CN103468741B - 改进的由PiggyBac转座子介导的个体基因突变方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及改进的由PiggyBac转座子介导的个体基因突变方法。本发明的方法通过设计适用于基因捕获的构建物来实现。本发明的方法可以在生物个体中进行基因捕获和基因突变，将插入到基因内的转座事件变成一种基因插入突变的结果，并能快速而方便地筛选出来。

Description

改进的由PiggyBac转座子介导的个体基因突变方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种改进的由piggyBac(PB)转座子介导的个体基因突变技术。

背景技术

基因组计划是人类上世纪末实施的一项宏伟工程，通过解析控制生命活动的遗传密码和机制，逐步理解生命活动的本质。它不仅对生命科学本身产生了革命性的影响，而且将为促进人类健康和现代生物医药的产业化作出重大的贡献。随着包括人类在内的多种生物基因组DNA序列分析的完成，全面开展基因功能的研究即功能基因组学已成为生命科学的重要前沿领域[1]。

利用基因组结构、个体发生和发育过程、组织细胞结构和功能特征等与人类相近的模式生物体系，建立动物模型，在整体生物水平研究复杂生命现象和相关未知基因的功能，已成为功能基因研究的主要技术手段。获得各种带有遗传突变的动物模型是阐述某一基因功能的直接策略。因此，X射线、化学诱变、逆转录病毒转染及转基因技术等多种产生突变的方法相继出现并被应用于基因功能研究[2-5]。但这些方法都带有不稳定性，如经常影响多个基因或引起染色体重排，或不能提供分子标记来方便地获得突变的信息[6-8]。在胚胎干细胞(ES)内利用同源重组产生特定基因突变的基因打靶技术(knockout or knockin)是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一[9]。然而，由于同源重组几率低、动物繁育耗时费力且产生的功能失活突变(无义突变，null mutations)常常与疾病中发现的分子损伤类型不同，因此，也带有明显的局限性。

基因捕获(gene trapping)是一种结合了随机突变可以在短期内获得大量突变物种资源、同时又兼有对突变信息可以进行比较方便、明确的突变策略，即“随机基因打靶”[10]。由于原理简单及其高效性，很快被应用于植物、昆虫、果蝇及小鼠中。基因捕获技术是通过将基因捕获载体随机整合到基因组中，产生插入失活突变，并通过设计好的筛选手段，主要是利用真核基因具有启动子和Poly A的特征，通过启动子捕获或者PolyA捕获，大量而低成本地获得突变 的细胞或者个体。由于这一技术具有的优势，它已成为一种产生大规模基因突变的便利方法，对揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值[11-13]。

转座因子是一类在基因组内可以移动的DNA元件。利用转座子在动植物基因组内进行突变的方法已有报道[14]。piggyBac(PB)是在甘蓝环蛾中发现的一个属于第二类真核生物转座子，转座子长2,476bp，两端含有末端反向重复序列(ITR)，中间2.1kb构成一个编码转座酶的编码框。piggyBac转座子可以在基因组中切出和转座，转座位点发生在特征性的TTAA四核苷酸序列[15-17]。研究表明，piggyBac转座子在多种物种中具有转座活性，包括在昆虫、果蝇、小鼠中[18-25]。

尽管基因捕获技术已经被大量研究应用，但还需要对这类技术加以改良，以适用于更方便、快捷地获得发生突变的生物个体，提高基因突变的成功效率，提高筛选的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的由piggyBac(PB)转座子介导的个体基因突变技术。

在本发明的第一方面，提供一种用于基因捕获的构建物，所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：

piggyBac转座子左臂，RNA剪接受体(SA)，启动子，报告基因，翻译终止密码子(TC)，RNA剪接供体(SD)，piggyBac转座子右臂；

其中，所述的报告基因不带有3’端PolyA终止信号。

在一个优选例中，所述的启动子是人巨细胞病毒启动子CMV。

在另一优选例中，所述的构建物中，在报告基因的3’端，还包括以下依次相连的元件：Loxp，IRES，Loxp。

在另一优选例中，所述的构建物中，在报告基因的3’端，还包括以下元件：mRNA不稳定信号；和/或KOZAK序列。

在另一优选例中，所述的KOZAK序列为3个拷贝的KOZAK序列。

在另一优选例中，所述的构建物中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因。

在另一优选例中，所述的构建物是载体。

在本发明的另一方面，提供一种表达转座酶的构建物，所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：精原细胞特异性表达启动子，piggyBac转座酶编码基因以及PolyA终止信号。

