JPH03503639A - レトロウイルスｈｉｖのペプチドｐｆ１０〜ｐｆ１９、該ペプチドの合成方法、特に診断用としてのその使用 - Google Patents

レトロウイルスｈｉｖのペプチドｐｆ１０〜ｐｆ１９、該ペプチドの合成方法、特に診断用としてのその使用

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JPH03503639A
JPH03503639A JP1504146A JP50414689A JPH03503639A JP H03503639 A JPH03503639 A JP H03503639A JP 1504146 A JP1504146 A JP 1504146A JP 50414689 A JP50414689 A JP 50414689A JP H03503639 A JPH03503639 A JP H03503639A
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ロシヤ，エルベ
バラウイ，エル・ミユスターフア
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フエリ，ステフアンヌ
グラニエ，クロード
バン・リーシヨタン，ジユルフアール
サバテイエ，ジヨン‐マーク
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アンステイテユ・パストウール
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レロルス旧ｖへＰＦ１０〜ＰＦ１９へ ム　　　゛　　　、こ　ノ　　　　　し　　の　　の本発明は、リンパ節症候群 （ＬＡＳ）又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を人体に誘発することが可能 なレトロウィルスのＦタンパク質と共通の免疫学的特性、場合により免疫原性を 有するペプチドに係る。
今日までにＬＡＳ又はＡＩＤＳの発症に関与する種々のレトロウィルスが単離及 び同定されている。まずＬＡＹ−１又はＨＩＶ−１と呼称される最初のウィルス が単離され、英国特許出願第８３７２４８００号及び１９８４年９月１４日付は ヨーロッパ特許出願第８４／４０１８３４号に記載されている。このウィルスは Ｆ、　ＢａｒｒｅＳｉｎｏｕｓｓｉ他により５ｃｉｅｎｃｅ、　２２０　ｎ”　 ４５−９９．２０．８６８−８７１頁にも記載されている。
このウィルスＨＩＶ−１の変異株であるＬＡＶ　ＥＬＩ及びＬＡＶ　Ｍ＾Ｌも単 離、同定され、ヨーロッパ特許出願第８４／４０１８３０１８３４号に記載され ている。
別の類に属し且つ上記のレトロウィルスとの間に制限された免疫学的関係しかも たないレトロウィルスの単離及び同定は、ヨーロッパ特許出願第８７／４００１ ５１４号（公開明細書第２３９４２５号）に記載されている。これらのレトロウ ィルスは）ＩＩシー２の呼称のもとに分類され、リンパ節症又はＡＩＤＳの徴候 を示す複数のアフリカ人患者で単離された。
ヨーロッパ特許公開明細書第（１２２６５１３号の著者らは、ウィルスＨＩＶの ゲノムによりコードされ且つＭＨＣ抗原（自己主要組織適合複合体（ｓｅｌｆ　 ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘｅｓ＞の英 文略称）と共通のペプチド配列を有するペプチドの研究を行った。レトロウィル ス旧Ｖのこのような非特異的ペプチド配列は、ヨーロッパ特許公開明細書第０２ ２６５１３号によると、ＡＩＤＳに関与するウィルスと丁４リンパ球により担持 されるＴ４レセプタとの相互作用を抑制する能力があり、より一般的にいうなら ば、夫々マクロファージと補助Ｔリンパ球との相互作用と、これらの補助Ｔリン パ球とＢリンパ球との相互作用が通常クラス■の主要自己組織適合複合体（人体 におけるクラス■のＨＬ＾抗原）によりコードされるリンパ球レセプターにより 仲介されるとき、これらの相互作用に関して免疫調節効果を発揮する能力を有す る。
これらのレトロウィルスＨＩＶ−１及び旧Ｖ−２の研究の結果、それらの相補的 ＤＮＡ配列が得られ、その後、上記以外のタンハク質、特に文献Ｂｒｕｎｏ　Ｇ ｕｙ他、Ｎａｔｕｒｅ　１９８７．　ｖｏｌ、　３３゜ｐ、　２６６〜２６９に 記載のＨＩＶ−１のＦタンパク質をコードする特異的ヌクレオチド配列を同定す るに至った。
Ｆタンパク質は（ｐｒｏｔｌ！ｉｎ　Ｆ）、ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発すること が可能なレトロウィルスに感染した患者の血清に含まれる抗体、より特定的には このＦタンパク質に対する抗体に対して抗原性を有することが知られている。
本発明者らは、レトロウィルスＨＩＢ−１又はＨＩＶ−２の種々の単離様につい て検討した結果、Ｆタンパク質の既知の配列から選択した特定のペプチド配列が 上記レトロウィルスの一方による感染を検出するなめに特に有利であることを確 認した。
之　　　　レトロウィルスＨＩＶのこれらの特異的ペプチド配列は調節タンパク 質の類に属し、構造ウィルスタンパク質とは対照的に感染細胞により分泌される 。
し　　　　完全に有利なことに、本発明者らはＦタンパク質（ＰＦとも呼称する ）の特定のペプチドがウィルスによる感染の非常に早期に■■ｖ型のレトロウィ ルスにより感染した宿主で誘導される抗体により認識されるという事実に着目し た。
この知見は必要に応じて、このようなペプチドがクラス旧Ｖ−１又はＨＩＭ−２ のレトロウィルスによる人体感染を早期に検出するために有利であることを証明 するものである。
この見地から本発明は、ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発することが可能なレトロウィ ルスのＦタンパク質のペプチドに係り、該ペプチドはこのＦタンパク質と共通の 免疫学的特性を有しており、特にクラスｔ＋ｒｖ−ｉ又はクラス）ＩＩシー２の レトロウィルス旧Ｖに感染した宿主の生物学的サンプル〈特に組織又は体液）中 に存在するこのタンパク質に対する抗体により認識される能力を有する。
本発明は更に、免疫原性を有するが又はｉｎ　ｖｉｖｏで免疫原性を与えられ得 るレトロウィルス旧Ｖ−１又はＨＩＶ−２のＦタンパク質のペプチドにも係る。
本発明のペプチドは、所定のレトロウィルスのＦタンパク質の完全配列がら単離 するが、又は化学的合成により得られる。
第１図は一方がレトロウィルス旧Ｌ２、他方がレトロウィルスＩ（ＩＶ−１に対 応する２種の単離様のＦタンパク質のペプチド配列を示す、アミノ酸とその１文 字標記との対応は以下の通りである。
Ｈメチオニン Ｌ　　　ロイシン Ｄ　　　アスパラギン酸 Ｅ　　　グルタミン酸 Ｃシスティン −トリプトファン レトロウィルスの単離様がら場合によりアミノ酸連鎖の改変後に得られるか又は 合成により得られる本発明のペプチドは、クラスＨＩＶ−１のレトロウィルス及 び／又はクラスＨＩＶ−２のレトロウィルスのＦタンパク質の対応するペプチド 配列との間に、ウィルス旧Ｖ−１又はＨＩＶ−２の一方又は他方に感染した宿主 の生物学的媒体（特に血清）中で形成された抗体に対してこの配列の免疫学的特 性が維持されるように十分な配列関係又は（相同性）を有するように選択される 。
上記アミノ酸連鎖の改変は、ペプチドが決定されるレトロウィルス旧ＶのＦタン パク質のアミノ酸配列に対応するこの連鎖のＮ又はＣ末端位置に外因性システィ ン型のアミノ酸を加え、例えば輸送タンパク質にペプチドを特徴的（特異的）に 結合することにより実施される。
この点に関して、ＬＡＳ又は＾ＩＤＳを誘発し得るレトロウィルスの抗Ｆタンパ ク質抗体との間に免疫学的複合体を形成することが可能な本発明のペプチドは、 レトロウィルスＨＩＶのＦタンパク質の一部に対応するか又はレトロウィルスＨ ＩＶの抗Ｆタンパク質抗体により免疫学的に認識されるようなこの配列の変形に 対応する配列を形成する最大７０個のアミノ酸を含むことを特徴とする。
本発明の別の態様によると、ペプチドはレトロウィルスＢＩＶ−１又はｆｌＩＶ −２の一方又は他方により特異的に感染した宿主の抗Ｆタンパク質抗体により認 識される能力に応じて選択される。
