PL186706B1 - Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV - Google Patents

Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV

Info

Publication number
PL186706B1
PL186706B1 PL96325376A PL32537696A PL186706B1 PL 186706 B1 PL186706 B1 PL 186706B1 PL 96325376 A PL96325376 A PL 96325376A PL 32537696 A PL32537696 A PL 32537696A PL 186706 B1 PL186706 B1 PL 186706B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fiv
vaccine composition
cell
vaccine
infected
Prior art date
Application number
PL96325376A
Other languages
English (en)
Other versions
PL325376A1 (en
Inventor
Janet K. Yamamoto
Original Assignee
Univ California
Univ Florida
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California, Univ Florida filed Critical Univ California
Publication of PL325376A1 publication Critical patent/PL325376A1/xx
Publication of PL186706B1 publication Critical patent/PL186706B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)

Abstract

1. Kompozycja szczepionki indukujaca odpowiedz odpornosciowa przeciw co najmniej dwóm podtypom FIV u ssaka wrazliwego na zakazenie FIV, zwlaszcza u kota, znamienna tym, ze zawie- ra immunogen FIV w ilosci skutecznej do indukowania tej odpowiedzi odpornosciowej, przy czym ten immunogen FIV stanowi immunogen lub immunogeny pochodzace z co najmniej dwu róznych podtypów FIV lub stanowiace co najmniej dwa rózne podtypy FIV. 2. Kompozycja szczepionki wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze zawiera immunogen lub im- munogeny niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej syntetyczny peptyd FIV, konstrukt zrekombi- nowanego wektora wirusowego FIV, naturalne lub zrekombinowane bialko FIV lub fragment tego bialka FIV, caly lub czesciowy wirus FIV wolny od komórek i komórke zakazona FIV. 33. Zastosowanie kompozycji szczepionki zawierajacej immunogen FIV, który stanowia immu- nogen lub immunogeny pochodzace lub stanowiace co najmniej dwa rózne podtypy FIV, do wy- twarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornosciowej przeciw dwóm lub wiekszej liczbie podtypów FIV u ssaka wrazliwego na zakazenie FIV, zwlaszcza u kota. 34. Zastosowanie wedlug zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierajacej immunogen lub im- munogeny niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej syntetyczny peptyd FIV, konstrukt zrekombi- nowanego wektora wirusowego FIV, naturalne lub zrekombinowane bialko FIV lub fragment tego bialka FIV, caly lub czesciowy wirus FIV wolny od komórek i komórke zakazona FIV. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także nowy sposób oznaczania przeciwciał neutralizujących wirus (VN) w próbce przy wykorzystaniu niezakażonych linii komórkowych według niniejszego wynalazku. W odróżnieniu od PMBC, które giną po ograniczonej liczbie pasaży i nie namnażają się tak łatwo jak komórki FeT-1C lub FeT-J, komórki FeT-1C i FeT-J są ustalonymi liniami komórkowymi i mogą być łatwo przechowywane w formie zamrożonej do późniejszego stosowania. Wyniki uzyskane w pomiarach VN z zastosowaniem komórek FeT-1C są znacznie bardziej powtarzalne niż pomiary VN z zastosowaniem PMBC, ponieważ
186 706
PMBC z różnych kotów SPF mogą wykazywać indywidualne różnice w tempie wzrostu i podatności na zakażenie FIV. Ponadto PMBC do pomiarów VN muszą być uzyskiwane z kotów SPF, które wymagają pomieszczeń i hodowli w warunkach wolnych od mikroorganizmów, aby wyeliminować zakażenia in vivo, które mogą wpływać na test in vitro VN z użyciem PMBC. Tak więc kocia linia komórkowa taka jak FeT-1C, która może być łatwo zakażona przez FIV różnych podtypów, może być korzystnie zamiennikiem PMBC w testach VN.
Stosowane są następujące skróty dla szczepów FIV.
Szczep (podtyp) Skrót
Petaluma (A) FIVPet
Dixon (A) fivDix
UK8 (A) FIVuk.8
Bangston (B) FIV Bang
Aomtomi (B) FIV Aoml
Aomori-2 (b) FIV Aom2
Shizuoka (D) FIVSh
Hodowle komórek. Wszystkie linie komórkowe hodowane w zawiesinie hodowano
w RPMI 1640 zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą (FCS) inaktywowaną termicznie, 10 mM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy), 2 mM L-glutaminę, 50 mg/ml gentamycynę i 5x10'5 M 2-merkaptoetanol. Do komórek zależnych od IL-2 dodawano 100 U/ml zrekombinowanej ludzkiej IL-2 (Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornia). Komórki hodowane w zawiesinie pasażowano w stężeniach 0,5 - 4x106 komórek/ml i dwa razy tygodniowo przenoszono do świeżych pożywek. Wszystkie komórki hodowane w formie warstw pojedynczych pasażowano dwa razy tygodniowo przy wyjściowym stężeniu 2 x 106 komórek/ml. Płyny z hodowli tkankowych (TCF) z komórek zakażonych FIV zbierano dwa razy tygodniowo, odwirowywano przy 3000 obrotach/minutę przez 1 godzinę w celu usunięcia resztkowych komórek i przechowywano w -20°C albo w -70°C w przypadku tych TCF, które miały być od razu użyte. Komórki podatne na FIV (1 x 106 komórek/ml) zakażano FIV o aktywności odwrotnej transkryptazy (RT) około 30000 cpm/ml.
