JP2705791B2 - Ａｉｄｓ関連病の検出のための合成抗原 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 リンパ節症候群及び後天性免疫不全症候群（AIDS）が
リンパ節症ウィルス（LAV）、ヒト−Ｔ細胞リンパ栄養
ウィルス−III（HTLV-III）、AIDS−関連ウィルス（AR
V）又は免疫不全関連ウィルス（IDAV）と呼ばれる伝染
性レトロウィルスによって引き起こされるという発見に
従って、疾病の潜在ベクター、たとえば疾病個人からの
血液（輸血のために使用され得又はこれから特定の血液
要因が単離され得る）を検出できることが直ちに必要に
なって来た。 疾病の潜在ベクターを検出するためには、ウィルスタ
ンパク質及び／又はそのようなタンパク質に対する抗体
を有することが必要である。LAV/HTLV-IIIレトロウィル
スを増殖することに関しては危険であるので、ウィルス
タンパク質又はそれらの免疫同等体を得るための手段を
確立することに有意な興味が存在し、そしてこの手段は
多量の生きている、潜在的な伝染性ウィルスを操作する
必要がない。他方、そのウィルスは、レトロウィルスが
変遷するにつれて頻繁に変化する、高い多形性であると
報告されている事実に関心があるにちがいない。 関連文献の簡単な説明 レトロウィルスの種々の抗原がSaxingerなど.,Scienc
e（1985）227:1036〜1038によって記載されている。ま
た、Galloなど.,前記．（1984）224:500;Sarangadharn
など.,前記．224:506;Barresinoussiなど.,前記．（198
3）220:868;Montagnierなど.,In Human T−Cell Leukem
ia/Lymphona Virus,Gallo,Essex,Gross,出版（Cold Spr
ing Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Yor
k）,1984,363ページを参照のこと。これらはp13,p18,p2
5,p36,gp43,p55,gp65,gp110等を含むが（ここでその数
字は、報告者によって異なる）、しかしこれだけに限定
されない。 Hopps and Woods,Proe.Natl.Acad.Sci.USA（1981）7
8:3824は、それらの比較的親水性に基づいて、ポリペプ
チドの潜在的エピトープとしてペプチドを選択するため
の基準を説明する。これらの基準を用いる１つの研究に
おいては、活性タンパク質によって誘発された抗体の９
％を結合する、12個のアミノ酸ペプチドを合成した〔Ho
pp,Molec.Immunol.（1981）18:869〕。一般的に、Hopp/
Woodsの基準は、高い予言的な値を有することを示さな
かった。さらに、親水性でないエピトープが報告された
〔Kazimなど.,Biochem.J.（1982）203:201〕。ポリペプ
チドの抗原性の他の研究は、Greenなど.,Cell（1982）2
8:477、ここで抗体を誘発するペプチドが使用され、そ
して該抗体は活性タンパク質に結合することができ、と
ころが逆に、活性タンパク質によって誘発された抗体は
ペプチドに結合できず；及びTrainerなど.,Nature（198
4）312:127〔Greenなどのそれらに類似するミオヘムエ
リトリンに起因する〕を含む。 LAVの完全なヌクレオチド配列がWain-Hobsonなど.,Ce
ll（1985）40:9によって報告されている。HTLV-IIIのた
めの完全な配列は、Muesingなど.,Nature（1985）313:4
50によって報告され、そしてARVのための完全な配列はS
anchez-Pescadorなど.,Science（1985）227:484によっ
て報告されている。すべての３種のウィルスは、実質的
なヌクレオチド相同性を示し、そして形態学、細胞病理
学、最適な逆転写酵素活性のための必要条件及び少なく
ともいくつかの抗原特性に関して類似し〔Levyなど.,Sc
ience（1984）225:840;Shupbachなど.,Science（1984）
224:503〕、そして従って、同じウィルスの単離物が考
慮されるべきである。また、Changなど.,Science（198
5）228:93も参照のこと。 発明の要約 LAV/HTLV-IIIレトロウィルスのgag及び／又はenv領域
にコードされているタンパク質を免疫学的にまねること
ができるペプチド配列が、レトロウィルスへの暴露の
前、血液及び血液生成物のスクリーニングに使用するた
めの試薬として提供される。そのペプチドは少なくとも
５個のアミノ酸のものであり、そしてLAV/HTLV-IIIウィ
ルスに対する抗体の検出、LAV/HTLV-III抗原の検出のた
めの種々の特異的結合アッセイに又は免疫原として使用
され得る。 特定の態様の説明 この開示のためには、ウィルスは、下記の基準を実質
的に満たす場合、LAV/HTLV-IIIに同じか又は同等である
と思われる： （ａ） ウィルスがＴ−リンパ球、特にヘルパ−Ｔ細胞
（CD4⁺,BernarclなどLeucoyte Typing，ニューヨーク:S
pringer Verlag,1984に定義された国際命名法に例え
ば）のために栄養的であり； （ｂ） ウィルスが感染されたCD4⁺細胞のために細胞変
性的であり（HTLV−Ｉ及び−IIの場合、むしろ形質転換
的である）； （ｃ） ウィルスが、Mg²⁺依存性である（最適濃度5m
M）,7.8の最適pHを有し、アクチノマイシンＤによって
抑制できずそしてその３′LTRから逆転写のためのプラ
イマーとしてオリゴ（dT）_12〜18を使用することができ
るRNA−依存性DNAポリマラーゼ（逆転写酵素）をコード
し； （ｄ） ウィルスが約1.16の密度でスクロースグラジェ
ントにバンドを形成し； （ｅ） ウィルスが〔³Ｈ〕−ウリジンによりラベルさ
れ得； （ｆ） ウィルスが、LAV/HTLV-IIIのgag及びenv領域に
よってコードされるタンパク質と免疫学的に実質的に交
