CN109983130A - 制备电转感受态酵母细胞的方法以及使用这些细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酵母细胞的改进的酵母转化，以及由此转化得到的酵母细胞库。更具体地，本发明涉及通过电穿孔进行的酵母转化。

Description

制备电转感受态酵母细胞的方法以及使用这些细胞的方法

技术领域

本发明涉及酵母细胞的改进的酵母转化，以及由其转化得到的酵母细胞库。更具体地，本发明涉及通过电穿孔进行的酵母转化。

背景技术

多年来，癌症治疗的基石为手术、化疗和放射治疗。在过去十年中，靶向疗法也已成为许多癌症的标准治疗方法，如伊马替尼和曲妥珠单抗是通过对准主要在这些细胞中所见的特定分子变化而靶向癌细胞的药物。

如今，令人兴奋的是越来越多使用免疫疗法治疗，即利用患者免疫系统的力量来对抗疾病。免疫疗法的一种途径涉及患者自身免疫细胞的基因改造，以识别和攻击其肿瘤。这种称为过继细胞转移(ACT)的方法已在晚期癌症患者中产生了一些显著的疗效。

虽然通常预期天然T细胞受体(TCR)具有足够高的亲和力以达到治疗疗效，但是，在开发治疗性TCR或其衍生物，例如可溶性TCR(sTCR)时，通常期望/需要所谓的亲和力成熟，以在体内引发有效的免疫应答。

为了达到成熟状态，通常应用一种酵母表面展示技术的方法。但是，为了产生具有足够多样性的文库，需要高效的酵母转化方法。

长期以来希望鉴定出基本上由天然α和β链序列组成且与特定抗原特异性结合的TCR，从而可以开发例如TCR或其可溶性类似物，为潜在治疗剂提供基础。被上述所鉴定TCR识别的抗原可能与疾病(如：癌症、病毒感染、自身免疫疾病、寄生虫感染和细菌感染)相关。因此，这些疗法可用于治疗所述疾病。

此外，一旦发现天然或自然TCR，并确定了它们的序列，就可根据需要引入导致亲和力或半衰期增加的突变，如WO2012/013913所述。传统上而言，对于特异结合疾病相关抗原(例如，癌症病毒、自身免疫或细菌抗原)的TCR的发现尝试，受限于志愿者供体抽取的血液样本的使用。这些样本用于分离与疾病相关抗原结合的T细胞及其相应的TCR。这种方法通常需要至少20个供体。该过程漫长并且耗费劳力，且不能保证发现与抗原结合的T细胞受体。当识别到功能性T细胞受体时，它们通常对抗原具有弱亲和力、低特异性和/或在体外不当折叠。能够被筛选出的T细胞的多样性受限于供体内的T细胞多样性。一些疾病相关抗原，包括大部分癌抗原，为自身抗原；由于经胸腺选择来去除识别自身抗原的TCR，所以对疾病相关抗原具有特异性的TCR可能不存在于供体的天然组成中，或者可能对抗原具有弱亲和力。

对于设计用于分离新的具有抗原结合特异性的TCR文库的尝试，已经持续了数年。由于TCR链不太稳定并且通常不能正确展示，因此TCR文库远比同类抗体文库更难创建。构建TCR文库非常复杂。优选保留CDR3长度变体(在自然谱系中发现的)。任一文库中的相当一部分都败给了终止密码子、框架移位、折叠问题、以及可能根本不会与HLA复合体结合的TCR链组合。考虑到大量的可变α和可变β基因以及J和D基因，产生和鉴别出一起形成与抗原肽结合且具有所需特异性的TCR的功能性折叠的α链和功能性折叠的β链的几率极低。

在真核系统(如酵母)中产生核酸文库以及由此产生的重组产物(如药物蛋白质)的方法的使用价值，相对于使用原核系统如(大肠杆菌)，具有显著的优点。酵母通常可以生长为比细菌更高的细胞密度，并且容易适应于连续发酵加工。但是，由于缺乏关于转化条件和外来核酸稳定引入酵母宿主细胞合适方法的相关知识，开发酵母物种作为产生重组产物和文库的宿主/载体系统受到严重的阻碍。

