CN106521638A - 一种基因突变大鼠资源库及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一个基因突变大鼠品系资源库及其制备方法。该资源库中的基因突变大鼠可由携带piggyBac转座子插入突变的大鼠精原干细胞，胚胎干细胞或受精卵产生获得。该资源库中的基因突变大鼠也可以通过在雄性突变大鼠生殖系细胞中移动转座子获得。本发明可用于动物表型分析，基因功能研究，人类疾病模拟，药物筛选和药靶开发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一个基因突变大鼠品系资源库及其制备方法。本发明可用于动物表型分析，基因功能研究，人类疾病模拟，药物筛选和药靶开发。
背景技术
基因突变能改变特定基因的DNA核苷酸序列，具体种类包括碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。基因突变造成特定基因产物的表达量或者功能发生变化，从而导致细胞水平上的生物学过程发生改变，以及动物个体水平上的表型发生异常(Griffiths等编著的《Introduction to Genetic Analysis》第十版)。
携带基因突变的实验动物模型在生物学研究，新药开发和畜牧业品种改造中是非常重要的工具。在生物学研究中，携带随机基因突变的动物可被用于发现具有特定功能的新基因。另外，针对携带基因突变的动物进行的表型分析有助于发现特定基因的新功能。在新药开发领域，携带致病基因突变的动物可用于模拟人类疾病，以及研究疾病发生机理。此外，基因突变疾病动物模型还可以在临床前试验中用于筛选能缓解疾病表型的新药，以及确定新药的安全性和有效性。当特定基因被发现可以在动物模型中调控临床疾病相关的表型时，这些基因可以被候选为新型的药物靶点。在畜牧业相关的应用中，通过基因突变可以得到繁殖能力强和抗病能力高的新畜牧品种，有助于大水平提高畜牧品产量。
现有的大规模基因突变体库皆选用实验小鼠作为模式生物。三十年前，随着小鼠胚胎干细胞培养技术(Bradley等，1984，Nature 309：255-256)、基因打靶技术(Thomas和Capecchi，1987，Cell 51：503-512)、反转入病毒插入突变技术(Jaenisch等，1981，Cell 24：519-529)，以及小鼠化学诱导突变技术(Russell等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：5818-5819；Hitotsumachi等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6619-6621)的建立，小鼠成为了基因突变动物的首选模型。利用这些在小鼠中的基因操作技术，英国、德国和美国已联合建立了大规模的基因突变小鼠资源库(Nolan等，2000，Nat.Genet.25：440-443；deAngelis等，2000，Nat.Genet.25：444-447；Skarnes等，2011，Nature 474：337-342；White等，2013，Cell 154：452-464)。
转座子插入突变技术是另一种在实验动物中引入突变的方法。piggyBac转座子(PB)系统是现有在哺乳动物中诱导插入突变效率最高的转座子系统(Ding等，2005，Cell 122：473-483；Wang等，2008，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：9290-9295)。piggyBac转座子早先于粉斑夜蛾(Trichoplusia ni)的基因组中被发现，大小为2472bp，两端包含反向末端重复序列(ITR)，中间包含编码594个氨基酸的转座酶。piggyBac转座子类属于DNA转座子，通过剪切和粘贴机制可以由位于外源DNA或内源基因组的起始位点切离，并随机插入基因组中的另一位点。piggyBac转座子插入靶位点的序列为四核苷酸的TTAA。piggyBac转座子在切离TTAA时一般不会改变原位点及原位点的附近序列，即所谓无痕转座(Cary等，1989，Virology 172：156-169；Fraser等，1995，Virology 211：397-407；Fraser等，1996，Insect Molecular Biology 5：141-151)。2005年至今，我国复旦大学已利用piggyBac转座子系统建立了大规模的基因插入突变小鼠资源库，从而使得小鼠基因突变体库得到进一步扩大(Ding等，2005，Cell 122：473-483；Chen和Xu，2011，BMC Neurosci.12：1；Shi等，2014，Hum.Mol.Genet.23：3792-3800；Xia等，2013，Immunity，39：470-481)。
