JP2886861B2 - エイズ関連症の検出用合成抗原 - Google Patents
エイズ関連症の検出用合成抗原Info
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
リンパ節症々候群および後天的免疫不全症(AIDS)と
呼ばれる疾病が、リンパ節症ウイルス(LAV)、ヒトT
−細胞リンパ趨向性ウイルス−III(HTLV−III)、エイ
ズ−関連ウイルス(ARV)または免疫不全−関連ウイル
ス(IDAV)と命名された感染性レトロウイルスに起因す
るものであることが見出された結果、該疾病の潜在的媒
介体、例えば、発病した個体からの血液など(これは輸
血に使用されるかもしれないし、またこれら特異的な血
液因子が単離できるかも知れない)を検出し得る技術に
対する早急な需要が高まってきている。 この疾病の潜在的媒介体を検出するためには、ウイル
スタンパクおよび/またはかかるタンパクに対する抗体
を手に入れる必要がある。LAV/HTLV−IIIレトロウイル
スの育生に伴う危険性のために、該ウイルスタンパクま
たはその免疫的等価物を得るための、生きた、強力な感
染性ウイルスを大量に取扱う必要のない手段を確立する
ことが注目されている。別法を選ぶ場合には、ウイルス
が著しく多形性であり、しばしばレトロウイルスが継代
に伴って変化するものであると報告されている事実に注
意しなければならない。 (関連文献の簡単な説明) レトロウイルスの様々な抗原がザクシンジャー(Saxi
nger)等により、サイエンス(Science)、1985、227、
1036−1038に記載されている。また、ガロ(Gallo)等
のibid、1984、224、500;サランガダーン(Sarangadhar
n)等のibid、1984、224、506;バレーシヌシ(Barre−S
inoussi)等のibid、1983、220、868;モンタニエ(Mont
agnier)等の“ヒトT−細胞ロイケミア/リンフォーマ
ウイルス(Human T−cell Leu kemia/Lymphoma Viru
s)、ガロ、エセックス、グロス(Gallo,Essex,Gross)
編〔コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold S
pring Harbor Laboratory)、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク〕、1984、p363をも参照できる。こ
れらはp13、p18、p25、p36、gp43、p55、gp65、gp110な
どを含むがこれに制限されず、これら番号は報告者に応
じて異る。 ホップとウッズ(Hopp and Woods)は、プロシーディ
ングズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイ
エンスズ オブユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A)、1981、78、3824において、相対的な親水度に基き
ペプチドをポリペプチドの潜在的エピトープとして選択
するための基準を記載している。この基準を利用した一
研究において、12個のアミノ酸からなるペプチドが合成
され、これは天然タンパクにより誘発された抗体9%を
結合していた〔ホップ(Hopp)、モレキュラー イムノ
ロジー(Molec.Immunol.)、1981、18、869〕。一般に
ホップ/ウッズの基準は高い予測値を与えないことが示
されている。更に、エピトープはこれらが親水性ではな
いことが立証されている〔カジム(Kazim)等、バイオ
ケミカルー ジャーナル(Biochem.J.)、1982、203、2
01〕。その他のポリペプチド抗原性に関する研究はグリ
ーン(Green)等のセル(Cell)、1982、28、477に開示
された文献〔ここでは抗体を誘発するペプチドが用いら
れ、該抗体は天然タンパクに結合でき、一方逆に天然タ
ンパクにより誘発された抗体はペプチドに結合し得なか
った〕およびトレイナー(Trainer)等、ネイチャー(N
ature)、1984、312、127(このミオヘメリトリンに関
する結果はグリーン等の結果と一致した)を包含する。 LAVの完全なヌクレオチド配列はワイン−ホブソン(W
ain−Hobson)等により報告されている〔セル(Cel
l)、1985、40、9〕。HTLV−IIIの完全な配列はミュー
ジング(Muesing)等により報告されており〔ネイチャ
ー(Natuer)、1985、313、450、一方ARVの完全配列は
サンチェーペスカドール(Sauchez−Pescador)等によ
り報告されている〔サイエンス(Science)、1985、22
7、484〕。これら3種のウイルスは実質的なヌクレオチ
ド相同性を示し、かつ最適逆転写酵素活性に関する形態
学的、細胞病理学的要求および少なくともいくつかの抗
原特性に関して類似しており〔レビー(Levy)等、サイ
エンス(Science)、1984、225、840;シュプバッハ(Sh
upbach)等、サイエンス、1984、224、503〕、従って同
一のウイルスの分離体であると考えられる。チャン(Ch
ang)等のサイエンス、1985、228、93をも参照のこと。
これらの並びに他のデータを基にして、ウイルスの分類
学に関する国際委員会のヒトレトロウイルス分科会が、
この群の極めて関係深いウイルスをヒト免疫不全ウイル
ス(Human Immuno−deficiency Virus)(HIV)と命名
することを提案した(サイエンス、1986、232、697)。
この名称を本明細書でも使用する。 (発明の目的) HIVレトロウイルスのpolおよびgag領域に免疫的に類
似するタンパクをコード化し得るペプチド配列を、スク
リーニング以前にレトロウイルスに曝露された血液生成
物および血液をスクリーニングする際に使用する試薬と
して提案する。このペプチドは長さが少なくともアミノ
酸5個であり、かつHIVウイルスに対する抗体を検出
し、HIV抗原を検出するための種々の特異的結合アッセ
イにおいてまたは免疫原として使用できる。 (発明の開示および特定の態様) 本発明の開示の目的で、ウイルスは、これが実質的に
以下の基準を満たす場合には、HIVと同一またはこれと
等価であるとする。 (a) 該ウイルスがT−リンパ球、特にヘルパーT細
胞に対し刺激性である〔ベルナール(Bernard)等編、
ロイコサイト タイピング(Leucocyte Typing)、ニュ
ーヨーク、スプリンガーベルラグ、1984において規定さ
れた国際命名法によればCD4+〕。 (b) 該ウイルスが感染CD4+細胞に対し(HTLV−Iお
よびIIと同様に、形質転換というよりも)細胞変性々で
ある。 (c) 該ウイルスはRNA−依存DNAポリメラーゼ(逆転
写酵素)をコード化し、該ポリメラーゼはMg25−依存性
であり、(至適濃度=5mM)、至適pH7.8をもち、アクチ
ノマイシンDにより阻害できず、かつその3′LTRから
の逆転写のためのプライマーとしてオリゴ(dT)12-18
(oligo(dT)12-18)を利用できる。 (d) 該ウイルスはスクロース勾配下で、密度約1.16
にバンドをもっている。 (e) 該ウイルスは〔3H〕−ウリジンで標識し得る。 (f) 該ウイルスはHIVのgag、enyおよびpol領域によ
りコード化されたタンパクと実質的に免疫的に交叉反応
性である。および (g) 該ウイルスは、LAVまたはHTLV−IIIと実質的な
ヌクレオチド相同性(約75〜100%)およびアミノ酸配
列相同性(約75〜100%)をもつ。 新規ペプチドは、HIVレトロウイルスによりコードさ
れた免疫的に類似のタンパク、特に該ウイルスゲノムの
pol領域によってコードされたタンパクとして与えられ
る。異る分離体における株毎の変異に対応するために、
保存性の置換の調節並びに非−保存性の置換が関与する
その他のものからの選択を行うことができる。このペプ
チドは単独でまたは組合せで、生理的サンプル中のウイ
ルスまたは該ウイルスに対する抗体の検出のために用い
ることができる。テストプロトコルの性質に応じて、該
ペプチドは標識してもまたしなくともよく、固体表面に
結合でき、担体または他の化合物と複合化するなどが可
能である。 本発明のペプチドはpolおよびgag領域でコード化した
ペプチドから誘導される。これらのペプチドは、主とし
てpol領域のp31からおよびgag領域のp25から誘導され
る。これらのペプチドにはローマ数字を与え、また数値
的表示もなされ、これは本明細書ではこれらペプチドが
生成された方法と関連して任意的なものである。特に興
味あるのは、塩基対(bp)約4265〜bp4519、特に約bp42
65〜bp4399およびbp4385〜bp4519(より短いセグメント
bp4430〜bp4519を含む)に亘って広っているコード領域
である。また、約pb897〜bp986に亘り広っているコード
領域も特に興味深いものである。ここで番号付けは上記
のワイン−ホブソンの文献に従った。 本発明のペプチドは少なくとも5、しばしば6、しば
