MX2007014139A

MX2007014139A - Piggybac como una herramienta para manipulacion genetica y analisis en vertebrados.

Info

Publication number: MX2007014139A
Application number: MX2007014139A
Authority: MX
Inventors: Sheng Ding; Tian Xu; Min Han; Yuan Zhuang; Xiaohui Wu; Gang Li
Original assignee: Univ Fudan
Priority date: 2005-05-14
Filing date: 2005-05-14
Publication date: 2008-10-09
Also published as: EP1896578A4; CN101297031B; CA2608481A1; IL187348A0; AU2005331864A1; EP1896578A1; JP2008545375A; CN101297031A; US20100154070A1; WO2006122442A1; BRPI0520212A2; NO20076465L

Abstract

La presente invención se refiere a células de vertebrados transgénicos, incluyendo mamíferos, cuyos genomas comprenden uno o más elementos del sistema de transposones de la familia piggyBac. También se proveen vertebrados no humanos transgénicos, incluyendo mamíferos no humanos transgénicos, cuyos genomas comprenden uno o más elementos del sistema de transposones de la familia piggyBac. Adicionalmente se proveen métodos para formar y usar las células y animales de la invención, incluyendo aplicaciones de los campos de medicina, veterinaria y agrícola. La presente invención también se refiere a equipos útiles para practicar dichos métodos.

Description

piggyBac COMO UNA HERRAMIENTA PARA MANIPULACIÓN GENÉTICA Y ANÁLISIS EN VERTEBRADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a células de vertebrados transgénicos , incluyendo mamíferos, y vertebrados no humanos transgénicos, incluyendo mamíferos no humanos, cuyos genomas comprenden uno o más elementos del sistema de transposón de familia piggyBac, y los métodos para formar y usar las células y animales. La presente invención también se refiere a quipos útiles para practicar dichos métodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los elementos Transposables o transposones son unidades genéticas móviles identificadas en muchos metazoarios, incluyendo gusanos, insectos y seres humanos. En los seres humanos y ratones, las secuencias derivadas de transposones cuentan para más del 40% del genoma (Lander y otros, · 2001, Nature 409: 860-921; aterston y otros, 2002, Nature 420:520-552), indicando la importancia de transposición en evolución. Dado que el descubrimiento del primer transposón en maíz por McClintock (McClintonck, 1950, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 36:344-345), los elementos transposables se han convertido en herramientas invaluables para análisis genético en muchos organismos. En procariotes, la mutagénesis asada en transposones ha conducido al descubrimiento de genes importantes para patogénesis microbianas (Hutchinson y otros, 1999, Science 286: 2165-2169; Vilen y otros, 2003, J. Virol. 77: Virol, 77: 123-134). En eucariontes, la introducción de transgénesis mediadas por elementos . P y mutagénesis insercional de genética de Drosophila dramáticamente avanzadas, son no funcionales fuera de sus huéspedes naturales, sugiriendo que los factores de huésped se implican en transposición (Handler y otros, 1993, Archiver of Insect Biochemistry & Physiology 22: 373-384). Los sistemas de transposones incluyendo miembros de la familia de Tcl/Mariner se han usado en ratones y pez cebra Danio rerio. Usando un enfoque filogenético comparativo, se ha probado que el transposón Sleeping Beauty (SB) similar a Tcl sintético es activo en células de ratones y humanos (Ivics y otros, 1997, Cell 91:6759-6764; Horie y otros, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 95: 10769-10773). Aunque los transposones tales como Sleeping Beauty y Minos se han probado para mutagénesis insercional en ratones ( Dupuy y otros, 2001, Génesis 30:82-88; Fischer y otros, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 98:6759-6764; Horie y otros, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 98:9191-9196; Zagoraiu y otros, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 98:11474-114-11478), una aplicación general de estos transposones en genética de ratones aún se limita debido al hecho de que las inserciones del transposón se han concentrado bastante cerca del sitio original y ocurrieron con bajas eficiencias (Drabek y otros, 2003, Genomics 81:108-111; Dupuy y otros, 2001, Génesis 30:82-88; Fischer y otros, 2001, Prac. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764; Horie y otros, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:9191-9196; Horie y otros, 2003, Mol. Cell Biol . 23:9189-9207; Zagoraiou y otros, 2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:11474-11478). Los elementos piggyBac son transposones de 2472 pb con repeticiones de terminales de 13 pb invertidas ("RTI") y una transposasa de 594 aminoácidos (Cary y otros, Virology, Volumen 161, 8-17,1989). Se ha mostrado que el elemento transposable de piggyBac de la palomilla del gusano de la col, Trichoplusia ni (Cary y otros, Virology, Volumen 161, 8-17, 1989) es un yector de transferencia de genes efectivo en la mosca de la fruta Mediterránea, Ceratitis capitata (Handler et al. Prac. Nat'l. Acad. Sci. USA, Volumen 95, 7520-7525, 1998). El uso de un auxiliar de transposasa no modificada bajo la regulación del promotor piggyBac indica que piggyBac retiene función autónoma en la moscamed, dado que se mantuvo que la regulación transcripcional, asi como actividad enzimática. Esta observación fue única dado que todas las transformaciones de la linea germinal de insectos exitosamente han limitado las especies de dipterana usando vectores aislados del mismo u otro dipterano. La transformación inicial de la moscamed (Loukeris y otros, Science, -Volumen 270,2002-2005, 1995) utilizó el vector Minos de Drosophila hydei (Franz & Savakis, Nucí. Acids Res., Volumen 19, 6646, 1991), y Aedes aegypti se ha transformado de Hermes (Jasinskiene y otros, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. USA, Volumen 95, 3743-3747, 1998) de Musca domestica (Warren y otros, Genet. Res. Camb., Volume 64, 87-97, 1994) y mariner (Coates y otros, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. USA, Volumen 95, 3748-3751, 1998) de Drosophila mauritiana (Jacobson y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, Volumen 83, 8684-8688, 1986). Drosophila melanogaster también se ha transformado de Hermes (O'Brochta y otros, Insect Biochem. Molec. Biol . , Volumen 26,739-753, 1996), mariner (Lidholm y otros, Genetics, Volumen 134,859-868, 1993), Minos (Franz y otros, Proc. Nat'l.. Acad. Sci. USA, Volumen 91, 4746-4750, 1994) y por los transposones de P y descubiertos originalmente en su propio genoma (Rubin and Spradling, 1989; Blackman y otros, EMBO J., Volumen 8, 211-217, 1989) . Drosophila virilis también se ha transformado de hobo (Lozovskaya y otros, Genetics, Volumen 143, 365-374, 1995; Gómez & Handler, Insect Mol. Biol., Volumen 6, 1-8, 1997) y mariner (Lohe y otros, Genetics, Volumen 143,365-374, 1996). Mientras la restricción para vectores dipteranos se debe en parte al número limitado de sistemas de transposones disponibles de especies o dipeteranos, limitaciones filogenéticas en función del transposón no es inesperado considerando los efectos perjudiciales que pueden tener los transposones funcionales en un genoma huésped. Además, se refleja por el alto nivel de regulación colocado en movimiento de transposón entre especies, entre cepas dentro de una especie huésped, y aunque entre los tipos de células dentro de un organismo (Berg & Howe, obile DNA, American Society for Microbiology, Washington, D.. C . 1989) . El píggyBac (PB) pertenece a transposones de ADN, loes elementos de los cuales se cortan generalmente de un sitio genómico y se integran en otro mediante un mecanismo de cortado y . pegado. Es un transposón 2472 pb con repeticiones terminales invertidas de 13 pb (RTI) y una transposasa de 594 aminoácidos (Cary y otros, 1989, Virology 172: 156-169; Fraser y otros, 1995, Virology 211:397-407; Fraser y otros, 1996, Insect Molecular Biology 5: 141-151) . Los elementos de piggyBac se han usado para análisis genético en Drosophila melanogaster y otros insectos. Se encontró que el transposón insertado en el sitio de tetranucleótido TTAA, que se duplica por la inserción (Frase y otros, 1995, Virology 211:397-407; Fraser y otros, 1996, Insect Molecular Biology 5:141-151). Debido a que la única transposasa y secuencias en el sitio blanco TTAA, se ha sugerido que el transposón es en miembro encontrado de una nueva familia de transposones de ADN, la familia piggyBac (Robertson, 2002, In Mobile DNA II, Craig y otros, eds. (Washington, D.C., ASM Press), págs. 1093-1220; Sumitani y otros 2003, 'insect Biochem. Mol. Biol. 33:449-458) . Como un mutágeno, piggyBac se transposiciona por lo menos tan efectivo como el elemento P en Drosophila (Thibault y otros, 2004, Nat. Genet . 36:283-287) . En el escarabajo de harina rojo Tribolium casteneum, la transposición de piggyBac también se presento eficientemente entre los cromosomas no homólogos (Lorenzen y otros, 2003, Insect Mol. Biol. 12:433-440) . Muchas secuencias similares a piggyBac se encontraron en los genomas por especies filogenéticamente diversas de hongos a mamífero, indica además que su actividad no puede restringirse a insectos (Sarkar y otros, 2003, Mol. Genet. Genomics 170:173-180). De hecho, piggyBac recientemente se ha mostrado capaz de transposicionar en la planaria Girardia tigrina (Gonzalez-Estevez y otros, 2003, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. USA 100:14046-14051) . La discusión y citas de una referencia en la presente no se deberá interpretar como admisión de que dicha referencia es la técnica anterior de la presente invención. 3. Sumario de la Invención La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que el piggyBac puede, transposicionarse eficientemente en vertebrados incluyendo mamíferos, células, tanto in vivo, y ex vivo-. La transposición de piggyBac ocurre casi exclusivamente en sitios de TTAA siguiendo una manera de cortado y pegado precisas. Cuando se introduce en huevos fertilizados, el transposón piggyBac podrían integrarse en el genoma del ratón sin las preferencias regionales de cromosomas obvias, y se insertaron preferiblemente en las unidades transcripcionales . También, los elementos de piggyBac pueden portar genes de marcadores múltiples y permiten la expresión de estos genes en varios sitios de inserción. Por lo tanto, el sistema de transposón de piggyBac, y otros miembros de la familia de transposón "similares a piggyBac" , son nuevas herramientas valiosas para manipulación genética eficiente y análisis en ratones y otros vertebrados . La presente invención provee métodos para formar vertebrados no humanos transgénicos que comprenden los genomas de una o más de sus células un transposón similar a ' piggyBac y/o una transposasa similar a piggyBac . Por lo tanto, los métodos para introducir los transposones similares a piggyBac y las transposasas en animales se proveen en la presente, como los métodos para movilizar o inmovilizar los transposones similares a piggyBac . En ciertas modalidades, la presente invención provee métodos para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, que comprende los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y (c) después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando el vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células el transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb. Como una alternativa para introducir ex vivo en el embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado de un ácido nucleico que comprende un transposón similar de piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, se puede introducir una pluralidad de ácidos nucleicos que comprender! porciones traslapantes de transposón similar a piggyBac, mientras el traslapamiento es suficiente para que tome lugar la recombinación homologa dentro de la célula en la cual se introducen los ácidos nucleicos. Esta alternativa es particularmente útil para introducirla en el genoma de un transposón similar a piggyBac que porta un inserto grande. Por lo tanto, en dichas modalidades, un primer ácido nucleico podría contener la terminal izquierda del transposón similar a piggyBac y por lo menos una porción del inserto y un segundo ácido nucleico podría contener la. terminal derecha del transposón similar a piggyBac y por lo menos una porción del inserto. Si solo se usan dos ácidos nucleicos, la porción del ' inserto contenido por el primer ácido nucleico y la porción del inserto contenido por el segundo traslapamiento del ácido nucleico. Si se usa un tercer ácido nucleico, el tercer ácido nucleico podría tener regiones para traslaparse con el primer ácido nucleico en un extremo y con el segundo ácido nucleico en el otro extremo. La Fig. 14B ilustra dicha modalidad. Este principio de recombinación homologa con múltiples ácidos nucleicos traslapantes (v.gr., dos, tres cuatro, cinco, seis, o más) se puede aplicar para introducirlo en los genomas de células vertebradas y organismos de transposomas similares a piggyBac con grandes insertos . La presente invención también provee un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de uno o más de sus células un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica un rasgo en dicho vertebrado no humano transgénico, que comprende los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano oocito fertilizado un ácido nucleico que comprende un transposón similar, a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica un rasgo en dicho vertebrado no humano transgénico, y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) implantando el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión de un vertebrado no humano transgénico; y (c) después de un periodo de tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando el vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células del transposón similar a piggyBac, dicho transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica un rasgo en dicho vertebrado no humano transgénico. La presente invención además provee métodos para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac está ¦ dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado un ácido nucleico linearizado que comprende un transposón similar a piggyBac y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasá similar a piggyBac; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorece el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, que recupera el vertebrado no humano transgénico de la madre, generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasá similar a piggyBac, en donde la secuencia de nucleótido que codifica la transposasá similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBa c. La presente invención además provee métodos para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado, que' comprende los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado (i) un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac; y (ii) el polipéptido de transposasa similar a piggyBac en una cantidad efectiva para inducir la integración de dicho transposón de piggyBac en el genoma de una o más células de dicho embrión o en el genoma de dicho oocito o una o más células de un embrión derivada del mismo, respectivamente; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen en desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y 'c) después de un periodo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, que recupera el vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado. La presente invención además debe proveer métodos para generar una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, que comprende lo pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrado en cultivo un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales la transposasa similar a piggyBac se expresa de manera que él transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrado en el cultivo, generando asi una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb . Como una alternativa para introducir en una célula de vertebrado en cultivo un ácido nucleico que comprenden transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, una pluralidad de ácidos nucleicos que comprenden porciones traslapantes del transposón similar a piggyBac pueden introducirse, mientras el traslapamiento sea suficiente para que la recombinación homologa tome lugar dentro de la célula en la cual se introducen los ácidos nucleicos. Como se describió antes, usando múltiples ácidos nucleicos comprendiendo solo porciones de transposones similares a piggyBac y sus insertos, esta alternativa es particularmente útil para generar e introducir en el genoma de una célula un transposón similar a piggyBac que porta un inserto grande. La presente invención aún provee métodos para generar una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de invertebrado, comprendiendo los pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrado en cultivo un ácido nucleico que comprende un transposón similar a. piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina, de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrado, y, dentro del mismo o un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) cultivar dichas célula bajo, condiciones en las cuales la transposasa similar a piggyBac se expresa de manera que el transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrado 'en cultivo, generando asi una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBa c .

La presente invención aún provee métodos para generar una célula de vertebrados recombinante en cultivo cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac, que comprende los pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrados en cultivo un ácido nucleico linearizado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, y (b) cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales la secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrados en cultivo, generando asi una célula de vertebrados recombinante en cultivo cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica dicha transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac . La presente invención aún provee métodos de movilización de un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un ' primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de uno o más de sus células germinales un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, con un segundo vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células germinales una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos una o más progenies del paso (a) que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto del transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que. codifica la transposasa similar a piggyBac, de manera que se expresa la transposasa similar a piggyBac y el transposón se inmoviliza; movilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano. El primero y segundo vertebrados no humanos transgénicos pueden generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. La presente invención aún provee métodos para movilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende el genoma de en una o más de sus células germinales un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac, con un segundo vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de ' sus células germinales una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos uno de dichas una o más progenies del paso (a) que comprende en el genoma de una o más de sus células dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, de manera que se expresa la transposasa similar a piggyBac y el transposón se moviliza; movilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano. Los primero y segundo vertebrados no humanos transgénico pueden generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. La presente invención además provee métodos de inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear el primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células (i) un transposón similar a piggyBac que comprende un inserto de por lo menos 2 kb y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifican una transposasa similar a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies (b) identificar por lo menos uno de una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifican la transposasa similar a piggyBac, y comprende en el genoma de una o mas de sus células un transposon similar a piggyBac, tal como el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano. El primer vertebrado no humano transgénico puede generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. El segundo vertebrado, no humano transgénico no es necesariamente un animal transgénico; sin embargó., si es transgénico, entonces puede generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la misma. La presente invención . provee aún métodos para inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto (i) un transposón similar a piggyBac que comprende un inserto de por lo menos 2 kb y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar .a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies; (b) identificando por lo menos una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, y comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a 'piggyBac, de manera que el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano. El primer vertebrado no humano transgénico puede generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. El segundo vertebrado no humano transgénico no es necesariamente un animal transgénico; sin embargo, si es transgénico, entonces puede generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descrita en la presente. La presente invención además provee métodos para inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica un rasgo en dicho vertebrado no humano transgénico y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, y comprende ' en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, de manera que el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano. El primer vertebrado no humano transgénico puede generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. La presente invención además provee métodos para inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto (i) un transposón similar a piggyBac en donde el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, y comprende en el genoma de una o más de sus células un transpósón similar a piggyBac, de manera que el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano. El primer vertebrado no humano transgénico puede generarse de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. La presente invención aún provee además métodos para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o mas de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado, el método comprendiendo los pasos de: (a) generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una pluralidad de sus células de liheas germinales tanto (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac operablemente ligada a un promotor que se- expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno de dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótido que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac, que comprende los pasos de: introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado uno o mas ácidos nucleicos, uno o más de dichos ácidos nucleicos comprendiendo (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno de .uno o más ácidos nucleicos se lineariza; implantar el embrión de vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperar un vertebrado no humano transgénico de la madre que comprende en el genoma de una pluralidad de süs células de linea germinal (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de . nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno del transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótido que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) permitir que el vertebrado no humano transgénico recuperado del paso (a) crezca en su adultez; (c) aparear al vertebrado no humano transgénico adulto del paso (b) un segundo vertebrado adulto dando una más progenies; (d) identificar por lo menos una o más progenies del paso (c) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos codificando la transposasa similar a piggyBac ligada al promotor que se expresa en la linea germinal, y comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, en donde una o más progenies en cada vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado; generando así un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado. La presente invención provee además métodos para generar un banco de vertebrados no humanos transgénicos , cada uno de los cuales comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado, el método comprendiendo los pasos de: (a) generar un vertebrado no humano transgénico ¦ que comprende en el genoma una pluralidad de sus células de línea germinal (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a un promotor que se expresa en la línea ¦ germinal, en donde por lo menos uno de dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos codificando la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac, comprendiendo los pasos de: introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado uno o más ácidos nucleicos, dichos uno o más ácidos nucleicos comprendiendo (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno o más de dichos ácidos nucleicos se lineariza; implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y después de .un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión de un vertebrado no humano transgénico, recuperar un vertebrado no humano transgénico de la madre que comprende en el genoma de una pluralidad de sus células de la linea germinal (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar piggyBac ligada operablemente a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno del transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una- pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) permitir que el vertebrado no humano transgénico recuperado del paso (a) crezca hasta adulto; (c) , aparear el vertebrado no humano transgénico adulto del paso (b) con un segundo vertebrado adulto para dar una pluralidad de progenie; (d) identificar dos o más progenies del paso (c) , cada uno. de los cuales no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac ligada operablemente al promotor que se expresa en la linea germinal y comprende en el genoma de una o más de sus células un 'transposón similar a piggyBac, en donde dicha una o más progenies es cada una un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizada, generando asi un banco de vertebrados no humanos transgénicos, cada uno comprendiendo en el genoma de una o mas de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado . En ciertos aspectos, la presente invención además provee un vertebrado no humano transgénico, que comprende en el 'genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac y/o una transposasa similar a piggyBac . En ciertas modalidades el transposón porta un inserto de por lo menos 1.5 k; comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica un rasgo en dicho vertebrado no humano transgénico; y/o está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBa c .

En ciertos aspectos, la presente invención además provee una célula de vertebrado en cultivo que comprende en su genoma un transposón similar a piggyBac y/o una transposasa similar a piggyBac. En ciertas modalidades, el transposón porta un inserto de por lo menos 1.5 kb; comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica un rasgo en un vertebrado no humano transgénico; está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac; y/o comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteina de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrados . ¦ La presente invención además provee bancos de vertebrados no humanos transgénicos o células de vertebrados en cultivo descritas en la presente. En ciertas modalidades, los bancos se producen por loes métodos de la invención. En ciertas modalidades, un banco de vertebrados no humanos transgénicos comprende por lo menos 6, por lo menos 20, por lo menos 50 o por lo menos 100 miembros, por lo menos algunos, o de preferencia todos, de los cuales contienen un transposón similar a piggyBac en una posición diferente en el genoma. Un banco de células de vertebradas en cultivo, en •ciertas modalidades, comprende por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 100 miembros o por lo menos 1000 miembros, por lo menos algunos, o preferiblemente todos, de los cuales contienen un transposón similar a piggyBac en una posición diferente en el genoma. Por lo tanto, en ciertas modalidades, la presente invención provee bancos de vertebrados no humanos transgénicos o célula de vertebrados en cultivos, los genomas que contienen los transposones similares a piggyBac, en donde los transposones portan un inserto de por lo menos 1.5 kb; comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteina que modifica un rasgo en un vertebrado no humano transgénico ; están dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac; y/o comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteina de valor en el tratamiento o prevención de una ..enfermedad o trastorno de vertebrados . Los métodos y composiciones de la invención son útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención provee métodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno, dicho método comprendiendo el paso de administrar una célula de vertebrado recombinante cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de la enfermedad o trastorno de vertebrado a un sujeto que necesita de dicho tratamiento o prevención.

