CN112442514B - 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒。该慢病毒包装载体系统包含2个或更多个质粒，能产生只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒，其中一个质粒包含顺次连接的启动子、增强子、以及用于编码包膜蛋白的核酸片段，编码包膜蛋白的核酸片段包括用于表达SARS‑CoV‑2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS‑CoV‑2的S蛋白的突变体的核酸片段，用于表达SARS‑CoV‑2的S蛋白的突变体为SARS‑CoV‑2的S蛋白的S1亚基的C端第614位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸。利用上述慢病毒包装载体系统制得的慢病毒可以用于筛选针对SARS‑CoV‑2或其突变株的药物，安全性高。

Description

慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒。
背景技术
严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2)是继SARS-CoV和MERS-CoV之后发现的一种对人类具有高致病性的新型β冠状病毒，为非节段单股正链RNA包膜病毒。
然而，由于SARS-CoV-2是一种生物安全三级(BSL-3)的烈性传染病的病原体，SARS-CoV-2的分离与培养必须在具有BSL-3的条件下进行，这限制了针对SARS-CoV-2的药物的研发效率。
发明内容
基于此，有必要提供一种慢病毒包装载体系统，利用该慢病毒包装载体系统构建的慢病毒包膜蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白，用该慢病毒研发治疗SARS-CoV-2的药物时，不必在BSL-3的条件下进行。
一种慢病毒包装载体系统，其包含2个或更多个质粒，能产生只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒，其中一个质粒包含顺次连接的启动子、增强子、以及用于编码包膜蛋白的核酸片段，所述用于编码包膜蛋白的核酸片段包括用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段，所述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体为SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基的C端第614位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸；所述SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；所述增强子为β-珠蛋白的内含子。
上述慢病毒包装载体系统利用SARS-CoV-2的S蛋白代替传统的VSV-G蛋白来包装慢病毒，制得的慢病毒是S蛋白包膜的慢病毒，S蛋白包膜化的慢病毒大大降低了研究SARS-CoV-2对实验操作环境的要求，可以实现在BSL-2的条件下模拟野生型SARS-CoV-2病毒或其突变株的一系列生物过程，可以加快筛选抗SARS-CoV-2感染的治疗性抗体和相关疫苗的研发。
在其中一个实施例中，所述慢病毒包装载体系统为四质粒系统，包括包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒。在其中一个实施例中，所述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQIDNo：3所示，所述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段的核苷酸序列如SEQIDNo：4所示。在其中一个实施例中，所述启动子为巨细胞病毒启动子或CAG启动子。在其中一个实施例中，所述增强子的核苷酸序列如SEQIDNo：5所示。
一种慢病毒的构建方法，包括以下步骤：使用上述的慢病毒包装载体系统转染宿主细胞，制备慢病毒。
在其中一个实施例中，所述慢病毒包装载体系统包括包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒，所述包膜蛋白表达质粒、所述慢病毒包装表达质粒、所述gag-pol表达质粒及所述rev表达质粒的用量比为(3μg～10μg)：10μg：(3μg～10μg)：(3μg～10μg)。
一种慢病毒，由上述的慢病毒的构建方法制得。
一种试剂盒，包括表达ACE2受体的细胞株及上述的慢病毒。
一种试剂盒，包括表达ACE2受体的细胞株和上述的慢病毒包装载体系统。
附图说明
图1为实施例1中的HEK293T-ACE2稳转株在显微镜(200×)下的图像；图2为实施例1的Western Blot结果图；图3为实施例2的Western Blot结果图；图4为实施例3的各个慢病毒转导入HEK293T和HEK293T-ACE2稳转株后的S蛋白或S蛋白的突变体的表达情况；图5为实施例4中的各组的转染结果；图6为实施例5中康复病人血清对实施例3制备的病毒4的作用效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
研究发现，SARS-CoV-2通过糖基化的跨膜突刺Spike(S)蛋白介导病毒与细胞受体结合并进入细胞，S蛋白分为S1和S2两个亚基，两者之间的边界存在一个furin蛋白酶切割位点，S1亚基包含一个独立的折叠子域RBD，可介导病毒识别并结合到宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(Angiotensin-onverting enzyme 2，ACE2)受体。在某些情况下，S1蛋白会有一定的概率脱落下来，使SARS-CoV-2失去对ACE2受体的亲和性；S2介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合过程，从而使病毒最终进入宿主细胞中。S蛋白是SARS-CoV-2的表面糖蛋白和抗原表位，决定了病毒的宿主范围和特异性，是宿主中抗体的重要作用靶点，同时也是研发针对SARS-CoV-2的疫苗、治疗性抗体和诊断方法的关键靶标。