しば8、しばしば12で、通常約50以下、より一般的には
約35以下、好ましくは約25以下のアミノ酸を含み、これ
らはHIVレトロウイルスによってコードされる配列内に
含まれる。各例において、オリゴペプチドはできる限り
小さく、しかもより大きなペプチドの実質的にすべての
感受性を維持しているものであることが望ましい。いく
つかの例では、相互に重複しない2またはそれ以上のオ
リゴペプチドを結合させて、単一のペプチド構造を形成
するかあるいはこれらを個々のペプチドとして同時に使
用することが望ましく、これらは別々にあるいは一緒に
なって親と等価な感受性をもたらす。 これらのペプチドは、そこに保存性または非保存性の
置換を導入して、そのアミノ酸の通常20数%(number
%)以下、より一般には10数%以下を交換することによ
り変性できる。領域が多形であることがわかっているこ
れらの情況において、一またはそれ以上の特定のアミノ
酸を変えて、異るレトロウイルス株の異るエピトープに
より一層効果的に似せることが望ましい。 本発明において使用するポリペプチドは、目的とする
化合物がHIVレトロウイルス株の少なくとも一つのタン
パクと免疫的に競合し得る限り、任意の特定のHIVポリ
ペプチド配列と同一である必要はないことを理解すべき
である。従って、目的とするポリペプチドは保存性また
は非保存性の挿入、脱落、および置換などといった様々
な変化を受ける恐れがあり、これらの変化はその使用に
際してある利点をもたらすかも知れない。保存性置換と
は、gly、ala;val、ile;leu、asp;asn、gln;ser、thr;l
ys、arg;phe、tyr;およびnorleu、metなどの組内での置
換を意味する。通常、この配列はHIVレトロウイルスの
少なくとも一つの株の配列と、20%を越えて相違するこ
とはない。但し、本発明のペプチドを有利に固定化し得
る“腕(arm)”を与えるために、いずれかの末端には
追加のアミノ酸を付加できる。これらの腕の長さは通常
少なくとも一つのアミノ酸であり、かつ50またはそれ以
上、より頻繁には1〜10個のアミノ酸である。 更に、オリゴペプチドまたはペプチドの末端に1また
は2個のアミノ酸を付加して、ペプチド間の相互の結合
を容易にし、以下に述べる理由で支持体またはより大き
なペプチドへの結合を容易にし、(該ペプチドまたはオ
リゴペプチドの物理的または化学的特性を改善したりす
ることが可能である。 チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アス
パラギン酸などのアミノ酸を上記ペプチドまたはオリゴ
ペプチドのC−またはN−末端に導入して、結合用の有
用な官能性を与えることができる。システインは、他の
ペプチドとの共有結合を容易にしまたは酸化によりポリ
マーを形成するために特に好ましい。システインと介在
アミノ酸スペーサーとの組合せも有用である。例えば、
2個のシステイン残基を、炭素原子数4以下の(結合反
応の妨害を避けるためには小さな寸法のものが望まし
い)単一の側鎖をもつ1またはそれ以上のα−アミノ酸
によって分離できる。グリシン残基はこの理由から好ま
しく、特に結合を容易にするために、アミノ酸間に1〜
3個のグリシン残基が添加される。システイン残基は、
酸化により網状ポリマーを形成する際に特に有用であ
る。このような場合、好ましくはペプチドの末端部分に
付加されたシステイン残基を用いて、結合されている分
子内に少なくとも3個のシステイン残基を含むことが好
ましい。 更に、本発明のペプチドまたはオリゴペプチドは、そ
の配列が末端NH2アシル化、例えばアセチル化、あるい
はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシルアミド
化(例えばアンモニアまたはメチルアミンによる)など
で、支持体または他の分子と結合するサイトを形成する
ために変性されていることから、天然の配列と異る配列
をもつことができる。 以下、興味あるペプチドおよびオリゴペプチドについ
て考察する。bp4265〜bp4399の領域にコード化されたペ
プチドI(126)は以下のアミノ酸配列を有し、ここで
以下の配列内に含まれるオリゴペプチドはかかる配列内
に線形のエピトープを含んでいる。 ここで、XおよびYは場合により存在し、存在する場
合には該ペプチドとタンパク担体または他のペプチドと
の共有結合形成を容易にし、あるいは酸化によって、付
加されたシステイン残基を介して重合することを容易に
するアミノ酸を表し、Zはカルボキシル末端をもつアミ
ノ酸が遊離カルボキシルおよびアミドのいずれかとして
存在することを示す。XおよびYが存在する場合、好ま
しい態様は、XとYとが夫々独立に1またはそれ以上の
システインあるいは1またはそれ以上のシステインとス
ペーサアミノ酸との組合せを表すものとして存在する。
好ましいスペーサアミノ酸は炭素原子数4以下の単一の
側鎖をもつα−アミノ酸残基である。グリシンが特に好
ましいスペーサである。酸化重合に用いる好ましいペプ
チドは、XとYとが一緒に少なくとも3個のシステイン
残基を表すものである。該ペプチドの同一端部に2つの
システイン残基がある場合、好ましい態様は、該システ
イン残基が1〜3個のスペーサアミノ酸残基、好ましく
はグリシン残基によって分離されているものである。 このペプチドは、HIVゲノムによりコードされた約45
以下のアミノ酸を有することが好ましい。 以下のペプチドII(123)は約bp4385〜bp4519ひ亘っ
て広っている領域によりコードされ、かつ以下に示す配
列を有している。ここで、以下の配列内に含まれるオリ
ゴペプチドはこのような配列内に線形のエピトープを含
んでいる。 ここでアミノ末端Yおよびカルボキシル末端X−Zは
上記定義通りである。 もう一つの興味あるオリゴペプチドII aは以下の配列
をもつ。 但し、X、YおよびZは上記定義通りである。 gag領域に対して、ペプチドIII(158)は約bp897〜bp
986に亘り広った領域によりコード化され、かつ以下に
示す配列を有している。ここで、以下の配列内に含まれ
るオリゴペプチドは該配列内に線状のエピトープを含
む。但し、X、YおよびZは上記定義通りである。 特に興味あるのは、末端アミノ基などをアシル化し
て、ジスルフイド結合あるいはより長い結合により2つ
のペプチドまたはオリゴペプチドもしくはその組合せを
結合するのに利用される、システインまたはチオグリコ
ール酸のメルカプト基の利用である。これを達成するに
は、ビス−ハロアセチル基、ニトロアリールハライドな
どを有し、チオ基に対して特異的な化合物を用いること
ができる。かくして、異なるペプチドまたはオリゴペプ
チドの2つのメルカプト基間の結合は単結合あるいは炭
素原子数少なくとも2、通常少なくとも4で、しかも約
16以下、通常約14以下を有する結合基であり得る。 目的とするペプチドは可溶性巨大分子(例えば≧5キ
ロダルトン)担体に結合して使用できる。有利には、こ
の担体はポリ(アミノ酸)であり、これは天然、合成の
いずれでもよく、これに対する抗体はヒト血清中にはみ
られない。ポリペプチドの例はポリ−L−リジン、牛血
清アルブミン、笠貝(keyhole limpet)ヘモシアニン、
牛γ−グロブリンなどを包含する。これらの選択は主と
して便宜的および入手容易性による。 このような複合体に関連して、巨大分子1分子当たり
少なくとも1種の目的とするペプチドを少なくとも1分
子、即ち巨大分子0.5キロダルトン当たり約1以下、通
常巨大分子2キロダルトン当たり約1以下である。同一
の巨大分子に1またはそれ以上の異るペプチドを結合で
きる。 結合方法は公知であり、p−マレイミド安息香酸、p
−メチルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水コハク
酸、グルタルアルデヒドなどの試薬を利用する。この結
合は分子のN−末端、C−末端または末端間の中間部位
で起こる。目的とするペプチドは結合により得ることも
でき、支持体などに結合したまま相互に結合することも
できる。 上記化合物はその用途に応じて標識したまたは未標識
化合物として使用できる。(ここで標識とは直接または
間接的に分子が検出可能な信号を与えることを意味す
る)。種々の標識、例えば放射性核種、酵素、蛍光物
質、化学発光物質、酵素基質、コファクターまたは阻害
剤、粒子例えば磁性粒子、リガンドと受容体との組合
せ、例えばビオチンとアビジンなどを利用できる。更
に、これらのポリペプチドは、例えばマイクロタイター
プレート、ガラスビーズ、クロマト材料表面、例えば
紙、セルロース、シリカゲルなどの表面に結合する種々
の方法で変性できる。ポリペプチドを他の化合物または
表面に結合する特別な方法は公知であり、文献中に多数
の例を見出すことができる。例えば、米国特許第4,371,
515号および同第4,487,715号並びにこれら特許に引用さ
れている特許を参照できる。 レトロウイルスタンパクに対する抗体またはレトロウ
イルスタンパク自体のいずれかの存在を検出する種々の
アッセイプロトコルが利用できる。特に興味深いのは該
ペプチドを標識試薬として使用するものであり、あるい
