具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明为一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法,实施如下:
1)剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体;
2)将需要检测病毒的部分基因组克隆至假病毒载体;
3)将慢病毒的整合酶基因进行突变,使得慢病毒的整合能力降低或丧失整合性;
4)在293T细胞中进行假病毒的包装;
5)对制备的假病毒进行拷贝数测定及整合效率测定。
实施例一:构建剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体
在现有的慢病毒载体FV011(复百澳公司自有载体,如图8所示),去除启动子和外源表达框:
步骤S011:将慢病毒载体在37℃水浴条件下酶切2小时,酶切体系具体为:
步骤S012:琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物:用1%琼脂糖,120V恒压电泳30~40分钟,在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化,上样信息:样品8-9:FV-011-PacI-NheI;电泳结果如图1所示。
实施例二:将需要检测病毒的部分基因组克隆至假病毒载体;
步骤S021:通过全基因合成的方式获得冠状病毒的部分序列,合成至PUC57载体,记为PUC57-ORF 1a/bEN;合成序5’端含有PAC I酶切位点,3’端含有Nhe I酶切位点,具体序列信息如下:
TAATTAAATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAGCTAGC;
进一步地,ORF1 A/B序列如下:
ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACAT;
E基因序列如下:
ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA;
N基因序列如下:
ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA;
步骤S022:将合成完毕的ORF1 A/B,E基因和N基因通过酶切的方式获得待插入慢病毒载体的片段;酶切的条件为:37℃水浴下酶切2小时,酶切体系为:
步骤S023:琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物:用1%琼脂糖,120V恒压电泳30~40分钟,在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化;
步骤S024:将回收的载体产物和酶切胶回产物连接,连接条件为室温下1小时;具体涉及的试剂及其体积分别为:
步骤S025:连接产物转化,连接产物转化的方法为:
步骤S0251:取50μl感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司公司)放在冰上融化,取5μl连接产物和感受态细胞混匀;
步骤S0252:冰浴30分钟,42℃水浴热激90秒,继续冰浴2分钟;
步骤S0253:在混合物中加入1mL无抗性SOB液体培养基,摇床37℃,在250rpm/min下摇菌1小时;
步骤S0254:摇菌结束后,在4000rpm下离心2分钟;
步骤S0255:去除部分上清后留约200μl混匀沉淀,涂于LB培养平板上,将板倒扣,在37℃细菌培养箱中培养12~16小时,得重组质粒,质粒电泳结果如图2所示。
实施例三:慢病毒包装辅助质粒的整合酶基因进行突变,使慢病毒的整合能力降低或丧失整合性:
突变前:
tttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctaGattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacataaaagtagtgccaAGaAGaAaAgcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggat;
突变后:
tttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctaAattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacataaaagtagtgccaGCaGCaCaTgcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggat;
整合酶基因的64位氨基酸Asp、116位氨基酸Asp、262位-264位氨基酸Arg,Arg,Lys三个氨基酸突变将会降低慢病毒的整合效率,提高其安全性。介于此,进行了组合突变设计,64位氨基酸Asp突变成Asn,262位-264位氨基酸Arg,Arg,Lys突变成Ala,Ala,His;进行突变的具体方法为:
步骤SS031:设计突变引物:以慢病毒包装辅助质粒psPAX2为模板进行点突变,先进行64位氨基酸的碱基突变,将64位氨基酸Asp突变成Asn:
F:gcccaggaatatggcagctaAattgtacacatttagaaggaaaagttatc
R:tccttctaaatgtgtacaatTtagctgccatattcctgggctac
再在此基础上再进行262位-264位氨基酸的突变,将262位-264位氨基酸Arg,Arg,Lys突变成Ala,Ala,His:
F:gtgacataaaagtagtgccaGCAGCACATgcaaagatcatcagg
R:taatccctgatgatctttgcATGTGCTGCtggcactacttttatg;
步骤SS032:使用点突变试剂盒进行点突变实验,试剂盒使用:诺唯赞,C215-01,具体方法如下:
步骤SS0321:将试剂盒中的除了Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase外的各组分按要求充分解冻;
步骤SS0322:配制反应体系如下:
步骤SS0323:PCR扩增反应程序如下:
步骤SS0324:PCR扩增产物加入1μl DpnI酶消化,去除模板DNA;
步骤SS0325:消化后的产物进行环化重组,37℃水浴反应30分钟,待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却5分钟,反应体系如下:
