる組成物の量であって、感染症の症状の完全解消、感染症の症状の重篤度の低減、または感染症の進行の減速をもたらす量を、治療上有効な量とみなす。本発明の方法は、投与量および投与計画を最適化するための監視工程に加えて、結果を予測する工程も含んでもよい。本発明のいくつかの方法において、まず患者が潜伏期のＨＩＶ感染症であるか否かを判定し、その後、本明細書に記載の１つ以上の組成物を用いて患者を治療するか否かを決定してもよい。薬物抵抗の発現を検知し、応答性患者を非応答性患者と迅速に区別するためにも、監視工程を利用することができる。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、患者が保有する特定のＨＩＶの核酸配列を判定する工程、およびその後、それらの特定の配列に相補的になるようにガイドＲＮＡを設計する工程を含んでもよい。例えば、被検体のＬＴＲのＵ３領域、Ｒ領域、またはＵ５領域の核酸配列を判定し、その後、患者の配列に正確に相補的になるように１つ以上のガイドＲＮＡを設計する（この場合も、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶプロモーターの一部である配列は選択しない）。
組成物は、例えば、予防的治療として、レトロウイルス性感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）のリスクを有する被検体の治療にも有用である。これらの方法は、以下の工程をさらに含んでもよい：ａ）ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体を特定する工程；およびｂ）短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの制御下にあるＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をコードしている核酸を含む組成物を被検体に与える工程。当該配列は、ＨＩＶ標的配列（例えば、ＨＩＶ ＬＴＲ）に相補的なガイドＲＮＡを、さらにコードしていてもよい。ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体としては、例えば、無防備な性交（つまり、コンドームを使用しない性行為を行った）現在性交渉のある個体；別の性感染症を患う現在性交渉のある個体；静脈内薬の使用者；または割礼を受けていない男性、が挙げられる。ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体としては、例えば、職業上ＨＩＶ感染した人々と接触することになる個体（例えば、医療関係者または初期対応者）が挙げられる。ＨＩＶ感染症のリスクを有する被検体としては、例えば、矯正施設の収容者、またはセックスワーカー（つまり、収入を得る仕事のために、または貨幣以外のもの（食物、薬物、または宿など）のために、性交を行う個体）が挙げられる。
組成物は、母からその子供へのＨＩＶの伝染の可能性を減少させるために、ＨＩＶ感染症を患う妊婦または授乳婦にも投与することができる。ＨＩＶに感染した妊婦は、子宮内で胎盤を通じて、産道を通る分娩の時、または分娩後に母乳を通じて、ウイルスをその子供に移すことがある。本明細書に記載の組成物は、ＨＩＶに感染した母に対して、（i）出産前、周産期もしくは出産後の授乳期に投与してもよいし、または（ii）出産前投与、周産期投与および出産後投与の、任意の組み合わせであってもよい。組成物は、標準的な抗レトロウイルス療法（後述）と共に、母に投与してもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、分娩後すぐの乳児に投与してもよい。また、いくつかの実施形態において、その後一定の期間ごとに投与してもよい。上記の乳児は、標準的な抗レトロウイルス療法も受けてもよい。
組成物は、ＨＩＶ感染症を予防するために、ＨＩＶに感染していない個体に投与してもよい。組成物は、薬学的組成物を治療上有効な量送達することを含み得る。薬学的組成物は、上述したとおり、（i）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、ならびに（ii）少なくとも、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのコア領域および短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのＴＡＲ領域をコードしている配列を含んでもよい。
本明細書に記載の方法は、広範囲にわたる種に適用することが可能である。その例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル）、ウマまたは他の家畜、イヌ、ネコ、フェレットまたは他のペットとして飼われている哺乳類、ラット、マウスまたは他の実験室動物、が挙げられる。
本発明の方法は、医薬品の調製という観点から表現することができる。したがって、本発明は、医薬品の調製における本明細書に記載の薬剤および組成物の使用を包含する。本明細書に記載の化合物は、治療的組成物および投薬計画に有用であり、または本明細書に記載の疾患または病気の治療に使用するための医薬品の製造に有用である。
本明細書に記載の組成物はいずれも、後に標的細胞へ送達されるように、宿主の身体の任意の場所に投与することができる。組成物は、哺乳類の、脳、髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋組織、皮膚、または腹腔に送達され得るが、これらに限定されない。送達経路の観点から、組成物は、静脈内注射、頭蓋内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、筋肉内注射、直腸内注射、膣内注射、髄腔内注射、気管内注射、皮内注射、または経皮注射によって、経口投与または経鼻投与によって、または時間をかけた漸次的潅流(gradual perfusion)によって、投与されてもよい。さらなる例としては、組成物のエアロゾル調製物を、吸入によって宿主に与えてもよい。
必要な投与量は、投与経路、製剤の性質、患者の病気の性質、患者の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与されている他の薬物、ならびに担当臨床医の判断、に基づいて決定される。様々な細胞標的、および様々な投与経路により異なる効率の観点から、広範囲にわたる必要投与量が予想される。これらの投与量レベルの変化幅は、当該分野においてよく理解される通り、標準的な経験的最適化ルーチンを用いて調節することができる。投与は、１倍または複数倍（例えば、２倍もしくは３倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、またはより大きい倍率）であってもよい。化合物を好適な送達ビヒクル（例えば、高分子微粒子または埋入器具）に封入することにより、送達効率を向上させることができる。
本明細書に提供されている任意の組成物を用いた治療の期間は、１日という短い期間から宿主の生存期間（例えば、長年）という長い期間まで、任意の長さの期間であってもよい。例えば、化合物を週に１回（例えば、４週間から何カ月間または何年間にも渡って）；月に１回（例えば、３〜１２カ月間または何年間にも渡って）；または年に１回を５年間、１０年間、またはより長い期間、投与してもよい。なお、治療の頻度も変わり得る。例えば、本発明の化合物は、日に、週に、月に、または年に１回（または２回、３回、など）投与されてもよい。
本明細書に提供されている任意の組成物の有効量を、治療が必要な個体に投与することができる。有効量は、既知量の特定の組成物を投与した後、患者の反応を評価することによって決定すればよい。さらに、毒性（もしあれば）のレベルは、既知量の特定の組成物を投与する前後において、患者の臨床症状を評価することによって決定すればよい。なお、患者に投与される特定の組成物の有効量は、患者の反応および毒性のレベルだけではなく、所望の成果に合わせて調節してもよい。大きな毒性は、特定の患者それぞれによって異なり得るものであり、複数の要因に依存している。当該複数の要因としては、患者の疾患状態、年齢、および副作用に対する耐性が挙げられるが、これらに限定されない。
当該分野において知られている任意の方法を、特定の反応が誘導されるか否かの判定に用いることができる。特定の疾患状態の程度を評価できる臨床的方法を、反応が誘導されるか否かの判定に用いることができる。反応を評価するために使用される特定の方法は、患者の障害の特質、患者の年齢および性別、投与されている他の薬物、ならびに担当臨床医の判断によって決定される。
