NO173034B

NO173034B - PROCEDURES AND PEPTIDES FOR DETECTION OF AIDS-RELATED DISEASE

Info

Publication number: NO173034B
Application number: NO865274A
Authority: NO
Inventors: Wesley Loren Cosand
Original assignee: Genetic Systems Corporated
Priority date: 1985-04-29
Filing date: 1986-12-23
Publication date: 1993-07-05
Also published as: NO173034C; NO865274L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte som angitt i krav l's ingress, og et peptid for anvendelse deri som angitt i krav 5's ingress. The present invention relates to a method as stated in claim 1's preamble, and a peptide for use therein as stated in claim 5's preamble.

Oppfinnelsesområde Field of invention

Ved oppdagelsen av at sykdommen kalt lymfadenopati syndrom og tilegnet immunsvikt sykdom (AIDS) forårsakes av en infeksjonsretrovirus kalt lymfadenopativirus (LAV), human T-celle lymfotropvirus-III (HTLV-III), AIDS-relatert virus (ARV) eller immunsvikt assosiert virus (IDAV), har det oppstått et øyeblikkelig behov for å kunne påvise potensielle vektorer for sykdommen, så som blod fra personer med sykdommen, som kan anvendes for transfusjoner eller hvorfra spesifikke blodfaktorer kan isoleres. Upon the discovery that the disease called lymphadenopathy syndrome and acquired immunodeficiency disease (AIDS) is caused by an infectious retrovirus called lymphadenopathy virus (LAV), human T-cell lymphotropic virus-III (HTLV-III), AIDS-related virus (ARV) or immunodeficiency-associated virus ( IDAV), there has arisen an immediate need to be able to detect potential vectors for the disease, such as blood from people with the disease, which can be used for transfusions or from which specific blood factors can be isolated.

For å påvise potensielle vektorer for sykdommen, er det nødvendig å ha virusproteiner og/eller antistoffer mot slike proteiner. På grunn av farene i forbindelse med dyrking av LAV/HTLV-III-retrovirus er det betydelig interesse for å fremskaffe midler for å fremstille virusproteiner eller deres immunologiske ekvivalenter som ikke betyr at man må håndtere store volumer av levende, potensiell infeksjonsvirus. Ved å velge alternativer, må man ta hensyn til det faktum at virusene er rapportert å være meget polymorfe og hyppig forandrer seg når retrovirusen er i omløp. In order to detect potential vectors for the disease, it is necessary to have viral proteins and/or antibodies against such proteins. Because of the dangers associated with culturing LAV/HTLV-III retroviruses, there is considerable interest in providing means for producing viral proteins or their immunological equivalents that do not involve handling large volumes of live, potentially infectious virus. In choosing alternatives, one must take into account the fact that the viruses are reported to be highly polymorphic and frequently change when the retrovirus is in circulation.

Kort beskrivelse av den relevante litteratur. Brief description of the relevant literature.

De forskjellige antigener for retrovirusen er beskrevet av Saxinger et al., Science (1985) 227:1036-1038. Se også Gallo et al., ibid. (1984) 224:500; Sarangadharn et al., ibid. 224:506; Barre-Sinoussi et al., ibid. (1983) 220:868; Montagnier et al., i Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, Gallo, Essex, Gross eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), 1984, s.3 63. Disse kan inbefatte, men er ikke begrenset til, pl3, pl8, p25, p36, gp43, p55, gp65, gpllO, osv., hvor tallet kan variere avhengig av den som rapporterer. The various antigens of the retrovirus are described by Saxinger et al., Science (1985) 227:1036-1038. See also Gallo et al., ibid. (1984) 224:500; Sarangadharn et al., ibid. 224:506; Barre-Sinoussi et al., ibid. (1983) 220:868; Montagnier et al., in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, Gallo, Essex, Gross eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), 1984, p.3 63. These may include, but are not limited to, pl3, pl8, p25, p36, gp43, p55, gp65, gp110, etc., where the number may vary depending on the reporter.

Hopp and Woods, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78.: 3824, beskriver kriterier for å velge ut peptidet som potensielle epitoper for polypeptider basert på deres relative hydrofilitet. I en undersøkelse som anvender disse kriterier, ble et 12-aminosyrepeptid syntetisert som bandt 9% av anti-stoffene frembrakt av det opprinnelige protein (Hopp, Molec. Immunol. (1981) _18:869). Generelt er Hopp/Woods kriterier ikke vist å ha en høy forutsigelsesverdi. Videre er epitoper blitt påvist som ikke er hydrofile (Kazim et al. , Biochem. J. Hop and Woods, Proe. Nati. Acad. Pollock. USA (1981) 78.: 3824, describes criteria for selecting peptides as potential epitopes for polypeptides based on their relative hydrophilicity. In a study using these criteria, a 12-amino acid peptide was synthesized that bound 9% of the antibodies raised by the original protein (Hopp, Molec. Immunol. (1981) _18:869). In general, Hopp/Wood's criteria have not been shown to have a high predictive value. Furthermore, epitopes have been demonstrated that are not hydrophilic (Kazim et al., Biochem. J.

(1982) 203:201). Andre studier av polypeptid antigenitet er Green et al., Cell (1982) 28:477, hvor polypeptider ble anvendt som fremlagte antistoffer, hvilke antistoffer var istand til å binde til det opprinnelige protein, mens derimot antistoffer som var frembrakt av det opprinnelige protein ikke bandt til peptidene, og Trainer et al., Nature (1984) 312:127, hvis resultater med myohaemerytrin var sammenfallende med Green et al. (1982) 203:201). Other studies of polypeptide antigenicity are Green et al., Cell (1982) 28:477, where polypeptides were used as presented antibodies, which antibodies were able to bind to the original protein, while, on the other hand, antibodies produced by the original protein did not bound to the peptides, and Trainer et al., Nature (1984) 312:127, whose results with myohaemerythrin coincided with Green et al.

Den fullstendige nukleotidsekvens for LAV er beskrevet av Wain-Hobson et al., Cell (1985) 40:9. Den fullstendige sekvens for HTLV-III er rapportert av Muesing et al., Nature The complete nucleotide sequence of LAV is described by Wain-Hobson et al., Cell (1985) 40:9. The complete sequence for HTLV-III is reported by Muesing et al., Nature

(1985) 313:450, mens den fullstendige sekvens for ARV er rapportert av Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227:484. Alle tre virus viser betydelig nukleotid homologi og har likheter med hensyn til morfologi, cytopatologi, behov for optimum reverstranskriptaseaktivitet, og i det minste noen antigenegenskaper (Levy et al., Science (1984) 225:840; Shupback et al., Science (1984) 224:503), og bør følgelig betraktes som isolater av den samme virus. Se også Chang et al., Science (1985) 228:93. (1985) 313:450, while the complete sequence for ARV is reported by Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227:484. All three viruses show significant nucleotide homology and share similarities in morphology, cytopathology, requirement for optimal reverse transcriptase activity, and at least some antigenic properties (Levy et al., Science (1984) 225:840; Shupback et al., Science (1984) ) 224:503), and should therefore be considered as isolates of the same virus. See also Chang et al., Science (1985) 228:93.

Oppfinnelsen er kjennetegnet ved de trekk som fremgår av krav l's og krav 5's karakteriserende deler. The invention is characterized by the features that appear in claim 1's and claim 5's characterizing parts.

Peptidsekvenser med evne til å immitere proteiner immunologisk kodet i gag og/eller env områdene av LAV/HTLV-III retrovirus tilveiebringes som reagenser for bruk i undersøkelsen av blod og blodprodukter for forutgående eksponering for retrovirus. Peptidene kan brukes i forskjellige spesifikke bindingsmålinger for påvisning av antistoffer til LAV/HTLV-III virus, for påvisning av LAV/HTLV-III antigener eller som immunogener. Peptide sequences capable of mimicking proteins immunologically encoded in the gag and/or env regions of LAV/HTLV-III retroviruses are provided as reagents for use in the examination of blood and blood products for prior exposure to retroviruses. The peptides can be used in various specific binding measurements for the detection of antibodies to LAV/HTLV-III virus, for the detection of LAV/HTLV-III antigens or as immunogens.