并且，对SARS-CoV-2分离株的序列变异分析中发现，其中一个突变株(下文简称“D614G突变株”)的S1亚基C端第614位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸(D614G)，导致该突变株在感染人群中以惊人的速度传播，其原因在于D614G突变株的D614G突变的使得S1亚基脱落的概率降低，增加了S蛋白整体的稳定性，从而提高了病毒的侵染活性。
因此，本发明一实施方式提供了一种慢病毒包装载体系统，其包含2个或更多个质粒，能产生只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒，其中一个质粒包含顺次连接的启动子、增强子、以及用于编码包膜蛋白的核酸片段，用于编码包膜蛋白的核酸片段包括用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段，用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体为SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基的C端第614位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸。采用该慢病毒包装载体系统得到的慢病毒具有SARS-CoV-2的S蛋白或SARS-CoV-2的S蛋白的突变体，可以利用该慢病毒来研究药物对SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株与宿主细胞表面的ACE2受体的亲和性的影响，筛选用于治疗由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株所引起的疾病的药物。与野生型的SARS-CoV-2或D614G突变株相比，该慢病毒的安全性更高，不必在BSL-3的条件下进行，在BSL-2的条件下进行即可。
可选地，慢病毒包装载体系统为四质粒系统。进一步地，慢病毒包装载体系统为第三代慢病毒包装系统，构建得到的慢病毒删除了HIV基因组上所有的病毒基因，仅留下两个ITR和包装信号以及部分调控序列，安全性高。具体地，慢病毒包装载体系统包括包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒。其中：
包膜蛋白表达质粒用于表达慢病毒的包膜蛋白。传统慢病毒的构建方法中使用的包膜蛋白表达质粒含有用于表达VSV-G蛋白的水疱性口炎病毒糖蛋白G基因，而在本实施方式中，包膜蛋白表达质粒中包括用于编码包膜蛋白的核酸片段。具体地，用于编码包膜蛋白的核酸片段包括用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段，不包括用于表达VSV-G蛋白的水疱性口炎病毒糖蛋白G基因，也不包括病毒自身的包膜蛋白(也即是用SARS-CoV-2的S蛋白或其突变体替代VSV-G蛋白或Env包膜蛋白)，使得制备的慢病毒的包膜蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白或SARS-CoV-2的S蛋白的突变体(也即是，采用SARS-CoV-2的S蛋白或SARS-CoV-2的S蛋白的突变体替代传统的VSV-G蛋白或env基因来包装慢病毒，从而得到一种具有SARS-CoV-2的S蛋白或SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的复制缺陷型慢病毒)，从而可以利用制得的慢病毒来研究药物对SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株与宿主细胞表面的ACE2受体的亲和性的影响，筛选用于治疗由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株所引起的疾病的药物。
本实施方式中的SARS-CoV-2的S蛋白是在野生型SARS-CoV-2的S蛋白的基础上缺失了19个作为内质网保留信号的氨基酸。也即是，本实施方式中的SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。可选地，用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
本实施方式中的SARS-CoV-2的S蛋白的突变体是将野生型的SARS-CoV-2的S蛋白的S1亚基的C端第614位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，并缺失了19个作为内质网保留信号的氨基酸。也即是，本实施方式中的SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。可选地，用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段的核苷酸序列如SEQID No：4所示。
具体地，包膜蛋白表达质粒包括顺次连接的启动子、增强子及用于编码包膜蛋白的核酸片段。用于编码包膜蛋白的核酸片段如上述，此处不再赘述。更具体地，启动子为巨细胞病毒启动子(CMV启动子)或CAG启动子。具体地，增强子为β-珠蛋白的内含子。通过在启动子和用于编码包膜蛋白的核酸片段之间引入β-珠蛋白的内含子作为增强子，可以使得制得的慢病毒对ACE2受体的亲和力更高。具体地，增强子的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。在本实施方式中，β-珠蛋白的内含子为人β-珠蛋白的内含子。可以理解的是，在其他实施例中，β-珠蛋白的内含子的来源不限于人，还可以是动物，例如鸡。
在一些实施例中，包膜蛋白的表达质粒还包括用于表达纯化或检测标签的核酸片段。具体地，用于表达纯化或检测标签的核酸片段位于用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段的下游(3’端)。