En otros aspectos, la presente invención provee métodos para suministrar un '+acido nucleico que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de un trastorno de vertebrados en una o más células de un sujeto que necesita de dicho tratamiento o prevención, dicho método comprendiendo el paso de administrar un virus recombinante cuyo genoma comprende (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótido que codifican dicha proteina y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a un promotor que dirige la expresión de la transposasa similar a piggyBac en dichas una o más células de dicho sujeto, tal como el transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de dichas una o más células de dicho sujeto que sigue dicha administración, suministrando si un ácido nucleico u codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de un trastorno vertebrado a un sujeto que necesita de dicho tratamiento .o prevención. En ciertas modalidades, el virus puede ser un retrovirus, un adenovirus, o un virus adenoasociado . La presente invención además provee un virus recombinante, v.gr., un retrovirus, un adenovirus, o un virus adenoasociado, cuyo genoma comprende (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteina y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente aun promotor.. Debido a la eliminación precisa de transposones similares a piggyBac, los métodos presentes pueden ser útiles para determinar si un fenotipo exhibido por un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac se ocasiona por el transposón similar a piggyBac . En ciertos aspectos, dichos métodos comprenden los pasos de: (a) genera r una o más progenies de dicho vertebrado no humano transgénico en el cual se extirpa el- transposón similar a piggyBac; b) determinando si existe una correlación entre la eliminación de dicho transposón similar a piggyBac en dicha progenie y una reversión del fenotipo, en donde una correlación indica que el fenotipo se ocasiona por el transposón similar a piggyBac, determinando asi si un fenotipo exhibido por un vertebrado no humano transgénico comprendiendo en el genoma de una o más de sus células, un transposón similar a piggyBac ocasionado por el transposón similar a piggyBac . Los transposones similares a piggyBac de la invención son útiles para atrapar el mejorador. Por lo tanto, la presente invención provee métodos para aislar un mejorador de un vertebrado no humano o de una célula de vertebrado en cultivo. En ciertos aspectos, los métodos comprenden los pasos de: (a) evaluar un vertebrado no humano transgénico que comprende el genoma de una o más de sus células o tejidos un transposón similar a piggyBac en donde el transposón comprende un gen reportero bajo el control de un promotor mínimo, la expresión del gen reportero en dichas una o más células o tejidos del vertebrado no humano transgénico de la descendencia derivada del mismo; y (b) aislar un ácido nucleico que flanquea dicho transposón similar a piggyBac que es responsable de la expresión del gen reportero en dichas una o más células o tejidos; aislando así un mejorador de un vertebrado no humano. En otros aspectos, los métodos útiles para aislar un mejorador de una célula de vertebrados recombinantes en cultivos, en donde la célula recombinante comprende el transposón similar a piggyBac que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor . mínimo, comprende los pasos de: (a) evaluar la expresión del gen reportero en dicha célula de vertebrado recombinante o su progenie; y (b) aislar un ácido nucleico que flanquea dicho transposón similar a piggyBac que es responsable de la expresión del gen reportero en células de vertebrados recombinantes; aislando así un mejorador de una célula de vertebrado recombinante en cultivo. Los métodos de la invención son un método útil para generar animales de vertebrados no humanos quiméricos. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención provee métodos para generar vertebrados no humanos transgénicos cuyas células son mosaico para un transposón similar a piggyBac, que comprende los pasos de: (a) generar un embrión no humano transgénico que comprende dentro de su genoma (i) un sitio genético homocigoto para un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón . similar a piggyBac comprende una secuencia de reconocimiento de recombinasa especifica para sitio, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica dicha recombinasa especifica para el sitio ligado operablemente a un promotor; (b) cultivar el embrión no humano transgénico bajo condiciones en las cuales la recombinasa especifica para sitio se expresa y ocurre la proliferación; generando asi un vertebrado transgénico no humano que cuyas células son mosaico de un transposón similar a piggyBac . Los animales quiméricos producidos por dichos métodos también se abarcan por la presente invención. La presente invención además provee equipos que comprenden materiales adecuados para practicar la invención. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la invención provee equipos que comprenden (a) en uno o mas recipientes, uno o más ácidos nucleicos que comprenden (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifican una transposasa similar a piggyBac; y (b) en un segundo recipiente, (i) una célula de vertebrados en cultivo o (ii) o un oocito de vertebrados no humanos. En dichas modalidades especificas, el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 1.5 kb y/o porta un inserto que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrado. En ciertos aspectos, se lineariza por lo menos un ácido nucleico en un equipo de la invención. En ciertas modalidades de los métodos y composiciones reclamadas en la presente, el transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos dentro de un concatámero, comprendiendo una pluralidad de transposones similares de piggyBac . En ciertos aspectos de os métodos y composiciones reclamados en la presente, el ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac se lineariza, de manera que el genoma de una o más de dichas células comprende el transposón similar a piggyBac dentro de un concatámero, comprendiendo una pluralidad e transposones similares a piggyBac . En aún otros aspectos de los métodos y composiciones reclamadas en la presente, el ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac se lineariza, de manera' que el genoma de una o más de dichas células comprende el transposón similar a piggyBac dentro de un concatámero, comprendiendo una pluralidad de transposones similares a piggyBac. En aún otros aspectos de los métodos y composiciones reclamadas en la presente, el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican la transposasa similar a piggyBac se lineariza, de manera ~que el genoma de una o más células comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBa-c dentro de un concatámero, el concatámero comprendiendo una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac. En aún otros aspectos de los métodos y composiciones reclamadas en la presente, el transposón similar a piggyBac comprende una secuencia reconocida por una proteina que se une a y/o modifica ácidos nucleicos. En ciertas modalidades, la proteina de modificación de ácidos nucleicos es una proteina de unión de ADN, una proteina de modificación de ADN, una proteina de unión de ARN o una proteina de modificación de ARN.. La proteina de modificación de ácidos ' nucleicos también puede ser un sitio blanco para una recombinasa especifica para sitios, por ejemplo, un sitio blanco para FRT o recombinasa Lox. En aún otros aspectos de los · métodos y composiciones de la invención, el transposón similar a piggyBac comprende un marcador seleccionable . En aún otros aspectos, el transposón similar a .piggyBac comprende un gen reportero. En una modalidad especifica, el transposón similar a. piggyBac comprende un ' marcador seleccionable y un gen reportero. En otra modalidad especifica, el gen reportero es endógeno a las especies a las cuales se introduce el transposón . En aún otros aspectos de los método y composiciones de la invención, el transposón similar a piggyBac comprende un inserto de por lo menos 0.5 kb, por lo menos 1 kb, o por lo menos 1.5 kb . En otras modalidades, el transposón similar a piggyBac comprende un inserto de por lo menos 2 kb, por lo menos 2.5 kb, por lo menos 3 kb, por lo .menos 4 kb, por lo menos 5 kb, por lo menos 6 kb, por lo menos 7 kb, por lo menos 8 kb, por lo menos 9 kb, por lo menos 10 kb, por lo menos 11 kb, por lo menos 11.5 kb, por lo menos 13 kb, por lo menos 14 kb, o por lo menos 15 kb. En otras modalidades especificas, el -transposón similar a piggyBac comprende un inserto no mayor a 15 kb, no mayor a 20 kb, no mayor a 25 kb, no mayor a 30 kb, no mayor a 35 kb, no mayor a 40 kb, no mayor a 45 kb, no mayor a 50 kb, no mayor a 60 kb, no mayor a 75 kb, o no mayor a 100 kb. En aún otras modalidades especificas, el transposón similar a piggyBac. comprende un inserto que varia entre 1.5-3 kb, 1.5-5 kb, 1.5-10 kb, 1.5-20 kb, 1.5-30 kb, 1.5-50 kb, 1.5-75 kb, 2-5 kb, 2-10 kb, 2-20 kb, 2-30 kb, 2-50 kb, 2-75 kb, 3-5 kb, 3-10 kb, 3-20 kb, 3-30 kb, 3-50 kb, 3-75 kb, 5-10 kb, 5-20 kb, 5-30 kb, 5-50 kb, 5-75 kb, 10-20 kb, 10-30 kb, 10-50 kb, o 10-75 kb. En donde los métodos o composiciones de la invención abarcan la introducción de un transposón similar a piggyBac y una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa piggyBac en una célula u organismo, el transposón similar a piggyBac y la secuencia de nucleótidos que codifican la transposasa similar piggyBac puede estar dentro del mismo ácido nucleico o un ácido nucleico separado. En un a modalidad en donde el transposón y la transposasa que codifica la región están en ácidos nucleicos separados, el ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac es ADN y el ácido nucleico que comprende la transposasa similar a piggyBac es ARN, permitiendo que el transposón, similar a piggyBac sea inmovilizado en el genoma de dicha célula u organismo. Alternativamente, los ácidos nucleicos que comprenden el transposón similar a piggyBac y la transposasa similar de piggyBac pueden ser ambos ADN, permitiendo la generación de una célula u organismo cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac . Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac se liga "operablemente a un promotor. En una modalidad, el promotor dirige la expresión de la transposasa en la linea germinal, por ejemplo es un promotor ubicuito, o más preferiblemente, es un promotor especifico para linea germinal. En una modalidad, el promotor especifico de la linea germinal es un promotor especifico para hombres (v.gr., promotor Protamina 1 (Prm), como se describió en la presente) . En otra modalidad, el promotor especifico para la linea germinal es' un promotor especifico para hembras (v.gr., un promotor ZP3) . Los sujetos de los métodos terapéuticos y profilácticos de la invención preferiblemente son vertebrados no humanos. En modalidades preferidas, el sujeto es un animal humano o no humano. En modalidades especificas, el animal es una mascota (v.gr., gatos, perros) o un animal de ganado (vaca, caballo) . En ciertas modalidades, él vertebrado no humano transgénico de la invención es un ave (v.gr, pollo u otras aves), o pez (v.gr., pez cebra). En otras modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano, incluyendo pero no limitado a primate no humano, vaca, gato, perro, caballo, ovejas, ratones, ratas, conejillos de la india, panda y cerdo. En una modalidad específica, el vertebrado no humano transgénico es un animal de ganado. La célula recombinante de la invención puede ser cualquier célula de vertebrados. En modalidades específicas,, la célula es de origen de un ave (v.gr., pollo u otra ave) o pez (v.gr., pez cebra). En otras modalidades, la célula es de origen mamífero, incluyendo pero no limitado a primates (incluyendo pero no limitado a células humanas y células de chimpancé) , vaca, gato, perro, caballo, ovejas, ratones, • rata, conejillo de la india, hámster, búfalo, panda cerdo. En otras modalidades, la célula es una célula fe ranas, v.gr., una célula de Xenopus laevis. En una modalidad especifica, el origen de la célula es de un animal de ganado. La célula puede ser normal o enferma, y de cualquier tipo de diferenciación o estado. En ciertas modalidades de la presente invención, los ácido nucleicos que contienen el transposón y/o secuencia de codificación de transposasa similar a piggyBac se linearizan antes de su introducción en una célula u organismo, de manera que el ácido nucleico se inserta al genoma de dicho organismo como un concatámero. Preferiblemente, el transposón similar a piggyBac empleado en los métodos y composiciones de la invención es un transposón de piggyBac, y/o transposasa similar a piggyBac es una transposasa de piggyBac . La presente invención también provee modalidades que cubren cualquiera y otras las permutaciones de las características descritas en la presente. Todos los valores y escalas entre .todos los valores listados en la presente, por ejemplo con respecto al tamaño de inserto de transposón similar a piggyBac o tamaño de bancos de células/organismos, también se abarcan por la presente invención. 4. Breve Descripción de la Invención Figs. 1A y IB. Los vectores de transposón y construcciones de transposasa del sistema de transposón binario piggyBac para células de mamíferos y ratones. (Fig. 1A) Construcciones donadoras de PB . Los genes marcador o endógeno (casillas sombreadas con flechas que denotan la dirección de transcripción) impulsadas por varios promotores se colocaron entre un par de terminaciones de repetición de PB (PBL y PBR, flechas negras) . Las cabezas de las flechas por arriba de las terminaciones muestran las posiciones relativas de iniciadores usadas para RCP inversa. Las longitudes totales de los transposones también se indican. Las casillas abiertas representan las secuencias de la estructura del plásmido. M: Mfel ; B: BamHI ; S. SwaI; A: AscI; H: HindIII. (Fig. IB) construcciones auxiliares de transposasa de PB . El gen de transposasa piggyBac (PBase) impulsada por promotores de citomegalovirus (CMV) , beta-actina (act) , o Prptamina 1 (Prml) se siguió por cualquiera de hormona de crecimiento de ovinos polyA (BGHpA) o betaglobina de conejo polyA (rBG pA) . Figs. 2A a 2C. La integración de piggyBac en células cultivadas de mamíferos. (Fig. 2A) Resultados estadísticos de integración de transgenes mejorada en 293 células. Los números de clones resistentes a G418 se clasificaron de las transíecciones de construcción de transposón de donadores con o sin plásmidos auxiliares. Cada número es el promedio obtenido de tres experimentos de transfección . La barra muestra la desviación normal (P < 0.0001) . (Fig. 2B) Resultados estadísticos de integración de transgenes mejorada en células de ratones W4/129S6. Los clones se contaron como en (a) . (Fig. 2C) Un ejemplo de experimentos de transfección de células eS de ratones. Los clones sobrevivientes se tiñeron con azul de metileno después de selección de G418. Figs . 3A a 3C. Transposición de elementos de piggyBac en ratones. (Fig. 3A) Relación de fundadores positivos para transposones determinados por RCP que realiza genotipificación entre todas las cría que resultan de la inyección de plásmidos circulares. Las barras sólidas y barras abiertas representan los resultados de las coinyecciones del plásmido donador y auxiliar o inyecciones del o plásmido donador solo, respectivamente. La presencia de la transposasa de PB dio como resultado una eficiencia transgénica elevada. (Fig. 3B) Análisis de Southern de fundadores positivos de PB[Act-RFT] . En algunos casos, se observaron más de 10 integraciones en un ratón fundador (AFO-41) solo, mientras que no se encontraron señales en el control de tipo silvestre. (Fig. 3C) El análisis de Southern indicó transmisión de la línea germinal de elementos de PB. Después de aparearse con animales tipo silvestre, los fundadores y sus progenies se analizaron. Múltiples integraciones de PB [Act-RFP] en un fundador macho (AFO-61) se segregaron en su descendencia. Un fundador de PB [Act-RFP] hembra (AFO-47) que porta una sola integración de transposición de PB [Act-RFP] solos (juzgado por Southern y el resultado de RCP inverso, A47T6 en la Tabla 3) también transmitió su transposón a una de su progenie (47-336) . Figs . 4A a 4C. Eliminación y transposición precisa de piggyBac en línea germinal de ratones. Un ratón fundador macho co-inyectado con Prml-PBase y PB [Act-RFP] se usaron para analizar la transposición de la línea germinal. (Fig. 4A) Estructura elevadas del transposón PB [Act-RFP]. El ADN genómico se representa por líneas curvas, mientras el concatámero de plásmidos que contienen transposón de PB se muestra en casillas alineadas. Sitios de restricción: : MluI , E: EcoRV, B: BglII, A: Acc65I . La posición de la sonda para análisis de Southern se ilustra por la línea sólida. Los iniciadores usados para detectar eventos de eliminación se muestran como cabezas de flechas. (Fig. 4B) . Análisis de Southern de un fundador (BFO-33) y su progenie reveló bandas diferentes a la señal de concatámero de 1.3 kb, implicando así la ocurrencia de la transposición de la línea germinal. (Fig. 4C) Bandas positivas con longitud esperada de eliminación precisa se observaron en varias progenies después de la amplificación de RCP con los iniciadores mostrados en la (Fig. 4A) . Figs . 5A a 5D. Expresión de transgenes en vectores piggyBac (Fig. 5A) Expresión de PB[Act-RFP] en las progenies que dieron como resultado fluorescencia roja bajo la iluminación de una luz UV de onda larga portátil . Dos ratones positivos que portan el mismo transposón de una sola copia (flechas) y se muestran dos carnadas negativas (estrellas) . (Fig. 5B) expresión de PB[Act-RFP] en un ratón fundador y su progenie. La fluorescencia roja fue de mosaico en el fundador. La segregación de transposones en la progenie dieron como resultado diferentes intensidades de señal de RFP . El asterisco marca las carnadas negativas de transgenes. (Fig. 5C) y (Fig. 4D) La co-expresión de dos transgenes en el mismo vector de piggyBac. Como resultado de la expresión de tirosinasa, un fundador de PB[K14-Tyr, Act-RFP] muestra color de cubierta gris bajo luz blanca, mientras que la carnada negativa de transgenes permanece albina (Fig. 5C, derecha e izquierda, respectivamente) . Cuando se iluminan por UV, se observa fluorescencia roja desde su fundador (Fig. 5D) . Figs. 6A a 6E. Sitios de integración de piggyBac en ratón. (Fig. 6A) Composición de nucleótidos de secuencias de flanqueo de sitios de integración de 100 PB . Además de la especificidad de sitios blanco De TTAA, se observó un enriquecimiento de Ts y As en las secuencias de flanqueo. Los asteriscos denotan P <0.05 cundo se compara con la secuencia de flanqueo del control de TTAA muestreado aleatoriamente. (Fig. 6B) Distribución de inserciones de PB en genes. Los porcentajes de las inserciones de pB localizadas en exones, ' intrones, secuencias reguladoras 5' (10 kb adyacentes al sitio de inicio de transcripción), secuencias reguladoras 3' (10 kb adyacentes al sitio poliA) , y se ilustran en las cuatro regiones (total) . Las barras sólidas indican datos de todos los genes conocidos y previstos y las barras vacías indicaron datos de los genes conocidos o EST. (Fig. 6C) Distribución de inserciones de PB en regiones 5'. (Fig. 6D) Distribución de inserciones de PB en regiones 3'. (Fig. 6E) Análisis de sitios de integración 93 en ratones mostraron que las integraciones de PB parecieron señalar todos pero los dos cromosomas más pequeños (19 e Y) . Las cabezas de las flechas llenas indican señalamientos en exones, las cabezas de flechas obscuras indican los señalamientos en intrones, las cabezas de flechas vacías indican señalamientos en regiones intergénicas previstas. Fig. 7. Integración de piggyBac mejorada en varias líneas celulares de mamíferos. Fig. 8. piggyBac puede transposicionarse en diferentes especies. Fig. 9. piggyBac puede eliminar y transposicionarse en células somáticas de ratones. Los ratones doblemente positivos para la Base de Act-P y un concatámero de PB se obtuvo mediante cruza. RCP con los iniciadores de flanqueo de PB detectaron las eliminaciones de los transposones de sus sitios originales. Nuevas inserciones de transposón se revelaron además por RCP inversa del mismo individuo. Estos eventos no se detectaron en sus padres positivos solos de pB . Dado que el ADN se extrajo de la muestra final, las eliminaciones y transposiciones se espera que suceda en células somáticas. Fig . 10. La transposición por co-inyección de transposón de piggyBac con la construcción de transposasa Pmr-piggyBac . Figs . 11A a 11C. La transposición por cruza. Fig. 11A. Un promotor (prm) específico para línea terminal macho se probó además con la estrategia cruzada. El transposón de piggyBac portadora de ratones se cruzaron con ratones que portan el transgene de Pmr-P Base, los resultados que muestran que una estrategia de entrelazamiento puede usarse para inducir nuevas transposiciones. Fig. 11B. Ratones doblemente positivos para la Base Act-P y un concatámero de PB se cruzaron con ratones tipo silvestre. Los nuevos eventos de transposición se detectaron en las progenies de esta cruza por RCP inversa y análisis de Southern. Las tres transposiciones nuevas probadas podrían transmitirse establemente a la siguiente generación. Fig. 11C. Un ratón macho doblemente positivo para Pmr-P base y un concatámero de PB (DFO-9) produjo activamente la progenie que porta nuevas inserciones de transposón (como se reveló por Southern en el panel izquierdo y RCP inversa) . Aproximadamente el 50% de las nuevas inserciones se localizaron cerca del sitio original putativo en el cromosoma cuatro, lo cual sugiere que el salto local puede suceder cuando salta el PB . Los ratones que portan los transposones de PB no autónomo (concatámero de una sola copia) se cruzaron con los ratones que portan la transposasa (v.gr., Pmr-P Ase que expresa la transposasa específicamente en la línea germinal de ratones) . Los ratones Fl doblemente positivos de transposón/transposasa (solo ratones macho en el caso de Pmr-PBase) , se cruzaron con ratones de tipo silvestre. En la siguiente generación (F2), se uso análisis de Southern y RCP inversa para clonar los nuevos sitios de transposición. Usando Pmr-pbase y Act-Pbase, se obtuvieron nuevas inserciones en cada una de las recombinaciones tratadas, aun cuando los ratones que portan una sola copia de transposón se usaron con una línea iniciadora. Una de las transposiciones analizadas originadas en el cromosoma 5 y posadas en el cromosoma 1. Figs . 12A y 12B. Las inserciones de piggyBac reportan patrones de expresión de genes. Los transposones de piggyBac que contienen lacZ reportan los patrones de expresión de los genes en los cuales se insertan. Dos Ejemplos: inserciones en F27ÍR43 (Fig. 12A) y en GrblO (Gif. 12) . En la Fig. 12B, se muestran los resultados de un vector de trampa de exones basado en PB que porta un gen reportero de LacZ. Cuando el transposón insertado en el primer intron de GrblO, la tinción de LacZ de los embriones de ratones mostraron el patrón de expresión de Brb20 compatible con los resultados reportados por otros. Figs . 13A a 13B. Las inserciones de piggyBac pueden ocasionar fenotipos en ratones. Dos Ejemplos: Inserciones en gen Pkd2 ocasiona letalidad embriónica (recesiva, ocasionando hemorragia focal y edema corporal completo en embriones homocigotos Pkd2) (Fig. 13A a 13B) y en el gen Eyal ocasiona defecto en ojos (dominante (Fig. 13B) , tal como ratones mutantes generados por métodos de eliminación tradicionales. Figs. 14A y 14B. Ilustra el uso del sistema del transposón similar a piggyBac para insertar grandes piezas de ADN en genomas de vertebrados. La Fig. 14A muestra un plásmido, un cósmido, un fragmento de Pl o un fragmento de BAC que porta uno o más genes (representados por flechas obscuras) y se clona en las repeticiones de terminales invertidas (RTI) de un transposón similar a piggyBac. En presencia de una transposasa similar a piggyBac (círculos) , todo el cásete podría integrarse en el genoma (línea sólida) por transposición. Alternativamente, como se muestra en la Fig. 14B, una región de cromosomas grande se cortó en varios fragmentos traslapantes parciales, con dos piezas externas portando cada una RTI similar a piggyBac. En presencia de transposasa similar a piggyBac, estos fragmentos podrían integrarse en el genoma (línea sólida) por transposición y recombinación homologa. 5.- Descripción Detallada de la Invención La presente invención provee aplicaciones de sistemas de transposón similar a piggyBac en células de vertebrados y organismos vertebrados no humanos. La invención provee células de vertebrados y organismos no humanos tratados para expresar componentes del sistema de transposones similares a piggyBac, métodos para formar dichas células y organismos, bancos de dichas células y organismos tratados . La invención se refiere a la introducción del transposón similar a piggyBac de la invención al genoma de una célula. La incorporación eficiente del transposón ocurre cuando la célula también contiene una transposasa similar a piggyBac. Como se trató antes, la transposasa similar a piggyBac puede proveerse a la célula como proteína de transposasa similar a piggyBac o como un ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac. El ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac puede tener la forma de ARN o ADN. Además, el ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac puede tener la forma de ARN o AD . Además, el ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac puede incorporarse estable o temporalmente en la célula para facilitar la expresión temporal o prolongada de la transposasa similar a piggyBac en la célula. Además, los promotores u otras regiones de control de expresión pueden ligarse operablemente con el ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac para regular la expresión de la proteína en una forma cuantitativa o específica para tejido. El transposón similar a piggyBac de esta invención puede introducirse en una o más células usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la materia tales como, pero no limitado a microinyección, combinando un ácido nucleico que comprende el transposón con vesículas de lípidos, tales como vesículas de lípidos catiónicos, bombardeo de partículas, electroporación, reactivos de condensación de ADN (v.gr., fosfato de calcio, polilisina o polietilenimina) o incorporando el transposón en un vector viral y poniendo en contacto el vector viral con la célula. En donde se usa un vector viral, el vector viral puede incluir cualquiera de una variedad de vectores virales conocidos en la materia incluyendo vectores virales seleccionados del grupo que consiste de un vector retroviral, un vector de adenovirus o un vector viral adeno-asociado .

