JP2008533006A - ネコ免疫不全ウイルスを検出するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

ＦＩＶ ｇａｇポリペプチド，および動物においてネコ免疫不全ウイルス感染を検出するための方法および装置が開示される。この方法は，ネコからの生物学的サンプルをＦＩＶポリペプチドと接触させ，そしてサンプル中の抗体のポリペプチドへの結合を測定することを含む。ＦＩＶ抗体を検出するための装置が提供される。

Description

本発明は，ネコ免疫不全ウイルスに対する抗体の検出に関する。

従来はネコＴリンパ球レンチウイルスと呼ばれていたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）は，１９８６年にカリフォルニア州ペタルマ（Ｐｅｔａｌｕｍａ）の大きな飼いネコ集団から初めて発見された（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３５：７９０）。ネコがＦＩＶに感染するとエイズ様症候群を呈する。ＦＩＶは形態的および病理学的にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と似ているが，抗原性ではＨＩＶと明確に区別される。ＨＩＶと同様，ネコが一旦ＦＩＶに感染すると。初期感染期（ウイルス血症，発熱，一般的なリンパ節炎）から長期の無症候期を経て，ＣＤ４リンパ球の減少により引き起こされる極めて難治性の免疫機能障害が出現し，二次感染を併発して遂には死に至る。

ＦＩＶはレトロウイルス科レンチウイルス亜科に分類される。レトロウイルス科にはヒト免疫不全ウイルス，サル免疫不全ウイルス，ウマ伝染性貧血ウイルス，ヒツジのマエディ・ビスナ・ウイルス，ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が含まれる。ＦＩＶのゲノムは他のレンチウイルスと同様に，ｇａｇ，ｐｏｌおよびｅｎｖに対応する３つの長いオープン・リーディング・フレームを有する構造をしている（Ｔａｌｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）８６：５７４３；Ｏｌｍｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）８６：２４４８）。ｇａｇ遺伝子はウイルスの主要な構造要素，ｅｎｖ遺伝子はエンベローブの糖タンパク質，ｐｏｌ遺伝子はポリメラーゼ・タンパク質をコードしている。

ｇａｇ遺伝子からは５５ｋＤのポリタンパク質が発現し，これはプロセシングされてｐ１５マトリックス・タンパク質，ｐ２４カプシド・タンパク質，ｐ１０核カプシド・タンパク質の３つのサブユニットとなる。ｐｏｌ遺伝子は，プロテアーゼ，逆転写酵素，それに機能不明のｐ１４．６タンパク質の３つのタンパク質をコードしている。この遺伝子のプロテアーゼ部分の自動プロセシングにより，ｐｏｌ領域の３つのタンパク質すべての産生が増加する。さらに，このプロテアーゼはｇａｇ前駆物質のプロセシングにも重要な働きをする。ｐｏｌ遺伝子はｇａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質として発現する。エンベローブ遺伝子は１６０ｋＤの糖タンパク質ｇｐ１６０として発現する。ＦＩＶコア・タンパク質の抗原性は他のレンチウイルスとよく似ている。

世界中でいくつかのウイルス株が分離され，ウイルスの構造を決定するためいくつかの独立した研究が実施されてきた。用いられた分離株は米国のペタルマ株（Ｔａｌｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，５７４３−５７４７；Ｐｈｉｌｉｐｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０，６４，１０，４６０５−４６１３），日本のＴＭ１株とＴＭ２株（Ｍｉｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９，１０８，５９−６８），スイスのＦＩＶＺ１株とＦＩＶＺ２株（Ｍｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，２１，５３−６３）である。

米国のＦＩＶ分離株（ペタルマ株）から得られた３つのプロウイルス・クローン（ＦＩＶ３４ＴＦ１０，ＦＩＶ１４，分離ＰＰＲの各クローン）のヌクレオチド配列が誌上発表され（Ｏｌｍｓｔｅｄ，ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｐｈｉｌｉｐｐｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｔａｌｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９），２つのスイス株と比較されている（Ｍｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９１）。Ｍｏｒｉｋａｗａらは，この比較研究により，ＦＩＶのｅｎｖ遺伝子にはいくつかの不変領域と可変領域が存在することを明らかにした。フランス株（Ｗｏ株とＭｅ株）も分離されている（Ｍｏｒａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｖｅｔ．Ｍｉｃ．，３１，４１−４５）。