慢病毒包装表达质粒包含了包装、转染和稳定整合到宿主细胞所需的遗传信息。可选地，慢病毒包装表达质粒包括荧光报告基因，以便于观察转染效果和备选药物的作用效果。在一个可选地具体示例中，荧光报告基因为EGFP。
gag-pol表达质粒包含gag基因和pol基因。gag基因编码约500个氨基酸组成的p55蛋白前体，p55蛋白前体经蛋白酶裂解形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)。pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶和核糖核酸酶H。
rev表达质粒包含rev基因。rev基因编码Rev蛋白。在慢病毒包装表达质粒经转录产生慢病毒基因组mRNA后，Rev蛋白与慢病毒基因组mRNA中的RRE结合，将基因组mRNA从细胞核转运到细胞质中。慢病毒基因组mRNA衣壳蛋白、逆转录酶、整合酶和包膜蛋白等组装成假病毒颗粒。
可以理解的是，在一些实施方式中，慢病毒包装载体系统也可以为两质粒系统或三质粒系统，只要其中一个质粒包含上述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段或上述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段，且能使得产生的慢病毒颗粒的包膜蛋白含有上述S蛋白或上述S蛋白的突变体即可。
本发明一实施方式还提供了慢病毒的构建方法，该构建方法包括以下步骤：使用上述慢病毒包装载体系统转染宿主细胞，制备慢病毒。
在一些实施例中，上述慢病毒包装载体系统为四质粒系统，包括包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒。包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒的用量比为(3μg～10μg)：10μg：(3μg～10μg)：(3μg～10μg)。进一步地，包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒的用量比为(3μg～7μg)：10μg：10μg：(3μg～10μg)。
上述慢病毒的构建方法采用第三代慢病毒包装系统，构建得到的慢病毒删除了HIV基因组上所有的病毒基因，仅留下两个ITR和包装信号以及部分调控序列，安全性高。
本发明一实施方式还提供了一种慢病毒，该慢病毒由上述慢病毒的构建方法制得。
具体地，该慢病毒的包膜蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白或SARS-CoV-2的S蛋白的突变体，SARS-CoV-2的S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
上述慢病毒可以用来研究药物对SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株与宿主细胞表面的ACE2受体的亲和性的影响，筛选用于治疗由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株所引起的疾病的药物。
本发明一实施方式还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括表达ACE2受体的细胞株及上述慢病毒。表达ACE2受体的细胞株用于稳定表达ACE2受体。在本实施方式中，表达ACE2受体的细胞株为稳定表达ACE2受体的HKE293T。
上述试剂盒可以用于研究药物对SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株与宿主细胞表面的ACE2受体的亲和性的影响，进而筛选用于治疗由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株所引起的疾病的药物。
本发明一实施方式还提供了另一种试剂盒，该试剂盒包括表达ACE2受体的细胞株和上述慢病毒包装载体系统。采用该试剂盒中的上述慢病毒包装载体系统可以制备上述慢病毒，因此，通过与该试剂盒中的表达ACE2受体的细胞株配合，同样也能用于研究药物对SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株与宿主细胞表面的ACE2受体的亲和性的影响，进而筛选用于治疗由SARS-CoV-2或SARS-CoV-2的S蛋白的突变株所引起的疾病的药物。
具体地，该试剂盒包括表达ACE2受体的细胞株、包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒。此处的包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒与上述慢病毒的构建方法中所提及的包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒相同，因此，此处不再赘述。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
表达ACE2受体的细胞株的制备
(1)将pLV[Exp]-Bsd-CMV>hACE2(来自云舟生物)用VSV-G包装成慢病毒；
(2)将步骤(1)的慢病毒转导HKE293T细胞，用合适浓度的杀稻瘟菌素Bsd(Blasticidin)药筛直至空白细胞死亡，得到表达ACE2受体的稳转株，记为HEK293T-ACE2稳转株。HEK293T-ACE2稳转株在200×显微镜下的图像如图1所示。由图1可知，HEK293T-ACE2稳转株生长状态良好。
(3)提取HEK293T-ACE2稳转株的基因组DNA，进行qRT-PCR检测，其中qPCR引物如下：ACE2-F：5’-GCAGCCACACCTAAGCATT-3’(SEQ ID No：6)；ACE2-R：5’-CCATCCACCTCCACTTCTCT-3’(SEQ ID No：7)；HKE293T作为空白对照。