Beskrivelse av spesifikke utførelsesformer Description of specific embodiments

I forbindelse med denne beskrivelse anses et virus å være det samme som eller ekvivalent med LAV/HTLV-III hvis det i det vesentlige oppfyller de følgende kriterier: (a) Viruset er tropisk for T-lymfocyter, spesielt T-hjelpe-celler (CDA<A+>, ifølge den internasjonale nomenklatur definert i Bernard et al., eds. Leucocvte Typing. New York: Springer Verlag, 1984); (b) viruset er cytopatisk for infiserte CD<4+> celler (istedet for transformerende, så som HTLV-I og -II er) ; (c) viruset koder for en RNA-avhengig DNA polymerase (revers transkriptase) som er Mg<2+->avhengig (optimums konsentrasjon 5mM), har et pH optimum på 7,8, ikke inhiberes av aktinomysin D, og kan anvendes oligo (dT) 12.18 som en primer for revers transkripsjon fra sin 3' LTR; (d) virus-båndene i en sukrosegradient ved en densitet på ca. 1,16; (e) viruset kan merkes med [<3>H]-uridin; (f) viruset er hovedsakelig kryss-reaktiv immunologisk med proteinet som kodes for av gag og env områdene av LAV/HTLV-III; og (g) viruset deler hovedsakelig nukleotidhomologi (ca.75-100%) og aminosyresekvens-homologi (ca. 75-100%) med LAV eller For purposes of this specification, a virus is considered to be the same as or equivalent to LAV/HTLV-III if it substantially meets the following criteria: (a) The virus is tropic for T lymphocytes, especially T helper cells (CDA <A+>, according to the international nomenclature defined in Bernard et al., eds. Leucocvte Typing. New York: Springer Verlag, 1984); (b) the virus is cytopathic to infected CD<4+> cells (rather than transforming, as HTLV-I and -II are); (c) the virus encodes an RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) which is Mg<2+->dependent (optimum concentration 5mM), has a pH optimum of 7.8, is not inhibited by actinomycin D, and can be used oligo (dT) 12.18 as a primer for reverse transcription from its 3' LTR; (d) the virus bands in a sucrose gradient at a density of approx. 1.16; (e) the virus can be labeled with [<3>H]-uridine; (f) the virus is predominantly cross-reactive immunologically with the protein encoded by the gag and env regions of LAV/HTLV-III; and (g) the virus shares predominantly nucleotide homology (about 75-100%) and amino acid sequence homology (about 75-100%) with LAV or

HTLV-III. HTLV-III.

Nye peptider frembringes som immunologisk imiterer proteiner kodet for av LAV/HTLV-III retrovirus, spesielt proteiner kodet for av gag og/eller env områdene i virusgenomet. For å romme stamme-til-stamme-variasjoner blant forskjellige isolater, kan justeringer for konservative substitusjoner og seleksjon blant alternativene hvor ikke konservative substitusjoner inngår, foretas. Disse peptider kan brukes enkeltvis eller sammen for påvisning av viruset eller av antistoffer mot viruset i en fysiologisk prøve. Avhengig av forsøksforskriftens art, kan peptidene være merket eller ikke merket, bundet til fast overflate, konjugert med en bærer eller andre forbindelser, eller lignende. New peptides are being produced that immunologically mimic proteins encoded by LAV/HTLV-III retroviruses, especially proteins encoded by the gag and/or env regions of the viral genome. To accommodate strain-to-strain variation among different isolates, adjustments for conservative substitutions and selection among alternatives where conservative substitutions are not included can be made. These peptides can be used individually or together for the detection of the virus or of antibodies against the virus in a physiological sample. Depending on the nature of the experimental procedure, the peptides may be labeled or unlabeled, bound to a solid surface, conjugated with a carrier or other compounds, or the like.

De aktuelle peptider vil stamme fra peptider kodet for av gag området eller env området. Disse peptider vil primært stamme fra p55 eller fragmenter derav, f.eks. p25 og pl8, eller gpl50 og fragmentene derav, f.eks. gp41. Disse peptider vil være gitt romertall, men vil også blir gitt numeriske betegnelser som har tilfeldig sammenheng med den måte de er fremstilt på. The relevant peptides will originate from peptides coded for by the gag region or the env region. These peptides will primarily originate from p55 or fragments thereof, e.g. p25 and pl8, or gp150 and its fragments, e.g. gp41. These peptides will be given Roman numerals, but will also be given numerical designations that have a random connection with the way they are produced.

For gag området er kodeområdene som går fra ca. basepar (bp) 450 til bp 731 av spesiell interesse, spesielt fra ca. bp 450 til bp 545 (97) og bp 696 til bp 731 (71); fra ca, bp 900 til bp 1421, spesielt fra ca. bp 921 til bp 1016 innbefattende bp 921 til bp 1010, bp 972 til bp 1060 (92); og bp 936 til.bp 995 (17); eller fra ca. bp 1158 til ca. bp 1400, spesielt bp 1164 til bp 1250 (90), bp 1278 til bp 1385 (88); og bp 1320 til bp 1385 (15) , eller av LAV/HTLV-III retrovirus. For the gag area, the code areas are from approx. base pairs (bp) 450 to bp 731 of particular interest, especially from ca. bp 450 to bp 545 (97) and bp 696 to bp 731 (71); from ca., bp 900 to bp 1421, especially from ca. bp 921 to bp 1016 inclusive bp 921 to bp 1010, bp 972 to bp 1060 (92); and bp 936 to.bp 995 (17); or from approx. bp 1158 to approx. bp 1400, especially bp 1164 to bp 1250 (90), bp 1278 to bp 1385 (88); and bp 1320 to bp 1385 (15) , or of LAV/HTLV-III retrovirus.

(Nummerering ifølge Wain-Hobson et al. , ovenfor). (Numbering according to Wain-Hobson et al., above).

For env området vil områdene av spesiell intreresse være slike polypeptider som kodes for innenfor bp 7210 til bp 7815 områdene, spesielt innenfor bp 7231 til bp 7794, særlig innenfor ca. bp 7246 t.o.m. bp 7317 (36), bp 7516 t.o.m. bp 7593 (39), spesielt bp 7543 t.o.m. bp 7593 (79) og bp 7561 t.o.m. 7593 (78), bp 7708 t.o.m. 7779 (23), bp 7630 t.o.m. bp 7689 (40), bp 7498 t.o.m. bp 7554 (56). For the env region, the regions of special interest will be such polypeptides which are coded for within the bp 7210 to bp 7815 regions, in particular within bp 7231 to bp 7794, in particular within approx. bp 7246 up to and including bp 7317 (36), bp 7516 up to and including bp 7593 (39), especially bp 7543 up to and including bp 7593 (79) and bp 7561 up to and including 7593 (78), bp 7708 up to and including 7779 (23), bp 7630 up to and including bp 7689 (40), bp 7498 up to and including bp 7554 (56).

Peptidene av interessse vil inneholde minst fem, noen ganger seks, noen ganger åtte, noen ganger tolv, normalt mindre enn ca. 50, enda heller færre enn ca. 35, og fortrinnsvis færre enn ca. 2 5 aminosyrer i en sekvens kodet for av LAV/HTLV-III retrovirus. I hvert tilfelle er det ønskelig at oligopeptidet er så lite som mulig, mens samtidig hovedsakelig hele sensitiviteten til det større peptidet bibeholdes. I noen tilfeller kan det være ønskelig å skjøte to eller flere oligopeptider som ikke er overlappende i den samme peptidstruktur eller som enkeltpeptider, hvilke separat eller tilsammen gir ekvivalent sensitivitet som det opprinnelige. The peptides of interest will contain at least five, sometimes six, sometimes eight, sometimes twelve, normally less than about 50, even fewer than approx. 35, and preferably fewer than approx. 25 amino acids in a sequence encoded by LAV/HTLV-III retrovirus. In each case, it is desirable that the oligopeptide is as small as possible, while at the same time essentially the entire sensitivity of the larger peptide is retained. In some cases, it may be desirable to join two or more oligopeptides which are not overlapping in the same peptide structure or as single peptides, which separately or together provide equivalent sensitivity to the original.

Peptidene kan modifiseres ved å innføre konservative eller ikke-konservative substitusjoner i peptidene, normalt færre enn 2 0 antall prosent, enda heller færre enn 10 antall prosent av peptidene er utskiftet. I de situasjoner hvor områdene finnes å være polymorfe, kan det være ønskelig å variere én eller flere enkelte aminosyrer for mer effektivt å imitere de forskjellige epitoper for de forskjellige retrovirus-stammer. I mange tilfeller kan metionin erstattes med norleucin (Nor), for å få kjemisk og fysikalsk stabilitet. The peptides can be modified by introducing conservative or non-conservative substitutions in the peptides, normally less than 20 percent, even less than 10 percent of the peptides have been replaced. In those situations where the regions are found to be polymorphic, it may be desirable to vary one or more individual amino acids in order to more effectively imitate the different epitopes for the different retrovirus strains. In many cases, methionine can be replaced with norleucine (Nor), to obtain chemical and physical stability.

Det bør være klart at polypeptidene som anvendes i foreliggende oppfinnelse ikke behøver å være identiske med noen spesiell LAV/HTLV-III polypeptidsekvens, så lenge de foreliggende forbindelser er istand til å gi immunologisk konkurranse med proteiner fra minst én av stammene av LAV/HTLV-III retrovirus. It should be clear that the polypeptides used in the present invention need not be identical to any particular LAV/HTLV-III polypeptide sequence, as long as the present compounds are capable of providing immunological competition with proteins from at least one of the strains of LAV/HTLV- III retroviruses.

