ES2952039T3

ES2952039T3 - Método para preparar células de levadura electrocompetentes y método para usar dichas células

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Publication number: ES2952039T3
Application number: ES17805126T
Authority: ES
Inventors: Sebastian Bunk; Dominik Maurer; Felix Unverdorben
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2023-10-26
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: TWI720268B; US20180135039A1; US20200263162A1; EP3541947A1; AU2017360666A1; JP2019531751A; CN109983130B; AU2017360666C1; MX2019005622A; EP3541947B1; PH12019501001A1; EA201990758A1; AU2017360666B2; JP7133226B2; IL266538A; US10683495B2; AR110087A1; US20210355478A1; BR112019008385A2; US11104894B2

Abstract

La presente invención se refiere a la transformación mejorada de células de levadura y a bibliotecas de células de levadura transformadas de esta manera. Más específicamente, la presente invención se refiere a la transformación de levadura mediante electroporación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar células de levadura electrocompetentes y método para usar dichas células

La presente invención se refiere a la transformación de levadura mejorada de células de levadura y bibliotecas de células de levadura transformadas de esta manera. Con mayor especificidad, la presente invención se refiere a la transformación de levadura por electroporación.

Antecedentes de la invención

Por años, los pilares fundamentales del tratamiento del cáncer han sido la cirugía, la quimioterapia, y la radioterapia. Durante la última década, las terapias dirigidas como los fármacos imatinib (Gleevec®) y trastuzumab (Herceptin®) que se dirigen a las células cancerosas al centrarse en cambios moleculares específicos que se observan principalmente en esas células- también han surgido como tratamientos estándar para un número de cánceres.

Ahora, crece el entusiasmo por la inmunoterapia: terapias que aprovechan el poder del sistema inmunitario de un paciente para combatir su enfermedad. Un enfoque de la inmunoterapia implica diseñar por ingeniería genética las propias células inmunitarias de los pacientes para que reconozcan y ataquen sus tumores. Este enfoque, llamado transferencia celular adoptiva (ACT), ha generado algunas respuestas notables en pacientes con cáncer avanzado.

Mientras se espera típicamente que los receptores de linfocitos T naturales (TCR) tengan una afinidad lo suficientemente alta para alcanzar la eficacia terapéutica, cuando se desarrollan TCR terapéuticos o derivados de los mismos, tales como, por ejemplo, TCR solubles (TCRs), usualmente se desea/requiere una llamada maduración de la afinidad para provocar una respuesta inmunitaria productiva in vivo.

Para la maduración, se emplea comúnmente un método que usa tecnología de exposición de superficie de levadura. Sin embargo, con el fin de generar bibliotecas que tengan una diversidad suficiente, es necesario un método altamente eficiente para la transformación de la levadura.

Se ha deseado por mucho tiempo identificar los TCR que consisten esencialmente en secuencias de cadena alfa y beta naturales que se unen específicamente a antígenos particulares, de manera que, por ejemplo, los TCR, o sus análogos solubles, se puedan desarrollar para proporcionar la base para posibles tratamientos. Los antígenos reconocidos por los TCR identificados se pueden asociar con una enfermedad, tal como cáncer, infecciones virales, enfermedades autoinmunitarias, infecciones parasitarias e infecciones bacterianas. Por lo tanto, tales terapias se pueden usar para el tratamiento de tales enfermedades.

Adicionalmente, una vez que se han identificado los TCR naturales o nativos y se han determinado sus secuencias, se pueden introducir mutaciones que resulten en un aumento en la afinidad o la vida media, según sea necesario, tal como se describe en el documento WO2012/013913. Tradicionalmente, los intentos de identificar TCR que se unen específicamente a antígenos asociados a enfermedades, tales como antígenos virales, autoinmunitarios o bacterianos del cáncer, se han limitado al uso de muestras de sangre tomadas de donantes voluntarios. Tales muestras se usan para aislar linfocitos T y sus TCR correspondientes que se unen a antígenos asociados a enfermedades. Este enfoque generalmente requiere al menos 20 donantes. El proceso es largo y laborioso, y no existe garantía de identificar los receptores de linfocitos T que se unen al antígeno. Cuando se identifican receptores de linfocitos T funcionales, a menudo tienen una afinidad débil por el antígeno, una baja especificidad, y/o no se pliegan correctamente in vitro. La diversidad de linfocitos T que se pueden examinar se limita a la diversidad de linfocitos T dentro de los donantes. Algunos antígenos asociados a enfermedades, que incluye la mayoría de los antígenos del cáncer, son autoantígenos; dado que la selección tímica sirve para eliminar los TCR que reconocen antígenos propios, los TCR específicos para antígenos asociados a enfermedades pueden no estar presentes en el repertorio natural de los donantes, o bien pueden tener una afinidad débil por el antígeno.

