CN112553172B

CN112553172B - 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN112553172B
Application number: CN202110188314.9A
Authority: CN
Inventors: 路娜; 李德彬; 葛泰根; 崔利兰; 张雅婷; 张杭; 丁昆雁
Original assignee: Suzhou Inshore Protein Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Inshore Protein Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2041-02-19
Also published as: CN112553172A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种COVID‑19假病毒及其制备方法和用途本发明，所述COVID‑19假病毒由外壳蛋白质粒与辅助质粒经病毒包装而成，所述外壳蛋白质粒包括表达SARS‑CoV‑2 S蛋白的质粒、表达SARS‑CoV‑2 M蛋白的质粒和表达SARS‑CoV‑2 E蛋白的质粒。本发明的COVID‑19假病毒采用三质粒系统包装，以S/M/E蛋白替代表达VSV‑G蛋白，比仅含有S蛋白的假病毒感染能力更强、灵敏度更高。而且，COVID‑19假病毒携带两种荧光报告基团，不同的荧光报告基团可应用于不同的场景，使得COVID‑19假病毒应用时更简便。

Description

一种COVID-19假病毒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种COVID-19假病毒及其制备方法和用途。

背景技术

COVID-19是一种新型的冠状病毒SARS-CoV-2引起的疾病，SARS-CoV-2具有极强的传播能力。SARS-CoV-2是一种有包膜的单链RNA病毒，RNA长度达到近30kb，N蛋白（Nucleocapsid）外壳的包膜中含有S（Spike protein，刺突蛋白）、M（Membrane protein，膜蛋白）和E（Envelope protein，包膜蛋白）三种蛋白。目前发现的最主要的感染途径是病毒的S蛋白的RBD（Receptor Binding Domain，受体结合区）与细胞膜表面的ACE2蛋白结合，导致细胞膜与病毒包膜融合，最终病毒感染宿主细胞。

药物治疗和疫苗预防两种途径降低新型冠状病毒的危害。目前已经有超过5款疫苗三期临床结束，已经上市或将要上市，还有更多的疫苗处在临床阶段，中和抗体的新药研究也已经进入临床阶段。而如何评价药物和疫苗的作用，成为接下来研究的重点。

疫苗的评价除了临床实验外，如何更好的跟踪接种后中和抗体的产生，是目前亟待解决的问题。疫苗接种后的体外评价主要有三种方式，第一种是对抗真病毒的感染，第二种是拮抗ACE2与S蛋白（特别是RBD）的结合，第三种是对抗假病毒的感染。第一种方式是最接近真实的，但是对于实验环境有较高的要求，无法作为普及性检测方法；第二种只是评价了RBD与ACE2的结合抑制，对于病毒感染过程中的拮抗无法检测到；而第三种用假病毒的方式克服了前两种的弊端，因为不是真病毒，不具备感染能力，普通实验室即可操作，模拟了病毒感染宿主细胞的过程，比阻断蛋白之间的结合更真实。

目前大多数实验室做的假病毒外壳蛋白主要选择S蛋白，S蛋白和ACE2结合是感染的必要条件，但是现有技术中忽略了M蛋白和E蛋白的辅助作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种COVID-19假病毒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种COVID-19假病毒，所述COVID-19假病毒由外壳蛋白质粒与辅助质粒经病毒包装而成，所述外壳蛋白质粒包括表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒。

本发明还提供所述的COVID-19假病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将外壳蛋白质粒与辅助质粒混合，转染宿主细胞，转染后收集的细胞上清中即含有假病毒，其中所述外壳蛋白质粒包括表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒。

本发明还提供所述COVID-19假病毒在筛选或评价COVID-19预防、治疗药物中的用途。

本发明还提供用于筛选或评价COVID-19预防、治疗药物的组合物，所述组合物的有效物质包括所述的COVID-19假病毒。

本发明还提供一种用于体外检测COVID-19预防、治疗药物疗效的方法，所述方法包括以下步骤：将所述COVID-19假病毒与COVID-19的靶标样本、预防或治疗药物共同孵育，孵育结束后检测发光强度。

如上所述，本发明的COVID-19假病毒及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本发明的COVID-19假病毒采用三质粒系统包装，以S/M/E蛋白替代表达VSV-G蛋白，比仅含有S蛋白的假病毒感染能力更强、灵敏度更高。而且，COVID-19假病毒携带两种荧光报告基团，不同的荧光报告基团可应用于不同的场景，使得COVID-19假病毒应用时更简便。

