KR20190065400A - 전기감응성 효모 세포의 준비 방법 및 상기 세포의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모 세포의 향상된 효모 형질전환 및 그로써 형질전환된 효모 세포 라이브러리에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 전기천공에 의한 효모의 형질전환에 관한 것이다.

Description

전기감응성 효모 세포의 준비 방법 및 상기 세포의 사용 방법

본 발명은 효모 세포의 향상된 효모 형질전환 및 그로써 형질전환된 효모 세포 라이브러리에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 전기천공에 의한 효모의 형질전환에 관한 것이다.

오래 동안, 암 치료의 기본은 수술, 화학요법 및 방사선 요법이었다. 지난 10년에 걸쳐, 주로 암 세포에서 나타나는 특정한 분자 변화에 조준함으로써 그러한 세포를 표적으로 하는 약물들인 이마티닙(Gleevec®) 및 트라스투주맙(Herceptin®) 등의 표적화 요법들 또한 다수의 암에 대한 표준 치료로 대두되었다.

현재, 환자의 질병과 싸우는 환자의 면역계의 힘을 포획하는 요법인 면역요법에 대한 기대가 커지고 있다. 면역요법에 대한 한 접근 방식은 환자의 종양을 인식하여 공격하는 환자 자신의 면역 세포의 조작이 관여한다. 이 접근 방식을 입양 세포 전달(ACT)이라고 하며 진행성 암 환자에서 일부 현저한 반응을 생성했다.

예를 들어 용해성 TCR(sTCR)과 같은 치료 TCR 또는 그 유도체의 개발 시 천연 T 세포 수용체(TCR)가 치료 유효성을 성취할 만큼 충분하게 높은 친화도를 갖는 것이 전형적으로 기대되지만, 생체 내 생산적인 면역 반응을 유발하기 위해 대개는 소위 친화도 성숙이 바람직하다/요구된다.

성숙 과정을 위해 효모 표면 발현 기술을 사용하는 방법이 흔히 채택된다. 하지만 충분한 다양성을 가진 라이브러리를 생성하려면, 효모 형질전환을 위한 고도로 효율적인 방법이 필요하다.

예를 들어 TCR 또는 이의 용해성 유사체가 잠재적 치료제의 기반을 제공하도록 개발될 수 있도록, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 천연 알파 및 베타 사슬로 기본적으로 구성된 TCR을 식별하는 것을 오랫동안 추구해 왔다. 식별된 TCR에 의해 인지된 항원은 암, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 기생충 감염 및 세균 감염과 같은 질병과 연관될 수 있다. 그러므로 이러한 요법들을 상기 질환의 치료를 위해 사용하는 것이 가능하다.

더욱이 천연 또는 고유 TCR이 식별되어 그 서열이 결정되면, WO 2012/013913에 기술된 바와 같이 필요에 따라 친화도나 반감기의 증가를 초래하는 돌연변이의 개입이 가능하다. 전통적으로 암 바이러스성, 자가 면역 또는 세균의 항원과 같은 질병과 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 TCR의 식별 시도는 자원 공여자로부터 수집한 혈액 검체의 사용으로 제한되었다. 이러한 검체를 사용하여 T 세포와 질병 연관 항원에 결합하는 상응하는 TCR을 분리한다. 이 접근 방식은 일반적으로 최소 20명의 공여자를 요구한다. 이 과정은 시간이 오래 걸리며 노동력이 많이 들지만 항원 결합 T 세포 수용체 식별에 대한 보장이 없다. 기능적 T 세포 수용체가 식별되는 경우, 이것은 흔히 항원에 대해 약한 친화도, 낮은 특이성을 갖고/갖거나 시험관 내에서 제대로 접히지 않는다. 스크리닝이 가능한 T 세포의 다양성은 공여자 이내의 T 세포 다양성으로 제한된다. 암 항원의 대부분을 포함하여 일부 질병 연관 항원들은 자가 항원이다. 흉선 선택은 자가 항원을 인식하는 TCR 제거의 역할을 하므로, 질병 연관 항원에 특이적 TCR은 공여자의 천연 레퍼토리에 존재하지 않거나 아니면 항원에 대해 약한 친화도를 가질 수 있다.

항원 결합 특이성을 가진 새로운 TCR의 분리를 위한 라이브러리 설계의 시도가 수년 동안 지속되어 왔다. TCR 사슬이 덜 안정하고 흔히 올바르게 발현되지 않으므로, TCR 라이브러리는 유사한 항체 라이브러리보다 훨씬 더 창출하기 어렵다. TCR 라이브러리의 구축에 따른 복잡성은 거대하다. CDR3 길이에 대한 변동(천연 레퍼토리에서 발견됨) 유지가 선호된다. 모든 라이브러리의 상당한 부분이 일반적으로 정지 코돈, 틀 이동, 접히는 문제 그리고 단순히 HLA 복합체에 절대로 결합할 수 없는 TCR 사슬 조합으로 상실된다. 다수의 가변 알파 및 가변 베타 유전자 그리고 J 및 D 유전자를 고려할 때, 요구되는 특이성을 갖춘 항원성 펩티드에 결합하는 TCR을 함께 형성하는 기능성 접기 알파 사슬 및 기능성 접기 베타 사슬을 생성하고 식별할 확률이 지극히 낮다.