在促进细胞电转化的多种电和生物学参数中，DNA吸附到细胞表面是其中之一。低强度的交流电场也可促进DNA转移到大肠杆菌中，很可能是通过DNA渗透酶的电刺激发生作用。对于聚电解质DNA的电穿孔基因转移的主要电扩散或电泳效应，已经积累了证据。通过电穿孔促进的电渗作用和膜内陷也有报告。

跨酵母细胞膜的电场施加可产生对电穿孔过程至关重要的瞬时孔。电穿孔仪信号发生器提供跨过电极之间间隙(cm)的电压(单位kV)。电位差定义了所谓的电场强度，其中E等于kV/cm。每个细胞都有自己的对于最佳电穿孔的临界场强。这由细胞大小、膜组成和细胞壁本身个体特征决定。例如，哺乳动物细胞通常需要0.5-5.0kV/cm电场强度才能发生细胞死亡和/或电穿孔。通常，所需的场强与细胞大小成反比。

EP2257638A1涉及通过电穿孔转化酵母的方法。这些方法包括作为细胞调节剂的乙酸锂(LiAc)和二硫苏糖醇(DTT)的组合，它们都被用于提高酵母转化的频率。如表2所示，在去除DTT或LiAc预处理后，效率分别降低93.3％和85.7％。

同样，Smith等人(在：T Cell Receptor Engineering and Analysis Using theYeast Display Platform.Methods Mol Biol.2015；1319:95-141一文中)公开了有关与作为肽-MHC(pepMHC)配体的抗原结合的TCR的研究。对于改造TCR亲和力，从而以与抗体相似的方式使用这类分子，已经引起了关注。为了改造TCR以及更快速地分析它们的结合特征，使用酵母展示系统作为平台。表达和设计类似于抗体scFv片段的单链形式TCR使得TCR可以针对多种可能的pepMHC配体进行亲和力成熟改造。此外，酵母展示平台使得人们可以快速产生具有多种结合亲和力的TCR变体，并分析特异性和亲和力，而不需要纯化可溶形式的TCR。本文介绍了使用酵母展示技术进行单链TCR设计和分析的方法。

酵母文库没有达到噬菌体文库已经实现的大小或效率，典型的最大噬菌体文库大小为10¹⁰至10¹¹，而典型的酵母文库大小为10⁷。虽然电穿孔方案的最新进展(参见Chao,Nature Protocols 1(2):755-768(2006))在单次转化中可实现最大5x 10⁷大小的酵母文库。迄今为止实现的酵母菌文库大小仍然显著低于噬菌体展示文库常规可实现的10¹⁰至10¹¹大小，这一表述仍然正确。

在实现越来越高的转换效率的同时，使用上述方法和披露内容，来将10⁶至10⁷大小范围的多个小型文库积累形成10⁸至10⁹大小范围的较大组合文库，仍然很费力，花费大量时间和重复劳动。

使用磁珠和荧光启动细胞分选方法的酵母展示文库选择提供了一种有效和灵敏的方法，以富集靶向抗原的特异性结合物，特别是其与荧光启动细胞分选(FACS)的兼容性。但是，由于酵母细胞转化效率低，典型酵母展示文库大小有限阻碍了这种选择的优势。

因此，需要利用酵母而高效地产生蛋白质文库(例如TCR文库)的方法。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种制备电转感受态酵母细胞的方法，其包括以下步骤：a)使酵母细胞生长至OD₆₀₀值约1.0-2；b)用冷水洗涤细胞；c)用包含山梨糖醇和CaCl₂的冷溶液洗涤细胞；d)使细胞在包含乙酸锂和三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的溶液中孵育；e)用包含山梨糖醇和CaCl₂的冷溶液洗涤细胞；f)将细胞重悬于包含山梨糖醇的溶液中；和g)任选地，适当地储存所述细胞。

因此，本发明提供了一种高效转化酵母细胞的方法，例如，用于产生改进的酵母细胞文库。本发明的方法消除了将酵母展示技术作为一种实际工具进行应用中的重大瓶颈，可进入以前未被探索的更大的TCR多样性空间。