本発明の第１のペプチドＰＦ１６（ＨＩＶ−１）！ｉ　式：％式％ （式中、−は最終ペプチドが上記レトロウィルスの一方による感染時に形成され る抗体により認識される能力を維持するように選択された可変アミノ酸を示し、 Ｘ基は遊離もしくは特に炭素原子数１〜５の１又は２個のアルキル基によりアミ ド基化したＭＨｚ基、又は１〜５個のアミノ酸を含み且つＮ末端アミノ酸がそれ 自体前記のような遊離もしくはアミド基化したＮＨ，基であるようなペプチド基 を表し、Ｚ基は遊離もしくはアルコキシル化され、したがって炭素原子数１〜５ のアルキル基を含むＯＨ基、又は１〜５個のアミノ酸を含み且つそのＣ末端アミ ノ酸がそれ自体前記のような遊離もしくはアルコキシル化したＯＨ基であるペプ チド基を表し、Ｘ又はＺ又はその両方に場合により含まれる１〜５個のアミノ酸 の基及び−に置換するアミノ酸は、それらの存在が形成されるペプチドの免疫学 的特性、場合により免疫原性、特にレトロウィルスＨＩＶ−１のＦタンパク質に 対する抗体、より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体を含むヒト血 清により認識される能力に不適合ではないように選択される）の全部又は一部に より表されることを特徴とする。
上記構造に対応する好適なペプチドを以下に挙げる。
ＸＧＭＤＤＰＥＲＥＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬＡＦＨＨＶＡＲＥＬＨＰＥＹＦＫＮＣ ＺＸｆｌ：ＭＥＤＡＥＫＥＶＬＶＷＲＦＤＳＫＬＡＦＨＨＭＡＲＥＬＨＰＥＹＹ ＫＤＣＺＸにＭＥＤＡＥＲＥＶＬＫＷＫＦＤＳＳＬＡＬＲ）ＩＲＡＲＥＱＨＰＥ ＹＹＫＤＣＺχＧＭＥＤＰＥＲＱＶＬＫＷＲＦＮＳＲＬＡＦＥＨＫＡＲＥＭＨＰ ＥＦＹＫＮＺ特に好適なペプチドは次のアミノ酸連鎖により与えられる。
にＭＤＤ　Ｐ　ＥＲＥ　Ｖ　ＬＥＷＲＦ　Ｄ　ＳＲＬＡＦ　ＨＨＶ　ＡＲＥＬＨ Ｐ　ＥＹＦ　Ｋ　ＮＣＧＭＥＤＡＥＫＥＶＬＶＩＩＩＲＦＤＳＫＬＡＦＩＩＨＭ ＾ＲＥＬＩＩＰＥＹＹＫＤＣＧＭＥＤＡＥＲＥＶＬＫＩＩＩＫＦＤＳＳＬＡＬＲ ＨＲＡＲＥＱＨＰＥＹＹにＤＣＧＭＥＤＰＥＲＱＶＬＫＩＩＩＲＦＮＳＲＬＡＦ ＥＨＫＡＲＥＭＨＰＥＦＹＫＮレトロウィルスＨＩＶ−１により感染したヒト血 清に含まれるＦタンパク質に対する抗体との間に免疫学的複合体を形成する能力 により特徴付けられる本発明に包含されるＦタンパク質に属する他のペプチドは 以下のペプチドである。
ＰＦＩＩ：　ＸＣＧＫＷＳＫＳＳＶＶＧＩＩＩＰＴＶＲＥＲＭＲＲＡＥＰＡＡＤ ＧＶＧＡＹＣＺＰＦ１２：　ＸＧＧＫＨＳＫＳＳＶＶ（ＨＰＴＶＲＥＲＭＲＲＡ ＥＰＡＡＤＧＶＩ；ＡＡＳＲＤＬＥＫＢＧ＾ＩＴＳＳＮＴ＾ＡＴＮＡＡＣＡＷＬ ＥＡＱＥＥＥＥＶにＺＰＦ１３：　　ＸＡＳＲＤＬＥＫＩＩにＡＩＴＳＳＮＴ＾ ＾ＴＮ＾＾ＣＡＭＬＥＡＱＥＥＥＥＺＰＦ１４：　　ＸＣＶＧＦＰＶＴＰＱＶＰ ＬＲＰＭＴＹＫ＾ＡＶＤＬＳＨＦＬＫＥＫＧＣＬＥにＬＩＨＳＱＲＲＱＤＩＺ ＰＦ１５：　　ＸＣにＹＦＰＤＷＱＮＹＴＰＧＰＣＶＲＹＰＬＴＦＩＪＣＹＫＬ ＶＰＶＥＰＤＫＶＥＥＡＮＫＧＥＮＴＳＬＬＨＰＶＺ ＰＦ１７：　　ＸＣＹＫＬＶＰＶＥＰＤＫＶＥＥＡＮＫＧＥＮＴＳＬＬＨＰＶＳ ＬＨＧＮＤＤＰＥＲＥＶＬＥＩＩＲＦＤＳＲＬＡＦＨＨＶＡＲＥＬＨＰＥＹＦＫ ＮＣＺＰＦ１８：　　ＸＣＫＧにＬＥＧＬＩＨＳＱＲＲＱＤＩＬＤＬＭＩＹＩ（ ＴＱにＹＦＰＤＺ本発明は更に、上記と同一のアミノ酸配列を有していながら、 所定のシスティン基のレベルにアセトアミノメチル（ａｃｅ）保護基を含むペプ チド： ＰＦＩＩ：　　ＸＧにＩＩＩｓＫｓｓＶＶＧＨＰＴＶＲＥＲＭＲＲＡＥＰＡＡＤ ＣＶにＡＹＣ（ａｅｍ）ＺＰＦ１２：　ＸＧＩ：ＫＨＳＫＳＳＶＶＧＭＰＴＶＲ ＥＲＭＲＲＡＥＰＡＡＤＧＶＧＡＡＳＲＤＬＥＫＨＧＡＩＴＳＳＮＴ＾＾ＴＮ＾ ＾Ｃ（ｉｃｅ）＾ＩＩＩＬＥＡＱＥＥＥＥＶＧＺＰＦ１３：　　ＸＡＳＲＤＬＥ ＫＨに＾ＩＴＳＳＮＴ＾＾ＴＮ＾＾Ｃ（ａｃ−）＾ＩＩＩＬＥＡＱＥＥＥＥＺＰ Ｆ１４：　ＸＣ（ａｃｅ）ＶＧＦＰＶＴＰＱＶＰＬＲＰＭＴＹＫＡＡＶＤＬＳＨ ＦＬＫＥＫＧＧＬＥＧＬＩＨＳＱＲＲＱＤＩＬＺ ＰＦ１５：　　ＸＣＧＹＦＰＤＮＱＮＹＴＰＧＰにＶＲＹＰＬＴＦＧＨＣ（ａｅ ｍ）ＹＫＬＶＰＶＥＰＤＫＶＥＥＡＮにＧＥＮＴＳＬＬＩＩＰＶＺ ＰＦ１７：　　ＸＣ（ａｅｍ）ＹＫＬＶＰＶＥＰＤＫＶＥＥＡＮＫＧＥＮＴＳＬ ＬＨＰＶＳＬＨにＭＤＤＰＥＲＥＶＬＥＷＲＦＤＳＲＬＡＦＨＨＶＡＲＥＬ）Ｉ ＰＥＹＦＫＮｃ（ｔｅＩＩ）ＺＰＦ１８　二　ＸＣ（ａｃｅ）ＫＧにＬＥ［；Ｌ ＩＨＳＱＲＲＱＤＩＬＤＬＷＩＹＩ（ＴＱＧＹＦＰＤＺにも係る。
本発明は更に、レトロウィルスＨＩＶ−１により感染したヒト血清中に存在する Ｆタンパク質に対する抗体に対して免疫学的特性を維持するという条件下でこれ らのペプチドの変異体も包含する。これらのペプチドの変異体はより特定的には 、上記ペプチドを第３図に示すＨＩＶ−１の他の単離様に対応するペプチドの変 異体と整合させることにより得られるペプチドである。
この第３図は、ＡＩＤＳのウィルスの４種の単離様に関するＦタンパク質の配列 の整合を示す、単離様ＬＡＶ、、ｕを基準とし、ＡＲＶ２、ＬＡｖ、ｌＡＬ及び ＬＡｖつＬｌｌニラテはＬＡＶ、Ｒ，、との相異ノミを示した。
本発明は更に、上記外因性システィン型のアミノ酸を欠失しており且つ結合の必 要のために化学的合成時に加えることが可能であった上記ペプチドにも係る。
−は整合に導入された欠失に対応する。
本発明の他のペプチドはクラス旧Ｖ−２のレトロウィルスにより感染した宿主で 形成された抗体により認識され得、次の配列ＰＦＩＯ： ＸＫＦｌｌ［ＩＰＩＩＧＥＴＬＶＷＥＦＩ）ＰＬＩ、ＡＹＳＹＥＡＦＩＲＹＰＥ ＥＦＧ）ＩＫＺ（式中Ｘ及びＺは、ペプチドがレトロウィルス１（ＩＶ−２のＦ タンパク質に対する抗体、より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体 を含むヒト血清により認識される能力を維持できるように選択するという条件下 で上記と同義である）と共通の免疫学的特性、場合により免疫原性を有すること を特徴とする。
レトロウィルスＨＩＶ−２により感染した宿主で形成される抗体により認識され 得る本発明の別のペプチドは、次の配列ＰＦ１９　： ＸＣＲＧ［；ＬＥＧＭＦＹＳＥＲＲｆ（ＫＩＬＮＩＹＬＥＫＥＥＧｒｌＡＤＺ又 は配列： ＸＣ（ａｃＩＩ）ＲＧＧＬＥＧＭＦＹＳＥＲＲＨＫＩＬＮＩＹＬＥＫＥＥＩ；Ｉ ＩＡＤＺ（式中Ｘ及びＺは、ペプチドがレトロウィルスＨＩＶ−２のＦタンパク 質に対する抗体、より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体を含むヒ ト血清により認識される能力を維持できるように選択するという条件下で上記と 同義である）と共通の免疫学的特性、場合により免疫原性を有することを特徴と する。
本発明ペプチドの組成について記載される種々のアミノ酸配列の他の改変、場合 により所定のアミノ酸のレベルにおける欠失は、形成される改変配列が生物学的 媒体、特にＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発し得るレトロウィルスによる感染後のヒト 血清中に存在する該当ペプチドの一方又は他方に対する単一特異性抗体により認 識される能力を維持する限り、予想することができる。
形成される最小寸法の配列がレトロウィルスＨＩＶのＦタンパク質に対する抗体 に対して免疫学的特性、場合により免疫原性を維持する限りにおいて、特に上記 ペプチドの一部のみを使用することができる。
本発明は更に、上記ペプチドの少なくとも２Ｍの混合物を含むことを特徴とする 組成物にも係る。このような組成物は、レトロウィルスＨＩＶ（特にＨＩＶ−１ 又は旧ｖ−２）による感染後にＦタンパク質又はＦタンパク質の一部、特に組成 物中に場合により存在するペプチドフラグメントに対して形成される抗体を被験 生物学的サンプル中で検出するために使用可能である。
本発明はこの点において、１（ＩＶ型のレトロウィルスにょる感染の非特異的診 断用組成物に係る。このような組成物は、ペプチドＰＦＩＯ〜ＰＦ１９又はＦタ ンパク質もしくは抗体の誘導源となるペプチドに対して形成された抗体により認 識される能力を有するこれらのペプチドの変異体がら選択される少なくとも２種 の異なるペプチドの混合物を含む。
本発明は更に、ヒトレトロウィルス）ＩＩＶ−１又はＨＩＶ−２による感染の特 異的診断を可能にする組成物であって、検出しようとする感染に関与するウィル スのＦタンパク質の配列を有するか、又は該ウィルスによる感染後に形成される 抗体により認識される特性を有するという条件下で上記から選択される少なくと も２種の異なるペプチドを含む組成物に係る。
