CN108559730B - 利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法 - Google Patents

利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；2)供体质粒的构建；3)分选原代单核细胞；4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；5)敲入效率的鉴定。本发明方法具有简便易行，无需后期细胞筛选，即可获得较高的基因编辑效率，这大大增加了实验的可行性和应用前景。适用范围广等特点。

Description

利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实 验方法
技术领域
本发明涉及一种实验方法，具体是一种利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法。属于医学领域。
背景技术
近年来，获得性免疫缺陷病毒(HIV)的感染率逐年升高。抗病毒药物的发现和普及，使得HIV感染已经由一种急性致死性疾病逐渐变为一种慢性可控性疾病。随着患者生存时间的延长，HIV感染并发症发病率逐年提高，其中HIV相关神经认知紊乱受到广泛关注。HIV相关神经认知紊乱在HIV感染者中的发病率为40％-60％，大大的影响着患者的生存质量。
经研究发现，HIV转录激活因子(HIV-Tat)在HIV相关神经认知紊乱的发生发展中扮演着重要角色：一方面，HIV-Tat本身作为一种神经毒性因子可以直接损伤神经元和胶质细胞，另一方面，HIV-Tat可以激活HIV的转录和复制，促进HIV在神经系统中的扩散。因此，中和HIV-Tat对于HIV相关神经紊乱的治疗中具有重要意义。
由于血脑屏障的存在，普通的抗病毒药物无法到达中枢神经系统发挥药物作用，因此找到合适的穿越血脑屏障的方法不仅具有科学研究意义，也具有实际应用价值。常用的穿越血脑屏障的方法有以下几种：受体或载体介导的胞吞机制，电磁场、超声波等瞬时开放侵袭性手段以及细胞介导的跨越血脑屏障机制。其中，胞吞机制的实施对药物要求高，操作难度大，而且药物持续时间短；侵袭性手段的实施局部损伤大，患者耐受性差，这些方法实用价值较低。
在中枢神经系统细胞治疗方面单核细胞具有明显的优势。但是单核细胞体外增值和表达能力较差，目前还没有一种行之有效的针对单核细胞的基因编辑技术，从而大大限制了单核细胞在中枢神经系统治疗中的应用。
目前传统的基因编辑方法，慢病毒/腺病毒介导的细胞感染技术，脂质体介导的细胞转染技术以及ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术。病毒介导的转染技术具有明显的生物安全问题，且其造成的基因随机整合可能影响基因组的稳定性；脂质体介导的细胞转染技术治疗性基因无法长期稳定表达；ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术操作难度大，编辑效率低。如何将人源化的抗HIV-Tat抗体-Fc融合蛋白Hutat2:Fc敲入单核细胞，以期达到治疗目的是目前要解决的问题。
发明内容
本发明的目的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法。本发明方法具有简便易行，无需后期细胞筛选，即可获得较高的基因编辑效率，这大大增加了实验的可行性和应用前景。适用范围广等特点。
本发明的目的是通过以下措施来实现的：利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：
1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；
2)供体质粒的构建；
3)分选原代单核细胞；
4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；
5)敲入效率的鉴定。
所述步骤1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；具体如下：
a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQ ID No.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；
b)针对上述位点，设计并合成sgRNA序列，具体为F-sgRNA序列为SEQ ID No.2：5’-3’CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；
R-sgRNA序列为SEQ ID No.3：
5’-3’AAACCCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC；
F-sgRNA序列和R-sgRNA序列为合成的单链DNA片段；
c)将上述合成的单链DNA片段进行退火，形成双链DNA片段；
d)选取pX330质粒:pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，利用限制性内切酶BbsⅠ对pX330质粒进行酶切；