本发明的另一方面涉及一种转染电感受态酵母细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供根据本发明方法的电转感受态酵母细胞；b)用包含山梨醇的冷溶液洗涤细胞；c)使细胞与待转染的DNA混合，以形成电穿孔预混合物；d)将所述电穿孔预混合物转移到合适的电穿孔比色皿中；以及e)在约2.5kV/cm至约12.5kV/cm之间对所述细胞进行电穿孔约2至约5ms。

在本发明的方法中，优选所述DNA为线性的或环状的。更优选的是，在本发明的方法中，所述DNA包含编码相关蛋白质文库的DNA片段文库，例如酵母表面展示文库的形式存在的DNA文库。最优选的是，在本发明的方法中，所述展示文库为T细胞受体(TCR)文库。

令人惊奇地是，申请人发现，通过使用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)作为还原剂，本发明方法的转化效率比使用DTT时要高，例如高于1x 10⁸个酵母转化体/μg载体DNA，优选高于2x 10⁸个酵母转化体/μg载体DNA。

本发明的另一方面涉及用于产生改进的目标蛋白酵母文库的方法，例如以酵母表面展示文库形式存在的文库，其包括以下步骤：a)提供根据本发明方法的转染的酵母细胞；b)将转染的细胞稀释在山梨糖醇溶液：生长培养基为1:1的混合物中；c)将细胞重悬于合适的生长培养基中；d)任选地，进行稀释以计算多样性，并将所述稀释液铺在含卡那霉素的SD-CAA平板上；以及e)将所述文库转移到合适的生长培养基中，并扩展每次电穿孔得到的所述文库；以及f)任选地，适当地存储所述扩展文库。

优选的是，根据本发明的方法，其中所述展示文库为T细胞受体文库。优选的是，根据本发明的方法，其中所述文库的多样性高于约10¹²。

具体实施方式

在本发明的背景中，术语“表达载体”是指包括一个自主复制位点(ARS)——转录起始位点和至少一个编码将在宿主生物体中表达的蛋白质的结构基因的DNA构建体。复制位点或复制起点是控制克隆和表达载体复制的任何DNA序列。表达载体通常还含有适当的控制区域，例如一个或多个增强子和/或启动子，抑制子和/或沉默子，以及控制宿主酵母中蛋白质表达的终止子。根据本发明的表达载体还可能含有包含本文所述必需基因的选择标志物。表达载体还任选地含有可广泛获得和本领域技术人员熟知的其它可选择标志物。表达载体是载体的一种类型。载体可任选地包括来自一种或多种酵母菌株的一种或多种ARS序列(元素)。

术语“可操作地连接”是指DNA区段配制成使得它们一致地作用于其预期目的，例如，转录在启动子处起始，并贯穿编码区段进行，直至到达终止子。

术语“转化”或“转染”是指将DNA或其他核酸引入到受体酵母宿主细胞中，以改变基因型。

术语“转化体”或“转化细胞”是指经历转化的受体酵母宿主细胞及其后代。

除非另有说明，否则“大约”应为给定值的+/-10％。

可用于本发明的电穿孔方法的载体包括pYD载体、一般可以通过酵母细胞或核酸繁殖的任何其它载体及其衍生构建体。本发明的表达载体可以基于任何类型的载体，只要载体可以转化、转染或转导宿主酵母细胞即可。在一项优选的实施方案中，表达载体基于酵母质粒，特别是来自酿酒酵母的质粒。在酵母细胞转化后，编码文库序列的外源DNA被细胞吸收，随后由转化细胞表达。

更优选的情况是，表达载体可以是可在大肠杆菌或酵母中繁殖的酵母细菌穿梭载体(Struhl,et al.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.)。纳入大肠杆菌质粒DNA序列(如pBR322)有助于在大肠杆菌中定量制备载体DNA，从而有效转化酵母。

可用作穿梭的酵母质粒载体的类型可以是复制载体或整合载体。复制载体是一种酵母载体，由于存在DNA复制的功能来源，其能够介导其独立于酵母染色体DNA的自身维持。整合载体依赖于与染色体DNA的重组以促进复制，并因此继续维持宿主细胞中的重组DNA。复制载体可以是基于2微米的质粒载体，其中DNA复制起点源自内源性2微米质粒酵母。或者，复制载体可以是自主复制(ARS)载体，其中“明显的”复制起点源自酵母的染色体DNA。任选地，复制载体可以是着丝粒(CEN)质粒，除了上述一种DNA复制起点之外，还携带已知含有着丝粒的酵母染色体DNA序列。