Derfor kan de foreliggende polypeptider være gjenstand for forskjellige forandringer så som innskudd, delesjoner og substitusjoner, enten konservative eller ikke-konservative, hvor slike forandringer kan gi bestemte fordeler ved bruk av dem. Med konservative substitusjoner menes kombinasjoner såsom gly, ala; val, ile, leu; asp, glu* asn, gin; ser, thr; lys, arg; og phe, tyr. Normalt vil sekvensen ikke atskille seg med mer enn 2 0% fra sekvensen til minst én stamme av et LAV/HTLV-III retrovirus, unntatt hvor ytterligere aminosyrer kan tilføyes ved begge endene i den hensikt å gi en "arm" hvormed peptidene i denne oppfinnelse lett kan immobiliseres. Armene vil normalt ha minst én aminosyre og kan være 50 eller flere aminosyrer, oftere 1 til 10 aminosyrer. Therefore, the present polypeptides can be subject to various changes such as insertions, deletions and substitutions, either conservative or non-conservative, where such changes can provide certain advantages in their use. Conservative substitutions mean combinations such as gly, ala; val, ile, leu; aspen, glu* asn, gin; see, thr; bright, angry; and phe, bull. Normally, the sequence will not differ by more than 20% from the sequence of at least one strain of a LAV/HTLV-III retrovirus, except where additional amino acids may be added at either end to provide an "arm" with which the peptides of this invention can easily be immobilized. The arms will normally have at least one amino acid and can be 50 or more amino acids, more often 1 to 10 amino acids.

I tillegg kan én eller to aminosyrer tilføyes endene av et oligopeptid eller peptid for å lette binding av peptider til hverandre, for kobling til en bærer eller større peptid av grunner som skal omtales i det følgende, for å modifisere de fysikalske eller kjemiske egenskapene til peptidet eller oligopeptidet eller lignende. In addition, one or two amino acids may be added to the ends of an oligopeptide or peptide to facilitate binding of peptides to each other, for coupling to a carrier or larger peptide for reasons to be discussed below, to modify the physical or chemical properties of the peptide or the oligopeptide or the like.

Aminosyrer såsom tyrosin, cystein, lysin, glutamin- eller aspartin-syre eller lignende kan innføres ved C- eller N-enden av peptidet eller oligopeptidet for å muliggjøre en anvendelig funksjonalitet for binding. Av spesiell mLeresse er at det foreligger fra 1 til 3 cysteiner ved C- eller N-enden for binding til en bærer. Cysteinet kan bindes gjennom en disulfidbinding til en ditio- eller tio-funksjonalisert bærer på en tioeterbinding til en aktivert olefinbærer. Amino acids such as tyrosine, cysteine, lysine, glutamic or aspartic acid or the like can be introduced at the C- or N-terminus of the peptide or oligopeptide to enable a useful functionality for binding. Of particular importance is that there are from 1 to 3 cysteines at the C- or N-end for binding to a carrier. The cysteine can be bound through a disulphide bond to a dithio- or thio-functionalized support on a thioether bond to an activated olefin support.

I tillegg kan peptid- eller oligopeptid-sekvensene atskille seg fra den naturlige sekvens ved at sekvensen modifiseres med ende-NH2-acylering, f.eks. acetylering eller tioglykolsyre-amidering, ende-karboksy-amidering, f.eks. ammoniakk, metylamin, osv. I noen tilfeller kan disse modifikasjonene gi punkter for binding til en bærer eller et annet molekyl. In addition, the peptide or oligopeptide sequences may differ from the natural sequence in that the sequence is modified with terminal NH 2 acylation, e.g. acetylation or thioglycolic acid amidation, terminal carboxy amidation, e.g. ammonia, methylamine, etc. In some cases, these modifications can provide points for attachment to a support or another molecule.

Peptidene og oligopeptidene av interesse skal man nå se nærmere på. De første peptidene av interesse vil stamme fra gag området, spesielt proteinet som kalles p25 og pl8. The peptides and oligopeptides of interest must now be looked at in more detail. The first peptides of interest will originate from the gag region, especially the protein called p25 and pl8.

Peptidene for p25 er som følger: The peptides for p25 are as follows:

peptidet I (15) som kodes for i området pb 1320 til bp 1385 vil ha den følgende aminosyresekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: the peptide I (15) which is coded for in the region pb 1320 to bp 1385 will have the following amino acid sequence, where oligopeptides that form part of the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor aminoende Y, f.eks. Tyr eller Cys, om de foreligger, er tilføyet for å lette kobling av peptidet til en proteinbærer. where amino end Y, e.g. Tyr or Cys, if present, are added to facilitate coupling of the peptide to a protein carrier.

Det neste peptid II (17) vil kodes for av området som går fra ca. bp 936 til bp 995, og vil ha den følgende sekvens hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The next peptide II (17) will be coded for by the area starting from approx. bp 936 to bp 995, and will have the following sequence where oligopeptides that form part of the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor aminoenden Y er som forut definert. where the amino end Y is as previously defined.

Av spesiell interesse er oligopeptidet Ila: Of particular interest is the oligopeptide Ila:

hvor X og Y er som forut definert og Z er en binding, en aminosyre som gir et middel for binding, f.eks. cystein, tyrosin, osv., eller sammen med X i den funksjonelle gruppe som kan brukes for binding, f.eks. et olefin som i allyl eller maleimidyl, ditio, osv. where X and Y are as previously defined and Z is a bond, an amino acid that provides a means of bonding, e.g. cysteine, tyrosine, etc., or together with X in the functional group that can be used for binding, e.g. an olefin as in allyl or maleimidyl, dithio, etc.

Det neste peptid av interesse, III (92), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 972 til bp 1016 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptidene som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The next peptide of interest, III (92), will be encoded by the region extending from approx. bp 972 to bp 1016 and will have the following sequence, where the oligopeptides included in the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor X, Y og Z er som forut definert. where X, Y and Z are as previously defined.

Fortrinnsvis vil dette peptid ikke ha mer enn ca. 15 aminosyrer kodet for av LAV/HTLV-III genomet. Preferably, this peptide will not have more than approx. 15 amino acids coded for by the LAV/HTLV-III genome.

Det neste peptid, IV (90), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 1164 til bp 1250 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptidet som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The next peptide, IV (90), will be coded for by the region extending from approx. bp 1164 to bp 1250 and will have the following sequence, where the oligopeptide included in the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

Fortrinnsvis vil dette peptid ikke ha mer enn ca. 29 aminosyrer som kodes for av LAV/HTLV-III genomet. Preferably, this peptide will not have more than approx. 29 amino acids encoded by the LAV/HTLV-III genome.

Peptidet V (88) vil kodes for av området som går fra ca. bp 1278 til bp 13 8 5 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: Peptide V (88) will be coded for by the area from approx. bp 1278 to bp 13 8 5 and will have the following sequence, where oligopeptides that form part of the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor X og Y er som forut definert. where X and Y are defined as before.

Det neste peptidet av interesse vil stamme fra gag proteinområdet som kalles pl8. The next peptide of interest will originate from the gag protein region called pl8.

Den neste peptidet av interesse, VI (97), vil kodes for av området som går fra ca. bp 450 t.o.m. bp 545 og vil ha den følgende sekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The next peptide of interest, VI (97), will be encoded by the region that runs from approx. bp 450 up to and including bp 545 and will have the following sequence, where oligopeptides that form part of the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor X og Y er som forut definert. where X and Y are defined as before.

Det neste peptid av interesse VII (71) vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 696 til bp 731. Dette peptid vil inneholde alle oligopeptider som koder for lineære epitoper med den følgende aminosyresekvens: The next peptide of interest VII (71) will be encoded by the region extending from approx. bp 696 to bp 731. This peptide will contain all oligopeptides encoding linear epitopes with the following amino acid sequence:

hvor Y er definert forut. where Y is defined before.

De neste polypeptider av interesse vil være de som stammer fra env området, fra gp 110 (HOkDal) . The next polypeptides of interest will be those originating from the env region, from gp 110 (HOkDal).

Det neste peptidet av interesse, VIII, vil være kodet for av området som strekker seg fra ca. bp 7246 t.o.m. bp 7317, og skjønt det kommer innenfor de forutangitte generelle begrensninger, vil det generelt ikke ha mer enn 2 4 aminosyrer The next peptide of interest, VIII, would be encoded by the region extending from ca. bp 7246 up to and including bp 7317, and although it falls within the assumed general limitations, it will generally not have more than 2 4 amino acids

kodet for av LAV/HTLV-III genomet. encoded by the LAV/HTLV-III genome.

Peptidet av interesse vil generelt ha den følgende aminosyresekvens, hvor oligopeptider som ligger innenfor den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The peptide of interest will generally have the following amino acid sequence, where oligopeptides located within the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor X er OH eller NH2, hvor karboksy- Z-endegruppen, f.eks. Cys, om den foreligger, er en aminosyre tilført for å lette kobling av peptidet til en proteinbærer. where X is OH or NH2, where the carboxy Z end group, e.g. Cys, if present, is an amino acid added to facilitate coupling of the peptide to a protein carrier.

Av spesiell interesse er når o, i alminnelighet opp til 4 av de naturlig forekommende C-avsluttede aminosyrer, er deletert eller substituert. Of particular interest is when o, generally up to 4 of the naturally occurring C-terminated amino acids, is deleted or substituted.

Oligopeptider innenfor den ovenfor nevnte sekvens av spesiell interesse innbefatter: Oligopeptides within the above sequence of particular interest include:

De neste peptider av interesse vil stamme fra env området kjent som gp41. The next peptides of interest will originate from the env region known as gp41.

Det neste peptid, IX (56), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7498 til bp 7554, hvor oligopeptider som faller innenfor den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper i en slik sekvens: The next peptide, IX (56), will be coded for by the region extending from approx. bp 7498 to bp 7554, where oligopeptides falling within the following sequence will contain linear epitopes in such a sequence:

hvor X, Y og Z er som ovenfor definert. where X, Y and Z are as defined above.