１（ＩＶ−１による感染の特異的診断用の具体的な組成物は、ペプチドＰＦＩＩ 〜ＰＦ１８又は上記に規定したような変異体から選択される少なくとも２種の異 なるペプチドを含む。
本発明の特に有利な態様によると、 −例えばＰＦ１５、ＰＦ１６及びＰＦ１７から選択されるＦタンパク質のＣ末端 領域の少なくとも１種のペプチドと、例えばＰＦＩＩ、ＰＦ１２及びＰＦ１３か ら選択されるＦのＮ末端領域で選択される少なくとも１種のペプチド、 −少なくともペプチドＰＦ１２とＰＦ１７、−少なくともペプチドＰＦ１２とＰ Ｆ１６、及び場合によりＰＦ１７、−少なくともペプチドＰＦＩＩとＰＦ１７、 及び場合によりＰＦ１６、−少なくともペプチドＰＦ１３とＰＦ１７及び／又は ＰＦ１６、あるいは抗体検出に有利な他の全組み合わせ から成る混合物を含む組成物を挙げることができる。
本発明は更に、上記規定の範囲で上記種々のペプチドの全体の混合物を含む組成 物にも係る。
本発明の特定の態様によると、クラスＨＩＶ−１のレトロウィルスにより感染し たヒト血清中に存在する抗体により認識されることが可能な混合物で上記ペプチ ドＰＦＩＩ〜ＰＦ１８のいくつかを使用することができる。
別の態様によると、レトロウィルスＨＩＶ−２により感染したヒト血清中に存在 する抗体により認識されることが可能なペプチドＰＦＩＯ及びＰＦ１９の混合物 を使用する。
更に、ＨＩＶ−１型のレトロウィルスに対する抗体により認識されるペプチドと 、ＩＩＩＶ−２型のレトロウィルスにより認識されるペプチドとの混合物を使用 することもできる。
本発明は更に、このようなペプチドを単独で含むか又は、ＬＡＳ又はＡＩＤＳを 誘発することが可能なレトロウィルスのゲノムによりコードされる他のタンパク 質又はペプチドとの混合物としてこのようなペプチドを含む組成物、及び生物学 的サンプル中におけるＨＩＶ−１又は■ＩＶ−２型のレトロウィルスによる感染 のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法でのその使用にも係る。
本発明は更に、Ｆタンパク質の有利なペプチドの合成にも係る。
合成原理は例えば、ペプチド配列を結合させる固相と、溶媒及び試薬を含む液相 とを存在させることがら成る。各段階で、成長しつつあるペプチドと試薬との間 の分離は電縫な濾過及び洗浄により実施される。
まず最初に、反応基を担持する固体支持体は、ブロック（例えばｔ−ブチルオキ シカルボニルにより保護）したα−Ｎｈと共に導入したアミノ酸のカルボキシル と反応し、共有結合を形成する。（例えばトリフルオロ酢酸のような酸で洗浄す ることにより）アミン官能基の脱保護後、保護した第２のアミノ酸を導入し、結 合により最初のペプチド結合を形成する。配列の２番目のアミノアシルを供給す る第２のアミノ酸は、Ｃ末端アミノアシル残基がら連鎖の第１のＣ末端アミノ酸 の脱保護アミン官能基に結合する。好ましくは、この第２のアミノ酸のカルボニ ル官能基は例えばジシクロヘキシルカルボジイミドにより活性化される１反応、 脱保護及び結合から成る一連の操作により、合成はＣ末端残基からＮ末端残基に 向がって進行する。所望の配列が合成されたら、最初に形成されたペプチド−残 基結合の特異的切断反応により、ペプチドを固相から分離する。この合成の詳細 なプロトコルは実施例１に記載する。
以上の説明に従うペプチドの合成方法は次の段階、即ちａｌカルボキシル基と反 応し得る反応基を担持する固体支持体を、自己縮合を避けるために他のアミノ酸 との結合に介入する以前にアミン官能基のレベルで保護された被合成連鎖の第１ のＣ末端アミノ酸と接触させる段階と、ｂ／予め固定したアミノ酸のアミン官能 基を脱保護する段Ｃ／段Ｎｂ／から得たアミノ酸の脱保護アミン官能基を、アミ ン官能基のレベルで保護され且つ被合成ペプチドのＣ末端アミノアシル残基に結 合した第２のアミノアシル残基を供給する第２のアミノ酸のカルボキシル官能基 と結合する段階と、 ｄ／加えた第２のアミノ酸のアミン官能基を脱保護し、該ペプチドのＮ末端アミ ノアシル残基に到達するまで夫々連続的アミノアシル残基に対応するアミノ酸を 連続的に使用して結合段階Ｃ／及び脱保護段階ｄ／を繰り返す段階と、ｅ／　Ｎ 末端アミノ酸の導入後、合成されたペプチドを担持する固相を（特にフッ化水素 酸を用いて）処理することにより、形成されたペプチドを分離する段階と、ｆ／ 温溶液らペプチド配列を回収する段階とを含むことを特徴とする。
上記方法の１好適態様によると、脱保護段階ｂ／の後に、アミン官能基を求核性 にするための中和段階を実施する。
別の態様によると、段階Ｃ／から得られたペプチドの洗浄及び中和後に、結合剤 を用いて第２の結合段階を実施し、第１の結合時に反応しなかったアミン官能基 を反応させるようにしてもよい。
トリプトファン又はシスティンのような所定のアミノ酸については、反応基の脱 保護は夫々塩基を用いるか又は酢酸水銀処理により樹脂からペプチドを分離後に 得られる。
当然のことながら本発明のペプチドの合成方法は上記方法に限定されず、こうし て合成されるペプチド配列が所望の免疫学的特性を維持する限りにおいて全変形 を包含する。
ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ″（有機化学方法）Ｅ、　Ｗｕ ｎｓｃｈ編、ｖｏｌ、１５−１及び■９丁）ＩＩＥＭＥ、　５ｔｕｔｔ４ａｒｔ 　１９７４に記載されている均質溶液合成法を使用する。
この合成方法は所望の順序で連続的アミノアシルを２つずつ連続的に縮合するか 、又はアミノアシルと、予め形成され既に適当な順序で複数のアミノアシルを含 んでいるフラグメント、もしくはこうして予め形成された複数のフラグメントと を縮合することから成り、当然のことながら、ペプチド合成分野で周知の方法に 従い、これらのアミノアシル又はフラグメントにより担持される反応性官能基で あって、特にカルボキシル官能基の活性化後、ペプチド結合の形成に通常介入す ると思われる一方のアミン官能基と他方のカルボキシル官能基又は一方のカルボ キシル官能基と他方のアミン官能基とを除く全反応基を予め保護しておくように する。変形例によると、カルボジイミド型の慣用結合試薬（例えば１−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を使用することにより 結合反応を実施することもできる。使用されるアミノアシルが補助酸基を有する 場合（特にグルタミン酸の場合）、これらの官能基は例えばｔ−ブチルエステル 基により保護される。
本発明は更に、ＬＡＳ又は＾１０５を誘発し得るレトロウィルスによる感染のｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法にも係り、該方法は、ａ）ペプチドと抗体との免疫学的 複合体を形成することが可能な条件下で、本発明の少なくとも１種のペプチドを 、上記レトロウィルスＩ（ＩＶのＦタンパク質に対する抗体を含み得る被験生物 学的サンプルと接触させる段階と、ｂ）形成された免疫学的複合体を検出する段 階とを含むことを特徴とする。
ペプチド−抗体の免疫学的複合体を検出し、こうして怒つ　　染の診断を行うた めには、例えばラジオイムノアッセイを使用することができる。また、ＥＬＩＳ Ａ法のような酵素抗体法を使用することもできる。
ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発することが可能なレトロウィルスによる感染の検出試 験の第１の実施態様によると、抗Ｆタンパク質抗体の存在の診断を実施するなめ に使用されるペプチドはレトロウィルスＨＩＶ−１により特異的に認識される。
この検出試験の第２の実施態様によると、使用されるペプチドはレトロウィルス ＨＩＶ−２により特異的に認識される。
この試験の別の実施態様によると、レトロウィルス）ＩＩＶ−１のＦタンパク質 に対して形成された抗体を認識するペプチドと、レトロウィルス旧Ｖ−２のＦタ ンパク質に対して形成された抗体を認識するペプチドとの混合物を使用するよう に選択する。こうしてレトロウィルスＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の一方又は他方 による感染の非特異的診断を実施することができる。
診断を実施するためには、ペプチドをＥＬＩＳ＾プレートに固定すると有利であ る。