このウイルスは，最適には，血液中の単核球の中で複製されて増殖し，Ｔリンパ球，腹水マクロファージ，脳マクロファージ，星状膠細胞に対する指向性がある。他のレトロウイルスで一般的なように，ＦＩＶの遺伝子物質はＲＮＡであり，ウイルスＲＮＡからＤＮＡコピーを産生する過程は宿主中でＦＩＶが複製するために必要不可欠なステップである。このステップには侵入したウイルスが宿主に持ち込んだ逆転写酵素が必要である。ウイルスゲノムのＤＮＡが感染宿主細胞の遺伝物質の中に挿入され，ここでウイルスはプロウイルスの形で住み続ける。このプロウイルスは，細胞が分裂するたびに複製され，新しいウイルス粒子を産生することができる。ＦＩＶに感染した細胞は死ぬまで感染したままである。

感染したネコの唾液には相当量のウイルスが存在することから（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．１９８８，８：１２４６），このウイルスは通常，主に感染したネコが噛んだ傷からの水平感染で伝染すると考えられる。垂直感染の報告もあるが，これはまれである。

ＦＩＶ感染の現在の診断スクリーニング試験では，血清中の抗ＦＩＶ抗体（Ａｂ）を検出している。ウイルス検出キットも入手できるが，普及していない。感染動物中の抗ＦＩＶ抗体の存在を判定する診断試験が多数利用できる。例えば，ＰｅｔＣｈｅｋ（登録商標）ＦＩＶ抗体試験キットおよびＳＮＡＰ（登録商標）ＣｏｍｂｏＦｅＬＶＡｇ／ＦＩＶ抗体試験キット（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｍａｉｎｅ）は，免疫測定法に基づいたＦＩＶ感染の診断試験である。

ＦＩＶ感染が世界中で広がっていることがいくつかの研究により明らかになっていることから，ＦＩＶ感染の検出は益々重要となっている。したがって，感度の高い簡便な検出手法が求められている。

１つの観点においては，本発明は，ＦＩＶ ｇａｇポリペプチドに関する。別の観点においては，本発明は，動物からの生物学的サンプルにおけるＦＩＶ抗体の存在を検出することにより，動物がＦＩＶに感染しているか否かを判定する方法に関する。他の種々の観点においては，本発明はまた，サンプル中のＦＩＶ抗体を検出するための装置およびキットに関する。装置およびキットは，固相上に固定化されたＦＩＶ ｇａｇポリペプチドを含む。キットは，標識とコンジュゲートされた，ＦＩＶ抗体に対する特異的結合パートナーを含む。

詳細な説明
本明細書に記載される発明を詳細に説明する前に，いくつかの用語の定義を記す。本明細書において用いる場合，単数形の"ａ"，"ａｎ"，および"ｔｈｅ"は，文脈が明らかに示しているのでない限り，複数形の関係項も含めるものとする。

本明細書において用いる場合，「ポリペプチド」という用語はペプチド結合でつながっているアミノ酸残基の単鎖もしくは２つ以上の鎖の複合体からなる化合物を指す。ペプチド鎖はどのような長さでも良い。タンパク質はポリペプチドであり，これらは同義語として扱う。本発明の範囲内には，機能上同等のＦＩＶポリペプチドの変異体および断片も含まれる。ポリペプチドはそのポリペプチドに特異的な１つまたは複数の抗体と結合することができる。

ＦＩＶに由来するポリペプチドには，ＦＩＶプロテオームの任意の領域が含まれ，例えば，ｇａｇおよびｅｎｖ領域の一部，およびこれらのミミト−プが含まれる。米国特許５，６４８，２０９，５，５９１，５７２，および６，４５８，５２８（その全体が参照として本明細書に組み入れられている）は，ＦＩＶ ｅｎｖおよびｇａｇタンパク質に由来するＦＩＶポリペプチドを記載する。これらのペプチド，およびｅｎｖおよびｇａｇタンパク質からの同様の他のペプチドは，本発明の方法において使用するのに適している。

配列番号１〜配列番号４は，天然のＦＩＶ ｇａｇ ｐ２４に由来する。
配列番号 1
KMVSIFMEKAREGLGGEEVQLWFTAFSANLTPTDMA
配列番号 2
EILDESLKQMTAEYDRTHPPDGPRPLPYFTAAEIMG
配列番号 3
KAKSPRAVQLRQGAKEDYSSFIDRLFAQIDQEQNTAEVK
配列番号 4
EYDRTHPPDGPRPLPYFTAAEIMGIGLTQEQQAEARFAPAR