附图说明

图1显示为本发明的S/M/E蛋白表达检测图。

图2显示为本发明的SME假病毒感染ACE2阳性和阴性细胞荧光对比图，左图中白色细胞为绿色荧光阳性细胞。

图3显示为本发明的SME假病毒感染ACE2+细胞流式结果。

图4显示为本发明的SME和S假病毒感染能力比较。

图5显示为本发明的SME和S假病毒在评价中和抗体时的比较。

图6 显示为本发明的中和抗体DA034抑制COVID-19假病毒感染。

图7 显示为本发明的用假病毒评价疫苗汇总结果。

具体实施方式

本发明提供一种COVID-19假病毒，所述COVID-19假病毒由外壳蛋白质粒与辅助质粒经病毒包装而成，所述外壳蛋白质粒包括表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒。

所述假病毒是指非病毒RNA与病毒的蛋白质外壳包裹成的微生物颗粒。

所述COVID-19假病毒中SARS-CoV-2 S蛋白、SARS-CoV-2 M蛋白或SARS-CoV-2 E蛋白为完整的蛋白。

所述S蛋白、M蛋白或E蛋白选自野生型或突变型。

在一种实施方式中，S蛋白选自D614G突变的蛋白，突变后的S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述M蛋白或E蛋白选自野生型或突变型。

在一种实施方式中，所述M蛋白和E蛋白分别融合有不同标签。所述标签例如为有HIS标签、Flag标签。

所述辅助质粒为编码gag、pol、Rev蛋白的一个或者多个核苷酸序列以及其它必需的病毒包装组件核苷酸序列。

所述荧光报告质粒为能表达荧光蛋白或荧光素酶（luciferase）的质粒。

在一种实施方式中，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白（GFP或EGFP）、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白中的一种或几种。

COVID-19假病毒因由荧光报告质粒包装而成，因此COVID-19假病毒能表达荧光报告基团。

在一种实施方式中，所述荧光报告质粒中包括用于表达EGFP和luciferase的基因序列，二者通过2A序列连接。荧光报告基团的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

外壳蛋白质粒以及荧光报告质粒的载体可以选自现有技术中常用的慢病毒载体。所述慢病毒载体可以选自：pcDNA3.3、pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV -tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLV、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1 -puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC- TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro- IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6- GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ、pLV-NEO、pLV-puro中的任一。

本发明的COVID-19假病毒用SARS-CoV-2 S/M/E蛋白代替原先慢病毒包膜的VSVG，同时含有GFP-Luciferase双报告基团；COVID-19假病毒通过各质粒按照一定比例转染293T细胞后制备得到。COVID-19假病毒感染ACE2阳性的细胞，被感染的细胞会发出绿色荧光，用荧光素酶底物检测，可以检测到化学发光信号，通过荧光或化学发光的强度反应病毒的感染能力。用中和抗体和已经接种新冠疫苗的志愿者血清阻断病毒的感染，通过荧光或化学发光的减弱程度，反应抗体阻断病毒感染的能力。

本发明还提供所述假病毒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将外壳蛋白质粒、荧光报告质粒与辅助质粒混合，转染宿主细胞，转染后收集的细胞上清中即含有假病毒，其中所述外壳蛋白质粒包括表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒。

转染前，先将表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒混合，再将上述混合的质粒与荧光报告质粒、辅助质粒混合。较佳的，表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒按照质量比为5:4:1混合。

所述宿主细胞可以为生产慢病毒的细胞，例如可以为293T细胞。

在一种实施方式中，转染48小时后再收集细胞上清。

在一种实施方式中，还可以将收集的细胞上清进行浓缩、纯化。

本发明还提供所述假病毒在筛选或评价COVID-19预防、治疗药物中的用途。

所述预防药物例如为疫苗。

药物评价包括药理毒理学评价、安全性评价等。

本发明还提供一种用于筛选或评价COVID-19预防、治疗药物的组合物，所述组合物的有效物质包括所述假病毒。

在一种实施方式中，所述组合物中还可以包括溶剂等其他物质。

所述靶标样本来源于各种分离或获至对象的生物样本。具体的，所述靶标样本包括表达COVID-19靶标以下物质：细胞、组织、血液或血液制品、羊水、脐带血、绒毛、脑脊液、脊髓液中的一种或几种。所述COVID-19靶标例如为ACE蛋白。