本発明は更に、Ｆタンパク質に対する単一特異性抗体を精製するためのＦタンパ ク質のペプチドの使用にも係る。
例えばアフィニティークロマトグラフィーによりこのような精製を実施するため には、次のように操作することができる。
一精製に使用されるペプチドを支持体に固定し、−ペプチド−抗体免疫学的複合 体の形成を可能にする条件下で、精製すべき抗体を含む溶液（該溶液はモノクロ ーナル抗体を含むポリクローナル血清又は上滑又は腹水であり得る）をこの支持 体上に通し、固定したペプチドに該抗体を接触させ、 一反応しなかった成分を除去し、 −Ｆタンパク質に対する単一特異性抗体を回収する。
本発明は更に、上記１又は複数のペプチドにより認識されることを特徴とする、 Ｆタンパク質に対する単一特異性抗体にも係る。
本発明は更に、上記ペプチドに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗 体にも係る。これらの抗ペプチド抗体はレトロウィルスＨＩＶのＦタンパク質の 存在を検出するために使用することができる。
本発明は更に、ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発することが可能なレトロウィルスによ る感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断用キットにも係り、該キットは、 一本発明のペプチド、又はこれらのペプチドの混合物と、−１又は複数のペプチ ドと生物学的サンプル中に場合により存在する抗体との間に免疫学的反応を形成 するのに適当な媒体、特に緩衝溶液を構成するための試薬と、−形成されたペプ チド−抗体複合体を検出するために該Ｉ又は複数のペプチドと反応し得る、場合 により標諏された１又は複数の試薬と、 一任意要素として、場合によりレトロウィルスＨＩＶに感染した人体に由来し且 つ該ペプチドを認識する抗体を欠失する生物学的媒体に類似する対照用生物学的 媒体（例えば血清）とを含むことを特徴とする。
被験生物学的サンプル中におけるＦタンパク質の存在を検出するために、診断用 試薬が本発明のペプチドに対する抗体により構成されるとき、検出用キットは、 −上記ペプチドの少なくとも１種に対する抗体と、−試薬の１又は複数の抗体と 生物学的サンプル中に場合により存在するＦタンパク質との間の免疫学的反応の 形成に適当な媒体、特にＭ＠温溶液構成するための試薬と、−形成された抗体− Ｆタンパク質複合体を検出するために１又は複数の抗体と反応し得る、場合によ り標識された１又は複数の試薬と、 一任意要素として、場合によりレトロウィルスＨＩＶに感染した人体に由来する 生物学的媒体に類似し且つ該抗体により認識されるＦタンパク質を欠失する対照 用生物学的媒体（例えば血清）とを含む。
ペプチドは、細胞膜を通ってペプチドを導入し、例えば血液中のペプチドの半減 期を増加できるように場合により改変後、レトロウィルスＨＩｖに起因する疾患 の治療に使用され得る０例えばミリスチル化又はペプチドＬからペプチドＤへの 転換のような改変を予想することができる。
更に、本発明のペプチドは免疫原性組成物で予防接種に使用され得る。
以下の実施例は、本発明のペプチドの合成、及びウィルスＨＩＶ−１により感染 していると認められるヒト血清に含まれる抗Ｆタンパク質抗体の存在の診断試験 における該ペプチドの使用を説明するものである。
他の特徴は図面にも示される。
ＬｌｆｉＪｉ　ｎ　■ｖ　−２ｃｒ）単離様ＲＯＤ、Ｐ及びＨＩＶ−１ノ単離株 ＬＡＶ、Ｐ４：：関するＦタンパク質のアミノ酸配列の整合を示す。
１ｉｌはアミノ酸の全体的導入収率と、固相合成（Ｈａｎｇ。
Ｓ、Ｓ、、　１９７２）により得られた生成物の純度との関係を示す。
１１１はレトロウィルスＨＩＶ−１の４種の単離様のＦタンパク質を示す。
１支ｌは単離様ＨＩＶ−Ｉ　ＢｒｕのＦタンパク質（ｎｅｆ）の−次構造を１文 字対応コードにより示す、化学的に合成したペプチド配列を矢印により示す。１ つのＨＩＶ株から別の株へのＦタンパク質の可変度は約２〜１７％であることが 認められる。
第］−は２種の陽性１１１Ｖヒト血清（曲線＾及びＢ）を用いた＋２５１　ｎｅ ｆの液相ラジオイムノアッセイを示す。”’Ｉ　ｎｅｆの結合曲線を血清の希釈 度の関数として与える。約１：２００及び１：５００の血清希釈度で５０％の結 合率が得られる　１２５Ｉｎｅｆの非特異的結合は２種の陰性ＨＩＶ血清（曲線 Ｃ及びＤ）を使用することにより評価される。
ＬＩＬは抗ｎｅｆ陽性ヒト血清（１：２００）を用いた＋２’Ｉ　ｎｅｔの液相 ラジオイムノアッセイを示す。”’Ｉ　ｎｅｆの結合特異性は、非放射性タンパ ク質ｎｅｆが抗ｎｅｆ抗体とタンパク質１２５■ｎｅｆとの結合を阻止する能力 により示される。タンパク質”’Ｉ　ｎｅｆと抗ｎｅｆ抗体との結合の５０％を 阻止する（即ちに、、５）ことが可能なｎｅｆの濃度は２．２ｘ　１０−’Ｈで ある。
え１ｊｌＪＬＬ ペブのム　　　　　び口 １／： 合成を行うために以下の条件、即ち 一液相の溶媒及び試薬に不溶性であり、−合成の試薬に対して不活性であり、 −撹拌及び濾過を行うために物理的に十分安定であり、−溶液反応に比較して過 度に大きな割合で反応速度を遅らさせないように試薬の良好な拡散を確保すると いう条件を満たすように、良好な固体支持体を選択する。
合成の必要のために２種の樹脂、即ち 一１％のジビニルベンゼンの存在下でスチレンの共重合により得られ、反応基と してベンジドリルアミン基（−０−ＣＨＯ−Ｎｌ２）を有しており、Ｏ２０鵠− ｏｌｅ　ＮＨ２／ＩＦ樹脂の置換度を有する樹脂と、 一反応基としてアミノメチル基（−ＣＩ＝−ＮＨｚ）を有する置換度０．５又は ０．７ｓｍｏｌｅ　ＮＨ２／ＩＦのマクロポーラスポリアクリルアミド樹脂を使 用した。
２／ア」−乙敢ｍ夏−： ａ／α−アミノ基の保護ニ アミノ酸の自己縮合反応を避けるために、付加したアミノ酸のα−Ｎ■２官能基 を保護した。この合成に使用した保護基は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３０ ％トリフルオロ酢酸（ＴＦ＾）により脱離したｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニ ル（Ｂｏｃ）である。
ｂ／側鎖官能基の保護： α−アミン官能基の一時的保護とは逆に、側鎖により担持される官能基は全合成 工程の間保護状態に維持されなければならず、したがって、保護は３０％丁Ｆ＾ 媒体中で安定でなければならない、また、該官能基は一般にペプチド−歿基結合 を切断するために使用される試薬であるフッ化水素酸により脱保護される。使用 されるアミノ酸に対応する種々の保護基を第１表に示す。
第１表：本　日のム　に　　されるアミノ　の　３　Ｆ　の保う３７犬ｔａＺ： ＭＥＲＲＩＦ　ＩＥＬＤにより記載されている一般方法に従い、合成装置（＾Ｐ ＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）ＰｅｐｔｉｄｅｓＳｙｎ　ｔｈ ｅｓ　１ｚｅｒモデル４３０＾）でペプチドの合成を自動的に行った。
４／　　の　　プロ　コル： 合成サイクルを実施するための実験プロトコルは以下の段階を含む。
ａ／−ミン　　　の　　テ 該脱保護は２分間の前処理２回と、それに続＜３０分間の３０％ＴＦ＾／ＣＨｚ Ｃｈ処理により得られる。使用される条件は通常、官能基α−ＮＨ，の保護基Ｂ ｏａを完全に除去するために十分で脱保護した生成物を２分間ＣＦＩ２ＣＩ２で ５回洗浄した。
Ｃ／−も扛 樹脂上のペプチドのアミンα−ＮＨ２を脱イオン化し、結合反応に関与できるよ うに求核性にするために必要な中和は、２分間の前処理２回と、それに続＜１０ 分間の５％ＤＩＥ＾／ＣＨ２Ｃｌ。
（ＤＩＥ＾はジインプロピルエチルアミンである）処理とにより得られる。
ｄ／−第」Ｊと１遣− 第１の結合はＣＬＣＩ２中過剰（３倍）のＢｏａアミノ酸（ａａ）及びジシクロ へキシルカルボジョージイミド（ＤＣＣ）中で実施される（２時間）、下記に示 す機序を有する結合時に、二次反応は溶媒の種類に依存する非反応性尿素誘導体 を与える。
この反応はジクロロメタン中ではかなり弱く、過剰の試薬（ＤＣＣ及びＢｏａ− ａａ）の使用により拮抗される。
アミノアシル樹脂 ジシクロヘキシル尿素 ジシクロへキシルカルバミドによる結合機序ｅ／−洗２ 反応生成物をＣＬＣｌｚで２分間５回洗う。
