NO173034B - Fremgangsmaate og peptider for paavisning av aids-relatert sykdom - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte som angitt i krav l's ingress, og et peptid for anvendelse deri som angitt i krav 5's ingress.

Oppfinnelsesområde

Ved oppdagelsen av at sykdommen kalt lymfadenopati syndrom og tilegnet immunsvikt sykdom (AIDS) forårsakes av en infeksjonsretrovirus kalt lymfadenopativirus (LAV), human T-celle lymfotropvirus-III (HTLV-III), AIDS-relatert virus (ARV) eller immunsvikt assosiert virus (IDAV), har det oppstått et øyeblikkelig behov for å kunne påvise potensielle vektorer for sykdommen, så som blod fra personer med sykdommen, som kan anvendes for transfusjoner eller hvorfra spesifikke blodfaktorer kan isoleres.

For å påvise potensielle vektorer for sykdommen, er det nødvendig å ha virusproteiner og/eller antistoffer mot slike proteiner. På grunn av farene i forbindelse med dyrking av LAV/HTLV-III-retrovirus er det betydelig interesse for å fremskaffe midler for å fremstille virusproteiner eller deres immunologiske ekvivalenter som ikke betyr at man må håndtere store volumer av levende, potensiell infeksjonsvirus. Ved å velge alternativer, må man ta hensyn til det faktum at virusene er rapportert å være meget polymorfe og hyppig forandrer seg når retrovirusen er i omløp.

Kort beskrivelse av den relevante litteratur.

De forskjellige antigener for retrovirusen er beskrevet av Saxinger et al., Science (1985) 227:1036-1038. Se også Gallo et al., ibid. (1984) 224:500; Sarangadharn et al., ibid. 224:506; Barre-Sinoussi et al., ibid. (1983) 220:868; Montagnier et al., i Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, Gallo, Essex, Gross eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), 1984, s.3 63. Disse kan inbefatte, men er ikke begrenset til, pl3, pl8, p25, p36, gp43, p55, gp65, gpllO, osv., hvor tallet kan variere avhengig av den som rapporterer.

Hopp and Woods, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78.: 3824, beskriver kriterier for å velge ut peptidet som potensielle epitoper for polypeptider basert på deres relative hydrofilitet. I en undersøkelse som anvender disse kriterier, ble et 12-aminosyrepeptid syntetisert som bandt 9% av anti-stoffene frembrakt av det opprinnelige protein (Hopp, Molec. Immunol. (1981) _18:869). Generelt er Hopp/Woods kriterier ikke vist å ha en høy forutsigelsesverdi. Videre er epitoper blitt påvist som ikke er hydrofile (Kazim et al. , Biochem. J.

(1982) 203:201). Andre studier av polypeptid antigenitet er Green et al., Cell (1982) 28:477, hvor polypeptider ble anvendt som fremlagte antistoffer, hvilke antistoffer var istand til å binde til det opprinnelige protein, mens derimot antistoffer som var frembrakt av det opprinnelige protein ikke bandt til peptidene, og Trainer et al., Nature (1984) 312:127, hvis resultater med myohaemerytrin var sammenfallende med Green et al.

Den fullstendige nukleotidsekvens for LAV er beskrevet av Wain-Hobson et al., Cell (1985) 40:9. Den fullstendige sekvens for HTLV-III er rapportert av Muesing et al., Nature

(1985) 313:450, mens den fullstendige sekvens for ARV er rapportert av Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227:484. Alle tre virus viser betydelig nukleotid homologi og har likheter med hensyn til morfologi, cytopatologi, behov for optimum reverstranskriptaseaktivitet, og i det minste noen antigenegenskaper (Levy et al., Science (1984) 225:840; Shupback et al., Science (1984) 224:503), og bør følgelig betraktes som isolater av den samme virus. Se også Chang et al., Science (1985) 228:93.

Oppfinnelsen er kjennetegnet ved de trekk som fremgår av krav l's og krav 5's karakteriserende deler.

Peptidsekvenser med evne til å immitere proteiner immunologisk kodet i gag og/eller env områdene av LAV/HTLV-III retrovirus tilveiebringes som reagenser for bruk i undersøkelsen av blod og blodprodukter for forutgående eksponering for retrovirus. Peptidene kan brukes i forskjellige spesifikke bindingsmålinger for påvisning av antistoffer til LAV/HTLV-III virus, for påvisning av LAV/HTLV-III antigener eller som immunogener.

Beskrivelse av spesifikke utførelsesformer

I forbindelse med denne beskrivelse anses et virus å være det samme som eller ekvivalent med LAV/HTLV-III hvis det i det vesentlige oppfyller de følgende kriterier: (a) Viruset er tropisk for T-lymfocyter, spesielt T-hjelpe-celler (CDA<A+>, ifølge den internasjonale nomenklatur definert i Bernard et al., eds. Leucocvte Typing. New York: Springer Verlag, 1984); (b) viruset er cytopatisk for infiserte CD<4+> celler (istedet for transformerende, så som HTLV-I og -II er) ; (c) viruset koder for en RNA-avhengig DNA polymerase (revers transkriptase) som er Mg<2+->avhengig (optimums konsentrasjon 5mM), har et pH optimum på 7,8, ikke inhiberes av aktinomysin D, og kan anvendes oligo (dT) 12.18 som en primer for revers transkripsjon fra sin 3' LTR; (d) virus-båndene i en sukrosegradient ved en densitet på ca. 1,16; (e) viruset kan merkes med [<3>H]-uridin; (f) viruset er hovedsakelig kryss-reaktiv immunologisk med proteinet som kodes for av gag og env områdene av LAV/HTLV-III; og (g) viruset deler hovedsakelig nukleotidhomologi (ca.75-100%) og aminosyresekvens-homologi (ca. 75-100%) med LAV eller

HTLV-III.

