JPH01500962A - ウィルスベクター及びエイズ原因ウィルスのｆ蛋白質をコードするｄｎａ組換え体、該ベクターにより感染された細胞培養物、上記蛋白質の製造方法、得られた蛋白質、ワクチン及び得られた抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルスベクター及びエイズ原因ウィルスのＦ蛋白質をコードするＤＮＡ組換え 体、該ベクターにより感染された細胞培養物、上記蛋白質の製造方法、得られた 蛋白質、ワクチン及び得られた抗体本発明は、やや詳しくは、エイズ（ＡＩＤＳ ）予防用のワクチンに関するものである。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、北米、ヨーロッパ及び中央アフリカにお いて現在極めて深刻な問題となっているウィルス性疾患である。

最近の推定によれば、約１００万人のアメリカ人がすでにエイズウィルスに曝露 されているとされている。罹患者は重篤な免疫不全を呈し、この疾患は一般に致 命的なものである。

本疾患の伝播は、性的接触を介して行われることが最も多いが、静注による麻薬 使用者も危険度の高いグループをなしている。さらに、多くの人が汚染された血 液または血液製剤を受けた後にこのウィルスに感染している。

かかる状況の原因因子はレトロウィルスである。動物の多くの身体状態がレトロ ウィルスによるものとされてきたが、ヒトを冒すレトロウィルスを記述できるよ うになったのは極く最近である。

タイブエ及び■のヒトＴ細胞レトロウィルス（ＨＴＬＶ：ヒトＴ白血病ウィルス ）は成人でのある種のＴ細胞白血病の原因因子であるとされているが、ＨＴＬＶ −ＩＩＩウィルスまたはエイズ関連ウィルス（ＡＲＶ）としても知られているリ ンパ節疾患関連レトロウィルス（ＬＡＶ）は現在やっとエイズ原因因子であると 認められるようになったところである。

ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩレトロウィルスのいくつかの単離物のゲノムは非 常に完全に特性を記述されてきており〔ウエインーポプリン（Ｖａｉｎ−Ｈｏｂ ｓｏｎ　）ら、１９８５年；ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、１９８５年；ミュー ジング（Ｍｕｅｓｉｎｇ　）ら、１９８５年；サンチェスーペスカドール（Ｓａ ｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ）ら、１９８５年〕、ゲノム配列に関するデータ は、レンチウィルス群との密接な関係を示している。ヒツジのヴイスナウィルス をプロトタイプとするレンチウィルスは、典型的に長い潜伏期間を持ち、徐々に 疾患を進行させる因子である。ＬＡＶとヴイスナウィルスとは多くの類似点を持 ち、特にそれらの向神経組織性において類似する。

全てのレトロウィルスにおいて見出され、ｇ　ａｇ＋ｐｏｌ及びｅｎｖと呼ばれ ているゲノムの３つの部分に加えて、ＬＡＶウィルスはその他に少くとも３つの 他の遺伝子を含有し、それら遺伝子はＲまたは５ｏｒ。

ＴＡＴ及び旦または３’ｏｒｆとして知られている〔ウェインーポプリン（Ｖａ ｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　）ら、１９８５年；アリア（Ａｒｙａ）ら、１９８６年〕 。Ｆ遺伝子産物は、エイズ患者の血清と反応することが特徴で、蛋白質の同一性 は直接アミノ酸配列決定によって確認されている〔アラン（Ａｌｌａｎ　）ら、 １９８５年〕。

本発明者らによれば、Ｆ蛋白質は患者血清の３０〜９０％によって認識される。

この蛋白質はＳＤＳアクリルアミドゲル上で２６ＫＤと２８ＫＤとの間の見掛は 分子量に従って移動する。２４ＫＤと２５ＫＤとの間のＦ遺伝子産物を提示して いる著者もあり、二番目のＡＴＧで翻訳が開始される可能性を示している。

Ｆ蛋白質は、Ｎ−グリコジル化の可能な個所が２つ存在するが、グリコジル化さ れていない。最後に、Ｆ蛋白質がミリスチン酸によってアシル化されていること が証明されている。細胞接着に関与するある種の蛋白質中に、また第ｎ類のＨＬ Ａ抗原の一つの鎖中に見出されるテトラペプチド（Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ、− ８ｅｔ）がＦ蛋白質中にある。

オーフレイ（（Ａｕｆｆｒａｙ　）　、１９８６年〕は、１４９２８球へのｅｎ ｖ蛋白質及びＬＡＶウィルスの認識及び、付着にＦ蛋白質が関与し、それによっ てウィルスの伝播に寄与していることの可能性を唱えている。さらに、Ｆ蛋白質 の株による変異性が高く　（２〜１７％）、エンヴエローブ糖蛋白質のそれに匹 敵することは、Ｆ蛋白質が感染に効果的に関与していることを示唆する〔ラトナ ー（Ｒａｔｎｅｒ）　ら、１９８５年〕。

本発明は、Ｆ蛋白質発現用ベクターとして、翻訳後のそれの再編成を可能ならし める環境下で該蛋白質を発現されうるウィルスベクターを使用することを提案す る。

すなわち、本発明は、エイズ原因ウィルスのＦ蛋白質を含有するウィルスベクタ ーに関するものである。

使用しうるウィルスの中では、ポックスウィルス、とりわけワクシニアウィルス （ＶＶ）を特に挙げることができる。

ワクシニアウィルスは、天然痘の防除及び撲滅のために世界中で極めて広く用い られてきた２本鎖ＤＮＡウィルスである。最近の技術的進歩によって、このウィ ルスをクローニングベクターとして開発することが可能となり、生きた組換えウ ィルスが異種抗原を発現させることを、さらには種々のウィルス性または寄生虫 性の疾患に対する免疫を達成することを可能ならしめてきている。

かくして、最近、数グループが、インフルエンザ抗原及びＢ型肝炎抗原及び狂犬 病糖蛋白質を発現させ、これら疾患に対する免疫を得るために、この種の組換え 体を使用し得ることを証明している〔スミス（Ｓｗｉｔｈ　）ら、１９８３年； バニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）ら、１９８３年；キ異種蛋白質をコードする配列 のワクシニアウィルス（ＶＶ）による発現には、必然的に２つの段階が含まれる ： １）コードする配列がＶｖプロモーターにそろえて配列されて、ＶＶ　ＤＮＡの 非必須セグメントに挿入され、適当な細菌プラスミド中にクローン化されなけれ ばならない； ２）コードする配列の両側に位置するＶＶ　ＤＮＡ配列は該プラスミドとウィル スゲノムとの間の生体内相同組換えを可能とするものでなければならない；二重 相互組換え事象はプラスミドからウィルスゲノムへのＤＮＡ挿入部の転移をきた し、該挿入部は該ウィルスゲノム中で増殖し、発現される〔パニカリ（Ｐａｎｉ ｃａｌｉ）とバオレツティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）　、１９８２年；マケット（Ｍ ａｃｋｅｔｔ　）ら、１９８２年；スミス（Ｓｍｉｔｈ　）ら、１９８３年：バ ニカリ　（Ｐａｎｉｃａｌりら、１９８３年〕。

当然のことながら、このタイプのベクターの使用はしばしばベクターウィルスの ゲノムの部分的欠失を伴う。

本発明は、より詳しくは、少なくとも以下を含有するウィルスベクターに関する ものであるニーベクターウィルスのゲノムの一部、 −エイズ原因ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子、及び 一細胞内でのこの蛋白質の発現に必要な諸要素。

本発明はまた、該ウィルスベクターに対応する組換えＤＮＡに関するものでもあ る。

「エイズ原因ウィルス」とは、とりわけＬＡＶウィルスまたはＨＴＬＶ−１１１ １またはＡＲＶウィルス、これらウィルスの可能性ある黒変異体または部分欠失 体、並びに関連ウィルスを意味するものである。

ベクターウィルス（エイズ原因ウィルスとは異なる）のゲノムに相当する部分で は、ウィルスベクターは、任意の起源のウィルスのゲノムから形成されていてよ い。

しかしながら、ポックスウィルスのゲノムの一部を用いるのが好ましく、ワクシ ニア遺伝子の一部を用いるのが特に好ましい。

ワクシニアウィルスでの異種蛋白質の発現に必要な条件は上記した通りである。

一般的にいえば、問題の遺伝子、例えばＦ蛋白質が発現されるためには、これが ワクシニア遺伝子のプロモーターの制御下になければならないのであろう；この プロモーターはワクシニアの７．５に蛋白質プロモーターとするのが通常であろ う。さらに、コードする配列はワクシニアの非必須遺伝子の中に挿入されなけれ ばならないであろう；該遺伝子は、適切であれば、マーカー遺伝子として役立ち うるであろうものであり、大抵の場合、ＴＫ遺伝子ということになるであろう。