El sistema de transposón similar a piggyBac de esta invención se puede usar fácilmente para producir animales transgénicos que portan un marcador particular o expresan una proteína particular en una o más células del animal. Los métodos para producir animales transgénicos se conocen en la materia . En otra aplicación de esta invención, la invención provee un método para movilizar una secuencia similar a piggyBac en una célula. En este método el transposón similar a piggyBac se incorpora en ADN en una célula. La transposasa similar a piggyBac o ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac se introduce en la célula y la proteína puede movilizar (es decir, se mueve) el fragmento de ácido nucleico de una primera posición dentro del ADN de la célula a una segunda posición con el ADN de la célula. El método permite el movimiento del fragmento del ácido nucleico de una ubicación en el genoma a otra ubicación en el genoma, o por ejemplo, de un plásmido en una célula al genoma de dicha célula. En una modalidad, la célula está en cultivo. La movilización de transposones similares a piggyBac también pueden tomar lugar en el contexto de un animal, por ejemplo, igualando dos adultos, uno de los cuales contiene el transposón similar a piggyBac en por lo menos algunas de sus células germinales y otro que contiene una transposasa similar a piggyBac que codifica la secuencia en por lo menos una de sus células germinales, generando así la progenie que contiene tanto el transposón como la transposasa. Alternativamente, se genera un animal transgénico co- inyectando ácidos nucleicos para un transposón y transposasa similar a piggyBac (en los mismos ácidos nucleicos o separados) en un óvulo o huevo fertilizado, generando así un animal transgénico que comprende una secuencia de codificación de transposón y transposasa similar a piggyBac. Las secuencias de codificación de transposasa pueden colocarse bajo un promotor ubicuito o específico para tejidos, de manera que se expresa en por lo menos algunas de las células que contienen el transposón. Esto permite la movilización del transposón. Si el promotor es activo en la línea germinal, entonces la progenie del. animal puede heredar el transposón movilizado. Para asegurar la estabilidad del transposón movilizado, la progenie se selecciona de manera que no comprende el gen de codificación de transposasa. En dicha progenie, el transposón se inmoviliza. Los sistemas de transposón similares a piggyBac de la invención comprenden transposones similares a piggyBac en combinación con la proteína transposasa similar a piggyBac o ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac son herramientas potentes para transformación de la línea germinal, para la producción de animales transgénicos , para la introducción de ácido nucleico en ADN en una célula, pera mutagénesis insercional, y para etiquetar los genes en una variedad de especies de vertebrados . • La invención además provee aplicaciones de este sistema en vertebrados como una herramienta para la manipulación y análisis genético eficiente, con aplicaciones en las industrias médica, farmacéutica y de ganados. 5.1. Sistemas de Transposón Similar a piggyBac La presente invención se refiere al uso de sistemas de transposón similar a piggyBac en células de vertebrados. Dichos sistemas se usan para introducir secuencias de ácido nucleicos en el ADN de una célula de vertebrados. Las transposasas similares a piggyBac se unen a los sitios de reconocimiento en las repeticiones invertidas de los transposones similares a piggyBac y catalizan la incorporación del transposón en ADN, tal como el ADN genómico de una célula blanco. Como se ilustra en los ejemplos, la combinación del transposón similar a piggyBac y el ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac de esto da como resultado la integración de la secuencia de transposón en una célula u organismo. Los transposones similares a piggyBac son móviles, en cuanto a que pueden moverse de una posición en el ADN a una segunda posición en ADN en presencia de una transposasa similar a piggyBac . Hay dos componentes fundamentales del sistema de transposón similar a piggyBac , una fuente de una transposasa similar a piggyBac activa y RTI similar a piggyBac que se reconocen y movilizan por la transposasa. La movilización de RTI permite la intervención de ácido nucleico entre RTI para que se movilicen también. El sistema de tr'ansposones similares a piggyBac de esta invención, por lo tanto, comprende dos componentes: una transposasa similar a piggyBac o ácido nucleico que codifica una transposasa similar a piggyBac, y un transposón similar a piggyBac clonado, que es un ácido nucleico que comprende por lo menos dos repeticiones invertidas reconocidas por una transposasa similar a piggyBac. Cuando se colocan juntos estos dos componentes provee actividad de transposón activa. En uso, la transposasa se une a las repeticiones invertidas y promueve la integración de la secuencia de ácidos nucleicos de intervención en ADN de una célula. La práctica de los métodos de la composición implica asi un sistema de transposón similar a piggyBac bipartita, que comprende un elemento de transposón similar a piggyBac y una transposasa similar a piggyBac o un ácido nucleico que codifica una transposasa similar a piggyBac. Los componentes similares a piggyBac pueden derivarse de piggyBac o cualquier sistema de transposón similar a piggyBac relacionado . En los transposones similares a piggyBac de la presente invención, las terminales de transposón izquierda y derecha (que contienen las repeticiones invertidas de la terminal 5' y 3' reconocidas por transposasa similar a piggyBac) flanquean un inserto, por ejemplo un ácido nucleico que se deberá insertar en un genoraa de células blanco o codifica un marcador fenotipico seleccionable , como se describe en mayor detalle más adelante. El inserto localizado o colocado entre las terminales izquierda y derecha del transposón similar a piggyBac puede variar mucho en tamaño. Además, los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que el piggyBac puede transposicionarse establemente aún cuando porta insertos grandes de 14 kb o mas. En modalidades especificas, el inserto por lo menos es de 0.5 kb, por lo menos 1 kb, por lo menos 1.5 kb, por lo menos 2 kb, por lo menos 2.5 kb, por lo menos 3 kb, por lo menos 4 kb por lo menos 5 kb, por lo menos 6 kb, por lo menos 7 kb, por lo menos 8 kb, por lo menos 9 kb, por lo menos 10 k, por lo menos 11 kb, por lo menos 11.5 k, por lo menos 13 kb, por lo menos 14 kb, o por lo menos 15 kb. En otras modalidades especificas, el transposón similar a piggyBac comprende un inserto no mayor a 15 kb, no mayor a 20 kb, no mayor a 25 kb, no mayor a 30 ,kb, no mayor a 35 kb, no mayor a 40 kb, no mayor a 45 kb, no mayor a 50 kb, no mayor a 60 kb, no mayor a 75 kb, o no mayor a 100 kb. En aún otras modalidades especificas, el transposón similar a piggyBac comprende un inserto que varia entre 1.5-3 kb, 1.5-5 .kb, 1.5-10 kb, 1.5-20 kb, 1.5-30 kb, 1.5-50 kb, 1.5-75 kb, 2-5 kb, 2-10 kb, 2-20 kb, 2-30 kb, 2-50 kb, 2-75 kb, 3-5 kb, 3-10 kb, 3-20 kb, 3-30 kb, 3-50 kb, 3-75 kb, 5-10 kb, 5-20 kb, 5-30 kb, 5-50 kb, 5-75 kb, 10-20 kb, 10-30 kb, 10-50 kb, o 10-75 kb . 'Cuando el inserto de un tamaño .que es suficientemente grande de manera que inactiva la capacidad del sistema de transposón para integrar el transposón en el genoma blanco, el transposón puede suministrarse en porciones traslapantes (v.gr., dos o tres o cuatro), en diferentes ácidos nucleicos, de manera que la recombinación homologa podría permitir que los diferentes ácidos nucleicos se recombinen dentro de la célula y se integren en el genoma como uno solo, el transposón grande en presencia de una transposasa similar a piggyBac . Por lo tanto, en dichas modalidades, un primer ácido nucleico podría contener la terminal izquierda del transposón similar a piggyBac y por lo menos una porción del inserto y un segundo ácido nucleico podría contener la terminal derecha del transposón similar a piggyBac y por lo menos una porción del inserto. Si solo se usan dos ácidos nucleicos, la porción del inserto contenido por el primer ácido nucleico y la porción del inserto contenida por el segundo ácido nucleico traslapado. Si se usa un tercer ácido nucleico, el tercer ácido nucleico podría tener regiones de traslapamiento con el primer ácido nucleico en un extremo y con el segundo ácido nucleico en el toro extremo. La Fig. 14B ilustra dicha modalidad. Este principio de recombinación homologa con múltiples ácidos nucleicos traslapantes (v.gr. , dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) puede aplicarse para introducirse en los genomas de células vertebrados y organismos de transposones similares a piggyBac con grandes insertos. De esta forma, los transposones con insertos de hasta 50 kb, 60 kb, 75 kb, 100 kb, 120 kb, 140 kb, 160 kb o aún más pueden introducirse en el genoma de una célula blanco. Este sistema de recombinación homologa permite ventajosamente la inserción de piezas grandes de ADN en células blanco, por ejemplo, genes completos que comprenden intrones, exones y elementos reguladores. El grado de traslapamiento entre cada par de ácidos nucleicos dependerá de los requerimientos de recombinación para la célula blanco, pero puede ser tan poca como de aproximadamente 20 nucleótidos a varias kilobases. En modalidades especificas, el grado de traslapamiento por lo menos es de 50 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, por lo menos 200 nucleótidos por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 750 nucleótidos o por lo menos 1. kb. En otras modalidades, el grado de traslapamiento no es mayor a 750 nucleótidos, no mayor a l kb, no mayor a 1.5 kb o no mayor a 1.5 kb.

Como se mencionó antes, el sistema de transposones similar a piggyBac de la presente invención también incluye una fuente de actividad de transposasa similar a piggyBac. La actividad de transposasa similar a piggyBac es una que se une a . las repeticiones invertidas del transposón similar a piggyBac y media la integración del transposón en el genoma de la célula blanco. Cualquier actividad de transposasa similar a piggyBac adecuada puede emplearse en los métodos presente mientras cumple con los parámetros anteriores. La actividad de transposasa similar a piggyBac puede ser de la misma fuente o de una fuente diferente como el propio transposón similar a piggyBac. La fuente de la actividad de transposasa similar a piggyBac puede variar. En ciertas modalidades, la fuente puede ser una proteina que exhibe la actividad de transposasa similar' a piggyBac. Sin embargo, la fuente generalmente es un ácido nucleico que codifica una proteina que tiene actividad de transposasa similar a piggyBac. En donde la fuente es un ácido nucleico que codifica una proteina que tiene actividad de transposasa similar a piggyBac, el ácido nucleico que codifica la proteina de transposasa generalmente es parte de un módulo de expresión, como se describió antes, en donde los elementos adicionales proveen la expresión de la transposasa según se requiere. La transposasa por lo tanto puede integrarse en el genoma de una célula blanco. Sin embargo, en ¦ ¦ ciertas modalidades, la transposasa se provee a la célula como una proteina o como un ARN . El transposón similar a piggyBac de la presente invención generalmente se introduce en una célula blanco o en 5 un vector, tal como un plásmido, un vector con base viral, una molécula de ADN lineal, y similares. Preferiblemente, el transposón similar a piggyBac comprende un inserto que contiene por lo menos una porción de una trama de lectura abierta. Los marcos de lectura abierta adecuadas se proveen 0 en la Sección 5.14. En una modalidad, el inserto de transposón similar a piggyBac contiene además una región reguladora, tal como una región reguladora transcripcional (v.gr., un promotor, un mejorador, un silenciador, una región de control de sitio, o un elemento de limite) . Las regiones 5 reguladoras adecuadas se proveen en la Sección 5.11.

Preferiblemente, la región reguladora se liga al marco de lectura abierto. En ciertas modalidades en . donde la fuente de actividad de la transposasa es un ácido nucleico que codifica 0 una transposasa similar a piggyBac, el transposón similar a piggyBac y el ácido nucleico que codifica la transposasa están presentes en vectores separados, v.gr., plásmidos separados. En ciertas modalidades, la secuencia de codificación de transposasa puede estar presente en el mismo 5 vector que el transposón, v.gr., en el mismo plásmido. Cuando esta presente en el mismo vector, la transposasa similar a piggyBac que codifica la región o dominio se localiza afuera del transposón RTI . Los sistemas de transposón ilustrativos de los cuales el transposón y elementos de transposasa de la invención pueden obtenerse se listan en la siguiente Tabla 1: Nombre o descripción Referencia Fuente adecuada Vector de transformación Acceso a Banco de Genes No. Transposón de piggyBac pk [BIG-alfa] AF402295 Plásmido auxiliar de Acceso a Banco de Genes No. Transposasa piggyBac pBlu-uTp, AY196821 Secuencia completa Transposón similar a Acceso a Banco de Genes No. Transposón piggyBac de Phytophthora AY830111 Transposasa infestans, PiggyPi-1 Vector de transformación Acceso a Banco de Genes No. Transposón de piggyBac pB-MCS w+ AY196822 Vector de transformación Acceso a Banco de Genes No. Transposón de piggyBac pB-UAS w+ AY196823 Vector de transformación Acceso a Banco de. Genes No. Transposón de piggyBac pB-UGateway w+ AY196824 Vector de transformación Acceso a Banco de Genes No. Transposón de piggyBac pB-UGIR w+ AY196825 Vector de reemplazo de Acceso a Banco de Genes No. Transposasa ubiquitina-transposasa P AY196826 de piggyBac EP3005 Vector de clonación Acceso a Banco de Genes No. Transposón piggyBac PB AY515146 Vector de clonación Acceso a Banco de Genes No. Transposón piggyBac RB AY515147 Vector de clonación Acceso a Banco de Genes No. Transposón piggyBac WH AY2151148 Gen de transposasa de Acceso a Banco de Genes No. Transposasa piggyBac del transposón AY264805 Heliothis virescens Más de 40 secuencias Sarkar y otros, 2003, Mol. Transposón similares a piggyBac Genet. Genomix 270 (-2): 173- Transposasa 80. Secuencias similares a Kapitonov & Jurka, 2003, Transposón piggyBac en Drosophila Proc Nati Acad Sci EUA Transposasa melanogaster 100(11) : 6569-74. Secuencias similares a Robertson, 2002, In Mobile Transposón piggyBac de una variedad DNA II, Craig y otros, eds . Transposasa de especies (Washington, D.C.,,ASM Press), págs. 1093-1110 Tabla 1 : Fuentes adecuadas del sistema de transposón Además de las secuencias de transposasa similares a piggyBac especificas provistas en la Tabla 1 anterior, en la siguiente Sección 6, la transposasa similar a piggyBac puede codificarse por ADN que puede hibridizarse a un ácido nucleico que codifica transposasa provista en la Tabla 1 bajo condiciones de hibridi zación estrictas, mientras la proteina codificada retiene la actividad de transposasa con respecto a un transposón similar a piggyBac . En modalidades especificas, la transposasa se codifica por una secuencia de nucleótidos con identidad de secuencia de por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% a las secuencias de codificación de' transposasa similar a piggyBac provistas en la Tabla 1. En ciertas modalidades, hay una variedad de cambios conservadores que pueden hacerse a la secuencia de aminoácidos de la transposasa similar a piggyBac sin alterar actividad similar a piggyBac . Estos cambios se llaman mutaciones conservadoras, es decir, un aminoácido que pertenece á un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño particular o se pueden sustituir características para otro aminoácido, particularmente en regiones de la proteína que no se asocian con actividad catalítica o actividad de unión de ADN, por ejemplo. Otras secuencias de aminoácidos de la transposasa similar a piggyBac incluyen transposasas con secuencias de aminoácidos que contienen cambios conservadores relativos a secuencias presentadas en la presente que no alteran significativamente la función de la transposasa. Los sustitutos para unas secuencias de aminoácidos pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos ) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina y triptofano. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas incluyen, pero no se limitan a, Lys para Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu para Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser para Thr de manera que se mantiene un grupo hidroxilo libre; y Gln para Asn para mantener un grupo amino libre. Además, una secuencia de ADN particular que codifica una transposasa similar a piggyBac puede modificarse para emplear los codones preferidos para un tipo de célula particular, v.gr, los codones para la célula blanco en la cual se va a introducir la secuencia de codificación de transposasa.

Además de las secuencias . de transposón similares a piggyBac específicamente enumeradas en la Tabla 2, y en la siguiente Sección 6, el término "transposón similar a piggyBac" abarca cualquier fragmento de ADN que pudiera extirparse por transposasas naturales o artificiales y reinsertarse en un sitio blanco de TTAA en el genoma, ocasionando. una duplicación de sito blanco (DSB) que flanquea el elemento. En modalidades específicas, esta secuencia se deriva de piggyBac o un elemento similar a piggyBac listado en la Tabla 1 o descrito en la siguiente Sección 6. 5.2. Métodos para Preparar el Sistema de Transposón Similar a piggyBac Los diferentes elementos del sistema de transposón similar a piggyBac empleado en los métodos presente, v.gr., vectores que comprenden el transposón similar a piggyBac o elementos de transposasa, pueden producirse por métodos normales de separación, unión y clonación molecular de enzimas de restricción. Un protocolo para construir los vectores presente incluyen los siguientes pasos. Primero, los fragmentos de ácidos nucleicos purificados que contienen secuencias de nucleótidos de componentes deseadas así como secuencias extrañas se separan con endonucleasas de restricción de fuentes iniciales, v.gr., un vector que comprende el transposón similar piggyBac . Los fragmentos que contienen las secuencias de nucleótidos deseadas se separan luego de los fragmentos no deseados de diferente tamaño usando métodos de separación convencionales, v.gr., por e.lectroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos deseados se extirpan del gen y se ligan juntos en la configuración apropiada de manera que se produce un ácido nucleico circular o plásmido que contiene las secuencias deseadas como se describió en la presente. Cuando se desea, las moléculas circulares asi construidas se amplifican en un huésped procariótico, v.gr., E. coli. Los- procedimientos de separación, construcción de plásmidos, transformación celular y producción de plásmidos implicadas . en estos pasos son bien conocidas para alguien experto en la materia y las enzimas requeridas para restricción y ligación están comercialmente disponibles (véase, v.gr., T. maniatis, D.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982) ; Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalogo 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc.). Ejemplos adicionales de cómo construir los vectores empleados en los métodos presentes se proveen en la Sección 6, siguiente. 5.3. Uso del Sistema de Transposón Similar a piggyBéLC para Integrar un Acido nucleico en un Genoma de Células Blanco Los métodos descritos en la presente encuentran uso en una variedad de aplicaciones en las cuales se desea introducir e integran establemente un ácido nucleico exógeno en el genoma de una célula u. organismo blanco. Los organismos de interés incluyen vertebrados, en donde el vertebrado es un mamífero en muchas modalidades. En ciertas modalidades, el vertebrado de la invención es un pájaro (v.gr., pollo u otra ave de corral), o pez (v.gr., pez cebra) . En otras modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano, incluyendo pero no limitado a un primate no humano, vaca, gato, perro, caballo, oveja, ratón, rata, hámster, visón, conejillo de indias, panda, y cerdo. EN otras modalidades, el organismo es una rana, v.gr., Xenopus laevis. En una modalidad específica, el vertebrado no humano transgénico es un animal de ganado. En modalidades que implican la administración del sistema de transposón directamente al organismo multicelular, pro ejemplo, para fines de terapia de genes (descrito más extensamente en la Sección 5.4, anterior) el mamífero también puede ser un ser humano. 5.4 Métodos para Introducir el Sistema de Transposición Similar a piggyBac en Organismos Multicelulares La ruta del sistema de transposones similar a piggyBac a un organismo multicelular depende de varios parámetros, incluyendo, la naturaleza de los vectores que portan los componentes del sistema, la naturaleza del vehículo de suministro, la naturaleza del organismo y similares. Una característica común de este modo de administración es que provee el suministro in vivo de los componentes del sistema de transposón a las células blanco. En ciertas modalidades, el ADN lineal o circular, v.gr. , un plásmido, se emplea como el vector para suministrar el sistema del transposón a la célula ' blanco. En dichas modalidades, el plásmido puede administrarse, en un vehículo de suministro acuoso, v.gr., una solución salina. Alternativamente, se puede usar un agente que modula la distribución del vector en el organismo multicelular. Por ejemplo, cuando' los vectores que comprenden los componentes del presente sistema son vectores de plásmidos, basados en lípidos, v.gr., liposoma, se pueden emplear los vehículos en donde el vehículo basado en lípidos puede dirigirse a un tipo de células específicas para suministro específico de células o tejido del vector. Las patentes que describen dichos métodos incluyen: Patentes de E.U.A. Nos. 5,877,302; 5,840,710; 5,830,430; y 5,827,703, las descripciones de la cual se incorporan aquí por referencia. Alternativamente, los péptidos basados en polilisina pueden emplearse como vehículos, que pueden o no modificarse con porciones de dirección al blanco y similares. (Brooks, A.I., y otros, 1998, J. Neurosci. Métodos V. 80 p: 137-47; Muramatsu, . , Nakamura, a., y H. M. Park 1998 Int. J. Mol. Med. V. 1 p: 55-62) . En aún otras modalidades, los componentes del sistema pueden incorporarse en vectores virales, tales como vectores derivados de adenovirus, vectores derivados de virus sindbis, vectores derivados retrovirales , etc., vectores híbridos, y similares. Los vectores anteriores y vehículos de suministro son únicamente representativos.. Cualquier combinación de vector/vehículo de suministro puede emplearse, mientras provea administración in vivo del sistema de transposones al organismo multicelular y célula blanco. Los vectores/vehículos de suministro adecuados en el contexto de terapia de genes se proveen en la siguiente Sección 5.13. Debido a la multitud de diferentes tipos de vectores y vehículos de suministro que pueden emplearse, la administración puede ser por cualquier número de diferentes rutas, en donde las rutas representativas de administración incluyen: oral, tópica, intra-arterial, intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, etc. El modo particular de administración depende, por lo menos en parte, de la naturaleza del vehículo de suministro empleado para los vectores que contienen el sistema de transposón similar a piggyBac . -En muchas modalidades, el vector o vectores que contienen el sistema de transposón similar a piggyBac se administran intravascularmente, v.gr., intra-arterialmente o intravenosamente, empleando un vehículo de suministro con base acuosa, v.gr., una solución salina. Los elementos del sistema de transposón similar a piggyBac v.gr., el transposón similar a piggyBac y la fuente de transposasa similar a piggyBac, se administra al organismo multicelular en una forma in vivo de manera que se introducen en una célula blanco del organismo multicelular bajo condiciones suficientes para eliminar el ácido nucleico flanqueado de repetición invertido del vector que porta el transposón e integración subsiguiente del ácido nucleico eliminado en el genoma de la célula blanco. Dependiendo de la estructura del propio vector de transposón, es decir, si el vector incluye o en una región que codifica un producto que tiene la actividad de transposasa similar a piggyBac, el método además puede incluir la introducción de un segundo vector en la célula blanco que codifica la actividad de transposasa requerida. La cantidad de ácido nucleico del vector que comprende el elemento de transposón, y en muchas modalidades la cantidad de ácido nucleico de vector que codifica la transposasa, que se introduce en la célula, es suficiente para proveer la eliminación e inserción deseada del ácido nucleico del transposón en el genoma de células blanco. Como tal, la castidad de ácido nucleico de vector introducida deberá proveer una cantidad suficiente para actividad de transposasa y un número de' copias suficiente de del ácido nucleico que se introduce en la célula blanco varia dependiendo de la eficiencia del protocolo de introducción particular que se emplea, v.gr. , el protocolo de administración particular in vivo que se emplea. La dosis particular de cada componente del sistema que se administra al organismo multicelular varía dependiendo de la naturaleza del ácido nucleico del transposón, v.gr., la naturaleza del módulo de expresión y gen, la naturaleza del vector en el cual están presentes los elementos del componente, la naturaleza del vehículo de suministro y similares. La dosis pueden determinarse fácilmente de manera empírica por los expertos en la materia. Por ejemplo, en ratones en donde los componentes del sistema de transposón similar a piggyBac están presentes en plásmidos separados que se administran intravenosamente a un mamífero en un vehículo de solución salina, la cantidad de plásmido de transposón que se administra en muchas modalidades varía normalmente de aproximadamente 0.5 a 40 y normalmente es de aproximadamente 25 iq, mientras la cantidad de transposasa similar a piggyBac que codifica el plásmido que se administra normalmente varía de aproximadamente 0.5 a 25 y usualmente es de aproximadamente 1 iq . Una vez que el ADN del vector ha entrado a la célula blanco en combinación con las transposasa requerida, · la región de ácidos nucleicos del vector que se flanquea por repeticiones invertidas, es decir, el ácido nucleico del vector colocado entre las repeticiones invertidas reconocidas de transposasa similar a piggyBac, se eliminan del vector vía la transposasa provista- y se insertan en el genoma de la célula dirigida al blanco. Como tal, la introducción del ADN del vector en la célula blanco se sigue por la eliminación de inserción mediada por transposasa subsiguiente del ácido nucleico exógeno portado por el vector en el genoma de la célula dirigida al blanco. Los métodos presentes pueden usarse para integrar ácidos nucleicos de varios amaños en el genoma de células blanco, como se describió en la Sección 5.1, anterior. Los métodos de la presente dan como resultado una integración estable del ácido nucleico en el genoma de células blanco. Por integración estable se entiende que el ácido nucleico sigue estando presente en el genoma de células blanco más de un periodo temporal, y se pasa en una parte del material genético cromosomal a la progenie de la célula blanco. 5.5 Métodos para Generar Células Recombinantes que Comprenden Transposones Similares a piggyBac.