具体的，所述预防或治疗药物选自COVID-19中和抗体、COVID-19疫苗等。

具体的，孵育结束后，检测COVID-19的靶标样本的发光强度，若发光强度较高则表明假病毒与COVID-19的靶标样本结合能力较强，预防或治疗药物的疗效较差；若发光强度较低，则表明假病毒与COVID-19的靶标样本结合能力较差，预防或治疗药物的疗效较强。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1假病毒相关组分的构建策略和序列信息

将S蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）、M蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）和E蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示）分别构建到pcDNA3.3载体.TOPO（购自Invitrogen，K830001）上分别获得pcDNA-S、pcDNA-M和pcDNA-E质粒，S蛋白包含D614G突变，其余位点参考NCBI报道序列，突变后的S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，M蛋白和E蛋白参考NCBI报道序列（M蛋白Gene ID: 43740571，E蛋白Gene ID: 43740570），M蛋白和E蛋白在C端分别含有HIS和Flag标签。将EGFP和luciferase野生型序列（参考NCBI）用2Asequence串联后构建到慢病毒载体pLV（购自英茂盛业，CR2002）上，获得pLV-EGFP-Luc质粒，EGFP-2A- luciferase串联后的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所需引物序列如SEQ ID NO.6~ SEQ ID NO.15，M蛋白的F端引物可简称为MP-F， M蛋白的R端引物可简称为MP-R，E蛋白的F端引物可简称为EP-F，E蛋白的R端引物可简称为EP-R，S蛋白的F端引物可简称为SP-F，S蛋白的R端引物可简称为SP-R，EGFP的F端引物可简称为E2AL-F，EGFP+2A的R端引物可简称为E2AL-R1， EGFP+2A-Luciferase的F端引物可简称为E2AL-F1，2A-Luciferase的R端引物可简称为E2AL-R。

实施例2 假病毒制备和质控

假病毒制备

将构建完成的质粒pcDNA-S、pcDNA-M和pcDNA-E分别按照质量比（5：4：1）混合成S/M/E质粒（或称外壳蛋白质粒），按照pMDLg/pRRE（购自Addgene，12251）：S/M/E质粒：pRSV-Rev（购自Addgene，12253）：pLV-EGFP-Luc=5：3：2：10的比例转染293T细胞，72h收集细胞上清，-80℃保存备用。

假病毒外壳蛋白表达ELISA检测

用5μg/ml S蛋白中和抗体（DA035，Anti-2019-nCoV S-mIgG1 NeutralizingAntibody ，Novoprotein）包板，加入制备好的假病毒悬液，37℃孵育1h，PBS清洗后分别加入S配对蛋白抗体（DA041，Anti-2019-nCoV S Antibody ，Novoprotein）、Anti-HIS-HRP（购自Biolegend，652504）和Anti-Flag-HRP（购自GenScript，A01428），37℃孵育1h，清洗后S蛋白配对抗体组加入二抗，其余组加TMB显色。ELISA检测得结果见图1，ELISA的表达检测结果证明SME病毒包装成功。

假病毒感染ACE2阳性细胞

取假病毒20μl，加入在无血清环境下培养的3×10⁴个293-ACE2细胞（XCC14，Novoprotein）和HEK 293细胞中，同时加入polyberene（购自Sigma，TR-1003 ）增强感染，感染后6h，添加5-10%血清，感染48h后，荧光显微镜观察，并取细胞上流式细胞仪检测。感染的荧光图见图2，流式结果见图3。SME假病毒外壳能检测到S/M/E蛋白的表达，同时可以感染ACE2阳性细胞，说明SME假病毒制备成功。

实施例3 S/M/E假病毒与S假病毒的比较

将S/M/E质粒更换成pcDNA-S，利用与S/M/E假病毒相同的制备方法自主制备S假病毒，两种假病毒分别取5μl和10μl，感染293-ACE2细胞，48h后去细胞上流式细胞仪检测，读取MFI（Mean Fluorescence Intensity，平均荧光强度），进行分析比较，结果见图4，SME假病毒展现出比单纯S假病毒更强的感染能力。

取5μl两种假病毒分别感染293-ACE2细胞，同时加入COVID-19中和抗体（DA034，Novoprotein）10μg/ml，结果见图5，SME假病毒在评价中和抗体时灵敏度更强。