自然のままのＦ蛋白質は分泌シグナルをもたず、グリコジル化されていない。発 現生成物の免疫原性を向上させるためのこの遺伝子の修飾をここに提案する。

Ｆ遺伝子を修飾して、細胞外への分泌が行われるよう、さらに、第三の構成とし て、該蛋白質が膜内に係留（アンカリング）されるようにすることを提案する。

この目的のため、異種ウィルス由来のシグナル配列、たとえば狂犬病ウィルス糖 蛋白質のシグナル配列を付加することによって、蛋白質のＮＨ２を末端をコード する部分のレベルで遺伝子を修飾することができる。これにより、蛋白質の細胞 からの分泌が可能となるであろう。

その他のウィルス蛋白質から誘かれたシグナル配列も用い得ることを容易に理解 されよう。

最後に、蛋白質の免疫原性の点から、該蛋白質が細胞膜内に係留され、宿主の免 疫系へ正確に提供されることが有利である。この理由から、上記構成（Ｆ十狂犬 病シグナル）から出発して、Ｆ蛋白質のＣ０ＯＨ末端をコードする部分のレベル で、狂犬病ウィルス糖蛋白質をコードする配列の場合と同様に、異種ウィルス由 来のトランスメンブレン部分をコードする配列を付加することを提案する。

本発明は、まず第一に、ＬＡＶウィルスのＦ遺伝子によりコードされる蛋白質を 細胞培養で得るためにウィルスベクターを使用することに関するものである。

従って、最初の段階は、本発明のウィルスベクターに感染した、またはその代り に対応する組換えＤＮＡを含有していてもよい、哺乳動物細胞を包含する；これ らの細胞の中では、とりわけヒト二倍体（ジブロイド）細胞、初代培養、またヴ エロ（Ｖｅｒｏ）細胞を挙げるべきであろう。当然のことながら、後記実施例に 実際に見られるように、他のタイプの細胞を導入することも可能である。

それにより得られた蛋白質は、精製後に、ワクチン製造のために使用できる。

ワクチン接種のために本発明のウィルスベクターを直接使用することを考慮して もよく、その場合、Ｆ蛋白質はインシトウ（その場で）または生体内で生産され る。

本発明はまた、上記Ｆ蛋白質に対して産生された抗体に関するものであり、これ ら抗体は、生物体を上記ウィルスベクターに感染させ、一定時間後に誘発抗体を 回収することによって得られる。

最後に、本発明は、上記Ｆ蛋白質に対して産生された抗体の検出に、また患者か ら採取した生物学的試料の中にそれら抗体を検出することに基いて試験管内で患 者のエイズを検知できる対応する診断法に関するものである。

Ｆ蛋白質の取得のために用いる技法、細胞培養技法及び予防接種技法は、既知の ワクチンについて現在行われているものと同じであり、ここで詳細に述べること はしない。

以下に記載の方法及び実施例を参照すれば、より容易に本発明を理解できるであ ろう。

以下の図面は実施例を図示したものである：第１図は、組換え体ＶＶ、ＴＧ、Ｆ ＬＡＶ、１１４７及びＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５１：よッテ合成され、抗 ＬＡＶ血清によって免疫沈降させられた蛋白質に対するツニカマイシンの作用を 示す；この図において、分子量はキロドルトン単位で表わされており、記号は次 のものを表わす： Ｐ：細胞ベレット Ｓ：上澄み 一：処理なしに得られた生成物 ＋：ツニカマイシン処理後に得られた生成物１　：ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１ ４５２：ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４７ ３：野生型ワクシニアウィルス； 第２図は、組換えウィルスＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡｖ、１１４５によって合成された Ｆ蛋白質を認識する能力について抗ＬＡＶ血清をスクリーニングした結果を示す ；分子量はキロドルトン単位で表わされており、記号は次のものを表わす： ０：野生型ワクシニアウィルス ｌ　：ＶＶ、’ｒＧ、ＦＬＡＶ、１１４５、クローンＣ２：ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡ Ｖ、１１４５、クローンロー：陰性対照血清 ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ：エイズ患者の血清；第３図は、組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＦＬ ＡＶ、１１４７によって合成された蛋白質の免疫沈降を示す；この図での記号は 次のものを表わす１ １：野生型ワクシニアウィルス ２：ＶＶ、’ｒｃ、ＦＬＡＶ、１１４７ａ、３５ＳによるＢＨＫ２１細胞のラベ リングｂ：３２ＰＯ４によるＢＨＫ２１細胞のラベリングｃ：（３Ｈ）ミリスチ ン酸によるＢＨＫ２１細胞のラベリング 分子量はドルトン単位で表わされている；第４図は３２ｐ□Ｌによるラベリング 後のワクシニア組換え体感染ＢＨＫ２１細胞の抽出物の免疫沈降を示す；この図 での記号は次のものを表わすニ ー　：　ＴＰＡを添加しないでの免疫沈降子：　ＴＰＡを添加しての免疫沈降 Ｐ：細胞ベレット Ｓ：培養上澄み 分子量はドルトン単位で表わされている；第５図は、組換えウィルスＶＶ、ＴＧ 、ＦＬＡＶ、１１６５によって合成され、〔３５Ｓ〕メチオニンによってラベル された蛋白質の免疫沈降を示す：この図での記号は次のものを表わす： １　：ＶＶ、’ｒＧ、ＦＬＡＶ、１１４５感染細胞２：ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、 １１６５感染細胞３：ＶＶ、”ｒｃｙ、ＦＬＡＶ、１１４７感染細胞分子量の単 位はキロドルトンである； 第６ａ及び６ｂ図は、組換えウィルス接種マウスの抗体の、大腸菌中で生産され 、ニトロセルロース上へ移されたＦ蛋白質に対しての反応を示す； 第６ａ図において、ストリップ１及び３は野生型ワクシニアウィルスに対応し、 ストリップ２．４．５．８．９ｔｉウィルスＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５１ ：対応し、ストリップ６．７．８．１１．１２はＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４ ７に対応し、ストリップ１３．１４．１５ｃ：ｉつ（／ｌｚスｖｖ、ＴＧ、ＦＬ ＡＶ、１１４６１：対応する；第６ｂ図において、ストリップ１．２は野生型ワ クシニアウィルスに対応し、ストリップ３はウィルスＶｖ。

ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４６に対応し、ストリップ４はウィｈスＶＶ、ＴＧ、ＦＬ ＡＶ、１１４７１：対応し、ストリップ５．６．７．８はウィルスＶＶ、ＴＧ、 ＦＬＡＶ。

１１６５に対応する。

年 １９８３年由来の方法 ワクシニアへの伝達：キーニ（Ｋｉｅｎｙ　）ら、１９８４年。唯一の相違：ヒ ト１４３Ｂ細胞をＬＭＴＫ−細胞の代りに使用する。

保存ウィルスの調製 「無菌の」ニワトリ初代細胞に０．０１ｐｆｕ／細胞で４日間、温度３７℃で感 染させる（ＭＥＭ培地＋５％上記保存ウィルスを２５０Ｏｒｐｍで１５分間遠心 分離する（　５ｏｒｖａ　Ｉ　ＩローターＧＳＡ）。上澄みを一方へとっておく 。ペレットをＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，４，１０ｍＭ　Ｋ ＣＩ、１ｍＭＭｇＣｌ２）中４℃で１５分間処理する。この懸濁液をボッター（ Ｐｏｔｔｅｒ）中で磨砕し、次いで２５０Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離する。上 澄みを上記の上澄みに加え、２回目の磨砕を同様にして行う。

全ての上澄みを、３６％（Ｗ／　Ｖ　）スクロースクッション（１０ｍＭ）リス 、ｐＨ８）１０ｆｌｔＱの上に置く。

１４０００ｒｐｍで２時間遠心分離を行う（ベックマンローター５Ｗ２８）。

ペレットをとり、分散させ、再び第二の同一クッションの上に置く。第二のペレ ットをＰＢ８５ｍＱ中にとり、２０〜４０％スクロース勾配（１０ｍＭ）リス、 ｐＨ８）上にのせる（同じローター）。１２０００ｒｐｍで４５分間遠心分離す る。

ウィルスのバンドを回収する。これを、２００００ｒｐｍで１時間遠心してペレ ットとする。ペレットを１０ｍＭ）リス、ｐＨ８へとる。

免疫沈降 ＢＨＫ２１細胞の感染（直径３ｃｍのディツシュ、細胞１０８個／ディツシュ、 Ｇ−ＭＥＭ＋１０％ＦＣ８中で培養）は、０，２ｐｆｕ／細胞で１８時間行う。

培地をデカントし、ディツシュ当りメチオニン不含培地１１１ｉ２及び［３５Ｓ ）メチオニン（５ｍ　Ｃｉ　／　３００　ｔｔ　Ｑ　）アマ−ジャム（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ）　１０　ｕ　Ｑで置換える。