步骤SS033:反应产物转化、涂板、克隆鉴定,具体方法为:
步骤SS0331:取20μl冷却反应液,加入到200μl感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30分钟;
步骤SS0332:42℃热激90秒,再冰水浴孵育2分钟;
步骤SS0333:加入900μl SOB培养基,37℃孵育10分钟充分复苏;
步骤SS0334:37℃摇菌45分钟,取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上;
步骤SS0335:将平板倒置,于37℃中培养12~16小时,挑取克隆测序鉴定,正取质粒进行质粒扩增
实施例四:在293T细胞中进行假病毒的包装,获得假病毒颗粒,具体方法为:
步骤SS041:转染前,显微镜下观察293T细胞的状态,确定细胞状态良好、密度达90%左右,无污染;
步骤SS042:每盘细胞更换10ml含2%FBS的DMEM培养基;
步骤SS043:配制转染体系如下:
转染试剂1X PEI 30μl/盘,混合加入到含500μl OMEM的EP管中,室温静置15min;
步骤SS044:将转染体系分别缓慢滴加至细胞培养皿中,保持培养皿水平,晃动培养皿,使得转染复合物均匀分布于细胞表面;
步骤SS045:转染8小时后,每盘细胞更换10ml含2%FBS的DMEM培养基;
步骤SS046:转染48小时后,收集细胞上清液,该上清液中已经含对应的假病毒颗粒。
实施例五:对制备假病毒的产毒量和整合效率检测;
1、病毒产毒量检测:
①使用病毒RNA提取试剂盒(Beaverbio,Cat.NO.70406)进行病毒上清液的中RNA的提取,提取实验按照实验说明书执行;
②病毒RNA提取后使用一步法QPCR检测试剂盒进行QPCR检测,该试剂盒可以同时完成RT-PCR将RNA反转成cDNA和QPCR实时定量检测;
③所构建的假病毒序列和慢病毒转录调控序列WPRE共一条核酸RNA,通过测量WPRE的含量计算拷贝数。
④WPRE的qPCR引物序列如下:F:5’-GTCCTTTCCATGGCTGCTC-3’,R:5’-CCGAAGGGACGTAGCAGA-3’;
⑤通过自行构建WPRE的标准质粒制备拷贝数标准品,浓度梯度如下:107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl;
⑥QPCR反应体系配制如下:
病毒产毒量检测实验结果如下表所示:
通过标准品比对计算所产生的病毒量,实验组:1.19×107copy/mL对照组:8.32×106copy/mL,即改造后的载体可以较为稳定的产生假病毒颗粒。
2、病毒整合效率检测:
①实验前24H,接种293T细胞于24孔板中,约1*105个/孔,500μl/孔,于37℃,5%CO2条件下培养;
②实验前在显微镜下,对实验用细胞进行观察,确定细胞饱满、分部均匀、无污染后再进行后续实验;
③按照MOI=5分别取实验组和对照组的病毒液感染24孔板中293T细胞,每组三个复孔;
④72H后显微镜观察感染后的细胞荧光比例,并提取基因进行QPCR检测整合病毒量,使用的引物序列为病毒包装元件WPRE;
⑤WPRE的qPCR引物序列如下:F:5’-GTCCTTTCCATGGCTGCTC-3’,R:5’-CCGAAGGGACGTAGCAGA-3’;
⑥通过自行构建WPRE的标准质粒制备拷贝数标准品,浓度梯度如下:107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl;
⑦QPCR反应体系配制如下:
病毒感染细胞检测实验结果,如图3所示。
病毒整合比例检测数据——QPCR检测基因组如下:
实验结果,两组病毒分别以同样的MOI值感染293T细胞,通过荧光比例和强弱显示,实验组(非整合假病毒组)数量和荧光强度略低于对照组,通过对比感染后的荧光比例。
通过分析两组细胞的基因组中所整合病毒基因数量分析,实验组(非整合假病毒组)的整合量为:3.56×104copy/mL,对照组的整合量为:1.48×106copy/mL,和对照组相比实验组(非整合假病毒组)的整合率为2.412%,实验组(非整合假病毒组)与对照组相对整合率柱状图如图4所示,实验组(非整合假病毒组)的基因整合效率显著低于对照组。
2019新冠病毒核酸检测验证:
试剂盒抽提假病毒total RNA:利用苏州海狸生物医学工程有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒抽提假病毒total RNA,利用复百澳公司提供的DNase-DEPC-H2O洗脱并溶解total RNA;
荧光定量法检测目的基因含量:利用南京诺维赞生物科技有限公司生产的
ⅡU+One Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒直接将抽提的病毒核酸为模板,配制QPCR反应体系,同时使用复百澳公司生产的WPRE标准品作为病毒滴度检测的标准品,同时上机检测,测定样品和标准品的CP值;
QPCR检测的引物和探针信息如下:
QPCR检测数据结果如下:
其中,QPCR检测数据扩增曲线如图5-7所示。
一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法,可以用于2019新型冠状病毒的假病毒构建,也可以用于SARS-COV(重症急性呼吸综合征)、MERS-COV(中东呼吸综合症)、流感病毒等假病毒的构建,制备的假病毒的核酸序列,应用于核酸检测的标准质控品的制备,核酸序列包括且不限于ORF 1,E基因和N基因,不限于的序列包括S基因、E基因、M基因;不限于的病毒包括SRAS非典型肺炎病毒、MERS中东呼吸综合症、流感病毒等其RNA类病毒,制备冠状病毒核酸序列在核酸检测的标准质控品的方法中的应用,应用于核酸检测全流程质控。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节,也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然,根据本说明书的内容,可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例,是为了更好地解释本发明的原理和实际应用,从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 复百澳(苏州)生物科技有限公司
<120> 一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法
<130> 20210401
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2002