配列番号５〜配列番号９は天然のＦＩＶ ｇａｇ ｐ１５に由来する。
配列番号 5
MGNGQGRDWKMAIKRCSNVAVGVGGKSKKFGEGNFR
配列番号 6
EGNFRWAIRMANVSTGREPGDIPETLDQLRLVICDLQER
配列番号 7
ETLDQLRLVICDLQERREKFGSSKEIDMAIVTLKVFAVAGLLNMT
配列番号 8
LLNMTVSTAAAAENMYSQMGLDTRPSMKEAGGKEE
配列番号 9
KEEGPPQAYPIQTVNGVPQYVALDP

「結合特異性」または「特異的結合」とは，第１の分子が第２の分子を実質的に認識することを表し，これらは，例えばポリペプチドとそのポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体あるいは抗体の断片（例えば，Ｆｖ，単鎖Ｆｖ，Ｆａｂ’，またはＦ（ａｂ’）２断片）である。

「特異的結合対」とは，２つの異なる分子の組であり，ここで，一方の分子は，その表面上または空洞内に，他の分子のある領域に特異的に結合し，したがってこれに相補的である領域を有する。「特異的結合パートナー」とは，これらの２つの相補的結合分子の一方を表す。「特異的結合対」は，例えばリガンドとレセプターを表すことができる。別の例においては，特異的結合対は，免疫学的対，例えば抗原と抗体を表してもよい。

「実質的な結合」または「実質的に結合する」とは，特定の測定条件下における測定混合物中の分子間の特異的な結合あるいは認識の程度をいう。最も広い観点においては，実質的な結合は，分子の相対濃度やインキュベーションなどの特定の測定条件下において，第１の分子が第２の分子と結合するかまたは第２の分子を認識する能力の欠如の程度と，第１の分子が第３の分子と結合するかまたは第３の分子を認識する能力の程度との差，すなわち，特異的な結合を識別する意味ある測定を実施するのに十分であるような差に関係している。別の観点においては，分子の相対濃度やインキュベーションなどの特定の測定条件下において，交叉反応という意味において１つの分子が別の分子と結合するかまたは別の分子を認識する能力が実質的に欠如しており，ここで，第１の分子は第２の分子に対して，第３の分子に対して示す反応性の２５％以下，好ましくは１０％以下，さらに好ましくは５％以下の反応性を示す。特異的な結合は広く知られている多くの方法，すなわち免疫組織化学法，酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），放射性免疫測定法（ＲＩＡ），またはウェスタン・ブロット法で試験することができる。

ＦＩＶに感染する動物はネコ類であり，飼いネコ，ライオン，トラ，ジャガー，ヒョウ，ピューマ，オセロットなどネコ目のすべての動物が含まれると理解されている。本明細書において用いる場合，「ネコ」，「動物」の用語はすべてのネコ類を指す。

「生体サンプル」とは唾液，全血，血清，血漿，その他ＦＩＶ抗体を含んでいると考えられるサンプルなどの，被検動物から得られたサンプルを指す。

「標識」とは，別の分子または固体支持体に結合（共有結合でも非共有結合手段によるものでもよく，単独でも封入されていてもよい）し，標識された分子の検出を可能とする特定の特徴について選択される任意の分子である。一般に，標識は，限定されないが，以下の種類から構成される：粒子状金属および金属誘導体，放射性同位体，触媒性または酵素系反応物，発色基質および発色団，蛍光および化学発光分子，および蛍光物質。標識の利用により，電磁気学的照射の検出または直接可視化等の手段により検出することができるシグナルが生成し，任意にこれを測定することができる。

