JP6956416B2 - トランスポゾン系、それを含むキット及びそれらの使用 - Google Patents
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Description
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲に用いられる或る特定の用語をここにまとめる。本明細書において他に規定のない限り、本開示に用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解され、使用されるものと同じ意味を有するものとする。また、文脈上必要とされない限り、単数形の用語がその複数形を含み、複数形の用語がその単数形を含むことを理解されたい。特に、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形(the singular forms "a" and "an")は文脈上そうでないことが明らかに示されない限り、複数の指示対象を含む。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「少なくとも1つの」及び「1つ以上の」という用語は同じ意味を有し、1つ、2つ、3つ又はそれ以上を含む。
概して、本開示は、対象の遺伝子(例えば、治療用タンパク質の遺伝子)を保有するように細胞を改変するための系、方法及び/又はキットに関する。改変細胞はこの場合、対象の遺伝子の産物によって治療可能な疾患及び/又は障害を患う患者を治療する治療剤として使用される。
細胞培養
ヒト胎児腎臓細胞株293(HEK293)、ヒトJK不死化Tリンパ球(Jurkat T)及び初代ヒトT細胞を本研究に使用した。HEK293細胞は10%FBS、2mM L−グルタミン、1倍非必須アミノ酸、1倍ペニシリン/ストレプトマイシン及び1mMピルビン酸ナトリウムを含有するMEM培地中で培養した。Jurkat T細胞及び初代ヒトT細胞は2mM L−グルタミン、10%FBS、1mMピルビン酸ナトリウム及び0.1mM非必須アミノ酸を含有するRPMI1640培地中で培養した。全ての細胞を37℃、5%CO2で維持した。
Jurkat細胞を新鮮培地中、2×106/mLの密度で24時間培養した後、培養培地を回収し、濾過し、馴化培地として使用した。
pBS−カセット
SV40プロモーターによって駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するDNAフラグメントを、pcDNA3.1_hygro_LacZベクター(Invitrogen)から切り出した。XmnI及びSapI消化後に、DNAフラグメントをpBlueScript SKIIのSmaI部位にクローニングし、pBS−hygroの構築を完了した。カナマイシン耐性遺伝子及びColE1複製起点を更に挿入するために、pZErO−2.1(Invitrogen)のApoI_AflIIIフラグメントをpBS−hygroのEcoRV部位にクローニングし、pBS−カセットの構築を完了した。
pBS−カセットを制限酵素SmaI及びEcoRVで消化し、続いてpBSII−ITR1に由来するpXLBacIIPUbnlsEGFPに消化フラグメントを挿入した。このようにして作製した構築物mini−piggyBac_longは、その5’末端及び3’末端にそれぞれ308bp及び238bpの末端反復(TR)を有するものであった。
mini−piggyBac_long構築物をPciI及びAclIで消化し、クレノウ(NE Biolabs)によってフィルインし(filled-in)、T4 DNAリガーゼ(NE Biolabs)によって自己ライゲートさせ、アンピシリン耐性遺伝子及びf1複製起点を含有しないmini−piggyBac_shortを作製した。
短いpiggyBac末端反復ドメイン(TRD)(すなわち、pXL−BacIIの746〜808の3’LTR及び1426〜1460の5’LTR)を以下の4対のプライマー;pB−11−KpnI(配列番号5)、pB−5−フォワード(配列番号6)、pB−6−リバース(配列番号7)及びpB−12−SacI(配列番号8)からなるPCR混合物から得た。間にSwaI及びXho I制限部位を有する67bpの5’TRD及び40bpの3’TRDの両方を含有する得られるアンプリコンを、Kpn I及びSac I制限部位を介してpBS−SKIIにクローニングし、pPBendAATTを得た。上記のpBS−カセットから得られる発現カセットを、平滑末端Xho I部位を介してpPBendAATT中の短いpiggyback TRDの間に挿入し、micro−piggyBac_longを作製した。
micro−piggyBac_longをAcc65I及びAflIIIで消化し、アンピシリン耐性遺伝子及びf1複製起点を除去した。残りのDNAフラグメントを平滑末端化し、続いて自己ライゲーションを行い、アンピシリン耐性遺伝子及びf1複製起点を含有しないmicro−piggyBac_shortの構築物を生成した。この構築物もミニサークルカセットと指定される。
代替的には、micro−piggyBac_short、すなわちミニサークルカセットは、MC−Easy circle Minicircle DNA Productionキットを用いて作製することができる。この方法では、micro−piggyBac_longをKpnI、SacI及びXmnIで消化し、micro−piggyBacの左(microL)及び右(microR)逆方向反復を含有するKpnI−SacIフラグメント(3993bp)を平滑末端化し、pMC.BESPX−MCS1のEcoRV部位に挿入して、pMC−microPB−カセットを作製した。ミニサークル−microPB−カセットは、pMC−microPB−カセットからMC−Easy circle Minicircle DNA Productionキットを用い、製造業者のプロトコルに従って作製した。このようにして作製したミニサークル−microPB−カセットは、アンピシリン耐性遺伝子及びf1複製起点を含有しないものであった。