Los intentos de diseñar una biblioteca para el aislamiento de nuevos TCR con especificidad de unión a antígeno han estado en curso por varios años. Las bibliotecas de TCR son mucho más difíciles de crear que las bibliotecas de anticuerpos comparables, dado que las cadenas de TCR son menos estables y, a menudo, no se exponen correctamente. Las complejidades implicadas en la construcción de una biblioteca de TCR son enormes. Es preferible conservar la variación en la longitud de CDR3 (como se encuentra en los repertorios naturales). Una porción sustancial de cualquier biblioteca generalmente se pierde ante a los codones de parada, los cambios de marco, los problemas de plegamiento y las combinaciones de cadenas de TCR que simplemente nunca podrían unirse a un complejo HLA. Teniendo en cuenta el gran número de genes alfa variable y beta variable, así como también los genes J y D, la posibilidad de producir e identificar una cadena alfa plegable funcional y una cadena beta plegable funcional que juntas forman un TCR que se une a un péptido antigénico con la especificidad requerida es extremadamente baja.

La disponibilidad de medios para la producción de bibliotecas de ácidos nucleicos y productos recombinantes producidos de esta manera, tales como proteínas farmacéuticas, en sistemas eucariotas tales como levaduras, proporciona ventajas significativas con relación al uso de sistemas procariotas tales como E. coli. La levadura generalmente se puede cultivar a densidades celulares más altas que las bacterias y se adapta fácilmente al proceso de fermentación continua. Sin embargo, el desarrollo de especies de levadura como sistemas hospedero/vector para la producción de bibliotecas y productos recombinantes se ve gravemente obstaculizado por la falta de conocimiento sobre las condiciones de transformación y los medios adecuados para introducir de forma estable ácidos nucleicos extraños en la célula hospedera de levadura.

Entre los varios parámetros eléctricos y biológicos que facilitan la electrotransformación de las células se encuentra la adsorción del ADN a la superficie celular. Los campos eléctricos alternos de baja intensidad también promueven la transferencia de ADN a bacterias E. coli, presumiblemente por la estimulación eléctrica de las permeasas de ADN. Se ha acumulado evidencia del efecto electrodifusor o electroforético dominante sobre la transferencia génica electroporativa del ADN polielectrolítico. También se han reportado efectos electroosmóticos y la invaginación de la membrana facilitada por la electroporación.

La aplicación de un campo eléctrico a través de la membrana de una célula de levadura resulta en la creación de poros transitorios que son críticos para el proceso de electroporación. Un electroporador generador de señales proporciona el voltaje (en kV) que viaja a través del espacio (en cm) entre los electrodos. Esta diferencia de potencial define lo que es llamado la fuerza de campo eléctrico donde E es igual a kV/cm. Cada célula tiene su propia fuerza de campo crítica para una electroporación óptima. Esto se debe al tamaño de la célula, la composición de la membrana y las características individuales de la propia pared celular. Por ejemplo, las células de mamífero requieren típicamente entre 0,5 y 5,0 kV/cm antes de que ocurra la muerte celular y/o la electroporación. Generalmente, la fuerza de campo que se requiere varía inversamente con el tamaño de la célula.

El documento EP2257638A1se refiere a métodos para la transformación de levadura por electroporación. Estos incluyen la combinación de acetato de litio (LiAc) y ditiotreitol (DTT) como agentes acondicionadores de células, de los cuales se han usado para potenciar la frecuencia de transformación de la levadura. Como se muestra en la Tabla 2, la eliminación del tratamiento previo con DTT o LiAc resultó en reducciones de eficiencia respectivas del 93,3 % y el 85,7%.

De manera similar, Smith y otros (en: IT Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141) describen un estudio sobre el TCR en la unión de antígenos como ligandos péptido-MHC (pepMHC). Ha existido interés en diseñar por ingeniería genética la afinidad de los TCR con el fin de usar esta clase de moléculas de manera similar a como se hace ahora con los anticuerpos. Para diseñar por ingeniería genética los TCR y analizar sus características de unión más rápidamente, han usado un sistema de exposición de levadura como plataforma. La expresión y el diseño por ingeniería genética de una forma monocatenaria del TCR, análoga a los fragmentos scFv de los anticuerpos, permiten que el TCR madure por afinidad con una variedad de posibles ligandos pepMHC. Además, la plataforma de exposición de levaduras permite generar rápidamente variantes de TCR con diversas afinidades de unión y analizar la especificidad y la afinidad sin necesidad de purificar las formas solubles de los TCR. El artículo describe los métodos para diseñar por ingeniería genética y analizar los TCR monocatenarios mediante el uso de la exposición de levadura.

Las bibliotecas de levadura no han alcanzado el tamaño o la eficiencia que se ha alcanzado por las bibliotecas de fagos, un tamaño máximo típico de biblioteca de fagos es de 1010a 1011, mientras que una biblioteca de levadura típica es de 107 en tamaño. Aunque el progreso reciente en los protocolos de electroporación (ver Chao, Nature Protocols 1(2):755-768 (2006)) ha hecho posible alcanzar un tamaño máximo de biblioteca de levadura de 5 * 107 en una sola transformación. Aún es una afirmación correcta que los tamaños de las bibliotecas de levadura alcanzados hasta la fecha aún se encuentran significativamente más abajo de lo que se puede alcanzar de forma rutinaria por las bibliotecas de exposición en fagos en el tamaño de 1010a 1011.