효모와 같은 진핵 체계에서 핵산 라이브러리 그리고 약학적 단백질과 같은 이에 의해 생산되는 재조합 생성물을 위한 수단의 가용성은 대장균(E. coli)과 같은 원핵 체계의 사용에 비해 상당한 이점을 제공한다. 효모는 일반적으로 세균보다 더 높은 세포 밀도로 성장될 수 있으며 연속 발효 처리에 즉시 적응될 수 있다. 하지만 재조합 생성물 및 라이브러리의 생산을 위한 숙주/벡터 체계로서의 효모종의 개발은 형질전환 조건에 관한 지식과 외부 핵산을 효모 숙주 세포로 안정되게 도입하는 적절한 수단의 결여로 인해 심하게 방해를 받는다.

세포의 전기적 형질전환을 원활하게 하는 다양한 전기적 및 생물학적 매개변수들 가운데 세포 표면으로의 DNA 흡착이 있다. 낮은 전류의 전기장을 교대하는 것 또한 대장균으로의 DNA의 전달을 촉진시키며, 이는 DNA 투과효소의 전기적 자극에 의한 것으로 추측된다. 중합전해질 DNA의 전기천공 유전자 전달에 대한 우세한 전기확산 또는 전기영동 효과에 대한 증거가 축적되어 있다. 전기천공에 의해 원활하게 되는 전기삼투 효과 및 막 함입 또한 보고되었다.

효모 세포막에 걸친 전기장을 적용하면 전기천공 과정에 매우 중요한 일과성 구멍이 생성된다. 전기천공기 신호 생성기는 전극 사이의 간격(센티미터(cm) 단위)을 걸쳐 이동하는 전압(킬로볼트(kV) 단위)을 제공한다. 이러한 전위 차이로 전계 강도(E = kV/cm)가 정의된다. 세포마다 최적의 전기천공에 필요한 고유의 중대한 전계 강도가 있다. 이것은 세포 크기, 막 조성 및 세포벽 자체의 개별적 특성에 기인한다. 예를 들어 포유류 세포는 세포사 및/또는 전기천공이 발생하기 전에 전형적으로 0.5 ~ 5.0 kV/cm가 요구된다. 일반적으로, 요구되는 전계 강도는 세포의 크기와 역으로 변한다.

EP 2257638A1은 전기천공에 의한 효모의 형질전환 방법에 관한 것이다. 여기에는 세포 전처리 제제로서 초산 리튬(LiAc) 및 디티오트레이톨(DTT)의 조합이 포함되며, 이 두 가지 모두 효모 형질전환의 빈도를 강화하는데 사용되어 왔다. 표 2에서 보는 바와 같이, DTT 또는 LiAc 전처리의 제거는 각각 93.3% 및 85.7%의 효율 감소를 초래했다.

마찬가지로, Smith 등(참조문헌: T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141)은 펩티드-MHC(pepMHC) 리간드로서 항원의 결합에 있어서 TCR에 관한 연구를 공개한다. 이 계열의 분자들을 현재 항체에 사용하는 방식과 유사하게 사용하기 위해 TCR 친화도의 조작에 대한 관심이 있어 왔었다. TCR을 조작하기 위해 그리고 그 결합 특징을 보다 신속히 분석하기 위해서, 효모 발현계를 플랫폼으로 사용한다. 항체의 scFv 단편(fragment)과 유사한 TCR의 단일 사슬 형태에 대한 발현 및 조작은 TCR이 다양한 가능한 pepMHC 리간드들과의 친화도 성숙을 허용한다. 추가적으로, 효모 발현 플랫폼으로 다양한 결합 친화도를 통해 TCR 변이체를 신속히 생성할 수 있으며 또한 용해성 형태의 TCR의 정제가 필요 없이 특이성 및 친화도를 분석할 수 있게 한다. 이 논문은 효모 발현을 사용하는 단일 사슬 TCR의 조작 및 분석의 방법을 기술한다.

효모 라이브러리는 파지 라이브러리에 의해 성취된 규모 또는 효율을 달성하지 못하였는데, 전형적인 최대 파지 라이브러리 규모는 10¹⁰ ~ 10¹¹인 반면 전형적인 효모 라이브러리 규모는 10⁷이다. 전기천공 프로토콜(Chao, Nature Protocols 1(2):755-768 (2006) 참고)에서의 최근 발전으로 인해 단일 형질전환에서 최대 5 x 10⁷ 효모 라이브러리 규모의 성취를 가능하게 했지만, 현재까지 성취된 효모 라이브러리 규모는 파지 발현 라이브러리에 의해 성취가 가능한 10¹⁰ ~ 10¹¹ 규모에 비해 여전히 상당히 적다.

상기의 방법과 공개 내용은 점차적으로 더 높은 형질전환 효율이 성취되었으나, 10⁶ ~ 10⁷ 규모 범위의 작은 다중 라이브러리로부터 더 크며 조합된 10⁸ ~ 10⁹ 규모 범위의 라이브러리까지 축적하는 것이 여전히 힘든 작업이며 상당한 시간과 반복적인 노력이 요구된다.

자성 비드와 형광 활성 세포 분류를 사용하는 효모 발현 라이브러리 선택은 항원을 표적으로 하는 특이적 결합체를 강화시키며 특히 형광 활성 세포 분류(FACS)와의 호환성에 의한 효율적이며 민감한 방법을 제공한다. 하지만 이러한 선택 능력의 이점은 전형적인 효모 발현 라이브러리의 제한된 규모에 의해 방해를 받는데 이는 효모 세포의 낮은 형질전환 효율에 기인한다.