Nye peptider frembringes som immunologisk imiterer proteiner kodet for av LAV/HTLV-III retrovirus, spesielt proteiner kodet for av gag og/eller env områdene i virusgenomet. For å romme stamme-til-stamme-variasjoner blant forskjellige isolater, kan justeringer for konservative substitusjoner og seleksjon blant alternativene hvor ikke konservative substitusjoner inngår, foretas. Disse peptider kan brukes enkeltvis eller sammen for påvisning av viruset eller av antistoffer mot viruset i en fysiologisk prøve. Avhengig av forsøksforskriftens art, kan peptidene være merket eller ikke merket, bundet til fast overflate, konjugert med en bærer eller andre forbindelser, eller lignende.

De aktuelle peptider vil stamme fra peptider kodet for av gag området eller env området. Disse peptider vil primært stamme fra p55 eller fragmenter derav, f.eks. p25 og pl8, eller gpl50 og fragmentene derav, f.eks. gp41. Disse peptider vil være gitt romertall, men vil også blir gitt numeriske betegnelser som har tilfeldig sammenheng med den måte de er fremstilt på.

For gag området er kodeområdene som går fra ca. basepar (bp) 450 til bp 731 av spesiell interesse, spesielt fra ca. bp 450 til bp 545 (97) og bp 696 til bp 731 (71); fra ca, bp 900 til bp 1421, spesielt fra ca. bp 921 til bp 1016 innbefattende bp 921 til bp 1010, bp 972 til bp 1060 (92); og bp 936 til.bp 995 (17); eller fra ca. bp 1158 til ca. bp 1400, spesielt bp 1164 til bp 1250 (90), bp 1278 til bp 1385 (88); og bp 1320 til bp 1385 (15) , eller av LAV/HTLV-III retrovirus.

(Nummerering ifølge Wain-Hobson et al. , ovenfor).

For env området vil områdene av spesiell intreresse være slike polypeptider som kodes for innenfor bp 7210 til bp 7815 områdene, spesielt innenfor bp 7231 til bp 7794, særlig innenfor ca. bp 7246 t.o.m. bp 7317 (36), bp 7516 t.o.m. bp 7593 (39), spesielt bp 7543 t.o.m. bp 7593 (79) og bp 7561 t.o.m. 7593 (78), bp 7708 t.o.m. 7779 (23), bp 7630 t.o.m. bp 7689 (40), bp 7498 t.o.m. bp 7554 (56).

Peptidene av interessse vil inneholde minst fem, noen ganger seks, noen ganger åtte, noen ganger tolv, normalt mindre enn ca. 50, enda heller færre enn ca. 35, og fortrinnsvis færre enn ca. 2 5 aminosyrer i en sekvens kodet for av LAV/HTLV-III retrovirus. I hvert tilfelle er det ønskelig at oligopeptidet er så lite som mulig, mens samtidig hovedsakelig hele sensitiviteten til det større peptidet bibeholdes. I noen tilfeller kan det være ønskelig å skjøte to eller flere oligopeptider som ikke er overlappende i den samme peptidstruktur eller som enkeltpeptider, hvilke separat eller tilsammen gir ekvivalent sensitivitet som det opprinnelige.

Peptidene kan modifiseres ved å innføre konservative eller ikke-konservative substitusjoner i peptidene, normalt færre enn 2 0 antall prosent, enda heller færre enn 10 antall prosent av peptidene er utskiftet. I de situasjoner hvor områdene finnes å være polymorfe, kan det være ønskelig å variere én eller flere enkelte aminosyrer for mer effektivt å imitere de forskjellige epitoper for de forskjellige retrovirus-stammer. I mange tilfeller kan metionin erstattes med norleucin (Nor), for å få kjemisk og fysikalsk stabilitet.

Det bør være klart at polypeptidene som anvendes i foreliggende oppfinnelse ikke behøver å være identiske med noen spesiell LAV/HTLV-III polypeptidsekvens, så lenge de foreliggende forbindelser er istand til å gi immunologisk konkurranse med proteiner fra minst én av stammene av LAV/HTLV-III retrovirus.

Derfor kan de foreliggende polypeptider være gjenstand for forskjellige forandringer så som innskudd, delesjoner og substitusjoner, enten konservative eller ikke-konservative, hvor slike forandringer kan gi bestemte fordeler ved bruk av dem. Med konservative substitusjoner menes kombinasjoner såsom gly, ala; val, ile, leu; asp, glu* asn, gin; ser, thr; lys, arg; og phe, tyr. Normalt vil sekvensen ikke atskille seg med mer enn 2 0% fra sekvensen til minst én stamme av et LAV/HTLV-III retrovirus, unntatt hvor ytterligere aminosyrer kan tilføyes ved begge endene i den hensikt å gi en "arm" hvormed peptidene i denne oppfinnelse lett kan immobiliseres. Armene vil normalt ha minst én aminosyre og kan være 50 eller flere aminosyrer, oftere 1 til 10 aminosyrer.