Los métodos y descripciones anteriores, mientras que alcanzan una eficiencia de transformación cada vez más alta, siguen siendo laboriosos y toman un tiempo significativo y esfuerzos repetitivos para acumular múltiples bibliotecas pequeñas en los intervalos de tamaño de 106a 107 a un tamaño de biblioteca más grande y combinado en los intervalos de tamaño de 108a 109.

La selección de bibliotecas de exposición en levaduras, que usa tanto la clasificación de células activadas por fluorescencia como de perlas magnéticas, ofrece un método eficiente y sensible para enriquecer aglutinantes específicos para antígenos diana, en particular por su compatibilidad con la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La ventaja de este poder de selección, sin embargo, se ve obstaculizada por el tamaño limitado de las típicas bibliotecas de exposición en levadura debido a la baja eficiencia de transformación de las células de levadura.

Por lo tanto, existe la necesidad de métodos eficientes para producir bibliotecas de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de TCR, mediante el uso de levadura.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar células de levadura electrocompetentes, que comprende las etapas de: a) cultivar células de levadura hasta una DO⁶⁰⁰de entre aproximadamente 1,0 a 2; b) lavar las células con agua fría; c) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol y CaCh; d) incubar las células con una solución que comprende acetato de litio y tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP); e) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol y CaCh; f) resuspender las células en una solución que comprende sorbitol; y g) opcionalmente, almacenar adecuadamente dichas células.

Por lo tanto, la invención proporciona un método altamente eficiente para transformar células de levadura, por ejemplo, para la producción de bibliotecas de células de levadura mejoradas. Los métodos de la invención eliminan un cuello de botella significativo en la aplicación de la tecnología de exposición en levaduras como una herramienta práctica para acceder a un espacio de diversidad de TCR mucho más grande que sin explorar anteriormente.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere entonces a un método para transfectar células de levadura electrocompetentes, que comprende las etapas de: a) proporcionar células de levadura electrocompetentes de acuerdo con el método de acuerdo con la presente invención; b) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol; c) mezclar las células con el ADN a transfectar, para formar una mezcla de preelectroporación; d) transferir dicha mezcla de preelectroporación a una cubeta de electroporación adecuada, y e) electroporar dichas células entre aproximadamente 2,5 kV/cm y aproximadamente 12,5 kV/cm por entre aproximadamente 2 a aproximadamente 5 ms.

Se prefiere un método de acuerdo con la presente invención, en donde dicho ADN es lineal o circular. Con mayor preferencia es un método de acuerdo con la presente invención, en donde dicho ADN comprende una biblioteca de fragmentos de ADN que codifican una biblioteca de proteínas de interés, por ejemplo, en forma de una biblioteca de exposición en superficie de levadura. Con la máxima preferencia es un método de acuerdo con la presente invención, en donde dicha biblioteca de exposición es una biblioteca de receptores de linfocitos T (TCR).

Sorprendentemente se encontró que al usartris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) como agente reductor, la eficiencia de transformación del método de acuerdo con la presente invención es más alta en comparación con DTT, por ejemplo, más alta que 1 * 108 transformantes de levadura/pg de ADN del vector, preferentemente más alta que 2 * 108transformantes de levadura/μg de ADN del vector.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere entonces a un método para producir una biblioteca de levadura mejorada de proteínas de interés, por ejemplo en forma de una biblioteca de exposición en superficie de levadura, que comprende las etapas de: a) proporcionar células de levadura transfectadas de acuerdo con el método de acuerdo con la presente invención; b) diluir las células transfectadas en una mezcla 1:1 de una solución de sorbitol en medio de cultivo; c) resuspender las células en un medio de cultivo adecuado; d) opcionalmente, realizar diluciones para un cálculo de diversidad, y sembrar dichas diluciones en placas de SD-CAA que contienen kanamicina; y e) transferir dicha biblioteca a un medio de cultivo adecuado y expandir dicha biblioteca por electroporación; y f) opcionalmente, almacenar adecuadamente dicha biblioteca expandida.

Se prefiere un método de acuerdo con la presente invención, en donde dicha biblioteca de exposición es una biblioteca de receptores de linfocitos T. Se prefiere un método de acuerdo con la presente invención, en donde la diversidad de dicha biblioteca es más alta que aproximadamente 1012.