ｆ／−１虹扛 この新規中和を実施するためには、２分間の前処ＦＪＺ回と、それに続＜１０分 間の５％ＤＩＥ＾／ＣＨ２Ｃｌ２処理を行う。
この再中和により、最初の塩基処理で排出された筈であるーαアミンを活性化さ せることができる。
ｇ／−直重 生成物を２分子ｆｊｌ　ＣＨ２Ｃｌ　ｚで５回、２分間ジメチルホルムアミド（ ＤＮＦ）で１回洗う。
ｈ／−亀ユ！」１し この第２の結合は試薬としてＤＭＦ中１．５倍量のＢｏｃアミノ酸のベンゾトリ アゾールエステルを介入させる（１時間）。
Ｂｏａ（ａａ）のベンゾトリアゾールエステルはその場で次のように調製する。
一ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＤＣＣ及びヒドロキシベンゾトリアゾー ル（ＨＯＢｔ）の等分子混合物を調製し、０℃で１０分間インキュベートする　 ０次に、Ｂｏａアミノ酸を加え、０℃で１０分間反応を続ける。こうして形成さ れたＢｏａアミノ酸のベンゾトリアゾールエステルを反応容器に加える。
ｉ／−洗ｊＬ 生成物を再び２分間Ｃｆ１．Ｃ１，で５回洗浄した。
５／Δ　　　の　　　　　　： 合成は中間生成物の精製なしに行われるので、結合反応が完全になるように制御 することが不可欠である。第２図のグラフは、長い配列の合成のために完全な結 合を有することの重要性を示しており、実際に４０残基のペプチドを９８％の全 体く脱保護、中和及び結合）収率で合成するならば、所望のペプチド４６％とよ り短い種々のペプチド５４％とを含む混合物が得られる。収率が段階平均９９％ であるならば、完全ペプチドは６７％存在する。収率が９９．５％であるならば 、所望のペプチドは８２％を示し、より小さいペプチドの混合物は１８％に過ぎ ない。
結合の良好な実現を確認するためには、３種類の結合試験を実施することができ る。
一ニンヒドリン試験（Ｋａｉｓｅｒ他、１９７０）　、ペプチジル−樹脂のアリ コート部分（約１０ｚｇ）を分取し、小ガラス管中でエタノールで洗う、遠心分 離及びエタノール除去後、ニンヒドリン溶液を加え、５分間９５℃で反応させる 。
青着色の発色（陽性試験）は不完全な結合を意味する。樹脂の色が変わらないな らば、結合は少なくとも９９％行われている。
−フルオレサミン試験（Ｆｅｌｅｘ及びＪｉｍｅｎｅｚ、　１９７３）、ニンヒ ドリン試験よりもやや高感度であり、１％未溝の遊離ＮＨａを検出することがで きる。ペプチジル−樹脂のアリコート部分＜１０〜２０ｍｇ）をＤＣＭ、エタノ ール及びＤＩＥ＾の５％ＤＣＭ溶液で連続的に洗った後、フルオレサミンを加え る０反応は塩基媒体（ＤＩＥ＾５％）中で１０分間行う、洗浄及び乾燥後、波長 ３６６ｎｍのＵｖ灯で樹脂を観察する。蛍光の出現は遊離ＮＨ２の存在を意味す る。
一クロラニル試験（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、　１９７９）、任意のアミノ酸を プロリンに結合した後は、前記２種の試験は二次アミンの検出感度が低いので使 用することができない、そこでクロラニル（２，３，５，８−テトラクロロ−１ ，４−ベンゾキノン）を使用する。ペプチジル−樹脂のアリコート部分（５〜１ ０Ｂ）にアセトン２００ＩＩＮ及びクロラニルの飽和トルエン溶液５０ＩＪｆｆ ｉを加える。全体を５分間撹拌状態に維持する。緑色の発色は不完全な結合を意 味する。試験の結果に従い、第２又は第３の結合後にも陽性であるならば、反応 しながったα−Ｎｌ１２官能基をアセチル化によりブロックし、欠失を有するペ プチドの形成を避け、陰性であるならば、新たな脱保護−結合サイクルを開始す る。また、樹脂上に存在するアミンの量を等間隔（導入した２又は３種の残基毎 ）で滴定する。この量は一定でなければならず、最初に固相に固定したアミノ酸 の量に等しくなければならない、このために、ピクリン酸塩法（Ｇｉｓｉｎ、　 １９７２）を使用し、１０〜２０■の乾燥ペプチジル−樹脂を注射器で正確に分 取し、次のように処理する。
−ＤＣＭで５回洗浄、 一ピクリン酸溶液（ＤＣＭ中０．０ＩＭ）で３分間処理３回、−過剰のピクリン 酸を除去するためにＤＣＭで５回洗浄、＝５分間ＤＩＥ＾（ＤＣＭ中５％）処理 を５回行い、樹脂に結合したピクリン酸塩を分離する。１００ｚ１容フラスコに ｒ液を集める。
−樹脂をエタノールで洗浄し、その後、１００ｚ１容フラスコにエタノールを充 填する。
一３５８ｎｍで光学密度の測定、　３５８ｎ−の６Ｍ（モル消光係数）の値（１ ３８００）が判明したら、対応する塩を形成するためにピクリン酸と反応しなか った遊離α−Ｎｌ（２の濃度を計算する。
６／　　　のペブ　ドのアセ　ル　： 数回の反応を試行後にアミノ酸の結合が不完全のままである場合、又はペプチド の合成が終了し、ペプチドのα−ＮＨ２末端をアセチル基によりブロックしたい 場合（Ｎ末端のアセチル化は電荷の観点から見て天然のタンパク質中に存在する 電荷を表すペプチドを得る目的で実施される）、樹脂上のペプチドを次の条件で アセチル化する。
−５％ＤＩＥ＾による中和、 −ＤＣＭ洗浄、 −ＤＭＦ洗浄、 −ＤＭＦ中の無水酢酸（１０ｍｍｏｌｅ）ｌｚ／及びＤＩＥ＾（１０ｍｍｏｌｅ ＞１．７ｚｊ！の混合物によるアセチル化６反応は２０〜３０分間行われ、結合 試験が陰性であるとき完全であるとみなされる。
７／ベブ−４の　　： ペプチド−固相結合の破壊は０℃で無水フッ化水素酸（ＨＦ）により行われる（ Ｌｅｎａｒｄ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ、　１９６７；　５ａｋａｋｉｂａｒａ他１ ９８７）　。
ＨＦ中で不安定な保護基を選択した場合、この操作に引き続き、側鎖の脱保護を 行う、遊離基を捕え、遊離保護基による所定の残基（例えばチロシン）のアルキ ル化を阻止するためには、アニソール（１０容量％）の存在が必要である。ベン ゾヒドリルアミン樹脂を使用することにより、反応後にアミド化したＣ−α形態 のペプチドが得られる。フッ化水素酸の蒸発後、アニソールをエーテルにより抽 出し、ペプチドを酢酸により可溶化させる。切断反応の収率はフッ化水素酸によ る切断前のペプチド（樹脂に結合したペプチド）及び切断後のペプチド（遊離し た粗ペプチド）の量を与えるアミノ酸の分析結果から計算される。しかしながら 、（例えばホルミルトリプトファンのように）アミノ酸によっては補助処理を介 さないと側鎖の所定の保護基が除去されないものもある。
８／トリプトフアンの　　：： ホルミルトリブトファン形態の芳香族アミノ酸は、合成中にインドール基の酸化 の危険から保護すると好都合である。このインドール基は水性媒体中で１時間塩 基（１Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ９）を作用させることにより再生される（Ｏ ｈｎｏ他、１９７２）　。
合成されたペプチドは下記第３表に示す物理化学的特性を有する。
莱１表 夾１ｊＬＬ Δ　によ　′　れるＦタンパク　のペプ　ドＰＦ１６を秋ｉム」］すｍ 上記方法によりペプチドを予め合成しておいた。このペプチドはレトロウィルス ■ＩＶ−１のＦタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端の３５個のアミノ酸の配列を 含む。
ペプチドＰＦ１６は次のアミノ酸配列：ＧＭＤＤＰＥＲＥＶＬＩＪＩＲＦＤＳＲ ＬＡＦＩＩＨＶ＾ＲＥＬＨＰＥＹＦにＮＣ（ａｃｓ＋）（式中、アセトアミドメ チル（ａｃＩＩ）はシスティンのＳＲ官能基の保護基を表す）を有する。
試験の必要のために、使用した種々のペプチドＰＦ１６、ＰＦ１９、ＰＦ１３、 ＰＦ１７は２ｍｇ７ｘｉの濃度に希釈した。
トランスプロット用のＢＩＯＲＡＤ紙テープ上にｌｕｌ、２μｌ、ｈｌ、１０ｕ １の各スポットを堆積した。
乾燥後、ウィルス旧Ｖ−１により感染した患者の血清でＦタンパク質に対して陽 性のものを抗体として１／１００〜１／３００の種々の希釈度で使用することに より、慣用ウェスタンプロット試験を実施した。
試験したペプチドによると、３種の異なる抗Ｆ＋÷血清（＋÷はより顕著な反応 を意味する）を用いて第２表に要約するような結果が得られた。
一方、本発明者らはマウスで産生されたレトロウィルスＨＩＶ−１の抗Ｆタンパ ク質モノクローナル抗体がＥＬＩＳ＾試験で本発明のペプチドＰＦ１６を認識す ることを確認した。
このことは本発明のペプチドの免疫優性特徴を立証するものである。