組成物は、他の治療剤（例えば、ＨＡＡＲＴに使用される抗レトロウイルス剤）と共に投与されてもよい。抗レトロウイルス薬としては、逆転写酵素阻害剤（例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、ジドブジン、emtricitibine、ラミブジン、およびtenoifvir；ならびに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（efavarenz、ネビラピン、リルピビリンなど））；プロテアーゼ阻害剤（例えば、tipiravir、ダルナビル、インジナビル）；侵入阻害剤（例えば、マラビロク）；融合阻害剤（例えば、enfuviritide）；またはインテグラーゼ阻害剤（例えば、raltegrivir、ドルテグラビル）が挙げられる。抗レトロウイルス薬としては、多種を組み合わせた薬剤もある。多種を組み合わせた薬剤としては、例えば、エムトリシタビン、efavarenz、およびtenoifvirの組み合わせ；エムトリシタビン、リルピビリン、およびtenoifvirの組み合わせ；またはエルビテグラビル、コビシスタット、エムトリシタビンおよびtenoifvirの組み合わせが挙げられる。
２つ以上の治療剤を併せて投与する場合、それらの治療剤の治療的効果が発揮されている期間が重複する限り、それらの治療剤を同時に投与する必要、または同一経路で投与する必要はない。同時投与または逐次投与には、別々の日または別々の週に投与することが予期されている。治療剤は、規則的な投薬計画に基づき投与されてもよい（例えば、治療剤の継続的な少量投与）。
そのような組成物の投与量、毒性、および治療的有効性は、培養細胞または実験用動物における、標準的な薬学的手順によって決定してもよい。例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％が致死する投与量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に対して治療的効果のある投与量）を決定するための薬学的手順によって決定してもよい。毒性効果と治療的効果との間の用量比は、治療上の指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。
培養細胞の分析および動物実験から得られたデータを、ヒトに使用される投与量の範囲を策定するために使用することができる。そのような組成物の投与量は、毒性が微小または皆無である状態で、かつ血中濃度の範囲にＥＤ５０が含まれることが好ましい。投与量は、この範囲内で、採用される投与形態および利用される投与経路に合わせて変わり得る。本発明の方法において使用される任意の組成物について、治療的効果のある投与量は、まず培養細胞の分析から推定されてもよい。投与量は、培養細胞において決定されたように、動物モデルにおいて策定されてもよい。この場合、血漿中濃度の範囲にＩＣ５０（つまり、症状を最大値の半分だけ抑制するような試験化合物の濃度）が含まれるように、投薬量が策定されてもよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定してもよい。
記載したとおり、組成物の治療上有効な量（つまり、効果的な投与量）とは、所望の治療的（例えば臨床的）結果をもたらすのに、十分な量を意味する。組成物は、日に１回以上〜週に１回以上投与されてもよい（２日に１回の投与を含む）。当業者であれば、被検体を効果的に治療するために必要な投与量およびタイミングが、ある種の要因に影響され得ることを理解するであろう。当該一定の要因としては、疾患または障害の重篤度、過去の治療、被検体の全身の健康状態および／または年齢、ならびに他に発症している疾患が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物の治療上有効な量を用いる被検体の治療としては、１回の治療または一連の複数回の治療が挙げられる。
本明細書に記載の組成物は、上述した様々な薬物送達システムにおける使用に、好適である。さらに、投与される化合物のインビボ血清中における半減期を長期化させるため、組成物は、カプセル化されるか、リポソームの内腔に導入されるか、コロイドとして調製されてもよい。または、組成物の血中における半減期を延長する、他の従来技術を採用してもよい。リポソームの調製には様々な方法が利用可能であり、例えば、米国特許第４,２３５,８７１号（Szoka, et al.）、同第４,５０１,７２８号、および同第４,８３７,０２８号に記載の方法が利用可能である（それぞれが参照により、本開示に援用される）。さらに、薬物は標的薬物送達システムによって投与されてもよい。例えば、組織特異的抗体によってコーティングされたリポソームとして投与されてもよい。リポソームは、ある器官を標的にしており、その器官に選択的に取り込まれる。
レトロウイルスを不活性化する方法も、提供される。当該レトロウイルスとしては、例えば、哺乳動物細胞中のレンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはウシ免疫不全ウイルスなど）が挙げられる。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり得る。ヒト免疫不全ウイルスは、染色体に組み込まれているプロウイルスであり得る。哺乳動物細胞は、ＨＩＶに感染した任意の細胞型であってもよい。当該細胞型としては、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞（ランゲルハンス細胞および濾胞樹状細胞など）、造血幹細胞、内皮細胞、脳小膠細胞、星状膠細胞、ならびに胃腸上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。そのような細胞型には、通常は初期感染において感染される細胞型が含まれる。当該細胞型としては、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、単球またはランゲルハンス細胞に加えて、潜伏ＨＩＶ保有体を構成する細胞型（つまり、潜伏感染細胞）が挙げられる。
当該方法は、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのコア領域およびＴＡＲ領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターに操作可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている単離核酸を含む組成物に、細胞を曝露するおよび／または接触させる工程を含み得る。単離核酸はさらに１つ以上のガイドＲＮＡをコードしていてもよく、当該ガイドＲＮＡはレトロウイルス中の標的核酸配列に相補的である。接触させる工程は、インビボで行ってもよい（つまり、組成物は、ＨＩＶ感染症を患う被検体に直接投与されてもよい）。しかしながら、当該方法はこれに限定されず、接触させる工程はエクスビボで行ってもよい。例えば、細胞もしくは複数の細胞、または組織外植片を、ＨＩＶ感染症を患う被検体から取り出して培養し、その後、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターに操作可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（および任意構成でガイドＲＮＡ）を含む組成物に接触させられてもよい。ここで、上記ガイドＲＮＡは、ＨＩＶの核酸配列に相補的である。上述したとおり、薬学的組成物は、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸を含んでもよい。
組成物は、哺乳動物細胞による取り込みを促進するように製剤される。有用なベクターシステムおよび製剤は、上述したとおりである。いくつかの実施形態において、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、物理的送達方法（エレクトロポーション法、マイクロインジェクション、弾道粒子、および「ジーン・ガン」システムなど）と同様に、他のＤＮＡ送達方法（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、およびペルフルオロ薬液を使用した化学的トランスフェクションなど）が予期される。
標準的な方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを検知するイムノアッセイ、または核酸系アッセイ（ガイドＲＮＡを検知するＰＣＲなど））を、細胞が導入されたタンパク質を取り込んだことおよび／または発現したことを確認するために、使用することができる。操作を受けた細胞は、その後、それらが得られた被検体へと再導入されてもよい（後述）。