酶切体系建立：pX330质粒：1微克，10×缓冲液：2微升，BbsⅠ：1微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，37℃孵育30分钟，利用T4连接酶将退火后的双链DNA片段连入pX330质粒；
连接体系建立：将上述酶切产物：100纳克，双链DNA片段：200纳克，10×缓冲液：2微升，T4连接酶：0.5微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，室温孵育30分钟；将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。
所述退火条件：95℃5分钟；95℃开始，每循环2秒钟，每循环下降0.1℃，共200个循环；到达75℃，每循环1秒钟，每循环下降0.1℃，600个循环；15℃2分钟。
所述步骤2)供体质粒的构建:利用T4连接酶于目的序列Hutat2:Fc的两端各连入～1.5kb针对基因组AAVS1位点靶序列上下游的同源臂序列，选取PTA2质粒作为供体质粒载体，利用BamHⅠ和HindⅢ对PTA2质粒进行双酶切，利用T4连接酶将目的片段和同源臂序列连入PTA2载体中，30分钟后将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。
所述步骤3)分选原代单核细胞具体为：从血库取全血10毫升，按照体积比1:20加入单核细胞阴选抗体，室温孵育20分钟后，按照体积比1:1加入PBS缓冲液进行稀释，混匀后，将20毫升稀释血液沿试管壁缓慢的叠加到10毫升淋巴细胞分离液之上，并与分离液面形成明显的界面；梯度离心2000转/分钟离心20分钟，收集离心后的环状乳白色淋巴细胞层；加入40毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心10分钟，重复两次。按照体积比9:1加入NH4Cl溶液于冰上孵育10分钟以裂解红细胞。加入10毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心5分钟，重复两次以备后用。
所述步骤4)电脉冲穿孔法转染单核细胞：取5×105个单核细胞重悬于200微升电转缓冲液，并置于电转杯中，加入2微克打靶质粒和8微克供体质粒，操作过程中不能产生气泡，将电转杯置于冰上5-10分钟，于电穿仪上进行电穿，电穿完成后迅速将细胞悬液转移至1640完全培养基中，置于37℃，体积百分数为5％CO2中培养9天以基因编辑。
所述步骤4)中的电脉冲穿孔条件：电压为1200V，时间为20ms，脉冲为3pulses。
所述步骤5)敲入效率鉴定：通过Sanger测序或PCR检测目的序列的整合。
本发明的优点：
1)该方法简便易行，将CRISPR/Cas9技术与电穿孔的转染方法结合，使其更加适用于原代悬浮细胞的基因编辑，即便是对于单核细胞中这种难转染细胞也可以获得较高的编辑效率；
2)该方法无需后期细胞筛选，即可获得较高的基因编辑效率，这大大增加了实验的可行性和应用前景。
3)该方法适用范围广，对于10-10000bp长度的基因片段的敲入均适用，可以完全满足一般科研的需要。
4)该方法将基因片段敲入安全区AAVS1位点，不会影响原代单核细胞的正常功能，尤其是保护了单核细胞迁徙能力，这大大增加了基因修饰后单核细胞穿过血脑屏障进入中枢神经系统的可能性，为未来运用于中枢神经系统的细胞治疗提供了更为科学有效的实验方法。
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1是供体质粒构建示意图；
图2是单核细胞Hutat2:Fc敲入效率分析；
图3是敲入的单核细胞分泌Hutat2:Fc蛋白情况分析；
图4是分泌的Hutat2:Fc蛋白对HIV-Tat引起神经毒性作用的影响；
图5是基因编辑对15种单核细胞相关基因表达的影响；
图6是基因编辑对单核细胞扩膜能力的影响。
具体实施方式
CRISPR/Cas9技术是近年来新发现的一种基因编辑技术，这一技术可以实现基因组内特异位点的基因编辑。和ZFN/TALEN介导的基因定点插入技术相比，CRISPR/Cas9技术操作简便，编辑效率高，可以实现定点单拷贝基因插入，对基因组稳定性影响较小。而且人类基因组序列中固有的AAVS1位点是人类基因组序列中的“安全港”位点，这一位点可以实现各种外源基因的插入并且不会影响细胞的正常功能。因此本发明利用该技术将治疗性基因插入人原代单核细胞的AAVS1位点，使其穿过血脑屏障进入神经系统发挥治疗作用。
利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，包括如下步骤：
1)CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；具体如下：
a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQ ID No.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；
b)针对上述位点，设计并合成sgRNA序列，具体为F-sgRNA序列为SEQ ID No.2：5’-3’CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；