I tillegg kan én eller to aminosyrer tilføyes endene av et oligopeptid eller peptid for å lette binding av peptider til hverandre, for kobling til en bærer eller større peptid av grunner som skal omtales i det følgende, for å modifisere de fysikalske eller kjemiske egenskapene til peptidet eller oligopeptidet eller lignende.

Aminosyrer såsom tyrosin, cystein, lysin, glutamin- eller aspartin-syre eller lignende kan innføres ved C- eller N-enden av peptidet eller oligopeptidet for å muliggjøre en anvendelig funksjonalitet for binding. Av spesiell mLeresse er at det foreligger fra 1 til 3 cysteiner ved C- eller N-enden for binding til en bærer. Cysteinet kan bindes gjennom en disulfidbinding til en ditio- eller tio-funksjonalisert bærer på en tioeterbinding til en aktivert olefinbærer.

I tillegg kan peptid- eller oligopeptid-sekvensene atskille seg fra den naturlige sekvens ved at sekvensen modifiseres med ende-NH2-acylering, f.eks. acetylering eller tioglykolsyre-amidering, ende-karboksy-amidering, f.eks. ammoniakk, metylamin, osv. I noen tilfeller kan disse modifikasjonene gi punkter for binding til en bærer eller et annet molekyl.

Peptidene og oligopeptidene av interesse skal man nå se nærmere på. De første peptidene av interesse vil stamme fra gag området, spesielt proteinet som kalles p25 og pl8.

Peptidene for p25 er som følger:

peptidet I (15) som kodes for i området pb 1320 til bp 1385 vil ha den følgende aminosyresekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor aminoende Y, f.eks. Tyr eller Cys, om de foreligger, er tilføyet for å lette kobling av peptidet til en proteinbærer.

Det neste peptid II (17) vil kodes for av området som går fra ca. bp 936 til bp 995, og vil ha den følgende sekvens hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor aminoenden Y er som forut definert.

Av spesiell interesse er oligopeptidet Ila:

hvor X og Y er som forut definert og Z er en binding, en aminosyre som gir et middel for binding, f.eks. cystein, tyrosin, osv., eller sammen med X i den funksjonelle gruppe som kan brukes for binding, f.eks. et olefin som i allyl eller maleimidyl, ditio, osv.

Det neste peptid av interesse, III (92), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 972 til bp 1016 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptidene som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor X, Y og Z er som forut definert.

Fortrinnsvis vil dette peptid ikke ha mer enn ca. 15 aminosyrer kodet for av LAV/HTLV-III genomet.

Det neste peptid, IV (90), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 1164 til bp 1250 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptidet som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor X, Y og Z er som forut definert.

Fortrinnsvis vil dette peptid ikke ha mer enn ca. 29 aminosyrer som kodes for av LAV/HTLV-III genomet.

Peptidet V (88) vil kodes for av området som går fra ca. bp 1278 til bp 13 8 5 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor X og Y er som forut definert.

Det neste peptidet av interesse vil stamme fra gag proteinområdet som kalles pl8.

Den neste peptidet av interesse, VI (97), vil kodes for av området som går fra ca. bp 450 t.o.m. bp 545 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor X og Y er som forut definert.

Det neste peptid av interesse VII (71) vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 696 til bp 731. Dette peptid vil inneholde alle oligopeptider som koder for lineære epitoper med den følgende aminosyresekvens:

hvor Y er definert forut.

De neste polypeptider av interesse vil være de som stammer fra env området, fra gp 110 (HOkDal) .

Det neste peptidet av interesse, VIII, vil være kodet for av området som strekker seg fra ca. bp 7246 t.o.m. bp 7317, og skjønt det kommer innenfor de forutangitte generelle begrensninger, vil det generelt ikke ha mer enn 2 4 aminosyrer

kodet for av LAV/HTLV-III genomet.

Peptidet av interesse vil generelt ha den følgende aminosyresekvens, hvor oligopeptider som ligger innenfor den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor X er OH eller NH2, hvor karboksy- Z-endegruppen, f.eks. Cys, om den foreligger, er en aminosyre tilført for å lette kobling av peptidet til en proteinbærer.

Av spesiell interesse er når o, i alminnelighet opp til 4 av de naturlig forekommende C-avsluttede aminosyrer, er deletert eller substituert.

Oligopeptider innenfor den ovenfor nevnte sekvens av spesiell interesse innbefatter:

De neste peptider av interesse vil stamme fra env området kjent som gp41.

Det neste peptid, IX (56), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7498 til bp 7554, hvor oligopeptider som faller innenfor den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper i en slik sekvens:

hvor X, Y og Z er som ovenfor definert.

Oligopeptider innenfor den ovenfor nevnte sekvens av spesiell interesse er:

Det neste peptid av interesse, X (39) , vil kodes for av området fra ca. cp 7516 t.o.m. bp 7593, og har den følgende aminosyresekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor X er OH eller NH2.

Det neste peptid, XI (40), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7630 til 7689, hvor oligopeptider som ligger innenfor den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens:

hvor Y,X og Z er som forut definert.

Det neste peptid av interesse XII (23) , vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7708 t.o.m. bp 7779. Dette peptid vil inneholde alle oligopeptider som koder for lineære epitoper innenfor den følgende aminosyresekvens:

hvor X, Y og Z er som forut definert.