過剰の非放射性メチオニンを２時間後に加える。

ラベリングが完了すると、感染細胞をかき取り、エッペンドルフ遠心機中で１分 間遠心分離し、上澄みとベレット画分とを分離し、ペレットをＰＢＳ緩衝液で１ 回洗い、次にゲル中で免疫沈降を行う〔ラテ（Ｌａｔｈｅ　）ら、１９８０年に 従う〕。

ツニカマイシン存在下に合成された蛋白質の免疫沈降上記のようにＢＨＫ２１細 胞を感染させた後、培地１戒当り１．５μｇのツニカマイシンを１８時間後に１ 時間にわたり加える。

次に培地をデカントし、ツニカマイシン１．５μｇを含有するメチオニン不含Ｍ 　Ｅ　Ｍｌ　ｍＱと（３５Ｓ）メチオニン（アマ−ジャム）１０μＱとで置換え る。その後の操作は上と同様に行う。

エンド−Ｆ処理 ラベルされた蛋白質をエイズ患者血清で免疫沈降させた後、蛋白質Ａ−セファロ ース画分を ０．２Ｍリン酸Ｎａ、ｐＨ６，１ ０，０５％５ＤＳ ０．１％ノニデットＰ４０ ０．１％β７メルカブトエタノール ０．１％ＥＤＴＡ、ｐＨ８ にとり、５分間煮沸して、蛋白質を変性させる。

１ｍｌ当り４単位のエンド−Ｆと共に３７℃で２０時間インキニベーションを行 い、次に、水中で、１１５容の１００％ＴＣＡで２分間沈澱させる。ベレットを ８０％アセトンで３回洗い、試料緩衝液を加え、混合物をＳＤＳゲルに付す。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によるワクシニア抗体のアッセイ９６個の平底穴をもつプレー ト（ヌンク）を、炭酸緩衝液中野生型ワクシニアウィルス１０’ｐｆｕで３７℃ で１８時間インキュベートする。次にプレートを０．０１％ゼラチンで飽和させ る。次にマウス血清をプレートに吸着させ、残りのプロトコールは通常のＥＬＩ ＳＡ試験の場合と同様に行う。

４９２ｎｍで読み取りを行う。

実施例１ その後にそれを発現させるのに必要な諸要素を組合わせると、数ｋｂのオーダー の寸法となる。従って、必要な操作を容易にすべく、構築に用いる大腸菌内複製 用プラスミドの寸法を極小化することが必要であると判断された。

ＶＶゲノムのＨｉ　ｎｄｍ　（Ｈｉ　ｎ−Ｊ）断片は、チミジンキナーゼ（ＴＫ ）の完全な遺伝子を含んでおり、これはすでに先にｖＶゲノムへ挿入されたＤＮ Ａの交換及び組換えを可能ならしめるために利用されている〔マケット（Ｍａｃ ｋｅｔｔ　）ら、１９８２年〕。ＶＶゲノムのＴＫ遺伝子中への挿入断片の移入 によって選択可能なＴＫ欠損ウィルスが生じることは注記しておくべき重要な事 柄である。まず第一に、ＶＶＨｉｎ−Ｊ断片の組込みに用いうる単一のＨｉｎｄ ■部位をもった小型プラスミドを製出する必要があった。さらに、以後の操作が 可能となるよう、プラスミドの不必要な制限配列を除去することが必要であった 。

構築は、プラスミドｐＢＲ３２２から自然欠失によって導かれたベクターであっ て、１０８９番目と２４９１番目のヌクレオチドの間のセグメントが失われてい るプラスミドｐＭＬ２からスタートした〔ラスキー（Ｌｕｓｋｙ　）とボチャン （Ｂｏｔｃｈａｎ　）　）　ｏまず、ｐ　Ｍ　Ｌ　２の２個所のＡｈａｍ部位の 間にｐＵＣ８（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）とメリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　、 １９８２年〕のＡｈａｍ−Ａｈａ（Ｌａｔｈｅ　）ら、１９８４年〕を用いて、 このプラスミドこれによって、機能性のベーターラクタマーゼ遺伝子（アンピシ リン耐性を付与する）を有し、さらに、大腸菌中で活性な複製開始点ならびに単 一のＨｉｎｄｍ制限部位を含む２０４９塩基対のプラスミドに到達する。

この構築物をｐＴＧＩＨと名付けた。

ＴＫ遺伝子を有するＶＶ　ＤＮＡのＨｉｎ−Ｊ断片を前もってｐＢＲ３２７（ド リリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ）とスペーナ−（Ｓｐｅｈｎｅｒ　）　、１９８３ 年〕由来のベクター中にクローン化した。この４．６ｋｂ断片をｐＴＧＩＨの旦 ｉｎｄｍ部位に再クローン化した。ＴＫ遺伝子がアンピシリン耐性をコードする 遺伝子よりも遠位にあるクローンを選択した。

このｐＴＧＩＨ−ＴＫ構築物を以後の実験のベクターとして使用した。

の発現を制御するのに用いうるｖｖプロモーターを単離するものであった。７５ ００ドルトン（７，５Ｋ）の蛋白質をコードする初期遺伝子のプロモーターは同 じ目的ですでに成功裡に使用されており〔スミス（Ｓｍｉｔｈ　）ら、１９８３ 年〕、従ってこのセグメントの単離を行った。

７．５に遺伝子は、ｖｖのＷＲ型ゲノムの最も小さい５ａｌＩ断片（Ｓａｌ−３ 回片）の一つの上にある〔ペンカタザン（Ｖｅｎｋａｔａｓａｎ）ら、１９８１ 年〕。小さい断片は優先的にクローン化されるので、５ａｌＩ切断ｖＶタイプＷ ＲＤＮＡを直接プラスミドｐＢＲ３２２にクローン化して得られるクローンの多 くが５ａｌ−３回片をもっている。この断片を、５ａｌＩ消化及び再ライゲーシ ョンによってベクターバクテリオファージＭ１３ｍｐ７０１（キーニー（Ｋｉｅ ｎｙ　）ら、１９８３年〕へ移入した。これによりファージＭ１３ＴＧＳａｌ− ５が生じた。

このクローンでは、７．５に遺伝子の開始ＡＴＧのす流には、ベクター由来の各 車−のＢａｍＨＩ部位及び大腸菌ポリメラーゼのフレノウ断片を用いて埋めた後 、８ｇｌｎリンカ−５’　−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３’　を介しトする。同時に、 下流の５ａｌＩ（ＡｃｃＩ）部位が除、　かれ、従って上流の５ａｌＩ部位が唯 一のものとなる。

この構築物をＭ１３７Ｇ７．５にと呼ぶ。

ＶＶ　ＤＮＡのＨｉｎ−Ｊ断片内には、約３０塩基対を隔ててＣａｌＩ部位とＥ ｃｏＲＩ部位とがある〔ウェアー（Ｗｅｉｒ）とモス（Ｍｏｓｓ）　、１９８３ 年）。Ｍ１３７Ｇ７．５に中に存在する７、５にプロモーター断片をン化して、 ｐＴＧＩＨ−ＴＫ−Ｐ７．５Ｋを生ぜしめた。

この構築物により、Ｍ１３ベクターの各車−のＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲＩ部 位の７．５にプロモーター配列のすぐ下流への移転が果たされる。これら単一の ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位を次の構築に用いる。

バクテリアファージＭ１３ＴＧ１３１　（キーニー（Ｋｉｅｎｅｙ）ら、１９８ ３年〕のポリリンカーセグメントをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで切り出し、プラ スミドｐＴＧＩＨ−ＴＫ−Ｐ７．５にのＥｃｏＲＩ部位と１３ａｍＨ工部位との 間に挿入して、ｐＴＧ１８６−１）ＯＩ　Ｖを生ぜしめる。この構築物中には、 Ｐ７．５にの制御下に外来遺伝子をクローニングするのに用いうる各車−の制限 部位が５か所ある（ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、５ｓｔＩ、Ｆ配列を有するプラスミ ドの構築 まず、狂犬病ウィルス糖蛋白質のためのシグナル配列及びトランスメンブレン配 列に囲まれたＬＡＶのｅｎｖ遺伝子を、先に記載したプラスミド（ｐ　ＴＧ　１ １３４）に挿入した。プラスミドｐＴＧ１１３４のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をベ クターＭ１３ｍｐ７０１中に適切なオリエンテーションでクローン化する。生じ たバクテリオファージがＭ１３ＴＧ１６９である： （Ｒ８−狂犬病シグナル） （ＲＴＭ−狂犬病トランスメンブレン）Ｆ蛋白質をコードするゲノム断片は、ク ローン化され、先に記載したプロウィルスセグメントであるプラスミドｐＪ１９ −６のＢ　ａｍＨＩ／Ｈｉ　ｎ　ｄｍ消化によッテ得られる。