实施例4 假病毒的应用

用于评价中和抗体

取5μl SME假病毒，感染293-ACE2细胞，同时加入梯度稀释的中和抗体DA034，细胞培养48h后，裂解细胞，加入荧光素酶底物，立即在酶标仪读化学发光数值，数据统计分析得图6。

用于疫苗评价

取5μl SME假病毒，感染293-ACE2细胞，同时加入5μl志愿者血清（分为接种疫苗和未接种疫苗的志愿者，志愿者来自浙江鼎晶，疫苗来自科兴生物），接种疫苗的血清对假病毒感染具有较强的抑制效果，需要多份未接种的志愿者作为阴性对照。培养培养48h后，裂解细胞，加入荧光素酶底物，立即在酶标仪读化学发光数值，数据统计分析得图7。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司

<120> 一种COVID-19假病毒及其制备方法和用途

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1278

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala

20 25 30

Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe

35 40 45

Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe

50 55 60

Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly

65 70 75 80

Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr

85 90 95

Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala

115 120 125

Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro

130 135 140

Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser

145 150 155 160

Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val

165 170 175

Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys

180 185 190

Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile

195 200 205

Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly

210 215 220

Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile

225 230 235 240

Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro

245 250 255

Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val

260 265 270

Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly

275 280 285

Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr

290 295 300

Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr

305 310 315 320

Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn

325 330 335

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

340 345 350

Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

355 360 365

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

370 375 380

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

385 390 395 400

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

405 410 415

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

420 425 430

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

435 440 445

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

450 455 460

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

465 470 475 480

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

485 490 495

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

500 505 510

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

515 520 525

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val

530 535 540

Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser

545 550 555 560

Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp

565 570 575

Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile

580 585 590

Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn

595 600 605

Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu

610 615 620

Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val

625 630 635 640

Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile

645 650 655

Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly

660 665 670

Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg

675 680 685

Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu

690 695 700

Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro

705 710 715 720

Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met

725 730 735

Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr

740 745 750

Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu

755 760 765

Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln

770 775 780

Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys

785 790 795 800

Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys

805 810 815

Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr

820 825 830

Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp

835 840 845

Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr

850 855 860

Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser

865 870 875 880

Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly

885 890 895

Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn

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Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile

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Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

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Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val

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Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg

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Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly

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Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser

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Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr

1060 1065 1070

Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1075 1080 1085

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly

1090 1095 1100

Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile

1105 1110 1115 1120

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Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser

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Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile

1170 1175 1180

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys

1205 1210 1215

Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile

1220 1225 1230

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1235 1240 1245

Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp

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Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270 1275

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile

20 25 30

Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

35 40 45

Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys

50 55 60

Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile

65 70 75 80

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Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe

100 105 110

Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile

115 120 125

Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile

130 135 140

Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp

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Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu

165 170 175

Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr

195 200 205

Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln His His

210 215 220

His His His His

225

<210> 3

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

35 40 45

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val Asp Tyr Lys Asp Asp

65 70 75 80

Asp Asp Lys

<210> 4

<211> 3837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcctagag gacctgtggc tgctctgctg ctgctgattc ttcatggcgc ctggtcctgc 60

gtgaacctga caactaggac ccagctgccc cccgcctaca caaacagctt caccaggggc 120

gtgtactacc ctgataaggt gttcaggagc agcgtgctgc acagcaccca ggatctcttc 180

ctccccttct tcagcaacgt gacctggttc cacgccatcc acgtgagcgg gaccaacggg 240

actaagcggt ttgacaaccc cgtcctgccc tttaacgatg gggtgtactt cgcctccaca 300

gagaagagca acattatccg ggggtggatc ttcggcacaa ccctggacag caagacacag 360

tccctgctga tcgtgaacaa cgccacaaac gtggtcatta aggtgtgcga gttccagttc 420

tgcaacgatc cctttctggg ggtgtactac cataagaaca acaagtcctg gatggagagc 480

gagttcaggg tctactcctc cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgag ccagcccttc 540

ctgatggatc tggagggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgggagtt cgtgttcaag 600