は該ペプチドを直接または間接的に表面に結合するもの
であり、前者ではラベルが検出可能な信号を与え、後者
ではサンプル中の該ペプチドに対する抗体が該表面上の
ペプチドに結合することになる。従って、該ペプチドに
結合したヒト抗体の存在はヒト免疫グロブリン、通常ヒ
トIgMおよびIgGの両者に特異的な異種間抗体を用い、あ
るいは免疫複合体、例えばRf因子またはS. オーレウス
(aureus)タンパクAに対して特異的な標識タンパクを
用いることにより検出できる。 競争的または非競争的な、様々な異種プロトコルを使
用できる。ペプチドは表面または支持体(“サポート
(support)”)および標識抗体に結合でき、かつ標識
抗体はサンプル内の抗体と限られた量の結合ペプチドを
争うことができる。支持体に結合するラベルの量はサン
プル中の競争的抗体の量に関係する。 抗体は支持体に結合でき、また標識ペプチドと結合し
たサンプルと結合できる。反応混合物と結合抗体とを接
触させた後、支持体に結合したラベルの量はサンプル中
の同種の抗体量に関係している。 異種間抗−ヒト抗体、例えば免疫グロブリンIgGおよ
びIgMのFcに対する抗体は支持体に結合できた。サンプ
ルは免疫グロブリンおよび標識ペプチドと接触され、支
持体に結合した標識ペプチドの量は同種抗体の存在を表
示する。 また、同質アッセイが利用でき、そこでは該ペプチド
は酵素、蛍光物質または他のラベルに結合し、ここで抗
体とペプチドとの結合は特異的結合対錯体に関与するラ
ベルと該錯体に関与していないラベルとの間の識別を可
能とする。このような技術を用いるアッセイについて
は、例えば米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、
同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533
号、同第3,996,345号、同第4,034,074号および同第4,09
8,876号を参照でき、これらは本発明の参考文献とす
る。 本発明の一例として、目的のペプチドは蛍光物質、例
えばフルオレセイン、ローダミンまたはウンベリフェロ
ンに複合化できる。抗体との錯体形成を検出するには、
種々の方法、例えば蛍光偏光法が利用できる。このアッ
セイにおいて、蛍光偏光は錯化されたおよび錯化されて
いないペプチド複合体間で異っている。この蛍光偏光に
おける変化を測定するための装置として、例えばアボッ
トラボラトリーズ(Abbott Laboratories;イリノイ州シ
カゴ)により供給されているTDxなどが入手できる。 アッセイ法の例はサンプル容器、例えばマイクロタイ
タープレートのウェルを用い、本発明のポリペプチドま
たはその複合体を該容器の底および/または壁に、共有
結合的にまたは非共有結合的に付着させる。サンプル、
即ち通常適当な緩衝溶媒で希釈したヒト血液または血清
を該容器に加え、該ポリペプチドとサンプル中の任意の
同種抗体との錯体形成するのに十分な時間保持する。上
澄を除き、かつ非特異的に結合したタンパクを除くため
に該容器を洗浄する。 錯体に特異的に結合した、標識された特異的結合タン
パクを検出に用いる。該容器に、ヒト免疫グロブリンに
対する異種抗血清、特に適当に緩衝された媒質中の抗−
(ヒトIgMおよびIgG)を加えることができる。この異種
抗血清は検出可能なラベル、例えば放射性核種または酵
素で通常標識される。抗血清の代りに、免疫錯体に特異
的なタンパク、例えばS. オーレウス(aureus)タンパ
クAを用いることができる。次いで、ラベルを検出す
る。例えば、酵素を用いた場合、非特異的に結合した酵
素ラベルを除去した後、現像剤溶液を添加する。この現
像剤溶液は酵素基質および場合によっては酵素コファク
タ、色素原などを含み、これらは反応の際に夫々比色法
であるいは蛍光測定法で検出し得る着色または蛍光性生
成物を与える。 本発明のペプチドは種々の方法で調製できる。これら
は比較的短い寸法をもつので、該ペプチドは公知の方法
に従って、溶液中で、あるいは固体支持体上で合成でき
る。今日では種々の自動合成装置が市販品として入手で
き、しかも公知のプロトコルに従って使用できる。これ
については、例えばスチュアートおよびヤング(Stewar
t and Young)の固相ペプチド合成(Solid Phase Pepti
de Synthesis)、第2版、ピアースケミカルコーポレー
ション(Pierce Chemical Co.)、1984およびタム(Ta
m)等のジャーナル オブ アメリカンケミカルソサイ
アティー(J.Am、Chem.Soc.)、1983、105、6442を参照
できる。 また、ハイブリッドDNA技術も利用でき、これによれ
ば合成遺伝子が、該ポリペプチドをコードする一本鎖あ
るいはその実質的な相補償を用いることにより調製で
き、ここで一本鎖を重ね合せ、かつ交雑のために一緒に
アニール溶媒中に入れることができる。交雑鎖を次に結
合して完全な遺伝子を形成することができ、しかも適当
な末端を選ぶことにより、該遺伝子を表現ベクタ(これ
らは今日では容易に入手できる)内に挿入することがで
きる。これについては、例えばマニアティス(Maniati
s)等の“モレキュラークローニング、ア ラボラトリ
ーマニュアル(Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l)、“CSH、コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、1982を参照できる。あるいは、該ペプチドをコード
するウイルスゲノムの領域を公知の組換えDNA技術によ
りクローン化し、かつ表現させることが可能である〔上
記マニアティス(Maniatis)の文献参照〕。 該ペプチドを表現するのに使用できるDNAコード化配
列は以下のものを含む。 これら配列からの断片はペプチド断片を表現するのに
利用でき、保存的塩基交換を行うことができ(ここで、
変えられたコドンは同一のアミノ酸をコードする)、あ
るいはコード化配列内に非保存的交換をなすことができ
る(ここで得られるアミノ酸は、前に議論したように、
該アミノ酸配列中で保存性または非保存性交換であり得
る)。 このコード化配列は5′−または3′−末端あるいは
両末端において延長でき、これによりペプチドを伸長で
き、一方でそのエピトープサイトは保持される。この延
長の際結合用、例えば酵素などのラベルに結合するた
め、2またはすべてのペプチドを同一の鎖内に一緒に結
合するため、あるいは抗原活性を付与するために腕を与
えることが可能である。 表現のためには、コード化配列は開始並びに停止コド
ン、プロモータおよびターミネータ領域並びに細胞宿
主、例えば原核生物または真核生物、バクテリア、酵
母、哺乳動物細胞中で表現するための表現ベクタを与え
る通常の複製系を備えている。 通常少なくとも15個の塩基、好ましくは少なくとも18
個の塩基をもつ上記配列自体、その断片またはより大き
な配列を、レトロウイルスRNAまたはプロウイルスDNAの
検出用のプローブとして用いることができる。種々の方
法、例えばグリュンシュタイン−ホグネス(Grunstein
−Hogne−ess)法、サザーン(Southern)法、ノーザン
(Northern)法、ドット−ブロット(dot−blot)法、
これらの改良法並びに他の方法が開示されている。例え
ば、WO 83/02277およびベラン(Berent)等のバイオテ
クニックス(Biotechniques)、1985、3、208を参照。 有利には、上記ポリペプチドは融合タンパクとして調
製でき、ここで該ポリペプチドは該融合ポリペプチドの
N−またはC−末端であってよい。得られる融合タンパ
クはそれ自体直接試薬として用いることができ、あるい
はこの目的とするポリペプチドは該融合タンパクの残り
の配列の全体またはその一部から開裂により得ることが
できる。内部にメチオニンをもたないポリペプチドの場
合、該融合サイトにメチオニンを導入することにより、
該ポリペプチドはシアンブロミドを用いて開裂できる。
内部メチオニンをもつ場合、これはタンパク加水分解に
より開裂サイト、例えばポリリジンおよび/またはポリ
アルギニンまたはその組合せをもつ必要があり、あるい
は内部メチオニンは、シアンブロミド開裂のために添加
されたロイシンおよびN−末端をもつメチオニンなどの
アミノ酸で置換できる。ジペプチダーゼを含む広範囲の
プロテアーゼが周知であり、適当なプロセッシング信号
を適当なサイトに導入できる。このプロセッシング信号
は開裂を保証すべく直列の反復を有することができる。
というのは、1またはそれ以上の外来アミノ酸の存在は
本発明のポリペプチドの有用性を妨害しないからであ
る。 アッセイの性質に依存して、生理的サンプル、例えば
唾液、血液血漿または血清をアッセイ溶媒中に希釈して
前処理することができる。この溶媒は通常、様々なバッ
ファー、例えばリン酸バッファー、トリスバッファーな
どの一種を用いて緩衝された水性溶媒である。好ましい
希釈剤はブロットである。これは2.5w/v%の脱脂乾燥ミ
ルク、0.1%のチメロサール、0.05%のアンチフォーム