本発明において用いられる標識としては，限定されないが，アルカリホスファターゼ；グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（"Ｇ６ＰＤＨ"）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光物質，例えば，イソルミノール，フルオレセインおよびローダミン化合物等の蛍光物質；リボザイム；および染料などが挙げられる。標識は，直接シグナルを生成し，したがってシグナルを生成するために追加の成分を必要としないものであってもよい。あるは，標識は，シグナルを生成するために追加の成分，例えば，基質または補酵素を必要としてもよい。シグナルを生成するのに有用なそのような標識の適合性および使用は，米国特許．６，４８９，３０９および米国特許．５，１８５，２４３（その全体が参照として本明細書に組み入れられている）に説明されている。例えば，標識は，特異的結合パートナーに非共有結合的にコンジュゲート化させてもよい。あるいは，標識は，特異的結合パートナーに共有結合的にコンジュゲート化させてもよい。米国特許３，８１７，８３７および米国特許３，９９６，３４５（その全体が参照として本明細書に組み入れられている）は，標識を非共有結合でまたは共有結合で特異的結合パートナーにコンジュゲートさせることができる種々の方法の例を詳細に記載する。

固相とは，多孔質または非孔質の水不溶性物質，例えば支持体または表面を意味する。支持体は，疎水性であってもよく，または疎水性とされることができ，例えば，無機粉体，例えばシリカ，硫酸マグネシウムおよびアルミナ；天然の高分子物質，特にセルロース性物質およびセルロースから誘導される物質，例えば，線維含有紙，例えば，フィルター紙，クロマトグラフィー紙等；合成のまたは修飾された天然に生ずる高分子，例えばニトロセルロース，酢酸セルロース，ポリ（塩化ビニル），ポリアクリルアミド，架橋デキストラン，アガロース，ポリアクリレート，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ（４−メチルブテン），ポリスチレン，ポリメタクリレート，ポリ（エチレンテレフタレート），ナイロン，ポリ（ビニルブチレート）（これらはそれ自身として用いてもよく，他の物質と組み合わせて用いてもよい）；Ｂｉｏｇｌａｓｓなどとして入手可能なガラス，セラミクス，金属などが挙げられる。天然のまたは合成の組立物，例えばリポソーム，リン脂質ベシクルおよび細胞も用いることができる。

ｓｂｐのメンバーの支持体または表面への結合は，一般に文献から入手可能なよく知られる手法により行うことができる。例えば，"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，"Ｉｃｈｉｒｏ Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７８）およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）を参照。表面は，多くの形状，例えば，ストリップ，ロッド，ビーズなどの粒子などの任意のものを有することができる。１つの観点においては，本発明のポリペプチドは，ポリペプチドの固相への結合を助けるためにＮ末端システイン残基を含んでいてもよい。

本発明の方法は，多くの方法により最適化することができ，当業者は，この方法において用いるサンプル希釈率，試薬濃度，インキュベート温度および時間を同時に調節して，生物学的サンプル中のＦＩＶに対する抗体を検出することができる。

本発明の１つの観点においては，配列番号１−９のＦＩＶ ｐ１５またはｐ２４ポリペプチドを適当な固体支持体に固定化する。生物学的サンプルをポリペプチドと接触させ，サンプル中に抗ＦＩＶ抗体が存在すればポリペプチドに抗体が結合する。結合は，サンプル抗体に特異的に結合する第２の分子を用いて検出することができる。第２の分子は，本明細書に記載されるように標識してもよく，または標識に結合しうる別の成分を含んでいてもよい。適切な態様においては，検出試薬はＦＩＶタンパク質を含み，これは抗ＦＩＶ抗体（存在する場合には）を捕捉するために用いられるタンパク質と同じであるかまたは類似するものである。本発明の特定の態様においては，検出試薬は抗ネコＩｇＧ抗体である。抗体は標識にコンジュゲート化させる。未結合サンプル抗体および検出試薬を固相から除去した後，標識の存在を検出することができる。

「機能上の同等」または「機能的に同等」とは，ＦＩＶ ｇａｇのポリペプチド配列に関係するか，またはこれに由来するポリペプチドであって，そのアミノ酸配列が１個または複数のアミノ酸の置換，挿入，欠失により修飾されている場合，およびアミノ酸類似物などアミノ酸が化学的に修飾されているが，なお実質的に同等の機能を保持している場合を表す。機能的に同等の変異体は，自然の生物学的多様性として発生することもあり，または化学合成，部位特定の突然変異，無作為突然変異，アミノ酸の酵素的切断および／または結合などの既知の技術を使って作製することもできる。このように，変異体配列を得るためのアミノ酸配列の修飾は，ポリペプチドの機能が影響されない限り起こり得る。