aacatcgacg ggtacttcaa gatctacagc aagcacaccc ccatcaacct ggtgagggac 660

ctccctcagg ggttcagcgc cctggagccc ctggtcgacc tgcccattgg catcaacatc 720

acaaggttcc agaccctgct ggccctgcac cggagctacc tcacacccgg cgactccagc 780

agcgggtgga cagccggggc cgccgcctac tacgtggggt acctgcagcc ccggacattc 840

ctgctgaagt acaacgagaa cgggaccatc accgacgccg tggactgcgc cctggatccc 900

ctgagcgaga caaagtgcac actgaagtcc ttcacagtgg agaagggcat ctaccagaca 960

agcaacttca gggtgcagcc caccgagagc atcgtgcggt tccccaacat taccaacctg 1020

tgccccttcg gggaggtgtt caacgccacc cggttcgcca gcgtctacgc ctggaaccgg 1080

aagcggatca gcaactgcgt ggccgattac agcgtgctgt acaactccgc ctcctttagc 1140

accttcaagt gctacggggt gagccccacc aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg 1200

tacgccgaca gcttcgtgat ccggggcgat gaggtgaggc agatcgcccc aggccagacc 1260

ggcaagattg ccgattacaa ctacaagctg cccgatgatt tcacaggctg cgtgattgcc 1320

tggaacagca acaacctgga tagcaaggtg ggggggaact acaactacct ctaccggctg 1380

ttcaggaaga gcaacctgaa gcccttcgag cgggacatta gcacagagat ctaccaggcc 1440

ggcagcacac cctgcaacgg ggtcgagggg tttaactgct acttccccct gcagagctac 1500

gggttccagc ccacaaacgg cgtgggctac cagccctacc gggtggtggt gctgagcttc 1560

gagctgctgc acgcccccgc cacagtgtgc gggcctaaga agtccacaaa cctggtgaag 1620

aacaagtgcg tgaactttaa ctttaacggg ctgacaggga ccggggtgct gaccgagtct 1680

aacaagaagt tcctcccatt ccagcagttc ggccgggaca tcgccgacac caccgacgcc 1740

gtcagggacc cccagaccct ggagattctg gatattacac cctgcagctt cgggggggtg 1800

agcgtgatca cccccggcac taacaccagc aaccaggtgg ccgtgctgta ccagggcgtg 1860

aactgcacag aggtgcccgt cgccatccac gccgaccagc tgacccccac ctggcgggtg 1920

tacagcaccg ggtccaacgt ctttcagaca cgggccggct gcctgatcgg cgccgagcat 1980

gtcaacaact cctacgagtg tgacatcccc atcggcgccg gcatctgcgc ctcctaccag 2040

actcagacta actccccccg gcgggcccga agcgtggcct cccagagcat catcgcctac 2100

actatgagcc tcggcgccga gaactccgtc gcctactcca acaacagcat cgccatcccc 2160

acaaacttca caatcagcgt gaccacagag atcctgcctg tgagcatgac caagacaagc 2220

gtcgactgca ccatgtacat ctgcggggat agcactgagt gctccaacct cctgctccag 2280

tacgggtcct tctgcacaca gttgaacagg gccctgacag gcattgccgt ggagcaggat 2340

aagaacacac aggaggtgtt cgcccaggtg aagcagatct acaagacccc ccctatcaag 2400

gacttcggcg gctttaactt ctcacagatt ctgcccgacc ccagcaagcc ctccaagaga 2460

tccttcatcg aggacctcct gtttaacaag gtgactctgg ccgatgccgg cttcatcaag 2520

cagtacggcg actgcctggg ggatatcgcc gccagggatc tgatctgcgc ccagaagttc 2580

aacgggctga ccgtcctccc tcccctgctg acagatgaga tgatcgccca gtacacctcc 2640

gccctcctcg ccggcacaat cacaagcggc tggaccttcg gcgccggggc cgctctccag 2700

attcctttcg ccatgcagat ggcctacagg ttcaacggga tcggggtgac ccagaacgtc 2760

ctgtacgaga accagaagct catcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg gaagattcag 2820

gatagcctgt ccagcactgc ctccgctctg gggaagctcc aggatgtggt gaaccagaac 2880

gcccaggccc tgaacaccct cgtgaagcag ctgagcagca acttcggcgc catcagcagc 2940

gtcctgaacg atatcctgag ccggctggac aaggtggagg ccgaggtcca gatcgatagg 3000

ctgattactg ggcggctgca gagcctgcag acttacgtca cccagcagct gatccgggcc 3060

gccgagatta gggccagcgc caacctcgcc gccacaaaga tgagcgagtg cgtgctgggc 3120

cagtctaaga gggtggattt ttgcgggaag gggtaccacc tgatgagctt tccccagagc 3180

gctccccacg gggtggtgtt cctgcacgtg acatacgtcc ccgcccagga gaagaacttc 3240

acaaccgccc ctgccatctg ccacgatggc aaggcccact ttcctaggga gggcgtgttc 3300

gtgagcaacg ggacacactg gtttgtcacc cagaggaact tctacgagcc tcagatcatc 3360

actacagata acacatttgt gagcgggaac tgcgacgtgg tcattgggat cgtgaacaac 3420

acagtctacg accccctgca gcctgagctg gactccttca aggaggagct ggataagtac 3480

tttaagaacc acacctcccc cgacgtcgac ctgggcgata tcagcggcat taacgcctcc 3540

gtggtgaaca ttcagaagga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa cttgaacgag 3600