差反応し；そして （ｇ） ウィルスがLAV又はHTLV-IIIとヌクレオチド相
同体（約75〜100％）及びアミノ酸配列相同体（約75〜1
00％）を実質的に共有する。 LAV/HTLV-IIIレトロウィルスによってコードされるタ
ンパク質、特にウィルスゲノムのgag及び／又はenv領域
によってコードされるタンパク質に免疫学的に似ている
新規のペプチドが提供される。異なった単離体の間で種
と種の変動を調節するために、二者択一的に、保存性置
換及び選択のための調整（ここで、非保存性置換が関与
される）を、行なうことができる。これらのペプチド
は、生理学的サンプルにおいてウィルス又はウィルスに
対する抗体の検出のために個々に又は一緒に使用され得
る。試験案の種類に依存して、ペプチドは、ラベル又は
非ラベルされ、固形表面に結合され、担体又は他の化合
物に接合され又は同様にされる。 対象のペプチドは、gag領域又はenv領域によってコー
ドされるペプチドから誘導されるであろう。これらのペ
プチドは、最初に、p55又はそのフラグメント、たとえ
ばp25及びp18又はgp150及びそのフラグメント、たとえ
ばgp41から誘導されるであろう。これらのペプチドは、
ローマ数字を与えられるが、しかしそれらが生成される
方法に任意に関連される、数による名称もまた与えられ
るであろう。 gag領域に関しては、LAV/HTLV-IIIレトロウィルスの
塩基対（bp）450〜bp731、特に約bp450〜bp545（97）及
びbp696〜bp731（71）；約bp900〜bp1421、特に約bp921
〜bp1016、並びにbp921〜bp1010;bp972〜bp1016（9
2）；及びbp936〜bp995（17）；又は約bp1158〜約bp140
0、特にbp1164〜bp1250（90）;bp1278〜bp1385（88）及
びbp1320〜bp1385（15）を延長するコード領域が特に興
味の対象である（Wain-Hobsonなど.,前記による番号づ
け）。 env領域に関しては、特定の興味の領域は、bp7210〜b
p7815領域、特にbp7231〜bp7794内、より特別には約bp7
246〜bp7317（36）内、bp7516〜bp7593（39）、特にbp7
543〜bp7593（79）及びbp7561〜bp7593（78）,bp7708〜
bp7779（23）,bp7636〜bp7689（40）,bp7498〜bp7554
（56）内にコードされたこれらのポリペプチダーゼであ
ろう。 対象のペプチドは、LAV/HTLV-IIIレトロウィルスによ
ってコードされる配列内に含まれる、少なくとも５個、
時々６個、8,12個のアミノ酸、普通約50個よりも少な
い、より一般的には約35個よりも少ない、そして好まし
くは約25個よりも少ないアミノ酸を含むであろう。おの
おのの場合、そのオリゴペプチドは、大きなペプチドの
感受性のすべてを実質的に保持しながら、できるかぎり
小さい方が好ましい。ある場合、親と同等の感受性を単
独に又は一緒に提供する、同じペプチド構造体において
又は個々のペプチドとしてオーバーラップしない、２又
はそれ以上のオリゴペプチドを連結することが好まし
い。 そのペプチドは、普通20数％（20number percenc）よ
りも少ない、より一般的には10％よりも少ない、交換さ
れるペプチドを、ペプチドにおける保存性又は非保存性
置換法を導入することによって変性され得る。領域が、
多形的であることが見出された場合、異なったレトロウ
ィルス株の異なったエピトープをより効果的に模倣する
ために、１又は複数の特定のアミノ酸を変えることが好
ましいであろう。多くの場合、化学的及び物理的安定性
を付与するために、メチオニンがノルロイシン（Nor）
によって交換され得る。 本発明に使用されるポリペプチドは、この対象化合物
が、LAV/HTLV-IIIレトロウィルスの少なくとも１つの株
のタンパク質との免疫学的競争を提供することができる
かぎり、いづれか特定のLAV/HTLV-IIIポリペプチド配列
に同一である必要はないことが理解されるべきである。
従って、その対象ポリペプチドは、種々の変化、たとえ
ば挿入、欠失及び保存性又は非保存性置換（ここで、そ
のような変化は、それらの使用にある利点を提供するか
も知れない）にゆだねることができる。保存性置換によ
って、次の組み合せ、たとえばgly,ala;val,ile,leu;as
p,glu;asn,gln;ser,thr;lys,arg;及びphe,tyrが予期さ
れる。普通、その配列は、LAV/HTLV-IIIレトロウィルス
の少なくとも１つの株の配列と20％以上異ならないであ
ろう。但し、付加アミノ酸が、“アーム（arm）”を付
与するためにいづれかの末端で付加される場合、異な
り、そしてそれによって本発明のペプチドが便利に固定
され得る。そのアームは普通、少なくとも１個のアミノ
酸であり、そして50又はそれよりも多くのアミノ酸、た
いてい１〜10個のアミノ酸であろう。 さらに、１又は２個のアミノ酸が、オリゴペプチド又
はペプチドの末端に付加され、１つのペプチドのもう１
つのペプチドへの結合の容易さ、支持体又は大きなペプ
チドへのカップリング、次に討論されるべき理由のため
には、物理的又は化学的性質の修飾又は同様のことを提
供することができる。 アミノ酸、たとえばチロシン、システイン、リシン、
グルタミン酸又はアスパラギン酸又は同様のものが、結
合のために有用な官能価を提供するために、ペプチド又
はオリゴペプチドのＣ−又はＮ−末端で導入され得る。
支持体への結合のためにはＣ−又はＮ−末端で１〜３個
のシステインの存在が特定の興味の対象である。そのシ
ステインは、活性化されたオレフィン支持体へのチオエ
ーテル結合に基づいて、ジチオ−又はチオ−機能化支持
体にジスルフィド結合によって結合され得る。 さらに、ペプチド又はオリゴペプチド配列は、末端の
NH₂のアシル化、たとえばアセチル化、又はチオグルコ
ール酸のアミド化、末端のカルボキシル基のアミド化、
たとえばアンモニア、メチルアミン等によって修飾され
る配列によって天然の配列と異なる。いくつかの場合、
これらの修飾は、支持体又は他の分子への結合のための