Det neste peptid av interesse, XIII (79), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7543 t.o.m. bp 7593. Dette peptid vil inneholde alle oligopeptider som koder for lineære epitoper innenfor den følgende aminosyresekvens:

hvor X og Y er definert forut.

Det neste peptid av interesse, XHIa (78) , vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7561 t.o.m. bp 7593. Dette peptid inneholder alle oligopeptider som koder for lineære epitoper innenfor den følgende aminosyresekvens:

Av spesiell interesse er bruken av merkaptangruppen i cysteiner eller tioglykolsyre som brukes for acylering av endestående aminogrupper eller lignende for å binde to av peptidene eller oligopeptidene eller kombinasjoner derav sammen med en disulfidbinding eller en lengre binding. For å oppnå dette, kan forbindelser med bis-halogen-acetyl-grupper, nitroarylhalogenider eller lignende anvendes, hvor reagensene er spesifikke for tiogrupper. Således kan bindingen mellom de to merkaptogruppene av de forskjellige peptider eller oligopeptider være en enkelt binding eller en bindende gruppe på minst 2, normalt minst 4, og ikke mer enn ca. 16, normalt ikke mer enn ca. 14 karbonatomer. Av spesiell interesse er når et element i en sekvens fra gag området er bundet til et element fra env området. Disse chimere peptider som kan inneholde ikke-aminosyrebindinger, kan modifiseres videre slik det vil bli beskrevet for peptidene og oligopeptidene.

De foreliggende peptider kan anvendes bundet til en løselig makromolekylær (f.eks. > 5kDal) bærer. Bæreren kan gjerne være en poly(aminosyre), enten naturlig forekommende eller syntetisk, til hvilken antistoffer er usannsynlig å finne i menneskeserum. Illustrerende polypeptider er poly-L-lysin, bovin serumalbumin, nøkkelhull-limpet, hemocyanin, bovin gammaglobulin, osv. Valget avhenger primært av hensiktsmessighet og tilgjengelighet.

Med slike konjugater vil det være minst ett molekyl av minst ett foreliggende peptid pr. makromolekyl og ikke mer enn ca. 1 pr. 0,5kDal, normalt ikke mer enn 1 pr. 2kDal, av makromolekylet. Ett eller flere forskjellige peptider kan være bundet til samme makromolekyl.

Bindingsmåten er en vanlig, idet det anvendes slike reagenser som p-maleimidobenzosyre, p_-metylditiobenzosyre, maleinsyreanhydrid, ravsyreanhydrid, glutaraldehyd, osv. Bindingen kan foretas ved N-enden, C-enden eller et punkt mellom molekylets ender. Det foreliggende peptid kan være derivatisert for binding, kan være bundet samtidig med binding til en bærer, eller lignende.

Forbindelsene kan brukes som merkede eller ikke-merkede forbindelser avhengig av det enkelte tilfelle (med markør menes et molekyl som gir direkte eller indirekte et påviselig signal). Forskjellige markører anvendes, såsom radioaktive nucleider, enzymer, fluorescensmidler, kjemiluminescensmidler, enzymsubstrater, kofaktorer eller inhibitorer, partikler, f.eks. magnetiske partikler, kombinasjoner av ligander og reseptorer, f.eks. biotin eller avidin e.l. I tillegg kan peptidene modifiseres på en rekke måter for binding til en overflate, f.eks. mikrotiterplate, glasskuler, kromatografisk overflate, f.eks. papircellulose, kiselgel, eller lignende. Den spesielle måte polypeptider knyttes til en annen forbindelse eller overflate på, er ålment kjent og finnes utførlig illustrert i litteraturen. Se f.eks. U.S. patent nr. 4,371,515; 4,487,715; og patenter som er gjengitt i disse.

Forskjellige måleforskrifter kan anvendes for å påvise nærvær av enten antistoffer mot retrovirusproteiner eller retrovirusproteinet selv. Av spesiell interesse er bruk av peptidet som det merkede reagens, hvor markøren muliggjør et påviselig signal eller binding av peptidet, enten direkte eller indirekte til en overflate, hvor antistoff mot peptidet i prøven vil bli bundet til peptidet på overflaten. Nærværet av menneskeantistoff bundet til peptidet kan deretter påvises ved å anvende et zenogent antistoff som er spesifikt for humant immunoglobulin, normalt både humant IgM og IgG, eller et merket protein spesifikt for immunkomplekset, f.eks. Rf faktor eller S. aureus protein A.

Forskjellige heterogene forskrifter kan anvendes, enten kompetitive eller ikke-kompetitive. Peptid kan bindes til en overflate eller bærer ("bærer"), og merket antistoff få konkurrere med antistoff i prøven for den begrensede mengde av bundet peptid. Mengden av markør bundet til bæreren vil avhenge av mengden av kompetitivt antistoff i prøven.

Antistoff kan bindes til bæreren og prøven kombineres med merket peptid. Etter at reaksjonsblandingen har vært i kontakt med det bundede antistoff, vil mengden av markør bundet til bæreren stå i forhold til mengden av kognat antistoff i prøven.