그러므로 효모를 사용하여 단백질 라이브러리(예: TCR 라이브러리)를 생산하는 효율적인 방법에 대한 필요가 존재한다.

본 발명의 한 양태에서, a) 효모 세포를 약 1.0 ~ 2의 OD₆₀₀으로 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 찬 물로 세척하는 단계; c) 상기 세포를 소르비톨 및 CaCl₂를 포함하는 찬 용액으로 세척하는 단계; d) 상기 세포를 초산 리튬 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 포함하는 용액에서 배양하는 단계; e) 상기 세포를 소르비톨 및 CaCl₂를 함유하는 찬 용액으로 세척하는 단계; f) 상기 세포를 소르비톨을 포함하는 용액에 재현탁하는 단계; 및 g) 선택적으로 상기 세포를 적절하게 보관하는 단계를 포함하는 전기감응성 효모 세포의 준비 방법이 제공된다.

본 발명은 이로써 예를 들어 향상된 효모 세포 라이브러리의 생산을 위한 효모 세포의 고도로 효율적인 형질전환 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이전에 탐색되지 않는 훨씬 더 큰 TCR 다양성 공간에 접속하는 실용적인 도구로서 효모 발현 기술을 적용하는 데 있어서 상당한 병목을 제거한다.

더욱이 본 발명의 다른 양태는 a) 본 발명에 따른 방법에 따라 전기감응성 효모 세포를 제공하는 단계; b) 상기 세포를 소르비톨을 포함하는 찬 용액으로 세척하는 단계; c) 상기 세포를 형질주입하려는 DNA와 혼합하여 전-전기천공 혼합물(pre-electroporation-mix)을 형성하는 단계; d) 상기 전-전기천공 혼합물을 적절한 전기천공 큐벳으로 전달하는 단계; 및 e) 상기 세포를 약 2.5 kV/cm ~ 약 12.5 kV/cm에서 약 2 ~ 약 5 밀리초(ms) 동안 전기천공하는 단계를 포함하는 전기감응성 효모 세포를 형질주입하는 방법에 관한 것이다.

바람직하기로는 상기 DNA가 직선형 또는 원형인 본 발명에 따른 방법이다. 더욱 바람직하기로는 상기 DNA가 관심 대상 단백질들의 라이브러리를 예를 들어 효모 표면 발현 라이브러리의 형태로 인코딩하는 DNA 단편의 라이브러리를 포함하는 본 발명에 따른 방법이다. 가장 바람직하기로는 상기 발현 라이브러리가 T 세포 수용체(TCR) 라이브러리인 본 발명에 따른 방법이다.

트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 환원제로 사용함으로써, 본 발명에 따른 방법의 형질전환 효율이 DTT에 비해 더 높으며, 예를 들어 1 x 10⁸ 효모 형질전환주/μg 벡터 DNA보다 더 높으며, 바람직하게는 2 x 10⁸ 효모 형질전환주/μg 벡터 DNA보다 더 높은 것이 놀랍게 발견되었다.

더욱이 본 발명의 다른 양태는 a) 본 발명에 따른 방법에 따라 형질주입된 효모 세포를 제공하는 단계; b) 상기 형질주입된 세포를 성장 배지에서 소르비톨 용액의 1:1 혼합물로 희석하는 단계; c) 상기 세포를 적절한 성장 배지에 재현탁하는 단계; d) 선택적으로, 다양성 계산을 위한 희석을 수행하고 카나마이신을 함유하는 SD-CAA 플레이트 상에서 상기 희석물을 평판 배양하는 단계; 및 e) 상기 라이브러리를 적절한 성장 배지로 전달하고 상기 라이브러리를 전기천공에 따라 확장하는 단계; 및 f) 선택적으로, 상기 확장된 라이브러리를 적절하게 보관하는 단계를 포함하는, 예를 들어 효모 표면 발현 라이브러리의 형태로 관심 대상 단백질들의 향상된 효모 라이브러리를 생산하는 방법에 관한 것이다.

바람직하기로는 상기 발현 라이브러리가 T 세포 수용체 라이브러리인 본 발명에 따른 방법이다. 바람직하기로는 상기 라이브러리의 다양성이 약 10¹²보다 더 높은 본 발명에 따른 방법이다.

본 발명의 맥락에서, "발현 벡터"란 용어는 전사 개시의 부위인 자율 복제 부위(ARS)와 숙주 생물에서 발현될 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 구조적 유전자를 포함하는 DNA 구조체를 의미한다. 복제의 부위 또는 복제의 원천은 클로닝과 발현 벡터의 복제를 제어하는 일체의 DNA 서열이다. 발현 벡터는 대개 숙주 효모에서 단백질의 발현을 제어하는 하나 이상의 증진자 및/또는 촉진자, 억제자 및/또는 침묵자 그리고 종료자와 같은 적절한 제어 부위도 포함한다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 본 문서에서 기술된 필수 유전자를 포함하는 선택 표지자도 포함할 수 있다. 발현 벡터는 선택적으로 또한 당업자에게 널리 사용이 가능하며 잘 알려진 다른 선택가능한 표지자도 포함한다. 발현 벡터는 벡터의 한 유형이다. 벡터는 하나 이상의 효모 주로부터 유래하는 하나 이상의 ARS 서열(요소)을 선택적으로 포함할 수 있다.