En el contexto de la presente invención, el término "vector de expresión" significa una construcción de ADN que incluye un sitio autónomo de replicación (ARS), un sitio de iniciación de la transcripción y al menos un gen estructural que codifica una proteína que se va a expresar en el organismo hospedero. Un sitio de replicación, u origen de replicación, es cualquier secuencia de ADN que controla la replicación de los vectores de clonación y expresión. Un vector de expresión usualmente también contiene regiones de control apropiadas tales como uno o más potenciadores y/o promotores, supresores y/o silenciadores, y terminadores que controlan la expresión de la proteína en la levadura hospedera. Los vectores de expresión de acuerdo con la presente invención también pueden contener un marcador de selección que comprende un gen esencial como se describe en la presente descripción. El vector de expresión también contiene opcionalmente otros marcadores seleccionables ampliamente disponibles y bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores de expresión son un tipo de vector. Los vectores pueden incluir opcionalmente una o más secuencias ARS (elementos) de una o más cepas de levadura.

El término "unido operativamente" significa que los segmentos de ADN están dispuestos de manera que funcionen en conjunto para sus propósitos previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador.

El término "transformación" o "transfección" significa la introducción de ADN u otros ácidos nucleicos en una célula hospedera de levadura receptora que cambia el genotipo.

El término "transformante" o "célula transformada" significa una célula hospedera de levadura receptora, y la progenie de la misma, que se ha sometido a transformación.

"Aproximadamente" significará /-10 % del valor dado, a menos que se indique de cualquier otra manera.

Los vectores útiles en los métodos de electroporación de la invención incluyen el vector pYD, cualquier otro vector y sus construcciones derivadas que se pueden propagar por células de levadura, o ácidos nucleicos en general. El vector de expresión de la presente invención se puede basar en cualquier tipo de vector siempre que el vector pueda transformar, transfectar o transducir una célula de levadura hospedera. En una modalidad preferida, el vector de expresión se basa en un plásmido de levadura, especialmente uno de S. cerevisiae. Después de la transformación de las células de levadura, el ADN exógeno que codifica las secuencias de la biblioteca es captado por las células y posteriormente expresado por las células transformadas.

Con mayor preferencia, el vector de expresión puede ser un vector lanzadera de levadura-bacteria que se puede propagar en E. coli o levadura (Struhl, y otros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.). La inclusión de E. coli en las secuencias de ADN de plásmido, tal como pBR322, facilitan la preparación cuantitativa de ADN del vector en E. coli y, por tanto, la transformación eficiente de la levadura.

Los tipos de vectores de plásmidos de levadura que pueden servir como lanzadera pueden ser un vector de replicación o un vector de integración. Un vector de replicación es un vector de levadura que es capaz de mediar en su propio mantenimiento, independientemente del ^aDⁿcromosómico de la levadura, en virtud de la presencia de un origen funcional de replicación del ADN. Un vector de integración se basa en la recombinación con el ADN cromosómico para facilitar la replicación y, por tanto, el mantenimiento continuo del ADN recombinante en la célula hospedera. Un vector de replicación puede ser un vector de plásmido en base a 2 micrómetros en el que el origen de la replicación del ADN se deriva de la levadura endógena de plásmido de 2 micrómetros. Alternativamente, el vector de replicación puede ser un vector de replicación autónoma (ARS), en el que el origen "aparente" de replicación se deriva del ADN cromosómico de la levadura. Opcionalmente, el vector de replicación puede ser un plásmido centromérico (CEN) que porta, además de uno de los orígenes de replicación de ADN anteriores, una secuencia de ADN cromosómico de levadura conocida que alberga un centrómero.

Los vectores se pueden transformar en células de levadura en forma circular cerrada o en forma lineal. La transformación de la levadura por vectores de integración, aunque con una estabilidad heredable, puede no ser eficiente cuando el vector se encuentra en una forma circular cerrada (por ejemplo, produciendo sólo aproximadamente 1-10 transformantes por |jg de ADN). Los vectores linealizados, con extremos libres ubicados en secuencias de ADN homólogas al ADN cromosómico de la levadura, transforman la levadura con mayor eficiencia (100-1000 veces) y el ADN transformante se encuentra generalmente integrado en secuencias homólogas al sitio de escisión. Por tanto, al escindir el ADN del vector con una endonucleasa de restricción adecuada, es posible aumentar la eficiencia de la transformación y dirigirse al sitio de integración cromosómica. La transformación integrativa puede ser aplicable a la modificación genética de la levadura cervecera, siempre y cuando la eficiencia de la transformación sea lo suficientemente alta y la secuencia de ADN diana para la integración se encuentre dentro de una región que no altere los genes esenciales para el metabolismo de la célula hospedera.

Las cepas de levadura que se pueden transformar mediante el método de electroporación de la invención incluyen especies de levadura en el género Saccharomyces tales como Saccharomyces cerevisiae y el género Schizosaccharomyces tal como Schizosaccharomyces pombe. En una modalidad, las células de levadura son células de levadura diploides. Alternativamente, las células de levadura son células haploides tales como las cepas "a" y "a" de células haploides de levadura.