Xenogent anti-humant antistoff, f.eks. antistoffer mot Fc til IgG og IgM (immunoglobuliner), kan bindes til en bærer. Prøven vil kontaktes med immunoglobulinene og merket peptid, hvorved mengden av merket peptid bundet til bæreren vil være indikativt for nærvær av kognate antistoffer.

Alternativt kan homogene målinger anvendes hvor peptidet er bundet til en enzym, flurescensmiddel eller annen markør, hvor bindingen av antistoff til peptidet fører til at man kan skille mellom markør som inngår i et spesifikt bindingspar-kompleks og markør som ikke inngår i komplekset. For målinger som benytter slike teknikker, se f.eks. US patent nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; og 4,098,876, som her inngår som henvisninger.

Som en illustrasjonn på foreliggende oppfinnelse kan foreliggende peptider konjugeres med et fluorescerende molekyl såsom fluorescein, rhodamin eller umbelliferon. Forskjellige teknikker kan brukes for påvisning av kompleksdannelse med antistoffer, f.eks. fluorescerende polarisering. I denne målingen er den fluorescerende polarisering forskjellig mellom kompleksert og ikke-kompleksert peptidkonjugat. Det foreligger apparatur for måling av forandringer i fluorescens-polarisasjon, f.eks. TDx levert av Abbott Laboratories, Chicago, IL.

Illustrerende for en måleteknikk er bruken av prøve-beholdere, f.eks. mikrotiterbrønner, hvor de foreliggende polypeptider eller konjugater derav festes til beholder-bunnen og/eller veggene, enten kovalent eller ikke-kovalent. Prøven, normalt menneskeblod eller serum fortynnet i et passende buffret medium, settes til beholderen, og tilstrekkelig tid får gå til kompleksdannelse mellom polypeptidet eller polypeptidene og alle kognate antistoffer i prøven. Supernatanten fjernes, og beholderen vaskes for å fjerne ikke-spesifikt bundede proteiner.

Et merket spesifikt bindingsprotein som spesifikt binder til komplekset, anvendes for påvisningen. Beholderen kan tilsettes xenogenet antisera mot humant immunoglobulin, spesielt anti-(human IgM og IgG) i et tilsvarende buffret medium. De xenogene antisera vil normalt være merket med en påviselig markør, f.eks. radioaktivt nukleid eller enzym. I stedet for antisera kan proteiner som er spesifikke for de immune kompleks anvendes, f.eks. et S. aureus protein A. Markøren kan så påvises f.eks. ved at et enzym tilsettes en frem-kallerløsning etter fjerning av ikke-spesifikt bundet enzymmarkør. Fremkallerløsningen inneholder et enzymsubstrat og eventuelt enzym-kofaktorer, kromogener, osv., som etter reaksjon gir et farget eller fluorescerende produkt som kan påvises kolorimetrisk eller henholdsvis fluorimetrisk.

Peptidene kan fremstilles på en rekke måter. Peptidene kan, på grunn av at de er relativt korte, syntetiseres i løsning eller på en fast bærer ifølge vanlige teknikker. Forskjellige automatiske synteseanordninger er i handelen idag og kan brukes i henhold til kjente forskrifter. Se f.eks. Stewart og Young, Solid Phase Peptid Syntheses, 2nd ed., Pierce Chemical Co., 1984; og Tam et al., J. Am. Cn^ m. Soc.

(1983) 105:6442.

Alternativt kan hybrid-DNA-teknologi anvendes når et syntetisk gen skal fremstilles, ved å anvende enkle kjeder som koder for polypeptidet eller i det vesentlige komplementære kjeder derav, hvor de enkle kjeder overlapper og kan bringes sammen i et sammenføyningsmedium som gir hybridisering. De hybridiserte kjeder kan deretter ligeres til å danne det fullstendige gen, og ved valg av tilsvarende ender, kan genet innsettes i ekspresjonsvektorer som er lett tilgjengelige idag. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloninq, a Laboratorv Manual, CSH. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Eller områder av virusgenomet som koder for peptider kan klones ved vanlige rekombinante DNA-teknikker og uttrykkes (se Maniatis, ovenfor).

DNA som koder for sekvenser som kan brukes for ekspresjon av peptider I-XIII, er:

Fragmenter fra disse sekvenser kan anvendes for ekspresjon av peptidfragmenter, konservative baseforandringer kan foretas, hvor modifisert codon(er) koder for de(n) samme aminosyre(r), eller ikke-konservative forandringer i kodesekvensen kan foretas, hvor den resulterende aminosyre kan være konservativ eller ikke-konservativ forandring.

Den kodende sekvens kan forlenges ved enten 5'- eller 3'-enden eller begge ender for å forlenge peptidet mens dets epitope punkt bibeholdes. Forlengelsen kan gi en arm for binding, f.eks. til en markør som et enzym for å koble to av, eller alle, peptidene sammen i den samme kjede for å gi antigen-aktivitet eller lignende.

For ekspresjon vil kodesekvensen være utstyrt med start-og stopp-kodoner, promotor- og terminator-omra^er og normalt et replikasjonssystem for å gi en ekspresjonsvektor for ekspresjon i en cellulær vert, f.eks. prokaryotiske eller

eukaryotiske bakterier, gjær, pattedyr osv.