ｐＪ１９−６のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、狂ｎＩ部位とＨｉｎｄ■部 位で開いたベクターＭ　１３　Ｔ　Ｇ１６９中にクローン化する。次の配列の一 本鎖オリゴヌクレオチドによりＢａｍＨＩ部位をＫｐｎＩ部位に結合５’−（、 Ａ丁ＣＣ，ＴＡＣ−３’ 生じたバクテリオファージをＭ１３ＴＧ１７０と呼ぶ：Ｆ蛋白質をコードする配 列のみを切り出すことができるよう、オリゴヌクレオチドを用いた選択的変異誘 発により、翻訳開始ＡＴＧの上流にＢａｍＨＩ部位をつくり出す。

５”　ＧＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＴＡＡＧ　３’勤二ＨＥ 修復及び３２ｐ標識オリゴヌクレオチドによるプラークのスクリーニングの後、 ファージＭ１３７Ｇ１７３を単離する。これは、開始ＡＴＧの上流にＢａｍＨＩ が位置している点だけがファージＭ１３７Ｇ１７０と異なる。

この部位の導入により、Ｆ遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−８ｓｔＩ断片を、上述 した構築法によるｐＴＧ１８６−ｐｏｌｙのＢａｍＨＩ及び５ｓｔＩ部位で開い たところへクローン化することが可能になる。すでに述べたように、ワクシニア ウィルスでの異種蛋白質の発現には、コードする配列がワクシニアのプロモータ ー配列に揃えて整列されて、ワクシニアＤＮＡの非必須セグメントに挿入される ことを要する。両側に位置されることのＤＮＡは、コードする配列とそれに付随 するブト１モーターをワクシニアゲノムヘ転移させるところの二重相互組換えに よる生体内でワクシニアゲノムとの組換えを可能ならしめる。生じたプラスミド がプラスミドｐＴＧ１１４７である。

Ｆ遺伝子をコードする配列及び付随するプロモーターのワクシニアゲノムへの転 移は次のようにして達成されるニ スミス（Ｓｍｉｔｈ　）ら、１９８３年が記載している方策は、ＶＶ　ＴＫ遺遺 伝円内挿入断片を有するプラスミドと野生型ウィルスゲノムとの間で生体内交換 を行わせて、ウィルスが有するＴＫＫ伝子を不活化することに基いている。ＴＫ ’″ウィルスは、５−ブロモデオキシウリジン（５ＢＵＤＲ）存在下の細胞株（ ＴＫネガティブ）上へのブレーティングによって選択できる〔マケット（Ｍａｃ ｋｅｔｔ　）ら、１９８２年〕。チミジンキナーゼは５ＢＵＤＲをリン酸化して ５′−モノリン酸とし、これが次にトリリン酸に転化される。この化合物は低級 のｄＴＴＰアナログであり、ＤＮＡへのそれの組入れは、ウィルスの正常な発育 を妨げる。しかし、ＴＫ″″ウィルスはそのＤＮＡを正常に複製でき、ウィルス プラークを生じ、それらはやはりＴＫ″″の細胞株において容易に目で見ること ができる。

ワクシニアウィルスは、感染細胞の核におけるよりもむしろ細胞質内で増殖する 。そのため、宿主ＤＮＡの複製及び転写のための機構を利用することができず、 ヴイリオン（ウィルス粒子）がそのゲノムの発現のための諸成分をもつ必要があ る。精製されたＶＶ　ＤＮＡは非感染性である。

組換え体の産生には、関心の対象であるクローン化されたＤＮＡセグメントによ るトランスフェクションと同時に、ｖｖヴイリオンによる細胞感染を行うことが 必要である。しかしながら、組換え体の産生は、ＤＮＡによるトランスフェクシ ョンにコンピテントな細胞の小さな割合に限定される。そのため、非組換え体親 ウィルスによるバックグラウンドを少なくするために、間接的な「コンピテント 」法を採用することが必要であった。

これは、生きた感染性ウィルスとして、非許容温度の３９．５℃では増殖できな い温度感受性（ｔ　ｓ）のワクシニア変異体〔ドリリアン（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ） とスペーナ−（Ｓｐｅｈｎｅｒ　）　、１９８３年〕を用いることによって、達 成した。細胞を非許容条件下にｔｓ変異株に感染させ、野生型ウィルスのＤＮＡ でトランスフェクト（形質転換）するとき、ウィルスの増殖は、トランスフェク ションに対しコンピテントで、その中で野生型ＤＮＡとｔｓウィルスのゲノムと の間で組換えの起った細胞内でのみ、行われるであろう；他の細胞では、感染さ れているという事実にも拘らず、ウィルスは増殖しない。ｐＴＧ１１４７のごと きワクシニアＤＮＡ断片を含有する組換えプラスミドが、適切な濃度で野生型Ｄ ＮＡとともにトランスフェクション混合物中に含まれておれば、コンピテント細 胞中でのワクシニアＤＮＡとの同種（ホモロガス）組換えにそれを参加させるこ ともできる。

ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）の初代細胞の単層を３３℃でｖｖ−コペンハ ーゲンｔｓ７　（０，１ｐｆｕ／細胞）に感染させ、ｖＶ−コベンノ１−ゲン野 生型ウィルスのＤＮＡ　（５０ｎｇ／１０’細胞）と組換えプラスミド（５０ｎ ｇ／１０’細胞）とのリン酸カルシウム共沈物でトランスフェクトする。

ｔｓウィルスの生育を許容しない温度（３９，５℃）で２時間インキュベートし たのち、細胞を再び３９．５℃で４８８時間インキュベートる。ｔｓ＋ウィルス の稀釈液を用いて１４３Ｂ−ＴＫ″″ヒト細胞の単層を３７℃で再感染処理し、 次にそれら細胞を５ＢＵＤＲ（１５０μｇ／−）の存在下にインキュベートする 。組換えプラスミドを受け入れたこれらの細胞からは種々のＴＫ−ウィルスのプ ラークが得られるのに対しプラスミドのない対象培養は目に見えるプラークを示 さない。つぎに、ＴＫ−ウィルスを、５ＢＵＤＲの存在下での２回目の選択によ ってサブクローン化する。

ハイブリッドプラスミドｐＴＧ１１４７とｖｖゲノムとの間で正しい二重相互組 換えが起ると、挿入断片含有ＴＫＫ伝子とウィルスのＴＫＫ伝子との交換が起り 、組換え体はそれによりＴＫ−となる。

ＮＡ断片をサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　１９７５年）記載の技法に従ってニ トロセルロースフィルター上へ移す。つぎに、フィルターを３２ｐと共にニック 翻訳したプラスミドｐＴＧ１１４７とハイブリダイズする。フィルターを洗った 後、これをフルオログラフィーに付すと、ワクシニアウィルスがＬＡＶのＦ遺伝 子を組込んでおれば、オートラジオグラフ上に３．８５．２．９及び０．８ｋｂ のバンドが見える。これら組換え体の−っＶＶ、ＴＧ。

ＦＬＡＶ、１１４７を次の研究のために選んだ。

実施例４ 組換えワタシニアーＬＡＶウィルスを用いて合成されたＦ蛋白質 ハイブリッドワクシニアウィルスを用いてＬＡＶのＦ遺伝子の発現を証明するた めに、Ｇ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地＋１０％ウシ胎児血清中で培養したＢＨＫ２１鰯歯 類細胞を該ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４７組換え体に感染させる。

新鮮な半コンフルエントな単層（１０６細胞）を０．２ｐｆｕ／細胞で感染させ 、１８時間インキュベートする。

つぎに、培地を除いた後、メチオニン含量の低い、（３５Ｓ）メチオニン（５ｍ Ｃｉ／３００．ｃｌ）１０μＱ／ｍＱを添加した培地を加える（細胞１０”個当 り１−）。細胞を３７℃でインキュベートし、ラベルされた蛋白質を遠心分離に より集める。ベレットと上澄みとに分離した後、蛋白質をエイズ患者の血清とと もにインキュベートする。血清と反応する蛋白質を蛋白質Ａ−セファロース樹脂 に吸着させて回収し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって展開し、 ラテ（Ｌａｔｈｅ　）ら、１９８０年）記載の手法に従ってオートラジオグラフ ィーを行う。オートラジオグラフは、エイズ患者のい（つかの血清が感染細胞抽 出物の２種の蛋白質と特異的に結合することを示す。２５．５及び２７ＫＤとい う見掛は分子量が、Ｆ蛋白質の基準調製品中のエイズ患者血清により同定された Ｆ蛋白質とＬＡＶウィルス感染細胞抽出物中のそれとが同等であることを示唆す る。

Ｆをコードする配列は約２３ＫＤの一次翻訳産物をもたらすが、上記方法で得ら れるＦ蛋白質は２５ＫＤと２７ＫＤとの間の見掛は分子量をもつ。この不均一性 は、修飾（アシル化）及び／又はＦの翻訳開始に２か所のＡＴＧが使われうろこ とに帰すことができよう。

プラスミドｐＴＧ１１４５は、蛋白質のＮＨ２末端をコードする部分が狂犬病糖 蛋白質シグナル配列と同調しているＦ遺伝子を含有する。先に記載のファージＭ １３７Ｇ１７０から構築物を誘導する。