部位を提供することができる。 対象のペプチド及びオリゴペプチドが、今、考慮され
るであろう。対象の第１ペプチドはgag領域、特にp25及
びp18として言及されたタンパク質に由来されるであろ
う。 P25のためのペプチドは、次のとおりである：領域bp1
320〜bp1385にコードされるペプチドＩ（15）は、次の
アミノ酸配列を有し、ここで次の配列内に含まれるオリ
ゴペプチドは、そのような配列内に線状エピトープを含
むであろう：〔配列中、ＸはOH又はNH₂であり、そして存在するな
ら、アミノ末端基Ｙ、たとえばTyr又はCysがタンパク質
担体への該ペプチドの結合を促進せしめるために添加さ
れる〕。 次のペプチドII（17）は、約bp936〜bp995を延長する
領域によってコードされ、そして次の配列を有し、ここ
で次の配列内に含まれるオリゴペプチドは、そのような
配列内に線状エピトープを含むであろう： 〔配列中、ＸはOH又はNH₂であり、そしてアミノ末端基
Ｙは前に定義されたとおりである〕。 次のオリゴペプチド： 〔配列中、Ｘ及びＹは前に定義されたとおりであり、そ
してＺは結合、すなわち結合の手段、たとえばシステイ
ン、チロシン等を提供し、又はＸと一緒に考える場合、
結合のために使用され得る官能基、たとえばアリル又は
マレイミジル、ジチオ、等における場合のオレフィンを
提供するアミノ酸である〕が特に興味の対象である。 次の興味あるペプチド、III（92）は、bp972〜bp1016
を延長する領域によってコードされ、そして次の配列を
有し、ここで次の配列内に含まれるオリゴペプチドは、
そのような配列内で線状エピトープを含むであろう： 〔配列中、X,Y及びＺは前に定義された通りである。〕 好ましくは、このペプチドは、LAV/HTLV-IIIのゲノム
によってコードされた、約15個より多くなりアミノ酸を
有するであろう。 次のペプチド、IV（90）は、bp1164〜bp1250を延長す
る領域によってコードされ、そして次の配列を有し、こ
こで次の配列内に含まれるオリゴペプチドはそのような
配列内で線状エピトープを含むであろう：〔配列中、X,Y及びＺは前に定義された通りである。〕 好ましくは、このペプチドは、LAV/HTLV-IIIのゲノム
によってコードされた、約29個より多くなりアミノ酸を
有するであろう。 ペプチド、Ｖ（88）は、bp1278〜bp1385を延長する領
域によってコードされ、そして次の配列を有し、ここで
次の配列内に含まれるオリゴペプチドはそのような配列
内に線状エピトープを含むであろう： 〔配列中、Ｘ及びＹは前に定義された通りである〕。 次の対象のペプチドは、p18として言及されたgagタン
パク質領域から誘導されるであろう。 次の対象のペプチド、VI（97）は、bp450〜bp545を延
長する領域によってコードされ、そして次の配列を有
し、ここで次の配列内に含まれるオリゴペプチドは、そ
のような配列内で線状エピトープを含むであろう： 〔配列中、Ｘ及びＹは前に定義された通りである〕。 次の対象のペプチド、VII（71）は、bp696〜bp731を
延長する領域によってコードされるであろう。このペプ
チドは、線状エピトープをコードするいづれかのオリゴ
ペプチドを含み、そして次のアミノ酸配列： 〔配列中、Ｙは前に定義された通りである〕を有する。 次の対象のポリペプチドは、env領域、すなわちgp110
（110Kドルトン）から誘導されるものであろう。 次の対象のポリペプチド、VIIIは、bp7246〜bp7317を
延長する領域によってコードされ、そして前に指摘され
た一般的な制限内にある場合、好ましくは、LAV/HTLV-I
IIのゲノムによってコードされた、24個よりも多くない
アミノ酸を有するであろう。 対象のペプチドは、一般的に次のアミノ酸配列を有
し、ここで次の配列内に含まれるオリゴペプチドはその
ような配列内に線状エピトープを含むであろう： 〔式中、ＸはOH又はNH₂であり、そしてカルボキシ末端
基Ｚは、存在するなら、タンパク質担体への該ペプチド
の結合を促進するために添加されたアミノ酸、たとえば
Cysである〕。 ６個、便利には４個までの、天然に存在するＣ−末端
アミノ酸が欠失又は置換されることが特別な興味の対象
である。 特別に興味ある上の配列内に含まれるオリゴペプチド
は、次の配列： を含む。 次の対象のペプチドは、gp41として知られているenv
領域から誘導されるであろう。 次のペプチド、IX（56）は、bp7498〜bp7554を延長す
る領域によってコードされ、ここで次の配列内に含まれ
るオリゴペプチドは、そのような配列内に線状エピトー
プを含むであろう： 〔配列中、X,Y及びＺは前に定義された通りである。〕 特に興味ある上記配列内に含まれるオリゴペプチド
は、次の配列： を含む。 次の対象のペプチド、Ｘ（39）は、bp7516〜bp7593を
延長する領域によってコードされ、そして次のアミノ酸
配列を有し、ここで次の配列内に含まれるオリゴペプチ
ドは、そのような配列内に線状エピトープを含むであろ
う： 〔配列中、ＸはOH又はNH₂である〕。 次のペプチド、XI（40）は、bp7630〜bp7689を延長す
る領域によってコードされ、ここで次の配列内に含まれ
るオリゴペプチドはそのような配列内に線状エピトープ
を含むであろう： 〔配列中、X,Y及びＺは前に定義された通りである〕。 次の対象のペプチド、XII（23）は、bp7708〜bp7779
を延長する領域によってコードされるであろう。このペ
プチドは、次のアミノ酸配列： 〔配列中、X,Y及びＺは前に定義した通りである〕内に
線状エピトープをコードするいづれかのオリゴペプチド
を含むであろう。 次の対象のペプチド、XIII（79）は、bp7543〜bp7593
を延長する領域によってコードされるであろう。このペ
プチドは、次のアミノ酸配列： 〔配列中、Ｘ及びＹは前に定義した通りである〕内に線
状エピトープをコードするいづれかのオリゴペプチドを
含むであろう。 次の対象のペプチド、XIIIa（78）は、bp7561〜bp759
3を延長する領域によってコードされるであろう。この