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
taattaaatc gtgttgtctg tactgccgtt gccacataga tcatccaaat cctaaaggat 60
tttgtgactt aaaaggtaag tatgtacaaa tacctacaac ttgtgctaat gaccctgtgg 120
gttttacact taaaaacaca gtctgtaccg tctgcggtat gtggaaaggt tatggctgta 180
gttgtgatca actccgcgaa cccatgcttc agtcagctga tgcacaatcg tttttaaacg 240
ggtttgcggt gtaagtgcag cccgtcttac accgtgcggc acaggcacta gtactgatgt 300
cgtatacagg gcttttgaca tctacaatga taaagtagct ggttttgcta aattcctaaa 360
aactaattgt tgtcgcttcc aagaaaagga cgaagatgac aatttaattg attcttactt 420
tgtagttaag agacacactt tctctaacta ccaacatgaa gaaacaattt ataatttact 480
taaggattgt ccagctgttg ctaaacatat gtactcattc gtttcggaag agacaggtac 540
gttaatagtt aatagcgtac ttctttttct tgctttcgtg gtattcttgc tagttacact 600
agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc gtactgctgc aatattgtta acgtgagtct 660
tgtaaaacct tctttttacg tttactctcg tgttaaaaat ctgaattctt ctagagttcc 720
tgatcttctg gtctaaatgt ctgataatgg accccaaaat cagcgaaatg caccccgcat 780
tacgtttggt ggaccctcag attcaactgg cagtaaccag aatggagaac gcagtggggc 840
gcgatcaaaa caacgtcggc cccaaggttt acccaataat actgcgtctt ggttcaccgc 900
tctcactcaa catggcaagg aagaccttaa attccctcga ggacaaggcg ttccaattaa 960
caccaatagc agtccagatg accaaattgg ctactaccga agagctacca gacgaattcg 1020
tggtggtgac ggtaaaatga aagatctcag tccaagatgg tatttctact acctaggaac 1080
tgggccagaa gctggacttc cctatggtgc taacaaagac ggcatcatat gggttgcaac 1140
tgagggagcc ttgaatacac caaaagatca cattggcacc cgcaatcctg ctaacaatgc 1200
tgcaatcgtg ctacaacttc ctcaaggaac aacattgcca aaaggcttct acgcagaagg 1260
gagcagaggc ggcagtcaag cctcttctcg ttcctcatca cgtagtcgca acagttcaag 1320
aaattcaact ccaggcagca gtaggggaac ttctcctgct agaatggctg gcaatggcgg 1380
tgatgctgct cttgctttgc tgctgcttga cagattgaac cagcttgaga gcaaaatgtc 1440
tggtaaaggc caacaacaac aaggccaaac tgtcactaag aaatctgctg ctgaggcttc 1500
taagaagcct cggcaaaaac gtactgccac taaagcatac aatgtaacac aagctttcgg 1560
cagacgtggt ccagaacaaa cccaaggaaa ttttggggac caggaactaa tcagacaagg 1620
aactgattac aaacattggc cgcaaattgc acaatttgcc cccagcgctt cagcgttctt 1680
cggaatgtcg cgcattggca tggaagtcac accttcggga acgtggttga cctacacagg 1740
tgccatcaaa ttggatgaca aagatccaaa tttcaaagat caagtcattt tgctgaataa 1800
gcatattgac gcatacaaaa cattcccacc aacagagcct aaaaaggaca aaaagaagaa 1860
ggctgatgaa actcaagcct taccgcagag acagaagaaa cagcaaactg tgactcttct 1920
tcctgctgca gatttggatg atttctccaa acaattgcaa caatccatga gcagtgctga 1980
ctcaactcag gcctaagcta gc 2002
<210> 2
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atcgtgttgt ctgtactgcc gttgccacat agatcatcca aatcctaaag gattttgtga 60
cttaaaaggt aagtatgtac aaatacctac aacttgtgct aatgaccctg tgggttttac 120
acttaaaaac acagtctgta ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga 180
tcaactccgc gaacccatgc ttcagtcagc tgatgcacaa tcgtttttaa acgggtttgc 240
ggtgtaagtg cagcccgtct tacaccgtgc ggcacaggca ctagtactga tgtcgtatac 300