大鼠在疾病研究和新药开发领域相对于小鼠是更优选的实验模式生物。大鼠作为疾病动物模型具有以下优势：1)生理上与人更接近；2)在药物毒理研究中更好模拟人体反应；3)行为上与人更接近；4)动物手术操作性更强；5)个体较大，以致采样量大，并使得高分辨成像(如功能性磁共振成像fMRI等)成为可能；6)临床前研究历史悠久，有150年的历史；7)大鼠疾病模型可以让研究者在临床前确定安全剂量的同时研究药物的效用。由此可见，建立基因突变大鼠资源库将大大推进人类疾病相关的基因功能研究，进一步加快新型药物开发。迄今为止，在生物医学领域还缺乏一个有效的基因突变大鼠资源库。
发明内容
为了解决缺乏能用于基因功能研究和新药开发的基因突变大鼠资源库的问题，本发明提供了一个利用piggyBac转座子系统在实验大鼠中引入插入突变所得到的基因突变大鼠品系资源库。
本发明在制备基因突变大鼠资源库时利用的piggyBac转座子中包含基因捕获构建，该构建中包含的元件从5’端到3’端分别是：
RNA剪接受体(SA)，聚腺苷酸(polyA)转录终止信号，强效启动子，荧光蛋白，核糖体进入位点(IRES)和RNA剪接供体(SD)。
在一优选例中，所述的聚腺苷酸转录终止信号为兔β-球蛋白polyA。
在另一优选例中，所述的强效启动子为鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG。
在另一优选例中，所述的荧光蛋白为Katushka远红外荧光蛋白。
本发明在制备基因突变大鼠资源库时所采用的一种技术方案是：
1)将携带基因捕获构建和抗药筛选标记的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸通过脂质体转染同时导入体外培养的大鼠精原干细胞的基因组中，并通过药物筛选得到携带转座子随机插入突变的大鼠精原干细胞；
2)将携带转座子的精原干细胞注射入雄性大鼠睾丸内，并与同种雌鼠交配，随后通过数代繁殖，得到携带单个piggyBac转座子插入但不携带piggyBac转座酶的基因突变大鼠。
本发明在制备基因突变大鼠资源库时所采用的另一种技术方案是：
1)将携带基因捕获构建和抗药筛选标记的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸通过电穿孔转染同时导入体外培养的大鼠胚胎干细胞的基因组中，并通过药物筛选得到携带转座子随机插入突变的大鼠胚胎干细胞；
2)将携带转座子的胚胎干细胞注射入囊胚，并植入假孕母鼠体内，随后通过数代繁殖，得到携带单个piggyBac转座子插入但不携带piggyBac转座酶的基因突变大鼠。
本发明在制备基因突变大鼠资源库时所采用的另一种技术方案是：
1)将携带基因捕获构建的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸通过显微注射同时导入离体的大鼠受精卵的基因组；
2)将被注射后的受精卵植入假孕母鼠体内。在哺育得到的后代中，利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定获得携带随机插入转座子的阳性大鼠。随后通过数代繁殖，得到携带单个piggyBac转座子插入但不携带piggyBac转座酶的基因突变大鼠。
本发明在制备基因突变大鼠资源库时所采用的另一种技术方案是：
1)将编码piggyBac转座酶的核酸通过显微注射导入离体的大鼠受精卵的基因组。将被注射后的受精卵植入假孕母鼠体内在哺育得到的后代中，利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定获得携带piggyBac转座酶的阳性大鼠；