本発明の範囲内における機能的に同等のＦＩＶ変異体は，保存的に置換された配列を含んでいてもよく，すなわち，ＦＩＶポリペプチドの１個または複数のアミノ酸残基がＦＩＶポリペプチドの二次元および／または三次元構造を変えないように別の残基で置き換えられていてもよい。そのような置換には，アミノ酸を，荷電密度，大きさ，構成，親水性／疎水性などの同じような生理化学的特性を持つ残基で置き換えることが含まれる。例としてのみの目的で挙げれば，そのような置換には１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ）を別の脂肪族残基に置き換える，あるいは塩基性残基（ＬｙｓとＡｒｇ），酸性残基（ＧｌｕとＡｓｐ），アミド残基（ＧｌｎとＡｓｎ），ヒドロキシ残基（ＳｅｒとＴｙｒ），芳香族残基（ＰｈｅとＴｙｒ）を互いに置き換えることが含まれる。保存的な変異体は通常，本発明のポリペプチド配列を修飾し，修飾されたポリペプチドの抗原性を，例えば免疫組織化学法，酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），放射性免疫測定法（ＲＩＡ），またはウェスタン・ブロット法によって評価することにより同定できる。表現形質的に表立たないアミノ酸変換体の作製に関する詳細は，ボーウィらの論文（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０，１９９０）に見ることができる。

その他の変異体も本発明の範囲内で企図されており，そのような変異体には，例えば不特定数の残基のアミノ酸配列の追加ならびに１つまたは複数のアミノ酸の配列内への挿入により得られる，アミノおよび／またはカルボキシル末端の融合が含まれる。例えば，追加されるアミノ酸配列は，別のポリペプチドまたはタンパク質の全体または一部に由来するものであってもよく，またはＦＩＶのエンベローブまたはウイルスのタンパク質の対応する位置に提供されているものであってもよい。より長いペプチドは１つまたは複数のポリペプチド配列の複数のコピーを含んでいてもよい。さらに，複数のコピーのポリペプチドをポリリジンの主骨格のようなポリアミノ酸の主骨格と組み合わせて多抗原ペプチド（ＭＡＰ）を形成してもよい。

アミノ酸配列の欠失変異体は，配列から１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている変異体である。挿入変異体は，１つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドのあらかじめ定められた部位に組み込まれている場合に相当するが，無作為挿入法は結果的な産物の適切なスクリーニングを伴うオプションである。いずれの場合も，用いられるこれらのおよびその他のＦＩＶ変異体は実質的にＦＩＶポリペプチドと同じ抗原性を保持している。その他の変異体も企図されており，例えば，このタンパク質の抗原認識領域以外の領域のアミノ酸が置換されているものがある。ＦＩＶの２つ以上のポリペプチド配列を含む融合タンパク質も，その配列が適切な抗原性を提示する限り，本発明の範囲内にある。そのようなポリペプチドは一般的に，ＦＩＶの特徴であるエピトープまたはミミトープの少なくとも１つに対応している。特徴とは，エピトープまたはミミトープが，生体サンプル中のＦＩＶに対する抗体の免疫学的検出を妥当な確かさで可能にすることを意味する。通常，エピトープまたはミミトープ，変異体または融合タンパク質は，免疫学的にＦＩＶ以外のウイルスから明確に区別されること（すなわち，ＦＩＶ以外のウイルスを認識する抗体と交叉反応しないこと）が望ましい。

抗原性を発揮する変異体は，配列番号１−９またはその断片と，例えば１，２，３，５，６，１０，１５または２０個のアミノ酸残基が異なる。この比較にアライメントが必要なときは，配列が最大相同性となるようアライメントする。欠失，挿入，置換，反復，逆位，あるいは不一致は相違と考える。相違は非必須の残基での相違または変化，あるいは保存的な置換であることが好ましい。得られる変異ポリペプチドが，抗原的に配列番号１−９と実質的に類似している限り，ポリペプチドのどの場所でも変位部位が生じうる。機能的に同等の変異体の例には，５０％以上のアミノ酸が相同性を示すものが含まれる。相同性は６０％，７０％，あるいは８０％より大きいことが好ましい。しかし，そのような変異体は全体的に少ない割合の相同性を示すかもしれないが，相同性の領域が保存されている点でなお本発明の範囲内である。