ヘルパープラスミドpCMV−ThyPLGMH、pCMV−mycPBase、pCMV−TPLGMH及びpCMV−HAhyPBaseを、Yaa-Jyuhn James Meir et. al.(A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013: 27, 4429-4443)によって記載されるプロトコルに従って構成した。この刊行物の内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
HEK293細胞
トランスフェクションの18時間前に80%コンフルエンスの細胞を採取し、24ウェルプレートの個々のウェルに1×105細胞/ウェルの密度で播種した。各トランスフェクションについては、Fugene 6(Roche,Florence,SC)を用いて合計300ngのDNA混合物をトランスフェクトした。各DNA混合物は、合計300ngのDNAに対して100ngのヘルパープラスミド(すなわち、pCMV−ThyPLGMH、pCMV−mycPBase、pCMV−TPLGMH又はpCMV−HAhyPBase)、様々な量のDNAドナー(すなわち、mini−piggyBac_long、mini−piggyBac_short、micro−piggyBac_long、micro−piggyBac_short、pMC−microPB−カセット又はミニサークル−microPB−カセット;最小のドナーの量を100ngと設定した)及びpcDNA3.1を含有するものであった。各トランスフェクション反応については、トランスフェクト細胞の5分の1を100mmプレートに移し、続いて14日間のハイグロマイシン選択を行った。クローンを計数するために、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSで細胞を10分間固定した後、0.2%メチレンブルーで1時間染色した。14日間のハイグロマイシン選択の後、直径0.5mmのコロニーのみを計数した。
細胞をヌクレオフェクションの24時間前に1×106/mLで播種した。各ヌクレオフェクション反応については、合計6μgのDNAを用いて1×106個の細胞にトランスフェクトした。各DNA混合物は、合計6μgのDNAに対して2.5μgのヘルパープラスミド(すなわち、pCMV−ThyPLGMH、pCMV−mycPBase、pCMV−TPLGMH又はpCMV−HAhyPBase)、様々な量のDNAドナー(すなわち、mini−piggyBac_long、mini−piggyBac_short、micro−piggyBac_long、micro−piggyBac_short、pMC−microPB−カセット又はミニサークル−microPB−カセット;最小のドナーの量を2.0μgと設定した)及びpcDNA3.1を含有するものであった。ヌクレオフェクションの24時間後に、1.2mgのハイグロマイシンを含む上記の馴化培地50μL中30個の生細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。2、3日おきに、細胞クラスターを乱すことなく同量の馴化培地を各ウェルに静かに添加した。各反応について、合計10200個の生細胞をハイグロマイシン選択に供した。転移活性を、各反応についての細胞クラスターの総数をハイグロマイシン選択の6日後又は7日後に光学顕微鏡下で計数することによって決定した。
ヌクレオフェクションの1日前に、ヒト初代細胞(CD8+CD45RA+)をRPMI完全培地中で融解した。一晩の培養後に細胞を採取し、ヌクレオフェクションに供した。各ヌクレオフェクション反応については、合計2.2μgのDNAを用いて、20μlのオールインワンヌクレオフェクション緩衝液(GF1001、GenomeFrontier, Biosciences)中1×105個の細胞にトランスフェクトした。各DNA混合物は、合計2.2μgの量のDNAに対して0.8μgのヘルパープラスミド(すなわち、pCMV−HAhyPBase又はpCMV−ThyPLGMH)、様々な量のドナープラスミド(すなわち、mini−piggyBac_long、mini−piggyBac_short、micro−piggyBac_long又はmicro−piggyBac_short;最大のドナーの量を1.4μgと設定した)及びpcDNA3.1を含有するものであった。ヌクレオフェクションの24時間後に、各反応においてトランスフェクトした全細胞を、刺激物質(stimuli)(IL−2(50ug/ml)及びPHA)及びハイグロマイシン(1.0mg/ml)を添加した500ulのRPMI 1640完全培地中で培養した。転移活性を、ハイグロマイシン選択の22日後の生存細胞の総数を計数することによって決定した。
本実施例ではDNAドナー及びヘルパープラスミドの転移活性を分析した。結果を図1A〜図1Cに示す。
pCMV−ThyPLGMH及びmicro−piggyBacミニサークルの転移活性をJurkat T細胞において更に検査した。結果を図2A及び図2Bに示す。
上記の細胞株、すなわちHEK293細胞及びJurkat T細胞に加えて、特定のDNAドナー及びヘルパープラスミドの転移活性を初代ヒトT細胞において更に分析した。
Claims (12)