大Ｊ１理」− Ｆｌｒｖに　　しｔ・　　の　゛　　にお番る；　　タンパ　　ｎｅｆにる　　 の　　のｔ・めのム　ペプ　ドの便宜上、Ｆタンパク質の別称（３’　ｏｒｆ、 　Ｂ、　Ｅ’とも呼称する）としてｎｅｆなる呼称を用いる。
本実施例は、タンパ９’Ｉｎ＋４を合成する組換生物を用いてラジオイムノアッ セイにより陽性１１１Ｖ血清中の抗ｎｅｆ抗体を検出するものである０本実施例 はまた、分子の免疫優性領域を決定し、ＨＩＶに暴露されるヒト血清中の抗ｎｅ ｆ抗体を同定するために、ｎｅｆの長い合成フラグメントの抗原性を検討するも のである。
社１ｊｕＬ友広− 一免Ｉ」す１区１− 遺伝子ｎｅｆを含む組換細菌Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）を使用した。
これらの細菌はＧｕｙ　Ｂ他によりＮａｔｕｒｅ　１９８７．３３０：２６６− ２６９に記載されている。感染患者の３００個のヒト血清を使用してこれらの試 験を実施した。マウス抗ヒトＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）−ペルオキシダーゼ及び０−フ ユニレンジアミン（ＯＰＤ）の複合体はＰａ５ｔｅｕｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ （フランス）から入手し、成分１２５ＩＮａは＾論６ｒｓｈａ輸（英国）製品で あり、＾−セファロースタンバク質及び５ｅｐｈａｄｅｘカラムＧｚｓＰＤ＋ｏ はＰｈａｒｓａｃｉａ（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）の製品であり、９６ウ エルを有する微量滴定プレートはＮｕｎｃ（デンマーク、Ｒｏｔｓｋｉｌｄ）か ら入手し、ヨウ素はＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｒ＋ｅｉｃａｌｓ（米国Ｒｏｃｋｆｏ ｒｄ、　ＩＬ）から入手した。γカウンター及びｔｉｔｅｒｔｅｋ光度計Ｍｕｌ ｔｉｓｋｉｎ　ＭＣＣ３４０は夫々Ｋｏｎｔｒｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ スイス、Ｚｕｒｉｅｈ）及びＦｌｏ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（スウェーデン 、Ｕｐ９ｓａｌｔ）から入手した。
−ペプ　ドの　　　４ 実施例１に記載したと同一のプロトコルにしたがってこの合成を実施し、したが って、同一の生成物を使用した。
−ンパ　　ｎｅｆの Ｇｕｙ、　Ｂ、他の論文に記載の方法にしたがって細菌Ｅ、ｅｏｌｉ（大腸菌） でタンパク質ｎｅｆを合成した。大腸菌から得たタンパク質ｎｅｆはミリスチル 化しなかった。大腸菌の溶菌細胞のタンパク質をベンズアミジンの存在下に尿素 により抽出した。透析及び遠心分離後、上滑をシバクロンブルー上でクロマトグ ラフィーにかけた。　ｎｅｆ含有量の高いフラクションを最終的に限外沢過によ り精製した。ＨＰＬＣ法により決定したタンパク質ｎｅｆの均質度は約７５〜９ ０％であった。
−凹工Ω旦：し１北。
６０ｎｍｏｌｅのヨウ素で予め被覆した管に、０．５ｍＣ１の１２５７　Ｎ。
（１３〜１７＋Ｃｉ／シｇ）を含む９に７．４のリンＷ１緩衝液（ＰＢＳ）５０ ｕ／中にｎｅｆｌｏｕｙを溶解して成る溶液を加えた。この調製物を室温で１０ 分間インキュベートしな、チロシン１０ｕｌ（９ｗｇ／ｍｌ＞を加えることによ り反応を停止した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）を含む緩衝液ＰＢＳ で平衡した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５（ＰＤ　１Ｇ）カラム上でｒ遇することに より、ヨウ素化したタンパク質から４１５Ｉｌ＆を除去した　１０）により標識 したｎｅｆの比放射能は約２５１１Ｃｉ／μｇであった。
−一ジ　イムノアツセ　Ｒ１＾ １２５Ｉ　ｎｅｆ（６００００ｃｐｍ）５０ｕ１を種々ノ希釈度の血清５０μｌ ト共に２時間３７℃でインキュベートした。＋２’Ｉ　ｎｅｆと抗ｎｅｆ抗体と の間に予め形成された複合体を０．５％ＢＳ＾（ＩＶ／２Ｖ）を含むｐＨ７，４ のＰＢＳＭ衝液中の５ｅｐｈａｒｏｓｅ−Ａタンパク質懸濁液１００μｆで１時 間３７℃で免疫沈降させた。０．５％のＢＳ＾、０．０５％のＮａＮ３．０．０ １％のｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含有するｐＨ７，４のＰＢＳｌＩ衝液で ２回洗浄後、結合放射能をγカウンターで計数した。
−ロｅｆ　　　の　　のｔ・めのＥＬＩＳＡｆｉ９６ウエルを有する微量滴定プ レートを３７℃で細菌タンパク質ｎｅｆ５００ｎｇで一晩、又はｐＨ７，４のＰ ＢＳ５０．Ｎ中つェル当たり５００ｎｇの合成ペプチドで被覆した。５％のカゼ インを含むｐＨ７，４のＰＢＳ４００ｕＮで３７℃で１時間飽和させ、ＢＳＳＯ ２５％、ｔｗｅｅｎＯ，０１％を含有するｐＨ７，４のＰＢＳで洗浄した後、種 々の希釈度の血清５０．１を２時間かけて３７℃で加えた。濯ぎ後、マウス抗ヒ トＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）−ペルオキシダーゼ１：１０００の複合体５０μβを１時 間３７℃でインキュベートした。再び濯ぎ後、０ＰＤ１００μｌを暗所で室温で ３０分間かけて加えた。４Ｎ硫酸５０．１を加えることにより酵素の反応を停止 し、プレートの光学密度を４９２ｎ１１／６２０ｎｍテ読み取った。カゼインで 被覆したプレートを陰性対照として使用した。
陽性旧■血清を使用することにより、１２５Ｉで標識したＦタンパク質と抗ｎｅ ｆ抗体との免疫反応性をＲ１＾法により試験した。第５図は血清の希釈度の関数 として抗体と標識タンパク質ｎｅｆとの結合曲線に対応する。約１：２００の血 清希釈度で５０％の結合率が得られた。陰性ＨＩＶ血清から任意に選択した血清 を使用することにより、非特異的結合の存在を調べた。標識タンパク質ｎｅｆと の結合の特異性は、非放射性の天然タンパク質ｎｅｆが＋ｘｓ■により標識した タンパク質ｎｅｆと任意に選択された血清の１種の抗ｎｅｆ抗体との間の免疫複 合体の形成を阻止する能力により確認した。
この場合、抗ｎｅｆ抗体とタンパク質＋２’Ｔ　ｎｅｆとの間の結合の５０％を 阻止する（Ｋｏ、ｓに対応）ことが可能なｎｅｆの濃度は２．２ｘ　１０−’Ｍ （第６図）であった。
−ＨＩＶに、　　した　　にお番る　　　ｎｅｆ゛の１（ＩＶに感染した患者か らの陽性抗ｎｅｆ血清の百分率（％）を推定するために、３００個の陽性ＨＩＶ 血清と１００個の陰性１１１Ｖ血清（陰性対照に対応）とを試験し、Ｒ１Ａ法に より抗ｎｅｆ抗体の存在を検出した。試験は’　”Ｉ（６００００ｃｐｍ）で標 識したタンパク質ｎｅｆの存在下に１：２００に希釈した血清で実施した。対照 の陰性血清と標識タンパク質ｎｅｆとの閏で検出された非特異的結合は約３００ ±５０ｃｐｍに対応し、これに対して陽性血清の値は約１５００〜６０００ｃｐ ａであった。試験した３００個の陽性ＨＩＶ血清のうち２１１個が標識タンパク 質ｎｅｆとの間に顕著な免疫反応性を示した（７０±５．３％（信頼区間９５％ ））。
−Ｉ′ＩＩ■７．１気　　の　゛　の　ｎｅｆ　　　の　　のｔ・めの　タンパ ク　ｎｅｆのム　ベブ　ドフーグメントの旧ｖ悠染患者で抗ｎｅｔ抗体を検出す るための抗原として合成ペプチドの使用可能性を検討するために、Ｉ（ＩＶ−１ のタンパク質ｎｅｆの配列（第４図）の全体を包含する８個の合成ペプチドを、 ３１個の陽性抗ｎｅｆ血清及び対照として使用した２個の陰性抗ｎｅｆ血清と共 にＥＬＩＳ＾試験で使用した。ｎｅｆ組換体をＥＬＩＳ＾試験の陽性対照として 使用し、陰性対照としてカゼインを使用した。これらの実験の結果は、以下の試 験を示す第４表に与えられる。
３１個の陽性抗ｎｅｆ血清及び２個の陰性抗ｎｅｆ血清を合成ペプチド（ＰＦＩ Ｉ〜ＰＦ１８）で予め被覆するか、又はｎｅｆ、カゼインもしくはペプチドＰＦ １２及びＰＦ１７の混合物を使用することにより＋　ＥＬＩＳ＾試験を実施した 。血清は”’Ｉ　ｎｅｆを使用することによりＲ１ｈ法により試験した陽性抗ｎ ｅｆ血清及び陰性抗ｎｅｔ血清から任意に選択した。免疫放射能の強度は、−が ０．２未満の光学密度（００）、十が０Ｄ＝０．２〜０．４、＋＋が０Ｄ＝０． ４〜０．８、及び＋＋十がＯＤ＝　０．８〜２．０を表す。