La creación de una célula transformada requiere que el ADN se coloque primero de manera física dentro de la célula huésped. Los procedimientos de transformación actuales usan una variedad de técnicas para introducir ADN en una célula. En la forma de transformación, el ADN se microinyecta directamente en células mediante el uso de micropipetas . Alternativamente, la balística de alta velocidad se puede usar para propulsar partículas asociadas de ADN pequeñas en la célula. En otra forma, la célula se permeabiliza por la presencia de polietilenglicol , permitiendo así que el ADN entre a la célula por difusión. El ADN también puede introducirse en una célula fusionando protoplastos con otras entidades que contienen ADN. Estas entidades incluyen minicélulas, células, liposomas u otros cuerpos con superficie de lípidos fusionables. La electroporacion también es un método aceptado para introducir ADN en una célula. En esta técnica, las células se someten a impulsos eléctricos de alta resistencia de campo que permeabiliza reversiblemente las biomembranas , permitiendo así la entrada de secuencias de ADN exógeno. Un método preferido para introducir la construcción de transformación en células de acuerdo con la presente invención es microinyectar huevos fertilizados con la construcción. La secuencia de ADN flanquea por las repeticiones invertidas del transposón se insertaron en el genoma del huevo, fertilizado durante el desarrollo del organismo, este ADN pasará a todas las células de progenie para producir un organismo transgénico. La microinyección de huevos para producir animales transgénicos se ha descrito previamente y usado para producir mamíferos transformados (Hogan et . al., Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y., 1986; Shirk y otros, In Biotechnology For Crop Protection, Hedin et al (eds.), ACS Books, Washington D.C., 135-146, 1988; Morgan y otros, Annu. Rev., Biochem. , Volume 62,191-217,1993; todas incorporadas aquí por referencia) . Alternativamente, el sistema de transposón similar a piggyBac en dos partes puede suministrarse a las célula vía viruses, incluyendo retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes, y otros. Hay varias combinaciones potenciales de mecanismos de suministro para la porción del transposón conteniendo el transgene de interés flanqueo por las repeticiones de terminal invertida (RTI) y el gen que codifica la transposasa. Por ejemplo, tanto el transposón como el gen de transposasa pueden estar contenidos junto con el mismo genoma viral recombinante ; una sola infección suministra ambas partes del sistema similar a piggyBac de manera que la expresión del la transposasa luego dirige la separación del transposón del genoma viral recombinante para integración subsiguiente en un cromosoma celular. En otro ejemplo, la transposasa y el transposón puede suministrarse por separado por una combinación de virus y/o sistemas no virales tal como reactivos que contienen lipidos. En estos casos tanto el gen de transposón y/o la transposasa puede suministrarse por un virus recombinante. En cada caso, el gen de transposasa expresado dirige la liberación del transposón de su ADN portador (genoma viral) para la integración en el ADN cromosoma1. Los sistemas de transposón similar a piggyBac de la invención se pueden introducir en cualquier linea celular o linea de células primarias de origen vertebrado. En ciertas modalidades, la célula es de una linea celular, tal como células de ovario de hámster chino (OHC) , HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, mieloma (v.gr., NSO, NSI), HT-1080, o W138. La célula de vertebrados también puede ser el producto de un evento de fusión celular, tal como una célula de hibridoma. : En ciertas modalidades, la célula puede ser una célula pluripotente (es decir, una célula cuyos descendientes pueden diferenciarse en varios tipos de células restringidas, tales como células madre hemaotopoyéticas u otras células madre) . Las células tales como oocitos, huevos, y una o más células de un embrión se consideran también en esta invención . En otras modalidades, las células pueden ser células maduras, de una variedad de órganos o tejidos. Dicha células incluyen, pero no están limitadas a, linfocitos, hepatocitos, células neurales, células musculares, una variedad de células sanguíneas y una variedad de células de un organismo. 5.6 Métodos para Generar Animales Recombinantes que Comprenden Transposones Similares a piggyBac Los transgenes similares a piggyBac descritos antes se introducen en mamífero son humanos. La mayoría de mamíferos no humanos, incluyendo roedores tales como ratones y ratas, conejos, .ovinos tales como ovejas y cabras, porciones tales como cerdos y bovinos tales como ganado y búfalo son adecuados. En algunos métodos de transgénesis, los transgénes se introducen en los por-núcleos de oocitos fertilizados. Para algunos animales, se lleva a cabo la fertilización de ratones in vivo y se remueven quirúrgicamente los ovarios fertilizados. En otros animales, particularmente bovinos, es preferido remover ovarios de animales vivos o en el matadero y fertilizar los ovarios in vitro. Véase DeBoer y otros, WO 91/08216. La fertilización in vitro permite que un transgene sea introducido en células sustancialmente sincrónicas en una fase óptima del ciclo celular para la integración (no después de la fase S) . Los transgenes usualmente se introducen por microinyección . Véase Pat. de E.U.A. No. 4,873,292. Los oocitos fertilizados luego se cultivan in vitro hasta que se obtiene un embrión de preimplante conteniendo aproximadamente 16-150 células. La etapa de 16-32 células de un embrión se describió como una mórula. Los embriones de preimplante que contienen más de 32 células se llaman blastocitos. Estos embriones muestran el desarrollo de . una cavidad de blastoceles, normalmente en la etapa de 64 células. Los métodos para cultivar oocitos fertilizados a la etapa de preimplante se describieron por Gordon et al. (1984) Methods Enzymol. 101, 414; Hogan y otros, Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C.S.H.L. N .Y. (1986) (embriones de ratones); y Hammer et al. (1985) Nature 315, 680 (embriones de conejos y porcinos); Gandolfi et al. (1987) J. Reprod. Fert. 81, 23-28; Rexroad et al. (1988) J. Anim. Sci. 66, 947-953 (embriones de ovinos) y Eyestone et al. (1989) J. Reprod. Fert. 85, 715-720; Camous et al. (1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785; y Heyman et al. (1987) Theriogenology 27, 5968 (embriones de bovinos) (incorporada por referencia en su totalidad para todos los fines) . Algunas veces los embriones de -preimplante se almacenan congelados durante un implante de periodo pendiente. Los embriones de preimplante se transfieren a una hembra apropiada que resulta del nacimiento de un animal transgénico o quimérico que depende de la etapa del desarrollo en donde se integra .el transgene. Los mamíferos quiméricos pueden criarse para formar animales transgénicos de la línea germinal real. Alternativamente, los transgenes pueden introducirse en células madre embriónicas (ME) . Estas células se obtienen de embriones de preimplante cultivaos in vitro. Bradley y otros (1984), Nature 309, 255-258 (incorporadas en su totalidad por referencia ara todos los fines) . Los transgenes pueden introducirse en dichas ' células por electroporación microinyección . Las células de ME transformadas se combinan con blastocitos de un animal no humano. Las células de ME colonizan el embrión y en algunos embriones forman la línea germinal del animal quimérico resultante. Véase Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988) (incorporada por referencia en su totalidad para todos los fines) . Alternativamente, las células de ES pueden usarse como una fuente de núcleos para transplante en un oocito fertilizado enucleado originando un mamífero transgénico. Para la producción de animales transgénicos que contiene dos o más transgenes, v.gr., en modalidades en donde el transposón similar a piggyBac y componentes de transposasa similar a piggyBac de la invención se introducen en un animal vía ácidos nucleicos separados, los transgenes pueden introducirse simultáneamente usando el mismo procedimiento que para un solo transgene. Alternativamente, los transgenes pueden introducirse inicialmente en animales separados y luego combinarse en el mismo genoma por crianza de los animales. Alternativamente, un primer animal transgénico se produce conteniendo uno de los transgenes . Un segundo transgen se introduce luego en ovarios fertilizados yo células madre embriogénicas de dicho animal. En algunas modalidades, los transgenes cuya longitud podría exceder de alguna manera aproximadamente 50 kb, se considerar fragmentos traslapantes. Dichos fragmentos traslapantes se introducen en un oocito fertilizado o células madre embriogénicas simultáneamente y sufren de recombinación homologa in vivo. Ver Kay y otros, WO 92/03917 (incorporada por referencia en su totalidad para todos los fines) . Los mamíferos transgénicos pueden generarse convencionalmente introduciendo por microinyección los transgenes descritos antes en huevos fertilizados de mamíferos (aquellos en la fase de por-núcleo) , implantando los huevos en los oviductos de mamíferos hembra (mamíferos receptores) después de poca incubación adicional o directamente en sus úteros sincronizados para el pseudo-embarazo, y obteniendo los jóvenes. Para encontrar si son transgénicos los jóvenes generados, se puede usar análisis de inhibición de complemento, inmunohistológico, RCP, inmunotransferencia por puntos descritos más adelante y similares. Los mamíferos transgénicos así generados pueden propagarse igualando y obteniendo, convencionalmente a los jóvenes, o núcleos de transferencia (transferencia de núcleos) de las células somáticas de mamíferos transgénicos, que se han inicializado o no, en huevos fertilizados de los cuales se han enucleado previamente los núcleos, implantando los huevos en los oviductos o úteros de los mamíferos receptores, y obteniendo clones de los jóvenes. Las células transformadas y/o organismos transgénicos (aquellos que contienen el ADN insertado en el ADN de las células huésped)- pueden seleccionarse de de células no transformadas y/u organismos transformados si se incluyó un marcador seleccionable como parte de las secuencias de ADN introducidas. Los marcadores seleccionables incluyen, por ejemplo, genes que proveen resistencia a antibióticos; genes que modifican la fisiología del huésped, tal como por ejemplo proteína fluorescente verde para producir un fenotipo visible alterado; etc. Las células y/o organismos que contienen estos genes pueden sobrevivir en presencia de antibiótico, insecticidas o concentraciones herbicidas que matan células/organismos no transformados o producen un fenotipo visible alterado. Usando las técnicas normales conocidas para alguien familiarizado con el campo, las técnicas como tal, por ejemplo, inmunotransferencia Southern y reacción en cadena de polimerasa, el ADN puede aislarse de células transgénicas y/o organismos para confirmar que el ADN introducido se había insertado. 5.7. Los Transposones similares a piggyBac que Portan los Sitios de Reconocimiento de Reeombinasa Específicos para Sitio El sistema de transposones similares a piggyBac de la invención se pueden usar para insertar las secuencias de reconocimiento de reeombinasa específicas para sitio aleatoriamente en el cromosoma de vertebrados no humanos para facilitar la generación de animales mutantes y/o de -mosaico. En modalidades específicas, la reeombinasa específica para sitio, es el sistema Cre-loxP o el sistema de FLP-FRT (véase Kilby, 1993, Trends Genet 9 ( 12 ) : 413-421 y referencias citadas en la presente) . La recombinación entre dos secuencias de reconocimiento de reeombinasa ' específica para sitio integradas en diferentes cromosomas da como resultado la traslocación entre los cromosomas. Dichas traslocaciones son un medio común para crear mutaciones que conducen al desarrollo de anormalidades o tumorigenesis .

La recombinación entre dos secuencias de reconocimiento de recombinasa especificas para sitio en la orientación de repetición directa pueden ocasionar la eliminación de una secuencia de ADN de intervención (v.gr., un gen) . Aunque dichos eventos son potencialmente reversibles, la pérdida de la secuencia de ADN eliminada durante la división celular o por degradación hace irreversible la mutación. Una mutación nula en cualquier gen puede crearse de esta manera y la función del gen estudiado en células especificas y/o en etapas de desarrollo especificas . La recombinación entre dos secuencias de reconocimiento de recombinasa especificas para sitio en la orientación de repetición' invertida puede ocasionar la inversión de una secuencia o gen de intervención. La inversión puede ocasionar la activación o inactivación de un gen. Si la actividad del gen se puede detectar (v.gr., marcador seleccionable, mar'cador histoquimico, gen reportero) , los linajes de la célula pueden trazarse identificando eventos de recombinación para marcar una célula y sus descendentes mediante la detección de activación o inactivación de genes. Los linajes celulares pueden rastrearse independientes de la actividad de genes, monitoreando diferencias en el sitio de integración de la secuencia de reconocimiento de recombinasa especifica para sitio. La recombinación entre - una secuencia de reconocimiento de recombinasa especifica para sitio integrada en un cromosoma y una secuencia de reconocimiento de recombinasa especifica para sitio integrada en el material genético extracromosomal puede ocasionar la inserción del material genético en el cromosoma. Una inserción creada en esta forma podría proveer medios para crear animales no humanos transgénicos con integración específica para. sitio de una sola copia del transgene en un sitio en el genoma específico por la secuencia de reconocimiento de recombinasa específica para sitio cromosorna1. Preferiblemente, la secuencia de intervención o material genético contiene un gen tal como, por ejemplo, un gen en desarrollo, gen esencial, gen de citoquina, gen neurotransmisor , gen receptor de neurotransmisor, oncogén, gen supresor de tumor, marcador seleccionable , o marcado histoquímico, o porción del mismo. La recombinación puede ocasionar la activación o inactivación de un gen por yuxtaposición de regiones reguladoras al gen o separación de regiones reguladoras del gen, respectivamente. 5.8. Trampa de Exones Los sistemas de transposones similares a piggyBac de la invención también se pueden usar en clonación de trampas de exones, o procedimientos de trampas de promotores para detectar la expresión de genes diferenciales en variedades de tejido. Véase, v.gr, D. Auch & Reth, y otros, "Exon Trap Cloning: Using PCR to Rapidly Detect and Clone Exons from Genomic DNA Fragmente", Nucleic Acids Research, vol. 18, No. 22, p. 6743; Buckler, y otros, 1996, Proc. Nat'l Acá. Sci. EUA 88:4005-4009 (1991); Henske, y otros, Am. JU . Hum. Genet. 59:400-406. En dichas modalidades, el transposón similar a piggyBac comprende preferiblemente un gen marcador detectable, tal como PFV o una etiqueta de afinidad, flanqueado por donador de separación de exones y sitios de aceptores. La proteina codificada por el gen marcador se traslada asi dentro de la proteina codificad por el sitio genético en el cual se inserta el transposón similar a piggyBac, permitiendo la detección de la proteina codificada por el sitio genético. 5.9.. Aplicaciones de Síntesis de Polipéptidos Los métodos descritos en la presente que generan animales transgénicos y de mosaico y células recombinantes encuentran uso en la síntesis de polipéptidos, v.gr., proteínas de interés.

En dichas aplicaciones, se genera un animal transgénico o de mosaico, el genoma de algunas o todas sus células, comprendiendo un transposón similar a piggyBac que comprende un inserto que codifica el polipéptido de interés en combinación con las secuencias reguladoras de expresión requeridas y/o deseadas, v.gr., promotores, etc., (es decir, un módulo de expresión), para servir como un huésped de expresión para la expresión del polipéptido. Similarmente , una célula de vertebrados en cultivo que comprende dicho transposón similar a piggyBac puede usarse en estos métodos-El animal' transgénico o de mosaico o célula recombinante se somete luego a condiciones suficientes para la expresión del polipéptido codificado por el inserto contenido por el transposón similar a piggyBac. La proteina expresada luego se recupera y se purifica si se desea, usando cualquier protocolo conveniente. En el contexto de un animal transgénico o de mosaico, los métodos de la invención proveen un medio para expresar una proteina de interés en el animal o producir una linea celular capaz de niveles de expresión altos de una proteina de interés. Por lo tanto, los animales y células producidos por las invenciones son útiles como "bioreactores" para la producción de proteínas de interés. La proteína de interés puede ser endógena o exógena a las células o animales.