2)将piggyBac转座酶阳性大鼠与前述三种技术方案得到的携带单个piggyBac转座子插入的基因突变大鼠交配，得到基因组中即含有piggyBac转座子又含有piggyBac转座酶的双阳性雄性大鼠(在这些雄鼠的生殖系细胞基因组中，piggyBac转座子被piggyBac转座酶移动，得到新的插入突变)；
3)将双阳性公鼠和野生型母鼠交配后，子代中可得到携带新位点piggyBac转座子插入但不携带piggyBac转座酶的基因突变大鼠。
本发明的有益效果是，建立了携带基因插入突变得到的基因突变大鼠品系资源库，提供了新型的可用于动物表型分析，基因功能研究，人类遗传疾病模拟，新药筛选和新药靶发现的大鼠动物模型资源库。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1是本发明基因突变大鼠所携带的含基因捕获构建的piggyBac转座子的设计图。PBR：piggyBac转座子右臂；SA：RNA剪接受体(Splicing Acceptor)；polyA：兔β-球蛋白polyA；neo：neomycin抗药筛选标记；CAG：鸡β-肌动蛋白复合启动子；Kat：Katushka远红外荧光蛋白；IRES：核糖体进入位点；SD：RNA剪接供体(Splicing Donor)；PBL：piggyBac转座子左臂。
图2是本发明基因突变大鼠品系资源库的一个实例。在绿色光照射下，基因突变大鼠体表产生远红外荧光。该荧光可在荧光解剖镜下观察到。图中所示的幼仔分别携带插入于不同位点的piggyBac转座子，由于位置效应，个体呈不同亮度的远红外荧光。
图3是本发明制备方法的一种技术方案。编码piggyBac转座子(PB)和piggyBac转座酶(PBase)的核酸通过脂质体转染同时被导入体外培养的大鼠精原干细胞内。携带转座子的精原干细胞被注射入雄性大鼠睾丸内，并与同种雌鼠交配，在子代中得到携带插入于不同位点的piggyBac转座子(图中PB1，PB2和PB3)的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子。
图4是本发明制备方法的另一种技术方案。编码piggyBac转座子(PB)和piggyBac转座酶(PBase)的核酸通过电穿孔转染同时被导入体外培养的大鼠胚胎干细胞内。携带转座子的胚胎干细胞被注射入囊胚，并植入假孕母鼠体内，在子代中得到携带插入于不同位点的piggyBac转座子(图中PB1，PB2和PB3)的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子。
图5是本发明制备方法的另一种技术方案。编码piggyBac转座子(PB)和piggyBac转座酶(PBase)的核酸同时被显微注射入大鼠受精卵内。携带转座子的受精卵被植入假孕母鼠体内。在子代中得到携带插入于不同位点的piggyBac转座子(图中PB1，PB2和PB3)的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子。
图6是本发明制备方法的另一种技术方案。将piggyBac转座酶(PBase)阳性大鼠与图3，4和5中所述三种技术方案得到的piggyBac转座子阳性大鼠(起始位点为PB0)交配，得到基因组中即含有piggyBac转座子又含有piggyBac转座酶的双阳性雄性大鼠。将双阳性公鼠和野生型母鼠交配后，子代中可得到携带新位点piggyBac转座子(图中PB1，PB2和PB3)的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子。
图7是利用接头PCR鉴定大鼠基因组内piggyBac转座子插入位点的实施方式。大鼠基因组DNA经Sau3AI酶酶切后，在DNA片段两端同时加上接头(图中标记为灰色)。连有接头的基因组DNA文库经piggyBac转座子臂特异引物(左臂：PBLlink；右臂：PBRlink)和接头特异引物(LinkAmp)PCR扩增后得到的产物被连接装入T载体。在大肠杆菌中进一步扩增T载体以用于测序。测序得到的插入位点周旁基因组序列与大鼠基因组公开数据库中的序列进行比对，从而确定转座子的插入位点。