载体可以以死循环形式或线性形式转化成酵母细胞。通过整合载体转化酵母，虽然具有可遗传的稳定性，但是当载体呈紧密环形可能效率很差(例如，每μg DNA仅产生约1-10个转化体)。具有与酵母染色体DNA同源的DNA序列中的游离末端的线性化载体以更高的效率(100-1000倍)转化酵母，并且转化DNA通常被发现整合到与切割位点同源的序列中。因此，通过用适当的限制性内切核酸酶切割载体DNA可以提高转化效率并靶向作用于染色体整合位点。整合转化可适用于酿造酵母的基因修饰，条件是转化效率足够高，并且用于整合的靶DNA序列在不破坏宿主细胞代谢所必需基因的区域内。

可以通过本发明的电穿孔方法转化的酵母菌株包括酿酒酵母属中的酵母菌种(如：酿酒酵母)和粟酒裂殖酵母属(如粟酒裂殖酵母)。在一项实施方案中，酵母细胞为二倍体酵母细胞。或者，酵母细胞为单倍体细胞，例如，酵母单倍体细胞的“a”和“α”菌株。

本发明背景中的“T细胞受体文库”可以包括待筛选的人和/或突变人TCR的合适部分，优选为单链形式的TCR，例如：Vβ-接头-Vα单链(scTCR)；或Vα-接头-Vβ单链，任选地与自切割肽融合，例如，2A-肽。还可以使用公开的方法优化对野生型氨基酸序列进行最小修饰的TCR表达(例如：Szymczak,A.L.et al.Correction of multi-gene deficiency in vivousing a single‘self-cleaving’2A peptide–based retroviral vector.NatBiotechnol 22,589–594(2004)；Yang,S.et al.Development of optimal bicistroniclentivi-ral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robusttumor cell recognition.Gene Ther 15,1411–1423(2008)；Kuball,J.etal.Facilitating matched pairing and ex-pression of TCR chains introduced intohuman T cells.Blood 109,2331–2338(2007)；Cohen,C.J.et al.Enhanced AntitumorActivity of T Cells Engineered to Express T-Cell Receptors with a SecondDisulfide Bond.Cancer Res 67,3898–3903(2007)；Scholten,K.B.J.et al.Codonmodification of T cell receptors allows enhanced functional expression intransgenic human T cells.Clin.Immunol.119,135–145(2006))。

载体DNA与插入DNA的比例在约1:0.5至约1:10的范围内，例如1:0.5、1:1；1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一项实施方案中，在反应中使用约1μg载体DNA和约1μg插入DNA。在另一项实施方案中，沉淀约1μg载体DNA和约2μg插入DNA。在另一项实施方案中，沉淀约1μg载体DNA和约3μg插入DNA。在另一项实施方案中，沉淀约1μg载体DNA和约4μg插入DNA。在另一项实施方案中，沉淀约1μg载体DNA和约5μg插入DNA。

在一项实施方案中，细胞悬液包含约50至约400μl的酵母细胞，例如50、100、150、200、250、300、350、400μl酵母细胞。

在一项实施方案中，酵母细胞悬浮液为约1至约10x 10⁹个酵母细胞/mL，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10x 10⁹个酵母细胞/mL。

在一项实施方案中，用于电穿孔酵母细胞的场强为约0.5kV/cm至约12.5kV/cm，例如，0.5、1.0、约2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5kV/cm。

在一项实施方案中，酵母细胞以约10至约50μF的电容电穿孔，例如，10、15、20、25、30、35、40、45或50。

在一项实施方案中，将酵母细胞悬浮在约0.1至约10M山梨醇和0.1至10mM CaCl₂或MgCl₂中，例如，0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0M山梨醇或例如，0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0mMCaCl₂或MgCl₂。

在一项实施方案中，将酵母细胞温育在约0.01至约1.0M LiAc中，例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、约0.7、0.8、0.9或1.0M LiAc，以及1至100mM TCEP中，例如，1、10、20、30、40、50、60、约70、80、90或100mMTCEP。