tccctgattg acctgcagga gctcggcaag tacgagcagt acatcaagtg gccctggtac 3660

atctggctgg gcttcatcgc cggcctgatc gccatcgtga tggtgaccat catgctgtgc 3720

tgcatgacct cctgctgctc ctgcctgaag ggctgctgct cctgtgggtc ctgctgcaag 3780

ttcgacgagg acgactccga acccgtgctg aagggagtga agctgcacta cacctaa 3837

<210> 5

<211> 813

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala

225 230 235 240

Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

245 250 255

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys

260 265 270

Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln

275 280 285

Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala

290 295 300

Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe

305 310 315 320

Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn

325 330 335

Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe

340 345 350

Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala

355 360 365

Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser

370 375 380

Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu

385 390 395 400

Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp

405 410 415

Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr

420 425 430

Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser

435 440 445

Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val

465 470 475 480

Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro

485 490 495

Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met

500 505 510

Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met

515 520 525

Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys

530 535 540

Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys

545 550 555 560

Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala

565 570 575

Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys

580 585 590

Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr

595 600 605

Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Lys Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala

610 615 620

Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp

625 630 635 640

Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg

645 650 655

Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn

660 665 670

Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Leu Ala Tyr

675 680 685

Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val Gly Arg Leu Lys Ser Leu

690 695 700

Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile

705 710 715 720

Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro

725 730 735

Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His

740 745 750

Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln

755 760 765

Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu

770 775 780

Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Arg Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu

785 790 795 800

Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ile Ala Val

805 810

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggactctaga gccgccacca tggcagattc caacggtac 39

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cattactaac cggtgaattc tcagtggtgg tggtggtggt gctgtacaag caaagcaata 60

ttg 63

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggactctaga gccgccacca tgtactcatt cgtttcggaa g 41

<210> 9

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cattactaac cggtgaattc tcacttgtcg tcgtcgtcct tgtagtcgac cagaagatca 60

ggaactc 67

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggactctaga gccgccacca tgcctagagg acctgtggc 39

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cattactaac cggtgaattc ttaggtgtag tgcagcttc 39

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctactagagg atctatttcc ggtgccgcca ccatggtgag caagggcgag gag 53

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttagggggg ggggagggag aggggcgtta cacggcgatc tttccg 46

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catggacgag ctgtacaagg cacctgtaaa gcaaacactg 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtgtttgc tttacaggtg ccttgtacag ctcgtccatg 40

Claims

1.一种COVID-19假病毒，其特征在于，所述COVID-19假病毒由外壳蛋白质粒、荧光报告质粒与辅助质粒经病毒包装而成，所述外壳蛋白质粒包括表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒；SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SARS-CoV-2 M蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SARS-CoV-2E蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SARS-CoV-2 M蛋白和SARS-CoV-2 E蛋白分别融合有不同的标签，所述荧光报告质粒用于表达荧光蛋白和荧光素酶，所述荧光报告质粒的载体选自慢病毒载体，所述SARS-CoV-2 S蛋白编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的COVID-19假病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将外壳蛋白质粒、荧光报告质粒与辅助质粒混合，转染宿主细胞，转染后收集的细胞上清中即含有假病毒，其中所述外壳蛋白质粒包括表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2 E蛋白的质粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：先将外壳蛋白质粒中的表达SARS-CoV-2 S蛋白的质粒、表达SARS-CoV-2 M蛋白的质粒和表达SARS-CoV-2E蛋白的质粒混合后，再将外壳蛋白质粒与荧光报告质粒、辅助质粒混合。

4.权利要求1所述的COVID-19假病毒在体外筛选或检测COVID-19预防、治疗药物中的用途。

5.一种用于体外检测COVID-19预防、治疗药物疗效的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求1所述的COVID-19假病毒与COVID-19的靶标样本、预防或治疗药物共同孵育，孵育结束后检测发光强度。