(Antifoam)Aを0.01Mリン酸ナトリウム中に添加した
ものであり、pH=7.2で、0.15MのNaClを含む。通常pHは
約6〜9の範囲内にある。次いで、このサンプルを適当
なプロトコールに従って本発明の試薬と併合し、結合の
ために十分な時間保持する。異種系を用いる場合、通常
該結合工程後、非特異的結合を最小化するために洗浄を
行う。この手順の終了時に、公知の方法に従ってラベル
を検出する。 これらアッセイにおいて目的のペプチドおよびその類
似物を使用する以外に、この目的のペプチドはそれ自体
あるいは組合せでワクチンとしても利用できることがわ
かった。これらのペプチドは適当な方法で、一般的には
宿主の体重1kg当たり1μg〜20mgの範囲の濃度で処方
できる。担体としては、生理的に許容される媒体、例え
ば滅菌水、塩水、リン酸緩衝塩水(PBS)などを使用で
きる。水酸化アルミニウムゲルなどのアジュバントを用
いることができる。投与は、例えば筋肉内、腹膜、皮
下、静脈内注射などの注射により実施できる。投与は一
回または複数回、通常4週間隔で1回実施できる。 (実施例) 以下の実施例は例示のために与えられるものであり、
本発明を限定するものではない。 実施例 ペプチドをt−ブチルオキシカルボニル(BOC)−メ
チルベンジルシステイン−フェニルアセトアミドメチル
(PAM)ポリスチレン/ジビニルベンゼン樹脂〔アプラ
イドバイオシステムズ インコーポレーション(Applie
d Biosystems,Inc.)、カリフォルニア州、フォスター
シティー(FosterCity)〕上で組立てた。対称無水物カ
ップリングをアプライドバイオシステムズ430A合成装置
内で実施した。ベンジルを主体とする側鎖の保護および
BOCα−アミン保護を利用した。トリプトファンをホル
ミル部分でおよびメチオニンをそのスルホキシドで保護
した。これら2つの保護基は公知の手法で除去した。 これらペプチドはその配列内に3H−グリシン残基を導
入することにより放射性標識した。これらペプチドを脱
保護し、かつタム(Tam)“ロー=ハイ(low−high)"H
Fプロトコール(タム等の上記文献参照)によって樹脂
から分離した。ペプチドは5%酢酸中で樹脂から抽出し
た。次いで、5%酢酸中でゲル濾過クロマトグラフィー
にかけた。 上記の如くして合成したペプチドはしばしばシステイ
ン残基を介して酸化されて、網状構造のポリマーを与え
る。これは凍結乾燥したペプチドを0.1M炭酸塩/重炭酸
塩、6Mグアニジン−HCl(pH9.0)中に、5〜10mg/mlの
範囲の濃度で溶解することにより実施した。得られる溶
液のpHを追跡し、必要ならばpH9.0に調整し、該溶液を
室温にて一夜撹拌した。得られた溶液は以下に述べるエ
リザ(ELISA)アッセイで被覆抗原として用いた。 ELISAによる分析 ペプチド123、124および126を6M Gu−HCl中の4mg/ml
濃度の原液として、あるいは上記のような酸化ペプチド
原液として保存した。ペプチド158および158Eは0.05M炭
酸塩/重炭酸塩バッファー(pH9.6)中の4mg/ml溶液と
して保存した。これらペプチドを0.05M炭酸塩/重炭酸
塩バッファー(pH9.6)で希釈して、最終濃度5〜800μ
g/mlとした。100μのアリコートをマイクロタイター
の1ウェル当たり添加し、4℃にて一夜インキュベート
した。これらプレートを次にブロット(5w/v%の脱脂乾
燥ミルク、0.01%のチメロサール、0.01%のアンチフォ
ームAを0.01Mのリン酸ナトリウム中に含み、pHは7.2で
0.15Mの塩化ナトリウムを含有する)で37℃にて1時間
遮断した。血清または血漿サンプルを希釈剤(2.5w/v%
の脱脂乾燥乳、0.01%のチメロサール、0.005%のアン
チフォームAを20mMクエン酸ナトリウム中に含む)で1:
101または1:21に希釈し、100μの希釈血清または血漿
を1ウェル当りに加え、37℃で1時間保ち、血清または
血漿を吸い取り、プレートを洗浄用バッファー中で3回
洗い、100μの山羊抗−ヒトIg/ワサビパーオキシダー
ゼ複合体(クエン酸バッファー中に1%の正常山羊血清
を含む、pH7.0の希釈剤で1:10,000に希釈)を加え、37
℃で1時間保った。該複合体を除去し、プレートを再度
上記の如く3回洗浄した。ELISAアッセイに基質溶液(p
H6.0のクエン酸塩/リン酸塩バッファー中に80μg/mlの
テトラメチルベンジジンと0.0015%の過酸化水素を含
む)を100μ/ウェル添加し、室温で30分間行った。
ウェル1こ当たり100μの3N H2SO4を加えて反応を停
止し、450〜630nmにおける光学密度の比を、自動ELISA
読取器で決定した。 pol領域からのペプチドを、ジェネティックシステム
ズコーポレーション(Genetic Systems Corp.)LAV EIA
アッセイにおいて、全ウイルス溶解物を置換するELISA
フォーマットでテストした。血清を1:101に希釈し、ペ
プチドを酸化体および無酸化体両形状で使用した。ペプ
チドI(123)は34例の正のテスト血清中30例を正とし
て認識し、11例の負の血清中11例を負と認識した(第I
表参照)。ペプチドIIは34例の正の血清中32例を正と認
識し、かつ11例の負の血清中11例を負であると認識し
た。ペプチドIIのアミノ末端から12個のアミノ酸を除去
しても、HIVにつき正の血清を識別する配列の活性は低
下しなかった。 酸化形状のペプチド(これら特別なペプチドがアッセ
イにおいて機能する必要はない)を用いると、各サンプ
ルからの信号の全体量が増した。これは、マイクロタイ
タープレートに吸着したペプチドの量が増えたことによ
るものと思われる。 ELISAフォーマットでテストしたHIVゲノムのgag領域
からのペプチドIII(158)を用い、80μg/ウェルの割合
で塗布して、血漿および血清サンプル両者をスクリーニ
ングした。第II表に示したデータはこのペプチド158が1
7例のp25の正の血漿および血清中13例を認識することを
立証している。 メチオニンがノルロイシンで置換されている、ペプチ
ド158の変性体であるペプチド158Eを用いた別のアッセ
イでは、血清または血漿を1:21に希釈用バッファーで希
釈し、サンプルと複合体とのインキュベーション時間を
30分に短縮し、工程間の洗浄を6回に増した。これらの
変更により、17例の正のサンプル中17例が正と認識され
た。 血清スクリーニングの結果を以下の第I表に総めた。 (発明の効果) 上記の結果から、本発明のポリペプチドの一種または
その組合せを用いることにより、エイズに対する抗体の
存在に関る高感度で高精度のテストが行えることは明ら
かである。完全な溶解物または完全な抗原を独立した手
法として利用できるが、本発明のペプチドは単独でまた
は混合物として、スクリーニングアッセイまたは確認ア
ッセイで利用することができる。更に、該ペプチドの特
異性のために、これをコードするDNA配列もDNA交雑アッ
セイにおいて同様の特異性をもつことがわかった。かく
して、本発明はリンパ節症々候群および/またはエイズ
のレトロウイルス病因学的試薬に曝されている患者の検
出を可能とする。 本明細書に掲載したすべての刊行物および特許出願
は、本発明の関与する分野の当業者の熟練の程度を表す
ものである。すべての刊行物および特許出願は、本明細
書において、これらが特定的にかつ個別的に参考文献と
して編入すべきことを示すかの如く、同程度に参考文献
として編入されている。 以上本発明を十分に記載したので、当業者には本発明
の精神または上記特許請求の範囲を逸脱することなく、
多くの変更並びに改善をなし得ることは明白であろう。
呼ばれる疾病が、リンパ節症ウイルス(LAV)、ヒトT
−細胞リンパ趨向性ウイルス−III(HTLV−III)、エイ
ズ−関連ウイルス(ARV)または免疫不全−関連ウイル
ス(IDAV)と命名された感染性レトロウイルスに起因す
るものであることが見出された結果、該疾病の潜在的媒
介体、例えば、発病した個体からの血液など(これは輸
血に使用されるかもしれないし、またこれら特異的な血
液因子が単離できるかも知れない)を検出し得る技術に
対する早急な需要が高まってきている。 この疾病の潜在的媒介体を検出するためには、ウイル
スタンパクおよび/またはかかるタンパクに対する抗体
を手に入れる必要がある。LAV/HTLV−IIIレトロウイル
スの育生に伴う危険性のために、該ウイルスタンパクま
たはその免疫的等価物を得るための、生きた、強力な感
染性ウイルスを大量に取扱う必要のない手段を確立する
ことが注目されている。別法を選ぶ場合には、ウイルス
が著しく多形性であり、しばしばレトロウイルスが継代
に伴って変化するものであると報告されている事実に注
意しなければならない。 (関連文献の簡単な説明) レトロウイルスの様々な抗原がザクシンジャー(Saxi
nger)等により、サイエンス(Science)、1985、227、
1036−1038に記載されている。また、ガロ(Gallo)等
のibid、1984、224、500;サランガダーン(Sarangadhar
n)等のibid、1984、224、506;バレーシヌシ(Barre−S