R-sgRNA序列为SEQ ID No.3：
5’-3’AAACCCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC；
F-sgRNA序列和R-sgRNA序列为合成的单链DNA片段；
c)将上述合成的单链DNA片段进行退火，形成双链DNA片段；
d)选取pX330质粒:pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，利用限制性内切酶BbsⅠ对pX330质粒进行酶切；
酶切体系建立：pX330质粒：1微克，10×缓冲液：2微升，BbsⅠ：1微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，37℃孵育30分钟，利用T4连接酶将退火后的双链DNA片段连入pX330质粒；
连接体系建立：将上述酶切产物：100纳克，双链DNA片段：200纳克，10×缓冲液：2微升，T4连接酶：0.5微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，室温孵育30分钟；将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。
所述退火条件：95℃5分钟；95℃开始，每循环2秒钟，每循环下降0.1℃，共200个循环；到达75℃，每循环1秒钟，每循环下降0.1℃，600个循环；15℃2分钟。
2)供体质粒的构建；
利用T4连接酶于目的序列Hutat2:Fc的两端各连入～1.5kb针对基因组AAVS1位点靶序列上下游的同源臂序列，选取PTA2质粒作为供体质粒载体，利用BamHⅠ和HindⅢ对PTA2质粒进行双酶切，利用T4连接酶将目的片段和同源臂序列连入PTA2载体中，30分钟后将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用。
3)分选原代单核细胞；
从血库取全血10毫升，按照体积比1:20加入单核细胞阴选抗体，室温孵育20分钟后，按照体积比1:1加入PBS缓冲液进行稀释，混匀后，将20毫升稀释血液沿试管壁缓慢的叠加到10毫升淋巴细胞分离液之上，并与分离液面形成明显的界面；梯度离心2000转/分钟离心20分钟，收集离心后的环状乳白色淋巴细胞层；加入40毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心10分钟，重复两次。按照体积比9:1加入NH4Cl溶液于冰上孵育10分钟以裂解红细胞。加入10毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心5分钟，重复两次以备后用。
4)电脉冲穿孔法转染单核细胞；取5×105个单核细胞重悬于200微升电转缓冲液，并置于电转杯中，加入2微克打靶质粒和8微克供体质粒，操作过程中不能产生气泡，将电转杯置于冰上5-10分钟，于电穿仪上进行电穿，电穿完成后迅速将细胞悬液转移至1640完全培养基中，置于37℃，体积百分数为5％CO2中培养9天以基因编辑。
所述步骤4)中的电脉冲穿孔条件：电压为1200V，时间为20ms，脉冲为3pulses。
5)敲入效率的鉴定：通过Sanger测序或PCR检测目的序列的整合。
试验效果或试验论证
1.Hutat2:Fc敲入单核细胞效率的评估：
供体质粒构建示意图(参见图1)，提取转染后细胞的基因组，按照引物列表所示进行PCR，利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，灰度分析检测敲入效率，同时流式分析检测GFP+的比例确定敲入效率(参见图2)。最终在单核细胞中获得了9％的敲入效率。
2.敲入的单核细胞分泌Hutat2:Fc蛋白情况分析
通过ELISA检测培养单核细胞上清中Hutat2:Fc水平(参见图3)，可以看到上清中Hutat2:Fc逐渐积累，至效率评估后第5天达到顶峰。
3.分泌的Hutat2:Fc蛋白对HIV-Tat引起神经毒性作用的影响
分离小鼠大脑皮层神经元，培养6天至其分化成熟后加入HIV-Tat孵育3天，同时加入敲入的单核细胞培养上清，通过免疫荧光检测神经元的存活情况，以正常组的神经元存活率为100％，分别计算每组的神经元相对存活率(参见图4)。加入带有Hutat2:Fc蛋白的细胞上清可以部分拮抗HIV-Tat的毒性作用。
4.Hutat2:Fc敲入对单核细胞正常功能的影响
本发明比较了传统的慢病毒和我们使用的CRISPR两种基因编辑方式对单核细胞功能的影响。首先，本发明选取了单核细胞功能相关的15种基因，比较基因编辑前后它们的变化(参见图5)；然后本发明利用单核细胞跨膜实验，比较基因编辑对单核细胞跨膜能力的影响(参见图6)。慢病毒转染可能引起IL-8，STAT-1和CCR5表达的异常，同时降低单核细胞跨膜能力，而本发明目前应用的CRISPR技术则不会引起这样的改变。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法
<130> 2017
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列("人工序列")
<400> 1