ペプチドは、次のアミノ酸配列：内に線状エピトープをコードするいづれかのオリゴペプ
チドを含むであろう。 ジスルフィド結合又は長い結合によって、２つのペプ
チド又はオリゴペプチドもしくはその組合せを結合する
ために、システイン又はアミノ末端基をアシル化するた
めに使用されるチオグリコール酸もしくは同様のものの
メルカプタン基の使用が特別な興味の対象である。これ
を達成するために、ビス−ハロアセチル基、ニトロアリ
ルハリド又は同様のものを有する化合物を、使用するこ
とができ、ここでその試薬は、チオ基に対して特異的で
ある。従って、異なったペプチド又はオリゴペプチドの
２つのメルカプト基の間の結合は、単結合又は少なくと
も２個、普通少なくとも４個、そして16個よりも多くな
い、普通約14個よりも多くない炭素原子の結合基であ
る。gag領域からの配列のメンバーはenv領域からのメン
バーに連結されることが特に興味の対象である。非アミ
ノ酸結合を含むことができるこれらのキメラペプチド
は、そのペプチド及びオリゴペプチドについて記載され
るであろう場合、さらに変性され得る。 この対象ペプチドは、可溶性巨大分子（たとえば、≧
5Kドルトン）担体に結合され、使用され得る。便利に
は、その担体は、天然に存在するか又は合成のポリ（ア
ミノ酸）であり、そしてヒト血清中において、抗体は、
これに見出されそうもない。ポリペプチドの例は、ポリ
−Ｌ−リシン、ウシ血清アルブミン、キイホールリンペ
ット（Keyhole limpet）のヘモシアニン、ウシγ−グロ
ブリン、等を含む。主として、その便利さ及び有効性の
１つを基に選択される。 そのような接合体に関しては、巨大分子当り少なくと
も１つの対象ペプチド分子、及び巨大分子0.5Kドルトン
当り多くとも約１つのペプチド分子、普通巨大分子2Kド
ルトン当り多くとも約１つのペプチド分子が存在するで
あろう。１又は複数の異なったペプチドが同じ巨大分子
に結合され得る。 結合は、試薬、たとえばｐ−マレイミド安息香酸、ｐ
−メチルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水琥珀
酸、グルタルアルデヒド、等を用いて、従来の方法によ
って行なわれる。その結合は、Ｎ−末端、Ｃ−末端又は
分子の末端の中間部位で生じる。対象のペプチドは、連
結のために誘導体化され、支持体に結合されながら連結
され得る。 化合物が、それらの使用に依存して、ラベルされた又
はラベルされていない化合物として使用され得る。（直
接的又は間接的に検出可能なシグナルを提供する分子が
ラベルによってもたらされる。）種々のラベル、たとえ
ば放射性核種、酵素、フルオレスサー、化学ルミネセン
サー、酵素基質、補因子もしくは阻害剤、粒子たとえ
ば、磁気粒子、リガンド及び受容体、たとえばビオチン
及びアビジンの組合せ、又は同様のものが使用され得
る。さらに、ペプチドは、たとえばミクロタイタープレ
ート、ガラスビーズ、クロマトグラフィーの表面、たと
えば紙、セルロース、シリカゲル、又は同様のものへの
結合のために種々の方法で変性され得る。ポリペプチド
を、他の化合物又は表面に連結する特定の方法は、従来
通りであり、そして文献中に十分に例示されている。た
とえば、アメリカ特許第4,371,515号；第4,487,715号を
参照のこと。この開示を引用によりこの明細書中に組み
入れる。 種々のアッセイ法が、レトロウィルス性タンパク質に
対する抗体又はレトロウィルス性タンパク質自体の存在
を検出するために使用され得る。ラベルされた試薬とし
てペプチドを用い（ここで、ラベルは、検出できるシグ
ナルをもたらす）、又は直接的又は間接的に表面にペプ
チドを結合することが（ここで、サンプル中において、
ペプチドに対する抗体が表面上でペプチドに結合するよ
うになるであろう）、興味の対象である。次に、ペプチ
ドに結合されたヒト抗体の存在は、ヒト免疫グロブリ
ン、通常ヒトIgM及びIgGの両者に対して特異的な異種移
植性抗体、又は免疫複合体、たとえばRf因子又はS.アウ
レウス（S.aureus）のプロテインＡに対して特異的なラ
ベルされたタンパク質によって検出され得る。 種々の不均一法（コンペティティブ又は非コンペティ
ティブアッセイ）を使用することができる。ペプチド
は、表面又は支持体（“support"）に結合され、そして
ラベルされた抗体は、結合されたペプチドの限定量のた
めにサンプル中において抗体と競争することを可能にさ
れる。支持体に結合されるラベルの量は、サンプル中の
競争的抗体の量に関係するであろう。 抗体は、支持体に結合され、そしてサンプルはラベル
されたペプチドと共に混合される。反応混合物と結合さ
れた抗体との接触の後、支持体に結合されたラベルの量
は、サンプルの同種の抗体の量に関係するであろう。 異種移植抗−ヒト抗体、たとえばIgG及びIgM（免疫グ
ロブリン）のFcに対する抗体が支持体に結合される。サ
ンプルは、免疫グロブリン及びラベルされたペプチドと
共に接触され、それによって、支持体に結合された、ラ
ベルされたペプチドの量が同種抗体の存在を指摘するで
あろう。 他方、ペプチドが酵素、フルオレサー又は他のラベル
に結合される均一アッセイが使用され得、ここでペプチ
ドへの抗体の結合が、特定の結合対複合体に関与するラ
ベルと複合体に包含されないラベルとを識別することが
できることをもたらす。そのような技法に関与するアッ
セイについては、たとえばアメリカ特許第3,817,837
号；第3,850,752号；第3,901,654号；第3,935,074号；
第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；及び
第4,098,876号を参照のこと、この開示を引用によって
本明細書に組入れる。 本発明の例示として、対象ペプチドは、蛍光分子、た
とえばフルオレセイン、ローダミン又はウンベリフェロ
ンに接合され得る。種々の技法、たとえば蛍光偏光法
が、抗体と共に形成される複合体を検出するために使用
され得る。このアッセィにおいては、蛍光偏光は、複合
化された及び複合化されていないペプチド接合体の間で
異なる。装置、たとえばAbbott Laboratories,Chicago,