agggcttttg acatctacaa tgataaagta gctggttttg ctaaattcct aaaaactaat 360
tgttgtcgct tccaagaaaa ggacgaagat gacaatttaa ttgattctta ctttgtagtt 420
aagagacaca ctttctctaa ctaccaacat gaagaaacaa tttataattt acttaaggat 480
tgtccagctg ttgctaaaca t 501
<210> 3
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60
cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120
gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180
cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228
<210> 4
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
<210> 5
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60
gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120
gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180
tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240
agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300
ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360
ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420
attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480
attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540
ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600
gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660
caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720
ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780
ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840
gtggcaagta gacaggatga ggat 864
<210> 6
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60
gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120
gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180
tggcagctaa attgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240
agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300
ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360
ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420
attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480
attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540
ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600
gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660
caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720
ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780
ccagcagcac atgcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840
gtggcaagta gacaggatga ggat 864
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
gcccaggaat atggcagcta aattgtacac atttagaagg aaaagttatc 50
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
tccttctaaa tgtgtacaat ttagctgcca tattcctggg ctac 44
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gtgacataaa agtagtgcca gcagcacatg caaagatcat cagg 44
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
taatccctga tgatctttgc atgtgctgct ggcactactt ttatg 45
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
gtcctttcca tggctgctc 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
ccgaagggac gtagcaga 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
acactagcca tccttactgc gcttcg 26