在另一优选例中，所述的精原细胞特异性表达启动子是小鼠精蛋白1(protamine 1，prm1)的启动子。

在另一优选例中，所述的构建物是载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于基因突变的系统，所述系统包括：

(1)所述的用于基因捕获的构建物；和

(2)所述的表达转座酶的构建物。

在本发明的另一方面，提供一种制备基因组中发生基因插入突变的动物的方法，包括：

(a)将所述的构建物转入到动物受精卵内，将受精卵移植到动物生殖系统中，使动物怀孕，产生转基因阳性的子代动物；

(b)将所述的构建物转入到动物受精卵内，将受精卵移植到动物生殖系统中，使动物怀孕，产生转基因阳性的子代动物；

(c)将(a)获得的转基因阳性的子代动物与(b)获得的转基因阳性的子代动物杂交，选择转基因双阳性的子代雄性动物；

(d)将(c)获得的子代雄性动物与雌性动物交配，获得后代，选择报告基因表达阳性的动物，其基因组中发生基因插入突变。

在另一优选例中，步骤(a)所述的构建物中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白；步骤(d)中，报告基因表达阳性的动物在长波紫外光或者蓝光下表体发光。

在另一优选例中，步骤(b)中，将所述的构建物定位插入到动物受精卵的X染色体内；

并且，在步骤(d)之后，还包括步骤：(e)从步骤(d)获得的动物中选择雄性动物，其为不含有外源的转座酶的基因组中发生基因插入突变的动物。

在另一优选例中，定位插入的位置为X染色体的hprt基因内。

在另一优选例中，所述的动物是非人哺乳动物。

在本发明的另一方面，提供一种制备受精卵的方法，包括将所述的用于基因捕获的构建物转入到受精卵内；或

将所述的表达转座酶的构建物转入到受精卵内。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1、含有PB转座位点的polyA基因捕获载体的示意图。PBL：PB转座因子的左臂，PBR：PB转座因子的右臂，SA：RNA剪接受体(splice acceptor)，SD(splice donor)：RNA剪接供体，CMV-GFP：由人巨细胞病毒(MV)直接早期蛋白基因的启动子驱动绿色荧光蛋白的表达，TC：翻译终止密码子(termination codon)，LoxP：噬菌体P1的一种位点特异性重组系统的识别位点，IRES：核糖体识别位点，IC*3：三个拷贝的KOZAK序列(ACCAUGG)分别在不同的读框中；mRNA不稳定信号(mRNA instability)：介导mRNA的降解。

图2、PB转座酶的表达载体，其中pA表示PolyA。

图3、PB阳性动物个体与PB转座酶阳性的动物个体进行交配得到转基因双阳性的动物个体，然后再与野生型动物个体杂交得到各种含有突变位点的动物个体。在长波紫外或者蓝光下通过观察新生个体体表荧光，筛选到具有插入到有效基因的突变动物个体，通过基因插入位点鉴定得到具体的突变信息。

图4、在成年小鼠精原细胞中特异表达PB转座酶的载体。由小鼠的精蛋白1(protamine 1，prm1)的启动子驱动PB转座酶的表达。

图5、两种阳性小鼠进行雌雄交配得到含有转座位点和转座酶的双阳性小鼠，再与野生型小鼠交配不断得到含有不同插入位点的突变小鼠。

图6、突变小鼠的表型以及遗传型分析的结果。在荧光显微镜下观察458号双阳性的雄鼠与野生型交配后得到的一窝小鼠的情况。

具体实施方式

本发明建立了一种改良的由piggyBac(PB)转座因子介导的在动物个体中进行基因捕获的方法，本发明的方法可以在生物个体中进行基因捕获和基因突变，将插入到基因内的转座事件变成一种基因插入突变的结果，并能快速而方 便地筛选出来，同时对于在基因内的插入，这种筛选效率基本不受插入位点的影响。本发明的方法可以获得在基因内任何位置发生突变的生物个体，且操作者可以通过观察报告基因的表达情况方便地筛选到插入在基因内任何位置的突变物种。