本发明提供了转化酵母细胞的方法，包括对含有酵母与一种或多种核酸构建体的细胞悬液进行电穿孔。酵母细胞的转化可以发生于单个克隆到酵母细胞群体(即，酵母文库)的任何地方，其可用于筛选(a)通过衔羁到酵母表面蛋白、或经由与酵母细胞表面蛋白或其他组分的共价或非共价相互作用而产生的连接，从而在酵母细胞表面展示的肽或蛋白；(b)细胞内表达的肽或蛋白质；或(c)分泌到细胞外空间(如培养基)中或沉积在固体表面上的肽或蛋白质。此类酵母文库可以方便地适用于多种应用，以筛选或表征肽或蛋白质与可以引入酵母细胞或外源添加的另一种蛋白质、肽、DNA、RNA或其它化学物质之间的相互作用。具体实例是在酵母展示、酵母双杂交、酵母三杂交等中发现的实例。

本发明提供了一种用于转化酵母细胞的方法，包括使用足以转化酵母细胞的电阻、场强和脉冲持续时间中的一种或多种，对含有酵母以及一种或多种核酸构建体的细胞悬浮液进行电穿孔，所述核酸构建体包含一种或多种调节序列和一种或多种基因或基因片段。

在一项实施方案中，场强为约2.5kV/cm至约12.5kV/cm。在某些实施方案中，场强为0.5kV/cm、1.0kV/cm、1.5kV/cm、2.0kV/cm或2.5kV/cm。这些值将电穿孔比色皿有0.2cm的间隙考虑在内。较高场强是可行的，但其操作性在很大程度上取决于能够提供更强脉冲装置的开发。

在一项实施方案中，脉冲持续时间为约3毫秒至约10毫秒。在一项特定实施方案中，脉冲持续时间约为4毫秒。

通过本发明的电穿孔方法对细胞的处理是通过对一对电极之间的酵母细胞悬浮液施加电场来进行的。场强必须进行相当准确的调整，以使细胞电穿孔对细胞不会发生损伤或使损伤降至最小程度。之后可以测量电极之间的距离，可对电极施加根据公式E＝V/d得出的适当电压(E＝电场强度，单位V/cm；V＝电压，单位伏特；d＝距离，单位cm)。

用于执行本文所述程序的脉冲发生器已经上市多年。一种合适的信号发生器为Gene Pulser II(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)。典型的设置包括连接到电容延长器+的Gene Pulser II和脉冲控制器+模块。

本发明中使用电穿孔以便于将DNA引入酵母细胞。电穿孔是使用脉冲电场来瞬时透化细胞膜的过程，以让大分子(如DNA分子)进入细胞。但是，DNA转移到细胞中的实际机制尚不清楚。例如，对于转化假丝酵母，当细胞暴露于具有约10至约13kV/cm的场强、大约R5电阻值(129奥姆)的实验衰减脉冲电场、时间常数约4.5ms时，电穿孔的效率令人惊讶。通常，根据所选择的电穿孔设备，电阻和电容是现成的，或可由用户选择。无论如何，设备按照制造商的说明进行配置，以提供适当的场强和衰减参数。

本发明还涉及高效转化酵母的方法，使得可以高水平地表达任一种或多种所需内源(即天然存在于该酵母细胞内)或异源基因。本发明的方法还涉及制备文库的方法，例如表达TCR、scTCR、嵌合体或其片段的文库。

在一种情况下，携带感相关基因的表达载体可以通过电穿孔转化到酵母宿主细胞中以产生单个克隆或由许多表达细胞内蛋白质(例如，核或细胞质蛋白)、膜蛋白(例如，跨膜蛋白或膜附着蛋白)或分泌蛋白的转化细胞组成的文库。人们将能够使用转化细胞或文库来纯化蛋白质、研究蛋白质功能、识别蛋白质-蛋白质相互作用或识别新的蛋白质结合物或相互作用的配偶体。重要的是，产生非常大的展示或表达TCR和TCR片段的酵母文库的能力。文库可以通过靶抗原进行选择，以发现与选择抗原结合的TCR。