图8是本发明用于表型分析，基因功能研究和人类疾病模拟的实施例。基因突变大鼠库中的TshrPB/PB突变大鼠，其基因组中的piggyBac转座子插入了促甲状腺激素受体(Tshr)基因，造成突变大鼠生长迟滞(左图)和血清中甲状腺素T4水平降低(右图)，从而模拟了人类呆小症，即克汀病。
图9是本发明用于确定药物缓解疾病表型有效性的实施例。在给TshrPB/PB突变大鼠的食物中添加来源于野生型大鼠甲状腺的提取物，可减轻突变大鼠的疾病表型，减缓生长迟滞。治疗后，成年突变大鼠的体重接近野生型大鼠。
具体实施方式
本发明提供了一个利用piggyBac转座子系统在实验大鼠中引入插入突变所得到的基因突变大鼠品系资源库，其优点是可用于动物表型分析，基因功能研究，人类遗传疾病模拟，新药筛选和新药靶发现。
下面结合具体实施例，进一步阐明制备和应用本发明的关键步骤。
1.基因捕获构建。
本发明利用了一种依据RNA转录与剪接原理设计的基因捕获构建。更具体的，基于piggyBac转座子的基因捕获构建包括两个功能部份：一个是启动子捕获构建，即上游基因转录终止盒，其中含有RNA剪接受体(SA)和polyA终止信号；另一个是polyA捕获构建，即下游基因过表达盒，其中含有强效启动子，荧光蛋白，核糖体进入位点(IRES)和RNA剪接供体(SD)。
上游基因转录终止盒的具体功能是：当转座子正向插入内源基因时，该基因的转录将被上游基因转录终止盒内的polyA终止信号中断。上游基因转录终止盒内的RNA剪接受体(SA)将与上游邻近内源外显子的RNA剪接供体(SD)拼接，从而只表达内源基因的N端。
下游基因过表达盒的具体功能是：当转座子正向插入内源基因时，RNA聚合酶将从下游基因过表达盒内的强效启动子开始转录，并终止于下游邻近的内源polyA。此过程中荧光蛋白被表达。下游基因过表达盒内的RNA剪接供体(SD)将与下游邻近内源外显子的RNA剪接受体(SA)拼接，从而使得核糖体可以从IRES位点进入，表达内源基因的C端。
基因捕获构建的设计目的是为了增强转座子的突变能力，从而更有效地改变插入位点基因的表达量。
在建立优选例中所述的基因捕获构建的过程中，所涉及的质粒抽提，质粒转化，大肠杆菌培养，PCR，酶切，连接为本领域人员所熟知的实验。常规实验条件可参照M.R.格林和J.萨姆布鲁克编著的《分子克隆实验指南》第四版。
基因捕获构建优选例的具体建立步骤是：上游基因转录终止盒中的人工合成的RNA剪接受体(SA)(SEQ ID No：1)通过PCR扩增后，酶切装入piggyBac转座子中的PmeI和EcoRI位点间。
上游基因转录终止盒中的兔β-球蛋白polyA信号由pCAG-EFGP(购自Addgene)质粒酶切获得，装入EcoRI和NheI位点间。
抗药筛选标记neo由pcDNA3(购自Invitrogen)质粒酶切获得，装入NheI内。
下游基因过表达盒中的鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG由pCAG-EFGP(购自Addgene)质粒酶切获得，装入NheI和EcoRI位点间。
下游基因过表达盒中的Katushka远红外荧光蛋白(Shcherbo等，2007，Nat.Methods 4：741-746)序列由pTurboFP635(购自Evrogen)质粒酶切获得，装入EcoRI和MluI位点间。
下游基因过表达盒中的核糖体进入位点(IRES)由pIRES(购自Clontech)质粒酶切获得，装入MluI和EcoRI位点间。
下游基因过表达盒中的人工合成的RNA剪接供体(SD)(SEQ ID No：2)通过PCR扩增后，酶切装入EcoRI和BglII位点间。
最终获得的携带基因捕获构建和抗药筛选标记的piggyBac转座子(SEQ ID No：3)如图1所示。
2.本发明制备方法的实施例。
2.1本发明制备方法的一种实施例中，基因突变大鼠可由携带转座子插入突变的精原干细胞产生获得。
2.1.1精原干细胞培养。
大鼠精原干细胞培养于小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上，培养基的成分为：高糖DMEM(购自Gibco)，1.5g/L碳酸氢钠，20ng/mL神经胶质细胞源性神经营养因子，20ng/mL成纤维细胞生长因子，100uM 2-巯基乙醇，4uM L-谷氨酰胺，1xB27添加物(不含维他命A)(购自Sigma)。