イリノイによって供給されたTDXが、蛍光偏光における
変化を測定するために利用できる。 サンプル容器、たとえばマイクロタイタープレートウ
ェルの使用がアッセィ技法の例であり、そしてそこで、
対象ポリペプチド又はその接合体が共有的に又は非共有
的に容器底部及び／又は壁に付着される。サンプル、通
常、適切な緩衝培地中に希釈されたヒト血液又は血清が
該容器に添加され、そしてポリペプチドとサンプル中の
同種の抗体との間で複合体が形成するのに十分な時間、
保持される。上清液を除去し、そして容器を洗浄し、非
特異的に結合したタンパク質を除去する。 複合体に特異的に結合する、ラベルされた特異的結合
タンパク質が検出のために使用される。容器に、ヒト免
疫グロブリンに対する異種移植性抗血清、特に適切な緩
衝培地中における抗−（ヒトIgM及びIgG）を添加するこ
とができる。その異種移植性抗血清は、通常、検出可能
なラベル、たとえば放射性核種又は酵素によりラベルさ
れるであろう。抗血清の代わりに、免疫複合体に対して
特異的なタンパク質、たとえばS.アウレウスプロテイン
Ａを使用することができる。たとえば、非特異的に結合
した酵素ラベルの除去の後、酵素と共に展開溶液を添加
する。その展開溶液は、酵素基質及び多分、酵素補因
子、クロモゲン、等を含み、そして該クロモゲンは、反
応後、それぞれ比色分析的に又は蛍光定量的に検出され
得る着色された又は蛍光生成物を提供する。 ペプチドは、広範囲の種類の方法で製造され得る。ペ
プチドは、比較的短いサイズなので、それらは、従来の
技術に従って、溶液中で又は固形支持体上で合成され得
る。種々の自動合成機が今日商業的に利用可能であり、
そして既知方法に従って使用され得る。たとえば、Stew
art and Young,Solid Phase Peptide Syntesis,第二版,
Pierce Chemical Co.,1984;及びTamなど.,J.Am.Chem.So
c.（1983）105:6642を参照のこと。 他方、ハイブリッドDNA技法を使用することができ、
ここで、合成遺伝子を、ポリペプチドをコードする単鎖
又は実質的にその相補的鎖を使用することによって製造
することができ、そしてここで該単鎖はオーバラップ
し、そしてバイブリッド化するためにアニーリング培地
中に導びかれ得る。次に、そのハイブリッド化した鎖を
連結し、完全な遺伝子を形成し、そして適切な末端の選
択によって、その遺伝子を、発現ベクター中に挿入し、
そしてこの事は今日容易に利用できる。たとえば、Mari
atsなど.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,CS
H,Cold Spring Harbor Laboratory、1982を参照のこ
と。また、そのペプチドをコードするウィルスゲノムの
領域を、従来の組換えDNA技法によってクローン化し、
そして発現することができる（Maniatis,前記を参照の
こと）。 ペプチドＩ〜XIIIを発現するために使用され得るDNA
コード配列は、次のものである： これらの配列からのフラグメントは、ペプチドフラグ
メントの発現のために使用され得、保存性塩基変化を行
なうことができ、ここで変性されたコドンは同じアミノ
酸をコードし、又はコード配列における非保存性塩基変
化を行なうことができ、ここで得られるアミノ酸は保存
性又は非保存性変化体である。 そのコード配列を、５′−又は３′−末端又は両末端
のいづれかで延長することができ、その結果、そのエピ
トープ部位を保持しながら、ペプチドを延長することが
できる。その延長は、同じ鎖中に２つの又はすべてのペ
プチドを連結し、抗原性活性を供与し、又は同様のこと
のために、たとえばラベル（たとえば酵素）への結合の
ためのアームを提供することができる。 発現に関しては、そのコード配列は、出発コドン及び
停止コドン、プロモーター領域及びターミネーター領域
並びに普通複製システムにより供給され、細胞宿主、た
とえば原核生物、真核生物、細菌、酵母、哺乳類、等に
おいて発現のための発現ベクターを提供する。 普通少なくとも15個の塩基、好ましくは少なくとも18
個の塩基を有する、その配列自体、そのフラグメント又
はより大きな配列が、レトロウィルスRNA又は原ウィル
スDNA（Proviral DNA）の検出のためのプローブとして
使用され得る。多くの技法、たとえばGrunstein-Hognes
s技法、サウザーン技法、ノーザーン技法、Dot-blot
法、それらの改良法、及び他の方法論が記載されてい
る。たとえば、WO83/02277及びBerentなど.,Biotechniq
ues（1985）3:208を参照のこと。 ポリペプチドは、融合タンパク質として便利に製造さ
れ得、そしてここで該ポリペプチドは、該融合ポリペプ
チドのＮ−又はＣ−末端である。その得られる融合タン
パク質を、試薬として単独で直接的に使用することがで
き、又はその対象ペプチドを、融合タンパク質の残存配
列のすべて又は一部から分離することができる。内部に
メチオニンが存在しないポリペプチドに関しては、融合
部位でメチオニンを導入することによって、ポリペプチ
ドは、臭化シアンを用いて分離され得る。内部にメチオ
ニンが存在する場合、タンパク質分解分離部位、たとえ
ばポリ−リシン及び／又はポリ−アルギニン又はその組
合せを供与することが必要であり、又はその内部メチオ
ニンを、アミノ酸、たとえばロイシン及び臭化シアン分
離のために添加されたＮ−末端メチオニンと交換するこ
とができる。広範囲の種類のプロテアーゼ及びジペプチ
ターゼが良く知られていて、そして適切なプロセシング
シグナルが適切な部位で挿入され得る。そのプロセシン
グシグナルは、分離を確保するためにタンデム反復を有
することができる。なぜならば、１又は複数の外来性ア
ミノ酸の存在は、対象ポリペプチドの実用性を妨げない
であろうからである。 アッセイの性質に依存して、生理的サンプル、たとえ
ば唾液、血液、血漿又は血清がアッセイ培地中に希釈す
ることによって前処理され、ここで、該培地は普通、種
々の緩衝液、たとえばリン酸、トリス又は同様のものの