Ｆ遺伝子の５′部分、を、オリゴヌクレオチド誘発欠失により狂犬病糖蛋白質シ グナル配列と同調させる。

狂犬病糖蛋白質の最初の４つのアミノ酸を、シグナルペプチドの良好な切断を促 進するために残しておく。

５°シ蛍ｔ１迦注曳、Ｆ　Ｇユ江１ヨ拒≧３゜ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　’ｒＴ ＣＣＣＴ　Ａ？ｒ　ＧＧＴ　ＧＧＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＴＣＡ　ＡＡＡループ生成 のために用いるオリゴヌクレオチドは次の配列をもつ： ５’　ＴＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＴＡ（、ＧＣＡＡ丁ＴＴＣＣ ＣＡＡＡ　３’これによりファージＭ１３７Ｇ１７１が得られる。Ｆ遺伝子と融 合した狂犬病糖蛋白質の狂犬病シグナル（Ｒ８）を次にプラスミドｐＴＧ１８６ −ｐｏ１ｙへ移す。

ｙの中へクローン化する。生じたプラスミドをｐＴＧ１１４５と呼ぶ。狂犬病シ グナルと融合したＦ遺伝子を上記の通りにしてワクシニアへ移す。

実施例６ ｐＴＧ１１４６の構築 このプラスミドでは、狂犬病糖蛋白質のトランスメンブレン領域（ＲＴＭ）をコ ードする配列がＦ遺伝子の末端と融合している。Ｆ遺伝子のＴＧＡ　（停止）コ ドンは、下記の配列のオリゴヌクレオチドにより生ぜしめられた欠失ループの中 に含まれる： ５’　ＴＧ（ＡＣＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡ ＣＴＣ３’懲兜±吏坦兜モ１９戸兜虱止ｌ二と出 これによりファージＭ１３　Ｔ　Ｇ　１７２が得られる。

上流が狂犬病シグナル、下流が狂犬病トランスメンブレン部分と融合したＦ遺伝 子をプラスミドｐＴＧ１８６−ｐｏｌｙへ移す。

ｐｏｌｙの中へクローン化し、プラスミドｐＴＧ１１４６を生ぜしめる。

実施例７ ｍ換え’ｙイにス部ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５及び１１４６により合成さ れた蛋白質の免疫沈降プラスミドｐＴＧ１１４７について上記したと同様にして 、上記のようにして調製した他のプラスミドに対応するハイブリッドワクシニア ベクターを得る。

これらウィルスベクターを夫々 ＶＶ−ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５ ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４６ と呼ぶこととする。

上記と同様にして得た蛋白質を免疫沈降によって試験する（第１図）。ＶＶ、Ｔ Ｇ、ＦＬＡＶ、１１４５の生産物で得られた免疫沈降物は、見掛は分子量が２８ ＫＤの領域にある蛋白質を示している。培養上澄み中に存在することが証明され る蛋白質はより大きい見掛は分子量をもつ。Ｆ遺伝子産物が効果的に培養上澄み 中へ分泌されるようである。

オートラジオグラフィーのシグナルの拡散した姿がグリコジル化のあることを示 唆しているので、ツニカマイシン存在下で〔３５Ｓ〕メチオニンによるラベリン グの操作を行った。ツニカマイシンの存在下では、先に観察したよりも明らかに 小さい見掛は分子量２６ＫＤの蛋白質が得られる。このことは、ウィルスＶＶ、 ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５の生産物がグリコジル化されていることを示す。シグ ナルペプチドの存在及びＮ−グリコジル化可能部位の存在が、Ｆ蛋白質のグリコ ジル化をもたらしたのである。グリコジル化された蛋白質とグリコジル化されて いない蛋白質の分子量の差が２ＫＤであるので、２個のグリコジル化可能部位の うちの一つのみが使われているようである。

’フィルスＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４７を用いてテ行った同じ実験は、この ウィルスの生産物がグリコジル化されていないことを示している。

ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４６の生産物を用いて得た免疫沈降物は、先に観察 したよりも大きい（３４ＫＤ）見掛は分子量をもつ蛋白質を明らかにしている。

この結果は、Ｆ遺伝子が、トランスメンブレン部を含めた狂犬病糖蛋白質の末端 部と融合していることから、予期できた結果である。

ツニカマイシン存在下での（３５３）メチオニンによルラヘリンクニヨッテ、Ｖ Ｖ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４６の生産物がグリコジル化されていることも証明さ れた。

観察サレタ分泌は、ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５の場合より少なく、該蛋白 質が実際に細胞表面に係留されていることを示している。

このことは、先に記載の手法に従っての免疫蛍光抗体法によって確認される。細 胞の表面が、陰性対照に比して、明確に蛍光を発して見え、細胞表面にＦ蛋白質 の存在することを証明している。

’フィルスＶＶ、　Ｔｃ、ＦＬＡＶ、１１４５．１１４６及７週令の雄性Ｂａ１ ｂ／ｃ及びＣ５７／Ｂ　１マウスに、ｆ）イルスＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶを、１匹 当り５Ｘ１０７ｐｆｕを皮下注射又は２Ｘ１０７ｐｆｕを尾のつけ根を乱切して 適用することにより、接種する。２週間後にマウスに同用量をブースター注射し 、ブースタ一時及びその２週間後及び４週間後に採血する。それらの血清につき 、ＬＡＶウィルス及びワクシニアウィルスの抗原決定基に対する抗体が存在する かどうかを試験する。

接種した動物の全てが、ＥＬＩＳＡ法でワクシニアウィルスと反応しうる血清を 与える。

免疫沈降法又は「ウェスタンブロッティング」法を用いた。これらの方法は、電 気泳動ゲル中のＳＤＳにより変性された又は未変性の、ニトロセルロース膜へ移 されたＬＡＶの蛋白質と反応しうる抗体を証明することを可能ならしめる。この 実験では、使用するニトロセルロース膜は、既知の手法に従ってＬＡＶウィルス 感染細胞抽出物中に存在する蛋白質の転移によって得る。これらの膜を切断して ストリップとし、各ストリップを接種マウスの血清（１／２０に稀釈）と共にイ ンキュベートする。

１２５　ｌ−標識蛋白質Ａにより、マウス抗体に結合したＬＡＶウィルス蛋白質 を可視化できる。

ＬＡＶウィルスに感染した細胞の抽出物を［３５Ｓ）メチオニンでラベルして、 免疫沈降実験に用いた。

いくつかの血清が、Ｆ蛋白質に相当する分子量約２７ＫＤの蛋白質と特異的に反 応する。

ユニのマウスの血清が、「ウェスタンプロティング」において、膜に結合するＬ ＡＶウィルス製剤の未同定蛋白質に相当するシグナルを生じることを注記してお くべＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５７組換え体に感染したＢＨＫ２１細胞が、 天然のＦ蛋白質に類似した蛋白質を発現させ、それがＳＤＳポリアクリルアミド ゲル電気泳動で見掛は分子量２５ＫＤ及び２７ＫＤの２つの形をとることが示さ れた（第３図）。

野生型ＨＩＶ感染細胞により合成されたＦ蛋白質はミリスチル化される〔アラン （Ａｌｌａｎ　）ら、１９８５年〕ので、類似の翻訳後修飾があるかどうかを、 トリチウム化ミリスチン酸によるラベリングによって、組換えウィルスにより合 成された分子について調べた。

ＢＨＫ２１細胞（１０８個／ディツシュ）を組換えつィルスに（０，２ｐｆｕ／ 細胞で）感染させる；感染から１２時間後に、１００μＣｆ／ｍＱ（７）（’　 Ｈ）　ミ’）スｆ〕−（アマ−ジャム）を５　ｍ　Ｍピルビン酸ナトリウム添加 ｔ；　−１Ｍ培地溶液に加える。４時間のインキュベーションの後、ラベルされ た蛋白質を回収し、エイズ患者血清を用いて免疫沈降させる。抗体と反応した蛋 白質を蛋白リアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。

ゲルのオートラジオグラフィーによって、見掛は分子量２５ＫＤの形のものだけ がミリスチル化されることがわかる。２７ＫＤのものは見られない（第３図）。

従って、組換えワクシニアウィルスによるＦ蛋白質の発現は、ＨＩＶウィルスに より合成される天然分子のそれに似た分子のミリスチル化を達成することを可能 にする。

ミリステートは多分、他のミリスチル化蛋白質について観察されているように〔 グールド（Ｇｏｕｌｄ　）ら、１９８５年〕、細胞内膜中での分子の付着の原因 となっているのであろう。

Ｎ末端部の配列及びＥＧＦレセプターの膜に近い細胞質内部分の配列の比較 ＦＨＩＶ−１、ｐｐ６０ｓｒ（：及びＥＧＦ　ｒ　ｅ　ｃの蛋白質キナーゼＣに よるリン酸化の部位を矢印で示す。