inoussi)等のibid、1983、220、868;モンタニエ(Mont
agnier)等の“ヒトT−細胞ロイケミア/リンフォーマ
ウイルス(Human T−cell Leu kemia/Lymphoma Viru
s)、ガロ、エセックス、グロス(Gallo,Essex,Gross)
編〔コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold S
pring Harbor Laboratory)、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク〕、1984、p363をも参照できる。こ
れらはp13、p18、p25、p36、gp43、p55、gp65、gp110な
どを含むがこれに制限されず、これら番号は報告者に応
じて異る。 ホップとウッズ(Hopp and Woods)は、プロシーディ
ングズ オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイ
エンスズ オブユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A)、1981、78、3824において、相対的な親水度に基き
ペプチドをポリペプチドの潜在的エピトープとして選択
するための基準を記載している。この基準を利用した一
研究において、12個のアミノ酸からなるペプチドが合成
され、これは天然タンパクにより誘発された抗体9%を
結合していた〔ホップ(Hopp)、モレキュラー イムノ
ロジー(Molec.Immunol.)、1981、18、869〕。一般に
ホップ/ウッズの基準は高い予測値を与えないことが示
されている。更に、エピトープはこれらが親水性ではな
いことが立証されている〔カジム(Kazim)等、バイオ
ケミカルー ジャーナル(Biochem.J.)、1982、203、2
01〕。その他のポリペプチド抗原性に関する研究はグリ
ーン(Green)等のセル(Cell)、1982、28、477に開示
された文献〔ここでは抗体を誘発するペプチドが用いら
れ、該抗体は天然タンパクに結合でき、一方逆に天然タ
ンパクにより誘発された抗体はペプチドに結合し得なか
った〕およびトレイナー(Trainer)等、ネイチャー(N
ature)、1984、312、127(このミオヘメリトリンに関
する結果はグリーン等の結果と一致した)を包含する。 LAVの完全なヌクレオチド配列はワイン−ホブソン(W
ain−Hobson)等により報告されている〔セル(Cel
l)、1985、40、9〕。HTLV−IIIの完全な配列はミュー
ジング(Muesing)等により報告されており〔ネイチャ
ー(Natuer)、1985、313、450、一方ARVの完全配列は
サンチェーペスカドール(Sauchez−Pescador)等によ
り報告されている〔サイエンス(Science)、1985、22
7、484〕。これら3種のウイルスは実質的なヌクレオチ
ド相同性を示し、かつ最適逆転写酵素活性に関する形態
学的、細胞病理学的要求および少なくともいくつかの抗
原特性に関して類似しており〔レビー(Levy)等、サイ
エンス(Science)、1984、225、840;シュプバッハ(Sh
upbach)等、サイエンス、1984、224、503〕、従って同
一のウイルスの分離体であると考えられる。チャン(Ch
ang)等のサイエンス、1985、228、93をも参照のこと。
これらの並びに他のデータを基にして、ウイルスの分類
学に関する国際委員会のヒトレトロウイルス分科会が、
この群の極めて関係深いウイルスをヒト免疫不全ウイル
ス(Human Immuno−deficiency Virus)(HIV)と命名
することを提案した(サイエンス、1986、232、697)。
この名称を本明細書でも使用する。 (発明の目的) HIVレトロウイルスのpolおよびgag領域に免疫的に類
似するタンパクをコード化し得るペプチド配列を、スク
リーニング以前にレトロウイルスに曝露された血液生成
物および血液をスクリーニングする際に使用する試薬と
して提案する。このペプチドは長さが少なくともアミノ
酸5個であり、かつHIVウイルスに対する抗体を検出
し、HIV抗原を検出するための種々の特異的結合アッセ
イにおいてまたは免疫原として使用できる。 (発明の開示および特定の態様) 本発明の開示の目的で、ウイルスは、これが実質的に
以下の基準を満たす場合には、HIVと同一またはこれと
等価であるとする。 (a) 該ウイルスがT−リンパ球、特にヘルパーT細
胞に対し刺激性である〔ベルナール(Bernard)等編、
ロイコサイト タイピング(Leucocyte Typing)、ニュ
ーヨーク、スプリンガーベルラグ、1984において規定さ
れた国際命名法によればCD4+〕。 (b) 該ウイルスが感染CD4+細胞に対し(HTLV−Iお
よびIIと同様に、形質転換というよりも)細胞変性々で
ある。 (c) 該ウイルスはRNA−依存DNAポリメラーゼ(逆転
写酵素)をコード化し、該ポリメラーゼはMg25−依存性
であり、(至適濃度=5mM)、至適pH7.8をもち、アクチ
ノマイシンDにより阻害できず、かつその3′LTRから
の逆転写のためのプライマーとしてオリゴ(dT)12-18
(oligo(dT)12-18)を利用できる。 (d) 該ウイルスはスクロース勾配下で、密度約1.16
にバンドをもっている。 (e) 該ウイルスは〔3H〕−ウリジンで標識し得る。 (f) 該ウイルスはHIVのgag、enyおよびpol領域によ
りコード化されたタンパクと実質的に免疫的に交叉反応
性である。および (g) 該ウイルスは、LAVまたはHTLV−IIIと実質的な
ヌクレオチド相同性(約75〜100%)およびアミノ酸配
列相同性(約75〜100%)をもつ。 新規ペプチドは、HIVレトロウイルスによりコードさ
れた免疫的に類似のタンパク、特に該ウイルスゲノムの
pol領域によってコードされたタンパクとして与えられ
る。異る分離体における株毎の変異に対応するために、
保存性の置換の調節並びに非−保存性の置換が関与する
その他のものからの選択を行うことができる。このペプ
チドは単独でまたは組合せで、生理的サンプル中のウイ
ルスまたは該ウイルスに対する抗体の検出のために用い
ることができる。テストプロトコルの性質に応じて、該
ペプチドは標識してもまたしなくともよく、固体表面に
結合でき、担体または他の化合物と複合化するなどが可
能である。 本発明のペプチドはpolおよびgag領域でコード化した
ペプチドから誘導される。これらのペプチドは、主とし
てpol領域のp31からおよびgag領域のp25から誘導され
る。これらのペプチドにはローマ数字を与え、また数値
的表示もなされ、これは本明細書ではこれらペプチドが
生成された方法と関連して任意的なものである。特に興
味あるのは、塩基対(bp)約4265〜bp4519、特に約bp42
65〜bp4399およびbp4385〜bp4519(より短いセグメント
bp4430〜bp4519を含む)に亘って広っているコード領域
である。また、約pb897〜bp986に亘り広っているコード
領域も特に興味深いものである。ここで番号付けは上記
のワイン−ホブソンの文献に従った。 本発明のペプチドは少なくとも5、しばしば6、しば
しば8、しばしば12で、通常約50以下、より一般的には
約35以下、好ましくは約25以下のアミノ酸を含み、これ
らはHIVレトロウイルスによってコードされる配列内に
含まれる。各例において、オリゴペプチドはできる限り
小さく、しかもより大きなペプチドの実質的にすべての
感受性を維持しているものであることが望ましい。いく
つかの例では、相互に重複しない2またはそれ以上のオ
リゴペプチドを結合させて、単一のペプチド構造を形成
するかあるいはこれらを個々のペプチドとして同時に使
用することが望ましく、これらは別々にあるいは一緒に
なって親と等価な感受性をもたらす。 これらのペプチドは、そこに保存性または非保存性の
置換を導入して、そのアミノ酸の通常20数%(number
%)以下、より一般には10数%以下を交換することによ
り変性できる。領域が多形であることがわかっているこ
れらの情況において、一またはそれ以上の特定のアミノ
酸を変えて、異るレトロウイルス株の異るエピトープに
より一層効果的に似せることが望ましい。 本発明において使用するポリペプチドは、目的とする
化合物がHIVレトロウイルス株の少なくとも一つのタン
パクと免疫的に競合し得る限り、任意の特定のHIVポリ
ペプチド配列と同一である必要はないことを理解すべき
である。従って、目的とするポリペプチドは保存性また
は非保存性の挿入、脱落、および置換などといった様々
な変化を受ける恐れがあり、これらの変化はその使用に
際してある利点をもたらすかも知れない。保存性置換と
は、gly、ala;val、ile;leu、asp;asn、gln;ser、thr;l
ys、arg;phe、tyr;およびnorleu、metなどの組内での置
換を意味する。通常、この配列はHIVレトロウイルスの
少なくとも一つの株の配列と、20%を越えて相違するこ