Una "biblioteca de receptores de linfocitos T" en el contexto de la presente invención puede comprender partes adecuadas de TCR humanos y/o humanos mutados para examinar, preferentemente una forma monocatenaria del TCR, por ejemplo, un Vp-enlazador-Va monocatenario (TCRmc); o un Va-enlazador-Vp monocatenario, opcionalmente fusionada con un péptido autoescindible, por ejemplo, el péptido 2A. También se pueden usar métodos publicados para optimizar la expresión de TCR con una modificación mínima de la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje (por ejemplo, Szymczak, A. L. y otros, Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptidebased retroviral vector. Nat Biotechnol 22, 589-594 (2004); Yang, S. y otros, Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther 15, 1411 1423 (2008); Kuball, J. y otros, Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood 109, 2331-2338 (2007); Cohen, C. J. y otros, Enhanced Antitumor Activity ofT Cells Engineeredto Express T-Cell Receptors with a Second Disulfide Bond. Cancer Res 67, 3898-3903 (2007); Scholten, K. B. J. y otros, Codon modification ofT cell receptors allows enhanced functional expression in transgenic human T cells. Clin. Immunol. 119, 135-145 (2006)).

La relación del ADN del vector para insertar ADN se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1:0,5 a aproximadamente 1:10, por ejemplo, 1:0,5, 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, o 1:10. En una modalidad, se usan en una reacción aproximadamente 1 jg de ADN del vector y aproximadamente 1 jg de ADN de inserción. En otra modalidad, se precipitan aproximadamente 1 jg de ADN del vector y aproximadamente 2 jg de ADN de inserción. En otra modalidad, se precipitan aproximadamente 1 jg de ADN del vector y aproximadamente 3 jg de ADN de inserción. En aún otra modalidad, se precipitan aproximadamente 1 jg de ADN del vector y aproximadamente 4 jg de ADN de inserción. Aún en otra modalidad, se precipitan aproximadamente 1 jg de ADN del vector y aproximadamente 5 jg de ADN de inserción.

En una modalidad, la suspensión celular comprende de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 j l de células de levadura, por ejemplo, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 j l de células de levadura.

En una modalidad, la suspensión de células de levadura es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 * 109células de levadura/ml, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 * 109células de levadura/ml.

En una modalidad, la fuerza de campo que se usa para electroporar las células de levadura fue de aproximadamente 0,5 kV/cm a aproximadamente 12,5 kv/cm, por ejemplo, 0,5, 1,0, aproximadamente 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5 kV/cm.

En una modalidad, las células de levadura se electroporan a una capacitancia de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 pF, por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50.

En una modalidad, las células de levadura se suspenden en sorbitol de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 M y CaCl²o MgCh de 0,1 a 10 mM, por ejemplo, sorbitol 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, o 10,0 M, o, por ejemplo, CaCh o MgCh 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, o 10,0 mM.

En una modalidad, las células de levadura se incuban en LiAc de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 M, por ejemplo, LiAc 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, aproximadamente 0,7, 0,8, 0,9, o 1,0 M, y TCEP de 1 a 100 mM, por ejemplo, TCEP 1,10, 20, 30, 40, 50, 60, aproximadamente 70, 80, 90 o 100 mM.

La invención proporciona métodos para la transformación de células de levadura que comprenden la electroporación de una suspensión celular que contiene levadura junto con una o más construcciones de ácido nucleico. La transformación de las células de levadura puede resultar en cualquier parte, desde un solo clon hasta una población de células de levadura (es decir, una biblioteca o bibliotecas de levadura) que se pueden usar para detectar (a) péptido(s) o proteína(s) que se exponen en la superficie de células de levadura por medio de la unión a una proteína de superficie de levadura o asociación mediante un enlace covalente específico o interacción no covalente con proteínas de superficie de células de levadura u otros componentes; (b) péptido(s) o proteína(s) expresado(s) intracelularmente; o (c) péptido(s) o proteína(s) secretada(s) en el espacio extracelular tal como medios de cultivo, o se depositan sobre una superficie sólida. Tales bibliotecas de levadura pueden ser convenientemente adecuadas para múltiples aplicaciones, para examinar o caracterizar interacciones entre el(los) péptido(s) o la(s) proteína(s) con otra proteína, péptido, ADN, ARN u otras sustancias químicas que se pueden introducir en las células de levadura o añadirse exógenamente. Ejemplos específicos son aquellos que se encuentran en la exposición en levadura, dos híbridos de levadura, tres híbridos de levadura, etc.

La invención proporciona un método para la transformación de células de levadura que comprende la electroporación de una suspensión celular que contiene levadura junto con una o más construcciones de ácido nucleico que comprenden una o más secuencias reguladoras y uno o más genes o segmentos de genes, mediante el uso de uno o más de resistencia, fuerza de campo y duración del pulso suficiente para transformar las células de levadura.

En una modalidad, la fuerza de campo es de aproximadamente 2,5 kV/cm a aproximadamente 12,5 kV/cm. En determinadas modalidades, la fuerza del campo es de 0,5 kV/cm, 1,0 kV/cm, 1,5 kV/cm, 2,0 kV/cm, o 2,5 kV/cm. Estos valores tienen en cuenta que la cubeta de electroporación tiene un espacio de 0,2 cm. Son posibles fuerzas de campo más altas, pero su practicidad es dependiente en gran medida del desarrollo de un equipo que pueda suministrar un pulso más fuerte.