"동작가능하게 연결됨"이란 용어는 DNA 세그먼트들이 의도하는 목적을 위해 기능하도록 배열되는 것을 의미하며, 예를 들면 전사가 촉진자에서 개시되어 코딩 세그먼트를 통해 종료자까지 진행한다.

"형질전환" 또는 "형질주입"이란 용어는 유전형을 변경시키는 수령자 효모 숙주 세포 안으로 DNA 또는 다른 핵산을 도입하는 것을 의미한다.

"형질전환주" 또는 "형질전환된 세포"라는 용어는 형질전환을 거친 수령자 효모 숙주 세포 그리고 그 자손을 의미한다.

"약"은 달리 표시하지 않는 한 주어진 값의 +/- 10%를 의미한다.

본 발명의 전기천공 방법에서 유용한 벡터에는 pYD 벡터와 효모 세포에 의해 전파가 가능한 다른 벡터와 그 유도 구조체 또는 일반적으로 핵산이 포함된다. 본 발명의 발현 벡터는 그 벡터가 숙주 효모 세포를 형질전환, 형질주입 또는 형질도입할 수 있는 한 모든 유형의 벡터에 기반할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 효모 플라즈미드, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래한 것이다. 효모 세포의 형질전환 이후, 라이브러리 서열을 인코딩하는 외인성 DNA는 그 세포에 의해 흡수된 다음 형질전환된 세포에 의해 발현된다.

보다 바람직하게, 발현 벡터는 대장균 또는 효모에서 전파가 가능한 효모-박테리아 셔틀 벡터일 수 있다(Struhl, et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.). pBR322와 같은 대장균 플라즈미드 DNA 서열의 포함은 대장균에서 벡터 DNA의 정량적 제조를 원활하게 하므로 효모의 효율적인 형질전환을 원활하게 한다.

셔틀의 역할을 할 수 있는 효모 플라즈미드 벡터의 유형은 복제 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다. 복제 벡터는 DNA 복제의 기능적 기원의 존재에 따른 이점에 의해 효모의 염색체 DNA와 관계 없이 자신의 유지를 매개할 수 있는 효모 벡터이다. 통합 벡터는 복제 그리고 따라서 숙주 세포에서 재조합 DNA의 지속적 유지를 원활하게 하기 위해 염색체 DNA와의 재조합에 의존한다. 복제 벡터는 DNA 복제의 기원이 내인성 2 미크론 플라즈미드 효모에서 유래하는 2 미크론 기반의 플라즈미드 벡터일 수 있다. 대안적으로, 복제 벡터는 자율적 복제(ARS) 벡터일 수 있으며, 그 복제의 "뚜렷한" 기원은 효모의 염색체 DNA로부터 유래한다. 선택적으로, 복제 벡터는 상기한 DNA 복제의 기원들 가운데 하나에 추가하여 중심체를 보유하는 것으로 알려진 효모 염색체 DNA 서열을 운반하는 중심체(CEN) 플라즈미드일 수 있다.

이 벡터들은 밀폐된 원 형태 또는 직선 형태로서 효모 세포 안으로 형질전환될 수 있다. 통합 벡터에 의한 효모의 형질전환은 유전적 안정성이 있음에도 불구하고, 벡터가 밀폐된 원 형태인 경우 효율적이지 않을 수 있다(예: DNA μg당 단 1 ~ 10개 정도의 형질전환주 생산). 효모 염색체 DNA와 상동성인 DNA 서열에 위치한 자유 말단(free ends)을 가진 직선화 벡터가 더 높은 효율로(100 ~ 1000배) 효모를 형질전환하며, 형질전환하는 DNA는 일반적으로 절단의 부위와 상동성인 서열 안으로 통합되는 것으로 나타난다. 그리하여 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 벡터 DNA를 절단함으로써, 형질전환의 효율을 증가시키고 염색체 통합의 부위를 표적으로 하는 것이 가능하다. 통합 형질전환은 양조 효모의 유전적 변형에 적용될 수 있으며, 단 형질전환의 효율이 충분히 높으며 통합을 위한 표적 DNA 표적이 숙주 세포의 대사에 필수적인 유전자들을 방해하지 않는 영역 내에 있어야 한다.

본 발명의 전기천공 방법에 의해 형질전환이 가능한 효모 균주에는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 그리고 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces Pombe)와 같은 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속의 효모 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 효모 세포는 이배체 효모 세포이다. 대안적으로, 효모 세포는 효모 단배체 세포의 "a" 및 "α" 균주와 같은 단배체 세포이다.

본 발명의 맥락에서 "T 세포 수용체 라이브러리"는 스크리닝 대상의 인간 및/또는 돌연변이인 인간 TCR의 적절한 부분들, 바람직하게는 TCR의 단일 사슬 형태(예: V_β-링커-V_α 단일 사슬(scTCR); 또는 V_α-링커-V_β 단일 사슬, 선택적으로 예를 들어 2A-펩티드와 같은 자가 분할 펩티드에 융합된 것)를 포함할 수 있다. 야생형 아미노산 서열에 대한 최소 변형을 가진 TCR 발현을 최적화하는 출판된 방법 또한 사용이 가능하다(예: Szymczak, A. L. et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol 22, 589-594 (2004); Yang, S. et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther 15, 1411-1423 (2008); Kuball, J. et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood 109, 2331-2338 (2007); Cohen, C. J. et al. Enhanced Antitumor Activity of T Cells Engineered to Express T-Cell Receptors with a Second Disulfide Bond. Cancer Res 67, 3898-3903 (2007); Scholten, K. B. J. et al. Codon modification of T cell receptors allows enhanced functional expression in transgenic human T cells. Clin. Immunol. 119, 135-145 (2006)).