とはない。但し、本発明のペプチドを有利に固定化し得
る“腕(arm)”を与えるために、いずれかの末端には
追加のアミノ酸を付加できる。これらの腕の長さは通常
少なくとも一つのアミノ酸であり、かつ50またはそれ以
上、より頻繁には1〜10個のアミノ酸である。 更に、オリゴペプチドまたはペプチドの末端に1また
は2個のアミノ酸を付加して、ペプチド間の相互の結合
を容易にし、以下に述べる理由で支持体またはより大き
なペプチドへの結合を容易にし、(該ペプチドまたはオ
リゴペプチドの物理的または化学的特性を改善したりす
ることが可能である。 チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アス
パラギン酸などのアミノ酸を上記ペプチドまたはオリゴ
ペプチドのC−またはN−末端に導入して、結合用の有
用な官能性を与えることができる。システインは、他の
ペプチドとの共有結合を容易にしまたは酸化によりポリ
マーを形成するために特に好ましい。システインと介在
アミノ酸スペーサーとの組合せも有用である。例えば、
2個のシステイン残基を、炭素原子数4以下の(結合反
応の妨害を避けるためには小さな寸法のものが望まし
い)単一の側鎖をもつ1またはそれ以上のα−アミノ酸
によって分離できる。グリシン残基はこの理由から好ま
しく、特に結合を容易にするために、アミノ酸間に1〜
3個のグリシン残基が添加される。システイン残基は、
酸化により網状ポリマーを形成する際に特に有用であ
る。このような場合、好ましくはペプチドの末端部分に
付加されたシステイン残基を用いて、結合されている分
子内に少なくとも3個のシステイン残基を含むことが好
ましい。 更に、本発明のペプチドまたはオリゴペプチドは、そ
の配列が末端NH2アシル化、例えばアセチル化、あるい
はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシルアミド
化(例えばアンモニアまたはメチルアミンによる)など
で、支持体または他の分子と結合するサイトを形成する
ために変性されていることから、天然の配列と異る配列
をもつことができる。 以下、興味あるペプチドおよびオリゴペプチドについ
て考察する。bp4265〜bp4399の領域にコード化されたペ
プチドI(126)は以下のアミノ酸配列を有し、ここで
以下の配列内に含まれるオリゴペプチドはかかる配列内
に線形のエピトープを含んでいる。 ここで、XおよびYは場合により存在し、存在する場
合には該ペプチドとタンパク担体または他のペプチドと
の共有結合形成を容易にし、あるいは酸化によって、付
加されたシステイン残基を介して重合することを容易に
するアミノ酸を表し、Zはカルボキシル末端をもつアミ
ノ酸が遊離カルボキシルおよびアミドのいずれかとして
存在することを示す。XおよびYが存在する場合、好ま
しい態様は、XとYとが夫々独立に1またはそれ以上の
システインあるいは1またはそれ以上のシステインとス
ペーサアミノ酸との組合せを表すものとして存在する。
好ましいスペーサアミノ酸は炭素原子数4以下の単一の
側鎖をもつα−アミノ酸残基である。グリシンが特に好
ましいスペーサである。酸化重合に用いる好ましいペプ
チドは、XとYとが一緒に少なくとも3個のシステイン
残基を表すものである。該ペプチドの同一端部に2つの
システイン残基がある場合、好ましい態様は、該システ
イン残基が1〜3個のスペーサアミノ酸残基、好ましく
はグリシン残基によって分離されているものである。 このペプチドは、HIVゲノムによりコードされた約45
以下のアミノ酸を有することが好ましい。 以下のペプチドII(123)は約bp4385〜bp4519ひ亘っ
て広っている領域によりコードされ、かつ以下に示す配
列を有している。ここで、以下の配列内に含まれるオリ
ゴペプチドはこのような配列内に線形のエピトープを含
んでいる。 ここでアミノ末端Yおよびカルボキシル末端X−Zは
上記定義通りである。 もう一つの興味あるオリゴペプチドII aは以下の配列
をもつ。 但し、X、YおよびZは上記定義通りである。 gag領域に対して、ペプチドIII(158)は約bp897〜bp
986に亘り広った領域によりコード化され、かつ以下に
示す配列を有している。ここで、以下の配列内に含まれ
るオリゴペプチドは該配列内に線状のエピトープを含
む。但し、X、YおよびZは上記定義通りである。 特に興味あるのは、末端アミノ基などをアシル化し
て、ジスルフイド結合あるいはより長い結合により2つ
のペプチドまたはオリゴペプチドもしくはその組合せを
結合するのに利用される、システインまたはチオグリコ
ール酸のメルカプト基の利用である。これを達成するに
は、ビス−ハロアセチル基、ニトロアリールハライドな
どを有し、チオ基に対して特異的な化合物を用いること
ができる。かくして、異なるペプチドまたはオリゴペプ
チドの2つのメルカプト基間の結合は単結合あるいは炭
素原子数少なくとも2、通常少なくとも4で、しかも約
16以下、通常約14以下を有する結合基であり得る。 目的とするペプチドは可溶性巨大分子(例えば≧5キ
ロダルトン)担体に結合して使用できる。有利には、こ
の担体はポリ(アミノ酸)であり、これは天然、合成の
いずれでもよく、これに対する抗体はヒト血清中にはみ
られない。ポリペプチドの例はポリ−L−リジン、牛血
清アルブミン、笠貝(keyhole limpet)ヘモシアニン、
牛γ−グロブリンなどを包含する。これらの選択は主と
して便宜的および入手容易性による。 このような複合体に関連して、巨大分子1分子当たり
少なくとも1種の目的とするペプチドを少なくとも1分
子、即ち巨大分子0.5キロダルトン当たり約1以下、通
常巨大分子2キロダルトン当たり約1以下である。同一
の巨大分子に1またはそれ以上の異るペプチドを結合で
きる。 結合方法は公知であり、p−マレイミド安息香酸、p
−メチルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水コハク
酸、グルタルアルデヒドなどの試薬を利用する。この結
合は分子のN−末端、C−末端または末端間の中間部位
で起こる。目的とするペプチドは結合により得ることも
でき、支持体などに結合したまま相互に結合することも
できる。 上記化合物はその用途に応じて標識したまたは未標識
化合物として使用できる。(ここで標識とは直接または
間接的に分子が検出可能な信号を与えることを意味す
る)。種々の標識、例えば放射性核種、酵素、蛍光物
質、化学発光物質、酵素基質、コファクターまたは阻害
剤、粒子例えば磁性粒子、リガンドと受容体との組合
せ、例えばビオチンとアビジンなどを利用できる。更
に、これらのポリペプチドは、例えばマイクロタイター
プレート、ガラスビーズ、クロマト材料表面、例えば
紙、セルロース、シリカゲルなどの表面に結合する種々
の方法で変性できる。ポリペプチドを他の化合物または
表面に結合する特別な方法は公知であり、文献中に多数
の例を見出すことができる。例えば、米国特許第4,371,
515号および同第4,487,715号並びにこれら特許に引用さ
れている特許を参照できる。 レトロウイルスタンパクに対する抗体またはレトロウ
イルスタンパク自体のいずれかの存在を検出する種々の
アッセイプロトコルが利用できる。特に興味深いのは該
ペプチドを標識試薬として使用するものであり、あるい
は該ペプチドを直接または間接的に表面に結合するもの
であり、前者ではラベルが検出可能な信号を与え、後者
ではサンプル中の該ペプチドに対する抗体が該表面上の
ペプチドに結合することになる。従って、該ペプチドに
結合したヒト抗体の存在はヒト免疫グロブリン、通常ヒ
トIgMおよびIgGの両者に特異的な異種間抗体を用い、あ
るいは免疫複合体、例えばRf因子またはS. オーレウス
(aureus)タンパクAに対して特異的な標識タンパクを
用いることにより検出できる。 競争的または非競争的な、様々な異種プロトコルを使
用できる。ペプチドは表面または支持体(“サポート
(support)”)および標識抗体に結合でき、かつ標識
抗体はサンプル内の抗体と限られた量の結合ペプチドを
争うことができる。支持体に結合するラベルの量はサン
プル中の競争的抗体の量に関係する。 抗体は支持体に結合でき、また標識ペプチドと結合し
たサンプルと結合できる。反応混合物と結合抗体とを接
触させた後、支持体に結合したラベルの量はサンプル中
の同種の抗体量に関係している。 異種間抗−ヒト抗体、例えば免疫グロブリンIgGおよ
びIgMのFcに対する抗体は支持体に結合できた。サンプ
ルは免疫グロブリンおよび標識ペプチドと接触され、支
持体に結合した標識ペプチドの量は同種抗体の存在を表
示する。 また、同質アッセイが利用でき、そこでは該ペプチド
は酵素、蛍光物質または他のラベルに結合し、ここで抗
体とペプチドとの結合は特異的結合対錯体に関与するラ
ベルと該錯体に関与していないラベルとの間の識別を可
能とする。このような技術を用いるアッセイについて
は、例えば米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、