qRT-PCR结果表明，与空白对照HKE293T相比，HEK293T-ACE2稳转株的ACE2受体的表达量提高了约6354倍。
(4)取HEK293T-ACE2稳转株表达的蛋白进行Western Blot，结果图2所示。
由图2可知，HEK293T-ACE2稳转株能高效表达ACE2受体，HEK293T-ACE2稳转株构建成功。
实施例2
检测不同S蛋白表达载体(该载体在病毒包装过程中作为包膜蛋白表达质粒)瞬转HEK293T细胞后S蛋白表达水平
(1)将相同量的10种S蛋白表达载体，各自以Lipofectamine 2000为转染试剂瞬转HEK293T细胞，得到各S蛋白表达载体对应的HEK293T细胞。在10种S蛋白表达载体中，S_a的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示，编码野生型S蛋白；S_c的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示，编码D614G突变的S蛋白；S_b的核苷酸序列如SEQ ID No：10所示，是在S_a基础上进行优化后加上纯化标签3×Flag对应的核酸片段(即核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的核酸片段+3×Flag对应的核酸片段)得到的；S_d的核苷酸序列如SEQ ID No：11所示，是在S_c的基础上优化后加上纯化标签3×Flag对应的核酸片段(即核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的核酸片段+3×Flag对应的核酸片段)得到的，10种S蛋白表达载体的具体结构如下：
载体1：pRP[Exp]-CMV>S_a；载体2：pRP[Exp]-CMV>S_b；载体3：pRp[Exp]-CMV-human beta globin intron>S_a；载体4：pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron>S_b；载体5：pRP[Exp]-CAG>S_a；载体6：pRP[Exp]-CAG>S_b；载体7：pRP[Exp]-CMV-human betaglobin intron>S_c；载体8：pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron>S_d；载体9：pRP[Exp]-CAG>S_c；载体10：pRP[Exp]-CAG>S_d。以上载体中的“human beta globin intron”为“人β-珠蛋白的内含子”作为增强子，其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
(2)将10种转染有不同载体的HEK293T细胞，均培养48小时后离心收集细胞，利用RIPA裂解液(碧云天P0013B)裂解细胞，冰上放置20分钟。
(3)运用S蛋白一抗、GAPDH一抗和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天A0208)作为二抗进行Western Blot检测各HEK293T细胞中S蛋白表达情况，结果如图3所示。
S蛋白的全长大小为180kDa，S1和S2为90kDa，由于蛋白翻译后修饰及折叠作用，在Western Blot中的对应条带均显得偏大一些。图3为载体1～10瞬转HEK293T细胞48小时后的Western Blot结果，其中M为蛋白marker，T为HEK293T空白细胞，作为阴性对照。
由图3可知，在HEK293T细胞中S蛋白表达效果较好的是载体2、载体4、载体6、载体8和载体10。也即是，含有S_b和S_d的载体表达蛋白的效果好于含有S_a和S_c的载体，未经优化的S_a和S_c在上述载体中甚至不能表达S蛋白或D614G突变的S蛋白。
实施例3
比较不同S蛋白表达载体的慢病毒包装效果
选择实施例2的部分S蛋白表达载体进行慢病毒包装测试，测试所用的材料包括以下：
载体1：pRP[Exp]-CMV>S_a；载体2：pRP[Exp]-CMV>S_b；载体4：pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron>S_b；载体6：pRP[Exp]-CAG>S_b；载体7：pRP[Exp]-CMV-humanbeta globin intron>S_c；载体8：pRP[Exp]-CMV-human beta globin intron>S_d；载体9：pRP[Exp]-CAG>S_c；载体10：pRP[Exp]-CAG>S_d；慢病毒包装表达质粒：pLV[Exp]-CMV>EGFP；gag-pol表达质粒(下文简称PLV4)：含慢病毒的gag基因和pol基因；rev表达质粒(下文简称PLV5)：编码慢病毒Rev调控因子；RIPA裂解液(强)，碧云天P0013B；Sars SpikeProtein Antibody(SARS-S蛋白的抗体)，(novusbio NB100-56578SS)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，碧云天A0208。具体步骤包括：
(1)使用慢病毒包装表达质粒、PLV4、PLV5和以上8种S蛋白表达载体中一种进行慢病毒包装(具体包装体系如表1所示)。其中，包装时，慢病毒包装表达质粒、PLV4、PLV5和S蛋白表达载体的质量之比为10μg：5μg：5μg：5μg；在293T细胞中进行病毒包装，包装10cm皿规模的病毒。
表1
名称 包装体系组分
病毒1 慢病毒包装表达质粒、PLV4和PLV5
病毒2 慢病毒包装表达质粒、载体1、PLV4和PLV5
病毒3 慢病毒包装表达质粒、载体2、PLV4和PLV5
病毒4 慢病毒包装表达质粒、载体4、PLV4和PLV5
病毒5 慢病毒包装表达质粒、载体6、PLV4和PLV5
病毒6 慢病毒包装表达质粒、载体7、PLV4和PLV5
病毒7 慢病毒包装表达质粒、载体8、PLV4和PLV5
病毒8 慢病毒包装表达质粒、载体9、PLV4和PLV5
病毒9 慢病毒包装表达质粒、载体10、PLV4和PLV5