Adicionalmente , los métodos descritos en la presente son útiles para mejorar las características del ganado . 5.10. Aplicaciones Terapéuticas Los métodos de la invención son útiles en aplicaciones terapéuticas, en las cuales los sistemas de transposón similar a piggyBac se emplean para integrar establemente un ácido nucleico terapéutico, v.gr., gen, en el genoma de una célula blanco, es decir, aplicaciones de terapias de genes. Los sistemas del transposón similar a piggyBac pueden usarse para suministrar una amplia variedad de ácidos nucleicos terapéuticos a un sujeto. Los ácidos nucleicos terapéuticos de interés incluyen genes o marcos de lectura abiertos que reemplazan genes defectuosos en la célula huésped blanco, tal como las condiciones de enfermedad basadas en defectos genéticos; aquellas que tienen utilidad terapéutica en el tratamiento del cáncer; y similares. Las secuencias de codificación terapéuticamente benéficas ilustrativas se describen en la Sección 5.13. Un aspecto importante de os métodos presente, como se describió antes, es que los métodos presente pueden usarse para aplicaciones de terapia dé genes in vivo. Por aplicaciones de terapia de genes in vivo se entiende que la célula o células blanco en las cuales se desea la expresión del gen terapéutico no se remueven del huésped antes del contacto con el sistema de transposones. En contraste, los vectores que incluyen el sistema de transposones se administran directamenté al organismo multicelular y se absorben por las células blanco, siguiendo cual integración del gen en el genoma de células blanco se presenta. 5.11. Promotores En una modalidad de la invención, el ácido nucleico insertado en el transposón similar a piggyBac codifica un marco de lectura abierto ("MLA") ligado operablemente a un elemento que regula la expresión de MLA. Adicionalmente, los elementos reguladores , son convenientes para regular la expresión de la transposasa similar a piggyBac, particularmente en modalidades de la invención en las cuales se introduce un ácido nucleico que codifica una transposasa en el genoma de un animal. Preferiblemente, el módulo de expresión dentro de un transposón similar a piggyBac incluye los elementos reguladores de transcripción que proveen la expresión de un MLA contenido por el transposón. Los ejemplos de elementos reguladores de transcripción especifica incluyen: elementos SV40, como se describió en Dijkema y otros, EMBO J. (1985) 4:761; los elementos reguladores de transcripción derivados del TRL del virus de sarcoma Sous, como se describió en Gorman y otros, . Proc. Nat ' 1. Acad. Sci USA (1982) 79:6777; elementos reguladores de transcripción derivados del RTL de citomegalovirus humano (CMV) , como se describió en Boshart y otros, Cell (1985) 41:521; promotores de hsp70, (Levy-Holtzman, R. e I. Schechter (1994) 18: 301-308)) y similares. En modalidades especificas, el elemento regulador es un promotor inducible. Los promotores inducibles son conocidos para quien está familiarizado con la técnica y existe una variedad que podría usarse para impulsar la expresión del gen de transposasa. Los sistemas inducibles incluyen, por ejemplo, el sistema de promotor de choque de calor, el- sistema de metalotionina, el sistema de glucocorticoide, promotores específicos para tejidos, etc. Los promotores regulados por choque de calor, tal como el promotor asociado normalmente con el gen que codifica la proteína de choque de calor de 70 kDa, puede incrementar la expresión varias veces después de exponerse a temperaturas elevadas. El sistema de glucocorticoides también funciona bien para accionar la expresión de los genes. El sistema consiste de un gen que codifica la proteína de receptor de glucocorticoide (GR) que en presencia de una hormona de esferoides (es decir, glucocorticoide de uno de sus equivalentes sintéticos tal como desametasona ) forma un complejo con la hormona. Este complejo entonces se une a una secuencia de nucleótidos corta (25 pb) nombrada el elemento de respuesta de glucocorticoides (ERG) , y esta unión activa la expresión de genes ligados. Los promotores inducibles pueden usarse como un promotor inducible ambientalmente para controlar la expresión del gen introducido. Otros medios además de los promotores inducibles para controlar la actividad funcional de un producto de genes son conocidos para los que están f miliarizados con la técnica. En ciertas modalidades, la transposasa similar a piggyBac se expresa bajo el control de un promotor especifico para linea germinal. En. ciertas modalidades, el promotor especifico para linea germinal es un promotor especifico para machos (v.gr., promotor de protamina 1 (Prm), como se describió en la presente). En otras modalidades, el · promotor especifico para linea germinal es un promotor especifico para hembras (v.gr., un promotor ZP3, tal como un promotor ZP3 de murinos (mZP3) (lira y otros, 1990, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci . E.U.A. 87 (18) : 7215-9) . Para usar animales de ganado como bioreactores, se puede producir proteina de cantidad 'en leche, orina, sangre o huevos. Se sabe que los promotores promueven la expresión en leche, orina, sangre o huevos y estos incluyen, pero no están limitados a, promotor de caseína, el promotor de proteína urinaria de ratones, promotor de ß-globina y el promotor de ovalbúmina respectivamente. 5.12. Mutagénesis de Transposón Similar a p ggyBac y Descubrimiento de Genes La marcación de transposones es una técnica por la cual el ADN transgénico se suministra a células de manera que se integrará en genes, inactivándolos asi por mutagénesis insercional. En el proceso, los genes inactivados se margan por el elemento transposable el cual pueden usar después para recuperar el alelo mutado. La inserción de un elemento transposable puede alterar la función de un gen lo cual puede conducir a un fenotipo característico. Debido a su capacidad inherente , para cambiar de una ubicación cromosomal a otra dentro y entre genomas, los elementos transposables pueden tener manipulación genética revolucionada de ciertos organismos incluyendo bacterias (Gonzales y otros, 1996 Vet. Microbiol . 48, 283-291; Lee and Henk, 1996. Vet. Microbiol. 50, 143-148), Drosophila (Ballinger and Benzer, 1989 Prac. Nat ? . Acad. Sci . USA 86,9402-9406; Bellen y otros, 1989 Genes Dev. 3, 1288-1300; Spradling y otros, 1995 Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. USA 92, 10824-10830), C. elegans (Plasterk, 1995. Meth. Cell. Biol . , Academic Press, Inc. pags . 59-80) y una variedad de especies de plantas (OpiggyBac-likeorne and Baker, Curr. Opin. Cell Biol, 7,406-413 (1995)). Los transposones se han considerado vectores útiles para marcado de transposones, mejoradores de atrapamiento y transgénesis. Sin embargo, la mayoría, sino es que todos, los vertebrados carecen de dicha potente herramienta. Para su simplicidad y capacidad de funcionar en diversos organismos, los sistemas de transposones similares a piggyBac de la invención son útiles como un vector eficiente para especies en las cuales actualmente no está disponible la tecnología de transposones de ADN. El marcado de transposones es una técnica en la cual se movilizan los transposones para "saltar" en los genes, inactivándolos así por mutagénesis insercional. Estos métodos se tratan por Evans y otros, TIG 11997 13:370-374. En el procesos, los genes inactivados se "etiquetan" por el elemento transposable que luego puede usarse para recuperar el alelo mutado. Por lo tanto, la presente invención provee un método eficiente para introducir una etiqueta de transposón similar a piggyBac en el genoma de una célula. Cuando se inserta la etiqueta en una ubicación en la célula que altera la expresión de una proteína que se asocia con un fenotipo particular, la expresión de un fenotipo alterado en una célula que contiene el transposon similar a piggyBac permite la asociación de un fenotipo particular con un gen particular que se ha alterado por el transposón. En la presente el transposón similar a piggyBac funciona como un marcador. Los iniciadores diseñados para RCP inversa o para secuenciar el ADN genómico que flanquea el fragmento de ácidos nucleicos de esta invención se puede usar para obtener información de secuencias a aproximadamente el gen alterado. Hay varias formas para aislar el gen marcado. En todos los casos el ADN genómico se aisla de células de uno o más tejidos del animal mutado por técnicas convencionales (que varían para diferentes tejidos y animales). El ADN se separa por una endonucleasa de restricción que puede o no cortarse en el marcador del transposón (más frecuente que cuando no se separa, en un sitio conocido). Los fragmentos resultantes pueden clonarse directamente en plásmidos o vectores de fagos para su identificación usando sondas para el ADN del transposón (véas Kim y otros, 1995 para referencias en Mobile Genetic Elements, IRL Press, D.- L. Sheratt Eds . ) . ' Alternativamente, el ADN puede ser RCP amplificado en cualquiera de muchas formas. Se puede usar el procedimiento de RCP-LM de' Izsvak y Ivics 81993) , Biotechniques . 15(5): 814-8). El procedimiento de RCP-LM puede realizarse como se modificó por Devon y otros (995, Nucleic Acids Res. 23(9): 1644-5) e identificado por su hibridización a la sonda del transposón. Un método alternativo es RCP inversa (v.gr., Allende y otros, 1996, Genes Dev., 10:314.1-3155). Sin considerar el método de clonación, el con identificado luego se secuencia. Las seis secuencias que flanquean el transposón (u otro ADN insertado) puede identificarse por su no identidad al elemento insercional. Las secuencias pueden combinarse u luego usarse para buscar las bases de datos de ácidos nucleicos p.ara la homología con otros genes caracterizados previamente, u homología parcial a un gen o motivo de secuencia que codifica alguna función. En algunos casos el gen no tiene homología con cualquier proteína conocida. Se convierte en una nueva secuencia a la cual se comparan los otros. La proteína codificada con el centro de investigación adicional de este papel para ocasionar el fenotipo que. indujo su recuperación. Por lo tanto, los transposones similares a piggyBac pueden emplearse para mutagenizar genomas de vertebrados, permitiendo la generación de mutantes de pérdida de función y tamizando las mutantes para fenotipos de interés. Normalmente, se usaron los transposones similares a piggyBac los cuales contienen uno o más elementos que permiten la detección de animales que contienen el transposón. Más frecuentemente, se usan genes marcadores que afectan una característica visible, tal como color de piel u ojos. Sin embargo, cualquier gen puede usarse como un marcador que ocasiona un cambio fenotípico confiable y clasificada fácilmente en animales transgénicos . Un gen en el cual se inserta un transposón similar a piggyBac puede identificarse digiriendo el ADN de la célula en la cual se inserta" el transposón con una endonucleasa de restricción capaz de separar la secuencia del transposón similar a ¦ piggyBac; identificando las secuencias de repetición invertida del transposón; secuenciando el ácido nucleico cerca de las secuencias de repetición invertida para obtener secuencia de ADN de un marco de lectura abierto; y comparando la secuencia de ADN con información de secuencia en una base de datos de computadora. En una modalidad, la endonucleasa de restricción reconoce una secuencia de reconocimiento de 4 bases. En otra modalidad, el paso de digestión comprende además la clonación de los fragmentos digeridos o amplificación de RCP de los fragmentos digeridos. En una modalidad, el gen e identifica por RCP inversa. Por lo tanto, los sistemas de transposón similares a piggyBac de la invención también se pueden usar para descubrimiento de genes. En un ejemplo, el piggyBac en combinación con la proteina de transposasa similar a piggyBac o ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac se introduce en una célula. El transposón similar a piggyBac preferiblemente comprende un inserto que incluye una proteina de marcador, tal como PFV y un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, preferiblemente una secuencia de reconocimiento de 6 bases. Después de la integración, el ADN de células se aisla y digiere con la endonucleasa de restricción. Cuando se usa una endonucleasa de restricción que emplea una secuencia de reconocimiento de 4 bases, el ADN de las células se corta en fragmentos de aproximadamente 256 pb . Esto fragmentos pueden clonarse o los ligadores pueden añadirse, las reacciones de RCP se usan para amplificar fragmentos usando iniciadores de los enlazadores e iniciadores que se unen a las repeticiones directas de las repeticiones invertidas en el fragmento de ácidos nucleicos. Los fragmentos amplificados se secuencian y el ADN que flanquea las repeticiones directas se usan para buscar bases de datos en la computadora tal como Banco de Genes. ¦ 5.12.1. Reversión Fenotipica para Verificación de Mutación Los transposones similares a piggyBac empleados en los métodos de la invención se eliminan con presión por la transposición in vivo, sin salir detrás de cualquiera de las secuencias de transposones por eliminación. Esta característica del sistema de transposón similar a piggyBac puede tener la ventaja para confirmar que un fenotipo observado en un vertebrado no humano directamente resulta de la inserción de un transposón similar a piggyBac en el genoma. 5.13. Terapia de Genes Los vectores de transferencia de genes para. terapia pueden clasificarse ampliamente como vectores virales o vectores no virales. El uso del sistema de transposón similar a piggyBac es un refinamiento de transferencia de genes mediada por ADN no viral. Hasta la actualidad, se ha encontrado que los vectores virales son más eficientes para introducir y expresar genes en células. Hay varias razones por las que la transferencia de genes no viral es superior a la transferencia de genes mediada por virus para el desarrollo de nuevas terapias de genes. Por ejemplo, adaptando los virus como agente para la terapia de genes se restringe el diseño genético a las limitaciones de este genoma. de virus en términos de tamaño, estructura y regulación de expresión. Los vectores no virales se generan en gran parte de materiales de partida sintéticos y por lo tanto se manufacturan más fácilmente que los vectores virales. Los reactivos no virales tienen menos probabilidad de ser inmunogénicos que los agentes virales que hacen posible la administración repetida. Los vectores no virales son más estables que los vectores virales y por lo tanto son más adecuados para la formulación farmacéutica y la aplicación que los vectores virales. Los sistemas de transferencia de genes no virales actuales no se equipan para promover la integración de ácido nucleico en el ADN de una célula, incluyendo cromosomas huésped. Como resultado, las frecuencias de transferencia de genes estables que usan sistema son virales han sido muy bajos; 0.1% cuando mucho en células de cultivo en tejidos y mucho menos en células primarias y tejidos. El sistema presente es un sistema de transferencia de enes no viral que facilita la integración y mejora notoriamente la frecuencia de transferencia de genes estable. En el sistema de transferencia de genes de esta invención la transposasa similar a piggyBac puede introducirse en la célula como una proteina o como ácido nucleico que codifica la proteina. En una modalidad, el ácido nucleico que codifica la proteina es ARN y en otra, el ácido nucleico es ADN. Además, el ácido nucleico que codifica la transposasa similar a piggyBac puede incorporarse en una célula a través de un vector viral, lipido cationico y otros mecanismos de transfección normales incluyendo electroporación o bombardeo de partículas usado para células eucariótico. Después de la introducción de ácido nucleico que codifica el transposón similar a piggyBac, la transposasa similar a piggyBac puede introducirse en la misma célula. Similarmente, la transposasa similar a piggyBac puede introducirse en la célula como un fragmento lineal o como un fragmento circularizado, preferiblemente como un plásmido o como un ADN viral recombinante . Preferiblemente la secuencia de ácido nucleico comprende por lo menos una porción de un marco de lectura abierto para producir un producto que contiene aminoácidos. En una modalidad preferida, el transposón similar a piggyBac comprende un inserto que codifica por lo menos una proteina, por. ejemplo, un marcador seleccionable , un reportero, una proteina terapéutica o una proteina de valor en la industria ganadera, e incluye por lo menos un promotor seleccionado para expresión directa del marco de lectura abierto o región de codificación insertada en el transposón similar a piggyBac . Una descripción más extensa de de las regiones de codificación adecuadas contenidas en los transposones similares a piggyBac de la invención son provistas en la Sección 5.14, anterior. Para revisiones generales de los métodos de terapia de genes, véase Goldspiel y otros, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; u and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Mayo, 1993, TIBTECH 11 (5) : 155-215) . Los métodos conocidos comúnmente en la materia de tecnología de ADN recombinante que puede usarse se describieron en Ausubel y otros (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, New York. Cualquiera de dichos métodos pueden usarse para suministrar un ácido nucleico similar a piggyBac de la invención.

El suministro del ácido nucleico similar a piggyBac, v.gr. , un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac y/o secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, está ligada operablemente de manera opcional a un promotor, en un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o al vector que porta el ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células se transforman primero con el ácido nucleico . similar a piggyBac in vitro, luego transplantado en el paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respectivamente como terapia de genes in vivo o ex vivo. En una modalidad especifica, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, en donde se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por cualquier método numeroso conocido en la materia, v.gr., construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se convierte intracelular , v.gr., por infección usando un vector retroviral o viral defectuoso o atenuado (véase Patente de E.U.A. No. 4,980,286) o por inyección directa de ADN puro, o mediante el uso de bombardeo de micoparticulas (v.gr, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o revistiendo con lipidos o receptores de superficie celular o agentes de transíección, encapsulacion en liposomas, micropartículas, o microcápsulas o administrándolo entrelazado con un péptido que se conoce que entra al núcleo, administrándolo en entrelazamientos a un ligando sujeto a la endocitosis mediada por el receptor (véase v.gr . , u y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262-4429-4432) (que se pueden usar para dirigir tipos de células que expresan especifícamele a los receptores), etc. En otra modalidad, un complejo de lingandos de ácido nucleico pueden formarse en los cuales el ligando comprende un péptido viral fusogénico para alterar endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En aún otra modalidad, el ácido nucleico puede dirigirse in vivo para la absorción y expresión específica para células, dirigiéndose a un receptor específico (véase, v.gr., Publicaciones de WO 92/06180 con fecha Abr. 16, 1992 (WU et al.); WO 92/22635 con fecha Dic. 23, 1992 (Wilson et al.); WO 92/20316 con fecha Nov. 26, 1992 (Findeis et al.); WO 93/14188 con fecha Jul . 22, 1993 (Clarke et al.), WO 93/20221 con fecha Oct . 14, 1993 (Young) ) . Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intercelularmente e incorporarse dentro del ADN de las células huésped para la expresión, por recombinación homologa (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci .

EUA 86:8932-8935; Zijlstra y otros, 1989, Nature 342:435-438) . En una modalidad específica, se usa un vector viral que contiene el ácido nucleico similar a piggyBac . Por ejemplo, se puede usar un vector retroviral (véase iller y otros, 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599) . Estos vectores retrovirales se han modificado para borrar secuencias retrovirales que no son necesarias para empacar el genoma viral y la integración en ADN de células huésped. El ácido nucleico similar a piggyBac que será usado en terapia de genes se clonó en el vector, lo cual facilita el suministro del gen en un paciente. Mas detalles acerca de vectores retrovirales se .pueden encontrar en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en la terapia de genes son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Buman Gene Therapy 4:129-141; y Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114: Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden usar en terapia de genes. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan naturalmente el epitelio respiratorio en donde ocasionan una enfermedad moderada. Otros blancos para sistemas de suministro basados en adenovirus son hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tiene la ventaja de poder infectar células sin división. Kozarsky y Wilson, 1993, Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503 presenta una revisión de terapia de genes basada en adenovirus. Bout y otros, 1994, Human Gene therapy 5:3-10 demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en terapia de genes puede encontrarse en Rosenfeld y otros, 1991, Science 252:431; Rosenfeld y otros, 1992, Cell. 68: 143-155; Mastrangeli y otros, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234. Los virus adeno-asociados (AVV) también se han propuesto para usarse en terapia de genes (Walsh y otros, 1993, Proc. Soc. Exp . Biol . ed. 204:289-300. Otro enfoque de terapia de genes implica transferir un ácido nucleico similar a piggyBac a células en cultivo de tejidos por dichos métodos como electroporación, lipofección, transfección mediada con fosfato de calcio, o infección viral. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcado seleccionable a las células. Las células se colocan luego bajo selección para similar las células que se han tomado y que expresan el gen transferido. Aquellas células que se suministran a un paciente. En esta modalidad, el ácido nucleico similar a piggyBac se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede portarse por cualquier método conocido en la materia, incluyendo pero no limitado a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago conteniendo las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas , fusión de esferoblastos , etc. Se conocen numerosas técnicas en la materia para la introducción de genes extraños en células (véase v.gr. , Loeffler y Ehr, 1993, eth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) y puede usarse de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando no se alteren las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptores. La técnica deberá proveer la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de manera que el ácido nucleico se pueda expresar por la célula y heredar y expresar preferiblemente por su progenie de células. Las células recombinantes resultantes pueden suministrarse a un paciente por varios métodos conocidos en la materia. En una modalidad preferida, se inyectan células epiteliales, v.gr, subcutáneamente. En otra modalidad, las células de piel recombinantes pueden aplicarse como un injerto de pe en el paciente. Las células sanguíneas recombinantes (v.gr, células made o progenitoras hematopoyéticas ) preferiblemente se administran intravenosamente. La cantidad de células previstas para uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y pueden determinarse por alguien experto en la materia. Las células en las cuales se puede introducir un ácido nucleico similar a piggyBac pueden introducirse para fines de terapia de genes abarca cualquier tipo de célula disponible e incluyen, pero no está limita a células epiteliales, células · endoteliales , queratinocitos , fibroblastos, células del músculo, hepatocitos ; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrofilos, eosinófilos, megacariocitos , granulocitos , varias células madre y progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, v.gr., obtenidas de médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. 5.14. Proteínas Codificadas por Transposones similares a piggyBac Como se trata en la presente, los transposones similares piggyBac de la invención son útiles para suministrar una variedad de ácidos nucleicos contenidos por los ácidos nucleicos a un sujeto. Adicionalmente, en ciertas aplicaciones tales como atrapar el mejorador, los transposomas pueden contener útilmente genes marcadores. En aún otro aspecto, los transposones similares a piggyBac pueden contener una secuencia de nucleótidos que modifica una característica en el genoraa de la célula u organismo blanco, un marcador seleccionable , etc. Ejemplos de dichos ácidos nucleicos contenidos por los transposones similares a piggyBac de la invención se proveen enseguida. Los genes terapéuticos específicos para usarse en el tratamiento o prevención de condiciones de enfermedad basadas en defectos genéticos incluyen genes que codifican los siguiente,? productos: factor' IX, ß-globina, receptor de proteína de baja densidad, adenosina desaminasa, fosforilasa de nucleósidos de purina, esfingomielinasa, glucocerebrosidasa, regulador de transmembrana de fibrosis cística, a-antitripsina, CD18, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, fenilalanina hidroxilasa, a-cetoácido deshidrogenase de cadena ramificada, fumarilacetoacetato hidrolasa, glucosa 6-fosfatasa, a-L-fucosidasa, ß-glucuronidasa, a-L-iduronidasa , galactosa 1-fosfato uridiltransfrasa, insulina, hormona de crecimiento humano, eritropoyetina , ¦ factor VII de formación de grumos, hormona de crecimiento de bovinos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor VIII de formación de grumos, trombopoyetina, interleucina 1, interluecina 2, interleucina 1 RA, superoxido dismutasa, catalasa, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de neuritos, factor de estimulación de colonias de granulocitos, L-asparaginasas, uricasa, quimiotripsina, carboxipeptidasa, sucrasa, calcitonina, producto de gen Ob, glucagon, interferon, factor de crecimiento de transformación, factor de transformación de neuritas ciliar, factor-1 de crecimiento similar a insulina, facto de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos , factor de neurita derivada de cerebro, insulinotropina, activador de plasminogeno de tejido, uroquinasa, estreptoquinasa, adenosina desamidasa, calcitonina, arginasa, feninalanina amonia liasa, gama-interferon, pepsina, tripsina, elastasa, lactasa, factor intrínseco, colecistoquinina, y hormona insulinotrófica, y similares . Los genes terapéuticos de cáncer que se pueden suministrar vía los métodos de la presente incluyen: genes que mejorar la' actividad antitumoral de linfocitos, genes cuyo producto de expresión mejora la inmunogenicidad de células tumorales, genes supresores de tumores, genes de toxinas, genes suicidas, genes de resistencia a múltiples fármacos, secuencias de contrasentido, y similares. Las secuencias de genes marcadores por los transposones similares a piggyBac de la invención pueden se runa enzima, una proteína y péptido que comprende un epítope, un receptor, un transportador, ARNt, 'ARNr, o una molécula bioluminiscente, quimioluminiscente o ' fluorescente. En modalidades , específicas, el marcador es proteína fluorescente verde (PFV) o una mutante de la misma, tal como una PFV mutante que tiene una longitud de onda de fluorescencia alterada, fluorescencia incrementada, o ambas. En cierta modalidad especifica, la PFV mutante es PFV azul. En otros modos de la modalidad, la molécula fluorescente es proteina fluorescente roja (véase Sección 6) o proteina fluorescente amarilla. En aún otras modalidades, el marcador es cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , ß-galactosidasa (lacZ) y luciferasa (LUC) . En usos de ganadería, los transposones similares piggyBac pueden contener secuencias para hormonas del crecimiento, tales como factores de crecimiento similares a insulina (IGF), por ejemplo para promover crecimiento en un animal transgénico. En otros usos de ganadería, el transgen contenido por el transposón similar a piggyBac puede proveer mayor resistencia a la enfermedad. Un número de genes marcadores pueden insertarse en los transposones similares a piggyBac en la invención, incluyendo peor no limitado a timidina cinasa de virus de herpes simple ( igler y oros, 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026), y se pueden usar genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y otros, 1980, Cell 22:817) como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato en células tk, hgprt, o aprt, respectivamente. También, la resistencia de antimetabolitos puede usarse como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato ( igler y otros, 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare y otros, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico ( ulligan & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:2072); neo, que cnfiere resitencia a aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin y otros, 1981, J. Mol. Biol . 150:1); higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerr y otros, 1984, Gene 30:147); trpB, que permite que las células usen indol en lugar de triptofano; hisD, que permite que las células usen histinol en lugar de histidina (Hatman & Mulligan, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8047); y ODC (ornitinadescarboxilasa) qu econfier resistencia al inhibidor de ornitinadescarboxilasa, 2-(difluorometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, L., 1987, En: Current Communications in Molecualr Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed.). 5.15. Las Secuencias Sin Codificación Contenidas por Transposones similares a PiggyBac Además, o como una alternativa para, un . MLA, el transposón similar a piggyBac de la presente invención puede incluir también por lo menos una secuencia que 'se reconoce por una proteina que une a y/o modifica ácidos nucleicos. En modalidades especificas, la proteína es una proteína de unión de ADN, una proteína de modificación de ADN, una proteína de unión de ARN, o una proteína de modificación de ARN. En ciertas modalidades específicas, la secuencia es una que se reconoce por una endonucleasa de restricción, es decir, un sitio de restricción. Una variedad de sitios de restricción se conocen en la materia y pueden incluirse, por ejemplo, sitios reconocidos por las siguientes enzimas de restricción: HinglII, PstI, Salí, Accl, HincII, Xbal, BamHI, Smal, Xmal, Kpnl, SacI, EcoRI, y similares. En otras modalidades específicas, la secuencia es un sitio blanco para una recombinas específica para sitios, tales como recombinasas de FLP (es decir, la secuencia es un FRT) o la recombinasa de CRE (es decir, la secuencia es IoxP) . Dichas modalidades son útiles para entrar animales de mosaico, como se describió en la Sección 5.7) . 5.16. Usos Veterinarios y de Ganadería de la Invención Los métodos y composiciones presentes pueden utilizarse en un animal no human para uso veterinario para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno o para mejorar la calidad del ganado. En una modalidad específica, el animal no humano es una mascota doméstica. En otra modalidad específica, el animal no humano es un animal de ganado. En una modalidad preferida, el animal no humano es un mamífero, más preferiblemente una vaca, caballo, oveja, cerdo, gato, perro, ratón, rata, conejo, hámster, visón, o conejillo de india. En otra modalidad preferida, el animal no humano es una especie de ave del corral, más preferiblemente un pollo, pavo, pato, ganso o codorniz. 6. Ejemplos 6.1. Introducción Los elementos transposable se han usado rutinariamente como herramientas para manipulaciones genéticas en organismos inferiores, incluyendo la generación de animales transgénicos y mutagénesis insercional. En contraste, el uso de transposones en ratones y otros sistemas vertebrados aún se limita debido a la falta de un sistema de transposón eficiente. Hemos probado la capacidad de piggyBac, un transposón de ADN de de la palomilla del gusano de la col, Trichoplusia ni, para transposicionarse en sistemas de mamíferos, y han encontrado que los elemento de piggyBac que portan múltiples genes pueden transposicionarse eficientemente en líneas celulares de humanos y ratones y también en ratones. Los datos representados en la presente indican que durante la . transposición de la línea general los elementos piggyBac se eliminan precisamente de sitios de inserción originales y se transposicionan en el genoma de ratones en sitios diversos, preferiblemente unidades de transcripción, y se permite la expresión de los genes marcadores portado por el transposón. Estos datos proveen un paso critico hacia un sistema de transposón altamente eficiente para una variedad de manipulaciones genéticos que incluyen transgénesis y mutagénesis insercional en ratones y otros vertebrados . 6.2. Materiales y Métodos 6.2.1. Construcción de plásmidos PB[SV40-neo] : El fragmento de BamHI-Kpnl de pSLfall80fa (Horn and Wimmer, 2000, Dev Genes Evol 210, 630-637) se reemplazó por el fragmento de BamHI-Kpnl de pCLXSN (IMGENEX) . El cásete de neomicina se cortó luego con AscI y se insertó en el sitio de AscI de pBac { 3xP3-EGFPafm} (Horn and Wimmer, 2000, Dev. Genes Evol. 210:630-637) . CMV-PBase : La secuencia de codificación de la transposasa de piggyBac fue RCP amplificada de phsp-Bac (Handler and Harrell, 2001, Insect Biochem Mol Biol 31:199-205) con iniciadores BacEN-F ( 5 ' -GCCACCATGGGATGTTCTTTAG-3 ' ) (SEC ID NO: 1) y BacEN-B (5 ' -GTACTCAGAACAACTTTGGC-31 ) (SEC ID NO: 2), y se clonó en los sitios Spel ySPhl de pSLfall80fa para generar pSL-BacEN. Un fragmento de HindIII-EcoRI que contiene el gen de transposasa se aisló de pSL-BacEN y se insertó en pcDNA4/HisA (Invitrogen) para generar la construcción final. PB[PGK-neo] : El gen PG -neo de pPNT (Tybulewicz y otros, 1991, Cell 65:1153-1163.) se clonó en el sitio BglIII de pBac-AB, una construcción de piggyBac modificada para generar PB [PGK-neo]. PB[Act-RFP] : El fragmento de EcoRI de 0.7 kb de pCX-EGFP (Okabe y otros, 1997, FEBS Lett 407:313-319) se reemplazó por la secuencia de codificación de mRFP (Campbell y otros, 2002, Proc. at'l. Acad. Sci. EUA 99:7877-7882) para crear pX-RFP. El fragmento de SalI-BamHI de pCX-RFP incluyendo el 'cásete de expresión de RFP intacto además se clonó en el sitio de BglII de pBac-AB para generar PB[Act- RFP] . Los polienlazadores se agregaron para generar el vector de PB universal PB [Act-RFP] DS , que tiene múltiples sitios de clonación únicos. Prml-PBase : El promotor de Pmr-1 y el fragmento de BamHI-SalI de 'pPrml-rSBlO (Fischer y otros, 2001, Proc. Nat'l.' Acad. Sci. EUA 98:6759-6764) se clonaron en el sitio HindIII y el sitio BamHI-Xhol de pSL-BacEN, respectivamente, para generar este plásmido auxiliar de transposasa especifica para testículos. Act-PBase : usando un enlazador Nhel-Notl, el fragmento de EcoRI de pCX-EGFP se reemplazó por el fragmento de transposasa Spel-EagI de pSL-BacEn para generar este plásmido auxiliar de transposasa expresado ubicuitamente. PB [K14-Tyr] : El fragmento Smal de promotor K14 en plnK14-Albino (Saitou y otros, 1995, Nature 37 :159-162), un ADNc tirosinasa amplificado de una muestra de piel de un ratón de 129Sv por RCP-TA, y el SV40 polyA, se insertó en el sitio BglII de pBac-AB para generar PB[K14-Tyr]. PB[K14-Tyr, Act-RFP] : El fragmento de SalI-BamHI de pCx-RFP se clonó en el sitio de AscI de PB[K14-Tyr] para generar esta construcción. PB [Act-RFP, MCK-TSC1] : El fragmento Smal de PB [Act-RFP] , que consiste del cásete de expresión de y la terminación izquierda (piggyBacL) se usó para reemplazar el fragmento de SalI-EcoRV de pBluescript para generar pBS-BLRFP. El fragmento de Smal-EcoRV de PB [Act-RFP] DS, que consiste de la terminación derecha (PBR), se clonó luego en el sitio PMel de pBS-BLRFP para generar PB [Act-RFP], que sirve como un vector transgénico basado en piggyBac universal y un poliA hGH (Nguyen y otros, 1998, Science 279:1725-1729) se clonó en el sitio Swaql de PB [Act-RFP] DS . 6.2.2. Transfecciones de células 293 células se cultivaron en DMEM .(GIBCO/BRL) suplementado con 10% de suero a 37°C y 5% C02. Se sembraron 1.5xl05 células en cada pozo de una placa de 24 pozos un día antes de la transfección . Para cada pozo, 0.5 µ? de PB[SV40-neo] circular y 0.5 g C V-PBase circular en el grupo de prueba o 0.5 yg de pcDMA4/HisA circular en grupo de control se transfectaron por LipofectAMINE 2000 de acuerdo con el protocolo normal ( Invitrogen) . Un día después de la transfección, las células en cada pozo se tripsinizaron y sembraron en una placa de 10 cm en medio conteniendo 500 mg/ml G-418 (GIBCO/BRL) . La selección de fármaco continuó durante dos semanas. Las condiciones para el cultivo y electroporación de células madre embriónicas (ME) de ratón W4/129S6 se describieron en los protocolos recomendados por el fabricante (Tacnonic) . Veinticuatro microgramos de PB[PGK-neo] y 6 yg de Act-PBase en el grupo de prueba o 6 yg de ADN de esperma de arenque (Promega) en el grupo de control se usaron para electroporación de diez millones de células. Inmediatamente después de la electroporación, las células en cada grupo se sembraron en tres placas de 10 cm conteniendo células alimentadoras de fibroblastos embriónicos de ratón tratadas con mitomicina C. La selección se inició 48 horas después de la electroporación con medio conteniendo 200 mg/ml G-418. La selección de fármacos continuó durante dos semanas. Al final de la selección de fármaco, las células se fijaron con PBS conteniendo 4% de paraformaldehido durante 10 minutos y luego se tiñeron con 0.2% de azul de metileno durante una hora. Los clones se contaron después de lavado extenso con agua desionizada. 6.2.3. Análisis de RCP y secuencia Las digestiones de Haelll o MspI de ADN genómico se autoligaron para servir como el modelo para RCP inversa. Los iniciadores usados para recuperar la secuencia de flanqueo del lado izquierdo del transposón de piggyBac fueron LFl (5'-CTT GAC CTT GCC ACA GAG GAC ,??? TAG AGG-3 ' ) (SEC ID NO: 3) Y LAR1 (5'-CAG TGA CAC TTA CCG CAT TGA CAA GCA CGC-3') (SEC ID NO: 4). Los iniciadores usados para recuperar la secuencia de flanqueo del lado derecho del transposón de piggyBac fueron FR1 (5'-CCT CGA TAT ACA GAC CGA TAA AAC ACA TGC-3') (SEC ID NO: 5) y RR1 (5'-AGT CAG TCA GAA ACA ACT TTG GCA CAT ATC-3') (SEC ID NO: 6) . La detección de RCP del sitio . de eliminación se llevó a cabo con el iniciador ELI (5'-CCA TAT ACG CAT CGG GTT GA-3') (SEC ID NO: 7) y el iniciador ER1 (5' -TTA AAG TTT AGG TCG AGT AAA GCG C-3') (SEC ID NO: 8) . Los productos de RCP se clonaron en el vector pGEE -T (Promega) para secuenciación subsiguiente. Los resultados de secuenciación se analizaron con investigaciones de BLAST NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) y bases de datos -del genoma de humanos o ratón Ensembl (www.ensembl.org).