１つを使用する水性緩衝培地であろう。好ましい希釈剤
は、ブロトオ（blotto）〔５％w/v非脂肪性ドライミル
ク,0.01％チメロサール,0.01Mリン酸ナトリウム中0.01
％アンチフォームＡ（pH＝7.2）及び0.15MのNacl〕であ
る。普通、そのpHは、約６〜９の範囲内にあるであろ
う。次に、そのサンプルは、適当な方法に従って、試薬
と共に混合され、そして結合のために十分な時間、保持
されるであろう。不均一システムが使用される場合、次
に、通常、洗浄し、非特異的結合を最少にするであろ
う。その過程の最後で、ラベルが従来の方法に従って検
出されるであろう。 アッセイにおける対象ペプチド及びそれらの類似体の
他に、その対象ペプチドはまた、ワクチンに独自で又は
混合して使用され得る。そのペプチドは、便利な方法、
一般的に１μｇ〜20mg/宿主のkgの範囲の濃度で配合さ
れ得る。生理学的に許容できる培地、たとえば消毒され
た水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液及び同様のもの
は、担体として使用され得る。アジュバント、たとえば
水酸化アルミニウムゲノム又は同様のものが使用され得
る。投与は、たとえば筋肉内、腹膜内、皮下、静脈内、
等に注射によって行なわれ得る。投与は、普通１〜４週
間隔で、１回又は数回行な得る。 次の例は例示的であって、限定的ではない。 実験 ペプチド15,71,88,90,92及び97を、ｔ−ブチルオキシ
ルカルボニル（BOC）−メチルベンジル−システイン−
フェニル−アセトアミドメチル（PAN）のポリスチレン
／ジビニルベンゼン樹脂（Appliecl Biosystems,Inc.,F
oster City,CA）上にアセンブルした。カルボキサミド
ペプチド78及び79のためには、ｐ−メチルベンゾヒドリ
ルアミンのポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂を用い
た。対称的な無水物カップリング（symmetrical anhydr
ide eouplings）を、Applied Biosystems430A合成機で
行なった。但し、グルタミン及びアプパラギンを、ヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステルとしてカップルし
た。ベンジル基材の側鎖の保護及びBOCα−アミン保護
を行なった。トリプトファンを、ホルミル成分によって
保護し、メチオニンをそのスルホキシドによって保護
し、そしてジニトロフェノールを、ヒスチジンを保護す
るために使用した。保護基は、従来の方法によって除去
された。 ペプチド36を、Beckman990ペプチド合成機（Beckman
Instruments,La Brea,CA）で、ベンゾヒドリルアミンの
ポリエチレン／ジビニルベンゼン樹脂上にアセンブルし
た。ベンジル基材の側鎖の保護及びBOCα−アミン保護
を行なった。すべての残基を、直接的ジシクロヘキシル
カルボジイミド法によって付加した。但し、グルタミン
を、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとしてカッ
プルした。 ペプチド39を、ペプチド36について記載したようにし
て、ベンゾヒドリルアミン上で合成し、そしてまた、ア
ルパラギンを、エステルとしてカップルした。 ペプチドを放射性ラベルする場合、³Ｈ−酢酸及び過
剰のジシクロヘキシルカルボジイミドによりアミノ末端
をアセチル化することによって、それを行なった。 ペプチドを脱保護し、そしてTamの“low-high"HF法
（Tamなど.,前記）によって樹脂から分離した。ペプチ
ド36,39,79,78,88,90,92及び97を、５％酢酸により樹脂
から抽出し、そして５％酢酸によりゲル過クロマトグ
ラフィーにかけた。ペプチド15及び71を、0.5M炭酸アン
モニウム/0.001Mジチオエリトール（DTT）により抽出
し、そして0.05M炭酸アンモニウム/0.005Mβ−メルカプ
トエタノールによりクロマトグラフィー処理した。ペプ
チドを含む画分をプールし、そして凍結乾燥せしめた。
合成生成物の結合性を、おのおののカップリングの後、
ニンヒドリン制御によって、並びに分析用逆相クロマト
グラフィー及びアミノ酸分析によって確かめた。 ペプチド90,92及び97を、それらのスルフヒドリルの
酸化により分子間ジスルフィドへと重合せしめた。手短
に言えば、凍結乾燥された還元ペプチドを、最少の6Mグ
アニジンHCl/0.1Mリン酸ナトリウム（pH＝9.0）中に溶
解し、そして室温で１晩、酸化せしめた。 上記合成されたペプチド15,23,36,40,49,50及び56
を、Ishikawaなど.,J.of Immunoassay（1983）4:209に
よって本質的に記載しているようにして、Ｎ−スクシニ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロ−ヘキ
サン−１−カルボキシレート（SMCC）により誘導体化さ
れたウシ血清アルブミン（BSA）に接合した。 BSA溶液（0.1Mリン酸カリウム中において20mg/ml,pH
7.0）2ml中に、30℃でSMCC溶液（ジメチルホルムアミド
中において8mg/ml）1.5mlを添加した。その混合物を、
１時間、磁気攪拌し、その後それを遠心分離し、沈殿し
たアルブミンを除去した。次に、透明な混合物を、pH
6.0の0.Mリン酸カリウムにより平衡化されたSephadexG-
25を充填するゲル過にゆだねた。280nmでのそれらの
吸光度によって決定されるようなタンパク質含有性画分
をプールし、そして必要なまで−70℃で凍結保存した。 上記合成されたペプチドを、0.1Mリン酸ナトリウム
（pH 8.0）中に溶解し、それぞれの濃度を5mg/ml（ペプ
チド36）、8mg/ml（ペプチド15）又は1.6mg/ml（ペプチ
ド39）にした。おのおのの溶液1.5mlに、固形DTT 2mgを
添加した。その溶液を、30℃で30分間攪拌し、その後そ
れらを、0.1Mリン酸カリウム（pH 6.0）により平衡化さ