同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533
号、同第3,996,345号、同第4,034,074号および同第4,09
8,876号を参照でき、これらは本発明の参考文献とす
る。 本発明の一例として、目的のペプチドは蛍光物質、例
えばフルオレセイン、ローダミンまたはウンベリフェロ
ンに複合化できる。抗体との錯体形成を検出するには、
種々の方法、例えば蛍光偏光法が利用できる。このアッ
セイにおいて、蛍光偏光は錯化されたおよび錯化されて
いないペプチド複合体間で異っている。この蛍光偏光に
おける変化を測定するための装置として、例えばアボッ
トラボラトリーズ(Abbott Laboratories;イリノイ州シ
カゴ)により供給されているTDxなどが入手できる。 アッセイ法の例はサンプル容器、例えばマイクロタイ
タープレートのウェルを用い、本発明のポリペプチドま
たはその複合体を該容器の底および/または壁に、共有
結合的にまたは非共有結合的に付着させる。サンプル、
即ち通常適当な緩衝溶媒で希釈したヒト血液または血清
を該容器に加え、該ポリペプチドとサンプル中の任意の
同種抗体との錯体形成するのに十分な時間保持する。上
澄を除き、かつ非特異的に結合したタンパクを除くため
に該容器を洗浄する。 錯体に特異的に結合した、標識された特異的結合タン
パクを検出に用いる。該容器に、ヒト免疫グロブリンに
対する異種抗血清、特に適当に緩衝された媒質中の抗−
(ヒトIgMおよびIgG)を加えることができる。この異種
抗血清は検出可能なラベル、例えば放射性核種または酵
素で通常標識される。抗血清の代りに、免疫錯体に特異
的なタンパク、例えばS. オーレウス(aureus)タンパ
クAを用いることができる。次いで、ラベルを検出す
る。例えば、酵素を用いた場合、非特異的に結合した酵
素ラベルを除去した後、現像剤溶液を添加する。この現
像剤溶液は酵素基質および場合によっては酵素コファク
タ、色素原などを含み、これらは反応の際に夫々比色法
であるいは蛍光測定法で検出し得る着色または蛍光性生
成物を与える。 本発明のペプチドは種々の方法で調製できる。これら
は比較的短い寸法をもつので、該ペプチドは公知の方法
に従って、溶液中で、あるいは固体支持体上で合成でき
る。今日では種々の自動合成装置が市販品として入手で
き、しかも公知のプロトコルに従って使用できる。これ
については、例えばスチュアートおよびヤング(Stewar
t and Young)の固相ペプチド合成(Solid Phase Pepti
de Synthesis)、第2版、ピアースケミカルコーポレー
ション(Pierce Chemical Co.)、1984およびタム(Ta
m)等のジャーナル オブ アメリカンケミカルソサイ
アティー(J.Am、Chem.Soc.)、1983、105、6442を参照
できる。 また、ハイブリッドDNA技術も利用でき、これによれ
ば合成遺伝子が、該ポリペプチドをコードする一本鎖あ
るいはその実質的な相補償を用いることにより調製で
き、ここで一本鎖を重ね合せ、かつ交雑のために一緒に
アニール溶媒中に入れることができる。交雑鎖を次に結
合して完全な遺伝子を形成することができ、しかも適当
な末端を選ぶことにより、該遺伝子を表現ベクタ(これ
らは今日では容易に入手できる)内に挿入することがで
きる。これについては、例えばマニアティス(Maniati
s)等の“モレキュラークローニング、ア ラボラトリ
ーマニュアル(Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l)、“CSH、コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、1982を参照できる。あるいは、該ペプチドをコード
するウイルスゲノムの領域を公知の組換えDNA技術によ
りクローン化し、かつ表現させることが可能である〔上
記マニアティス(Maniatis)の文献参照〕。 該ペプチドを表現するのに使用できるDNAコード化配
列は以下のものを含む。 これら配列からの断片はペプチド断片を表現するのに
利用でき、保存的塩基交換を行うことができ(ここで、
変えられたコドンは同一のアミノ酸をコードする)、あ
るいはコード化配列内に非保存的交換をなすことができ
る(ここで得られるアミノ酸は、前に議論したように、
該アミノ酸配列中で保存性または非保存性交換であり得
る)。 このコード化配列は5′−または3′−末端あるいは
両末端において延長でき、これによりペプチドを伸長で
き、一方でそのエピトープサイトは保持される。この延
長の際結合用、例えば酵素などのラベルに結合するた
め、2またはすべてのペプチドを同一の鎖内に一緒に結
合するため、あるいは抗原活性を付与するために腕を与
えることが可能である。 表現のためには、コード化配列は開始並びに停止コド
ン、プロモータおよびターミネータ領域並びに細胞宿
主、例えば原核生物または真核生物、バクテリア、酵
母、哺乳動物細胞中で表現するための表現ベクタを与え
る通常の複製系を備えている。 通常少なくとも15個の塩基、好ましくは少なくとも18
個の塩基をもつ上記配列自体、その断片またはより大き
な配列を、レトロウイルスRNAまたはプロウイルスDNAの
検出用のプローブとして用いることができる。種々の方
法、例えばグリュンシュタイン−ホグネス(Grunstein
−Hogne−ess)法、サザーン(Southern)法、ノーザン
(Northern)法、ドット−ブロット(dot−blot)法、
これらの改良法並びに他の方法が開示されている。例え
ば、WO 83/02277およびベラン(Berent)等のバイオテ
クニックス(Biotechniques)、1985、3、208を参照。 有利には、上記ポリペプチドは融合タンパクとして調
製でき、ここで該ポリペプチドは該融合ポリペプチドの
N−またはC−末端であってよい。得られる融合タンパ
クはそれ自体直接試薬として用いることができ、あるい
はこの目的とするポリペプチドは該融合タンパクの残り
の配列の全体またはその一部から開裂により得ることが
できる。内部にメチオニンをもたないポリペプチドの場
合、該融合サイトにメチオニンを導入することにより、
該ポリペプチドはシアンブロミドを用いて開裂できる。
内部メチオニンをもつ場合、これはタンパク加水分解に
より開裂サイト、例えばポリリジンおよび/またはポリ
アルギニンまたはその組合せをもつ必要があり、あるい
は内部メチオニンは、シアンブロミド開裂のために添加
されたロイシンおよびN−末端をもつメチオニンなどの
アミノ酸で置換できる。ジペプチダーゼを含む広範囲の
プロテアーゼが周知であり、適当なプロセッシング信号
を適当なサイトに導入できる。このプロセッシング信号
は開裂を保証すべく直列の反復を有することができる。
というのは、1またはそれ以上の外来アミノ酸の存在は
本発明のポリペプチドの有用性を妨害しないからであ
る。 アッセイの性質に依存して、生理的サンプル、例えば
唾液、血液血漿または血清をアッセイ溶媒中に希釈して
前処理することができる。この溶媒は通常、様々なバッ
ファー、例えばリン酸バッファー、トリスバッファーな
どの一種を用いて緩衝された水性溶媒である。好ましい
希釈剤はブロットである。これは2.5w/v%の脱脂乾燥ミ
ルク、0.1%のチメロサール、0.05%のアンチフォーム
(Antifoam)Aを0.01Mリン酸ナトリウム中に添加した
ものであり、pH=7.2で、0.15MのNaClを含む。通常pHは
約6〜9の範囲内にある。次いで、このサンプルを適当
なプロトコールに従って本発明の試薬と併合し、結合の
ために十分な時間保持する。異種系を用いる場合、通常
該結合工程後、非特異的結合を最小化するために洗浄を
行う。この手順の終了時に、公知の方法に従ってラベル
を検出する。 これらアッセイにおいて目的のペプチドおよびその類
似物を使用する以外に、この目的のペプチドはそれ自体
あるいは組合せでワクチンとしても利用できることがわ
かった。これらのペプチドは適当な方法で、一般的には
宿主の体重1kg当たり1μg〜20mgの範囲の濃度で処方
できる。担体としては、生理的に許容される媒体、例え
ば滅菌水、塩水、リン酸緩衝塩水(PBS)などを使用で
きる。水酸化アルミニウムゲルなどのアジュバントを用
いることができる。投与は、例えば筋肉内、腹膜、皮
下、静脈内注射などの注射により実施できる。投与は一
回または複数回、通常4週間隔で1回実施できる。 (実施例) 以下の実施例は例示のために与えられるものであり、
本発明を限定するものではない。 実施例 ペプチドをt−ブチルオキシカルボニル(BOC)−メ
チルベンジルシステイン−フェニルアセトアミドメチル
(PAM)ポリスチレン/ジビニルベンゼン樹脂〔アプラ
イドバイオシステムズ インコーポレーション(Applie
d Biosystems,Inc.)、カリフォルニア州、フォスター
シティー(FosterCity)〕上で組立てた。対称無水物カ
ップリングをアプライドバイオシステムズ430A合成装置
内で実施した。ベンジルを主体とする側鎖の保護および
BOCα−アミン保護を利用した。トリプトファンをホル