(2)收毒：72h收毒，吸取上清，用0.45μm滤膜过滤。PEG6000/NaCl按1：5加入上清液中，4℃沉淀过夜，最后用HBSS重悬，得到各组的病毒液。
(3)各组病毒液分别进行如下操作：将病毒液分别转导HEK293T和实施例1制得的HEK293T-ACE2稳转株，观察荧光表达情况。当然，各组的病毒液的使用量(病毒滴度和使用病毒液的体积)相同，结果如图4所示。
由图4可知，相对于HEK293T细胞，病毒对表达ACE2受体蛋白的HEK293T-ACE2稳转株具有高度的亲和性，其中载体4、载体6、载体8、载体10均成功获得包膜蛋白为S蛋白的慢病毒，并且经检测，载体8包装得到的慢病毒经流式检测其滴度能达到108TU/mL。
另外，载体2和载体4相比，两者唯一的区别为是否添加human beta globinintron(人β-珠蛋白的内含子)，由图4的病毒3和病毒4可知只有添加了人β-珠蛋白的内含子的载体能有效的包装出慢病毒；在前述实验中，无法正常表达S蛋白的载体也无法有效包装出慢病毒，例如载体1和载体7。在前述实验中，能表达出S蛋白的载体不一定能有效包装出假型病毒，例如载体2和载体9，这可能跟包装方法和各质粒比例有一定关系。经过综合对比，效果最好的载体4和载体8，因此，载体4和载体8可以作为检测试剂盒的中包膜蛋白表达质粒，其中，载体4针对SARS-CoV-2，载体8针对SARS-CoV-2_D614G(D614G突变株)。
实施例4
测试慢病毒包装体系中的各质粒的比例对慢病毒包装的影响
使用实施例3中的载体4进行不同质粒预混液配比的探索。共设置16组不同比例的质粒预混液进行慢病毒包装，并用HEK293T细胞作为阴性对照，以表达S蛋白的293T细胞作为阳性对照。慢病毒包装表达质粒：载体4：PLV4：PLV5的比例区间为10μg：(3μg～10μg)：(3μg～10μg)：(3μg～10μg)；在293T细胞中进行病毒包装，包装10cm皿规模的病毒，各质粒的具体组成如表2所示。
表2
Figure BDA0002798917580000041
包装结果如图5所示，由图5可知，在载体4用量相同，其他质粒比例不一样时，S蛋白在包装体系中的表达效果不一样，其中第16组包装出的慢病毒的S蛋白表达最高。
实施例5
康复患者血清对具有S蛋白的慢病毒的作用效果
采用康复病人血清对实施例3制备的病毒4(下文简称S蛋白假型慢病毒)处理后，再转导293T-ACE2稳转株，观察处理前后荧光的变化，以评估康复病人血清中的抗体对具有S蛋白的慢病毒侵染活性的影响。
先将康复病人血清原液按1:20稀释，然后逐级1:2稀释5个梯度，各吸取50μL康复病人血清稀释液+50μL S蛋白假型慢病毒(共含有1×106个病毒颗粒)，孵育处理1h后，转导293T-ACE2稳转株，并以不处理组作为对照，结果如图6所示。图6中，同一组的两列图像中，左列为白光下的图像，右列为荧光下的图像。
由图6可知，随着康复病人血清原液稀释梯度的增加，EGFP的荧光表达越来越强，S蛋白假型慢病毒侵染能力加强，也说明康复病人的血清中含有能够中和S蛋白的有效抗体成份。因为有效药物浓度越高，S蛋白假型慢病毒侵染受到阻断或抑制的数量越多，EGFP的荧光表达量就越少。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 云舟生物科技（广州）有限公司
<120> 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
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Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
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Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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275 280 285
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355 360 365
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
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565 570 575
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Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
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His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
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Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
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Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
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Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
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Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
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Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