Oligopeptider innenfor den ovenfor nevnte sekvens av spesiell interesse er: Oligopeptides within the above sequence of particular interest are:

Det neste peptid av interesse, X (39) , vil kodes for av området fra ca. cp 7516 t.o.m. bp 7593, og har den følgende aminosyresekvens, hvor oligopeptider som inngår i den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The next peptide of interest, X (39) , will be coded for by the region from approx. cp 7516 up to and including bp 7593, and has the following amino acid sequence, where oligopeptides that form part of the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor X er OH eller NH2. where X is OH or NH2.

Det neste peptid, XI (40), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7630 til 7689, hvor oligopeptider som ligger innenfor den følgende sekvens vil inneholde lineære epitoper innenfor en slik sekvens: The next peptide, XI (40), will be coded for by the region extending from approx. bp 7630 to 7689, where oligopeptides located within the following sequence will contain linear epitopes within such a sequence:

hvor Y,X og Z er som forut definert. where Y, X and Z are defined as before.

Det neste peptid av interesse XII (23) , vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7708 t.o.m. bp 7779. Dette peptid vil inneholde alle oligopeptider som koder for lineære epitoper innenfor den følgende aminosyresekvens: The next peptide of interest XII (23), will be coded for by the region extending from approx. bp 7708 up to and including bp 7779. This peptide will contain all oligopeptides encoding linear epitopes within the following amino acid sequence:

Det neste peptid av interesse, XIII (79), vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7543 t.o.m. bp 7593. Dette peptid vil inneholde alle oligopeptider som koder for lineære epitoper innenfor den følgende aminosyresekvens: The next peptide of interest, XIII (79), will be encoded by the region extending from approx. bp 7543 up to and including bp 7593. This peptide will contain all oligopeptides encoding linear epitopes within the following amino acid sequence:

hvor X og Y er definert forut. where X and Y are defined beforehand.

Det neste peptid av interesse, XHIa (78) , vil kodes for av området som strekker seg fra ca. bp 7561 t.o.m. bp 7593. Dette peptid inneholder alle oligopeptider som koder for lineære epitoper innenfor den følgende aminosyresekvens: The next peptide of interest, XHIa (78), will be encoded by the region extending from approx. bp 7561 up to and including bp 7593. This peptide contains all oligopeptides encoding linear epitopes within the following amino acid sequence:

Av spesiell interesse er bruken av merkaptangruppen i cysteiner eller tioglykolsyre som brukes for acylering av endestående aminogrupper eller lignende for å binde to av peptidene eller oligopeptidene eller kombinasjoner derav sammen med en disulfidbinding eller en lengre binding. For å oppnå dette, kan forbindelser med bis-halogen-acetyl-grupper, nitroarylhalogenider eller lignende anvendes, hvor reagensene er spesifikke for tiogrupper. Således kan bindingen mellom de to merkaptogruppene av de forskjellige peptider eller oligopeptider være en enkelt binding eller en bindende gruppe på minst 2, normalt minst 4, og ikke mer enn ca. 16, normalt ikke mer enn ca. 14 karbonatomer. Av spesiell interesse er når et element i en sekvens fra gag området er bundet til et element fra env området. Disse chimere peptider som kan inneholde ikke-aminosyrebindinger, kan modifiseres videre slik det vil bli beskrevet for peptidene og oligopeptidene. Of particular interest is the use of the mercaptan group in cysteines or thioglycolic acid used for the acylation of terminal amino groups or the like to bind two of the peptides or oligopeptides or combinations thereof together with a disulfide bond or a longer bond. To achieve this, compounds with bis-halo-acetyl groups, nitroaryl halides or the like can be used, where the reagents are specific for thio groups. Thus, the bond between the two mercapto groups of the different peptides or oligopeptides can be a single bond or a binding group of at least 2, normally at least 4, and no more than approx. 16, normally no more than approx. 14 carbon atoms. Of particular interest is when an element in a sequence from the gag area is bound to an element from the env area. These chimeric peptides, which may contain non-amino acid bonds, can be further modified as will be described for the peptides and oligopeptides.

De foreliggende peptider kan anvendes bundet til en løselig makromolekylær (f.eks. > 5kDal) bærer. Bæreren kan gjerne være en poly(aminosyre), enten naturlig forekommende eller syntetisk, til hvilken antistoffer er usannsynlig å finne i menneskeserum. Illustrerende polypeptider er poly-L-lysin, bovin serumalbumin, nøkkelhull-limpet, hemocyanin, bovin gammaglobulin, osv. Valget avhenger primært av hensiktsmessighet og tilgjengelighet. The present peptides can be used bound to a soluble macromolecular (eg > 5kDal) carrier. The carrier may preferably be a poly(amino acid), either naturally occurring or synthetic, to which antibodies are unlikely to be found in human serum. Illustrative polypeptides are poly-L-lysine, bovine serum albumin, keyhole limpet, hemocyanin, bovine gamma globulin, etc. The choice depends primarily on expediency and availability.

Med slike konjugater vil det være minst ett molekyl av minst ett foreliggende peptid pr. makromolekyl og ikke mer enn ca. 1 pr. 0,5kDal, normalt ikke mer enn 1 pr. 2kDal, av makromolekylet. Ett eller flere forskjellige peptider kan være bundet til samme makromolekyl. With such conjugates, there will be at least one molecule of at least one present peptide per macromolecule and no more than approx. 1 per 0.5 kDal, normally no more than 1 per 2kDal, of the macromolecule. One or more different peptides can be bound to the same macromolecule.

Bindingsmåten er en vanlig, idet det anvendes slike reagenser som p-maleimidobenzosyre, p_-metylditiobenzosyre, maleinsyreanhydrid, ravsyreanhydrid, glutaraldehyd, osv. Bindingen kan foretas ved N-enden, C-enden eller et punkt mellom molekylets ender. Det foreliggende peptid kan være derivatisert for binding, kan være bundet samtidig med binding til en bærer, eller lignende. The binding method is a common one, using such reagents as p-maleimidobenzoic acid, p_-methyldithiobenzoic acid, maleic anhydride, succinic anhydride, glutaraldehyde, etc. The binding can be carried out at the N-end, C-end or a point between the ends of the molecule. The present peptide may be derivatized for binding, may be bound simultaneously with binding to a carrier, or the like.

Forbindelsene kan brukes som merkede eller ikke-merkede forbindelser avhengig av det enkelte tilfelle (med markør menes et molekyl som gir direkte eller indirekte et påviselig signal). Forskjellige markører anvendes, såsom radioaktive nucleider, enzymer, fluorescensmidler, kjemiluminescensmidler, enzymsubstrater, kofaktorer eller inhibitorer, partikler, f.eks. magnetiske partikler, kombinasjoner av ligander og reseptorer, f.eks. biotin eller avidin e.l. I tillegg kan peptidene modifiseres på en rekke måter for binding til en overflate, f.eks. mikrotiterplate, glasskuler, kromatografisk overflate, f.eks. papircellulose, kiselgel, eller lignende. Den spesielle måte polypeptider knyttes til en annen forbindelse eller overflate på, er ålment kjent og finnes utførlig illustrert i litteraturen. Se f.eks. U.S. patent nr. 4,371,515; 4,487,715; og patenter som er gjengitt i disse. The compounds can be used as labeled or unlabeled compounds depending on the individual case (marker means a molecule that gives directly or indirectly a detectable signal). Various markers are used, such as radioactive nuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, enzyme substrates, cofactors or inhibitors, particles, e.g. magnetic particles, combinations of ligands and receptors, e.g. biotin or avidin etc. In addition, the peptides can be modified in a number of ways for binding to a surface, e.g. microtiter plate, glass beads, chromatographic surface, e.g. paper cellulose, silica gel, or the like. The special way in which polypeptides are attached to another compound or surface is widely known and is illustrated in detail in the literature. See e.g. U.S. Patent No. 4,371,515; 4,487,715; and patents reproduced therein.

Forskjellige måleforskrifter kan anvendes for å påvise nærvær av enten antistoffer mot retrovirusproteiner eller retrovirusproteinet selv. Av spesiell interesse er bruk av peptidet som det merkede reagens, hvor markøren muliggjør et påviselig signal eller binding av peptidet, enten direkte eller indirekte til en overflate, hvor antistoff mot peptidet i prøven vil bli bundet til peptidet på overflaten. Nærværet av menneskeantistoff bundet til peptidet kan deretter påvises ved å anvende et zenogent antistoff som er spesifikt for humant immunoglobulin, normalt både humant IgM og IgG, eller et merket protein spesifikt for immunkomplekset, f.eks. Rf faktor eller S. aureus protein A. Different measurement regulations can be used to detect the presence of either antibodies against retrovirus proteins or the retrovirus protein itself. Of particular interest is the use of the peptide as the labeled reagent, where the marker enables a detectable signal or binding of the peptide, either directly or indirectly to a surface, where antibody against the peptide in the sample will be bound to the peptide on the surface. The presence of human antibody bound to the peptide can then be detected by using a xenogeneic antibody specific for human immunoglobulin, normally both human IgM and IgG, or a labeled protein specific for the immune complex, e.g. Rf factor or S. aureus protein A.