れたSephadexG-10を充填するゲル過クロマトグラフィ
ーにゆだねた。アリコートのシンチログラフィーによっ
て決定されるようなトリチウム含有性画分を、プール
し、そしてSMCCにより誘導体化されたBSA 1ml（ペプチ
ドＶのためには0.5ml）と共に混合した。得られた混合
物を、30℃で12時間攪拌し、そして次に水に対して徹底
的に透析した。 他のペプチドを、上記方法に従って調製し、そして上
記方法に従ってBSAに接合せしめた。BSAに対するペプチ
ドの比率を、従来の方法に従って放射能トレーサーを用
いて決定した。 モルペプチド／モルBSA Ｉ（15） 14 II（17） 5 VII（36） 9 IX（56） 17 Ｘ（39） 6 XI（40） 18 XII（23） 30^* ＊は、誤であり、そして55であろう。 ELISAによる分析 凍結乾燥されたペプチド又はタンパク質／ペプチドの
接合体を、6MグアニジンHCl中に溶解した。そのグアニ
ジン溶液を、0.05M炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH 9.
6）中に希釈し、８〜40μg/mlの最終ペプチド濃度に
し、すぐその後、96−ウェルプレート中プレートした。
50μｌのペプチド溶液を、マイクロタイターウェル当り
にアリコートし、そして４℃で１晩インキュベートし
た。次にプレートを、BLOTTO（５％〔w/v〕非脂肪性ド
ライミルク/0.01％チメロソール/0.01Mリン酸ナトリウ
ム中0.01％アンチフォームＡ、pH 7.2/0.15M塩化ナトリ
ウム）により37℃で１時間、ブロックした。血清を、BL
OTTO:PBS（0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.3/0.15MのNaC
l）の1:1混合物により1:100に希釈し、そして希釈され
た血清50μｌを、おのおののウェルに添加し、そして37
℃で１時間、インキュベートした。その血清を除去し、
そしてプレートを、緩衝液（0.15MのNaCl/0.05％〔w/
v〕Tween 20）により３度洗浄し、その後ヤギ抗−ヒトI
gG/ホースラディシュペルオキシダーゼ接合体（50mMク
エン酸ナトリウムにより1:10,000に希釈された50％スト
ック/0.05％Tween 20/1％熱不活性化された正常なヤギ
血清;Antiboclies,Inc.,Davis,CAから得られた）100μ
ｌを添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。
その接合体を除去し、そしてそのプレートを、0.15MのN
aCl/0.05％（w/v）Tween 20により３度洗浄した。ELISA
を、室温で30分間、ウェル当り基質溶液（0.05Mクエン
酸ナトリウム50ml中3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン10mg,pH 7.0）100μｌを添加することによって展開
せしめた。反応を、ウェル当り3NのH₂SO₄100μｌにより
停止せしめ、そして450nmで光学濃度を、目的化されたE
LISAリーダーによって決定した。 第１表の要約 第１表は、免疫反応性であるすべてのペプチドについ
てのELISA結果を与える。 ペプチド49及び50はペプチド36の一部である。 ペプチド56はペプチド39と一部オーバーラップする。 ペプチド49-BSAは、10/10陽性血清と反応する;2/2陰
性血清とは反応しない。 ペプチド50-BSAは、10/10陽性血清と反応する;2/2陰
性血清とは反応しない。 ペプチド56-BSAは、10/10陽性血清と反応する;2/2陰
性血清とは反応しない。 ペプチド40-BSAは、10/10陽性血清と反応する;2/2陰
性血清とは反応しない。 ペプチド23-BSAは、10/10陽性血清と反応する;2/2陰
性血清とは反応しない。 ペプチド15-BSAは、10/10陽性血清と反応する;2/2陰
性血清とは反応しない。 ペプチド36-BSAは、9/10陽性血清と反応する;2/2陰性
血清とは反応しない。 大きなパネルにおいて、一部ペプチド39とオーバーラ
ップするペプチド56は、ペプチド39と反応するすべての
血清と反応しない。これは、ペプチド39内に少なくとも
２つのエピトープが存在し又はペプチド39及び56は、オ
ーバーラップしない反応エピトープを有することを示唆
する。 ペプチド23（BSAに接合した及びBSAに接合しなかっ
た）を、大きなパネルの血清（23陽性,8陰性）に対して
さらに試験し、そして80〜90％の感受性を示す。 第２表の要約 第２表は、gag領域から誘導されたペプチドのうち２
つ（＃15及び＃17）は、ペプチド39とかろうじて反応す
るか又は反応しないLAV血清陽性（セロポジティブ）血
清と反応することを示す。これは、gag及びenvペプチド
の組合せの使用が一層敏感なアッセイを作り出すことを
示唆する。 第３表の要約 第３表は、ペプチド15-BSA及び39により得られた結果
と物理的に混合された（15-BSA＋39）又は化学的に組合
された（チオール−酸化の15＋39）これらのペプチドに
より得られた結果とを比較する。 陽性サンプルがペプチド15及び39の物理的又は化学的
組合せによりアッセイされる場合に得られた結果は、一
般的に、いづれかのペプチドのみにより得られた結果よ
りもより高い。これは、サンプル126,131,135,138及び1
296により明らかに例示される。 第４表の要約 第４表は、ELISAアッセイにおいて、ペプチド71,78,7
9,88,90,92及び97により得られた結果を比較する。１つ
を除くすべてのペプチドは、陽性のために70％以上の相
関関係を提供し、そして２つのペプチドは100％の相関
関係を持った。 第１表〜第３表の注 1:1983年９月15日に出願されたイギリス特許出願継続番
号83/24800に記載しているようにして調製した。 2:放射性ラベルされたLAV抗原を、RIPA緩衝液により崩
壊し〔Gileadなど.,Nature（1976）264:263〕，そして
次にヒト血清と反応せしめた。その得られた免疫複合体