Sekvensene i seg selv, fragmentet derav eller større sekvenser, normalt minst 15 baser, fortrinnsvis minst 18 baser, kan brukes som prober for påvisning av retroviralt RNA eller proviralt DNA. Mange teknikker er beskrevet, såsom Grunstein-Hogness-teknikken, Southern-teknikken, Northern-teknikken, do-blot, forbedringer av disse, samt annen metodikk. Se f.eks. WO 83/02277 og Berent et al., Biotechniques (1985) 3:208.

Polypeptidene kan lett fremstilles som fusjonsproteiner hvor polypeptidet kan være N- eller C-enden av det sammensmeltede polypeptid. Det resulterende sammensmeltede protein kan brukes direkte i seg selv som reagens, eller foreliggende polypeptid kan spaltes fra hele eller en del av den gjenværende sekvens av det sammensmeltede protein. Med et polypeptid hvor det ikke er noen innvendige metioniner, kan polypeptidet ved å innføre et metionin ved sammensmeltnings-punktet, spaltes med bromcyan. Når det foreligger et innvendig metionin, vil det være nødvendig å frembringe et proteolytisk spaltningspunkt, f.eks. poly-lysin og/eller -arginin eller kombinasjoner derav, eller innvendig metionin kan erstattes ved en aminosyre såsom leucin og et N-ende-metionin tilføyes før bromcyanspaltning. En hel rekke proteaser, innbefattet dipeptidaser er velkjente, og det riktige tilsvarende behandlingssignal kan innføres på det riktige sted. Behandlingssignalet kan ha tandem-repitisjoner for å sikre spaltning, da nærværet av én eller flere utvendige aminosyrer ikke vil innvirke på anvendeligheten av de foreliggende polypeptider.

Avhengig av målingens art, kan den fysiologiske prøve, f.eks. spytt, blod, plasma eller serum, forbehandles ved fortynning i et målemedium som normalt vil være et vandig, bufret medium som anvendes i én av en rekke buffere såsom fosfat, tris eller lignende. Et foretrukket fortynnings-middel er blotto (5 vekt% pr. volum fettfri tørrmelk, 0,01% thimerosal, 0,01% antifoam A i 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2 og 0,15 M NaCl). Normalt vil pH være i området ca. 6 til 9. Prøven vil så kombineres med reagenset ifølge den tilsvarende forskrift, og tilstrekkelig tid gis for binding. Når et heterogen-system brukes, vil normalt trinnene etterfølges av vaskeoperasjoner for å minimalisere ikke-spesifikk binding.

På slutten av prosedyren vil markøren påvises i henhold til vanlige metoder.

De følgende eksempler er gitt som illustrasjon og ikke som begrensning.

Eksperimentelt

Peptidene 15, 71, 88, 90, 92 og 97 ble satt sammen på en t-butyloksykarbonyl (BOC)-metylbenzylcysteinfenyl-aceta-midometyl (PAM) polystyren/divinylbenzenharpiks (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). For karboksamidpeptidene 78 og 79 ble p-metylbenzenhydrylaminpolystyren/divinylbenzen anvendt. Symmetriske anhydridkoblinger ble utført i en Applied Biosystems 430A syntetiseringsanordning, bortsett fra at glutamin og asparagin ble koblet som hydroksybenztriazol-estere. Benzylbasert sidekjedebeskyttelse og BOC alfa-aminbeskyttelse ble anvendt. Tryptofan ble beskyttet med formylrestene, metionin ble beskyttet som sitt sulfoksyd, og dinitrofenyl ble brukt for beskyttelse av histidin. Beskyttelsesgruppene ble fjernet ved vanlige metoder.

Peptid 3 6 ble satt sammen på en benzhydrylamin-polystyren/divinylbenzenharpiks i en Beckman 990 peptid-syntetiseringsanordning (Beckman Instruments, La Brea, CA.). Benzylbasert sidekjedebeskyttelse og BOC alfa-aminbeskyttelse ble anvendt. Alle restene ble tilsatt ved den direkte dicykloheksylkarbodiimid-metoden, unntatt for glutamin som var koblet som hydroksybenzotriazolester.

Peptid 39 ble syntetisert på en benzhydrylaminharpiks som beskrevet for peptidet 36, idet asparagin også kobles som ester.

Når peptidene ble merket radioaktivt, acylertes amino-endene med <3>H-eddiksyre og et overskudd av dicykloheksylkarbodiimid.

Beskyttelsesgruppene ble fjernet fra peptidene, og de ble spaltet fra harpiksen etter Tam "lav-høy" HF forskriften (Tam et al., ovenfor). Peptidene 36, 39, 78, 79, 88, 90, 92 og 97 ble ekstrahert fra harpiksen i 5% eddiksyre og gjennomgikk gel-filtreringskromatografi i 5% eddiksyre. Peptidene 15 til 71 ble ekstrahert i 0,5 M ammoniumkarbonat/O,001 M ditiotreitol (DDT) og kromatografert i 0,05 M ammonium-karbonat/O , 005 M /?-mercaptoetanol. Fraksjoner som inneholdt peptidet ble slått sammen og frysetørket. Integriteten til de syntetiske produkter ble kontrollert med ninhydrin etter hver kobling og ved analytisk revers-fasekromatografi og aminosyreanalyse.

Peptidene 90, 92 og 97 ble polymerisert ved oksydasjon av sulfhydrylene deres til intermolekylære disulfider. I korthet ble det frysetørkede, reduserte peptid oppløst i minimalt 6 M guanidin HCl/0,1 M natriumfosfat, pH 9,0 og fikk oksydere natten over ved romtemperatur.