Forskjellige heterogene forskrifter kan anvendes, enten kompetitive eller ikke-kompetitive. Peptid kan bindes til en overflate eller bærer ("bærer"), og merket antistoff få konkurrere med antistoff i prøven for den begrensede mengde av bundet peptid. Mengden av markør bundet til bæreren vil avhenge av mengden av kompetitivt antistoff i prøven. Different heterogeneous regulations can be applied, either competitive or non-competitive. Peptide can be bound to a surface or carrier ("carrier"), and labeled antibody is allowed to compete with antibody in the sample for the limited amount of bound peptide. The amount of marker bound to the carrier will depend on the amount of competitive antibody in the sample.

Antistoff kan bindes til bæreren og prøven kombineres med merket peptid. Etter at reaksjonsblandingen har vært i kontakt med det bundede antistoff, vil mengden av markør bundet til bæreren stå i forhold til mengden av kognat antistoff i prøven. Antibody can be bound to the carrier and the sample combined with labeled peptide. After the reaction mixture has been in contact with the bound antibody, the amount of marker bound to the carrier will be proportional to the amount of cognate antibody in the sample.

Xenogent anti-humant antistoff, f.eks. antistoffer mot Fc til IgG og IgM (immunoglobuliner), kan bindes til en bærer. Prøven vil kontaktes med immunoglobulinene og merket peptid, hvorved mengden av merket peptid bundet til bæreren vil være indikativt for nærvær av kognate antistoffer. Xenogeneic anti-human antibody, e.g. antibodies against Fc to IgG and IgM (immunoglobulins), can be bound to a carrier. The sample will be contacted with the immunoglobulins and labeled peptide, whereby the amount of labeled peptide bound to the carrier will be indicative of the presence of cognate antibodies.

Alternativt kan homogene målinger anvendes hvor peptidet er bundet til en enzym, flurescensmiddel eller annen markør, hvor bindingen av antistoff til peptidet fører til at man kan skille mellom markør som inngår i et spesifikt bindingspar-kompleks og markør som ikke inngår i komplekset. For målinger som benytter slike teknikker, se f.eks. US patent nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; og 4,098,876, som her inngår som henvisninger. Alternatively, homogeneous measurements can be used where the peptide is bound to an enzyme, fluorescent agent or other marker, where the binding of antibody to the peptide leads to a distinction being made between marker that is part of a specific binding pair complex and marker that is not part of the complex. For measurements that use such techniques, see e.g. US Patent No. 3,817,837; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; and 4,098,876, which are incorporated herein by reference.

Som en illustrasjonn på foreliggende oppfinnelse kan foreliggende peptider konjugeres med et fluorescerende molekyl såsom fluorescein, rhodamin eller umbelliferon. Forskjellige teknikker kan brukes for påvisning av kompleksdannelse med antistoffer, f.eks. fluorescerende polarisering. I denne målingen er den fluorescerende polarisering forskjellig mellom kompleksert og ikke-kompleksert peptidkonjugat. Det foreligger apparatur for måling av forandringer i fluorescens-polarisasjon, f.eks. TDx levert av Abbott Laboratories, Chicago, IL. As an illustration of the present invention, the present peptides can be conjugated with a fluorescent molecule such as fluorescein, rhodamine or umbelliferone. Various techniques can be used for the detection of complex formation with antibodies, e.g. fluorescent polarization. In this measurement, the fluorescent polarization is different between complexed and non-complexed peptide conjugate. There is equipment for measuring changes in fluorescence polarization, e.g. TDx supplied by Abbott Laboratories, Chicago, IL.

Illustrerende for en måleteknikk er bruken av prøve-beholdere, f.eks. mikrotiterbrønner, hvor de foreliggende polypeptider eller konjugater derav festes til beholder-bunnen og/eller veggene, enten kovalent eller ikke-kovalent. Prøven, normalt menneskeblod eller serum fortynnet i et passende buffret medium, settes til beholderen, og tilstrekkelig tid får gå til kompleksdannelse mellom polypeptidet eller polypeptidene og alle kognate antistoffer i prøven. Supernatanten fjernes, og beholderen vaskes for å fjerne ikke-spesifikt bundede proteiner. Illustrative of a measuring technique is the use of sample containers, e.g. microtiter wells, where the present polypeptides or conjugates thereof are attached to the container bottom and/or walls, either covalently or non-covalently. The sample, normal human blood or serum diluted in a suitable buffered medium, is added to the container, and sufficient time is allowed for complex formation between the polypeptide or polypeptides and all cognate antibodies in the sample. The supernatant is removed and the vessel is washed to remove non-specifically bound proteins.

Et merket spesifikt bindingsprotein som spesifikt binder til komplekset, anvendes for påvisningen. Beholderen kan tilsettes xenogenet antisera mot humant immunoglobulin, spesielt anti-(human IgM og IgG) i et tilsvarende buffret medium. De xenogene antisera vil normalt være merket med en påviselig markør, f.eks. radioaktivt nukleid eller enzym. I stedet for antisera kan proteiner som er spesifikke for de immune kompleks anvendes, f.eks. et S. aureus protein A. Markøren kan så påvises f.eks. ved at et enzym tilsettes en frem-kallerløsning etter fjerning av ikke-spesifikt bundet enzymmarkør. Fremkallerløsningen inneholder et enzymsubstrat og eventuelt enzym-kofaktorer, kromogener, osv., som etter reaksjon gir et farget eller fluorescerende produkt som kan påvises kolorimetrisk eller henholdsvis fluorimetrisk. A labeled specific binding protein that specifically binds to the complex is used for the detection. The container can be added to the xenogene antisera against human immunoglobulin, especially anti-(human IgM and IgG) in a corresponding buffered medium. The xenogeneic antisera will normally be labeled with a detectable marker, e.g. radioactive nuclide or enzyme. Instead of antisera, proteins specific for the immune complex can be used, e.g. a S. aureus protein A. The marker can then be detected, e.g. in that an enzyme is added to a developer solution after removal of non-specifically bound enzyme marker. The developer solution contains an enzyme substrate and possibly enzyme cofactors, chromogens, etc., which after reaction give a colored or fluorescent product that can be detected colorimetrically or fluorimetrically.

Peptidene kan fremstilles på en rekke måter. Peptidene kan, på grunn av at de er relativt korte, syntetiseres i løsning eller på en fast bærer ifølge vanlige teknikker. Forskjellige automatiske synteseanordninger er i handelen idag og kan brukes i henhold til kjente forskrifter. Se f.eks. Stewart og Young, Solid Phase Peptid Syntheses, 2nd ed., Pierce Chemical Co., 1984; og Tam et al., J. Am. Cn^ m. Soc. The peptides can be prepared in a number of ways. The peptides, because they are relatively short, can be synthesized in solution or on a solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesis devices are on the market today and can be used according to known regulations. See e.g. Stewart and Young, Solid Phase Peptide Syntheses, 2nd ed., Pierce Chemical Co., 1984; and Tam et al., J. Am. Cn^ m. Soc.

(1983) 105:6442. (1983) 105:6442.

Alternativt kan hybrid-DNA-teknologi anvendes når et syntetisk gen skal fremstilles, ved å anvende enkle kjeder som koder for polypeptidet eller i det vesentlige komplementære kjeder derav, hvor de enkle kjeder overlapper og kan bringes sammen i et sammenføyningsmedium som gir hybridisering. De hybridiserte kjeder kan deretter ligeres til å danne det fullstendige gen, og ved valg av tilsvarende ender, kan genet innsettes i ekspresjonsvektorer som er lett tilgjengelige idag. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloninq, a Laboratorv Manual, CSH. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Eller områder av virusgenomet som koder for peptider kan klones ved vanlige rekombinante DNA-teknikker og uttrykkes (se Maniatis, ovenfor). Alternatively, hybrid DNA technology can be used when a synthetic gene is to be produced, by using single chains that code for the polypeptide or substantially complementary chains thereof, where the single chains overlap and can be brought together in a joining medium that provides hybridization. The hybridized chains can then be ligated to form the complete gene, and by choosing corresponding ends, the gene can be inserted into expression vectors that are readily available today. See e.g. Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, CSH. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Or regions of the viral genome encoding peptides can be cloned by standard recombinant DNA techniques and expressed (see Maniatis, supra).

DNA som koder for sekvenser som kan brukes for ekspresjon av peptider I-XIII, er: DNA encoding sequences that can be used for expression of peptides I-XIII are:

Fragmenter fra disse sekvenser kan anvendes for ekspresjon av peptidfragmenter, konservative baseforandringer kan foretas, hvor modifisert codon(er) koder for de(n) samme aminosyre(r), eller ikke-konservative forandringer i kodesekvensen kan foretas, hvor den resulterende aminosyre kan være konservativ eller ikke-konservativ forandring. Fragments from these sequences can be used for expression of peptide fragments, conservative base changes can be made, where modified codon(s) code for the same amino acid(s), or non-conservative changes in the coding sequence can be made, where the resulting amino acid can be conservative or non-conservative change.