ミル部分でおよびメチオニンをそのスルホキシドで保護
した。これら2つの保護基は公知の手法で除去した。 これらペプチドはその配列内に3H−グリシン残基を導
入することにより放射性標識した。これらペプチドを脱
保護し、かつタム(Tam)“ロー=ハイ(low−high)"H
Fプロトコール(タム等の上記文献参照)によって樹脂
から分離した。ペプチドは5%酢酸中で樹脂から抽出し
た。次いで、5%酢酸中でゲル濾過クロマトグラフィー
にかけた。 上記の如くして合成したペプチドはしばしばシステイ
ン残基を介して酸化されて、網状構造のポリマーを与え
る。これは凍結乾燥したペプチドを0.1M炭酸塩/重炭酸
塩、6Mグアニジン−HCl(pH9.0)中に、5〜10mg/mlの
範囲の濃度で溶解することにより実施した。得られる溶
液のpHを追跡し、必要ならばpH9.0に調整し、該溶液を
室温にて一夜撹拌した。得られた溶液は以下に述べるエ
リザ(ELISA)アッセイで被覆抗原として用いた。 ELISAによる分析 ペプチド123、124および126を6M Gu−HCl中の4mg/ml
濃度の原液として、あるいは上記のような酸化ペプチド
原液として保存した。ペプチド158および158Eは0.05M炭
酸塩/重炭酸塩バッファー(pH9.6)中の4mg/ml溶液と
して保存した。これらペプチドを0.05M炭酸塩/重炭酸
塩バッファー(pH9.6)で希釈して、最終濃度5〜800μ
g/mlとした。100μのアリコートをマイクロタイター
の1ウェル当たり添加し、4℃にて一夜インキュベート
した。これらプレートを次にブロット(5w/v%の脱脂乾
燥ミルク、0.01%のチメロサール、0.01%のアンチフォ
ームAを0.01Mのリン酸ナトリウム中に含み、pHは7.2で
0.15Mの塩化ナトリウムを含有する)で37℃にて1時間
遮断した。血清または血漿サンプルを希釈剤(2.5w/v%
の脱脂乾燥乳、0.01%のチメロサール、0.005%のアン
チフォームAを20mMクエン酸ナトリウム中に含む)で1:
101または1:21に希釈し、100μの希釈血清または血漿
を1ウェル当りに加え、37℃で1時間保ち、血清または
血漿を吸い取り、プレートを洗浄用バッファー中で3回
洗い、100μの山羊抗−ヒトIg/ワサビパーオキシダー
ゼ複合体(クエン酸バッファー中に1%の正常山羊血清
を含む、pH7.0の希釈剤で1:10,000に希釈)を加え、37
℃で1時間保った。該複合体を除去し、プレートを再度
上記の如く3回洗浄した。ELISAアッセイに基質溶液(p
H6.0のクエン酸塩/リン酸塩バッファー中に80μg/mlの
テトラメチルベンジジンと0.0015%の過酸化水素を含
む)を100μ/ウェル添加し、室温で30分間行った。
ウェル1こ当たり100μの3N H2SO4を加えて反応を停
止し、450〜630nmにおける光学密度の比を、自動ELISA
読取器で決定した。 pol領域からのペプチドを、ジェネティックシステム
ズコーポレーション(Genetic Systems Corp.)LAV EIA
アッセイにおいて、全ウイルス溶解物を置換するELISA
フォーマットでテストした。血清を1:101に希釈し、ペ
プチドを酸化体および無酸化体両形状で使用した。ペプ
チドI(123)は34例の正のテスト血清中30例を正とし
て認識し、11例の負の血清中11例を負と認識した(第I
表参照)。ペプチドIIは34例の正の血清中32例を正と認
識し、かつ11例の負の血清中11例を負であると認識し
た。ペプチドIIのアミノ末端から12個のアミノ酸を除去
しても、HIVにつき正の血清を識別する配列の活性は低
下しなかった。 酸化形状のペプチド(これら特別なペプチドがアッセ
イにおいて機能する必要はない)を用いると、各サンプ
ルからの信号の全体量が増した。これは、マイクロタイ
タープレートに吸着したペプチドの量が増えたことによ
るものと思われる。 ELISAフォーマットでテストしたHIVゲノムのgag領域
からのペプチドIII(158)を用い、80μg/ウェルの割合
で塗布して、血漿および血清サンプル両者をスクリーニ
ングした。第II表に示したデータはこのペプチド158が1
7例のp25の正の血漿および血清中13例を認識することを
立証している。 メチオニンがノルロイシンで置換されている、ペプチ
ド158の変性体であるペプチド158Eを用いた別のアッセ
イでは、血清または血漿を1:21に希釈用バッファーで希
釈し、サンプルと複合体とのインキュベーション時間を
30分に短縮し、工程間の洗浄を6回に増した。これらの
変更により、17例の正のサンプル中17例が正と認識され
た。 血清スクリーニングの結果を以下の第I表に総めた。 (発明の効果) 上記の結果から、本発明のポリペプチドの一種または
その組合せを用いることにより、エイズに対する抗体の
存在に関る高感度で高精度のテストが行えることは明ら
かである。完全な溶解物または完全な抗原を独立した手
法として利用できるが、本発明のペプチドは単独でまた
は混合物として、スクリーニングアッセイまたは確認ア
ッセイで利用することができる。更に、該ペプチドの特
異性のために、これをコードするDNA配列もDNA交雑アッ
セイにおいて同様の特異性をもつことがわかった。かく
して、本発明はリンパ節症々候群および/またはエイズ
のレトロウイルス病因学的試薬に曝されている患者の検
出を可能とする。 本明細書に掲載したすべての刊行物および特許出願
は、本発明の関与する分野の当業者の熟練の程度を表す
ものである。すべての刊行物および特許出願は、本明細
書において、これらが特定的にかつ個別的に参考文献と
して編入すべきことを示すかの如く、同程度に参考文献
として編入されている。 以上本発明を十分に記載したので、当業者には本発明
の精神または上記特許請求の範囲を逸脱することなく、
多くの変更並びに改善をなし得ることは明白であろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 リンダ ジェイ ハリス
アメリカ合衆国 ワシントン州 98112
シアトル シックスティーンス アベ
ニュー イースト 1214
(72)発明者 レイ エル ホートン
アメリカ合衆国 ワシントン州 98034
カークランド ワンハンドレッドアン
ドテンス アベニュー ノースイースト
14018
(56)参考文献 特開 昭60−50068(JP,A)
CELL,Vol.40.(1985)p.
9−17
NATURE,Vol.313,(1985)
p.450−458
SCIENCE,Vol.227,
(1985)p.484−492
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.試料を、免疫学的にHIVエピトープ部位と競合的な
エピトープ部位を有する調合物と一緒にし、それによっ
て抗体を該タンパク調合物と結合させて少なくとも1種
の特異的結合対錯体を形成し、かつ該錯体形成の存在又
は量を測定することを含むHIVウイルスまたはHIVウイル
スに対する抗体の存在の検出法であって、 検定培地内で、試薬として、HIVレトロウイルスゲノム
のgag領域においてコードされる以下に示す配列 または、HIVレトロウイルスゲノムのpol領域においてコ
ードされる以下に示すペプチド配列の少なくとも一つの
配列内にある少なくとも12個の連続するアミノ酸を配列
中に有する12〜50個のアミノ酸配列 を有する少なくとも1種のペプチドを含有する調合物を
使用する方法。 2.ペプチドの1つが下記配列の1つを含む、特許請求
の範囲第(1)項記載の方法。 3.調合物が固体表面に結合されている特許請求の範囲
第(1)項記載の方法。 4.ペプチドが、巨大分子としての、少なくとも5キロ
ダルトンの水溶性タンパクに結合されている特許請求の
範囲第(3)項記載の方法。 5.ペプチドの2つが単結合または架橋基を介して一緒
に共有結合されていることを特徴とする特許請求の範囲
第(3)項記載の方法。 6.試料がヒト生理液体試料であって、 錯体形成を生ずるのに十分な時間インキュベートする工
程、及び 該錯体と結合して検出可能な信号を提供する標識された
特異的結合タンパクを使用することにより錯体形成を検
出する工程 を含む、特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 7.標識が蛍光体である特許請求の範囲第(6)項記載
の方法。 8.標識が酵素である特許請求の範囲第(6)項記載の
方法。 9.HIVレトロウイルスゲノムのgag領域又はpol領域に
おいてコードされる以下に示すアミノ酸配列を有するペ
プチド。 10.式(I)(126)をもつ特許請求の範囲(9)記
載のペプチド。 11.式(II)(123)をもつ特許請求の範囲(9)記
載のペプチド。 12.式(II a)(124)をもつ特許請求の範囲(9)
記載のペプチド。 13.式(III)(158)をもつ特許請求の範囲(9)記
載のペプチド。
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-
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