Ｍｙｒ＝ミリスチン酸；　ｔｍ−ＥＧＦ　ｒ　ｅ　ｃ蛋白質のトランスメンブレ ン部分 実施例１０ Ｆ蛋白質のリン酸化 Ｆ蛋白質はミリスチル化され（実施例９）、かくして他の膜蛋白質と接触して膜 内に係留される。Ｆとやはりミリスチル化される蛋白質ｐｐ６０ｓｒｃ　［グー ルド（Ｇｏｕｌｄ）ら、１９８５年〕との間に、またＥＧＦリセブタ−〔ウルリ ヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ　）ら、１９８４年〕の膜に近い細胞質内部分との間に配列 の類似性がある（第１表）。

後者の膜蛋白質は膜に近い部位で蛋白質キナーゼＣによりリン酸化されるので、 Ｆの場合にその様な修飾があるという可能性を調べた。Ｆのスレオニン１５の所 に蛋白質キナーゼＣによるリン酸化の為のコンセンサス配列が実際に存在する〔 ウッドゲット（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ）ら、１９８６年〕。

ＢＨＫ２１細胞（１０８個／デ４”、ｐ　シニ）　をＶＶ、ＴＧ、１１４７組換 え体（０，１ｐｆｕ／細胞）に感染させる；感染から１２時間後に、リン酸不含 ＭＥＭ培地中に３２ｐＱ、（アマ−ジャム）１００μｍＣｉ／ｍＱを加える。４ 時間のインキュベーションの後、実施例４と同様にして免疫沈降とゲル電気泳動 を行う。

第３図は、ミリスチル化される２５ＫＤ蛋白質がリンク酸化をも受けることを示 している。この蛋白質は２つのバンドに分れる：　Ｐ２５−１及びＰ２５−２゜ ホルボールエステルの１２−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（Ｔ 　Ｐ　Ａ）を免疫沈降の１０分前に培地に加えると、Ｐ２５−１ではリン酸化の 極めて顕著な増加が観察される。これは、活性がＴＰＡによって極めて強く増強 される蛋白質キナーゼＣによるリン酸化と一致する（第４図）。

ＨＩＶの多くの単離株が、スレオニン１５がアラニンで置換されたＦ遺伝子をも つ〔ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、１９８５年）。そのような単離株のＦ蛋白質 は従って理論的にはリン酸化されえない。この点を確認するために、１５位にア ラニンをもつＦ蛋白質を発現する組換え体を構築した。

Ｐ２５−２は、スレオニン１５以外のアミノ酸がリン酸化されたＦの形態か、又 はＦで免疫沈降された細胞蛋白質に相当するものであろう。

実施例１１ プラスミドｐＴＧ１１９１の構築 ６由来のＦ遺伝子を含有するが、そこでは１５位のスレオニンがアラニンにより 置換されている。構築物は上記のファージＭ１３ＴＧ１７０から導かれる（実施 例２）。

スレオニン−アラニン変異は、次の配列のオリゴヌクレオチドを用いて達成する ： ５’　ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣ，ＧＡ（、ＣＣＣＡＴＣＣ３’これにより ファージＭ１３７Ｇ１１５１を得る。次に、Ｆ−Ａｌａ遺伝子をプラスミドｐＴ Ｇ１８６−ｐｏｌｙへ移入する。このためには、Ｍ１３７Ｇ１１５１（７）Ｂａ 。

ｍＨＩ−３ｓｔＩ断片を、同部位で開いたｐＴＧ１８６−ｐｏｌｙの中へクロー ン化する。生じたプラスミドをｐＴＧ１１９１と呼ぶ。Ｆ−Ａｌａ遺伝子のワク シニアヘの移入は前記の通りに行う。

プラスミドｐＴＧ１１４７について上述したと同様にして、ウィルスベクターＶ Ｖ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１９１を得る。

得られた蛋白質を、上述のように〔３５ｓ〕メチオニンでラベルしたのち免疫沈 降させることによって調べる。

得られた、ＳＤＳ上に可視化された蛋白質は、ＶＶ、　Ｔ（、、ＦＬＡＶ、１１ ４５７組換え体により誘発されたもの（図示されていない）と同一である。

上述のように３２ｐ（ＩＬを用いてラベリングを行うと、ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ 、１１４７組換体により誘発されたＰ２５−１の形はもはや見られない。さらに 、培地へのＴＰＡの添加はＰ２５−２体のリン酸化を修飾しない（第４図）。

これらの結果は、蛋白質キナーゼＣによるリン酸化の部位がスレオニン１５であ ることを示している。若干の単離法のＦ蛋白質がＰＫＣによってリン酸化されえ ないという事実は、これらの単離法が異なる生物学的活性を持つことを意味して いるのかもしれない。実際、ＰＫＣによるリン酸化は通常それの基質の活性の調 節をなしている〔ニシヅカ（Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ　）　、１９８６年のレビニー 参照〕。

実施例１３ プラスミドｐＴＧ１１６５の構築 Ｆ蛋白質の免疫原生は、Ｆ蛋白質のＣ末端を疎水性領域に結合するとき、増大す ることが示された（ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５６組換え体）。しかしなが ら、蛋白質のコンホメーションは、陽性血清個体の抗体によるそれの認識が極め て悪かったので、正しくないことが明らかであった。従って、Ｎ末端が疎水性ペ プチドに結合しているＦ蛋白質を発現する組換えウィルスの構築を企てた。すな わち、該ペプチドは、細胞膜内での蛋白質の係留をより確保しながら、ミリスチ ン酸の役割を果たすものである。この組換え体は、上述の組換え体ｖｖ。

ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５から構築した。従って、本実施例は、未修飾Ｆ蛋白質 よりも免疫原性の高い、天然の蛋白質に類似のコンホメーションをもつＦ蛋白質 を発現するウィルスベクターの使用に関するものである。

かくして、プラスミドｐＴＧ１１６５は、蛋白質のＮＨ２末端をコードする部分 が狂犬病糖蛋白質のシグナル配列と同調されているＦ遺伝子を含有し、該シグナ ル配列は、疎水性シグナルペプチドとＦ蛋白質との間の生体内での切断が起きな いように変異されているものである。構築物は、上述のファージＭ１３ＴＧ１７ １（実施例５）から誘導する。

切断部位は、シグナルペプチドの末端グリシンと狂犬病糖蛋白質のＮ末端リジン との間にある。切断が起きないようにするため、切断部位から−１の位置のグリ シンをトリプトファンに、−２のフェニルアラニンをイソロイシンに、−５のプ ロリンをロイシンに変異させた。これらの変異は、次の配列をもつオリゴヌクレ オチドを用いて実施した： ５”　ＡＧＩ：、ＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡ、へＡｃ、ｘｃＡ′ＡｒＡｃＡＡＡ、 ｘＡｃｃｘｃ　３′これによりファージＭ１３７Ｇ１１０７が得られる。

Ｆ遺伝子と融合した狂犬病糖蛋白質の変異シグナル配列を次にプラスミドｐＴＧ １８６−ｐｏ　１　ｙへ移す。

このためには、Ｍ１３ＴＧ１１０７のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を、ＰｓｔＩ部位 で開いたｐＴＧ１８６　１）Ｏｌｙの中へクローン化する。生じたプラスミドを ｐＴＧ１１６５とよぶ。変異狂犬病シグナル配列と融合したＦ遺伝子を、上記と 同様にして、ワクシニアへ移す。

実施例１４ 組換えウィル７、ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１６５１：より合成された蛋白質の 免疫沈降 プラスミドｐＴＧ１１４７について述べたと同様にして、プラスミドｐＴＧ１１ ６５に対応する組換えワクシニアウィルスＶＶ、’ｒＧ、ＦＬＡＶ、１１６５を 得る。

上述と同様にして得た蛋白質を免疫沈降によって試験する（第５図）。

ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１４５の生産物を用いて得た免疫沈降物は、見掛は分 子量２６０００ドルトンの蛋白質を明らかにしている。培養上澄み中には該蛋白 質は存在しない。ツニカマイシン存在下で（３５Ｓｌメチオニンラベリングの操 作をすると、得られる蛋白質がグリコジル化されないことが示される。

実施例１５ ’フィルスＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１６５接種マウスにおける抗Ｆ抗体の証明 ７週令の雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、実施例８で述べたようにして、尾の基部を 乱切して接種する。抗体の検出は「ウェスタンブロッティングｊ法に依り行う。

大腸菌中で生産されたＦ蛋白質をニトロセルロース上へ移し、ストリップ片に切 り、接種動物の血清と共にインキュベートする（第６ａ図）。組換え体ＶＶ、Ｔ Ｇ、ＦＬＡＶ。