Para detectar preferencias de secuencias adicionales de eventos de inserción de PB, cinco pares de bases corriente arriba y corriente abajo del sitio blanco de TTAA se analizaron para 100 inserciones de piggyBac en ratones. A mismo tiempo, 100 sitios de TTAA seleccionados aleatoriamente se analizaron como el control. Se calcularon probabilidades por un lado entre dos proporciones con STTISTICA 6.0. 6.2.4. Generación de Ratones Transgénicos Se mezclaron construcciones de donadores piggyBac circulares con un plásmido auxiliara a una relación de 2:1. Las muestras de ADN mixtas (2 ng/µ?) se microiyectaron en los oocitos FVB/Nj fertilizados como se describió (Nagy y -otros, 2003, Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3a. edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press)) . 6.2.5. Análisis Southern El ADN genómico se aisló de muestras en cola, se digirieron con EcoRV y BGIII y luego se fraccionaron en 0.7% de geles de agarosa antes del análisis Southern. La sonda fue un fragmento de 499 pb de digestión de Sacll de PB[Act-RFP]. 6.3. Resultados 6.3.1. Actividad de transposición de piggyBac en células de mamíferos cultivadas Un sistema de análisis de co-transfección binario que consiste de un donador y un plásmido auxiliar se diseño para detecta eventos de integración cromosomal medida por piggyBac en células de cultivo de tejidos. El plásmido donador contiene los elementos de piggyBac en los cuales se reemplazó la transposasa de piggyBac (PBase) por un marcador de selección de fármacos (Fig. 1A) . El plásmido auxiliar portó el fragmento de transposasa pero careció de las secuencias terminales requeridas para la transposición (Fig. IB) . En ausencia del plásmido auxiliar, el plásmido donador puede integrarse aleatoriamente en el genoma, pero estos eventos de integración aleatorios pueden reducirse al mínimo si el plásmido se mantiene en forma circular. Por lo tanto, un incremento de clones resistentes a fármaco en presencia de plásmido auxiliar podría indicar eventos de transposición. Primero se examinó la transposición de piggyBac en 293 células de humanos. La co-transfección del elemento donador PB [SV40-neo] que porta un gen (neo) de resistencia a la neomicina impulsada por el promotor de SV40 y el CMV-PBase auxiliar que porte una transposasa expresada ubicuitamente (Fig. 1) produjo clones resistentes a neomicina 10 veces superiores a la transfección con plásmido donador solo (Fig. 2A) . Para probar si la integración elevada de donador se debió a la transposición, se · realizó RCP inversa para recuperar secuencia adyacente al sitio de repetición de terminal invertida derecha de piggyBac (RPB) de PB[SV40-neo] integrado (Fig. 1A) . Lo productos de RCP de un evento de transposición real deberá dar como resultado secuencia genómica fuera de RPB en lugar de la secuencia de plásmidos. Dieciocho secuencias genómicas independientes se recuperaron de cinco clones resistentes a fármacos. Todas estas secuencias contuvieron la secuencia TTAA de firma en el sitio de integración (Tabla 2) .

Posición Inserto N. Sitio de inserto Cromosoma Nombre de pene de inserto PBE-1T 3 nAAAGAAACACAG (SEQ. ID NO:9) 4 NM 003603 intron PBE- 1T 6 TTAATAAAGGGGTTfSEQ.ID NO:10) repite (MER7A) PBE-1T 5 TTAAAGCTCAAA(SEQ.ID N0: 1 1 ) repite PBE-1T-7 TTAAAAAAATITATfSEQ.ID NO: 12) 12 Q9Y219 intron PBE-1 T -1 1 TTAAAGAATCATGG(SEQ.ID NO:13) 6 Na PBE-1T-13 TTAATACAACTTGC (SEQ.ID NO: 14) 7 intergenico PBE-1T-15 TTAAAACGGAAGTT(SEQ.ID NO: 15) 2 ERBB4 intron PBE- 1T-29 TTAAGTAATAATAA(SEQ.ID NO: 1 6) Repite (Alu) PBE-1T-36 TTAAAAGCTAAGCC(SEQ.ID NO: 17) 3 intergenico PBE-2T-6 TTAATTAATCTGGG(SEQ.ID NO:18) 14 NA PBE-2T-10 TTAAAGTAAGAAAT(SEQ.ID NO: 19) 3 NA PBE-3T-2 TTAAAGTAAGAATfSEQ.ID NO:20) 19 X -371 190 intron PBE-3T-7 TTAAAGGAATACCA(SEQ.ID NO:21 ) 18 intergenico ???-3?-? TTAATAATTTGTCC(SEQ.ID NO:22) 17 ENSESTT000O0051373 intron repite (MER61 E- PBE-6T-2 TTAAAGATCAAAGT(SEQ.ID NO:23] ¡nt) PBE-6T-4 TTAATAAmGTCC (SEQ.ID NO:24) 22 PLA2G6 intron PBE 7T-1 TTAAAGAATGGTTA(SEQ.ID NO:25) 22 Q8TC68 intron PBE-7T-7 TTAAAAGACCTTTA(SEQ. ID NO: 26) repite (VER VH) Tabla 2. Transposición de PB en 293 células humanas La duplicación de TTAA se confirmo por secuenciación de varios fragmentos de unión en el otro extremo del transposón (datos no mostrados) . En contraste, él análisis de RCP inverso de clones resistentes a neomicina transfectaron establemente los clones resistentes a neomicina con PB[SV40-neo] solo · únicamente detectado junto con secuencias de plásmidos, que es consistente con eventos de inserción aleatorios (datos no mostrados) . Este experimento demostró que la transposición de piggyBac en células humanas con la misma preferencia de sitio como en células de insectos. Se obtuvieron resultados similares cunado el procedimiento de co-tfansfección se llevó a cabo en células de Ovario de Hámster Chinos (CHO) y célula MvlLu (de origen de visón) (véase Fig . 7) . Después probamos la capacidad de piggyBac para transposicionarse en células madre embriónicas (ME) W4/129S6. En esta prueba, el elemento PB[PGK-neoo] de plásmidos donadores portaron un gen neo impulsado por el promotor de PGK y el plásmido auxiliar aAct-PBase proporcionó transposasa de piggyBac bajo el control de un promotor de activa híbrido (Fig. IB). En tres experimentos, la transfección de de transfección repetidos, PB[PGK-neo] y Act-PBase produjo clones resistentes a fármacos en transfección de PB[PGK-neo] tha 50 veces superior sola (Fig. 2B y 2C) . El análisis de RCP inverso confirmó que la producción del clon mejorada se debió a la transposición (Tabla 3) .

Posición de Inserto N. Sitio de inserto Cromosoma Nombre de gene inserto TTAAAGAAACACAG (SEQ. ID PBES2T1 NO:27] 2 B230339M05Rik intron TTAATAAAGGGGTT(SEQ.ID PBES2T3 NO:28) 1 GENSCAN00000093186 intron TTAAAGCTCAAA(SEQ.ID PBES2T4 NO:29) repite (LTRs) TTAAAAAAATITATfSEQ.ID PBES4T58 NO: 12) 6 4833415F 1 I ik exon TTAAAGAATCATGGfSEQ.ID PBES4T59 N0: 13) 5· Nol5a ¡ntergenetico TTAATACAACTTGCfSEQ.ID PBES4T63 NO: l 4) 2 intron TTAAAACGGAAGTT(SEQ.ID PBE9T27 N0: 15) 5 ERBB4 ¡ntergenetico Tabla 3. Transposición de PB en células madre embriónicas 4/129S6 Se obtuvieron resultados de transposición similares cuando el procedimiento de co-transfección se llevó a cabo en una variedad de lineas celulares de. diferentes orígenes, incluyendo visón, hámster, rata, mono, humano y pollo (véase Fig. 8) . 6.3.2. PiggyBac se transposiciono eficientemente en la linea germinal en ratones La transposición eficiente en células de ME en ratones conllevó a la prueba de viabilidad de la transposición de piggyBac en la línea germinal de ratones. La coinyección de pronucleos del donador de transposón y plásmidos auxiliares de transposasa se llevó a cabo para genera ratones transgénicos . Para facilita el análisis de transposición en ratones transgénicos, se usaron marcadores visibles (Proteina Fluorescente Roja, PFR) en lugar de marcadores resistentes a fármacos en plásmidos dé donadores. Los elementos de pB[Act-RFP] donadores y el plásmido auxiliar Act-PBase se coinyectaron en formas circulares en pronucleos de embriones de ratón FVB/N . El análisis de RCP mostró que 34.8% (62/184) de los fundadores fue positivo sencillo para PB[Act-RFP], 00'.5% (1/184) fe positivo sencillo para Act-PBase, y 2.7% (5/184) fue doble positivo. En comparación, solo 10.4% (10/96) de las pústulas fueron positivas cuando se llevó a cabo la inyección con PB[Act-RFP] solo. Se obtuvieron resultados similares cuando un elemento de PB más grande con un gen marcador diferente, tirosinasa, que afecta la pigmentación de la piel, PB[K14-Tyr], se coinyectó con la misma construcción auxiliar (Fig. 1 y Fig. 3A) . Para analizar las estructuras de transgenes integrados en fundadores positivos para PFR, se realizó la hibridización de Southern con una sonda especifica para transposón' (Fig. 1A) . La mayoría de los fundadores portaron eventos de integración múltiples (Fig. 3.B) . Luego se realizó RCP inversa para recuperar secuencias genómicas que flanquean' las terminaciones de transposón. Un total de 85 eventos de transposición se recuperaron de 42 fundadores positivos para PFR (Tabla 4) .

Inserto Posición de N. Sitio de inserto Cromosoma Nombre de gene inserto AFO- TTAAAGAAACACAG (SEQ. T2?22 ID NO:34) 1 interqenetico AFO- TTAATAAAGGGGTTfSEQ.ID 166T18 NO:35) 1 GTL6 intron CFO- TTAAAGCTCAAAfSEQ.ID 61T70 NO:36) 1 NMJ 77835 intron CFO- TTAAAAAAATITAT(SEQ.ID 71TÓ1 NO:37) 1 Stau2 inron AF 1 - TTAAAGAATCATGG(SEQ.ID 38T20 NO:38) 2 Trpm7 exon(3'UT ) CFO- TTAATACAACTTGCfSEQ.ID 70T55 NO:41 ) 2 NMJ 77727 intron AFO- TTAAAACGGAAGTTfSEQ.ID 24T5 NO:42) 2 GENSCAN000000621 19 intron AFO- TTAACATTCCAGACfSEQ. 38T15 ID NO:43) 3 intergénico2 AFO- TTAAAACTAGCTGT(SEQ ID 83T16 NO:44) 3 intergénico2 AFO- TTAAAATTCTGGGA (SEQ. 180T25 ID NO: 45) 3 Ash l l intron DFO- TTAAGTGGGAAAGT(SEQ. 18Y60 ID NO: 46) 3 Madh9 intron AFO- TTAAATATATGAAG(SEQ. ID 46T18 NO: 47) 3 GENSCAN000000621 19 intron AFO- TTAAAGAAATAAAC(SEQ. 70T2 ID NO: 48 3 GENSCAN00000082627 intron AFO- TTAAAAAATAATTC(SEQ. ID 34T4 NO: 49) 4 4930523 1 Rik intron CFO- TTAAGAACACAGGT(SEQ. 70T56 ID NO: 50 4 ENSMUSEST00000035433 intron DFO- TTAACAAATGTTTG'(SEQ. ID 9T22 NO: 51 ) 4 ENSMUSEST0000065097 intron AFO- TTAAACGAAATAAG(SEQ. 153T10 ID NO: 52) 4 GENSCAN00000023389 intron AFO- TTAACAAGAGCTGAfSEQ. 50T15 ID NO: 53) 4 GENSCAN00000064724 intron CFO- TTAACAGAGGCAGC (SE 61T74 IC NO: 54) 4 intergénico3 AFO- TTAACAGAGGCAGC (SEC 51T3 ID. NO: 55) 4 intergénico3 AFO- TTAAGATGTGTGTG (SEC ID 180T5 NO: 56) 4 intergénico2-3 AFO- TTAAGCTTAACTGC (SEC ID 90T3 NO: 57) 5 intergenetico AFO- TTAAATTGCCTTCC (SEQ.ID 47T6 NO: 58) 5 pkd2 intrón AFO- TTAAAGAACAACAT (SEQ. 40T7 ID NO: 59) 5 GENSCAN00000122670 intrón AFO- TTAAGAATACATAC(SEQ. 90T12 ID NO: 60) 6 intergénico2 AFO- TTAATATCTGCTAT(SEQ. ID 53T1 1 NO: 61 ) 6 Osbp l 3 intrón AFO- TTAAGGAGGAAAGG(SEQ. 82T1 ID NO: 62) 6 ENSMUSG0000002979 intrón Inserción Nombre de Gen/ID de Posición de No. l Sitio de Inserción Cromosoma Ensamble Inserción AFO- TTAAGAGGAAATCG (SEC 90T30 ID NO:63) 6 Mgll intron AFO- TTAAAATATCTTAG(SEC ID 41T1 7 NO:64) 6 St7 intron AFO- TTAAATAAATTTAAfSEC ID 24T12 NO:65) 6 ENSMUSESTT00000055704 intron AFO- TTAA A ATATCTTAG (S EC ID 41T17 NO:64) ó S17 intron AFO- TTAAATAAATTTAA(SEC ID 24T12 NO:65) ó ENS USESn00000055704 intron AFO- TTAAATAGTAGAAAjSEC 87T1 ID NO:66) 6 intron AFO- TTAAGGCTAAGAAT(SEC 38T7 ID NO:ó7) 6 ¡nterqén¡co3 AFO- TTAAAAGCAGCATT(SEC 81 T10 ID NO:68) 7 ¡nterqén¡co2 CFO- TTAAAAATTAATTGjSEC ID 61 T68 NO:69) 7 ¡ntergénico AFO- TTAAAGTCATGTAA(SEC ID 81T2 NO. 0) 7 ¡ntergénico2,3 AFO- GTTAAAGCATTTAA(SEC ID I MT43 NO:7 l ] 7 ¡ntergénico2 AFO- TTAAGGAGAAAGATfSEC 1 2T5 ID NO:72) 8 Pmfbp l ¡ntron AFO- TTAAAGAACAACAA(SEC 70T7 ID NO:73) 8 Elavl l ¡ntron CFO- TTAAATAGTTAAAAjSEC ID 70T54 NO:74) 8 2410008G02Rik intron AFO- TTAAATA AG AGTTG (S EC 90T8 ID NO:75) 8 Nfix ¡nlron AFO- TTAATGAGTATGCA(SEC 48T30 ID NO:76) 8 GENSCAN0000010819 intron AFO- TTAAACCCTTCGCCfSEC 46T30 ID NO:77) 9 intergénico2 AFO- TTAAGGAGGAAATAfSEC 46T33 ID NO:78) 9 inter jénico2 AFO- TTAATGTTGAAGCAjSEC 46T34 ID NO:79) 9 ¡ntergén¡co2 AFO- TTAACCGCACTTCAjSEC 180T34 ID NO:80) 9 Dpp8 intron AFO- TTAAGATTTGTAAA(SEC ID 48T15 NO:81 ] 9 GESCAN00000135754 ¡ntron AFO- TTAAGGGAGAAAAG(SEC 1 1 T13 ID NO:82) 1 1 GENSCAN0000047992 ¡ntron AFO- TTAAGCAGGAAGCAjSEC 1 0T4 ID NO:83) 1 1 ENS USESTT00000064726 ¡ntron BF1 - TTAATAACTGTTTT(SEC ID 0T434 NO:84) 1 1 GENSCAN0000001 932 ¡nlron AFO- TTAACGAAGTCCAA(SEC 82T24 ID NO:85) 12 ENSMUSESTG000000131 3 ¡ntron BF1 - TTAAGGCTAGACTG(SEC 60T18 ID NO:86) 12 GENSCANOO00OO70967 ¡ntron CFO- TTAAGGAAATGACA(SEC 40T62 ID NO:87) 12 GENSCAN00000127032 ¡nlron AFO- TTAAATAAAGAAC(SEC ID 62T14 NO:88) 13 C730024G01 Rik exon AFO- TTAATCCCAGTACT(SEC 50T3 ID NO:89) 13 Lgals8 intron AFO- TTAAAATAAACATG(SEC 92T3 ID NO:90) 13 Hist 1 h2bm ¡nlron BF1- TTAAAAATCAATTT(SEC ID 29T64 NO:91 ) 13 Auh ¡ntron AFO- TTAAAGGTTTTTCA(SEC ID 52T5 NO:92) 13 2210404D 1 l Rik ¡ntron AFO- TTAACCAAGATCAA(SEC 50T24 ID NO:93) 13 ENSMUST00000038065 ¡ntron AFO- TTAAGATCTAAATT(SEC ID 30TI0 NO:94] 13 GENSCAN00000024946 intron CFO- TTAAGGTGTTTTCC(SEC ID 71T63 NO:95) 13 GENSCAN00000004330 intron Tabla 4. Transposición de PB en ratones. A, B: PB[Act-RFP] ; C: PB[K14-Tyr, Act-RFP] ; D: PB[Act-RFP, McK-TSC1] ; 2. Menos de 10 kb corriente abajo de genes conocidos o previstos; 3. Menos de 10 kb corriente arriba de genes conocidos o previstos; 4. Las inserciones de transposiciones de linea germinal . La mayoría de estas transposiciones se mapearon al genoma de ratón de acuerdo con secuencia genómica que flanquea la repetición de terminal derecha del transposón integrado. Seleccionamos aleatoriamente nueve eventos de transposición y amplificaron las secuencias de unión genómicas en el lado opuesto del transposón. En cada caso, la inserción del transposón se encontró que. produce una duplicación de TTAA precisa del sitio de integración (datos no mostrados) . Estos resultados indican que la mayoría de las integraciones de transgenes producidos de la co-inyección se debió a transposición. Para probar la capacidad de .transposones integrados para transmitir a través de la linea germinal, se aparearon varios fundadores negativos de plásmidos positivos pero auxiliares PB [Act-RFP] con ratones FVB/Nj tipo silvestre para generar lineas transgénicas . Uno de los 'fundadores (AFO-61) que tuvo ocho integraciones de PB [Act-RFP] se analizó en detalle. La genotipificación basada en RCP mostró que 15 de 16 progenies de este fundador retuvo el ADN- de transposón. El análisis de Southern de individuos positivos de RCP mostró que todos ellos heredaron por lo menos una copia di PB[Act-RFP] transposicionado (Fig. 3C y dato son mostrados). La segregación aleatoria de estos transgenes sugirió una distribución cromosomal diversa de los eventos de transposición iniciales en el fundador. El análisis de progenie de un segundo fundador (AFO-47) que portó un solo transposón indico que dos de ocho Fls en una sola carnada heredó el transposón (Fig. 3C y datos no mostrados) . La genotipificación basada en RCP con iniciadores que se dirigen a varios sitios de integración del transposón individual también confirmó herencia estable de los transposones integrados de fundadores a la generación Fl datos no mostrados). Juntos, la alta frecuencia de la integración de genes mediada por transposición y la capacidad de transgenes integrados para transmitirse a través de la linea germinal demuestra la viabilidad para usar elementos de piggyBac como herramientas de transferencia de genes en el ratón. 6.3.3. Eliminación y transposición precisa de piggyBac en linea germinal de ratones Se probó además el comportamiento de transposición de piggyBac en la linea germinal de ratones con la estrategia de crianza clásica de cultivos de "iniciadores" y "mutadores" (Cooley y otros, 1988, Science 239: 1121-1128; Horn y otros, 2003, Genetics 163:647-661). En este procedimiento, una linea de mutador que porta un transposón no autónomo se cruza con una linea iniciadora que expresa transposasa en la linea germinal macho. La transposición activa se espera que ocurra exclusivamente en las células germinales de machos que portan el ADN del transposón y de transposasa. Estos machos subsiguientemente se aparean con hembras tipo silvestre para producir lineas con nuevas inserciones, de transposones. Revisamos este procedimiento y usamos el método de coinyección para producir . directamente ratones doblemente positivos para un transposón no autónomo y un gen de transposasa auxiliar. Los animales transgénicos se produjeron por inyección de pronucleos convencional de plásmidos lineales, que aseguraran la cointegración tanto de plásmidos donadores como auxiliares en el mismo sitio. Se generaron varias lineas de ratones transgénicos que portan transgenes de transposasa de piggyBac (Prml-PBase) impulsadas por promotor de PB[Act-RFP] y protamina 1 (prml) . Se esperaba que el promotor prml fuera activo durante la espermiogénesis (O'Gorman y otros, 1997, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. EUA 94:14602-14607). Por lo tanto, en dichas lineas transgénicas o doblemente positivas, se esperaba que los ratones macho produjeron nuevos eventos de transposición mientras los ratones hembras podrían usarse como criadoras.