术语

如本文所用，所述的“动物”没有特别的限制，只要其是适合于采用本发明的方法进行转基因操作并能够产生子代(后代)，且是有性繁殖的动物。例如，所述的动物包括但不限于：线虫、果蝇、鱼、大鼠、小鼠、猴。作为一种可选的方式，所述的动物是哺乳动物，更特别的是非人哺乳动物。例如，所述的非人哺乳动物选自：小鼠、大鼠、兔、狗、猴。所述的非人哺乳动物在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面和人类接近。优选的，所述的非人哺乳动物是鼠(如大鼠、小鼠)；更优选的是小鼠。作为本发明的优选方式，以小鼠作为模式生物，和人类相比，它无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非常接近，因此可良好地应用于人类疾病发病机制、药物药理学研究等方面。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

基因捕获系统

本发明人依据polyA基因捕获的原理设计构建了一种新型的用于基因捕获的构建物，即PB介导的polyA基因捕获构建物。该构建物的左右各有一个转座位点，即piggyBac转座子左臂(PBL)与piggyBac转座子右臂(PBR)。所述 的PBL和PBR构成了piggyBac转座子的末端转座序列。

在左右两臂之间，包括一报告基因表达盒，包括：启动子，报告基因，翻译终止密码子(TC)；但去除了polyA信号。由于polyA信号的缺失，使得该构建物只有在捕获到目的基因的polyA信号后才能成功地表达报告基因。

所述的报告基因可以是本领域人员已知的各种报告基因，较佳地是一些可编码荧光蛋白的基因。所述的报告基因例如是：绿色荧光蛋白编码基因(GFP)、增效的绿色荧光蛋白编码基因(EGFP)、红色荧光蛋白编码基因或荧光素酶编码基因等。更优选的，所述的报告基因是绿色荧光蛋白编码基因，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且可见光不易淬灭。绿色荧光蛋白的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会。所述的“绿色荧光蛋白”还包括各种在野生型绿色荧光蛋白基础上进行改进的蛋白，比如进行基因密码子优化，通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温(如37℃)条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性等。“增效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，例如，可克隆自质粒pEGFP-N1(购自Clontech)。

在报告基因5’端和3’端还分别连接有RNA剪接的受体(Splicing Acceptor，SA)和RNA剪接的供体(Splicing Donor，SD)序列，当重组体插入到细胞基因组的中，由于剪接供体与剪接受体序列的作用而使报告基因不会在转录后修饰的过程中被剪切掉，而能够随着基因转录和表达。

较佳地，在报告基因的3’端，还有带有IRES元件，其两侧各有一loxP结构；更佳地，在IRES元件的3’端还包括KOZAK元件(优选含3个拷贝；IC*3)。加入IRES和KOZAK元件可以有效地避开mRNA监视机制，使得转录出来的报告基因的mRNA稳定。真核生物细胞中的mRNA监视机制是指翻译终止信号在离Poly A过远的情况下，会将这类mRNA视为非正常转录产物，而启动降解；这种情况，常发生在当基因捕获载体插入在基因5’区域时，由于报告基因的终止离捕获到的Poly A距离过长而不被翻译，最终造成筛选到的突变都是靠近基因的3’端。

较佳地，在报告基因的3’端，还有mRNA不稳定的信号序列，以此造成捕获载体在插入非基因区内、或者插入在内源基因非编码的3’区后转录出的报告基因的mRNA不稳定、不发生报告基因蛋白的合成，从而避免这类插入被作为阳性筛出，有效提高筛选的效率。

除非另外说明，以上所述的各元件均是本领域技术人员已知的元件，它们的序列可以直接通过化学合成来获得，或者可以从商购的载体中克隆获得。

所述的用于基因捕获的构建物中，没有转座酶的编码基因，因此，本发明人还构建了一个用于表达转座酶的构建物。所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：精原细胞特异性表达启动子，piggyBac转座酶编码基因以及PolyA终止信号。该构建物在转入到动物基因组中后，可以表达转座酶。

基因突变动物的构建

本发明提供了一种由piggyBac(PB)转座子介导的动物个体基因突变方法，这一方法的特征是利用PB转座子的转座功能使得具有polyA基因捕获功能的DNA序列(以下称基因捕获载体，Poly A splice donor gene trap vector)随机地插入到动物个体的基因组内，通过对报告基因的检测，筛选到正好插入到基因内的转座事件，以此获得动物的基因插入突变物种。

利用所述的用于基因捕获的构建物(载体)，建立转基因小鼠、转基因大鼠或者其他转基因动物，用这种转基因动物和转有piggyBac转座酶的同种动物体交配，产生双阳性的转基因动物；该双阳性转基因动物，与正常同种动物繁殖，通过鉴定后代动物报告基因的表达，筛选具有插入突变的后代动物，从而实现个体基因捕获。