１１６５で観察される反応は、組換え体ＶＶ、　ＴＧ、　ＦＬＡＶ−１１４５７ の場合の約３〜５倍強く、組換え体ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１９６のそれと同 等である（第６ｂ図）。しかし、ＶＶ、ＴＧ、ＦＬＡＶ、１１６５組換え体を使 用する方法が、合成される蛋白質が陽性血清個体の抗体によって完全に認識され 、従ってそのコンホメーションが正しいゆえに、好ましい。ＶＶ、ＴＧ。

ＦＬＡＶ、１１６５組換え体はＦ蛋白質に対するワクチンとして最良の候補であ ると思われる。

本発明を代表する株の寄託： ファージＭ１３ｍｐ７０１及びプラスミドｐＴ０１１３４は、１９８６年４月８ 日付特許出願第８６１０５０４３号中に記載されている。

プラスミドｐＪ１９−６は、１９８４年１１月１６日に、パスツール研究所の国 立微生物培養コレクションにＮｏ、３６６−Ｉとして寄託され、英国特許第８４ ／２９０９９号中に記載されている。

次の菌株は、１９８６年６月６日にパスツール研究所の国立微生物培養に寄託さ れたニ ーｐＴＧ１１４７形質転換大腸菌、Ｎｏ、　Ｉ　−５６１゜参照文献 １、アラン、ジェイ、ニス、（Ａ１１ａｎ、Ｊ、Ｓ、）　、−ｙリガン。

ジニイ、イー＋　（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｊ、Ｅ、）、　？クレーン、エム。

エフ、（Ｍｃｌａｎｅ、Ｍ、Ｆ、）　、カンキ、ビー、ジエイ。

（Ｋａｎｋｉ、Ｐ、Ｊ、）、グループマン、ジエイ、イー。

（Ｇｒｏｏｐｍａｎ、Ｊ、Ｅ、）　、エセツクス、エム、　（Ｅｓｓｅｘ、Ｍ、 ）。

サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３０，８１０−８１３　（１９８５）２、オ ーフレイ、シー、（Ａｕｆｆｒａｙ、Ｃ，）、Ｃ，Ｒ，Ａｅａｄ、　Ｓｃ。

Ｐａｒｉｓ、３０２（８）、シリーズ１１１．２８７−２９２　（１９８Ｂ）３ 、アリア、ケイ、ニス、　（Ａｒｙａ、に、Ｓ、）、ギヤ口、アール。

シー、　（Ｇａｌｉｏ、Ｒ，Ｃ，）、ブロシーデインダス　オブ　ザナショナル 　アカデミ−オブ　サイエンス　オブザ　ユナイテッド　スティン　オブ　アメ リカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８３．２ ２０９−２２１３（１９８Ｂ）４、ドリリアン、アール、（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、 Ｒ，）　、スベーナー。

ディー、（Ｓｐｅｈｎｅｒ、Ｄ、）、ヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。

Ｌ３Ｌ、３８５−３９３　（１９８３）。

５、グールド、ケイ、エル、　（Ｇｏｕｌｄ、に、Ｌ、）−ウッドゲット、ジエ イ、アール、　（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ｊ、Ｒ，）　、クーパー。

ジエイ、エイ、（Ｃｏｏｐｅｒ、Ｊ、Ａ、）　、バス、ジエイ、イー。

（Ｂｕｓｓ、Ｊ、Ｅ、）　、シャロウエイ、ディ、エフ。

（Ｓｈａｌｌｏｗａｙ、Ｄ、Ｆ、）、　ハンター、テ＜、　（Ｈｕｎｔｅｒ、Ｔ 、）　。

セル（Ｃｅｌｌ）　、４２，８４９−８５７　（１９８５）６、ギアデ、エム、 　（Ｇｕｙａｄｅｒ、Ｍ、）、ゲルノー、エム。

（Ｇｕｅｒｎｅａｕ、Ｍ、）　、　ソニーゴ、ビー、（Ｓｏｎｉｇｏ、Ｐ、）　 、　クラヴエル、エフ、　（Ｃ１ａｖｅ１．Ｆ、）　、モンタニエ、エル。

（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、）　、アロシン、エム、　（Ａｌｏｚｏｎ、Ｍ、 ）　。

ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、　３２８　、８８２−８６９０９８７）７、 キーニー、エム、ビー、　（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）、ラテ、アール、（Ｌａｔ ｈｅ、Ｒ，）、ルコック、ジエイ、ビー、（ｔ、ｅｃｏｃｑ。

Ｊ、Ｐ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、　２８．９１−９９　（１９８ｇ）８、キ ーニー、エム、ビー＋　（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）、ラテ、アール、（Ｌａｔｈ ｅ、Ｒ，）、ドリリアン、アール、（Ｄｒｉｌｌｆｅｎ　。

Ｒ，）　、　スペーナー、ディ、　（Ｓｐｅｈｎｅｒ、Ｄ、）、スコリー。

ニス、　（Ｓｋｏｒｙ、Ｓ、）、シュミット、ディ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｄ、）。

ヴイクター、ティ（Ｗｉｋｔｏｒ、Ｔ、）　、　コブロヴスキ、エイチ、　（Ｋ ｏｐｒｏｖｓｋｉ、Ｈ，）、ルＤ−／り、ジエイ、ピー。

（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２，１６３−１６６（ １９８４）９、ラテ、アール、（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）、　ハース、ビー（Ｈｉｒ ｔｈ。

Ｐ、）、デヴイルト、エム、　（Ｄｅｖｉｌｄｅ、Ｍ、）、　ハーフオード、エ フ、（Ｈａｒｆｏｒｄ、Ｎ、）、ルコツク、ジエイ、ピー。

（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、　Ｎａｔｕｒｅ、２８４．４７３−４７４　（ １９８０）１０、ラテ、アール、　（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）、キーニー、エム、ビ ー。

（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）、シュミット、ディ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｄ、）、　力 一チス、ピー（Ｃｕｒｔｉｓ、Ｐ、）　、ルコツク、ジエイ、ピー。

（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、 、　２，３３１−３４２スコリー、ニス、（Ｓｋｏｒｙ、Ｓ、）、ルコツク、ジ エイ、ピー、（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、ディエフエイ　（ＤＮＡ）、３゜ １２、ラスキー、エム、　（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ、）、ボチャン、エム。

（Ｂｏｔｃｈａｎ、Ｍ、）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３．７９−８１　（１９５ １）１８、マケット、エム、　（Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ、）、スミス、ジー、エル 、　（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｌ、）、モス、ビー、　（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　、　Ｐｒ ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９．７４１５−７４１９　（ １９８２）１４、　マニアナイス、ティ、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）　、フ リツチュ。

イー、エフ、　（Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、）、サムプルツク、ジエイ。

（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、）　、コールド　スプリング　／Ｘ−ノく一ラボラト リー、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ、　、　Ｎ 、Ｙ、） １５、ミュー’）ング、エム、エイ、（Ｍｕｅｓｌｎｇ、Ｍ、Ａ、）＋　スミス 、ディ、エイチ、　（Ｓ＋ｇｉｔｈ、Ｄ、Ｈ，）、カブラデラ、シー。

ディ、　（Ｃａｂｒａｄｉｌｌａ、Ｃ，Ｄ、）　、ベントン、シー、ケイ。

（Ｂｅｎｔｏｎ　、　Ｃ，Ｖ、）　、ラスキー、エル、エイ、（Ｌａｓｋｙ。

Ｌ、Ａ、）　、カポン、ディ、ジエイ、　（Ｃａｐｏｎ、Ｄ、Ｊ、）。

Ｎａｔｕｒｅ、３１３，４５０−４５８　（１９８５）１Ｂ、メッシング（Ｍｅ ｓｓｌｎｇ）　、ヴイエラス（Ｖｉｅｒａｓ）、　Ｇｅｎｅ。

１９．２６９−２７８　（１９ｇ２） １７、ニシズカ、ワイ、（Ｎｓｈｉｚｕｋａ、Ｙ、）、５ｃｊｅｎｃｅ、２３３ ，３０５−１８、パニカリ、ディ＋　（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ、）　、バオレッ テイ。

イー、　（Ｐｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７９．４９２７−４９３１　（１９ｇ２）１９、バニカリ、ディ、　（Ｐａｎｉ ｅａｌｉ、Ｄ、）　、デイヴイス、ニス、ダブリュ、（Ｄａｖｉｓ、Ｓ、Ｗ、） 、ワインバーグ、アール。

エル、　（′ｖＪｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ，Ｌ、）　、パオレッテイ、イー。

（Ｐｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、　８０゜２０、ラトナー、エル、　（Ｒａｔｎｅｒ、Ｌ、）　、　ヘイ ゼルタイン。