En una modalidad, la duración del pulso es de aproximadamente 3 milisegundos a aproximadamente 10 milisegundos. En una modalidad particular, la duración del pulso es de aproximadamente 4 milisegundos.

El tratamiento de células por los métodos de electroporación de la invención se lleva a cabo al aplicar un campo eléctrico a una suspensión de células de levadura entre un par de electrodos. La fuerza del campo se debe ajustar con una exactitud razonable de manera que la electroporación de las células se ocurra sin daño, o con un daño mínimo, a las células. La distancia entre los electrodos se puede medir entonces y aplicar entonces un voltaje adecuado de acuerdo con la fórmula E=V/d a los electrodos (E=fuerza de campo eléctrico en V/cm; V=voltaje en voltios; y d=distancia en centímetros).

Los generadores de pulsos para llevar a cabo los procedimientos que se describen en la presente descripción están y han estado disponibles en el mercado por un número de años. Un generador de señales adecuado es el Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Una configuración típica consiste en el Gene Pulser II conectado a módulos de expansión de capacitancia plus y controlador de pulso plus.

La electroporación se usa dentro de la presente invención para facilitar la introducción de ADN en las células de levadura. La electroporación es el proceso de usar un campo eléctrico pulsado para permeabilizar transitoriamente las membranas celulares, lo que permite que macromoléculas, tal como el ADN, pasen a las células. Sin embargo, el mecanismo real por el cual el ADN se transfiere a las células no es bien entendido. Para la transformación de candida famata, por ejemplo, la electroporación es sorprendentemente eficiente cuando las células se exponen a un campo eléctrico pulsado que decae experimentalmente que tiene una fuerza de campo de aproximadamente 10 a aproximadamente 13 kV/cm y un valor de resistencia de aproximadamente R5 (129 ohm), y una constante de tiempo de aproximadamente 4,5 ms. Típicamente, la resistencia y la capacitancia están presentes o pueden ser seleccionadas por el usuario, en dependencia del equipo de electroporación seleccionado. En cualquier caso, el equipo se configura de acuerdo con las instrucciones del fabricante para proporcionar parámetros de fuerza de campo y decaimiento según corresponda.

La invención se refiere adicionalmente a métodos altamente eficientes de transformación de levaduras que permiten un alto nivel de expresión de cualquiera o más genes endógenos deseados (es decir, existentes naturalmente dentro de esa célula de levadura) o heterólogos. Los métodos de la invención se refieren adicionalmente a un método para preparar bibliotecas, por ejemplo, que expresan TCR, TCRmc, quimeras o fragmentos de los mismos.

En un escenario, los vectores de expresión que portan genes de interés se pueden transformar en células hospederas de levadura mediante electroporación para generar un solo clon o una biblioteca que comprende muchas células transformadas que expresan proteínas intracelulares (por ejemplo, proteínas nucleares o citoplasmáticas), proteínas de membrana (por ejemplo, proteínas de membrana-transversales o proteínas unidas a la membrana), o proteínas secretadas. Uno será capaz de usar las células transformadas o la biblioteca para purificar proteínas, estudiar funciones de proteínas, identificar interacciones proteína-proteína, o identificar nuevos aglutinantes de proteínas o parejas de interacción. Cabe destacar la capacidad de generar bibliotecas de levadura muy grandes que exponen o expresan TCR y fragmentos de TCR. La biblioteca se puede someter a selección por antígenos diana para identificar los TCR que se unen a los antígenos de selección.

Como la levadura transformada tiene una tendencia a perder plásmidos construidos artificialmente, es ventajoso usar un medio de cultivo de modo que ejerza una presión de selección positiva en ellos. Cuando la cepa es un mutante auxotrófico para un metabolito esencial y cuando el plásmido vector que se usa comprende un gen marcador capaz de restaurar la prototrofia de la cepa, por ejemplo, el gen LEU2, esta presión de selección se puede ejercer al omitir el metabolito del medio de cultivo. Existen otros medios para obtener el mismo resultado y también se pueden usar para poner en práctica la invención.

Dependiendo de la naturaleza del gen estructural de interés, el producto o producto de expresión puede permanecer en el citoplasma de la célula hospedera de levadura o ser secretado. Se ha encontrado que no solo las proteínas que permanecen en la célula sino también aquellas que son secretadas son solubles. Donde el producto o producto de expresión deba permanecer en la célula hospedera de levadura, puede ser generalmente deseable tener una región de iniciación de la transcripción inducible, de manera que hasta que el transformante haya alcanzado una alta densidad, existe poca o ninguna expresión o producción del producto deseado. Después de un tiempo suficiente para que se exprese el producto o el producto de expresión, las células se pueden aislar por medios convencionales, por ejemplo, centrifugación, lisis y el producto de interés aislado. Dependiendo de la naturaleza y el uso del producto, el lisado se puede someter a varios métodos de purificación, tales como cromatografía, electroforesis, extracción con disolvente, cristalización, diálisis, ultrafiltración o similares. Los métodos de cromatografía incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de gases, HPLC, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico y otros métodos de cromatografía conocidos por los expertos en la técnica. El grado de pureza puede variar de aproximadamente 50 % a 90 % o más alto, preferentemente hasta aproximadamente 100 %.