Una de dichas lineas transgénicas dobles, denominadas como BFO-33, se probó para transposición en su progenie. La hibridización de Southern con el iniciador especifico para transposones (Fig. 1A) reveló nuevas integraciones de transposones en 67.8% (19/28) de las progenies positivas para transposones (Fig. 4A y datos no mostrados) . En promedio, se generaron nuevas inserciones para gametos. Las nuevas inserciones parecieron, ser regionales dado que tres de las nuevas inserciones se secuenciaron y se encontró que se localizaron en tres cromosomas separados (BF1-29T6, BF1-30T43, y BF1-44T10 en la Tabla 4)'. Los iniciadores que se dirigen a secuencias de plásmidos PB,[Act-RFP] que flanquean el transposon se usaron para explorar el comportamiento de transposición de piggyBac en la linea germinal (Fig. 4B) . Si el piggyBac se transposicionó a través de una forma de cortar y pegar, un producto de RCP de 273 pb podría detectarse. Además, este producto de RCP se detectó en 1 de 17 descendientes de la línea BGO-33 (Fig. 4C) . Siete de estas muestras se secuenciaron y revelaron la existencia de un solo sitio blanco de TTAA (datos no mostrados), demostrando que el piggyBac se transposicionó a través de un mecanismo de corte y pegado preciso en la línea germinal macho de ratones. Debido a que el fundador portó una disposición transgénica, se espera que algunos eventos de transposición (progenie BF1-30 y BF1-32 en la Fig. 4B a 4C) no se acoplaron con detección de este producto de 273 pb . 6.3.4. Sistema de transposón de piggyBac como una herramienta transgénica única Previamente se mostró que la eficiencia de transposición disminuye significativamente con el incremento de la longitud de algunos transposones, lo cual obstaculiza su utilidad como herramienta genética. Por ejemplo, en las células de Hela, se mostró que los transposones de SB tienen una disminución de aproximadamente 30% en eficiencia de transposición con cada incremento en kb en longitud además de sus 2.2 kb originales de longitud (Izsvak y otros, 2000, J. Mol. Biol. 302: 93-102) . Para determinar la limitación de tamaño de transposición de PB en ratones, a varios elementos de PB que varían de 4.8 a 14.3 kb se usaron para crear ratones transgénicos (Fig. 1A) . Estos transposones portados por un cásete reportero de PR y/o una unidad de transcripción separada. El régimen de integración de estos elementos de PB en plásmidos circulares se probaron en ausencia oa presencia de plásmido auxiliar Act-PBase (Fig. 3A) . Los resultados indicaron que los elementos de PB pueden variar 9.1 kb de la secuencia extraña sin reducir significativamente la eficiencia de integración. Los análisis de RCP confirmaron la presencia de eventos de transposición en 83.9% (26/31) de los fundadores con el elemento de PB[K14-Tyr, Act-RFP], el cual porta dos genes marcadores. La integración asistida por el Auxiliar disminuyó usando el elemento PB [Act-RFP, MCK-TSC] de 14.3 kb. Once fundadores positivos para Pb [Act-RFP, MCK-TSC1] se analizaron por hibridización Southern y RCP inversa y se encontró que cuatro portan la integración de transposición (Tabla 4 y datos no mostrados) . Por lo tanto, PB puede transposicionar la secuencia hasta de 14 kb . En seguida, se evaluó el comportamiento de la expresión de transgenes de elementos de PB integrados. Entre los ratones que potaron PB [Act-RFP], 98% (39/40) expresaron en marcador de RFP. En nuestro experimento, aún una copia del transposón de PB [Act-RFP] produjeron una señal roja visible bajo iluminación de UV (Fig. 5A) . Algunos de estos fundadores exhibieron señales de RFP de mosaico, un fenómeno más probablemente debido a la transposición en desarrollo embriónico después de la etapa de una célula (Fig. 5B) . Se observó la co-expresión de marcadores de PFR y tirosinasa en veintinueve por ciento (9/31) de los fundadores que portan PB[K14-Tyr, Act-RFP] conteniendo un gen de tirosinasa impulsado por el promotor K14 (K14-tyr) y un cásete de expresión de PFR (Fig. 1A, 5C y 5D) . Por lo tanto, la construcción de PB [Act-RFP], que contiene sitios de clonación únicos y un marcador de PFR, sirve como un vector de Pb transgénico universal. La capacidad de expresión simultánea de dos unidades de transcripción separadas y eventos de integración de alta frecuencia sugiere que la transposición de pB puede usarse como un método efectivo para generar ratones transgénicos . 6.3.5. Sistema de transposones de piggyBac como una herramienta de mutagénesis insercional Para probar la factibilidad de PB como una herramienta de mutagénesis insercional en vertebrados, evaluamos 104 eventos de transposición producidos en ratones (Tabla 3). Primero, la' secuencia de TTAA se encontró en todos los sitios de integración de PB menos uno. Segundo, se compararon . las secuencias genómicas que flanquean los sitios de TTAA de integración con sitios de TTAA muestreados aleatoriamente en el genoma de ratón y se encontró enriquecimiento de Ts y As que rodea la secuencia de TTAA en el núcleo (Fig. 6A) . Esto es similar a los sitios de integración encontrados en insectos (Lí y otros, 2005, Insect Mol Biol . 14 ( 1 ): 17-30 ) . Finalmente, los sitios genómicos de estos sitios de transposición se analizaron contra la base de datos de genomas de ratones Ensembl. Aunque algunos de los sitios no podrían mapearse debido a la presencia de secuencias repetitivas y espacios de secuencias en la base de datos, se determinaron las ubicaciones exactas de 93 sitios de integración transposones (Tabla 4, Fig. 6E) . Una amplia escala de distribución cromosomal se observó entre estos sitios de transposición. Todos los cromosomas de ratones excepto dos (cromosoma 19. y cromosoma Y) se señalaron por las transposiciones de PB (Fig. 6E) . Sesenta y siete por ciento (70/104) de todos los sitios de transposición se mapearon para unidades de transcripción conocidas o previstas. Entre estas integraciones, aproximadamente 97% (68770) señaló introñes, mientras el 3% (2/70) señaló exones (Fig. 6B) . La preferencia de integración dentro de unidades de transcripción aún permaneció alto aún si los genes invalidados (es decir, provistos) y EST se excluyeron del análisis (48% (50/104)). Además, más del 40% de las transposiciones " intergénicas " se mapearon dentro de 50 kb de genes cocidos o EST (Fig. 6C y 6D) . Cuando se estableció un intervalo de 10 kb como un umbral arbitrario para regiones reguladoras en los extremos 5' y 3' de una unidad de transcripción, la frecuencia de genes señalada por la transposición de PB fue de aproximadamente 80% (83/104) para unidades de transcripción conocidas o previstas (Fig. 6B) . La distribución cromosomal amplia y la preferencia de transposición en unidades de transcripción indica que los elementos de PB puede usarse como un mutágeno altamente efectivo para tamices genéticos de genoma amplio.

I Los estudios adicionales, hasta un total de 128 de inserciones nuevas se localizaron en unidades de transcripción, cubriendo todo los cromosomas. 5 de los mapas de transposones para exones y 63 para intrones. 6.4. Discusión Se ha mostrado que los elementos de PB pueden transposicionarse activamente en células de ratones y humanos. Se piensa que la transposición de PB es menos dependiente de los factores huésped que otros transposones, para él es el único transposón conocido capaz de transposicionarse en mas de una docena de especies de insectos diferente (Handler, 2002, Insect Biochemistry & molecular Biology 32:1211-1220; Sumitani y otros, 2003, Insect Biochem. Mol. Bil. ,.33:449-458). El hecho de que PB puede transposicionarse efectivamente en ambos insectos en mamíferos indica que este sistema de transpones puede tener aplicaciones amplias para estudios genéticos en invertebrados y vertebrados. Además sugiere que el mecanismo de transposición de elementos de PB puede ser significativamente diferente de otros transposones que existen en la naturaleza, lo cual solo trabaja en especies altamente restringidas. 6.4.1. piggyBac como una herramienta para transgénesis Los estudios sugieren que PB es una herramienta práctica para generar ratone transgénicos y talvez para generar otros animales vertebrados transgénicos. Primero, PB puede introducirse en la linea germinal de ratones con alta eficiencia. La coinyección pronuclear de plásmidos auxiliares y donadores da como resultado más del 30% de los donadores que portan plásmidos donadores integrados en su linea germinal (Fig. 3A) . Segundo, el enfoque produce copias únicas de' transgenes integrados. En la mayoría de los casos, la inyección pronuclear clásica de ADN lineal en ratones da como resultado de la formación de concatámeros de transgenes (Nagy y otros, 2003, Manipulatin the mouse embryo: a laboratory manual, 3a. Edición (Cold Spring Harbor Lavoratory Press)). Se mostró que los sitios de integración de transposón individuales puede definirse rápidamente por RCP inversa. Por lo tanto, se puede calcular el efecto del ambiente de cromatina en transgenes integrados. Tercero, el elemento de PB permite la expresión del transgene que lo porta. La frecuencia global de ratones que muestran el patrón de expresión transgénico esperado se comparó con experimentos transgénicas convencionales. Finalmente, los resultado sindican que PB puede portar transgenes hasta 9.1 kb sin una reducción importante de la frecuencia de transposición. La transposición se observó para transgenes tan grandes como 14.3 kb, que permite las inserciones mucho mayores que pueden portar los vectores retrovirales . Por lo tanto, un solo elemento de PB puede portar múltiples genes, lo cual permite que se lleven a cabo experimentos transgénicos tales como la identificación positiva de animales transgénicos con la ayuda de un marcador visible. 6.4.2. piggyBac como una herramienta genómica que descifra función de genes En la era postgenómica, la inactivación de genes sistemática es uno de los enfoques más potentes para descifrar la función del genoma . Este enfoque se ha probado que es exitoso en el estudio de organismo celulares sencillos como bacterias y levaduras, asi como de organismos multicelulares tales como C. elegans, Drosophila, pez cebra y Arabidopsis . Desafortunadamente, los métodos eficientes para amplia inactivación de genes de genomas en mamíferos se limita. La mutagénesis de ENU es uno de los pocos métodos disponibles para inactivación de genes a escala de genomas en los ratones; sin embargo, el mapeo de mutaciones inducida por ENU y clonación de genes definida por las mutaciones usualmente es laborioso y tardado (Herrón y otros, 2002, Nat . Gent . 30: 185-189). La mutagénesis insercional mediada por retrovirus también se ha usado ampliamente para producir mutaciones a través del genoma de ratones. Mientras que este método produce además un gran numero de mutaciones, la mayoría de estas mutaciones se genera en células de ME de ratones, y una cantidad importante de esfuerzo adicional se requiere para transmitir estas mutaciones específicas para genes en animales vivos. Recientemente, SE ME ha probado para la mutagénesis insercional en el ratón. Sin embargo, el movimiento local y eficiencia relativamente baja de transposición en unidades de transcripción evitan que se use ampliamente. En contraste, PB provee una nueva elección atractiva para tamizar mutaciones recesivas en el ratón. El éxito de transposición de PB eficiente en la línea germinal de ratones sugiere la viabilidad de este transposón para mutagénesis insercional. Varias propiedades únicas de PB podrían facilitar en gran parte los estudios de mutagénesis insercional en ratones. Una consideración importante de experimentos de mutagénesis insercional es si el mutágeno puede ¦ acertar en cada gen en el genoma en una forma no desviada. Los experimentos presentes han mostrado que las integraciones de PB tienen una distribución diversa en el genoma de ratón, lo cual concuerda con un estudio reciente en Drosophila mostrando que PB acierta en genes en una forma menos desviada que el elemento P ampliamente usado (Thibault y otros, 2004, Nt . Genet . 36: 283-287) .

Interesantemente, nuestro estudio reveló una alta preferencia de ransposición de PB para unidades transcripcionales . 67% de las integraciones de transposones se encontraron dentro de unidades transcripcionales conocidas o previstas. Incluyendo inserciones en las regiones reguladoras adyacentes a la iniciación transcripcional y. sitios de terminación, la frecuencia de transposicón de PB en genes es aún superior. Dado que solo ~15% de la secuencia de aucromatina de ratones codifica genes, la tra-nsposición de PB es altamente selectiva para secuencias de codificación. No está claro si esta propiedad de integración, está influenciada por las actividades transcripcionales del genoma o la secuencia exógena portada por los elementos de PB. Sin embargo, esta preferencia de integración hace de PB una herramienta potencial para una amplia mutagénesis insercional en el genoma. Un aspecto importante en el análisis de mutaciones obtenidas de mutagénesis aleatoria es la verificación de la relación entre mutaciones y los fenotipos que ocasionan. Esto es particularmente importante en el análisis de genes novedosos. La verificación de correlación de genotipo/fenotipo usualmente se realiza introduciendo un gen tipo silvestre en el mutante de fondo y fusca el "rescate" fenotípico (idealmente, reversión de la mutación inducida de nuevo a tipo silvestre) . Otra forma para determinar la correlación de genotipo/fenotipo es delimitar las mutaciones de inserción y buscan la reversión fenotipica. La capacidad de los transposone's de limitación por lo tanto se ha considerado una ventaja importante sobre vectores retrovirales . Sin embargo, la mayoría de los transposones dejan una pequeña supresión o inserción después de la eliminación del sitio original. De manera interesante, PB generalmente no deja huellas después de la eliminación, haciendo ideal que se revierta la producción. Esta característica también hace menos probable que PB ocasione daño genómico .durante mutagénesis, en la cual ocurren los eventos de transposición múltiple en un solo genoma. Los estudios presentes han demostrado que la eliminación de PB puede lograrse fácilmente con la expresión de la línea germinal de la transposasa. El hecho de que PB puede portar múltiples genes durante la transposición ofrece grandes ventajas para muchas manipulaciones genéticas incluyendo mutagénesis insercional y caracterización fenotipica. Permite que se siga la inserción/mutación y el estado de mutación, tal como heterocitos contra homocigotos y mutantes sencillos contra mutantes dobles, por marcadores visibles tales como PFR y Tirosinasa. Dado el tiempo de generación largo y el alto costo de alojamiento animal asociado con crianza de ratones, esto disminuirá dramáticamente el costo para muchos tipos de experimentos y hará que se vuelvan prácticos algunos experimentos reales. Además, los transposones de P para mutagénesis de inserción podrían portar también genes reporteros para la detección de me orador/promotor, o "atrapar genes", lo cual puede facilitar en gran parte el esfuerzo de anotación funcional del genoma de ratón y provee reactivos para muchos tipos de análisis biológicos. Por ejemplo, la tecnología para atrapar genes puede usarse con el sistema de PB . La microinyección o cruza se puede usar para inducir los. transposones que portan el vector de trampa de genes se transposiciona en el genoma de ratones. Cuando el transposón se inserta en los intrones de los genes en la dirección correcta, se activará el gen marcador (v.gr., LacZ) y se alterará el gen endógeno. Esto permite que la detección de la expresión del reportero y, en algunos casos, los fenotipos visibles ocasionados por las alteraciones en genes en algunas de las líneas atrapadas. En conclusión, nuestros experimentos proveen la base para una transgénesis altamente eficiente y el sistema de mutagénesis insercional en ratones, y sugiere que el sistema de PB pueda usarse también como ha potente herramienta para manipulaciones genéticas en otros organismos vertebrados (Thibault y otros, 2004, Nat . , Gente. 36:283-287) . 7. REFERENCIAS CITADAS Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí por referencia en su totalidad y para todos los fines a algún grado como si cada publicación individual o patente o solicitud de patente se indicara específicamente e individualmente para incorporarse por referencia en su totalidad para todos los fines. Muchas modificaciones y variaciones de esta invención se pueden hacer sin alejarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la' materia. Las modalidades específicas presentes se ofrecen a manera de ejemplo únicamente, y la invención será limitada solo por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance de equivalentes a los cuales se dirigen las reivindicaciones.

Claims

REIVI DICACIONES

1.- Un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 k, que comprende los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito · fertilizado un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y (c) después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando el vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células el transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb .

2. - El método de la reivindicación 1, en donde el transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica una característica en dicho vertebrado no humano transgénico.

3. - El método de la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac se lineariza, de manera que el genoma de una o más de dichas células comprende el transposón similar a piggyBac dentro de un concatámero, comprendiendo una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

4. - El método de la reivindicación 2, en donde dicho ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac se lineariza, de manera que el genoma de una o más de dichas células comprende el transposón similar a piggyBac dentro de un concatámero, comprendiendo una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

5. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el transposón similar a piggyBac comprende una secuencia reconocida por una proteína que se une a y/o modifica ácidos nucleicos.

6. - El método de la reivindicación 6, en donde la proteína que modifica el ácido nucleico es una proteína de unión de ADN, una proteína de modificación de ADN, una proteína de unión de ARN, o una proteína de modificación de ARN.

7. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 5, en donde el transposón similar a piggyBac comprende un sitio blanco para una recombinasa especifica para sitio.

8. - El método de la reivindicación 7, en donde el sitio blanco es un sitio blanco de TRF o un sitio blanco lox.

9. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el transposón similar a piggyBac comprende un marcador seleccionable .

10. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el _transposón similar a piggyBac comprende un gen reportero.

11. - El método de la reivindicación 10, en donde el gen reportero es endógeno .para la especie de dichas especies.

12.'- ¦ El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el transposón similar a piggyBac comprende un marcador seleccionable y un gen reportero .

13. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el transposón similar a piggyBac y la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac están dentro del mismo ácido nucleico .

14. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el transposón similar ' a piggyBac y la secuencia de , nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac están en ácidos nucleicos separados .

15. - El método de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac es ADN y el ácido nucleico que comprende la transposasa similar a piggyBac es AR .

16. - El método de la reivindicación 15, en donde el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en el vertebrado no humano.

17.- El método de la reivindicación 14, en donde los ácidos nucleicos que comprenden el transposón similar a piggyBac y la transposasa similar a piggyBac son ambos ADN.

18. - El método de la reivindicación 17, en donde el vertebrado no humano transgénico comprende además en el genoma de una o más de sus células secuencia de nucleótidos que codifican una transposasa similar a piggyBac .

19. - El método de la. reivindicación 18, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac se liga operablemente a un promotor.

20.- El método de la reivindicación 19, en donde el promotor es un promotor específico para la línea germinal.

21. - El método de la reivindicación 20, en donde el promotor es un promotor específico para la línea general.

22. - El método de la reivindicación 18, en donde el genoma de una o más de dichas células comprende la secuencia 141 de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac dentro de un concatámero, dicho concatámero comprendiendo una pluralidad de secuencia de nucleótidos, cada uno de los cuales codifica una transposasa similar a piggyBac .

23.- El método de la reivindicación 1, - en donde el vertebrado no humano es un mamífero no humano.

24. - El método de la reivindicación 1, en donde el vertebrado no humano es un animal de ganado.

25. - Un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que modifica una característica en dicho vertebrado no humano transgénico, que comprende los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que modifica una característica en dicho vertebrado no humano transgénico, y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y (c) después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando el' vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células el transposón similar a piggyBac, dicho transposón similar a piggyBac comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica una característica en dicho vertebrado no humano transgénico.

26. - El método de la reivindicación 25, den donde dicho ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac se lineariza, de manera que el genoma de una o más de dichas células comprende dicho transposón similar a piggyBac dentro de un concatámero, comprendiendo una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

27. - El método de la reivindicación 25 ó 26, en donde el transposóh similar a piggyBac comprende una secuencia reconocida por una proteina que se une a y/o modifica ácidos nucleicos.

28. - El método de la reivindicación 27, en donde la proteína de modificación de ácidos nucleicos es una proteína de unión de ADN, una proteína de modificación de ADN, una proteína de unión de ARN, o una proteína de modificación de ARN .

29. - El método de la reivindicación 29, en donde el sitio blanco es un sitio blanco de FRT o un sitio blanco de Lox .

30. - El método de la reivindicación 29, en donde el _ sitio blanco es un sitio blanco de FRT o un sitio blanco de lox .

31. - El método de la reivindicación 25 ó 26, en donde el transposón similar a piggyBac comprende un marcador seleccionable . .

32. - El método de la reivindicación 25 ó 26, en donde el transposón similar a piggyBac comprende un gen reportero.

33.- El método de la reivindicación 32, en donde el gen reportero es endógeno para la especie de dichas especies.

34.- El método de la reivindicación 25 ó 26, en donde el transposón similar a piggyBac comprende un marcador seleccionable y un gen reportero.

35.- El método de la reivindicación 25 ó 26, en donde el transposón similar a piggyBac y la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa .similar a piggyBac están dentro del mismo ácido nucleico.