ダブリュ、　（Ｈａｓｅｌｔｌｎｅ、Ｗ、）、バターカ、アール。

（Ｐａｔａｒｃａ、Ｒ，）、リヴ７　ツク、ケイ、ジエイ、　（Ｌｉｖａｋ。

Ｋ、Ｊ、）　、スターチッヒ、ビー、　（Ｓｔａｒｃｉｃｈｉ、Ｂ、）、　ジョ セフス、ニス、エフ、（Ｊｏｓｅｐｈｓ、Ｓ、Ｆ、）、トラン、イー。

アール、　（Ｄｏｒａｎ、Ｅ、Ｒ，）＋　ラフアルスキ、ジエイ、エイ。

（Ｒａｆａｌｓｋｉ、Ｊ、Ａ、）　、ホワイトホーン、イー、エイ。

（Ｗｈｊｔｅｈｏｒｎ、　Ｅ、Ａ、）　、バウマイスター、ケイ。

（Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ、に、）　、イワノフ、エル、（ｉｖａｎｏｆｆ、Ｌ、 ）。

ペターウェイ　ジニニア、ニス、アール、（ＰｅｔｔｅｒνａｙＪｒ、、Ｓ、Ｒ ，）、ピアソン、エム、エル、（Ｐｅａｓｏｎ、Ｍ、Ｌ、）　。

ラウテンバーガー、ジエイ、エイ、　（Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｊ。

Ａ、）、ババス、ティ、ニス、（Ｐａｐａｓ、Ｔ、Ｓ、）、　グライエフ、ジエ イ、（Ｇｈｒａｙｅｂ、Ｊ、）、チャン、エフ。ティ。

（Ｃｈａｎｇ、Ｎ、Ｔ、）、ギヤ口、アール、シー、（Ｇａｌｌｏ、Ｒ，Ｃ，） 。

ウオンースタール、エフ、　（Ｗｏｎｇ−ｓｔａｌｌ、Ｆ、）　＊　Ｎａｔｕｒ ｅ。

影、３．２７７−２８４　（１９８５）２１、ラトナー、エル、　（Ｒａｔｎｅ ｒ、Ｌ、）　＊　ストラチッヒ、ビー、（Ｓｔｒａｃｉｃｈｉ、Ｂ、）、ジョセ フ、ニス、エフ。

（Ｊｏｓｅｐｈ、Ｓ、Ｆ、）　、　バーン、ビー、エイチ、（Ｈａｈｎ　、　Ｂ 。

Ｈｏ）、レディ、イー、ビー、　（Ｒｅｄｄｙ、Ｅ、Ｐ、）、リヴ７　ツク、ケ イ、ジエイ、　（Ｌｉｖａｋ、に、Ｊ、）、ペターウェイ、ニス、アール、（Ｐ ｅｔｔｅｒｗａｙ、Ｓ、Ｒ，）、ピアソン、エム、エル、　（Ｐｅａｓｏｎ、Ｍ 、Ｌ、）　、ヘイゼルタイン、ダブリュ、エイ（Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、ν、Ａ、 ）、アリア、ケイ、ニス、　（Ａｒｙａ、Ｋ。

Ｓ、）、ウオンースクール、エフ、　（Ｗｏｎｇ−ｓｔａｌｌ、Ｆ、）　。

ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒ ｃｈ）　、１３，８２１９−８２２９　（１９８５）２２、サンチェスーベスカ ドール（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ）等。

５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２７，４８４−４９２　（１９８５）２３、スミス、ジ ー、エル、（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｌ、）、　マツケト、エム、　（）ｌａｃｋｅｔ ｔ、Ｍ、）、モス、ビー、（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　、　Ｎａｔｕｒｅ。

都１２．４９０−４９５　（１９８３）２４、スミス、ジー、エル、　（Ｓｗｉ ｔｈ、Ｇ、Ｌ、）、マーフィ、ビー、アール、　（Ｍｕｒｐｈ）’、Ｂ、Ｒ，） 　、モス、ビー、　（Ｍｏｓｓ　。

Ｂ、）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０．７ １５５−７１５９２５、ウルリッヒ（ＵＩ　Ｉｒ１ｃｈ）等、　Ｎａｔｕｒｅ、 ３０９．４１８−４２５２６、ヴエンカテサン、ニス、（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ 、Ｓ、）　、バルーディ、ビー、エム、　（Ｂａｒｏｕｄｙ、Ｂ、Ｍ、）、モス 、ビー。

（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　、セル（Ｃｅｌｌ）、　１２５，８０５−８１３　（１９ ８５）２７、ウエインーポプリン、ニス、（Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、）、 ソニーゴ、ティ、　（Ｓｏｎｉｇｏ　、　Ｔ、）　、ダノス、オウ。

（Ｄａｎｏｓ、０．）、　コール、ニス、（Ｃｏｌｅ、Ｓ、）　、アリシン。

エム、　（Ａｌｉｚｏｎ、Ｍ、）　、　Ｃｅ１１．並、９−１７　（１９８５） ２８、ウェア、ジェイ、ピー、　（Ｗｅｉｒ、Ｊ、Ｐ、）　、モス、ビー。

（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　、ジャーナル　オブ　ヴイロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、’）、４６．５３０−５３７　（１９８３）２９、ウッドゲット、 ジエイ、アール、（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ｊ、Ｒ，）　。

グールド、ケイ、エル、　（Ｇｏｕｌｄ、に、Ｌ、）、　ハンター、ティ、　（ Ｈｕｎｔｅｒ・Ｔ、）、ユアロピアン　ジャーナル　オブバイオケミストリ−（ Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、）　４ｊｊ、　１７７−１８４３０、シラー 、エム、ジエイ、　（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ、Ｊ、）　、スミス。

エム、　（Ｓｗｉｔｈ、Ｍ、）＝　メソズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、　１００，４６８−５００　（１９ ８３）、　ｅｄ　Ｃｂａ ａ　ｂ　Ｃ 符表平１−５００９６２　（１６） 閤瞭謬査報告 −一一−−人一一一一一、ＰＣτ／ＦＲ００２１９

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも −ウィルスゲノムの一部、 −エイズ原因ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子及び −細胞中でのこの蛋白質の発現を行なう諸要素を含有するウィルスベクター。
2. （２）ウィルスゲノムの一部がボックスウィルスのゲノムの一部であることを特 徴とする請求の範囲第１項に記載のウィルスベクター。
3. （３）ボックスウィルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範 囲第２項に記載のウィルスベクター。
4. （４）異種ウィルス由来のシグナル配列及び／又はトランスメンブレン配列を含 有することを特徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のウィルスベク ター。
5. （５）異種ウィルス由来のシグナル配列及び／又はトランスメンブレン配列が狂 犬病ウィルスに由来することを特徴とする請求の範囲第４項に記載のウィルスベ クター。
6. （６）コードしている遺伝子が５′末端から一狂犬病ウィルスのＧ遺伝子のシグ ナル配列、−Ｆ遺伝子の全体、 −Ｇ遺伝子のトランスメンブレン（ＴＭ）領域を含有するＦ遺伝子全体であるこ とを特徴とする請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のウィルスベクター。
7. （７）Ｆ蛋白質をコードするＤＮＡ配列がボックスウィルス遺伝子のプロモータ ーの制御下にあることを特徴とする請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のウ ィルスベクター。
8. （８）プロモーターがワクシニア遺伝子のプロモーターであることを特徴とする 請求の範囲第７項に記載のウィルスベクター。
9. （９）Ｆ蛋白質をコードするＤＮＡ配列が、ワクシニアの７．５Ｋ蛋白質の遺伝 子のプロモーターにより制御されていることを特徴とする請求の範囲第８項に記 載のウィルスベクター。
10. （１０）Ｆ蛋白質をコードする配列がワクシニアのＴＫ遺伝子中にクローン化さ れていることを特徴とする請求の範囲第７〜９項のいずれかに記載のウィルスベ クター。
11. （１１）請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のウィルスベクターに対応す る組換えＤＮＡ。
12. （１２）請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のウィルスベクターに感染し た又は請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡを含有する哺乳動物細胞の培養物。
13. （１３）請求の範囲第１２項に記載の細胞を培養し、生産されたＦ蛋白質を回収 することを特徴とする、エイズ原因ウィルスのＦ蛋白質を製造する方法。
14. （１４）請求の範囲第１３項に記載の方法を実施することによって得られた、エ イズ原因ウィルスのＦ蛋白質。
15. （１５）狂犬病ウィルス糖蛋白質をさらに含有することを特徴とする請求の範囲 第１４項に記載の蛋白質。
16. （１６）Ｎ末端位に疎水性ペプチドをさらに含有することを特徴とする請求の範 囲第１４項に記載の蛋白質。
17. （１７）請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のウィルスベクター及び／又 は請求の範囲第１４〜１６項のいずれかに記載の蛋白質からなるワクチン。
18. （１８）請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のウィルスベクター又は請求 の範囲第１４〜１６項のいずれかに記載の蛋白質を生物体に接種し、生じた抗体 を一定の時間後に回収したことを特徴とする、エイズ原因ウィルスのＦ蛋白質に 対して生ぜしめた抗体。
19. （１９）エイズ患者から採取した生物学的試料中に請求の範囲第１８項に記載の 抗体の存在を証明することによる、エイズ患者の試験管内診断方法。