これらの結果を以下に要約する。
−Ｒ１＾試験の３１個の陽性抗ｎｅｔ血清は組換タンパク質ｎｅｆに対してＥＬ ＩＳ＾試験で陽性反応を示した。
−Ｒ１＾試験で陰性抗ｎｅｆであった２個の血清は、ＥＬＩＳ＾試験でタンパク 質ｎｅｔ及び全合成ペプチドに対して陰性反応を示した。
一２６個の陽性抗ｎｅｆ血清はＣ末端ペプチドＰＦ１６及びＰＦ１７に対して応 答した。
−ＩＳ個の陽性抗ｎｅｆ血清はＮ末端ペプチドＰＦ１２及びＰＦＩＩ及び／又は ＰＦ１３と反応した。
一ペプチドＰＦ１４は３個の血清と強い陽性反応を示し、ペプチドＰＦ１５及び ＰＦ１８は夫々４及び１０個の血清と反応した。
−３１個の陽性抗ｎｅｆ血清はＮ及びＣ末端ペプチド（ＰＦ１２及びＰＦ１７） の混合物と強く反応した。
煮Ｊ１ １（ＩＶの複製は複数の調節因子に依存する。ＨＩＶタンパク質に対する宿主の 免疫応答を十分に理解できるようにするために、一方で抗ｎｅｆ抗体の特異性に 関する試験を実施し、他方で抗ｎｅｆ抗体と合成ペプチドとの反応性を試験する ことにより、タンパク質ｎｅｆに対する応答を検討した。
１１１Ｖ感染患者の血清中の抗ｎｅｆ抗体を検出するために、組換体Ｉ２５■ｎ ｅｆを使用してＲ１＾試験を実施した。抗ｎｅｆ抗体と１２ＳＩで標識したタン パク質ｎｅｆとの結合特異性は、天然のタンパク質ｎｅｆが”’Ｉ　ｎｅｆ−抗 ｎｅｆ複合体の形成を線量依存的に阻止する能力により確認した。試験した血清 では、上記実験条件下でタンパク質”’Ｉ　ｎｅｆ−抗ｎｅｆの５０％の結合を 阻止することが可能な天然のタンパク質ｎｅｆの濃度は約２．２ＸＩＯ−”Ｍで あることが判明した。この値（Ｋ、、、）は組換抗原と抗ｎｅｆ抗体との間に親 和性の高い相互作用があることを示す、一方、タンパク質”’Ｉ　ｎｅｆと抗体 との５０％の結合率に対応する希釈度として規定される血清力価は１：１００〜 １：１０００の範囲であった。
免疫診断試験用抗原としての合成ペプチドの使用を検討し、これと同時にＨＩＶ 感染血清に含まれる抗ｎｅｆ抗体の特異性を検討するために、タンパク質ｎｅｆ のペプチドフラグメントであって旧Ｖ−ｔのｎｅｆタンパク質の全体を含むよう に選択した８個の相互に重複するペプチドフラグメントを固相法により合成した 。　ｎｅｆの二次構造をＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ　（＾ｎｎ。
Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９７８．４７：２５１−２７６＞の方法に従っ て検討した。ペプチドの１個（ＰＦ１８）はタンパク質ｎｅｆの潜在的ＣＴＰ結 合部位を含むことが判明した。
これらの合成ペプチドを用いて３１個の陽性抗ｎｅｆ血清をＥＬＩＳ＾試験で分 析した処、認識されたエビトー１の異種性が判明した０例えば、血清の約半分は ｎｅｆのＣ末端部分を排他的に認識しくＰＦ１５、ＰＦ１６及びＰＦ１７）、４ 個の血清はＮ末端領域のみと反応した（ペプチドＰＦＩＩ、ＰＦ１２及びＰＦ１ ３）　、全陽性抗ｎｅｆ血清はＮ及び／又はＣ末端ペプチドと強く反応し、この ことは、分子のこれらの２領域の免疫優性を立証するものである。ペプチドＰＦ １２（配列１〜６６）と反応する血清は、ペプチドＰＦ１１（配列１〜３１）及 び／又はＰＦ１３（配列３２〜６４）を認識し、従って、少なくとも２個のエピ トープが夫々ペプチドＰＦＩＩ及びＰＦ１３の配列のレベルに位置することが判 明した。　Ｈｏｐｐ及びＭｏｏｄｓ（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳ＾、　１９Ｂ１゜７２：３８２４−３８２８）の方法にしたがってタ ンパク質ｎｅｆの親水性を分析した処、対応する配列上に２つの潜在的親水性領 域が存在することが判明した。また、ＰＦ１７（配列１４１〜２０５）と反応す る血清はペプチドＰＦ１６（配列１７１〜２０５）とも反応した。
ｎｅｆの親水性プロフィルによると、ペプチドＰＦ１７は２つの親水性ピーク、 即ち抗原性ペプチドＰＦ１６に対応するピークと、ペプチドＰＦ１５に含まれる ピークとを含むことが判明した。
ペプチドＰＦ１６の応答を考慮すると、ペプチドＰＦ１７に含まれる主要抗原部 位はＣ末端ペプチドＰＦ１６に位置すると予想される。ペプチドＰＦ１１（配列 １〜３１）、ＰＦ１４（配列６５〜１０９）及びＰＦ１８（配列９３〜１２２） に対応するｎｅｆの他の３つの領域は、同様に抗原部位を含む、潜在的ＧＴＰ結 合部位を含むと仮定されるペプチドＰＦ１８は、驚くべきことに陽性抗ｎｅｆ血 清の約１７３に対して顕著な免疫反応性を示す、　ｎｅｆのＮ及びＣ末端領域の 免疫優性を考慮して、ペプチドＰＦ１２及びＰＦ１７の混合物が陽性抗ｎｅｆ血 清により認識される能力を試験した。３１個の陽性抗ｎｅｆ血清はペプチド混合 物と強く反応した０以上のデータに明示されるように、主要エピトープはＦタン パク質のＮ及びＣ末端部分の近傍に位置する。
第１４ ？寵丁ムＬＩＩ＋ ネ丁 ＾ヤ合 禰１にアミノ…蓄↑欠−：８２ り　−−り　−−り　−− ＬＩＬ　：＃塁＝　＝Ｎ塁＝＝Ｐ、マ＝＞＞ζ−−糎＞〉＞ν〉〉 ｊ：ｊｊｊフニニ　　ニ二二二 −ｓ　　　　　−４−３−２−１０ １ｏｇ外＃伶べ東 国際調査報告 一−１−−＾−−−−ｋＰｃＴ／ＦＲＢ９１００１５１国際調査報告

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. １．ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発し得るレトロウィルスのＦタンパク質に対する抗 Ｆタンパク質抗体との間に免疫学的複合体を形成することが可能なペプチドであ って、ＨＩＶのＦタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列又はこの配列の変異 種であってレトロウィルスＨＩＶのＦタンパク質に対する抗Ｆタンパク質抗体に より免疫学的に認識されるような変異種に対応するアミノ酸配列を形成する最大 ７０個のアミノ酸を含むことを特徴とするペプチド。
  2. ２．式： ＸＧＭ−Ｄ−Ｅ−−ＶＬ−Ｎ−Ｆ−Ｓ−ＬＡ−−Ｈ−ＡＲＥ−ＨＰＥ−−Ｋ−Ｃ Ｚ（式中、Ｘ及びＺはＯＨ又はＮＨ２基、又はこれらの基を欠失するペプチドの 免疫学的特性が本質的に変わらない限りにおいて１〜５個のアミノ酸残基を含む 基であり、−の各々はレトロウィルスＨＩＶ−１のＦタンパク質に対する抗体、 より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体を含むヒト血清により認識 される能力を該ペプチドに維持させ得るような類から選択されるアミノアシル残 基に対応する）で表される配列の全部又は一部を有することを特徴とする請求項 １に記載のペプチド。
  3. ３．次のペプチド： 【配列があります】 から選択されるペプチドの全部又は一部により構成されることを特徴とする請求 項１又は２にに記載のペプチド。
  4. ４．以下のペプチド： ＰＦ１１：【配列があります】 ＰＦ１２：【配列があります】 ＰＦ１３：【配列があります】 ＰＲ１４：【配列があります】 ＰＦ１５：【配列があります】 ＰＦ１６：【配列があります】 ＰＦ１７：【配列があります】 ＰＦ１８：【配列があります】 （式中、Ｘ及びＺはＯＨ又はＮＨ２基、又はこれらの基を欠失するペプチドの免 疫学的特性が本質的に変わらない限りにおいて１〜５個のアミノ酸残基を含む基 であって、該アミノ酸はレトロウィルスＨＩＶ−１のＦタンパク質に対する抗体 、より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体を含むヒト血清により認 識される能力を該ペプチドに維持させ得るように選択される）から選択されるこ とを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
  5. ５．以下の配列： ＰＦ１０：【配列があります】 （式中、Ｘ及びＺはＯＨ又はＮＨ２基、又はこれらの基を欠失するペプチドの免 疫学的特性が本質的に変わらない限りにおいて１〜５個のアミノ酸残基を含む基 であって、該アミノ酸はレトロウィルスＨＩＶ−２のＦタンパク質に対する抗体 、より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体を含むヒト血清により認 識される能力を該ペプチドに維持させ得るように選択される）と共通の免疫学的 特性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