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Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
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Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
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<210> 2
<211> 1254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
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Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
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Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
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Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
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Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
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Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
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Ser Cys Gly Ser Cys Cys
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<210> 3
<211> 3762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagctcac agtgcgtcaa cctgaccacc 60
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caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 10
<211> 3831
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagctcac agtgcgtcaa cctgaccacc 60
agaacccaac tgccccccgc ctacaccaat agcttcacac ggggggtgta ctaccctgat 120
aaggtgttcc ggagttctgt gctgcactcc acacaggacc tgtttctgcc ttttttttcc 180
aatgtgacat ggttccacgc catccacgtg agcggcacca acggcacaaa aaggtttgac 240
aaccccgtgc tgccatttaa tgatggggtg tacttcgctt ccaccgagaa atccaacatc 300
attaggggct ggatcttcgg cactaccctg gattctaaga ctcagtccct gctgatcgtg 360
aataacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgcgaatttc agttctgcaa cgatccattc 420
ctgggggtgt actaccacaa gaataacaag agctggatgg agagcgaatt ccgcgtgtac 480
tcttccgcaa acaactgcac ctttgaatat gtgagtcagc ccttcctgat ggacctggag 540
ggaaagcagg gcaatttcaa aaacctcagg gaatttgtct tcaagaatat cgatggttat 600
ttcaagatct acagcaagca tactcccatc aacctggtga gagacctgcc ccagggcttc 660
agcgctctgg agcctctggt ggacctgccc atcggcatca acattaccag attccagacc 720
ctgctggctc tgcatcggtc ttacctgact cccggagata gtagcagcgg ctggaccgcc 780
ggcgccgctg cgtattatgt ggggtacctg cagcctcgga ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaacggga ccatcacaga tgccgtggac tgcgctctgg acccactctc cgagaccaaa 900
tgcaccctga agtcctttac cgtggagaaa ggcatctacc agacctccaa tttccgcgtg 960
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gtgttcaatg caacacggtt tgccagcgtg tacgcttgga atcggaagcg gatcagcaac 1080
tgcgtggccg actactctgt gctgtataac tccgcgtcct tttccacctt taaatgttac 1140