由于经转化的酵母具有失去人造构建质粒的倾向，因此使用培养基对其施加正向选择压力是有利的。当菌株为必需代谢物的营养缺陷突变体时以及当使用的载体质粒包含能够恢复菌株原生质体的标志物基因(例如LEU2基因)时，可以通过省略培养基中的代谢物来施加该选择压力。存在其它方法来获得相同的结果，这些方法也可用于实践本发明。

根据相关结构基因的性质，产物或表达产物可以保留在酵母宿主细胞的细胞质中或分泌产物或表达产物。已经发现，不仅保留在细胞中的蛋白质而且所分泌的蛋白质都是可溶的。当产物或表达产物保留在酵母宿主细胞中时，通常可能需要具有诱导型转录起始区，使得在转化体达到高密度之前，所需产物表达很少或没有表达或产生。在产物或表达产物表达足够的时间之后，可以通过常规方法(例如，离心、裂解)分离细胞，分离出相关产物。根据产物的性质和用途，裂解物可接受各种纯化方法，如色谱法、电泳、溶剂萃取、结晶、透析、超滤等。层析方法，包括但不限于气相色谱法、HPLC、柱层析法、离子交换层析法和本领域技术人员已知的其它层析方法。纯度可以在约50％至90％或更高，优选为至多约100％之间变化。

或者，表达产物或相关产物可以分泌到培养基中，并连续产生，其中培养基被部分抽出，提取所需的产物，例如通过柱或亲和层析法、超滤法、沉淀法等提取，并通过还原基本组分废弃或再循环废弃的用过的培养基。含有来自超滤产物的渗透物可进一步浓缩，进一步通过蒸发、随后使用醇和/或pH调节进行结晶或沉淀。本领域技术人员知道许多过程选项。当分泌产物时，通常使用组成型转录起始区，尽管也可使用非组成型区域。

可以参考如本文所述的附图，从实施例导出其它优选实施方案，但不限于此。为了本发明的目的，本文中引用的所有参考文献通过引用的方式并入。

附图说明

图1示出TCEP的改进转化效率与相同条件下DTT处理的比较。

实施例

除非另有说明，本发明的实践采用本领域熟知的细胞电穿孔和酵母细胞生物学的常规技术。

I.培养基

1.YPD培养基

酵母提取物 10g

细菌蛋白胨 20g

葡萄糖 20g

用H₂O将体积调至1L(添加无菌葡萄糖至高压灭菌溶液)

2.SD-CAA(pH 4.5)：

柠檬酸钠二水合物 14.8g(50mM最终)

柠檬酸一水合物 4.2g(20mM最终)

在800mL H₂O中，高压灭菌。

糖胺酸 5.0g

酵母氮碱(不含氨基酸) 6.7g

葡萄糖 20g

用H₂O将体积调至1L，无菌过滤

3.SD-CAA平板：

在800mL H₂O中，高压灭菌，冷却至～55℃。

在200ml H₂O中，无菌过滤，加入到冷却的高压灭菌溶液中

II.电感应态酵母细胞的制备

将20μl从-80℃新鲜解冻的酵母储备液在YPD琼脂平板上划线，并在30℃下孵育2天。将单个菌落(取整个菌落)从YPD琼脂平板上取出，放入15ml YPD培养基中，在30℃过夜振荡。次日早晨，将10ml培养物转移到100ml新鲜的YPD培养基中，并在30℃继续振荡7小时。测定OD₆₀₀，加入1L的冷YPD培养基，使OD₆₀₀为0.2。将振荡烧瓶置于预冷(4℃)的振荡器中。将振荡器编程为在工作日开始前5小时开始加热(30℃)并振荡(250rpm)。进行孵育，直到OD₆₀₀达到1.5，通常为振荡开始后6小时开始达到。