- 外来DNA配列を細胞のゲノムに組み込むin vitro方法であって、
(i)トランスポゾン系であって、
配列番号1からなる核酸配列を有する第1の逆方向反復、
前記第1の逆方向反復の下流の外来DNA配列、及び、
前記外来DNA配列の下流の第2の逆方向反復、ここで当該第2の逆方向反復は配列番号2からなる核酸配列を有する、を含有する第1のベクターと、
配列番号4のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第2のベクターと、
を含むトランスポゾン系を得ることと、
(ii)前記外来DNA配列が前記細胞のゲノムに組み込まれるように、前記第1のベクター及び前記第2のベクターを前記細胞に導入することと、
を含み、
前記細胞がT細胞であり、
前記第1のベクターが細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠くミニサークルDNAであり、前記トランスポザーゼが前記細胞中で発現され、前記第1のベクターからの前記外来DNA配列の切出し及び切り出された外来核酸の前記細胞のゲノムへの組込みを、細菌複製に必要とされる原核生物配列を含有する対応する第1のベクターから得られる転移有効性より高い転移有効性で触媒する、方法。 - 前記外来DNA配列が抗生物質耐性タンパク質、siRNA、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体又は自殺ポリペプチドをコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス40プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子1−αプロモーター、ヒトH1プロモーター及びU6プロモーターからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 導入工程の前に前記第1のベクターを線状化することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のベクター及び前記第2のベクターをリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学トランスフェクション、インペールフェクション、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス形質導入、又はデンドリマー、リポソーム若しくはカチオン性ポリマーによるトランスフェクションによって前記細胞に導入する、請求項1に記載の方法。
- 外来DNA配列を細胞のゲノムに組み込むためのキットであって、
容器と、
トランスポゾン系であって、
配列番号1からなる核酸配列を有する第1の逆方向反復、
前記第1の逆方向反復の下流の配列番号2からなる核酸配列を有する第2の逆方向反復、及び、
前記外来DNA配列を導入するための前記第1の逆方向反復と前記第2の逆方向反復との間のクローニング部位を含有する第1のベクターと、
配列番号4のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第2のベクターと、
を含むトランスポゾン系と、
前記容器に付随し、前記トランスポゾン系の使用方法を示す取扱説明書と、
を含み、
前記細胞がT細胞であり、
前記第1のベクターが、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠くミニサークルDNAであり、
前記トランスポザーゼが、前記第1のベクターからの前記外来DNA配列の切出し及び切り出された外来DNA配列の前記細胞のゲノムへの組込みを、細菌複製に必要とされる原核生物配列を含有する対応する第1のベクターから得られる転移有効性より高い転移有効性で触媒する、キット。 - 前記第2のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス40プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子1−αプロモーター、ヒトH1プロモーター及びU6プロモーターからなる群から選択される、請求項6に記載のキット。
- 前記第1のベクターが、前記第1の逆方向反復の下流かつ前記クローニング部位の上流に非原核生物プロモーターを更に含み、該非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス40プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子1−αプロモーター、ヒトH1プロモーター及びU6プロモーターからなる群から選択される、請求項6に記載のキット。
- 前記第1のベクターが、前記外来DNA配列に操作可能に連結した非原核生物プロモーターを更に含む、請求項2に記載の方法。
- 前記非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス40プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子1−αプロモーター、ヒトH1プロモーター及びU6プロモーターからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記第1のベクターが、エンハンサー、サイレンサー又はインシュレーターを更に含む、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞は好ましくはヒト細胞である、請求項1に記載の方法。
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