36.- El método de la reivindicación 25 ó 26, en donde el transposón similar a piggyBac y la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac están en ácidos nucleicos separados.

37. - El método de la reivindicación 36, en donde el ácido nucleico que comprende el transposón similar a piggyBac es ADN y el ácido nucleico que comprende la transposasa similar piggyBac es ARN .

38. - El método de la reivindicación 37, en donde el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicho vertebrado no humano. .

39.- El método de la reivindicación 36, en donde los ácidos nucleicos que comprenden el transposón similar a piggyBac y la transposasa similar a piggyBac son ADN.

40. - El método de la reivindicación 39, en donde el vertebrado no humano transgénico comprende además en- el genoma de una o más de sus células la secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac.

41. - El método de' la reivindicación 40, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac se liga operablemente a un promotor.

42.- El método de la reivindicación 41, en donde el promotor dirige la expresión de la transposasa en la linea germinal.

43.- El método de la reivindicación 42, en donde el promotor es un promotor especifico de la linea germinal.

44. - El método de la reivindicación 40, en donde el genoma de una o más de dichas células comprende dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac dentro de un concatámero, el concatámero comprendiendo una pluralidad de secuencia de nucleótidos, cada uno de los cuales codifica una transposasa similar a piggyBac .

45. - El método de la reivindicación 25, en donde el vertebrado no humano es un mamífero no humano.

46.- El método de la reivindicación 25, en donde el vertebrado no humano es un animal de ganado.

47.- Un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar ' a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac, y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y (c) después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando el vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un. vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células el transposón similar a piggyBac, dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

48. - El método de la reivindicación 47, en donde el transposón similar a piggyBac comprende una secuencia reconocida por una proteina que se une a y/o modifica ácidos nucleicos.

49. - El método de la reivindicación 48, en donde la proteina que modifica el ácido nucleico es una proteína de unión de ADN, una proteína de modificación de ADN, una proteína de unión de ARN, o una proteína de modificación de ARN.

50. - El método de la reivindicación 48, en -donde el transposóh similar a piggyBac comprende un sitio blanco para una recombinasa específica para sitio.

51. - El método de la reivindicación 50, en donde el sitio blanco es un sitio blanco de TRF o una sitio blanco de lox.

52. - El método de la reivindicación 47, en donde el transposón similar a pi ggyBa c ' comprende un marcador seleccionable .

53. - El método de la reivindicación 47, en donde el transposón similar a pi ggyBa c comprende un gen reportero.

54. - El método de la reivindicación 53, en donde el gen reportero es endógeno a la especie de dicha especie.

55. - El método de la reivindicación 47, en donde el transposón similar a pi ggyBa c comprende un marcador seleccionable y un gen reportero.

56. - El método de la reivindicación 47, en donde el transposón similar a pi ggyBa c y la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a pi ggyBa c está dentro del mismo ácido nucleico.

57. - El método de la reivindicación 47, en donde el transposón similar a pi ggyBa c y la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a pi ggyBa c están en 1 ácidos nucleicos separados. j

58. - El método de la reivindicación 57, en donde el ácido nucleico que comprende el transposón similar a pi ggyBa c es ADN y el ácido nucleico que comprende la transposasa ; similar a pi ggyBa c es ARN . !

59. - El método de la reivindicación 58, en donde el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en el vertebrado no humano .

60. - El método de la reivindicación 57, en donde los ácidos nucleicos que comprenden el transposón similar a piggyBac y la transposasa similar a piggyBac son ambos ADN.

61. - El método de la reivindicación 60, en donde el vertebrado no humano transgénico comprende además en el genoma de una o más de sus células secuencia de nucleótidos que codifican una transposasa similar a piggyBac .

62. - El método de la reivindicación 61, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac se liga operablemente a un promotor.

63. - El método de la reivindicación 62, en donde el promotor es un promotor específico para la línea germinal.

64. - El método de la reivindicación 63, en donde el promotor es un promotor específico para la línea general.

65. - El método de la reivindicación 61, en donde el genoma de una o más de dichas células comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac dentro de un concatámero, dicho concatámero comprendiendo una pluralidad de secuencia de nucleótidos, cada uno de los cuales codifica una transposasa similar a piggyBac .

66. - El método de la reivindicación 47, en donde el vertebrado no humano es un mamífero no humano.

67. - El método de la reivindicación 47, en donde el vertebrado no humano es un animal de ganado.

68. - Un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac dicho método comprendiendo los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho, embrión en un vertebrado no humano transgénico; y (c) después de ' un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando el vertebrado no humano transgénico de la madre; 150 generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células el transposón similar a piggyBac, en donde secuencia de nucleótidos que codifica, la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac .

69. - El método de la reivindicación 68, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac se liga operablemente a un promotor.

70. - El método de la reivindicación 69, en donde el promotor dirige la expresión de la transposasa en la linea germinal.

71. - El método de la reivindicación 70, en donde el promotor es un promotor especifico para la linea germinal.

72. - El método de la reivindicación 68, en donde el vertebrado no humano es un mamífero no humano.

73. - El método de la reivindicación 68, en donde el vertebrado no humano es un animal de ganado.

74.- Un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado, que comprende los pasos de: (a) introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado (i) un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac; y (ii) el polipéptido de transposasa similar a piggyBac en una cantidad efectiva para inducir la integración de dicho transposón de piggyBac en el genoraa de una o más células de dicho embrión o en el genoma de dicho oocito o una o más células de un embrión derivada del mismo, respectivamente; (b) implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen en desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano . transgénico; y c) después de un periodo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, que recupera el vertebrado no humano transgénico de la madre; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposó'n similar a piggyBac inmovilizado.

75. - El método de la reivindicación 74, en donde el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 1.5 kb.

76. - El método de la reivindicación 74, en donde el transposón similar a piggyBac comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que modifica una característica en dicho vertebrado no humano transgénico.

77. - El método de la reivindicación 74, en donde el ácido nucleico es linearizado, de manera .que el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

78. - El método de la reivindicación 74, en donde el vertebrado no humano es un mamífero no humano.

79. - El método de la reivindicación 74, en donde el vertebrado no humano es un animal de ganado..

80.- Un método para generar una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, comprendiendo los pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrado en cultivo un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales la transposasa similar a piggyBac se expresa de manera que el transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrado en cultivo, generando así una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb .

81.- Un método para generar una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrado, comprendiendo los pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrado en cultivo un ácido nucleico que comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que 'codifica una proteína de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrado y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales la transposasa similar a piggyBac se expresa de manera que el transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrado en cultivo, generando así una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención' de una enfermedad o trastorno de vertebrado.

82. - Un método para generar una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac, en donde dicho transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac, comprendiendo los pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrado en cultivo un ácido nucleico linearizado que comprende un transposón similar a piggyBac, y, dentro del mismo o en un ácido nucleico separado, una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales la transposasa similar a piggyBac se expresa de manera que el transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrado en cultivo, generando asi una célula de vertebrado recombinante en cultivo cuyo genoma comprende un transposón similar a , piggyBac, en donde dicho transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac.

83. - Un método para generar una célula de vertebrados recombinante en cultivo cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada uno de los cuales codifica una transposasa similar a piggyBac, que comprende los pasos de: (a) introducir en una célula de vertebrados en cultivo un ácido nucleico linearizado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, y (b) cultivar dicha célula bajo condiciones en las cuales la secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac se integra en el genoma de dicha célula de vertebrados en cultivo, generando asi una célula de vertebrados recombinante en cultivo cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica dicha transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleóti'dos , cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac .

84.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-83, en donde la célula, de vertebrados es una célula de mamíferos.

85. - El método de la reivindicación 84, en donde la célula de mamíferos es una célula humana.

86. - Un método para movilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un prime.r vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de uno o más de sus células germinales un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 1.5 kb, con un segundo vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células germinales una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac para dar una o má.s progenies; (b) identificar por lo menos una o más progenies del paso (a) que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto del transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, de manera que se expresa la transposasa similar a piggyBac y el transposón se inmoviliza; movilizando así el transposon similar a piggyBac en un vertebrado no humano.

87. - El método de la reivindicación 86, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 14. I

88. - El método de la reivindicación ¦ 86, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 74.

89. - El método de la reivindicación 86, en donde el segundo vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 68.

90. - Un método para movilizar un transposón similar- a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los . pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende el genoma de en una o más de sus células germinales un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica una característica en dicho vertebrado transgénico no humano, con un segundo vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células germinales una ¦ secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos uno de dichas una o más progenies del paso (a) que comprende en el genoma de una o más de sus células dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, de manera que se expresa la transposasa similar a piggyBac y el transposón se moviliza; I movilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano.

91. - El método de la reivindicación 90, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 36.

92. - El método de la reivindicación 90, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 74.

93. - El método de la reivindicación 90, en donde el segundo vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 68. .

94. - Un método para movilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende el genoma de en una o más de sus células germinales .un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac, con un segundo vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células germinales una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac para dar una o más progenies; 159 (b) identificar por lo menos uno de dichas una o más progenies del paso (a) que comprende en el genoma de una o más de sus células dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, de manera que se expresa la transposasa similar a piggyBac y el transposón se moviliza; movilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano.

95. - El método de la reivindicación 94, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 57.

96. - El método de la reivindicación 94, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 74.

97.- El método de la reivindicación 94, en donde el segundo vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 64.

98.- Un método para inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear el primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células (i) un transposón similar a piggyBac que comprende un inserto de por lo menos 1.5 kb y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifican una transposasa similar a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies (b) identificar por lo menos uno de una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifican la transposasa similar a piggyBac, y comprende en el genoma de una o mas de sus células un transposón similar a piggyBac, tal como el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano.

99.- El método de la reivindicación 98, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 18.

100.- Un método para inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ¦ una proteina que modifica un rasgo en dicho vertebrado no humano transgénico y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma ' la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, y comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, de manera que el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano.

101. - El método de la reivindicación 100, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por el método de la reivindicación 40.

102. - Un método para inmovilizar un transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) aparear un primer vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células tanto (i) un transposón similar a piggyBac, en donde dicho transposón similar a piggyBac está dentro del concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a. piggyBac, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar' a piggyBac con un segundo vertebrado adulto para dar una o más progenies; (b) identificar por lo menos una o más progenies del paso (a) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac, y comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, de manera que el transposón similar a piggyBac se inmoviliza en dicha progenie, inmovilizando asi el transposón similar a piggyBac en un vertebrado no humano.

103. - El método de la reivindicación 102, en donde el primer vertebrado no humano transgénico se genera por .el método de la reivindicación 61.

104. - Un método para generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado, el método comprendiendo los pasos de: (a) generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una pluralidad de sus células de lineas germinales tanto (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac operablemente ligada a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno de dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótido que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac, que comprende los pasos de: i introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado uno o mas ácidos nucleicos, uno o más de dichos ácidos nucleicos comprendiendo (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno de uno o más ácidos nucleicos se lineariza; implantar el embrión de vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico, recuperando un vertebrado no humano transgénico de la madre que comprende en el genoma de una pluralidad de sus células de linea germinal (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a ' un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno del transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótido que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) permitir que el vertebrado no humano transgénico recuperado del paso (a) crezca en su adultez; (c) aparear al vertebrado no humano transgénico adulto del paso (b) un segundo vertebrado adulto dando una más progenies; (d) identificar por lo menos una o más progenies del paso (c) que no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos codificando la transposasa similar a piggyBac ligada al promotor que se expresa en la linea germinal, y comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, en donde una o más progenies en cada vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado; generando asi un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado.

105.- Un método para generar un banco de vertebrados no humanos transgénicos , cada uno de los cuales comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado, el método comprendiendo los pasos de: (a) generar un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma una pluralidad de sus células de linea germinal (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno de dicho transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos codificando la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac, comprendiendo los pasos de: introducir ex vivo en un embrión vertebrado no humano u oocito fertilizado uno o más ácidos nucleicos, dichos uno o más ácidos nucleicos comprendiendo (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada a un promotor que se" expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno o más de dichos ácidos nucleicos se lineariza; implantar el embrión vertebrado no humano resultante u oocito fertilizado en una madre adoptiva de la misma especie bajo condiciones que favorecen el desarrollo de dicho embrión en un vertebrado no humano transgénico; y después de un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de dicho embrión de ' un vertebrado no humano txansgénico, recuperar un vertebrado no humano transgénico de la madre que comprende en el genoma de una pluralidad de sus células de la linea germinal (i) un transposón similar a piggyBac y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar piggyBac ligada operablemente a un promotor que se expresa en la linea germinal, en donde por lo menos uno del transposón similar a piggyBac y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac o un concatámero que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos cada una de las cuales codifica una transposasa similar a piggyBac; (b) permitir que el vertebrado nó humano transgénico recuperado del paso (a) crezca hasta adulto; (c) apa-rear el vertebrado no humano transgénico adulto del paso (b) con un segundo vertebrado adulto para dar una pluralidad de progenie; (d) identificar dos o más progenies del paso (c) , cada uno de los cuales no comprende en su genoma la secuencia de nucleótidos que codifica la transposasa similar a piggyBac ligada operablemente al promotor que se expresa en la linea germinal y comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, en donde dicha una o más progenies es cada una un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizada, generando asi un banco de vertebrados no humanos transgénicos , cada uno comprendiendo en el genoma de una o mas de sus células un transposón similar a piggyBac inmovilizado.

106. - Un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb.

107. - Un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica una característica den dicho vertebrado no humano transgénico.

108. - Un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac.

109. - Una célula de vertebrados en cultivo que comprende en su genoma un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb.

110. - Una célula de vertebrados en cultivo que comprende en su genoma un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de la enfermedad o trastorno de vertebrados.

111. - Una célula de vertebrados en cultivo que comprende en su genoma un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica una característica en un vertebrado no humano transgénico.

112. - Una célula de' vertebrados en cultivo que comprende en su genoma un transposón similar a piggyBac, en donde dicho transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similar a piggyBac . .

113.- Un banco de vertebrados no humanos transgénicos producidos por el método de la reivindicación 105.

114.- Un banco de vertebrados no humanos transgénicos, el banco comprendiendo una pluralidad de diferentes vertebrados no humanos transgénicos, cada uno comprendiendo en el genoma de una o mas de sus células un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb.

115. - Un banco de vertebrados no humanos transgénicos , dicho banco comprendido una pluralidad de diferentes vertebrados no humanos transgénicos, comprendiendo cada uno el genoma de una o más de sus células un transposón similar, a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrados.

116. - Un banco de vertebrados no humanos transgénicos, el banco comprendiendo una pluralidad de diferentes vertebrado no humanos transgénicos, cada uno comprendiendo en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que modifica una característica en un vertebrado no humano transgénico.

117. - Un banco de vertebrados no humanos transgénicos, dicho banco comprendiendo una pluralidad de diferentes vertebrados no humanos transgénicos, cada uno comprendiendo en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac, en donde dicho transposón similar al de piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

118. - El banco de animales no humanos transgénicos de la reivindicación 113, 114, 115, 116 ó 117, que comprende por lo menos 10 animales no humanos transgénicos.

119. - El banco de animales no humanos transgénicos de la reivindicación 118, que comprende por lo menos 20 animales no humanos transgénicos.

120. - Un banco de células vertebradas en cultivo, dicho banco comprendiendo una pluralidad de diferentes células, cada célula comprendiendo en su genoma un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb.

121. - Un banco de células dé vertebrados en cultivo, dicho banco comprendiendo una pluralidad de diferentes células, cada célula comprendiendo en su genoma un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de la enfermedad o trastorno del vertebrado.

122. - Un banco de células de vertebrados en cultivo, dicho banco comprendiendo una pluralidad de diferentes células, cada célula comprendiendo en su genoma un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que modifica una característica en un vertebrado no humano transgénico.

123. - Un banco de células de vertebrados en cultivo, dicho banco comprendiendo una pluralidad de diferentes células, cada célula comprendiendo en su genoma un transposón similar, a piggyBac, en donde dicho transposón similar a piggyBac está dentro de un concatámero que comprende una pluralidad de transposones similares a piggyBac .

124. - Un método para tratar o, prevenir una enfermedad o trastorno, dicho método comprendiendo el paso de administrar una célula de vertebrado recombinante cuyo genoma comprende un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de valor en el tratamiento o prevención de la enfermedad de vertebrados a un sujeto que necesita de dicho tratamiento o prevención.

125. - El método de la reivindicación 124, en donde la célula de vertebrado recombinante se genera de acuerdo con el método de la reivindicación 81.

126. - Un método para suministrar un ácido nucleico que codifica una proteína de valor en el tratamiento o prevención de un trastorno de vertebrado a una o más células de un sujeto que necesita de dicho tratamiento o prevención, dicho método comprendiendo el paso de administrar un virus recombinante cuyo genoma comprende (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteina y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a un promotor que dirige la expresión de la transposasa similar a piggyBac en una o más células de dicho sujeto, de manera que el transposón similar a piggyBac se integra en el genoma de una o más células de dicho sujeto siguiendo dicha administración, suministrando asi un ácido nucleico que codifica una proteina de valor en el tratamiento o prevención de un trastorno de vertebrados a un sujeto que necesita de dicho tratamiento o prevención.

127. - El método de la reivindicación 126, en donde el virus es un retrovirus, un adenovirus, o un virus adeno-asociado .

128. - Un virus recombinante cuyo genoma comprende (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteina y (ii) una secuencia dé nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac ligada operablemente a un promotor.

129. - El virus recombinante de la reivindicación 128 que es un retrovirus, un adenovirus, o un virus adeno-asociado.

130. - Un ( método para determinar si un fenotipo exhibido por un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una; o más de sus células un transposón similar a piggyBac se ocasiona por el transposón similar a piggyBac, dicho método comprendiendo: (a) generar una o más progenies de dicho vertebrado no humano transgénico en el cual el transposón similar a piggyBac se elimina; (b) determinar si existe una correlación entre la eliminación de dicho transposón similar a piggyBac en dicha progenie , y una revisión del fenotipo, en donde una correlación indica que el fenotipo se ocasiona por el transposon similar a piggyBac, determinar asi si un fenotipo exhibido por un vertebrado no humano transgénico que comprende en el genoma de una o más de sus células un transposón similar a piggyBac se ocasiona por el transposón similar a piggyBac.

131.- Un método para aislar un mejorador de un vertebrado no humano, que comprende los pasos de: (a) evaluar un vertebrado no humano transgénico que comprende el genoma de una o más de sus células o tejidos un transposón similar a piggyBac en donde el transposón comprende un gen reportero bajo el control de un promotor mínimo, la expresión del gen reportero en dichas una o más células o tejidos del vertebrado no humano transgénico de la descendencia derivada del mismo; y (b) aislar un ácido nucleico que flanquea dicho transposón similar a piggyBac que es responsable de la expresión del gen reportero en dichas una o más células o t j idos; aislando asi un mejorador de un vertebrado no humano .

132.- Un método para aislar un mejorador de una célula de vertebrado recombinante en cultivo, en donde la célula recombinante comprende transposón similar a piggyBac que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor mínimo, comprendiendo los pasos de: (a) evaluar la expresión del gen reportero en dicha célula de vertebrado recombinante o su progenie; y (b) aislar un ácido nucleico que flanquea dicho transposón similar a piggyBac que es responsable de la expresión del gen reportero en la célula de vertebrado recombinante; aislando así un mejorador de una célula de vertebrado recombinante en cultivo.

133.- Un método para generar un vertebrado no humano que es mosaico para un transposón similar a piggyBac, que comprende los pasos de: (a) generar un embrión no humano transgénico que comprende dentro de su genoma (i) un sitio genético homocigoto para un transposón similar a piggyBac, en donde el transposón similar a piggyBac comprende una secuencia de reconocimiento de recombinasa específica para sitio, y (II) üna secuencia de nucleótido que codifica dicha recombinasa específica para sitio ligada operablemente a un promotor; (b) cultivar el embrión no humano transgénico bajo condiciones en las cuales la recombinasa especifica para sitio se expresa y donde ocurre la proliferación; generando así un vertebrado no humano que es mosaico para un transposón similar a piggyBac .

134. - Un equipo que comprende: (a) en uno o más recipientes, uno o más ácido nucleicos que comprenden (i) un transposón similar a piggyBac que porta un inserto de por lo menos 1.5 kb y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) en un segundo recipiente, (i) una célula de vertebrados en cultivo o (ii) un oocito de vertebrado no humano .

135. - Un equipo que comprende: (a) en uno o más recipientes, uno o más ácidos nucleicos que comprenden (i) un transposón similar a piggyBac que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de valor en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno de vertebrados y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) en un segundo recipiente, (i) una célula de vertebrados en cultivo o (ii) un oocito de vertebrados no humano .

136. - Un equipo que comprende: (a) en uno o más recipientes, uno o más ácidos nucleicos que comprenden (i) un transposón similar a piggyBac-, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una transposasa similar a piggyBac; y (b) en un segundo recipiente, (i) una célula de vertebrados en cultivo o (ii) un oocito de vertebrados no humano .

137. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 25, 47, 68, 80, 81, 82, 83, 86, 90, 94, 98, 100, 102, 104, 105, 124, 126, 128, 130, 131, 132, o 133, en donde el transposón similar a piggyBac es un transposón de piggyBac y/o la transposasa similar a piggyBac es una transposasa de piggyBac .

138. - El vertebrado no humano transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 106-108, en donde el transposón similar a piggyBac es un transposón de piggyBac, y/o la transposasa similar a piggyBac es una transposasa de piggyBac .

139. - El bando de cualquiera de las reivindicaciones 113-117 y 120-123, en donde el transposón similar a piggyBac es un transposón de piggyBac, y/o la 177 transposasa similar a piggyBac es ' una transposasa de piggyBa c .

140. - La célula de vertebrados de cualquiera de las reivindicaciones 109-112, en donde el transposón similar a piggyBac es un transposón de piggyBac, y/o la transposasa similar a piggyBac es una transposasa de piggyBac .

141. - El virus recombinante de la reivindican 128, eñ donde el transposón similar á piggyBac es un transposón de piggyBac y/o la transposasa similar a piggyBac de una transposasa de piggyBac .

142. - El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 134-136, en donde el transposón similar a piggyBac es un transposón de piggyBac, y/o la transposasa similar a piggyBac es una transposasa de piggyBac . ·

143.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 80 y 86 en donde el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 2·.5 kb .

144. - El vertebrado no humano transgénico de la reivindicación 106, en donde el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 2.5 kb .

145. - El banco de cualquiera de las reivindicaciones 114 y 120, en donde, el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 2.5 kb. 1

146.- La célula de vertebrado de la reivindicación 109, en donde el transposón similar a piggyBac parota un inserto de por lo menos 2.5 kb . 147'.- El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 134, en donde el transposón similar a piggyBac porta un inserto de por lo menos 2.5 kb . 148.- El método de la rei indicación 105, en donde la identificación del paso (s) comprende llevar a cabo reacción de cadena de polimerasa inversa. 149.- El método de la reivindicación 21, 43, 64, o 71, en donde el promotor específico de línea germinal es un promotor específico para machos. 150. - El método de la reivindicación 149, en donde el promotor especifico para machos es un promotor de Protamina (Prm) . 151. - El método de la reivindicación 21, 43, 64, ó 71, en donde el promotor específico para la línea germinal es un promotor específico para hembras. 152. - El método de la reivindicación 151, en donde el promotor específico para hembras es un promotor ZP3.