벡터 DNA 대 삽입 DNA의 비율은 약 1:0.5 ~ 약 1:10의 범위이며, 예를 들어 1:0.5, 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10이다. 한 실시양태에서, 약 1μg의 벡터 DNA 및 약 1μg의 삽입 DNA가 반응에 사용된다. 다른 실시양태에서, 약 1μg의 벡터 DNA 및 약 2μg의 삽입 DNA가 침전된다. 다른 실시양태에서, 약 1μg의 벡터 DNA 및 약 3μg의 삽입 DNA가 침전된다. 또 다른 실시양태에서, 약 1μg의 벡터 DNA 및 약 4μg의 삽입 DNA가 침전된다. 또 다른 실시양태에서, 약 1μg의 벡터 DNA 및 약 5μg의 삽입 DNA가 침전된다.

한 실시양태에서, 세포 현탁액이 약 50 ~ 약 400 μL의 효모 세포, 예를 들어 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 μL의 효모 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 효모 세포 현탁액이 약 1 ~ 약 10 x 10⁹ 효모 세포/mL에 해당하며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 x 10⁹ 효모 세포/mL이다.

한 실시양태에서, 효모 세포의 전기천공에 사용되는 전계 강도가 약 0.5 kV/cm ~ 약 12.5 kV/cm, 예를 들어 0.5, 1.0, 약 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5 kV/cm이었다.

한 실시양태에서, 효모 세포가 약 10 ~ 약 50 μF, 예를 들어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 μF의 정전용량으로 전기천공된다.

한 실시양태에서, 효모 세포가 약 0.1 ~ 약 10 M 소르비톨 그리고 0.1 ~ 10 mM CaCl₂ 또는 MgCl₂에 현탁되며, 예를 들어 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10.0 M 소르비톨 또는 예를 들어 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 또는 10.0 mM CaCl₂ 또는 MgCl₂에 현탁된다.

한 실시양태에서, 효모 세포가 약 0.01 ~ 약 1.0 M LiAc, 예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 약 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 M LiAc, 그리고 1 ~ 100 mM TCEP, 예를 들어 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 약 70, 80, 90 또는 100 mM TCEP에서 배양된다.

본 발명은 효모 그리고 하나 이상의 핵산 구조체를 함께 함유하는 세포 현탁액의 전기천공을 포함하는 효모 세포의 형질전환 방법을 제공한다. 효모 세포의 형질전환은 효모 세포의 단일 클론부터 군집(즉, 효모 라이브러리 또는 라이브러리들)까지 무엇이나 초래할 수 있으며, 이것은 다음의 스크리닝에 사용이 가능하다: (a) 효모 표면 단백질로의 테터링, 또는 효모 세포 표면의 단백질 또는 다른 성분과의 특정한 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 통한 연관의 수단에 의한 효모 세포의 표면에 발현되는 펩티드(들) 또는 단백질(들); (b) 세포 내에 발현되는 펩티드(들) 또는 단백질(들); 또는 (c) 배양 배지와 같은 세포외 공간에 분비되거나 고형 표면에 침착되는 펩티드(들) 또는 단백질(들). 이러한 효모 라이브러리는 여러 용도에 편리하게 응용될 수 있으며, 여기에는 펩티드(들) 또는 단백질(들)과 다른 단백질, 펩티드, DNA, RNA 또는 효모 세포 안으로 도입이 가능하거나 외인성으로 추가될 수 있는 다른 화학적 물질 사이의 상호작용에 대한 선별 또는 특성화가 포함된다. 구체적인 예는 효모 발현, 효모 이잡종, 효모 삼잡종 등에서 찾을 수 있다.

본 발명은 효모 세포의 형질전환에 충분한 하나 이상의 저항, 전계 강도 및 펄스 기간을 사용하여, 하나 이상의 조절 서열 및 하나 이상의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 포함하는 하나 이상의 핵산 구조체와 함께 효모를 함유하는 세포 현탁액의 전기천공을 포함하는 효모 세포의 형질전환 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 전계 강도가 약 2.5 kV/cm ~ 약 12.5 kV/cm이다. 특정 실시양태들에서, 전계 강도가 0.5 kV/cm, 1.0 kV/cm, 1.5 kV/cm, 2.0 kV/cm 또는 2.5 kV/cm이다. 이러한 값들은 전기천공 큐벳이 0.2 cm의 간격을 갖는 것을 고려한 것이다. 더 높은 전계 강도가 가능하지만, 그 실용성은 더 강한 펄스를 전달할 수 있는 장치의 개발에 크게 의존한다.

한 실시양태에서, 펄스 기간이 약 3 ms ~ 약 10 ms이다. 한 특정한 실시양태에서, 펄스 기간이 약 4 ms이다.