Den kodende sekvens kan forlenges ved enten 5'- eller 3'-enden eller begge ender for å forlenge peptidet mens dets epitope punkt bibeholdes. Forlengelsen kan gi en arm for binding, f.eks. til en markør som et enzym for å koble to av, eller alle, peptidene sammen i den samme kjede for å gi antigen-aktivitet eller lignende. The coding sequence can be extended at either the 5' or 3' end or both ends to extend the peptide while retaining its epitope. The extension can provide an arm for binding, e.g. to a marker such as an enzyme to link two or all of the peptides together in the same chain to give antigenic activity or the like.

For ekspresjon vil kodesekvensen være utstyrt med start-og stopp-kodoner, promotor- og terminator-omra^er og normalt et replikasjonssystem for å gi en ekspresjonsvektor for ekspresjon i en cellulær vert, f.eks. prokaryotiske eller For expression, the coding sequence will be provided with start and stop codons, promoter and terminator regions and normally a replication system to provide an expression vector for expression in a cellular host, e.g. prokaryotic or

eukaryotiske bakterier, gjær, pattedyr osv. eukaryotic bacteria, yeast, mammals, etc.

Sekvensene i seg selv, fragmentet derav eller større sekvenser, normalt minst 15 baser, fortrinnsvis minst 18 baser, kan brukes som prober for påvisning av retroviralt RNA eller proviralt DNA. Mange teknikker er beskrevet, såsom Grunstein-Hogness-teknikken, Southern-teknikken, Northern-teknikken, do-blot, forbedringer av disse, samt annen metodikk. Se f.eks. WO 83/02277 og Berent et al., Biotechniques (1985) 3:208. The sequences themselves, their fragment or larger sequences, normally at least 15 bases, preferably at least 18 bases, can be used as probes for the detection of retroviral RNA or proviral DNA. Many techniques are described, such as the Grunstein-Hogness technique, the Southern technique, the Northern technique, do-blot, improvements of these, as well as other methodologies. See e.g. WO 83/02277 and Berent et al., Biotechniques (1985) 3:208.

Polypeptidene kan lett fremstilles som fusjonsproteiner hvor polypeptidet kan være N- eller C-enden av det sammensmeltede polypeptid. Det resulterende sammensmeltede protein kan brukes direkte i seg selv som reagens, eller foreliggende polypeptid kan spaltes fra hele eller en del av den gjenværende sekvens av det sammensmeltede protein. Med et polypeptid hvor det ikke er noen innvendige metioniner, kan polypeptidet ved å innføre et metionin ved sammensmeltnings-punktet, spaltes med bromcyan. Når det foreligger et innvendig metionin, vil det være nødvendig å frembringe et proteolytisk spaltningspunkt, f.eks. poly-lysin og/eller -arginin eller kombinasjoner derav, eller innvendig metionin kan erstattes ved en aminosyre såsom leucin og et N-ende-metionin tilføyes før bromcyanspaltning. En hel rekke proteaser, innbefattet dipeptidaser er velkjente, og det riktige tilsvarende behandlingssignal kan innføres på det riktige sted. Behandlingssignalet kan ha tandem-repitisjoner for å sikre spaltning, da nærværet av én eller flere utvendige aminosyrer ikke vil innvirke på anvendeligheten av de foreliggende polypeptider. The polypeptides can easily be produced as fusion proteins where the polypeptide can be the N- or C-end of the fused polypeptide. The resulting fusion protein can be used directly by itself as a reagent, or the present polypeptide can be cleaved from all or part of the remaining sequence of the fusion protein. With a polypeptide where there are no internal methionines, by introducing a methionine at the fusion point, the polypeptide can be cleaved with cyanogen bromide. When an internal methionine is present, it will be necessary to produce a proteolytic cleavage point, e.g. poly-lysine and/or -arginine or combinations thereof, or internal methionine can be replaced by an amino acid such as leucine and an N-terminal methionine added before cyanobromine cleavage. A variety of proteases, including dipeptidases, are well known, and the appropriate corresponding treatment signal can be introduced at the appropriate site. The processing signal may have tandem repeats to ensure cleavage, as the presence of one or more extraneous amino acids will not affect the utility of the present polypeptides.

Avhengig av målingens art, kan den fysiologiske prøve, f.eks. spytt, blod, plasma eller serum, forbehandles ved fortynning i et målemedium som normalt vil være et vandig, bufret medium som anvendes i én av en rekke buffere såsom fosfat, tris eller lignende. Et foretrukket fortynnings-middel er blotto (5 vekt% pr. volum fettfri tørrmelk, 0,01% thimerosal, 0,01% antifoam A i 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2 og 0,15 M NaCl). Normalt vil pH være i området ca. 6 til 9. Prøven vil så kombineres med reagenset ifølge den tilsvarende forskrift, og tilstrekkelig tid gis for binding. Når et heterogen-system brukes, vil normalt trinnene etterfølges av vaskeoperasjoner for å minimalisere ikke-spesifikk binding. Depending on the nature of the measurement, the physiological sample, e.g. saliva, blood, plasma or serum, is pre-treated by dilution in a measuring medium which will normally be an aqueous, buffered medium used in one of a number of buffers such as phosphate, tris or the like. A preferred diluent is blotto (5% by weight per volume nonfat dry milk, 0.01% thimerosal, 0.01% antifoam A in 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2 and 0.15 M NaCl). Normally, the pH will be in the range of approx. 6 to 9. The sample will then be combined with the reagent according to the corresponding regulation, and sufficient time is given for binding. When a heterogeneous system is used, the steps will normally be followed by washing operations to minimize non-specific binding.

På slutten av prosedyren vil markøren påvises i henhold til vanlige metoder. At the end of the procedure, the marker will be detected according to standard methods.

De følgende eksempler er gitt som illustrasjon og ikke som begrensning. The following examples are given by way of illustration and not by way of limitation.

Eksperimentelt Experimental

Peptidene 15, 71, 88, 90, 92 og 97 ble satt sammen på en t-butyloksykarbonyl (BOC)-metylbenzylcysteinfenyl-aceta-midometyl (PAM) polystyren/divinylbenzenharpiks (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). For karboksamidpeptidene 78 og 79 ble p-metylbenzenhydrylaminpolystyren/divinylbenzen anvendt. Symmetriske anhydridkoblinger ble utført i en Applied Biosystems 430A syntetiseringsanordning, bortsett fra at glutamin og asparagin ble koblet som hydroksybenztriazol-estere. Benzylbasert sidekjedebeskyttelse og BOC alfa-aminbeskyttelse ble anvendt. Tryptofan ble beskyttet med formylrestene, metionin ble beskyttet som sitt sulfoksyd, og dinitrofenyl ble brukt for beskyttelse av histidin. Beskyttelsesgruppene ble fjernet ved vanlige metoder. Peptides 15, 71, 88, 90, 92, and 97 were assembled on a t -butyloxycarbonyl (BOC) methylbenzylcysteine phenylacetamidomethyl (PAM) polystyrene/divinylbenzene resin (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). For the carboxamide peptides 78 and 79, p-methylbenzenehydrylamine polystyrene/divinylbenzene was used. Symmetric anhydride couplings were performed in an Applied Biosystems 430A synthesizer, except that glutamine and asparagine were coupled as hydroxybenztriazole esters. Benzyl-based side chain protection and BOC alpha-amine protection were used. Tryptophan was protected with the formyl residues, methionine was protected as its sulfoxide, and dinitrophenyl was used for protection of histidine. The protecting groups were removed by conventional methods.

Peptid 3 6 ble satt sammen på en benzhydrylamin-polystyren/divinylbenzenharpiks i en Beckman 990 peptid-syntetiseringsanordning (Beckman Instruments, La Brea, CA.). Benzylbasert sidekjedebeskyttelse og BOC alfa-aminbeskyttelse ble anvendt. Alle restene ble tilsatt ved den direkte dicykloheksylkarbodiimid-metoden, unntatt for glutamin som var koblet som hydroksybenzotriazolester. Peptide 3 6 was synthesized on a benzhydrylamine-polystyrene/divinylbenzene resin in a Beckman 990 peptide synthesizer (Beckman Instruments, La Brea, CA.). Benzyl-based side chain protection and BOC alpha-amine protection were used. All residues were added by the direct dicyclohexylcarbodiimide method, except for glutamine which was linked as hydroxybenzotriazole ester.

Peptid 39 ble syntetisert på en benzhydrylaminharpiks som beskrevet for peptidet 36, idet asparagin også kobles som ester. Peptide 39 was synthesized on a benzhydrylamine resin as described for peptide 36, asparagine is also linked as an ester.

Når peptidene ble merket radioaktivt, acylertes amino-endene med <3>H-eddiksyre og et overskudd av dicykloheksylkarbodiimid. When the peptides were radioactively labeled, the amino termini were acylated with <3>H-acetic acid and an excess of dicyclohexylcarbodiimide.