作为本发明的优选方式，还可以通过将用于表达转座酶的构建物定位插入到动物受精卵的X染色体内；从而可方便地选择到不含有外源的转座酶的基因组中发生基因插入突变的后代动物，使得突变能够稳定。

利用本发明的方法可以构建各种带有不同遗传突变的生物物种，这些突变物种可以用来研究基因的功能和建立疾病模型，也可以用于药物和治疗等方面的研究和开发。它的优点是能在个体水平上进行全基因组范围内的基因捕获，通过合理的设计，可以利用肉眼观测新生动物体表的报告基因荧光，来筛选成功插入内源蛋白编码基因的突变个体；本发明的另一个优点是确保在各种载体插入状况下这种筛选方式的有效性，这样的优点在以前的发明和文献报告中均是没有的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、含有PB转座位点的polyA基因捕获(splice donor gene trap)载体和PB转座酶表达载体的建立

1、构建含有PB转座位点的polyA基因捕获载体

PB介导的polyA基因捕获载体，结构如图1所示。具体的，两个Lox P是通过合成得到的(即：F1LoxP和R1LoxP引物、或F2LoxP和R2LoxP引物经退火获得)，第一个Lox P含有酶切位点：Bgl II和Sac I，第二个Lox P含有酶切位点：EcoR I和Sal I。再进行相应的酶切装入到pEGFP-C1(Clontech)载体中，得到pEGFP-C1-Lox P2。

利用Fgfp-ires和Rgfp-ires引物通过PCR从pIRES(Clontech)质粒扩增出IRES，并在pEGFP-C1-Lox P2的Sac I和EcoR I位点间插入，得到pEGFP-C1-LoxP2-IRES。

利用Fgfp-sd和Rgfp-sd引物从小鼠基因组DNA中扩增出基因hprt第8个外显子/第8个内含子之间约174bp的SD，插入在pEGFP-C1-Lox P2-IRES载体的Kpn I和Apa I中，得到pEGFP-C1-Lox P2-IRES-SD。

mRNA不稳定信号来自于人的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子前体(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor precursor，GM-CSF)的cDNA，共54bp，通过合成得到(即：FInst-B和RInst-X引物经退火获得)。插在pEGFP-C1-Lox P2-IRES-SD的Xba I和Mlu I位点间，得到pEGFP-C1-LoxP2-IRES-SD-in。

利用FpBac L和RpBac L引物在PB3XP3GFPaf(获自法国Thomas Jean-luc)扩增得到PiggyBac L，并通过Xba I和Mlu I装入pEGFP-C1-Lox P2-IRES-SD-in载体中，得到pEGFP-C1-Lox P2-IRES-SD-in-L。

利用SA-sen和SA-anti引物从人的基因组内扩增出B细胞淋巴(组织)瘤2基因(homo sapiens bcl-2)第2个内含子和第3个外显子间获得432bp的SA。并经过Sac I和Mul I插入载体pEGFP-C1-Lox P2-IRES-SD-in-L中。

利用FpBac R和RpBac R引物在PB3XP3GFPaf扩增得到PiggyBac R，插入在上述载体的Not I和Kpn I中，得到基因捕获载体PB(polyA(EG))。

有关引物如下：

F1LoxP：5’GA TCT TAA AtaacttcgtatagcatacattatacgaagttatGAGCT 3’(SEQ ID NO：1)；

R1LoxP：5’CataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatTTAA 3’(SEQ ID NO：2)；

F2LoxP：5’AATTC ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat G 3’(SEQ ID NO：3)；

R2LoxP：5’TCGAC ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat G 3’(SEQ ID NO：4)；

Fgfp-ires：5’ATT GAGCTC CCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAA 3’(SEQ ID NO：5)；