본 발명의 전기천공에 의한 세포의 처리는 한 쌍의 전극 사이에 있는 효모 세포 배양액에 대해 전기장을 가하여 실행된다. 세포의 전기천공이 세포에 대한 손상 없이 또는 최소한의 손상으로 발생하도록 전기장 강도를 적절히 정확하게 조절해야 한다. 그 다음에 전극 사이의 거리를 측정할 수 있으며 E = V/d 공식에 따라 적절한 전압을 전극에 가할 수 있다(E는 V/cm 단위의 전기장 강도이고; V는 볼트(V) 단위의 전압이고; d는 cm 단위의 거리이다).

본 문서에서 기술된 절차의 실시를 위한 펄스 생성기는 현재까지 수 년 동안 시중에서 제공되어 왔다. 한 가지 적절한 신호 생성기가 Gene Pulser II(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)이다. 전형적인 설치는 전기용량 증폭기 플러스 및 펄스 컨트롤러 플러스 모듈에 연결된 Gene Pulser II로 이루어진다.

본 발명에서 효모 세포 안으로 DNA를 도입하는 것을 원활히 하기 위해 전기천공을 사용한다. 전기천공이란 펄스화 전기장을 사용하여 일시적으로 세포막을 투과화하여 DNA와 같은 거대분자가 세포 안으로 들어갈 수 있도록 하는 과정이다. 하지만 DNA가 세포 안으로 전달되는 실제 기전은 잘 이해되어 있지 않다. 예를 들어 칸디다 파마타(Candida famata)의 형질전환의 경우, 전계 강도가 약 10 ~ 약 13 kV/cm이고 저항값이 약 R5(129 옴)이고 시간 상수가 약 4.5 ms인 실험적으로 감쇠되는 펄스화 전기장에 세포를 노출시킬 때 전기천공이 놀라울 정도로 효율적이다. 전형적으로, 선택된 전기천공 장비에 따라 저항 및 정전용량은 존재하거나 사용자가 선택할 수 있다. 어떠한 경우에서나 장비를 제조사의 지시에 따라 구성하여 적절한 전계 강도 및 감쇠 매개변수를 제공한다.

본 발명은 또한 어떠한 하나 이상의 바람직한 내인성(즉, 효모 세포 내에서 천연으로 존재하는) 또는 이종 유전자의 높은 발현 수준을 허용하는 효모 형질전환의 매우 효율적인 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어 TCR, scTCR, 키메라 또는 그 단편을 발현하는 라이브러리의 제조 방법에 관한 것이다.

한 시나리오에서, 관심 대상의 유전자를 운반하는 발현 벡터를 전기천공에 의해 효모 숙주 세포로 형질전환시켜 세포 내 단백질(예: 핵 또는 세포질 단백질), 막 단백질(예: 막관통 단백질 또는 막부착 단백질) 또는 분비된 단백질을 발현하는 다수의 형질전환된 세포들로 구성된 단일 클론 또는 라이브러리를 생성할 수 있다. 형질전환된 세포 또는 라이브러리를 사용하여 단백질 정제, 단백질 기능 연구, 단백질-단백질 상호작용 확인, 또는 신규 단백질 결합제 또는 상호작용 파트너의 식별이 가능하다. 한가지 중요한 내용은 TCR 및 TCR 단편을 표시하거나 발현하는 매우 큰 효모 라이브러리를 생성하는 능력이다. 이 라이브러리를 표적 항원에 의한 선택을 거침으로써 선택 항원에 결합하는 TCR을 확인할 수 있다.

형질전환된 효모가 인공적으로 구성된 플라즈미드를 상실하는 경향이 있으므로, 이 플라즈미드에 양성 선택 압력을 가하기 위해 배양 배지를 사용하는 것이 유리하다. 균주가 필수 대사물을 위한 영양 요구 돌연변이주이며 사용된 벡터 플라즈미드가 균주 원영양체를 회복할 수 있는 표지자 유전자(예: LEU2 유전자)를 포함하는 경우, 이러한 선택 압력은 배양 배지로부터 대사물을 누락시킴으로써 가해질 수 있다. 동일한 결과를 얻을 수 있는 다른 수단들이 존재하며, 이를 사용하여 또한 본 발명을 실행할 수 있다.

관심 대상인 구조적 유전자의 특성에 따라, 생성물 또는 발현 생성물이 효모 숙주 세포의 세포질에 남아 있거나 분비될 수 있다. 세포에 남아 있는 단백질뿐만 아니라 분비되는 것 또한 용해성임이 밝혀졌다. 생성물 또는 발현 생성물이 효모 숙주 세포에 남아 있는 경우, 형질전환주가 고밀도에 도달할 때까지 원하는 생성물의 발현 또는 생산이 거의 없거나 전혀 없도록 유도가능한 전사 개시 영역을 갖는 것이 일반적으로 바람직할 수 있다. 생성물 또는 발현 생성물의 발현을 위한 충분한 시간이 주어진 이후, 그 세포를 종래의 수단(예: 원심분리, 용해 및 분리된 관심 대상의 생성물)에 의해 분리할 수 있다. 생성물의 특성 및 용도에 따라, 크로마토그래피, 전기영동, 용매 추출, 결정화, 투석, 한외여과 등과 같은 다양한 정제 방법을 용해액에 대해 사용할 수 있다. 크로마토그래피의 방법에는 기체 크로마토그래피, HPLC, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 당업자에게 알려진 다른 방법의 크로마토그래피가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 순도의 정도는 약 50%에서 90% 이상, 바람직하게는 약 100%까지 다양할 수 있다.