場合によっては，特定のキャリアーとの結合を促進するため，あるいはジスルフィド結合が抗原ループを模倣できるようにして抗原性を高めるために，１個または複数のシステイン残基をポリペプチドの末端に付加することができる。さらに，デリバリーベヒクルへの取り込みを容易にし抗原性および免疫原性を増すために，ペプチドに脂肪酸または疎水性尾部を付加することもできる。

検出試薬として使用するＦＩＶポリペプチドは天然のもの，すなわち自然界から分離されたＦＩＶタンパク質全体または断片であってもよく，または合成されたものであってもよい。天然のタンパク質はアフィニティ・クロマトグラフィなど慣用の方法でＦＩＶウイルス全体から分離することができる。既知の技術で，ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を使用して適切なアフィニティ・カラムを調製することができる。

自然界のＦＩＶタンパク質と免疫学的に交叉反応するポリペプチドを化学的に合成することができる。例えば，アミノ酸を連続的に付加して長くしてゆく既知のメリフィールド固相合成法により，約１００個以下，より一般的には約８０個以下，典型的には約５０個以下のアミノ酸からなるポリペプチドを合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６）。組み換えタンパク質を使用することもできる。これらのタンパク質は，ＦＩＶゲノムの目的部位をコードしている組み換えＤＮＡ分子を持った培養細胞中で発現させることにより製造することができる。ＦＩＶゲノムの部分はそれ自体天然のものでも合成でもよく，天然の遺伝子は分離されたウイルスから慣用の技術により取得することができる。もちろんＦＩＶのゲノムはＲＮＡであり，逆転写酵素を使った慣用の技術により天然のＲＮＡをＤＮＡに転写する必要がある。ポリヌクレオチドも既知の技術で合成することができる。例えば，短い単鎖ＤＮＡ断片はＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓによって記載されているたフォスフォアミダイト法を用いて製造することができる（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２）。二本鎖断片は，相補性の鎖を合成した後それを適当な条件下でともにアニールするか，適当なプライマー配列とＤＮＡポリメラーゼを使って相補性の鎖を加えてゆくことにより作製できる。

目的のＦＩＶタンパク質または断片をコードした天然のまたは合成のＤＮＡ断片は，インビトロで細胞培養に導入でき発現させることができるＤＮＡコンストラクトの中に組み込むことができる。通常，ＤＮＡコンストラクトは酵母や細菌のような単細胞内で複製させるのに適したものである。それらを哺乳動物の培養細胞または他の真核細胞のゲノムに導入しインテグレートさせることも企図される。細菌や酵母に導入するために調製されるＤＮＡコンストラクトには，宿主細胞に認識される複製システム，目的のポリペプチド産物をコードしているＦＩＶ ＤＮＡ断片，ＦＩＶ ＤＮＡの５’末端に結合している転写および翻訳の開始制御配列，および断片の３’末端に結合している終末制御配列が含まれる。転写制御配列は宿主細胞によって認識される異種プロモーターを含む。便利なことに，多数の宿主細胞のための多くの適切な発現ベクターが市販されている。

本発明の検出方法に有用であるためには，ポリペプチドは実質的に純粋な形，すなわち典型的には純度が約５０％ｗ／ｗ以上であって，妨害タンパク質や不純物が実質的に含まれていない形で得る。ＦＩＶポリペプチドは少なくとも８０％ｗ／ｗの純度で分離あるいは合成するのが好ましく，少なくとも９５％ｗ／ｗの純度ならさらに好ましい。慣用のタンパク質精製法を使って少なくとも約９９％ｗ／ｗの純度の均一なポリペプチド組成物を取得することができる。例えば，上述のイムノアフィニティ・カラムを使用して，以下に示す抗体を用いてポリペプチドを精製することができる。

本発明の方法は，限定されないが，マイクロプレートや側方流（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ）装置などを使用して，当業者に知られる免疫測定技術を用いて行なうことができる。１つの実施形態では，ＦＩＶポリペプチドは固形支持体上の特定の位置に固定化される。固形支持体上のポリペプチド抗体複合体の検出は，当業者に知られる任意の方法により行うことができる。例えば，参照のため本明細書にその全体が組み込まれている米国特許５，７２６，０１０には，本発明に有用な側方流装置であるＳＮＡＰ（登録商標）免疫測定装置（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の例が記載されている。市販されているＷＩＴＮＥＳＳ（登録商標）ＦＩＶ診断試験（Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）のようなコロイド粒子に基づく試験も使用可能である。