Beskyttelsesgruppene ble fjernet fra peptidene, og de ble spaltet fra harpiksen etter Tam "lav-høy" HF forskriften (Tam et al., ovenfor). Peptidene 36, 39, 78, 79, 88, 90, 92 og 97 ble ekstrahert fra harpiksen i 5% eddiksyre og gjennomgikk gel-filtreringskromatografi i 5% eddiksyre. Peptidene 15 til 71 ble ekstrahert i 0,5 M ammoniumkarbonat/O,001 M ditiotreitol (DDT) og kromatografert i 0,05 M ammonium-karbonat/O , 005 M /?-mercaptoetanol. Fraksjoner som inneholdt peptidet ble slått sammen og frysetørket. Integriteten til de syntetiske produkter ble kontrollert med ninhydrin etter hver kobling og ved analytisk revers-fasekromatografi og aminosyreanalyse. The protecting groups were removed from the peptides and they were cleaved from the resin following the Tam "low-high" HF protocol (Tam et al., supra). Peptides 36, 39, 78, 79, 88, 90, 92 and 97 were extracted from the resin in 5% acetic acid and subjected to gel filtration chromatography in 5% acetic acid. Peptides 15 to 71 were extracted in 0.5 M ammonium carbonate/0.001 M dithiothreitol (DDT) and chromatographed in 0.05 M ammonium carbonate/0.005 M /?-mercaptoethanol. Fractions containing the peptide were pooled and freeze-dried. The integrity of the synthetic products was checked with ninhydrin after each coupling and by analytical reverse-phase chromatography and amino acid analysis.

Peptidene 90, 92 og 97 ble polymerisert ved oksydasjon av sulfhydrylene deres til intermolekylære disulfider. I korthet ble det frysetørkede, reduserte peptid oppløst i minimalt 6 M guanidin HCl/0,1 M natriumfosfat, pH 9,0 og fikk oksydere natten over ved romtemperatur. Peptides 90, 92 and 97 were polymerized by oxidation of their sulfhydryls to intermolecular disulfides. Briefly, the freeze-dried, reduced peptide was dissolved in minimal 6 M guanidine HCl/0.1 M sodium phosphate, pH 9.0 and allowed to oxidize overnight at room temperature.

Peptidene 15, 23, 36, 40, 49, 50 og 56 som var syntetisert ovenfor, ble konjugert med kvegserumalbumin (BSA) som ble derivatisert med N-succinimidyl-4-(Maleimidometyl)-cykloheksan-l-karboksylat (SMCC), i det vesentlige som beskrevet av Ishikawa et al., J. of Immunoassay (1983) 4:209. Peptides 15, 23, 36, 40, 49, 50 and 56 synthesized above were conjugated with bovine serum albumin (BSA) which was derivatized with N-succinimidyl-4-(Maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), in essentially as described by Ishikawa et al., J. of Immunoassay (1983) 4:209.

Til 2 ml av en BSA løsning (20 mg/ml i 0.1 M kaliumfosfat, pH 7,0) satte man ved 30°C 1,5 ml av en SMCC løsning (8 mg/ml i dimetylformamid). Blandingen ble rørt med magnet i en time, hvoretter den ble sentrifugert for å fjerne alt utfelt albumin. Den klarede blanding ble så gelfiltrert på Sephadex G.25 ekvilibrert i 0,1 M kaliumfosfat, pH 6,0. De proteinholdige fraksjoner målt ved deres absorbens ved 2 8 nm, ble slått sammen og lagret frosset ved -70°C inntil behov. To 2 ml of a BSA solution (20 mg/ml in 0.1 M potassium phosphate, pH 7.0) was added at 30°C 1.5 ml of an SMCC solution (8 mg/ml in dimethylformamide). The mixture was magnetically stirred for one hour, after which it was centrifuged to remove any precipitated albumin. The clarified mixture was then gel filtered on Sephadex G.25 equilibrated in 0.1 M potassium phosphate, pH 6.0. The proteinaceous fractions measured by their absorbance at 28 nm were pooled and stored frozen at -70°C until needed.

De ovenfor syntetiserte peptider ble oppløst i 0,1 M natriumfosfat, pH 8,0 til en konsentrasjon på 5 mg/ml (peptid 36), 8 mg/ml (peptid 15) eller 1,6 mg/ml (peptid 39). Til 1,5 ml av hver løsning satte man 2 mg fast DTT. Løsningene ble rørt i 30 min. ved 30°C, hvoretter de ble gelkromatografi-filtrert på Sephadex G.10, ekvilibrert i 0,1 M kaliumfosfat, pH 6,0. De tritiumholdige fraksjoner som bestemmes ved scintillografi av aliquoter, ble slått sammen og blandet med 1 ml (0,5 ml for peptid V) av SMCC-derivatisert BSA. De resulterende blandinger ble rørt ved 3 0°C i 12 timer og deretter uttømmende dialysert mot vann. The above synthesized peptides were dissolved in 0.1 M sodium phosphate, pH 8.0 to a concentration of 5 mg/ml (peptide 36), 8 mg/ml (peptide 15) or 1.6 mg/ml (peptide 39). 2 mg solid DTT was added to 1.5 ml of each solution. The solutions were stirred for 30 min. at 30°C, after which they were gel chromatography-filtered on Sephadex G.10, equilibrated in 0.1 M potassium phosphate, pH 6.0. The tritiated fractions determined by scintillography of aliquots were pooled and mixed with 1 ml (0.5 ml for peptide V) of SMCC-derivatized BSA. The resulting mixtures were stirred at 30°C for 12 hours and then exhaustively dialyzed against water.

De andre peptider ble fremstilt ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter og konjugert til BSA ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter. Forholdet av peptid til BSA ble bestemt ved å anvende radioaktive tracere ifølge vanlige metoder. The other peptides were prepared according to the methods described above and conjugated to BSA according to the methods described above. The ratio of peptide to BSA was determined by using radioactive tracers according to standard methods.

Analyse med ELISA Analysis with ELISA

De frysetørrede peptider eller protein/peptidkonjugat var oppløst i 6 M guanidin HC1. Guanidinløsningene ble fortynnet i 0.05 M karbonat/bikarbonatbuffer (pH 9,6) til en slutt-peptidkonsentrasjon på 8 til 4 0 jLtg/ml rett før pletering i 96-brønners plater. 50 fil peptidløsning ble alikvotert pr. mikrotiterbrønn og inkubert ved 4°C natten over. Plater ble så blokket med BLOTTO (5 vekt%/volum fettfri tørrmelk/0,01% thimerosal/0,01% antifoam Ai 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2/0,15 M natriumklorid) i en time ved 37°C. The lyophilized peptides or protein/peptide conjugate were dissolved in 6 M guanidine HCl. The guanidine solutions were diluted in 0.05 M carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6) to a final peptide concentration of 8 to 40 µg/ml immediately prior to plating in 96-well plates. 50 fil peptide solution was aliquoted per microtiter well and incubated at 4°C overnight. Plates were then blocked with BLOTTO (5% w/v nonfat dry milk/0.01% thimerosal/0.01% antifoam Ai 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2/0.15 M sodium chloride) for one hour at 37° C.

Sera ble fortynnet 1:100 med en 1:1 blanding av BLOTTO og PBS (0,01 M natriumfosfat, pH 7,3/0,15 M NaCl) og 50 ^1 av fortynnet sera satt til hver brønn og inkubert i en time ved 37"C. Sera ble fjernet, og platene ble vasket tre ganger i vaskebuffer (0,15 M NaCl/0,05 vekt%/volum Tween 20) før tilsetning av 100 1 geite-antihuman IgG/pepperrot-peroksydasekonjugat (50% stamløsning fortynnet til 1:10 000 i 50 mM natriumcitrat/0,05% Tween 20/1% varmeinaktivert, normal geiteserum, erholdt fra Antibodies, Inc., Davis, CA) i en time ved 37°C. Konjugatet ble fjernet, og platene vasket 3 ganger med 0,15 M NaCl/0,05vekt%/volum Tween 20. ELISA'en ble fremkalt ved å tilsette 100 /ul pr. brønn substratløsning (10 mg 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin i 50 ml 0,05 M natriumcitrat, pH 7,0) i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonene ble stoppet ved 100 /xl pr. brønn 3N H2S04/ og den optiske densitet ved 450 nm bestemt i en automatisert ELISA avleser. Sera were diluted 1:100 with a 1:1 mixture of BLOTTO and PBS (0.01 M sodium phosphate, pH 7.3/0.15 M NaCl) and 50 µl of diluted sera added to each well and incubated for one hour at 37°C. Sera were removed, and the plates were washed three times in wash buffer (0.15 M NaCl/0.05% w/v Tween 20) before addition of 100 1 goat antihuman IgG/horseradish peroxidase conjugate (50% stock solution diluted to 1:10,000 in 50 mM sodium citrate/0.05% Tween 20/1% heat-inactivated, normal goat serum, obtained from Antibodies, Inc., Davis, CA) for one hour at 37°C. The conjugate was removed, and the plates were washed 3 times with 0.15 M NaCl/0.05% w/v Tween 20. The ELISA was developed by adding 100 µl per well substrate solution (10 mg 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine in 50 ml 0.05 M sodium citrate, pH 7.0) for 30 minutes at room temperature The reactions were stopped at 100 µl per well 3N H 2 SO 4 / and the optical density at 450 nm determined in an automated ELISA reader.

Sammenfatning av tabell 1 Summary of Table 1

Tabell 1 gir ELISA resultater for alle peptider som er immunologisk aktive. Table 1 gives ELISA results for all peptides that are immunologically active.