Alternativamente, el producto de expresión o el producto de interés se puede secretar en el medio de cultivo, y producirse de forma continua, donde el medio se retira parcialmente, el producto deseado se extrae, por ejemplo, por columna o cromatografía de afinidad, ultrafiltración, precipitación o similares, y el medio gastado desechado o recirculado mediante la restauración de componentes esenciales. El permeado que contiene el producto de la ultrafiltración se puede someter adicionalmente a concentración, seguido de evaporación, seguido de cristalización o precipitación mediante el uso de alcohol y/o ajuste de pH. Los expertos en la técnica son conscientes de las muchas opciones de proceso. Cuando se va a secretar el producto, normalmente se empleará una región de iniciación de la transcripción constitutiva, aunque se pueden usar regiones no constitutivas.

Otras modalidades preferidas se pueden derivar de los ejemplos con referencia a las figuras como se describen en la presente descripción, sin embargo, sin limitarse a ellas.

La Figura 1 muestra una comparación de la eficiencia de transfección mejorada de TCEP, cuando se compara con DTT bajo las mismas condiciones.

Ejemplos

La práctica de la invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de electroporación celular y biología celular de levadura, que son bien conocidas en la técnica.

I. Medio

1. Medio YPD

Extracto de levadura 10 g

Bacto-peptona 20 g

Dextrosa 20 g

llevar el volumen a 1 L con H²O (añadir glucosa estéril a la solución esterilizada en autoclave)

2. SD-CAA (pH 4,5):

Citrato de sodio dihidratado 14,8 g (50 mM final) Ácido cítrico monohidrato 4,2 g (20 mM final) en 800 ml de H²O, esterilizar en autoclave.

Casaminoácidos 5,0 g

Base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos) 6,7 g

Glucosa 20 g

llevar el volumen a 1 L con H²O y filtro estéril

3. Placas de SD-CAA:

Sorbitol 182.2 g Agar 15 g

Citrato de sodio 14,8 g Ácido cítrico monohidrato 4.2 g en 800 ml de H²O, esterilizar en autoclave, y enfriar hast ta —55 °C.

Casaminoácidos 5,0 g

Base nitrogenada de levadura (sin aminoácidos) 6,7 g Glucosa 20 g

Sulfato de kanamicina 35 mg en 200 ml de H²O y filtro estéril, añadir a la solución esterilizada en autoclave enfriada

II. Preparación de células de levadura electrocompetentes

20 |jl de solución madre de levadura recién descongelada de -80 °C donde se sembraron en placas agar YPD, y se incubaron por dos días a 30 °C. Se tomaron colonias solas (se tomó toda la colonia) de la placa de agar YPD para 15 ml de medio YPD, y se agitó durante la noche a 30 °C. A la mañana siguiente, se transfirieron 10 ml de cultivo a 100 ml de medio YPD fresco, y se continuó agitando por 7 h a 30 °C. La DO⁶⁰⁰se determinó y se inoculó 1 L de medio YPD frío a una DO⁶⁰⁰de 0,2. El matraz agitador se colocó en un agitador enfriado previamente (4 °C). El agitador se programó para comenzar a calentar (30 °C) y agitar (250 rpm) 5 h antes de comenzar la jornada laboral. La incubación se realizó hasta que la DO⁶⁰⁰alcanzó 1,5, lo que usualmente era 6 h después de comenzar la agitación.

Las etapas posteriores se tienen que realizar en hielo y con soluciones, tubos, cubetas y centrífuga enfriados, si no se indica de cualquier otra manera.

Las células se sedimentaron a 2000 g y 4 °C por 3 min (proceso de 2 etapas en 10 tubos Falcon, 50 ml), se lavaron dos veces con 25 ml de H²O fría y se sedimentaron a 2000 g por 3 min. Las células se lavaron con 25 ml de sorbitol frío, 1 M/CaCl², 1 mM; y se sedimentaron a 2000 g por 3 min. Las células se resuspendieron en 25 ml de acetato de litio, 100 mM/TCEP, 10 mM. Se usaron tubos Falcon de 50 ml con tapa de filtro para permitir la aireación; las células se incubaron a 30 °C mientras se agitaban a 160 rpm por 30 min, se colocaron en hielo y las células se sedimentaron a 2000 g y 4 °C por 3 min. Las células se lavaron con 25 ml de sorbitol 1 M frío/CaCh 1 mM; y se sedimentaron a 2000 g y 4 °C por 3 min, y se lavaron con 25 ml de sorbitol 1 M frío; y se sedimentaron a 2000 g y 4 °C por 3 min. Las células se suspendieron en un tubo cónico en sorbitol 1 M frío hasta un volumen final de 400 j l por reacción de electroporación. Las células electrocompetentes se pueden almacenar directamente a -80 °C. Antes de usar las muestras para electroporación, las sales filtradas se han eliminado por centrifugación (2000 g, 4 °C, 5 min) y se lavaron dos veces con sorbitol frío, 1 M.