如果未另外说明，后续步骤必须在冰上和用冷却的溶液、管、比色皿和离心机进行。

细胞2000g和4℃离心3分钟(在10个Falcon管中，50ml，2个步骤过程)，成团，用25ml冷H₂O洗涤两次，2000g 3分钟成团。细胞用25ml 1M冷山梨糖醇、1mM CaCl₂洗涤；并以2000g离心3分钟。将细胞重悬于25ml 100mM乙酸锂、10mM TCEP。使用带有过滤器盖的50mlFalcon管进行通气；将细胞在30℃以160rpm振荡孵育30分钟，置于冰上，细胞以2000g和4℃离心3分钟。细胞用25ml冷1M山梨醇/1mM CaCl₂洗涤；在2000g和4℃离心3分钟，用25ml冷的1M山梨糖醇洗涤；在2,000g和4℃离心3分钟。将细胞悬浮在冷1M山梨糖醇的锥形管中，直至每次电穿孔反应的终体积为400μl。电转感受态细胞可以直接储存在-80℃。在使用样本进行电穿孔之前，通过离心(2000g，4℃，5分钟)除去泄漏的盐，并用1M冷山梨糖醇洗涤两次。

III.电穿孔

将400μl细胞与5-10μl DNA(载体)在H₂O中混合，在冰上保持3分钟并转移到预冷的0.2cm电穿孔比色皿中。使用BioRad微脉冲发生电穿孔系统，细胞以2.5kV进行电穿孔。通常的时间常数为约4ms，优选为4ms。将电穿孔的细胞转移到10ml 1:1的山梨醇:YPD培养基混合物中，30℃1小时，不振荡。在室温下以2000g 3分钟收集细胞，并在室温下再悬浮于10ml SD-CAA中。进行稀释，以计算多样性(1:10⁵至1:10⁷)。稀释液在含有卡那霉素的SD-CAA平板上，30℃孵育1天，室温孵育3天。将文库转移到100ml SD-CAA(优选每电穿孔得到的文库)，并在30℃、160rpm下继续振荡24小时。扩展的文库可直接用于诱导或在4℃储存两周。可在-80℃、30％甘油中长期冷冻储存。

通过使用最佳的电穿孔条件，可以常规地实现约2x 10⁸个酵母转化体/μg载体DNA的酵母转化效率(参见图1)。由于该转化效率是在最小化的细胞体积(100μl)中实现的，因此非常适用于自动化和多孔电穿孔装置。

Claims (9)

1.一种制备电转感受态酵母细胞的方法，其包括以下步骤：

a)使酵母细胞生长至OD₆₀₀值约1.0至2；

b)用冷水洗涤细胞；

c)用包含山梨糖醇和CaCl₂的冷溶液洗涤细胞；

d)在包含乙酸锂和三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的溶液中孵育细胞；

e)用包含山梨糖醇和CaCl₂的冷溶液洗涤细胞；

f)将细胞重悬于包含山梨糖醇的溶液中；以及

g)任选地，适当地储存细胞。

2.一种转染电感受态酵母细胞的方法，其包括以下步骤：

a)提供根据权利要求1所述方法制备的电转感受态酵母细胞；

b)用包含山梨糖醇的冷溶液洗涤细胞；

c)将细胞与待转染的DNA混合，以形成电穿孔预混合物；

d)将电穿孔预混合物转移到合适的电穿孔比色皿中，以及

e)以2.5kV/cm-12.5kV/cm对细胞进行2-5ms电穿孔。

3.根据权利要求2所述的方法，其中DNA为线性或环状。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中DNA包括编码目标蛋白文库的DNA片段文库，例如以酵母表面展示文库形式存在的目标蛋白文库。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述展示文库为T细胞受体(TCR)文库。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中转化效率高于1x 10⁸个酵母转化体/μg载体DNA，优选高于2x 10⁸个酵母转化体/μg载体DNA。

7.一种用于产生改进的目标蛋白酵母文库的方法，例如以酵母表面展示文库形式存在的文库，其包括以下步骤：

a)提供根据权利要求2至6中任一项所述方法制备的转染的酵母细胞；

b)将转染的细胞稀释在山梨糖醇溶液：生长培养基为1:1的混合物中；

c)将细胞重悬于合适的生长培养基中；

d)任选地，进行稀释以计算多样性，并将稀释液铺在含有卡那霉素的SD-CAA平板上；以及

e)将由每次电穿孔得到的文库转移到合适的生长培养基中，并扩展文库；以及

f)任选地，适当地存储所扩展的文库。

8.根据权利要求7所述的方法，其中展示文库为T细胞受体文库。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中文库的多样性高于10¹²。