Peptider 49 og 50 er deler av peptid 36. Peptides 49 and 50 are parts of peptide 36.

Peptid 56 overlapper delvis peptid 39. Peptide 56 partially overlaps peptide 39.

Peptid 49-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 49-BSA reactive with 10/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

Peptid 50-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 50-BSA reactive with 10/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

Peptid 56-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 56-BSA reactive with 10/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

Peptid 4 0-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 4 0-BSA reactive with 10/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

Peptid 23-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 23-BSA reactive with 10/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

Peptid 15-BSA reaktive med 10/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 15-BSA reactive with 10/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

Peptid 3 6-BSA reaktive med 9/10 positive sera; ikke-reaktive med 2/2 negative sera. Peptide 3 6-BSA reactive with 9/10 positive sera; non-reactive with 2/2 negative sera.

I et større panel er peptid 56 som delvis overlapper peptid 39, ikke-reaktiv med alle sera som er reaktive med peptid 39. Dette tyder på at det er minst to reaktive epitoper innenfor peptid 39, eller at peptidene 39 og 56 inneholder ikke-overlappende reaktive epitoper. In a larger panel, peptide 56, which partially overlaps peptide 39, is non-reactive with all sera reactive with peptide 39. This suggests that there are at least two reactive epitopes within peptide 39, or that peptides 39 and 56 contain non-overlapping reactive epitopes.

Peptid 23 (både konjugert med BSA og ikke-konjugert) ble prøvet videre ut mot et større panel av sera (23 positive, 8 negative) og viser en sensitivitet på 80-90%. Peptide 23 (both conjugated with BSA and unconjugated) was further tested against a larger panel of sera (23 positive, 8 negative) and shows a sensitivity of 80-90%.

Sammenfatning av tabell 2 Summary of Table 2

Tabell 2 viser at to av peptidene som stammet fra gag området (#15 og #17) er reaktive med LAV seropositive sera som er lite reaktive eller ikke-reaktive med peptidet 39. Dette støtter bruken av en kombinasjon av gag og env peptider for å frembringe en mer ømfintlig måling. Table 2 shows that two of the peptides derived from the gag region (#15 and #17) are reactive with LAV seropositive sera that are weakly reactive or non-reactive with peptide 39. This supports the use of a combination of gag and env peptides to produce a more sensitive measurement.

Sammenfatning av tabell 3 Summary of Table 3

Tabell 3 sammenligner resultater oppnådd med peptidene 15-BSA og 39 med resultater oppnådd med disse peptider fysisk blandet (15-BSA + 39) eller kjemisk kombinert (tioloksydert 15 + 39) . Table 3 compares results obtained with the peptides 15-BSA and 39 with results obtained with these peptides physically mixed (15-BSA + 39) or chemically combined (thiol oxidized 15 + 39).

Resultatene som oppnås når positive prøver måles med enten den fysiske eller kjemiske kombinasjonen av peptidene 15 og 39, er generelt høyere enn det som oppnås med hvert peptid alene. Dette er vist klart med prøvene 12 6, 131, 13 5, 13 8 og 1296. The results obtained when positive samples are measured with either the physical or chemical combination of peptides 15 and 39 are generally higher than those obtained with each peptide alone. This is clearly shown with samples 12 6, 131, 13 5, 13 8 and 1296.

Sammenfatning av tabell 4 Summary of Table 4

Tabell 4 sammenligner resultater oppnådd med peptidene 71, 78, 79, 88, 92 og 97 i en ELISA måling. Alle peptidene unntatt ett gir bedre enn 7 0% korrelasjon for positiver og to peptider hadde 100% korrelasjon. Table 4 compares results obtained with peptides 71, 78, 79, 88, 92 and 97 in an ELISA measurement. All but one of the peptides give better than 70% correlation for positives and two peptides had 100% correlation.

Fotnote til tabell 1- 3 Footnote to table 1-3

<1> Fremstilt som beskrevet i Britisk patentsøknad nr 83/24800, innsendt 15. september 1983. <2> Radioaktivt merkede LAV antigener ble brutt opp i et RIPA buffer (Gilead et al., Nature (1976) 264:263) og ble så omsatt med human serum. De resulterende immunkomplekser ble skilt ved binding til en Staphylococcus aureus absorbent (Kessler, <1> Prepared as described in British Patent Application No. 83/24800, filed September 15, 1983. <2> Radiolabeled LAV antigens were broken up in a RIPA buffer (Gilead et al., Nature (1976) 264:263) and were then reacted with human serum. The resulting immune complexes were separated by binding to a Staphylococcus aureus absorbent (Kessler,

J. Immunoloqy (1975) 115:1617) etterfulgt av flere vasker. J. Immunoloqy (1975) 115:1617) followed by several washes.

Immunologisk utfelte antigener ble analysert ved SDS polyaktylamidgel-elektroforese (Laemmli, Nature Immunoprecipitated antigens were analyzed by SDS polyactylamide gel electrophoresis (Laemmli, Nature

(1970) 227:680) etterfulgt av fluorografi. (1970) 227:680) followed by fluorography.

Tilstedeværelse av enten et p25 eller gp43 bånd ble ansett nødvendig og tilstrekkelig til å bekrefte en prøve som seropositiv. Presence of either a p25 or gp43 band was considered necessary and sufficient to confirm a sample as seropositive.

<3> LAS = Lymfadenopatisyndrom <3> LAS = Lymphadenopathy syndrome

A n.d. = ikke målt. A n.d. = not measured.

Det er tydelig fra de foregående resultater at ved å anvende ett eller en kombinasjon av peptider fra foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en ømfintlig, nøyaktig prøve på nærvær av antistoffer mot AIDS. De foreliggende peptider kan brukes i seg selv eller i kombinasjon med en undersøkelses-måling eller bekreftende måling, hvor det fullstendige lysat eller de fullstendige antigener kan anvendes som i en uavhengig fremgangsmåte. På grunn av egenskapene til peptidene, vil man videre forvente at DNA-sekvensene som koder for peptidene også ville finne lignende spesifisitet i en DNA-hybridiseringsmåling. Således muliggjør foreliggende It is clear from the foregoing results that by using one or a combination of peptides of the present invention, a sensitive, accurate test for the presence of antibodies against AIDS is provided. The present peptides can be used by themselves or in combination with a survey measurement or confirmatory measurement, where the complete lysate or the complete antigens can be used as in an independent method. Due to the properties of the peptides, one would further expect that the DNA sequences encoding the peptides would also find similar specificity in a DNA hybridization measurement. Thus enabling the present

oppfinnelse påvisning av pasienter som har vært utsatt for det etiologiske retrovirusmiddel til lymfadenopatisyndrom og/eller invention detection of patients who have been exposed to the etiological retroviral agent for lymphadenopathy syndrome and/or

AIDS. AIDS.

Selvom den foregående oppfinnelse er beskrevet i en viss detalj som illustrasjon og eksempel i den hensikt å klargjøre forståelsen, vil det være åpenbart at visse forandringer og modifikasjoner kan utøves innenfor omfanget av de vedlagte krav. Although the foregoing invention has been described in some detail by way of illustration and example for the purpose of clarifying the understanding, it will be obvious that certain changes and modifications can be made within the scope of the appended claims.

Claims

1. Method for detecting the presence of LAV/HTLV-III virus or antibody against LAV/HTLV-III virus where a sample is combined with a mixture of epitope points that compete immunologically with LAV/HTLV-III epitope points, including antibodies binds to such a protein mixture that a specific binding pair complex is formed and the degree of complex formation is determined, characterized in that a mixture containing at least one peptide coded for by the coding region of LAV/HTLV-III is added as a reagent to the measuring medium, the peptide containing at least one of the following peptide sequences: or a peptide of at least 8 and fewer than 50 amino acids, including at least 8 consecutive amino acids from and where the peptide is free of other peptides or conjugated with a macromolecule for which antibodies in human sera are essentially lacking.

2. Method according to claim 1, characterized in that a mixture containing at least two of the peptides is used, at least one of the peptides has the amino acid sequence according to peptide sequences I to VII and at least one of the peptides has an amino acid sequence according to peptides VIII to XIII.

3. Method according to claim 2, characterized in that a mixture is used in which one of the peptides is an o<1>igopeptide within the sequences mentioned in claim 2 with one of the following sequences:

4. Method according to claim 2, characterized in that a mixture is used in which two of the peptides are covalently bound together through a bond or chain.

5. Peptide for use in vitro, which is immunologically reactive towards antibodies against LAV/HTLV-III, characterized in that the peptide contains one of the following sequences: or a peptide of at least 8 and fewer than 50 amino acids, including at least 8 consecutive amino acids from and analogues thereof, in which amino acids in the sequence can be inserted, omitted and substituted provided that similar immunoreactivity to antibodies against LAV/HTLV-III is maintained.

6. Peptide according to claim 5, characterized in that the peptide is N-terminally acetylated.

7. Peptide according to claim 5, characterized in that the peptide is bound to a peptide or protein with a molecular weight of at least 5000, which peptide or protein is not normally bound to antibodies in a human host.

8. Peptide according to claim 5, characterized in that the peptide contains at least 8 and fewer than 50 amino acids, of which at least 8 consecutive amino acids from the following amino acid sequence: