CN105238818A - 一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法 - Google Patents

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本发明属于生物技术领域，涉及一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。本发明在引入插入突变时，提供了一种携带piggyBac转座子系统的非整合型慢病毒复合载体及其制备方法。本发明可用于高效地制备非人基因突变动物。通过本发明制备的基因突变动物可用于动物表型分析，基因功能研究，人类遗传疾病模拟，新药筛选和新药靶发现。

Description

一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。本发明可用于高效地制备非人基因突变动物。
背景技术
基因突变能改变特定基因的DNA核苷酸序列，具体种类包括碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。基因突变造成特定基因产物的表达量或者功能发生变化，从而导致细胞水平上的生物学过程发生改变，以及动物个体水平上的表型发生异常(Griffiths等编著的《IntroductiontoGeneticAnalysis》第十版)。
携带基因突变的实验动物模型在生物学研究和新药开发中是非常重要的资源。在生物学研究中，携带随机基因突变的动物可被用于发现具有特定功能的新基因。针对携带基因突变的动物进行的表型分析有助于发现特定基因的新功能。在新药开发领域，携带致病基因突变的动物可用于模拟人类疾病，以及研究疾病发生机理。此外，基因突变疾病动物模型还可以在临床前试验中用于筛选能缓解疾病表型的新药，以及确定新药的安全性和有效性。当特定基因突变在动物模型中引起抗疾病表型时，相应基因可被直接候选为新型的药物靶点。
现有制备基因突变动物的方法主要涉及离体胚胎干细胞基因操作(Bradley等，1984，Nature309：255-256；Thomas和Capecchi，1987，Cell51：503-512)和离体受精卵原核显微注射(Behringer等编著的《ManipulatingtheMouseEmbryo：ALaboratoryManual》第四版)。这些制备方法花费大，耗时长，技术要求高，而且在制备基因突变动物过程中还需要将离体细胞植入假孕雌性动物体内。
雄性动物睾丸内的精原干细胞可以分化形成成熟的精子，是另一种可被用于制备转基因动物的细胞源。将整合型慢病毒(Lentivirus)注射入正处于发育阶段的睾丸内，可以直接感染体内精原干细胞(Sehgal等，2011，PLoSOne6：e21975)。该方法可以简单易行地对非人动物进行在体基因操作。但在诱导基因突变方面，由于整合型慢病毒偏好插入于基因组中具有转录活性的区域，故无法做到完全地介导覆盖全基因组地随机插入(Schroder等，2002，Cell110：521-529；Mitchell等，2004PLoSbiology2；e234)。
发明内容
为了能高效地制备携带随机插入突变的基因突变动物，本发明提供了一种携带piggyBac转座子系统的非整合型慢病毒复合载体及其制备方法，以及应用该复合载体在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。
转座子插入突变技术是另一种在实验动物中引入插入突变的方法。piggyBac转座子(PB)系统是现有在哺乳动物中诱导插入突变效率最高的转座子系统(Ding等，2005，Cell122：473-483；Wang等，2008，Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：9290-9295)。piggyBac转座子早先于粉斑夜蛾(Trichoplusiani)的基因组中被发现，大小为2472bp，两端包含反向末端重复序列(ITR)，中间包含编码594个氨基酸的转座酶。piggyBac转座子类属于DNA转座子，通过剪切和粘贴机制可以由位于外源DNA或内源基因组的起始位点切离，并插入基因组中的另一位点。piggyBac转座子插入靶位点的序列为四核苷酸的TTAA。piggyBac转座子在切离TTAA时一般不会改变原位点及原位点的附近序列，即所谓无痕转座。piggyBac转座子在插入基因组时，不存在位点偏好性，随机整合入基因组，因此是介导覆盖全基因组地随机插入突变优选的遗传工具(Cary等，1989，Virology172：156-169；Fraser等，1995，Virology211：397-407；Fraser等，1996，InsectMolecularBiology5：141-151)。但是作为一种非病毒载体，生物技术领域至今仍缺乏一种有效利用piggyBac转座子系统在体递送制备基因突变动物的方法。
本发明在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变时利用了一种携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体，该复合载体中包含的元件从5’端到3’端分别是：
自身失活型慢病毒5’长末端重复序列(5’LTR)，病毒包装所必须的中央聚嘌呤区cPPT顺式元件序列，piggyBac转座子左臂(PBL)，强效启动子，报告基因，聚腺苷酸(polyA)转录终止信号，piggyBac转座子右臂(PBR)，土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件WPRE，自身失活型慢病毒3’长末端重复序列(3’LTR)。
在一优选例中，所述的强效启动子为鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG。
在另一优选例中，所述的报告基因为EGFP绿色荧光蛋白。
在另一优选例中，所述的聚腺苷酸转录终止信号为兔β-球蛋白polyA。
本发明在制备基因突变动物时所采用的技术方案是：
1)将piggyBac转座子-慢病毒复合载体质粒，Δ8.9-D64N/D116N非整合型包装结构质粒和VSV-G包膜质粒通过脂质体转染同时导入293T细胞中，并通过上清高速离心浓缩获得病毒；
2)将携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒和携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒同时直接注射入处于发育期的雄性非人动物睾丸内，感染体内精原干细胞；
3)注射后的雄性动物在成年后与野生型雌性动物交配获得基因组中携带一个或多个转座子随机插入突变的非人基因突变动物。
本发明的有益效果是，提供了一种简单易行地对非人动物进行在体基因操作的方法。该方法可以高效地制备携带随机插入突变的基因突变动物。通过本发明制备的基因突变动物可用于动物表型分析，基因功能研究，人类遗传疾病模拟，新药筛选和新药靶发现。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1是本发明piggyBac转座子-非整合型慢病毒复合载体及其在精原干细胞基因组中引入随机插入突变的设计图。携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体LV-PB[GFP]从5’端到3’端包含：5’LTR：自身失活型慢病毒5’长末端重复序列；cPPT：中央聚嘌呤区顺式元件；PBL：piggyBac转座子左臂；CAG；鸡β-肌动蛋白复合启动子；EGFP：绿荧光蛋白；PA：兔β-球蛋白polyA；PBR：piggyBac转座子右臂；WPRE：土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件；3’LTR：自身失活型慢病毒3’长末端重复序列。携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒复合载体LV-PBase从5’端到3’端包含：5’LTR，cPPT，CAG，piggyBac转座酶(PBase)，PA，WPRE和3’LTR。当LV-PB[GFP]和LV-PBase病毒颗粒同时感染精原干细胞，病毒基因组进入细胞核。其中，PBase被转录并在细胞质中被表达。PBase转座酶入核后介导piggyBac转座子转座，使其能随机插入精原干细胞基因组内。
图2是本发明piggyBac转座子一慢病毒复合载体病毒制备方法的一种技术方案。将携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体LV-PB[GFP]质粒(或携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒复合载体LV-PBase质粒)，Δ8.9-D64N/D116N非整合型包装结构质粒和VSV-G包膜质粒通过脂质体转染同时导入293T细胞中，并通过上清高速离心浓缩获得LV-PB[GFP]病毒(或LV-PBase病毒)。
图3是本发明应用于制备基因突变动物的一种技术方案。将携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒LV-PB[GFP]和携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒LV-PBase同时直接注射入处于发育期的受体公鼠睾丸内，感染体内精原干细胞。被注射后的公鼠在成年后与野生型母鼠交配获得基因组中携带piggyBac转座子随机插入突变的基因突变小鼠。
图4是本发明高效制备基因突变小鼠的一个实例。在蓝色光照射下，基因突变小鼠体表产生绿色荧光。该荧光可在荧光解剖镜下观察到。图中所示的幼仔分别携带插入于不同位点的piggyBac转座子，由于位置效应，个体呈不同亮度的绿色荧光。
具体实施方式
本发明提供了一种携带piggyBac转座子系统的非整合型慢病毒复合载体及其制备方法，以及应用该复合载体在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。本发明可用于高效地制备非人基因突变动物。
下面结合具体实施例，进一步阐明制备和应用本发明的关键步骤。
1.非整合型慢病毒载体。
慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒，以人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)为代表。基于I型人类免疫缺陷型病毒(HIV-1)的慢病毒载体目前已发展到第四代。第一代是复制缺陷型HIV-1慢病毒载体仅能感染CD4T细胞，并存在产生野生型HIV的危险。第二代慢病毒载体采用了其它病毒的包膜蛋白代替HIV的包膜蛋白，构建成假型慢病毒载体(pseudotypedlentivirusvector)。该载体的包膜蛋白为水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)G蛋白，使病毒颗粒非特异性地结合于靶细胞的膜磷脂，而不需要特异性膜受体。第三代慢病毒载体删除了与病毒包装和感染无关的序列，这些序列通常与病毒复制和致病性有关。第四代慢病毒载体为自灭活性载体。该类载体3’LTR中删除了所有参与病毒复制的非必需序列，使其经包装产生的子代重组病毒完全失去了复制能力，因而更安全。慢病毒能感染各类哺乳动物细胞并整合到靶细胞基因组中。慢病毒载体作为转基因递送工具被广泛使用。然而，由于慢病毒偏好插入于基因组中具有转录活性的区域，故无法做到完全地介导覆盖全基因组地随机插入(陈金中和薛京伦编著的《载体学与基因操作》)。
本发明制备方法的一种实施例中，引入插入突变的载体中包含了一种非整合型慢病毒载体。上述载体制备过程中使用了慢病毒包装结构质粒Δ8.9-D64N/D116N。上述质粒中，由pol基因编码的整合酶氨基酸序列中含有D45N突变。上述突变使得整合酶失去功能，从而导致该慢病毒包装结构质粒只能介导病毒包装无法介导慢病毒整合入靶细胞基因组(Nakajima等，2001，J.Viol.75：7944-7955)。
上面所述实施例中制备携带D45N突变整合酶的慢病毒包装结构质粒Δ8.9-D64N/D116N的具体步骤是：利用人工合成寡核苷酸D64NF(SEQIDNo.1)、D64NR(SEQIDNo.2)、D116NF(SEQIDNo.3)和D116NR(SEQIDNo.4)，以质粒Δ8.9(Lois等，2001，Science295：868-872)为模版，用定向突变试剂盒(购自Stratagene)进行定向突变，具体的实验条件为厂商所建议的条件，从而获得Δ8.9-D64N/D116N。
2.携带转座子系统的非整合型慢病毒。
本发明在制备携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体质粒和携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒复合载体质粒的过程中，所涉及的质粒抽提，质粒转化，大肠杆菌培养，酶切，Klenow酶末端补平，连接为本领域人员所熟知的实验。常规实验条件可参照M.R.格林和J.萨姆布鲁克编著的《分子克隆实验指南》第四版。
在制备携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体质粒的一种实施例中，构建优选例LV-PB[GFP]质粒的具体步骤是：1)piggyBac转座子左臂和右臂(PBL和PBR)由PB[Link]质粒(Ding等，2005，Cell122：473-483)通过SalI和NotI酶切，末端补平后，装入经PacI和EcoRI酶切补平后的FUGW载体质粒(Lois等，2001，Science295：868-872)，获得LV-PB[Link]质粒。2)鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG、EGFP绿色荧光蛋白和兔β-球蛋白polyA由pCAG-EGFP(购自Addgene)质粒通过SalI和HindlII酶切，末端补平后，装入经PmeI酶切后的LV-PB[Link]质粒，获得LV-PB[GFP]载体质粒。
在制备携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒复合载体质粒的一种实施例中，构建优选例LV-PBase质粒的具体步骤是：鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG、piggyBac转座酶和兔β-球蛋白polyA由Act-PBase(Ding等，2005，Cell122：473-483)质粒通过SalI和HindIII酶切，末端补平后，装入PacI和EcoRI酶切补平后的FUGW载体质粒(Lois等，2001，Science295：868-872)。
在制备携带转座子系统的非整合型慢病毒的一种实施例中，具体的步骤是：1)将4ugLV-PB[GFP]或LV-PBase质粒，4ugΔ8.9-D64N/D116N质粒和2ugVSV-G质粒(Lois等，2001，Science295：868-872)共同通过FugeneHD转染试剂(购自Promega)转染导入培养有单层293T细胞的10cm培养皿内，转染时细胞密度在60％-70％，具体的实验条件为转染试剂厂商所建议的条件。2)72hr后收集上清，4℃，35000×g离心45分钟，随后重悬LV-PB[GFP]或LV-PBase病毒于Dulbecco’sPBS缓冲液(购自Invitrogen)中使得最终得到的病毒滴度不少于1×106TU/mL。