2.1.2精原干细胞转染。
将携带基因捕获构建和抗药筛选标记的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸各0.5ug与10uL Lipofectamine 2000脂质体(购自Invitrogen)混合于200uL Opti-MEM培养基中。收集106精原干细胞悬浮于800uL精原干细胞培养基中，加入核酸脂质体混合液，37℃转染孵育1小时。随后，将被转染的精原干细胞置于滋养层上培养，并在培养基中加入75μg/ml G418(购自Invitrogen)，药物筛选两周，得到携带转座子的精原干细胞。
2.1.3由携带转座子的精原干细胞获得基因突变大鼠。
在手术前两周，对受体公鼠进行腹腔注射12.5mg/kg白消安，造成不育。手术当天，用80mg/kg ketamine和10mg/kg xylazine麻醉受体公鼠，手术打开腹腔，暴露睾丸。将75uL含5x105/100uL的精原干细胞悬浮液注射入睾丸，随后进行手术缝合。将复苏后的受体公鼠与同种母鼠交配，在子代中得到携带插入于不同位点的piggyBac转座子的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子基因突变大鼠。
2.2本发明制备方法的另一种实施例中，基因突变大鼠可由携带转座子插入突变的胚胎干细胞产生获得。
2.2.1胚胎干细胞培养。
大鼠胚胎干细胞培养于小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上，培养基的成分为：DMEM/F12和Neurobasal培养基(比例1∶1，购自Invitrogen)，100uM 2-巯基乙醇，1xN2添加物，1xB27添加物，CHIR99021和PD0325901抑制剂(购自Sigma)(Buehr等，2008，Cell 135：1287-1298；Li等2008，Cell 135：1299-1310)。
2.2.2胚胎干细胞转染。
将携带基因捕获构建和抗药筛选标记的piggyBac转座子核酸1ug和编码piggyBac转座酶的核酸20ug共同电转导入5x105大鼠胚胎干细胞中。随后，在胚胎干细胞培养基中加入180μg/ml G418(购自Invitrogen)，药物筛选两周，得到携带转座子的胚胎干细胞。
2.2.3由携带转座子的胚胎干细胞获得基因突变大鼠。
将12-15个携带转座子的胚胎干细胞注射入囊胚。用80mg/kg ketamine和10mg/kgxylazine麻醉E3.5天的假孕母鼠，手术打开腹腔，暴露子宫。在子宫内，植入8-10枚被注射的囊胚，随后进行手术缝合。在子代中可得到携带插入于不同位点的piggyBac转座子的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子基因突变大鼠。
2.3本发明制备方法的另一种实施例中，基因突变大鼠可由携带转座子插入突变的受精卵产生获得。
2.3.1受精卵注射。
将携带基因捕获构建的PiggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸，按摩尔比1∶1的比例混合。取混合DNA样品(5ng/uL)通过原核显微注射同时导入离体的大鼠受精卵的基因组内。
2.3.2由携带转座子的受精卵获得基因突变大鼠。
用80mg/kg ketamine和10mg/kg xylazine麻醉假孕母鼠，手术打开腹腔，暴露输卵管。在输卵管内，植入10-15枚被注射的受精卵，随后进行手术缝合。在哺育得到的后代中，采集新生大鼠为尾尖，用蛋白酶K消化提取基因组DNA，利用引物PBGT1(SEQ ID No：4)和PBGT2(SEQ ID No：5)进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定获得携带随机插入转座子的阳性杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子基因突变大鼠。
2.4本发明制备方法的另一种实施例中，基因突变大鼠可通过在携带转座子的雄性突变大鼠生殖系细胞中移动转座子获得产生获得。
2.4.1piggyBac转座酶阳性大鼠的制作。