Rgfp-ires：5’GCTGAATTCCATCCATCCATGGGTTGTGGCAAGCTTATCA TC 3’(SEQ ID NO：6)；

Fgfp-sd：5’AGT GGTACC ACTTCAGGGATTTGAATgtaag 3’(SEQ ID NO：7)；

Rgfp-sd：5’AAT GGGCCC ggacgtctgtacttgactacag 3’(SEQ ID NO：8)；

FInst-B：5’GATCCATCAGTAATATTTATATATTTATATTTTTAAAATATTTATTTATTTATTTATTTAAGT3’(SEQ ID NO：9)；

RInst-X：5’CTAGACTTAAATAAATAAATAAATAAATATTTTAAAAATATAAATATATAAATATTACTGATG 3’(SEQ ID NO：10)；

FpBac L：5’GGATCTAGA GTCGACCTGCAGGCATGCAAG 3’(SEQ ID NO：11)；

RpBac L：5’AAGACGCGT gacaatgttcagtgcagagac 3’(SEQ ID NO：12)；

SA-sen：5’CGG GAGCTC CTGTATCTCTAAGATGGCTGG 3’(SEQ ID NO：13)；

SA-anti：5’GCC ACGCGT TGC ATA TTA TTT CTA CTG C 3’(SEQ ID NO：14)；

FpBac R：5’AAT GGTACC cgatgttttgttttgacggac 3’(SEQ ID NO：15)；

RpBac R：5’AATGCGGCCGC gatcaaaacgcaaatcgacg 3’(SEQ ID NO：16)；

最终，获得的含有PB转座位点的载体的示意图如图1所示。

2、构建PB转座酶表达载体

含有PB转座酶的载体，启动子可以根据需要而选择，载体结构示意图见图2。

根据本发明人的实验设计，希望PB转座酶(PBase)在精原细胞中表达，造成各种突变发生在精原细胞内，产生带有各种突变的精子，这样通过后继的繁殖就可以获得相应的带有突变的个体。

为了获得在小鼠精原细胞中表达PB转座酶的转基因小鼠，利用fPrm1和rPrm1引物通过PCR技术从c57小鼠的基因组DNA中扩增出小鼠精蛋白1(protamine 1，prm1)的启动子，插入到pGL3-Basic(promega)载体的Bgl II和Hind III多克隆位点处。然后，再利用fPBase和rPBase引物通过PCR技术从质粒MA help pig A3(获自法国Thomas Jean-luc)上得到PB转座酶的cDNA插入到上述载体的Hind III和Xho I，得到pGL3-Prm1-PBase。经过测序，证实为阅读框正确的鼠精蛋白1基因上游启动子驱动的PB转座酶表达载体，如图4。

有关引物如下：

fPrm1：5’CTAAGATCTtgttttactagagcccacc 3’(Bgl II)(SEQ ID NO：17)；

rPrm1：5’TCGAAGCTTCATGGTGCTGGCTTGGCCG 3’(Hind III)(SEQ ID NO：18)；

fPBase：5’AGCAAGCTTggatgttctttagacgatg 3’(SEQ ID NO：19)；

rPBase：5’ATGCTCGAGtcagaaacaactttggcac 3’(SEQ ID NO：20)。

本发明人还构建了一个CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体pCMV-PBase，构建方法为：将PCR获得的转座酶基因克隆到表达载体pcDNA3(Invitrogen)中。

实施例2、基因捕获载体转基因小鼠和PB转座酶表达载体转基因小鼠的建立

基因捕获载体转基因小鼠利用实施例1中获得的载体PB(polyA(EG))构建。具体地，将CMV启动子驱动的PB转座酶表达载体(pCMV-PBase)和PB (polyA(EG))以环形质粒形式，在质量比1∶2的比例下，进行小鼠受精卵雄原核DNA显微注射，注射后的受精卵移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕并获得新生小鼠，采集新生小鼠尾尖，提取DNA后，利用PCR进行鉴定，得到了PB(polyA(EG))转基因阳性的转基因小鼠。

PB转座酶表达载体转基因小鼠的建立，转基因采用实施例1中获得的载体pGL3-Prm1-PBase，载体用Not I和AlwN I切下prm1-PBase表达框，并且割胶回收需要的目的片段。然后，通过如上所述的显微注射技术注射受精卵，移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕，获得含有上述prm1-PBase表达框的转基因阳性子代小鼠。

一种更好的方法是利用常规的Knock-in的方法，将Prm1-PBase表达框定位插入到小鼠ES细胞的X染色体内，通过将该ES细胞注射小鼠囊胚，获得嵌合小鼠后，获得相应的定点插入转基因小鼠，本发明人将它插入到小鼠X染色体的hprt基因内。这样做的好处是在以后突变小鼠筛选过程中，可以通过性别筛选(选择雄性)，获得不含有PB转座酶的突变小鼠。