  6. ６．以下の配列： ＰＦ１９：【配列があります】 （式中、Ｘ及びＺはＯＨ又はＮＨ２基、又はこれらの基を欠失するペプチドの免 疫学的特性が本質的に変らわない限りにおいて１〜５個のアミノ酸残基を含む基 であって、該アミノ酸はレトロウィルスＨＩＶ−２のＦタンパク質に対する抗体 、より特定的には上記ペプチドに対する単一特異性抗体を含むヒト血清により認 識される能力を該ペプチドに維持させ得るように選択される）と共通の免疫学的 特性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
  7. ７．レトロウィルスＨＩＶ−１による感染時に産生されるＦタンパク質又はＦタ ンパク質の一部に対する抗体の検出用組成物であって、請求項１から４のいずれ か一項に記載のペプチドから選択される少なくとも２種の異なるペプチドを混合 物として含むことを特徴とする組成物。
  8. ８．レトロウィルスＨＩＶ−２による感染時に産生されるＦタンパク質又はＦタ ンパク質の一部に対する抗体の検出用組成物であって、請求項５又は６に記載の ペプチドから選択される少なくとも２種の異なるペプチドを混合物として含むこ とを特徴とする組成物。
  9. ９．レトロウィルスＨＩＶによる感染時に産生されるＦタンパク質又はＦタンパ ク質の一部に対する抗体の検出用組成物であって、請求項１から６のいずれか一 項に記載のペプチドから選択される少なくとも２種の異なるペプチドを混合物と して含むことを特徴とする組成物。
  10. １０．一方がＨＩＶ−１のＦタンパク質のＣ末端領域のペプチドから選択され、 例えばＰＦ１５、ＰＦ１６及びＰＦ１７の配列から選択されるペプチドであり、 他方がＨＩＶ−１のタンパク質のＮ末端領域のペプチドから選択され、例えばＰ Ｆ１１、ＰＦ１２及びＰＦ１３の配列から選択されるペプチドであるように選択 された少なくとも２種のペプチドを混合物として含むことを特徴とする請求項７ 又は８に記載の組成物。
  11. １１．ペプチドＰＦ１２及びＰＦ１７を混合物として含むことを特徴とする請求 項１０に記載の組成物。
  12. １２．ペプチドＰＦ１２及びＰＦ１６を混合物として含むことを特徴とする請求 項１１に記載の組成物。
  13. １３．ペプチドＰＦ１３及びＰＦ１７を混合物として含むことを特徴とする請求 項１１に記載の組成物。
  14. １４．ペプチドＰＦ１３及びＰＦ１６を混合物として含むことを特徴とする請求 項１１に記載の組成物。
  15. １５．請求項２から４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のペプチドと請求 項５又は６に記載のペプチドとの混合物を含むことを特徴とするペプチド組成物 。
  16. １６．ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発することが可能なレトロウィルスによる感染の ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断用キットであって、−請求項１から６のいずれか一項に記 載のペプチド、又は請求項７から１５のいずれか一項に記載のペプチド組成物と 、−１又は複数のペプチドと生物学的サンプル中に場合により存在する抗体との 間の免疫学的反応の形成に適当な媒体、特に緩衝溶液を構成するための試薬と、 −形成されたペプチド−抗体複合体の検出のために１又は複数のペプチドと反応 し得る場合により標識された１又は複数の試薬と、 −任意要素として、場合によりレトロウィルスＨＩＶに感染した人体に由来する 生物学的媒体に類似し且つ該ペプチドを認識する抗体を欠失する対照用生物学的 媒体（例えば血清）とを含むことを特徴とするキット。
  17. １７．Ｆタンパク質に対する単一特異性抗体であって、請求項１から６のいずれ か一項に記載の１又は複数のペプチド又は請求項７から１５のいずれか一項に記 載の組成物により免疫学的に認識されることを特徴とする単一特異性抗体。
  18. １８．請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの合成方法であって、 ａ／カルボキシル官能基と反応し得る反応基を担持する固体支持体を、自己縮合 を避けるために別のアミノ酸との結合に介入する前にアミン官能基のレベルで保 護された被合成連鎖の第１のＣ末端アミノ酸と接触させる段階と、ｂ／先に固定 したアミノ酸のアミン官能基を脱保護する段階と、 ｃ／段階ｂ／で得られたアミノ酸の脱保護アミン官能基を、アミン官能基のレベ ルで保護され且つ被合成ペプチドのＣ末端アミノアシル残基に結合される第２の アミノアシル残基を供給する第２のアミノ酸のカルボキシル官能基と結合する段 階と、 ｄ／加えた第２のアミノ酸のアミン官能基を脱保護し、該ペプチドのＮ末端アミ ノアシル残基に到達するまで連続的アミノアシル残基に夫々対応するアミノ酸を 連続的に用いて結合段階ｃ／及び保護段階ｄ／を繰り返す段階と、ｅ／Ｎ末端ア ミノ酸の導入後に、合成されたペプチドを担持する固相を特に例えばフッ化水素 酸で処理することにより、形成されたペプチドを分離する段階と、ｆ／溶液から ペプチド配列を回収する段階とを含むことを特徴とする方法。
  19. １９．脱保護段階ｂ／の後に、アミン官能基を求核性にするための中和段階を実 施することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. ２０．結合段階でカルボキシル官能基、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイ ミドを活性化することが可能な結合剤を作用させることを特徴とする請求項１８ 又は１９に記載の方法。
  21. ２１．第１の結合時に反応しなかったアミン官能基を反応させるために、段階ｃ ／後に得られたペプチドの洗浄及び中和後に結合剤を用いて第２の結合段階を実 施することを特徴とする請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ２２．チロシンのＯＨ官能基に２，６−ジクロロベンジル、スレオニンもしくは セリンのＯＨ官能基又はアスパルテートもしくはグルタメートのＣＯＯＨ官能基 にベンジル、システインのＳＨ官能基にｔ−ブチルメルカブト、ヒスチジンのイ ミダゾール又はアルギニンのＮＨ官能基にトシル、リシンのＮＨ２官能基にベン ジルオキシカルボニル、トリプトファンのインドール官能基にホルミルを用いて アミノ酸の第３官能基の保護を行うことを特徴とする請求項１８から２１のいず れか一項に記載の合成方法。
  23. ２３．ＬＡＳ又はＡＩＤＳを誘発し得るレトロウィルスＨＩＶによる感染のｉｎ 　ｖｉｔｒｏ検出方法であって、ａ／ペプチド−抗体免疫学的複合体の形成を可 能にする条件下で、請求項１から６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のペ プチド又は請求項７から１５のいずれか一項に記載の組成物を、レトロウィルス ＨＩＶのＦタンパク質に対する抗体を含む可能性のある被験生物学的サンプルと 接触させる段階と、 ｂ／形成された免疫学的複合体を検出する段階とを含むことを特徴とする方法。
  24. ２４．使用されるペプチドがレトロウィルスＨＩＶ−１のＦタンパク質に対して 形成された抗体を特異的に認識することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  25. ２５．使用されるペプチドがレトロウィルスＨＩＶ−２のＦタンパク質に対して 形成された抗体を特異的に認識することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  26. ２６．レトロウィルスＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２による感染を検出することが可 能なペプチドの混合物を使用することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
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