III. Electroporación

Se mezclaron 400 j l de células con 5-10 j l de ADN (vector) en H²O, se mantuvo en hielo por 3 min y se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm enfriada previamente. Mediante el uso de un sistema de electroporación BioRad MicroPulser, las células se electroporan a 2,5 kV. Las constantes de tiempo típicas se encontraban en aproximadamente 4 ms, preferentemente en 4 ms. Las células electroporadas se transfirieron a 10 ml de una mezcla 1:1 de sorbitol 1 M: medio YPD a 30 °C por 1 hora sin agitación. Las células se cosecharon a 2000 g por 3 min a temperatura ambiente, y se resuspendieron en 10 ml de SD-CAA a temperatura ambiente. Se realizaron diluciones para el cálculo de la diversidad (1:105 a 1:107). Las diluciones en placas de SD-CAA que contenían kanamicina se incubaron por 1 día a 30 °C y por tres días a temperatura ambiente. La biblioteca se transfirió a 100 ml de SD-CAA (preferentemente por electroporación) y se continuó agitando por 24 h a 30 °C a 160 rpm. Las bibliotecas expandidas se pueden usar directamente para la inducción o almacenamiento a 4 °C por dos semanas. El almacenamiento a largo plazo se puede realizar al congelar en glicerol al 30 % a -80 °C.

Mediante el uso de la condición de electroporación más óptima, se puede alcanzar rutinariamente una eficiencia de transformación de levadura de aproximadamente 2 * 108transformantes de levadura/μg de ADN del vector (ver Figura 1). Como esta eficiencia de transformación se alcanza en un volumen de célula mínimo (100 μl), es altamente adecuado para la automatización y los dispositivos de electroporación multipocillo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar células de levadura electrocompetentes que comprende las etapas de:

a) cultivar células de levadura hasta una DO⁶⁰⁰de entre 1,0 a 2;

b) lavar las células con agua fría;

c) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol y CaCh;

d) incubar las células con una solución que comprende acetato de litio y tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP); e) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol y CaCh;

f) resuspender las células en una solución que comprende sorbitol; y

g) opcionalmente, almacenar adecuadamente dichas células.

2. Células de levadura electrocompetentes obtenibles con el método que consiste en las etapas de:

a) cultivar células de levadura hasta una DO⁶⁰⁰de entre 1,0 a 2;

b) lavar las células con agua fría;

c) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol y CaCh;

d) incubar las células con una solución que comprende acetato de litio y tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP); e) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol y CaCh; y

f) resuspender las células en una solución que comprende sorbitol.

3. Un método para transfectar células de levadura electrocompetentes, que comprende las etapas de:

a) proporcionar células de levadura electrocompetentes preparadas de acuerdo con la reivindicación 2; b) lavar las células con una solución fría que comprende sorbitol;

c) mezclar las células con el ADN a transfectar, para formar una mezcla de preelectroporación;

d) transferir dicha mezcla de preelectroporación a una cubeta de electroporación adecuada, y

e) electroporar dichas células de entre 2,5 kV/cm a 12,5 kV/cm durante de entre 2 a 5 ms.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho ADN es lineal o circular.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde dicho ADN comprende una biblioteca de fragmentos de ADN que codifican una biblioteca de proteínas de interés, por ejemplo, en forma de una biblioteca de exposición en superficie de levadura.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha biblioteca de exposición es una biblioteca de receptores de linfocitos T (TCR).

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde la eficiencia de transformación es más alta que 1 * 108 transformantes de levadura/μg de ADN del vector, preferentemente más alta que 2 * 108 transformantes de levadura/μg de ADN del vector.

8. Un método para producir una biblioteca de levadura mejorada de proteínas de interés, por ejemplo en forma de una biblioteca de exposición en superficie de levadura, que comprende las etapas de:

a) proporcionar unas células de levadura transfectadas de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7;

b) diluir las células transfectadas en una mezcla 1:1 de una solución de sorbitol en medio de cultivo;

c) resuspender las células en un medio de cultivo adecuado;

d) opcionalmente, realizar diluciones para un cálculo de diversidad, y sembrar dichas diluciones en placas de SD-CAA que contienen kanamicina; y

e) transferir dicha biblioteca a un medio de cultivo adecuado y expandir dicha biblioteca por electroporación; y f) opcionalmente, almacenar adecuadamente dicha biblioteca expandida.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha biblioteca de exposición es una biblioteca de receptores de linfocitos T.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde la diversidad de dicha biblioteca es más alta que 1012.