实施例3、基因捕获载体和PB转座酶双阳性小鼠的建立和突变小鼠的获得

将实施例2中所获得的基因捕获载体转基因小鼠(选择转基因阳性，表体无荧光小鼠)和PB转座酶转基因小鼠进行杂交，从后代中筛选获得基因捕获载体和PB转座酶均为阳性的转基因雄性小鼠(图5)。上述小鼠成年后作为种鼠和野生型雌性小鼠交配，即可以从后代中获得各类插入突变的小鼠。流程示意图如图3。

实施例4、插入突变小鼠的获得和插入位点的鉴定

利用实施例3中所获得的双阳性雄鼠，和野生型雌鼠进行交配繁殖，新生小鼠在长波紫外光或者蓝光下观察，表体发光的小鼠即表示转座子插入到某基因中，并由于捕获到该基因的Poly A而形成报告基因的完整表达形式，导致报告基因能正常表达而显现荧光，利用PCR方法可以排除PB转座酶在新生小鼠中的阳性出现。

当PB转座酶转基因被安置在X染色体上时，则只需要筛选雄性有荧光小鼠就可以排除PB转座酶为同时阳性的可能。图6是一个例子，在一窝出生的 九个小鼠中，有一只有明显的荧光(图6，右下侧小鼠)。进行常规PCR鉴定证实9只幼鼠中有5只是PB(polyA(EG))转基因阳性，然后再将这5只小鼠进行转基因插入位点鉴定，结果表明在荧光阳性的小鼠中，PB(polyA(EG))插在一基因的内含子里，此基因为甘油二酯激酶β(diacylglycerol kinase,beta，Dgkb)；而其它4只全是在小鼠3号染色体上非基因部位。

进一步实验证实，只有插入到小鼠某个基因的内部，而且绿色荧光蛋白(EGFP)的阅读框与内源性基因的阅读框方向一致时，才能在长波紫外光或者蓝光下观察小鼠的表体发光。

对这一窝小鼠进行位点鉴定的结果如表1。

表1

另一批次试验中，分别对各3只在长波紫外光或者蓝光下没有明显荧光的小鼠和有明显荧光的小鼠进行插入位点分析，结果如表2。

表2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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Claims (9)

1.一种用于基因捕获的构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：

piggyBac转座子左臂，RNA剪接受体，启动子，报告基因，翻译终止密码子，RNA剪接供体，piggyBac转座子右臂；

其中，所述的报告基因不带有3’端PolyA终止信号，并且在报告基因的3’端，还包括以下依次相连的元件：Loxp，IRES，Loxp；

并且在所述报告基因的3’端还包括以下元件：mRNA不稳定信号和KOZAK序列。

2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，在IRES元件的3’端还包括KOZAK元件。

3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的KOZAK序列为3个拷贝的KOZAK序列。

4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因。

5.一种用于基因突变的系统，其特征在于，所述系统包括：

(1)权利要求1-4任一所述的用于基因捕获的构建物；和

(2)表达转座酶的构建物，其中所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：精原细胞特异性表达启动子，piggyBac转座酶编码基因以及PolyA终止信号。

6.一种制备基因组中发生基因插入突变的动物的方法，包括：

(a)将权利要求1-4任一所述的构建物转入到动物受精卵内，将受精卵移植到动物生殖系统中，使动物怀孕，产生转基因阳性的子代动物；

(b)将一构建物转入到动物受精卵内，将受精卵移植到动物生殖系统中，使动物怀孕，产生转基因阳性的子代动物，

其中所述构建物从5’至3’端包括以下可操作性连接的元件：精原细胞特异性表达启动子，piggyBac转座酶编码基因以及PolyA终止信号；

(c)将(a)获得的转基因阳性的子代动物与(b)获得的转基因阳性的子代动物杂交，选择转基因双阳性的子代雄性动物；

(d)将(c)获得的子代雄性动物与雌性动物交配，获得后代，选择报告基因表达阳性的动物，其基因组中发生基因插入突变。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的构建物中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白；步骤(d)中，报告基因表达阳性的动物在长波紫外光或者蓝光下表体发光。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将所述的构建物定位插入到动物受精卵的X染色体内；

并且，在步骤(d)之后，还包括步骤：(e)从步骤(d)获得的动物中选择雄性动物，其为不含有外源的转座酶的基因组中发生基因插入突变的动物。

9.一种制备受精卵的方法，包括将权利要求1-4任一所述的用于基因捕获的构建物转入到受精卵内。