Peptidene 15, 23, 36, 40, 49, 50 og 56 som var syntetisert ovenfor, ble konjugert med kvegserumalbumin (BSA) som ble derivatisert med N-succinimidyl-4-(Maleimidometyl)-cykloheksan-l-karboksylat (SMCC), i det vesentlige som beskrevet av Ishikawa et al., J. of Immunoassay (1983) 4:209.

Til 2 ml av en BSA løsning (20 mg/ml i 0.1 M kaliumfosfat, pH 7,0) satte man ved 30°C 1,5 ml av en SMCC løsning (8 mg/ml i dimetylformamid). Blandingen ble rørt med magnet i en time, hvoretter den ble sentrifugert for å fjerne alt utfelt albumin. Den klarede blanding ble så gelfiltrert på Sephadex G.25 ekvilibrert i 0,1 M kaliumfosfat, pH 6,0. De proteinholdige fraksjoner målt ved deres absorbens ved 2 8 nm, ble slått sammen og lagret frosset ved -70°C inntil behov.

De ovenfor syntetiserte peptider ble oppløst i 0,1 M natriumfosfat, pH 8,0 til en konsentrasjon på 5 mg/ml (peptid 36), 8 mg/ml (peptid 15) eller 1,6 mg/ml (peptid 39). Til 1,5 ml av hver løsning satte man 2 mg fast DTT. Løsningene ble rørt i 30 min. ved 30°C, hvoretter de ble gelkromatografi-filtrert på Sephadex G.10, ekvilibrert i 0,1 M kaliumfosfat, pH 6,0. De tritiumholdige fraksjoner som bestemmes ved scintillografi av aliquoter, ble slått sammen og blandet med 1 ml (0,5 ml for peptid V) av SMCC-derivatisert BSA. De resulterende blandinger ble rørt ved 3 0°C i 12 timer og deretter uttømmende dialysert mot vann.

De andre peptider ble fremstilt ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter og konjugert til BSA ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter. Forholdet av peptid til BSA ble bestemt ved å anvende radioaktive tracere ifølge vanlige metoder.

Analyse med ELISA

De frysetørrede peptider eller protein/peptidkonjugat var oppløst i 6 M guanidin HC1. Guanidinløsningene ble fortynnet i 0.05 M karbonat/bikarbonatbuffer (pH 9,6) til en slutt-peptidkonsentrasjon på 8 til 4 0 jLtg/ml rett før pletering i 96-brønners plater. 50 fil peptidløsning ble alikvotert pr. mikrotiterbrønn og inkubert ved 4°C natten over. Plater ble så blokket med BLOTTO (5 vekt%/volum fettfri tørrmelk/0,01% thimerosal/0,01% antifoam Ai 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2/0,15 M natriumklorid) i en time ved 37°C.

Sera ble fortynnet 1:100 med en 1:1 blanding av BLOTTO og PBS (0,01 M natriumfosfat, pH 7,3/0,15 M NaCl) og 50 ^1 av fortynnet sera satt til hver brønn og inkubert i en time ved 37"C. Sera ble fjernet, og platene ble vasket tre ganger i vaskebuffer (0,15 M NaCl/0,05 vekt%/volum Tween 20) før tilsetning av 100 1 geite-antihuman IgG/pepperrot-peroksydasekonjugat (50% stamløsning fortynnet til 1:10 000 i 50 mM natriumcitrat/0,05% Tween 20/1% varmeinaktivert, normal geiteserum, erholdt fra Antibodies, Inc., Davis, CA) i en time ved 37°C. Konjugatet ble fjernet, og platene vasket 3 ganger med 0,15 M NaCl/0,05vekt%/volum Tween 20. ELISA'en ble fremkalt ved å tilsette 100 /ul pr. brønn substratløsning (10 mg 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin i 50 ml 0,05 M natriumcitrat, pH 7,0) i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonene ble stoppet ved 100 /xl pr. brønn 3N H2S04/ og den optiske densitet ved 450 nm bestemt i en automatisert ELISA avleser.

Sammenfatning av tabell 1

Tabell 1 gir ELISA resultater for alle peptider som er immunologisk aktive.

Peptider 49 og 50 er deler av peptid 36.

Peptid 56 overlapper delvis peptid 39.

Peptid 49-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

Peptid 50-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

Peptid 56-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

Peptid 4 0-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

Peptid 23-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

Peptid 15-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

Peptid 3 6-BSA reaktive med 9/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera.

I et større panel er peptid 56 som delvis overlapper peptid 39, ikke-reaktiv med alle sera som er reaktive med peptid 39. Dette tyder på at det er minst to reaktive epitoper innenfor peptid 39, eller at peptidene 39 og 56 inneholder ikke-overlappende reaktive epitoper.

Peptid 23 (både konjugert med BSA og ikke-konjugert) ble prøvet videre ut mot et større panel av sera (23 positive, 8 negative) og viser en sensitivitet på 80-90%.

Sammenfatning av tabell 2

Tabell 2 viser at to av peptidene som stammet fra gag området (#15 og #17) er reaktive med LAV seropositive sera som er lite reaktive eller ikke-reaktive med peptidet 39. Dette støtter bruken av en kombinasjon av gag og env peptider for å frembringe en mer ømfintlig måling.