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gtgattcggg gcgacgaagt cagacagatt gctcccggac agactggaaa gatcgccgac 1260
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cccgctaccg tgtgcggccc caagaaatcc accaacctgg tgaagaataa gtgtgtgaac 1620
ttcaacttca atggcctcac cggcaccggg gtgctgaccg agtctaataa gaaattcctt 1680
cccttccagc agttcgggag ggacatcgcg gataccacag atgccgtcag agacccacag 1740
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gagtgcgaca tccccatagg agccgggatt tgcgccagct accagaccca gacaaacagc 2040
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gccgagaata gcgtcgcata cagtaataat tccattgcca tcccaaccaa cttcaccatc 2160
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tacatctgtg gcgacagcac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg atccttttgc 2280
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<213> Artificial Sequence
<400> 11
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagctcac agtgcgtcaa cctgaccacc 60
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ggagactaca aagaccatga tattgattac aaggacgacg acgacaagta a 3831

Claims (4)

1.一种慢病毒包装载体系统，能产生只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包装载体系统为四质粒系统，包括包膜蛋白表达质粒、慢病毒包装表达质粒、gag-pol表达质粒及rev表达质粒，所述包膜蛋白表达质粒包含顺次连接的启动子、增强子、以及用于编码包膜蛋白的核酸片段，所述用于编码包膜蛋白的核酸片段为用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段或用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段，所述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，所述用于表达SARS-CoV-2的S蛋白的突变体的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；
所述增强子为β-珠蛋白的内含子，所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；
所述包膜蛋白表达质粒、所述慢病毒包装表达质粒、所述gag-pol表达质粒及所述rev表达质粒的用量比为5μg：10μg：5μg：5μg。
2.根据权利要求1所述的慢病毒包装载体系统，其特征在于，所述启动子为巨细胞病毒启动子或CAG启动子。
3.一种慢病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用权利要求1～2任一项所述的慢病毒包装载体系统转染宿主细胞，制备慢病毒。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括表达ACE2受体的细胞株和权利要求1～2任一项所述的慢病毒包装载体系统。
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PPARδ基因RNA干扰慢病毒载体的构建及稳定干扰结肠癌细胞株KM12C的建立;蒋小等;《生物医学工程学杂志》;20100425;第27卷(第02期);第400-406页，参见全文 *
Spike mutation D614G alters SARS-CoV-2 fitness;Jessica A Plante等;《Nature》;20201026;第592卷(第7852期);第116-121页，参见摘要 *
严重急性呼吸综合征冠状病毒2假病毒的制备及验证;彭浩然等;《第二军医大学学报》;20200415;第41卷(第4期);第359-364页，参见摘要，第360页右栏最后一段至第361页左栏第2段 *
人FAM172A基因慢病毒载体的构建及其在巨噬细胞中的表达;李梅芳等;《医学研究杂志》;20140415;第43卷(第4期);第25-29页，参见全文 *
慢病毒介导的稳定沉默MyD88基因的胰腺导管细胞株的建立;李扬等;《四川大学学报(医学版)》;20110515;第42卷(第03期);第293-297页，参见全文 *

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Address before: Room d301-d309, Guangzhou International Business Incubator (Zone D), No.3, Juquan Road, Science City, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangzhou 510000, Guangdong Province

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