대안적으로, 관심 대상의 발현 생성물 또는 생성물이 배양 배지 안으로 분비되어 연속적으로 생산될 수 있으며, 여기서 배지를 부분적으로 철회하고 원하는 생성물을, 예컨대 컬럼 또는 친화 크로마토그래피, 한외여과, 침전 등에 의해, 추출하고 사용한 배지는 버리거나 필수 성분을 회수하여 순환시킨다. 한외여과에서 얻어진 생성물을 함유하는 투과액은 추가로 증발시켜 더욱 농축시킨 다음 알코올 및/또는 pH 조절을 사용하여 결정화 또는 침전시킬 수 있다. 당업자는 다수의 공정 선택사양을 알고 있다. 생성물을 분비해야 하는 경우, 비구성적 영역을 사용할 수도 있지만 보통은 구성적 전사 개시 영역이 사용될 것이다.

다른 바람직한 실시양태들이 본 문서에서 도면을 참조하여 기술된 예로부터 유도될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 목적상 본 문서에 인용되는 모든 참조 문헌은 그 전문이 참조 문헌으로 포함된다.

도 1은 동일한 조건하에서 DTT와 비교할 때 TCEP의 향상된 형질주입 효율의 비교를 보여준다.

실시예

본 발명의 실시에 있어서 달리 표시하지 않는 한 당업계에서 잘 알려진 세포 전기천공 및 효모 세포 생물학의 전통적인 기법이 사용된다.

I. 배지

1. YPD 배지

효모 추출물 10 g,

박토-펩톤 20 g,

덱스트로스 20 g,

H₂O를 사용하여 부피를 1 L까지 만든다(무균 포도당을 가압멸균된 용액에 첨가한다).

2. SD-CAA(pH 4.5)

구연산나트륨 이수화물 14.8 g(50 mM 최종),

구연산 일수화물 4.2 g(20 mM 최종),

800 mL의 H₂O에 용해, 가압멸균한다.

카사미노산 5.0 g,

YNB 배지(Yeast nitrogen base, 아미노산 없음) 6.7 g,

포도당 20 g,

H₂O를 사용하여 부피를 1 L까지 만든 다음 무균 여과한다.

3. SD-CAA 플레이트

소르비톨 182.2 g,

한천 15 g,

구연산나트륨 14.8 g,

구연산 일수화물 4.2 g,

800 mL의 H₂O에 용해, 가압멸균하고 약 55 ℃로 식힌다.

카사미노산 5.0 g,

YNB 배지(Yeast nitrogen base, 아미노산 없음) 6.7 g,

포도당 20 g,

황산 카나마이신 35 mg,

200 mL의 H₂O에 용해 및 무균 여과하고, 식힌 가압멸균된 용액에 첨가한다.

II. 전기감응성 효모 세포의 조제

-80 ℃로부터 새로 녹인 효모 원액의 20 μL를 YPD 한천 플레이트 상에서 선상도말한 다음 30 ℃에서 2일 동안 배양했다. YPD 한천 플레이트로부터 단일 집락(집락 전체를 취함)을 취하여 15 mL YPD 배지로 옮긴 다음 30 ℃에서 밤새 진탕을 수행했다. 다음날 아침, 10 mL의 배양액을 100 mL의 신선한 YPD 배지로 옮긴 다음 30 ℃에서 7시간 동안 진탕을 계속했다. OD₆₀₀을 결정하고 1 L의 찬 YPD 배지를 0.2의 OD₆₀₀까지 접종했다. 진탕용 플라스크를 미리 식힌(4 ℃) 진탕기에 넣었다. 작업일 시작 전에 가열(30 ℃)이 시작되고 5시간 동안 진탕하도록(250 rpm) 진탕기를 프로그램했다. 배양은 OD₆₀₀이 1.5에 도달할 때까지(보통 진탕 시작 후 6시간) 수행했다.

달리 기술되지 않는 한, 다음 단계들을 얼음 위에서 그리고 식힌 용액, 시험관, 큐벳 및 원심분리기를 사용하여 수행해야 한다.

세포를 4 ℃에서 3분 동안 2,000 g로 펠릿화하고(10 Falcon 시험관(50 mL)에서 2단계 과정), 25 mL의 찬 H₂O로 2회 세척한 다음 3분 동안 2,000 g로 펠릿화했다. 세포를 25 mL의 찬 소르비톨, 1 M/CaCl₂, 1 mM로 세척한 다음 3분 동안 2,000 g로 펠릿화했다. 세포를 25 mL 초산 리튬, 100 mM/TCEP, 10 mM에서 재현탁했다. 통기가 허용되도록 필터 뚜껑이 있는 50 mL Falcon 시험관을 사용했다. 세포를 160 rpm에서 30분 동안 진탕하면서 30 ℃에서 배양한 다음, 얼음 위에 놓고 4 ℃에서 3분 동안 2,000 g로 펠릿화했다. 세포를 25 mL의 찬 1 M 소르비톨/1 mM CaCl₂로 세척한 다음 4 ℃에서 3분 동안 2,000 g로 펠릿화하고, 25 mL의 찬 1 M 소르비톨로 세척한 다음 4 ℃에서 3분 동안 2,000 g로 펠릿화했다. 찬 1 M 소르비톨이 들어 있는 코니칼 시험관에서 세포를 현탁한 후 전기천공 반응당 400 μL의 최종 부피로 만들었다. 전기감응성 세포는 -80 ℃에서 직접 보관할 수 있다. 전기천공을 위한 샘플을 사용하기 전에, 누출된 염을 원심분리(2,000 g, 4 ℃, 5분)로 제거한 다음 찬 소르비톨(1 M)로 2회 세척해야 한다.