Sammenfatning av tabell 3

Tabell 3 sammenligner resultater oppnådd med peptidene 15-BSA og 39 med resultater oppnådd med disse peptider fysisk blandet (15-BSA + 39) eller kjemisk kombinert (tioloksydert 15 + 39) .

Resultatene som oppnås når positive prøver måles med enten den fysiske eller kjemiske kombinasjonen av peptidene 15 og 39, er generelt høyere enn det som oppnås med hvert peptid alene. Dette er vist klart med prøvene 12 6, 131, 13 5, 13 8 og 1296.

Sammenfatning av tabell 4

Tabell 4 sammenligner resultater oppnådd med peptidene 71, 78, 79, 88, 92 og 97 i en ELISA måling. Alle peptidene unntatt ett gir bedre enn 7 0% korrelasjon for positiver og to peptider hadde 100% korrelasjon.

Fotnote til tabell 1- 3

<1> Fremstilt som beskrevet i Britisk patentsøknad nr 83/24800, innsendt 15. september 1983. <2> Radioaktivt merkede LAV antigener ble brutt opp i et RIPA buffer (Gilead et al., Nature (1976) 264:263) og ble så omsatt med human serum. De resulterende immunkomplekser ble skilt ved binding til en Staphylococcus aureus absorbent (Kessler,

J. Immunoloqy (1975) 115:1617) etterfulgt av flere vasker.

Immunologisk utfelte antigener ble analysert ved SDS polyaktylamidgel-elektroforese (Laemmli, Nature

(1970) 227:680) etterfulgt av fluorografi.

Tilstedeværelse av enten et p25 eller gp43 bånd ble ansett nødvendig og tilstrekkelig til å bekrefte en prøve som seropositiv.

<3> LAS = Lymfadenopatisyndrom

A n.d. = ikke målt.

Det er tydelig fra de foregående resultater at ved å anvende ett eller en kombinasjon av peptider fra foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en ømfintlig, nøyaktig prøve på nærvær av antistoffer mot AIDS. De foreliggende peptider kan brukes i seg selv eller i kombinasjon med en undersøkelses-måling eller bekreftende måling, hvor det fullstendige lysat eller de fullstendige antigener kan anvendes som i en uavhengig fremgangsmåte. På grunn av egenskapene til peptidene, vil man videre forvente at DNA-sekvensene som koder for peptidene også ville finne lignende spesifisitet i en DNA-hybridiseringsmåling. Således muliggjør foreliggende

oppfinnelse påvisning av pasienter som har vært utsatt for det etiologiske retrovirusmiddel til lymfadenopatisyndrom og/eller

AIDS.

Selvom den foregående oppfinnelse er beskrevet i en viss detalj som illustrasjon og eksempel i den hensikt å klargjøre forståelsen, vil det være åpenbart at visse forandringer og modifikasjoner kan utøves innenfor omfanget av de vedlagte krav.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte ved påvisning av nærvær av LAV/HTLV-III-virus eller antistoff mot LAV/HTLV-III-virus hvor en prøve kombineres med en blanding med epitope punkter som konkurrerer immunologisk med LAV/HTLV-III-epitope punkter, hvorunder antistoffer binder seg til en slik proteinblanding at det dannes et spesifikt bindingspar-kompleks og graden av kompleks-dannelse bestemmes, karakterisert ved at i målemediet tilsettes det som et reagens en blanding inneholdende minst et peptid kodes for av kodeområdet til LAV/HTLV-III, idet peptidet inneholder minst én av de følgende peptidsekvenser: eller et peptid på minst 8 og færre enn 50 aminosyrer, herunder minst 8 påhverandrefølgende aminosyrer fra og hvor peptidet er fritt for andre peptider eller konjugert med et makromolekyl for hvilket antistoffer i humansera i det vesentlige mangler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en blanding som inneholder minst to av peptidene, i det minste ett av peptidene har aminosyresekvensen ifølge peptidsekvenser I til VII og minst ett av peptidene har en aminosyresekvens ifølge peptidene VIII til XIII.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes en blanding hvori ett av peptidene er et o<1>igopeptid innenfor de i krav 2 nevnte sekvenser med en av de følgende sekvenser:

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes en blanding hvori to av peptidene er kovalent bundet sammen gjennom en binding eller kjede.

5. Peptid for anvendelse in vitro, som er immunologisk reaktivt overfor antistoffer mot LAV/HTLV-III, karakterisert ved at peptidet inneholder en av de følgende sekvenser: eller et peptid på minst 8 og færre enn 50 aminosyrer, herunder minst 8 påhverandrefølgende aminosyrer fra og analoger derav, hvori aminosyrer i sekvensen kan innsettes, utelates og substitueres såfremt liknende immunoreaktivitet som peptidets overfor antistoffer mot LAV/HTLV-III bibeholdes.

6. Peptid ifølge krav 5, karakterisert ved at peptidet er N-terminalt acetylert.

7. Peptid ifølge krav 5, karakterisert ved at peptidet er bundet til et peptid eller protein med molekylvekt på minst 5000, hvilket peptid eller protein ikke normalt bindes til antistoffer i en menneskevert.

8. Peptid ifølge krav 5, karakterisert ved at peptidet inneholder minst 8 og færre enn 50 aminosyrer, hvorav minst 8 påhverandrefølgende aminosyrer fra den følgende aminosyresekvens :