将编码piggyBac转座酶的核酸(5ng/uL)通过原核显微注射导入离体的大鼠受精卵的基因组内。用80mg/kg ketamine和10mg/kg xylazine麻醉假孕母鼠，手术打开腹腔，暴露输卵管。在输卵管内，植入10-15枚被注射的受精卵，随后进行手术缝合。在哺育得到的后代中，采集新生大鼠为尾尖，用蛋白酶K消化提取基因组DNA，利用引物PBaseGT1(SEQID No：6)和PBaseGT2(SEQ ID No：7)进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定获得携带piggyBac转座酶的阳性大鼠。
2.4.2在雄性突变大鼠生殖系细胞中移动转座子获得新的基因突变大鼠。
将piggyBac转座酶阳性大鼠与实施例2.1，2.2和2.3中所述的携带piggyBac转座子插入的基因突变大鼠进行交配，得到基因组中即含有piggyBac转座子又含有piggyBac转座酶的双阳性雄性大鼠。在这些雄性大鼠的生殖系细胞基因组中，piggyBac转座子被piggyBac转座酶移动，得到新的插入突变。将上述双阳性雄性大鼠和野生型雌性大鼠交配后，子代中可得到携带新位点piggyBac转座子插入的基因突变杂合子大鼠。杂合子大鼠通过同品系交配可获得纯合子基因突变大鼠。
3.利用接头PCR鉴定大鼠基因组内piggyBac转座子插入位点。
反向PCR和接头PCR是鉴定插入突变所在位点的常用方法，其中接头PCR的灵敏度更高(Hui等，1998，Cellular and Molecular Life Science 54：1403-1411)。本发明实施的优选例中，鉴定转座子在基因组中插入位点的方式是接头PCR，具体的步骤是：大鼠尾尖提取的DNA经Sau3AI限制性内切酶酶切后得到长度不同的DNA片段，随后通过T4连接酶在这些片段两端同时加上接头。这里所述的接头是由LinkerA(SEQ ID No.8)和LinkerB(SEQ ID No.9)寡核苷酸经退火获得的双链DNA。连有接头的基因组DNA文库经piggyBac转座子臂特异引物(左臂：PBLlink(SEQ ID No.10)；右臂：PBRlink(SEQ IDNo.11))和接头特异引物(LinkAmp(SEQ ID No.12))用Taq聚合酶PCR特异扩增插入位点周边基因组序列。PCR扩增产物随后连接装入T载体(购自Promega)，并转化至大肠杆菌中进行进一步扩增，以得到足够的DNA用于测序获得插入位点周边基因组序列。测序得到的序列与USCS Genome Browser中的大鼠基因组公开数据库中的序列进行比对，从而确定转座子的插入位点。
4.基因功能研究和药物研发中的应用。
携带基因突变的实验动物在基因功能研究和药物研发中是重要的工具。在基因功能研究领域，携带随机基因突变的动物可被用于发现具有特定功能的新基因。当特定基因突变了的动物个体表现出特定的表型时，可直接在该基因突变和表型间建立因果关系。另一方面，针对携带基因突变的动物进行表型分析有助于发现特定基因的新功能。在人类疾病研究领域，携带致病基因突变的动物可用于模拟人类疾病，以及研究疾病发生机理。在新药开发领域，基因突变疾病动物模型还可以在临床前试验中用于筛选能缓解疾病表型的新药，以及确定新药的安全性和有效性。当特定基因被发现可以在动物模型中调控临床疾病相关的表型时，这些基因可以被候选为新型的药物靶点。
本发明基因突变大鼠资源库可被用于表型分析，基因功能研究，人类疾病模拟和药物开发。
表1例举了部分本发明基因突变大鼠资源库中基因突变大鼠疾病模型。
| 疾病类型 | 大鼠模型突变基因 |
| 肿瘤 | p53：Pten |
| 内分泌疾病 | Tshr |
| 肥胖 | Lept in：Mc4r |
| 免疫缺陷 | Ada |
| 血友病 | Factor IX |
| 囊性纤维化 | Cftr |
| 神经系统疾病 | MeCP2 |
| 泌尿系统疾病 | Pkd1 |
在一个本发明应用于表型分析，基因功能研究和人类疾病模拟更具体的实施例中，piggyBac转座子插入了促甲状腺激素受体(Tshr)基因。表型分析结果发现该插入突变造成大鼠生长迟滞和血清中甲状腺素T4水平降低。该结果表明Tshr基因在动物个体生产和内分泌激素调节中有特定功能。该TshrPB/PB突变大鼠能有效模拟了人类呆小症，是一个克汀病动物模型。