上面说述LV-PB[GFP]病毒滴度的测定方法是：1)将293T细胞消化计数后稀释至1×105/mL，加入96孔板，100uL/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。2)准备10个1.5mLEppendorf管，每管加入90uL培养液，往第一个管中加入10ul病毒原液，混匀后，吸取10uL加入第二个管混匀。依此类推，做10个稀释度。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。次日，在每个孔再加入100uL培养液，利于细胞的生长。3)48hr后在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度(TU/ml)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(uL)。在相同条件下包装得到的LV-PBase病毒的病毒滴度默认为与LV-PB[GFP]病毒相近。
在制备携带转座子系统的非整合型慢病毒的另一些实施例中，piggyBac转座子-慢病毒复合载体可携带的核酸片段包括但不限于启动子，调控元件，报告基因，基因编码序列，聚腺苷酸转录终止信号，基因敲低构建，基因捕获构建。
3.体内精原干细胞感染。
本发明在体内精原干细胞引入插入突变的一种实施例中，携带转座子系统的非整合型慢病毒被用于感染小鼠体内精原干细胞，具体的步骤是：用80mg/kgketamine和10mg/kgxylazine麻醉28天龄的受体公鼠，手术打开腹股沟处，暴露睾丸。用30号针头和Hamilton注射器将10-20uLLV-PBase和LV-PB[GFP]混合病毒悬浮液注射入一侧睾丸，并将另一侧睾丸切除。随后进行手术缝合。
手术30天后，将受体公鼠与同种野生型母鼠交配，在子代中得到携带插入于不同位点的piggyBac转座子的基因突变杂合子小鼠(如图4所示)。杂合子小鼠通过同品系交配可获得纯合子基因突变小鼠。
本发明在体内精原干细胞引入插入突变的另一些实施例中，携带转座子系统的非整合型慢病毒被用于感染其他非人动物的体内精原干细胞，其中所述的非人动物包括但不限于大鼠，猪，牛，羊和猴。
4.利用接头PCR鉴定基因组内piggyBac转座子插入位点。
反向PCR和接头PCR是鉴定插入突变所在位点的常用方法，其中接头PCR的灵敏度更高(Hui等，1998，CellularandMolecularLifeScience54：1403-1411)。本发明实施的优选例中，鉴定转座子在基因组中插入位点的方式是接头PCR，具体的步骤是：小鼠尾尖提取的DNA经Sau3AI限制性内切酶酶切后得到长度不同的DNA片段，随后通过T4连接酶在这些片段两端同时加上接头。这里所述的接头是由LinkerA(SEQIDNo.5)和LinkerB(SEQIDNo.6)寡核苷酸经退火获得的双链DNA。连有接头的基因组DNA文库经piggyBac转座子臂特异引物(左臂：PBLlink(SEQIDNo.7)；右臂：PBRlink(SEQIDNo.8))和接头特异引物(LinkAmp(SEQIDNo.9))用Taq聚合酶PCR特异扩增插入位点周边基因组序列。PCR扩增产物随后连接装入T载体(购自Promega)，并转化至大肠杆菌中进行进一步扩增，以得到足够的DNA用于测序获得插入位点周边基因组序列。测序得到的序列与USCSGenomeBrowser或者NCBIGenebank中的小鼠基因组公开数据库中的序列进行比对，从而确定转座子的插入位点。

Claims (9)

1.一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法，其特征是可用于制备基因组中携带一个或多个转座子随机插入突变的非人基因突变动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是将携带转座子的非整合型慢病毒复合载体和携带转座酶的非整合型慢病毒复合载体同时直接注射入处于发育期的雄性非人动物睾丸内，感染体内精原干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的非整合型慢病毒复合载体，其特征是其慢病毒整合酶氨基酸序列中包含D64N/D116N突变，使其无法整合入靶细胞基因组内。
4.根据权利要求2和3所述的方法，其中所述的非整合型慢病毒复合载体，其特征是由转座子-慢病毒复合载体质粒，Δ8.9-D64N/D116N非整合性包装结构质粒和VSV-G包膜质粒共转染293T细胞，并通过上清高速离心浓缩获得。
5.根据权利要求1和2所述的方法，其中所述的转座子为piggyBac转座子，其特征是可以由非整合型慢病毒导入体内精原干细胞内并发生转座从而引入随机插入突变。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述的转座酶为piggyBac转座酶，其特征是可以由非整合型慢病毒导入体内精原干细胞内并介导piggyBac转座子发生转座。
7.根据权利要求1，2和5所述的方法，其中所述的转座子中可携带的核酸片段包括但不限于启动子，调控元件，报告基因，基因编码序列，聚腺苷酸转录终止信号，基因敲低构建，基因捕获构建。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的非人基因突变动物可由被携带转座子的非整合型慢病毒复合载体和携带转座酶的非整合型慢病毒复合载体同时注射后的雄性动物在成年后与野生型雌性动物交配获得。
9.根据权利要求1和2所述的方法，其中所述的非人动物包括但不限于小鼠，大鼠，猪，牛，羊和猴。
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