III. 전기천공

400 μL의 세포를 H₂O에 포함된 5 ~ 10 μL DNA(벡터)와 혼합하여 3분 동안 얼음 위에 놓은 다음 미리 식힌 0.2 cm 전기천공 큐벳으로 옮긴다. BioRad MicroPulser 전기천공 시스템을 사용하여, 세포를 2.5 kV에서 전기천공했다. 전형적인 시간 상수는 약 4 ms였으며, 바람직하게는 4 ms였다. 전기천공된 세포를 30 ℃의 1 M 소르비톨: YPD 배지의 1:1 혼합물 10 mL로 옮긴 다음 진탕 없이 1시간을 두었다. 세포를 실온에서 3분 동안 2,000 g로 수확한 다음 실온의 10 mL SD-CAA에 재현탁했다. 다양성 계산을 위해 희석을 수행했다(1:10⁵ ~ 1:10⁷). 카나마이신을 함유하는 SD-CAA 플레이트 상에서 희석한 것을 30 ℃에서 1일 동안 배양한 다음 실온에서 3일 동안 배양했다. 라이브러리를 100 mL SD-CAA로 전달하고(바람직하게는 전기천공에 따라), 30 ℃에서 24시간 동안 160 rpm으로 진탕을 지속했다. 유도를 위해 확장된 라이브러리를 직접 사용하거나 4 ℃에서 2주 동안 보관할 수 있다. 장기 보관은 -80 ℃에서 30% 글리콜과 함께 동결시켜 수행할 수 있다.

가장 최적의 전기천공 조건을 사용함으로써, 약 2 x 10⁸개의 효모 형질전환주/μg 벡터 DNA의 효모 형질전환 효율을 일상적으로 성취하는 것이 가능하다(도 1 참조). 이 형질전환 효율이 최소의 세포 용적(100 μL)에서 성취되므로, 자동화 및 다중웰 전기천공 장치의 사용이 고도로 용이하다.

Claims (9)

1. 전기감응성 효모 세포의 준비 방법으로서,
   a) 효모 세포를 1.0 내지 2의 OD₆₀₀으로 성장시키는 단계;
   b) 상기 세포를 찬 물로 세척하는 단계;
   c) 상기 세포를 소르비톨 및 CaCl₂를 포함하는 찬 용액으로 세척하는 단계;
   d) 상기 세포를 초산 리튬 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 포함하는 용액에서 배양하는 단계;
   e) 상기 세포를 소르비톨 및 CaCl₂를 포함하는 찬 용액으로 세척하는 단계;
   f) 상기 세포를 소르비톨을 포함하는 용액에 재현탁하는 단계; 및
   g) 선택적으로, 상기 세포를 적절하게 보관하는 단계
   를 포함하는 방법.
2. 전기감응성 효모 세포의 형질주입 방법으로서,
   a) 제1항에 따른 방법에 따라 전기감응성 효모 세포를 제공하는 단계;
   b) 상기 세포를 소르비톨을 포함하는 찬 용액으로 세척하는 단계;
   c) 상기 세포를 형질주입하려는 DNA와 혼합하여 전-전기천공 혼합물을 형성하는 단계;
   d) 상기 전-전기천공 혼합물을 적절한 전기천공 큐벳으로 전달하는 단계; 및
   e) 상기 세포를 2.5 내지 12.5 kV/cm에서 2 내지 5 ms로 전기천공하는 단계
   를 포함하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 DNA가 직선형 또는 원형인 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 DNA가, 예를 들어 효모 표면 발현 라이브러리의 형태로, 관심 대상의 단백질의 라이브러리를 인코딩하는 DNA 단편의 라이브러리를 포함하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 발현 라이브러리가 T 세포 수용체(TCR) 라이브러리인 방법.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환 효율이 1 x 10⁸개 효모 형질전환주/μg 벡터 DNA보다 더 높으며, 바람직하게는 2 x 10⁸개 효모 형질전환주/μg 벡터 DNA보다 더 높은 방법.
7. 관심 대상의 단백질의 향상된 효모 라이브러리, 예를 들어 효모 표면 발현 라이브러리 형태의 생산 방법으로서,
   a) 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 형질주입된 효모 세포를 제공하는 단계;
   b) 상기 형질주입된 세포를 성장 배지에서 소르비톨 용액의 1:1 혼합물로 희석하는 단계;
   c) 상기 세포를 적절한 성장 배지에 재현탁하는 단계;
   d) 선택적으로, 다양성 계산을 위한 희석을 수행하고 카나마이신을 함유하는 SD-CAA 플레이트 상에서 상기 희석물을 평판 배양하는 단계; 및
   e) 상기 라이브러리를 적절한 성장 배지로 전달하고 상기 라이브러리를 전기천공에 따라 확장하는 단계; 및
   f) 선택적으로, 상기 확장된 라이브러리를 적절하게 보관하는 단계
   를 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 발현 라이브러리가 T 세포 수용체 라이브러리인 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 라이브러리의 다양성이 10¹²보다 더 높은 방법.

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