ＦＩＶポリペプチドなどの１つまたは複数の分析物捕捉試薬を装置あるいは固形支持体上に固定化して，分析物捕捉試薬がサンプル，希釈液および／または洗浄操作により洗い流されないようにする。物理的な吸収（すなわち，化学リンカーを使用せず）または化学的結合（すなわち，化学リンカーを使用して）によって，１つまたは複数の分析物捕捉試薬を表面に結合させることができる。化学的結合は特異的結合物質を表面により強く結合させ，表面結合分子の明確な方向と配座を提供することができる。

別の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の標識された特異的結合試薬を含み，これは，本発明の装置に適用する前に試験サンプルと混合することができる。この場合には，標識した特異的結合試薬を装置中の特異的結合試薬パッドに沈積させ乾燥する必要はない。試験サンプル中に加えるかまたは装置上に予め沈積させた，標識された特異的結合試薬は，例えば，ＦＩＶに対する抗体に特異的に結合する標識されたＦＩＶタンパク質であることができる。

上述の態様のいずれもキットとして提供することができる。１つの特定の例においては，そのようなキットは，特異的結合試薬（例えば，固定化していない標識された特異的結合試薬および固定化された被検物質捕捉試薬）および洗浄試薬，ならびに所望または適当な場合には検出試薬および陽性対照および陰性対照試薬を備えた装置を含む。さらに，安定剤，バッファ等の他の添加物を含めることができる。種々の試薬の相対量は，アッセイの感度を実質的に最適化する溶液中の試薬の濃度を提供するように，様々であることができる。特に，試薬は，通常は凍結乾燥した乾燥粉末として提供することができ，これを溶解すると，サンプルと混合するのに適当な濃度を有する試薬溶液が得られる。

この装置には，結合していない物質（例えば，未反応の液体サンプルや未結合の特異的結合試薬）を反応ゾーン（固相）から除去する液体試薬を含めることができる。液体試薬は洗浄試薬であって，未結合物質を反応ゾーンから除去することのみに作用してもよく，検出試薬を含み，未結合物質の除去と分析物の検出の促進の両方に利用することができるものであってもよい。例えば，酵素とコンジュゲートさせた特異的結合試薬の場合，検出試薬は反応ゾーンで酵素抗体コンジュゲートと反応して検出可能な信号を発生する基質を含む。放射性物質，蛍光物質，または吸光分子とコンジュゲートさせた標識化特異的結合試薬の場合，検出試薬は単に未結合の標識試薬を洗い流すことによって反応ゾーンでの複合体形成の検出を促進する洗浄液としての役目のみを果たす。

装置には２つ以上の液体試薬が存在していてもよく，例えば装置は洗浄試薬として働く液体試薬と，検出試薬として働き分析物の検出を促進する液体試薬とを含むことができる。

液体試薬にはさらに限定された用量の「阻害物質」，すなわち検出可能な最終産物の発生を阻止する物質を含むことが可能である。限定された用量とは，過剰の未結合物質のほとんどまたはすべてが第２の領域から運び出されるまで最終産物の発生を阻止し，その時点で検出可能な最終産物が生成するのに十分な阻害物質の量である。

以下は例示目的のためだけに提供され，上記の広範な項で記述した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。この開示で引用しているすべての参考文献は参照として本明細書に組み入れられている。

血液サンプルは，ＦＩＶネガティブのネコおよび自然にＦＩＶに感染したネコから得た。サンプルは，ウエスタン免疫ブロット確認試験により，ＦＩＶ抗体ネガティブまたはポジティブであることを確認した。必要な場合には，血清および血漿サンプルは試験するまで凍結保存した。

マイクロプレートＥＬＩＳＡ分析は，確認されたＦＩＶおよび感染したネコから採取した血清サンプルについて，固相上の配列番号１−９のＦＩＶポリペプチドのそれぞれおよび市販の抗（ネコＩｇＧ）ペルオキシダーゼコンジュゲート試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｎｇｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）を用いて間接アッセイフォーマットで行った。

ポリペプチドは，市販の装置を用いて，製造元の指針にしたがって合成した。ポリペプチドの保存溶液をＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｍｌで調製した。次にポリペプチドをマイクロプレートのウエルにコーティングした（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４中１０ｕｇ／ｍｌのペプチド，１００ｕｌ／ウエル）。次にプレートを２％Ｔｗｅｅｎ−２０／２．５％ショ糖でブロッキング／オーバーコートし，マイラーバッグ中で乾燥剤を用いて乾燥させた。ＢＳＡコンジュゲート化ペプチドを用いることもできる。