上面所述实施例中检测血清中甲状腺素T4水平降低的方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)(购自R&D systems)，具体的实验条件为厂商所建议的条件。
在一个本发明应用于确定药物有效性更具体的实施例中，给幼年TshrPB/PB突变大鼠的食物中添加了野生型大鼠甲状腺提取物(购自Sigma)，该提取物可以减轻突变大鼠的疾病表型，减缓生长迟滞。经治疗的成年突变大鼠的体重接近野生型大鼠。
Claims (10)
1.一种基因突变大鼠资源库，其特征是资源库中的基因突变大鼠的基因组中携带一个或多个转座子插入突变。
2.根据权利要求1所述的基因突变大鼠资源库，其特征是资源库中的基因突变大鼠是基因组中携带转座子插入突变的杂合子或纯合子。
3.根据权利要求1所述的基因突变大鼠资源库，其特征是资源库中的基因突变大鼠携带的转座子包含基因捕获构建，其中包括以下元件：
1)启动子捕获构建，即上游基因转录终止盒；
2)polyA捕获构建，即下游基因过表达盒。
4.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库中的基因突变大鼠的一种制备方法是由携带转座子插入突变的精原干细胞产生获得，步骤是：
1)将携带基因捕获构建的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸通过脂质体转染同时导入体外培养的大鼠精原干细胞的基因组内；
2)将携带转座子的精原干细胞注射入雄性大鼠睾丸内，并与同种雌鼠交配，在子代中得到携带piggyBac转座子插入的基因突变大鼠。
5.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库中的基因突变大鼠的另一种制备方法是由携带转座子插入突变的胚胎干细胞产生获得，步骤是：
1)将携带基因捕获构建的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸通过电穿孔转染同时导入体外培养的大鼠胚胎干细胞的基因组内；
2)将携带转座子随机插入突变的大鼠胚胎干细胞注射入囊胚，植入假孕母鼠体内，在子代中得到携带piggyBac转座子插入的基因突变大鼠。
6.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库中的基因突变大鼠的另一种制备方法是由携带转座子插入突变的受精卵产生获得，步骤是：
1)将携带基因捕获构建的piggyBac转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸通过显微注射同时导入离体的大鼠受精卵的基因组内；
2)将携带转座子随机插入突变的受精卵植入假孕母鼠体内，在子代中得到携带piggyBac转座子插入的基因突变大鼠。
7.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库中的基因突变大鼠的另一种制备方法是通过在携带转座子的雄性突变大鼠生殖系细胞中移动转座子获得，步骤是：
1)将piggyBac转座酶阳性大鼠与权利要求4，5，6中所述的携带piggyBac转座子插入的基因突变大鼠交配，得到基因组中即含有piggyBac转座子又含有piggyBac转座酶的双阳性雄性大鼠；
2)将双阳性公鼠和野生型母鼠交配后，在子代中得到携带新位点piggyBac转座子插入的基因突变大鼠。
8.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库，其特征是资源库中的基因突变大鼠可用于表型分析和基因功能研究。
9.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库，其特征是资源库中的基因突变大鼠可用于模拟人类疾病和筛选能加重或减轻表型的药物。
10.权利要求1所述的基因突变大鼠资源库，其特征是资源库中具有抗疾病相关表型的突变大鼠所携带的基因突变可用作新药靶点。
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