ggggccacta gggacaggat tgg 23
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列("人工序列")
<400> 2
caccgggggc cactagggac aggattgg 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列("人工序列")
<400> 3
aaacccaatc ctgtccctag tggccccc 28

Claims (5)

1.利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：包括如下步骤：
1）CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；
2）供体质粒的构建；
3) 分选原代单核细胞；
4）电脉冲穿孔法转染单核细胞；
5）敲入效率的鉴定；
所述步骤1）CRISPR/Cas9打靶质粒的构建；具体如下：
a)筛选得到针对人体基因组AAVS1位点的靶序列为SEQ ID No.1：GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；
b)针对上述位点，设计并合成sgRNA序列，具体为F-sgRNA序列为SEQ ID No.2：5’-3’CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGATTGG；
R-sgRNA序列为SEQ ID No.3：
5’-3’AAACCCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC；
F-sgRNA序列和R-sgRNA序列为合成的单链DNA片段；
c)将上述合成的单链DNA片段进行退火，形成双链DNA片段；
d)选取pX330质粒: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，利用限制性内切酶BbsⅠ 对pX330质粒进行酶切；
酶切体系建立：pX330质粒：1微克，10×缓冲液：2微升，BbsⅠ：1微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，37℃孵育30分钟，利用T4连接酶将退火后的双链DNA片段连入pX330质粒；
连接体系建立：将上述酶切产物：100纳克，双链DNA片段：200纳克，10×缓冲液：2微升，T4连接酶：0.5微升，去离子水：将总体系补齐至20微升，室温孵育30分钟；将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用；
所述步骤2）供体质粒的构建:利用T4连接酶于目的序列Hutat2:Fc的两端各连入1.5kb针对基因组AAVS1位点靶序列上下游的同源臂序列，选取PTA2质粒作为供体质粒载体，利用BamHⅠ和HindⅢ对PTA2质粒进行双酶切，利用T4连接酶将目的片段和同源臂序列连入PTA2载体中，30分钟后将连接产物转化入DH-5α感受态细胞，挑取单克隆后测序验证并提取质粒以备后用；
所述步骤4）电脉冲穿孔法转染单核细胞：取5×105个单核细胞重悬于200微升电转缓冲液，并置于电转杯中，加入2微克打靶质粒和8微克供体质粒，操作过程中不能产生气泡，将电转杯置于冰上5-10分钟，于电穿仪上进行电穿，电穿完成后迅速将细胞悬液转移至1640完全培养基中，置于37℃，体积百分数为5% CO2中培养9天以基因编辑。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述退火条件：95℃ 5分钟；95℃开始，每循环2秒钟，每循环下降0.1℃，共200个循环；到达75℃，每循环1秒钟，每循环下降0.1℃，600个循环；15℃ 2分钟。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤3）分选原代单核细胞具体为：从血库取全血10毫升，按照体积比1:20加入单核细胞阴选抗体，室温孵育20分钟后，按照体积比1:1加入PBS缓冲液进行稀释，混匀后，将20毫升稀释血液沿试管壁缓慢的叠加到10毫升淋巴细胞分离液之上，并与分离液面形成明显的界面；梯度离心2000转/分钟离心20分钟，收集离心后的环状乳白色淋巴细胞层；加入40毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心10分钟，重复两次。按照体积比9:1加入NH4Cl溶液于冰上孵育10分钟以裂解红细胞。加入10毫升PBS缓冲液，1200转/分钟离心5分钟，重复两次以备后用。
4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤4）中的电脉冲穿孔条件：电压为1200V，时间为20ms，脉冲为3pulses。
5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法，其特征是：所述步骤5）敲入效率鉴定：通过Sanger测序或PCR检测目的序列的整合。
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