アッセイのためには，ネコ血清サンプル（１００ｕｌ／ウエル，５０％ウシ胎児血清で１／１０００に希釈）をウエルに加え，プレートを室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後，マイクロプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ヤギ抗（ネコＩｇＧ）：ペルオキシダーゼコンジュゲートをウエルに加えた（５０％ウシ胎児血清で１／４０００抗ネコＩｇＧ：ペルオキシダーゼに希釈）。プレートを室温でさらに１５分間インキュベートし，ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回目の洗浄を行った。ペルオキシダーゼの基質を加え（１００ｕｌ／ウエル，テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質），プレートを室温で１０分間，３回目のインキュベーションを行った。塩酸停止溶液（５０ｕｌ／ウエル）をプレートに加えた。サンプル抗体結合は，ペルオキシダーゼ活性（発色産物）を分光光度計（Ａ６５０ｎｍ）で判定することにより測定した。陽性／陰性のカットオフは，陰性サンプルの平均吸光度プラスこれらのサンプルについての標準偏差×３に設定した。また，参照試験として，ＩＤＥＸＸ ＰｅｔＣｈｅｋ（登録商標）抗ＦＩＶ抗体試験キットを使用して，これらのサンプルを測定した。

表１−９は，それぞれ配列番号１から配列番号９のポリペプチドについてのマクロプレートＥＬＩＳＡの結果を示す。これらのポリペプチドのそれぞれを用いて，ＦＩＶ感染ネコにおけるＦＩＶ抗体を検出することができた。

本明細書において本発明の様々な特異的実施形態を説明したが，本発明はそれらの厳密な実施形態に限られるわけではなく，当業者は本発明の範囲や精神から逸脱することなくそれらに様々な変更や改変を与え得ることが理解されるべきである。

Claims (9)

1. 配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，および配列番号９からなる群より選択されるポリペプチド。
2. 生物学的サンプルにおけるＦＩＶ抗体の存在を検出する方法であって，
   動物からの生物学的サンプルを請求項１記載のＦＩＶポリペプチドと接触させ，そして
   サンプル中のＦＩＶ抗体がポリペプチドに実質的に結合するか否かを検出し，このことにより，サンプル中のＦＩＶ抗体の存在を検出する
   ことを含む方法。
3. 動物においてＦＩＶ感染を検出する方法であって，
   （ａ） 動物からの生物学的サンプルを請求項１記載のＦＩＶポリペプチドが結合している固相と接触させ；
   （ｂ） サンプルおよび固相をＦＩＶ抗体の特異的結合パートナーと接触させ，ここで特異的結合パートナーは標識にコンジュゲート化されており；
   （ｃ） 標識を検出し，このことにより動物におけるＦＩＶ感染を検出する，
   ことを含む方法。
4. ＦＩＶ抗体の特異的結合パートナーが抗ネコＩｇＧ抗体である，請求項３記載の方法。
5. 動物においてＦＩＶ感染を検出する方法であって，
   （ａ） 動物からの生物学的サンプルをＦＩＶ抗体の特異的結合パートナーと接触させ，ここで，特異的結合パートナーは標識にコンジュゲート化されており；
   （ｂ） サンプルと，標識にコンジュゲート化されているサンプル抗体の特異的結合パートナーとを，請求項１記載のＦＩＶポリペプチドが結合している固相と接触させ；そして
   （ｃ） 標識を検出し，このことにより動物におけるＦＩＶ感染を検出する
   ことを含む方法。
6. ＦＩＶ抗体の特異的結合パートナーが抗ネコＩｇＧ抗体である，請求項５記載の方法。
7. 請求項１記載のＦＩＶポリペプチドが固定化されている固相を含む，動物においてＦＩＶ感染を検出するための装置。
8. 請求項７記載の装置およびＦＩＶ抗体の特異的結合パートナーを含む，動物においてＦＩＶ感染を検出するためのキットであって，特異的結合パートナーが標識にコンジュゲート化されていることを特徴とするキット。
9. ＦＩＶ抗体の特異的結合パートナーが抗ネコＩｇＧ抗体である，請求項８記載のキット。