を、スタフィロコーカス アウレアス（Staphylococcus
aureus）吸着剤に結合することによって分離（〔Kess
ler,J.Inmunology（1975）115:1617），次に数回洗浄し
た。 免疫沈殿された抗原を、SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析し〔Laemmli,Nature（1970）227:
680），次にフルオログラフィー処理した。p25又はgp43
バンドの存在は、血清陽性としてサンプルを確証するた
めに必要且つ十分であると考えられた。³ LAS＝リンパ節症候群。⁴ N.D.＝決定されなかった。 １個又は組合せの本発明のペプチドを用いて、AIDSに
対する抗体の存在についての敏感且つ正確な試験を提供
することは前述の結果から明らかである。本発明のペプ
チドは、単独で又はスクリーニングアッセイ又は確認ア
ッセイと共に使用され得、ここで完全な溶解物又は完全
な抗原が独立した方法として使用され得る。さらに、ペ
プチドの特異性のために、ペプチドをコードするDNA配
列はまた、DNAハイブリダイゼーションアッセイにおい
て類似する特異性を有するであろうことを、だれでもが
予想できるであろう。従って、本発明は、リンパ節症候
群及び／又はAIDSのレトロウィルス病因体にさらされて
いる患者の検出を可能にする。 前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で修飾及び変更を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 前置審査

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．サンプルを、LAV/HTLV-IIIエピトープ部位と免疫学
   的に競争するエピトープ部位を有するペプチドと混合
   し、それによって抗体がそのようなペプチドと結合し、
   特異的結合対複合体を形成し、そして複合体形成の量を
   決定することを含んで成る、LAV/HTLV-IIIウィルス又は
   LAV/HTLV-IIIウィルスに対する抗体を検出するための方
   法において、アッセイ培地中に、８〜50個のアミノ酸か
   ら成り、 （Ａ） そして下記のアミノ酸配列： からのLAV/HTLV-IIIの少なくとも８個の隣接するアミノ
   酸を有するペプチドであるか、あるいは （Ｂ） 上記アミノ酸配列（Ｉ），（II），（IV），
   （VI），（VII），（VIII），（Ｘ），（XI）又は（XI
   I）において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／
   又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミ
   ノ酸列であって且つLAV/HTLV-IIIに対する抗体と反応性
   を有するか又は巨大分子と結合した場合に該反応性を有
   するペプチドであって、 巨大分子（それに対する抗体はヒト血清中に実質的に存
   在しない）に結合しているか又は結合していないペプチ
   ドを使用することを特徴とする方法。 ２．前記ペプチドが、下記一般式： で示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３．前記ペプチドを固体表面に接合せしめる請求の範囲
   第１項又は第２項記載の方法。 ４．LAV/HTLV-IIIに対する抗体の存在が生理学的流体に
   おいて決定される請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
   １項記載の方法であって、 前記ペプチドの少なくとも１つにより少なくとも部分的
   に被覆されたサンプル容器中にヒト生理学的サンプルを
   導入し； 免疫複合体形成が生じるのに十分な時間インキュベート
   し；そして 免疫複合体の形成を決定することを含んで成る方法。 ５．前記免疫複合体形成が、前記複合体に結合し、そし
   て検出可能なシグナルを提供するラベルされた特異的結
   合タンパク質を用いることによって決定される請求の範
   囲第１項〜第４項のいずれか１項記載の方法。 ６．前記生理学的流体が、ヒト血清、血漿、唾液又は血
   液である請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載
   の方法。 ７．LAV/HTLV-IIIエピトープ部位と免疫学的に競争する
   エピトープ部位を有するペプチドを含んで成る試薬であ
   って、前記ペプチドが８〜50個のアミノ酸から成り、 （Ａ） そして下記アミノ酸配列： からのLAV/HTLV-IIIの少なくとも８個の隣接するアミノ
   酸を有するペプチドであるか、あるいは （Ｂ） 上記アミノ酸配列（Ｉ），（II），（IV），
   （VI），（VII），（VIII），（Ｘ），（XI）又は（XI
   I）において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／
   又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミ
   ノ酸列であって且つLAV/HTLV-IIIに対する抗体と反応性
   を有するか又は巨大分子と結合した場合に該反応性を有
   するペプチドであって、 巨大分子（それに対する抗体はヒト血清中に実質的に存
   在しない）に結合しているか又は結合していないペプチ
   ドであることを特徴とする試薬。 ８．前記ペプチドが、下記一般式： で示されるアミノ酸配列を含んで成る請求の範囲第７項
   記載の試薬。 ９．生理学的サンプル中のLAV/HTLV-IIIに対する抗体の
   決定のためのキットに含まれる請求の範囲第７項又は第
   ８項記載の試薬。 １０．前記キットが、ヒト血清、血漿、唾液又は血液中
   のLAV/HTLV-IIIに対する抗体の決定のために使用される
   請求の範囲第７項〜第９項のいずれか１項記載の試薬。