他の実施形態において、組成物は、１つ以上のＣａｓ９／短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションされた、細胞を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、エクスビボで適用することができる。つまり、被検体の細胞を体から取り出し、培養中に組成物で処置してＨＩＶ配列を切除し、処置された細胞を上記被検体の体に戻してもよい。細胞は、被検体の細胞であってもよく、または、ハプロタイプ適合細胞または細胞株であってもよい。複製を防止するために、細胞に放射線を照射してもよい。いくつかの実施形態において、細胞はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合細胞、自家移植細胞、細胞株、またはそれらの組み合わせである。他の実施形態において、細胞は幹細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞または人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））が挙げられる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多数の動物種から確立されてきた。これらの種類の多能性幹細胞は、再生医療用の細胞の、最も有用な供給源と考えられる。なぜなら、これらの細胞は、その多能性を保有しつつ活発に分裂する能力を維持しながら、適切な分化誘導によって、ほとんど全ての器官へと分化可能であるからである。特にｉＰＳ細胞は、自己由来の体細胞から確立することができる。したがって、胚を破壊することによって作製されるＥＳ細胞と比較して、倫理的および社会的問題を引き起こす可能性が低い。さらに、ｉＰＳ細胞は自己由来の細胞であるので、再生医療または移植療法において最大の障害となる、拒絶反応を回避することが可能になる。
本明細書に記載の組成物は、例えば、「レトロウイルス感染症（例えばＨＩＶ感染症）を患う被検体またはレトロウイルス感染症（例えばＨＩＶ感染症）に罹患している被検体を治療するための療法用」とラベル付けした、適切な容器に入れられてもよい。容器は、上述したとおり、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）および短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターをコードしている核酸配列を含む組成物を、収容していてもよい。配列はさらに、ＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ、またはその核酸をコードしているベクター、および１つ以上の適切な安定剤、担体分子、および／または香料などを、適宜目的の用途に合わせてコードしていてもよい。したがって、梱包製品（例えば、１つ以上の本明細書に記載の組成物を、濃縮してまたはそのまま使用できる濃度で収容しており、保存用、輸送用、または販売用に梱包されている無菌容器）、および少なくとも１つの本開示の組成物を含むキット。製品としては、１つ以上の本発明の組成物を収容する容器（例えば、バイアル、広口瓶、ボトル、袋、など）が挙げられる。また、製品としてはさらに、例えば、包装材料、取扱説明書、注射器、送達装置、緩衝剤、または予防または治療が必要な病気を治療または監視するためのその他の制御用試薬、が挙げられる。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の追加の抗レトロウイルス薬（例えば、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、または侵入阻害剤）を含んでもよい。追加の薬剤は、短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター（および任意で、ＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ）と操作可能に結合しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードしている核酸配列として、またはその核酸をコードしているベクターとして、同じ容器に一緒に収容されてもよい。または、それらは別々に収容されてもよい。
製品は、説明文（例えば、印刷されたラベルもしくは差し込み文書、または製品の使用法を説明する他の媒体（例えば、音声テープまたはビデオテープ））も含んでもよい。説明文は、容器に関連付けられ（例えば、容器に貼付され）てもよい。また、説明文は、収容する組成物の投与方法（例えば、投与頻度および投与経路）、その適応症、およびその他の使用方法が記載されていてもよい。組成物は、投与可能な状態（例えば、適切な投薬量単位の状態）にあってもよく、１つ以上の薬学的に許容できるアジュバント、担体、または他の希釈剤、および／または追加の治療剤を含んでいてもよい。別の場合としては、組成物は、希釈剤および希釈の説明書と共に、濃縮形態で提供されてもよい。
本発明の実施を、以下の非限定的な実施例に沿って説明する。
〔実施例１：ＬＴＲ−Ｃａｓ９バリアントのクローニング〕
全長および様々な短縮型ＬＴＲプロモーター配列を、ｐＮＬ４−３ＨＩＶベクター（NIH AIDS Reagent Program #114）をテンプレートとし、さらに以下のプライマー（制限部位は太字で記載）を用いてＰＣＲによって得た。
Figure 2018510219
短縮型ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターバリアントの起源を、ＬＴＲのＵ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域、ならびにＬＴＲエンハンサー要素、コア要素、ＴＡＲ（トランス活性型応答要素）、およびＴＡＴＡボックス要素を参照しながら、図１Ａに示す。図１Ｂは、ＰＣＲで増幅させたＬＴＲ短縮バリアントの、アガロースゲル電気泳動像を示す。
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＴＡベクター（Invitrogen）中で直接サブクローニングした。その後、制限酵素のＫｐｎ１またはＸｂａ１と、Ｎｃｏ１とを用いて切断した。次に、Ｃａｓ９遺伝子ソース／テンプレートとしてのpX260-U6-DR-BB-DR-Cbh-NLS-hSpCas9-NLS-H1-shorttracr-PGK-puroプラスミド（Addgene#42229）（以降、「ｐＸ２６０プラスミド」と称する）を、Ｋｐｎ１−Ｎｃｏ１またはＸｂａ１−Ｎｃｏ１で分解した後、ライゲーションした。ｐＸ２６０プラスミドには、Ｃｂｈプロモーター（Ｘｂａ１−Ｋｐｎ１−Ｃｂｈ−Ｎｃｏ１）が含まれていた。操作の結果、ｐＸ２６０プラスミドに元々含まれたＣｂｈプロモーターは取り除かれ、ＬＴＲプロモーター（Ｘｂａ１−−ＬＴＲ−Ｎｃｏ１またはＫｐｎ１−ＬＴＲ−Ｎｃｏ１）の１つに置き換えられた。元のｐＸ２６０プラスミド構造の設計図（「Ｃｂｈ−Ｃａｓ９」と表されている）を図２に示す（www.Addagene.orgおよびCong et al., Science (2013) 339(6121):819-23より）。修飾されたプラスミドの設計図を、図２に示す（「ＬＴＲ−Ｃａｓ９」）。
〔実施例２：Ｃａｓ９発現を誘導するためのＬＴＲ／Ｔａｔ比の最適化〕
トランス活性型効果を最適化するためのＴａｔとＬＴＲプロモーターとの最適比率を特定するために、ヒト初代膠芽腫細胞株Ｕ８７ ＭＧの細胞を、Lipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を用いて共トランスフェクションした。当該共トランスフェクションは、全長ＨＩＶ−１ ＬＴＲ（ｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９）プラスミドの制御下でＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９を発現する、異なる量のプラスミド（１０、５０、および２５０ｎｇ）を用いて行った。また、当該共トランスフェクションは、Ｔａｔ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６、２５０ｎｇ）を用いるものと、用いないものとを行った。Ｕ８７ ＭＧは、ＨＩＶ−１の潜伏に対するレポーター細胞株である。何も導入していないｐＣＭＶプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１）を用いて、ＤＮＡの総量が等しくなるように調整した。４８時間後、ＴＮＮ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０）で、細胞を溶解した。その後、Ｃａｓ９、Ｔａｔ、およびα−チューブリン発現を、ウェスタンブロットによって調べた。その結果を図３Ａに示す（Ｕ８７ ＭＧ 全細胞抽出物：５０μｇ／ウェル）。
レーン１：２５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、１０００ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン２：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン３：１０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４０ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン４：２５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、７５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
レーン５：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、９５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
レーン６：１０ｎｇのｐＬＴＲ（−４５４／＋６６）−Ｃａｓ９、９９０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
Ｃａｓ９およびα−チューブリン（ローディング・コントロールとして使用）に対応するバンド強度を、ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて分析・比較した。その結果を図３Ｂに示す。上部は、α−チューブリンレベルで標準化したＣａｓ９レベルの、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す（Ｔａｔ有り、またはＴａｔ無し）。下部は、Ｔａｔ有り／Ｔａｔ無しの比率の、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す。その結果、Ｃａｓ９発現の最大値（５．３倍）は、ｐＬＴＲ−Ｃａｓ９：ｐＣＭＶＴａｔ８６の比率が、１：５（５０ｎｇ：２５０ｎｇ）の時に得られることが分かった。
〔実施例３：Ｃａｓ９発現の誘導における短縮型ＬＴＲプロモーターの比較〕
短縮型ＬＴＲプロモーターを試験および比較するため、Ｕ８７ ＭＧ細胞を、（i）ＨＩＶ−１短縮ＬＴＲバリアントｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９または（ii）ＨＩＶ−１短縮ＬＴＲバリアントｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９の制御下でＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９を発現する、異なる量のプラスミド（５ｎｇまたは５０ｎｇ）を用いてトランスフェクションした。また、当該トランスフェクションは、Ｔａｔ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６、２５０ｎｇ）を用いるものと、用いないものとを行った。４８時間後、全細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって分析した。Ｃａｓ９およびα−チューブリン（ローディング・コントロールとして使用）に対応するバンド強度を、ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて分析・比較した。その結果を図４Ａに示す。
レーン１：５ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン２：５ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。
レーン３：５ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、９９５ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
レーン４：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン５：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。
レーン６：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−１２０／＋６６）−Ｃａｓ９、９５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
レーン７：５ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン８：５ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２４５ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌのｒＴａｔタンパク質。
レーン９：５ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、９９５ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
レーン１０：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ。
レーン１１：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、１２００ｎｇのｐＣＭＶ、２.５μｇ／ｍｌの＋ｒＴａｔタンパク質。
レーン１２：５０ｎｇのｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９、９５０ｎｇのｐＣＭＶ、２５０ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔａｔ８６。
Ｃａｓ９およびα−チューブリン（ローディング・コントロールとして使用）に対応するバンド強度を、ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて分析・比較した。その結果を図４Ｂに示す。上部は、α−チューブリンレベルで標準化したＣａｓ９レベルの、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す（Ｔａｔ無し、ｒＴａｔ有り、またはＴａｔトランスフェクション有り）。下部は、Ｔａｔトランスフェクション有り／Ｔａｔ無しの比率の、ウェスタンブロット画像からの定量化を示す。この結果から、ＬＴＲの調節領域および／またはエンハンサー領域（これらの領域は、図１Ａに模式的に示されている）の除去によっては、Ｃａｓ９発現のＴａｔ媒介性トランス活性化は、有意な影響を及ぼされなかったことが分かる。Ｔａｔ媒介性の発現は、ｐＬＴＲ（−８０／＋６６）−ＦＬＡＧ−Ｃａｓ９プラスミド（コア要素およびＴＡＲ ＬＴＲプロモーター要素を含むが、エンハンサー領域および調節領域を含まない）でも、明らかに観察された。
〔実施例４：遺伝子編集戦略によるＨＩＶ−１の負のフィードバック制御〕
本研究において、遺伝子編集組成物は、ＨＩＶ−１トランス活性型因子であるＴａｔによって、ウイルス再活性化の初期段階におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の条件つき活性化を可能にする。この新規の戦略は、ウイルスプロモーターおよび／またはウイルスコーディング配列に及ぶウイルス性遺伝子のセグメントを除去することにより、増殖性ウイルス複製に先立って、ウイルスの複製を完全かつ永久に除去する。さらに、本戦略は、細胞における不要かつ持続的な高レベルのＣａｓ９発現によって引き起こされ得る予期せぬ障害に起因する、あらゆる問題を軽減する。
〔結果〕
Ｃａｓ９遺伝子に対応するコーディングＤＮＡ配列を、ＨＩＶ−１プロモーターの３つの異なるセグメント（５’−ＬＴＲのＵ３領域およびＲ領域に及ぶ）を含む、ｐＸ２６発現ベクタープラスミド中に配置した。これにより、Ｔａｔに対する応答を依然として有するが、ｇＲＮＡ ＡおよびｇＲＮＡ Ｂ（ＨＩＶ−１のＤＮＡ編集に最初に使用される）に対応する配列を欠いている、ウイルスプロモーターの最小ＤＮＡ要素を特定した（図５Ａ）。各コンストラクトをＤＮＡシーケンシングすることによって、クローニングの戦略を検証した。その後、ＴＺＭｂ１細胞を、ｐＸ２６またはｐＸ２６−ＬＴＲ−Ｃａｓ９とＣＭＶ−Ｔａｔとを用いて共トランスフェクションした。当該細胞において、各ベクターによるＣａｓ９の発現、およびＴａｔに対する応答性レベルを調べた。ウェスタンブロットによって得られた結果から、最小ＤＮＡプロモーター配列（−８０から＋６６の間に位置する）を包含するプラスミドを含む、全３種類のコンストラクトによって、Ｃａｓ９の発現が活性化されることが明らかになった（図５Ｂ）。この結果は本研究にとって特に重要である。というのも、プロモーター配列はｇＲＮＡ ＡおよびｇＲＮＡ Ｂに対応するＤＮＡ配列の外側にあるからである（図５Ｂ）。次に、ＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９に対応するＤＮＡフラグメントをレンチウイルスベクター（ＬＶ）中でクローニングし、ＴＺＭｂ１細胞の形質導入に使用した。これによって、ＨＩＶ−１ ＤＮＡの組み込みコピー（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現している）の編集における、Ｔａｔタンパク質の効果を判定した。ＬＴＲのＰＣＲ増幅によって得られた結果から、ｇＲＮＡ ＡおよびｇＲＮＡ Ｂ、ならびにＴａｔタンパク質を発現している細胞において、２０５ｂｐのＤＮＡフラグメントが検出されたことが明らかになった（図５Ｃ、レーン１〜５とレーン６〜８とを比較）。ＰＣＲ増幅に使用するプライマーの位置および予想されるアンプリコンを、図５Ａに示す（図１０も参照のこと）。シーケンシングから得られた結果から、ＬＶ−ＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９とＬＶ−ｇＲＮＡ Ａ／Ｂとによって形質導入された細胞においてＴａｔが発現した時、１９０ｂｐのＤＮＡフラグメントが切除されたことが証明された。Ｃａｓ９、Ｔａｔ、およびα−チューブリン（等量ローディングのためのコントロール）の発現を、図５Ｄに示す。
次に、ウイルスＤＮＡの切除がウイルスプロモーター活性に与える影響を、ルシフェラーゼ・アッセイによって調べた。その結果、ＴａｔによるＣａｓ９の活性化に伴って、ルシフェラーゼ活性が徐々に低下することが分かった。これは、ＤＮＡアッセイの結果を裏付けており、ＤＮＡの切断により、それらの細胞のウイルスプロモーター活性が抑制されることが分かる（図５Ｅ）。追跡研究において、Ｃａｓ９の活性化を、ＨＩＶ−１によるＴＺＭｂ１細胞の感染に関して調査した。この目的のために、細胞をＬＶ−ＬＴＲ（−８０／＋６６）−Ｃａｓ９およびＬＶ−ｇＲＮＡ Ａ／Ｂによって２４時間形質導入し、その後、当該細胞を３つの異なるＭＯＩでＨＩＶ−１ＪＲＦＬまたはＨＩＶ−１ＳＦ１６２に感染させた。４８時間後に細胞を回収し、（i）ＰＣＲによってＤＮＡの切除を評価し、（ii）ルシフェラーゼ・アッセイによって組み込みプロモーター配列の発現を評価し、（iii）ウェスタンブロットによってＣａｓ９の発現を評価した。これらの実験結果から、ＨＩＶ−１ＪＲＦＬおよびＨＩＶ−１ＳＦ１６２に感染した細胞において、切断後の２０５ｂｐのＤＮＡフラグメントが検出された。ここから、ＨＩＶ−１ＪＲＦＬおよびＨＩＶ−１ＳＦ１６２によるＴａｔの産生が、これらの細胞において、ＬＴＲ（−８０／＋６６）プロモーターおよびＣａｓ９の産生をトランス活性化したことがわかる（図６Ａ）。さらに、ルシフェラーゼ・アッセイの結果から、細胞におけるルシフェラーゼ活性が有意に低下したことが分かった。このことからも、組み込みＨＩＶ−１ルシフェラーゼ遺伝子の機能停止において、ＨＩＶ−１ＪＲＦＬまたはＨＩＶ−１ＳＦ１６２への感染時に産生されるＴａｔによるＣａｓ９活性化が有効であることが証明された。感染細胞におけるＣａｓ９の誘導を、図６Ｂに示す。ウェスタンブロットの結果から、ＨＩＶ−１ＪＲＦＬおよびＨＩＶ−１ＳＦ１６２に細胞が感染した時、短縮型ＬＴＲプロモーター（ＬＴＲ（−８０／＋６６））が活性化し、その結果、細胞中でＣａｓ９タンパク質が産生されたことがわかった（図６Ｃ）。
追跡研究において、ヒトＴ−リンパ球性細胞株２Ｄ１０中でＨＩＶ−１ゲノムを取り除く際における、Ｔａｔ媒介性のＬＴＲ−Ｃａｓ９活性化能を、ｇＲＮＡ Ａ／Ｂを共に用いて試験した。これらの細胞は、１つの環状ＨＩＶ−１ＰＮＬＡ４−３の組み込みコピーを、潜伏状態で保有している。当該ＨＩＶ−１ＰＮＬＡ４−３のゲノムは、Ｇａｇ遺伝子およびＰｏｌ遺伝子の部分を欠き、Ｎｅｆ遺伝子はレポーター緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている遺伝子に置き換わっている。これらの細胞中では、Ｔａｔタンパク質レベルが向上し、Ｃａｓ９が活性化される（図７Ａ参照）。これによって、ＬＶ−ｇＲＮＡ Ａ／Ｂによって形質導入された細胞におけるＣａｓ９の活性化に伴って、ウイルス性ＬＴＲが編集された。（図７Ｂおよび図１１のレーン１〜８も参照）。したがって、Ｔａｔの存在下において、ＧＦＰ陽性細胞の数の有意な減少が検出された。このことは、Ｔａｔの活性化により、ウイルスＤＮＡ発現時に切断されたプロモーターの能力が削除され、それによって、これらの細胞中でＧＦＰが抑制されることを示している。ｇＲＮＡの位置、ＤＮＡフラグメントの切除、およびＰＣＲプライマーに対応するＤＮＡ配列を、図１２に示す。
ＰＭＡおよび／またはＴＳＡの、２Ｄ１０細胞におけるプロウイルスＤＮＡの組み込みコピーを促進する能力を示す先行研究を踏まえて、潜伏感染Ｔ−細胞モデルにおける、Ｃａｓ９の活性化に対するＰＭＡおよびＴＳＡの影響を評価した。図８Ａに示すとおり、２Ｄ１０細胞を、ＰＭＡおよびＴＳＡ（単独または組み合わせで）で処置することにより、Ｃａｓ９の発現レベルが増加した。並行実験において、ＬＴＲ ＤＮＡを検出するためにＰＣＲ分析を行った。その結果、２０５ｂｐのＤＮＡフラグメントの出現からも明らかなように（図１１、レーン９〜１４参照）、ウイルスＤＮＡの除去レベルが明らかに増加したことがわかった（図８Ｂ）。ウェスタンブロットによって、または緑色蛍光細胞（ウイルスの活性化を示す）を蛍光顕微鏡法によって定量化（図８Ｃ）することによって、細胞におけるＧＦＰレベルを測定した。当該測定結果に基づきウイルス活性化を検査したところ、ウイルス性遺伝子発現レベルの劇的な低下が見られた。このように、（i）不活性なプロウイルスの再活性化時に産生されたＴａｔによって、最小ウイルスプロモーター（−８８／＋６０）が活性化された場合、または（ii）Ｃａｓ９を産生するＰＭＡおよびＴＳＡによって、当該最小ウイルスプロモーターが直接活性化された場合のいずれも、ｇＲＮＡ ＡおよびｇＲＮＡ Ｂを含む細胞中に潜伏的に組み込まれたウイルスゲノムの発現に対して、負の影響を与える可能性がある。
〔考察〕
１９８５年の発見以来、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質は、転写レベルでのウイルスゲノムの発現におけるその決定的な役割から、および非感染細胞に対するその病原性の影響から、大いに注目を集めてきた。機構上、Ｔａｔは、転写開始点の下流（ヌクレオチド＋１から＋５９）に位置するＲＮＡ配列（いわゆる転写応答性領域またはＴＡＲと呼ばれる）に関連する。ＴａｔのＴＡＲと協働により、転写開始点（ヌクレオチド＋１）近傍において、転写開始前複合体および転写開始複合体の形成につながる、一連の分子的および生物化学的な現象を引き起こす。この複合体には、複合体の構成要素（ｐＴＥＦおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む）をリン酸化またはアセチル化することのできる、一連の細胞タンパク質が含まれている。これにより、ＲＮＡの転写的伸長が促進される。さらに、Ｔａｔと様々な転写因子（ＮＦ−κＢ、ｐ３００／ＣＢＰおよびＧＣＮ５を含む）との相互作用は、他のウイルス性遺伝子および細胞遺伝子の転写に影響を与え得る。これらの遺伝子は全て、ＨＩＶ−１陽性エイズ患者に見られる疾患スペクトラムの一因となっている。再活性化したウイルスプロモーターによる転写によってウイルス性の転写およびＴａｔ産生の初期段階に至る際には、保有体における潜伏ウイルスの増殖的複製において、Ｔａｔは大きな役割を果たす。ＨＩＶ−１複製およびエイズの病因におけるＴａｔに固有な重要性は、ワクチンの開発のみならず、創薬の潜在的な標的としても機能する、強力な理論的背景を提供する。事実、いくつかの有効な阻害剤（いくつかのものはＴａｔ−ＴＡＲ間相互作用の阻害能を有し、他のものはＴａｔとその細胞内協力因子との連携の阻害能を有する）が、ＨＩＶ−１複製に影響対して、様々な度合いの有効性を示している。
本研究において利用した戦略は、増殖中または潜伏中のＨＩＶ−１を有する細胞において、ウイルスゲノムのセグメントを切除し、ＨＩＶ−１遺伝子の転写および複製を永久的に除去するために、Ｔａｔを採用することであった。本戦略では、Ｔａｔにより誘導されるＨＩＶ−１の自殺経路を設計し、当該経路にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてウイルスゲノムを編集する工程が含まれる（図９に示す）。この経路によれば、細胞中でのＴａｔの産生により、全長５’−ＬＴＲ配列を有する当該細胞自身のプロモーターが刺激されることに加えて、Ｃａｓ９の発現も増強される。この増強は、高ＧＣ領域、ＴＡＴＡボックス領域、およびＴＡＲ領域（−８０〜＋６６）に及ぶ、短縮された最小プロモーター配列よる増強と、同じ機序で達成される。（i）Ｃａｓ９の産生、および（ii）Ｃａｓ９とｇＲＮＡ（（−８０〜＋６６）の外側にある、ＬＴＲ ＤＮＡ配列を標的とするように設計されている）との協働によって、全長ウイルスプロモーター内の欠失・挿入変異が誘導される。そして、遺伝子のセグメントが切除されることによって、細胞中のＨＩＶ−１を永久的に根絶することができる。予期された４１７ｂｐのＤＮＡフラグメント（全長ＬＴＲ配列を表す）に加えて、ＬＴＲ ＤＮＡの短い領域を増幅した結果からは、長さ２２７ｂｐの第２のＤＮＡフラグメントが、Ｔａｔを発現している細胞にのみ認められた。２２７ｂｐのＤＮＡフラグメントは、５’−ＬＴＲまたは３’−ＬＴＲのいずれかにおいてＣａｓ９／ｇＲＮＡ Ａにより切断された後、５’−ＬＴＲの残鎖と残存する３’−ＬＴＲとが結合することによって産生した。あるいは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによる切断の後、５’−ＬＴＲに由来する残存ＤＮＡフラグメントと３’−ＬＴＲに由来する残存ＤＮＡフラグメントとのライゲーションによって、遺伝子増幅用の新しいテンプレートが誕生し、同様の長さ（２２７ｂｐ）のアンプリコンが出現した可能性もある。ｇＲＮＡ ＡとｇＲＮＡ Ｇａｇとの間のＤＮＡフラグメントの除去を期待して、ＬＴＲ（ｇＲＮＡ Ａ）およびＧａｇ遺伝子内の領域を標的とする、ｇＲＮＡの複合を利用した。
正確かつ高効率な傑出したゲノム編集能力、ならびに実施の容易さおよび柔軟性のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集戦略は、生物医学研究において近年注目を集めてきた。しかしながら、いくつかの部分には細心の注意を払う必要がある。例えば、オフターゲット効果を回避するために、最も特異的で効果的なｇＲＮＡを設計することが重要である。特異性を最大化しオフターゲットな編集を回避するための、本開示において採用された戦略は、全ゲノムの超高深度シーケンシングおよび他の様々なテストによって確認された。第２の問題は、Ｃａｓ９の制御された発現により、長期間にわたり宿主ゲノムを非特異的に傷つける、および／または免疫反応を誘導するおそれのある、不要なタンパク質の存在を回避することに関する。本開示の戦略は、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの存在下のみにおける、Ｃａｓの条件付き発現のために開発されたものである。本戦略は、ウイルスが増加傾向にある時に、ＨＩＶ−１を根絶するための遺伝子編集を活性化および抑制する、新規のアプローチを提供する。
本開示において引用した全ての特許、特許出願、および公報それぞれの開示は、その全体が参照により本開示に援用される。当業者は、本発明が目標を実行し、また記載した目的および利点（ならびに本発明に本来備わっている目的および利点）を達成するのによく適していることを、容易に理解するであろう。本発明は特定の実施形態を参照しながら開示されたが、この発明の他の実施形態および変形が、本発明の実施における趣旨および範囲内で、他の当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および同等の変形の全てを含むと解釈されるべきである。

Claims (92)

  1. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をインビボまたはインビトロで不活性化する方法であって、
    ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている単離核酸配列を含む組成物を、
    被検体に投与する工程、または哺乳動物細胞に接触させる工程を含む、方法。
  2. 上記単離核酸配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードしている、請求項１に記載の方法。
  3. 上記ＨＩＶ中の標的核酸配列は、ＨＩＶのコード領域内または非コード領域内の配列を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 上記非コード領域はＨＩＶの長末端反復配列を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 上記標的核酸配列はＨＩＶの長末端反復内の配列を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 上記ＨＩＶの長末端反復内の上記配列は、上記短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの配列を全く含まない配列であって、Ｕ３領域内、Ｒ領域内またはＵ５領域内の配列である配列を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 上記哺乳動物細胞は潜伏感染細胞である、請求項１に記載の方法。
  8. 上記潜伏感染細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、単球、腸関連リンパ系細胞、小膠細胞、および星状膠細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 上記不活性化は、インビボまたはエクスビボで行われる、請求項１に記載の方法。
  10. 上記哺乳動物細胞は、（i）ＨＩＶに感染した被検体に由来する培養細胞、（ii）組織外植片、または（iii）細胞株を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
  12. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項１に記載の方法。
  13. 上記組成物は、トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしている配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  14. 上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合している、請求項１３に記載の方法。
  15. 上記組成物は、核局在化シグナルをコードしている配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 上記組成物は、発現ベクターと操作可能に結合している、請求項１に記載の方法。
  17. 上記発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 上記組成物は、上記ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  19. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を有する、単離核酸配列。
  20. 上記配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードしている、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  21. 上記ＨＩＶ中の標的核酸配列は、ＨＩＶのコード領域内または非コード領域内の配列を含む、請求項２０に記載の単離核酸配列。
  22. 上記非コード領域は、ＨＩＶの長末端反復、または当該ＨＩＶの上記長末端反復内の配列を含む、請求項２１に記載の単離核酸配列。
  23. 上記ＨＩＶの長末端反復内の上記配列は、上記短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの配列を全く含まない配列であって、Ｕ３領域内、Ｒ領域内またはＵ５領域内の配列である配列を含む、請求項２２に記載の単離核酸配列。
  24. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  25. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  26. トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしている配列をさらに含む、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  27. 上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合している、請求項２６に記載の単離核酸配列。
  28. 核局在化シグナルをコードしている配列さらに含む、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  29. 上記単離核酸配列は、発現ベクターと操作可能に結合している、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  30. 上記発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２９に記載の単離核酸配列。
  31. 上記ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をさらに含む、請求項１９に記載の単離核酸配列。
  32. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む、薬学的組成物。
  33. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  34. 上記薬学的に許容される担体は、脂質系コロイドまたは重合体系コロイドを含む、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  35. 上記コロイドは、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルである、請求項３４に記載の薬学的組成物。
  36. 上記薬学的組成物は、局所適用用に製剤されている、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  37. 上記薬学的組成物は、コンドーム内に収容されている、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  38. 上記配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードしている、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  39. 上記ＨＩＶ中の標的核酸配列は、ＨＩＶのコード領域内または非コード領域内の配列を含む、請求項３８に記載の薬学的組成物。
  40. 上記非コード領域は、ＨＩＶの長末端反復配列を含む、請求項３９に記載の薬学的組成物。
  41. 上記標的核酸配列は、ＨＩＶの上記長末端反復内の配列を含む、請求項４０に記載の薬学的組成物。
  42. 上記ＨＩＶの長末端反復内の上記配列は、上記短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの配列を全く含まない配列であって、Ｕ３領域内、Ｒ領域内またはＵ５領域内の配列である配列を含む、請求項４１に記載の薬学的組成物。
  43. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  44. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  45. トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしている核酸配列をさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  46. 上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合している、請求項４５に記載の薬学的組成物。
  47. 核局在化シグナルをコードしている配列をさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  48. 上記薬学的組成物は、発現ベクターと操作可能に結合している、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  49. 上記発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項４８に記載の薬学的組成物。
  50. 上記配列はさらに、上記ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしている、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  51. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を患う被検体を治療する方法であって、
    ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む薬学的組成物を、
    上記被検体に治療上有効な量投与する工程を含む、方法。
  52. 上記配列はさらに、ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードしている、請求項５１に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  53. ＨＩＶ感染症は潜伏感染症である、請求項５１に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  54. 上記薬学的組成物は、局所的または非経口的に投与される、請求項５１に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  55. 抗レトロウイルス剤を投与する工程をさらに含む、請求項５１に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  56. 上記抗レトロウイルス剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および侵入阻害剤からなる群から選択される、請求項５５に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  57. 上記抗レトロウイルス剤は、強力な抗レトロウイルス療法を含む、請求項５６に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  58. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項５１に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  59. 上記薬学的組成物は、発現ベクターと操作可能に結合している、請求項５７に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  60. 上記発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５９に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  61. 上記配列はさらに、上記ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしている、請求項５７に記載のＨＩＶ感染症を患う被検体を治療する方法。
  62. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法であって、
    ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む薬学的組成物を、
    上記被検体に治療上有効な量投与する工程を含む、方法。
  63. 上記被検体は、現在性交渉のある者、医療従事者、または初期対応者である、請求項６９に記載のＨＩＶ感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法。
  64. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である、請求項６２に記載のＨＩＶ感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法。
  65. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化されている、請求項６２に記載のＨＩＶ感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法。
  66. 上記薬学的組成物は、発現ベクターと操作可能に結合している、請求項６２に記載のＨＩＶ感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法。
  67. 上記発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６７に記載のＨＩＶ感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法。
  68. 上記配列はさらに、上記ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしている、請求項６７に記載のＨＩＶ感染症のリスクがある被検体におけるＨＩＶ感染症のリスクを低減する方法。
  69. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法であって、
    ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む薬学的組成物を、
    上記被検体に治療上有効な量投与する工程を含む、方法。
  70. 上記薬学的組成物は、出産前、周産期、および出産後の少なくとも１つの期間中に投与される、請求項６９に記載のＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法。
  71. 抗レトロウイルス剤を投与する工程をさらに含む、請求項６９に記載のＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法。
  72. 上記抗レトロウイルス剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および侵入阻害剤からなる群から選択される、請求項７１に記載のＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法。
  73. 上記抗レトロウイルス剤は強力な抗レトロウイルス療法を含む、請求項７２に記載のＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法。
  74. 治療上有効な量の上記組成物を、上記子供へ投与する工程をさらに含む、請求項６９に記載のＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法。
  75. 上記配列はさらに、上記ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのエンハンサー領域をコードしている、請求項６９に記載のＨＩＶに感染した妊婦または授乳婦からその子供へのＨＩＶ感染症の伝染リスクを低減する方法。
  76. 非感染被検体におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症を予防するために、薬学的組成物を投与する方法であって、
    ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む上記薬学的組成物を、
    上記非感染被検体に治療上有効な量投与する工程を含む、方法。
  77. ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む、組成物。
  78. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ヒト細胞における発現のために最適化される、請求項７７に記載の組成物。
  79. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓである請求項７７に記載の組成物。
  80. 上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）である、請求項７９に記載の組成物。
  81. 上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、最小ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下にある、請求項７９に記載の組成物。
  82. 上記短縮された最小ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターは、最初期転写活性化因子（Ｔａｔ）によって活性化され、
    それによって、ＨＩＶ複製の初期段階に、制限的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを活性化する、請求項８１に記載の組成物。
  83. ＨＩＶ中の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
  84. 上記組成物は、トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしている配列をさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
  85. 上記ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードしている配列と融合している、請求項８４に記載の組成物。
  86. 上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ウイルスゲノムのセグメントを切除し、
    上記セグメントは、ウイルスプロモーター配列および／またはウイルスコーディング配列に及んでいる、請求項７９に記載の組成物。
  87. 短縮型ウイルスプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）をコードしている核酸配列を含む、組成物であって、
    上記短縮型ウイルスプロモーターは、最初期転写活性化因子の制御下に置かれており、
    それによって、ウイルス複製の初期段階に、制限的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを活性化する、組成物。
  88. 上記ウイルス中の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含む、請求項８７に記載の組成物。
  89. 上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ウイルスゲノムのセグメントを切除し、
    上記セグメントは、ウイルスプロモーター配列および／またはウイルスコーディング配列に及ぶ、請求項８７に記載の組成物。
  90. 配列番号１〜２１の何れか１つに対して、少なくとも７５％の配列類似性を有する、単離核酸配列。
  91. 配列番号１〜２１の何れか１つ、またはその組み合わせを有する、単離核酸配列。
  92. （i）ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターの少なくともコア領域およびトランス活性型応答要素（ＴＡＲ）領域を含む短縮型ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合している、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードしている配列を含む単離核酸配列、または
    （ii）上記単離核酸をコードしているベクター
    を含む、一定量の組成物と、
    包装材料、使用方法説明を含む添付文書、無菌液、注射器、および無菌容器からなる群から選択される少なくとも１つと、を備えている、キット。
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