Oczyszczanie FIV. Płyny hodowlane z linii komórkowych zakażonych FIV indywidualnie wirowano przy 2000 do 3000 obrotów/minutę przez 1 godzinę w celu usunięcia komórek. Wirus w TCF osadzano przez ultrawirowanie przy 16000 obrotach/minutę przez 2 godziny 1 oczyszczano przez ultrawirowanie najpierw na nieciągłym gradiencie sacharozy 10/50% (wagowo/objętościowych) a następnie na ciągłym gradiencie sacharozy 10)/50% (Pederson iwsp., 1987; Yamamoto i wsp., 1988). Każdy z izolatów wirusa inaktywowano za pomocą 1,:25% sterylnego paraformaldehydu (sączonego przez sterylne filtry 0,22 pm) przez 18 godzin, a następnie wyczerpująco dializowano wobec sterylnego PBS. Inaktywowane wirusy rozcieńczano do stężenia 500 pj^ml sterylymn BBS, 250 p/00, 5 ml ażżdego ze szczeóów umieszczano w sterylnej probówce Eppendorfa i przechowywano w -70°C. Inaktywowane szczepy FIV rozmrażano w temperaturze pokojowej i 250 pg inaktywowanego wirusa w 0,5 ml jałowego PBS łączono z 0,5 ml adiuwanta tuż przed szczepieniem. Linie komórkowe zakażone FIV oddzielnie inaktywowano za pomocą 1,25% sterylnego paraformaldehydu przez 18 godzin, płukano 3 razy jałowym PBS, zawieszano w świeżym jałowym PBS w stężeniu około 5,0 x 107 komórek/ml w jałowych probówkach i przechowywano w 4°C. Typowo około 2,5 x 107 inaktywowanych zarażonych komórek w 0,5 ml jałowego PBS łączono z 0,5 ml adiuwanta tuż przed szczepieniem. Jako adiuwant używano 250 pg/0,5 ml dipeptydu treonylomuramylowego (adiuwant MDP MF75.2; Chiron Corporation, Emeryville, CA).
Oznaczenie CTL. Obwodowe jednojądrowe komórki krwi (PMBC) stymulowano Konkanawaliną A (Con A) przez 3 dni przed zakażaniem FIV przez 10 dni (Song i wsp., 1992). Komórki te były komórkami docelowymi do oznaczeń CTL. Aktywność CTL generowano przez hodowania wspólnie PMBC stymulowanych Con A z autologicznymi PMBC zakażonymi FIV i inaktywowanymi UV i promieniowaniem przez 5 dni. Komórki te służyły jako zaktywowane komórki efektorowe. W dniu pomiaru komórki docelowe znakowano 50 mCi Na^CrOą przez 1 do 3 godzin, płukano 3 razy, a następnie dodawano określoną liczbę zna12
186 706 kowanych komórek docelowych do płytek mikrotytracyjnych (5 x 104 komórek/studzienkę). Dodawano komórki efektorowe w trzech powtórzeniach przy różnych stosunkach komórek efektorowych do docelowych (np. 100:1, 50:1 i 10:1). Płytki odwirowywano przez 1 minutę przy 400 obrotach/minutę i inkubowano w 37°C przez 4 godziny. Kontrolne komórki docelowe znakowane 5'Cr lizowano detergentem by uzyskać maksymalne wartości dla uwolnienia. Zbierano supematanty ze studzienek i oznaczano ilościowo promieniowanie za pomocą licznika y. Uwalnianie spontaniczne mierzono przez inkubację znakowanych 5*Cr komórek docelowych w nieobecności komórek efektorowych. Procent specyficznej cytotoksyczności wyliczano jako:
% cytotoksyczności _ (100) (średnia liczba cpm. uwalniana w teście - średnia liczba cpm. uwaln. spontanicznie) (średnia liczba cpm. uwaln. maksymalnie - średnia liczba cpm. uwaln. spontanicznie)
Oznaczenia immunosorpcyjne związane z immunoblotem i enzymami (ELISA). Wirus oczyszczony w gradiencie sacharozy stosowano jako suBstrat w oznaczeniu typu immunoblot według opisu Yamamoto i wsp. 1993. FIVpct z płynu hodowlanego komórek zakażonych klarowano za pomocą wirowania z małą szybkością (2000 obrotów/minutę przez 45 minut), zatężano za pomocą ultrawirowania (16000 obrotów/minutę przez 2 godziny) i oczyszczano przez ultrawirowanie przez ciągły gradient sacharozy 10/50% (wagowo/objętościowych). Oczyszczony w ten sposób wirus użyto jako substrat do oznaczenia typu immunoblot.
Stosowano zmodyfikowaną uprzednio opisaną technikę immunoblot (Yamamoto i wsp., 199la). Przygotowano paski biotu wirusa przez solubilizację wirusa w 0,1% SDS, a następnie wykonano elektroforezę na 10% żelu SDS-poliakrylamidowym i przeniesienie elektrofotyczne na Błonę nitrocelulozową. Próbki surowicy z szczepionych kotów rozcieńczano 1:50 w buforze 3 (0,15 M chlorek sodu, 0,001 M kwas edytowy, 0,05 M TRIS wolna zasada, 0,05% Tween 20, i 0,1% albumina z surowicy krwi bydlęcej) i inkubowano z paskami biotu wirusa w oddzielnych studzienkach płytki do immunoblotów przez 18 godzin w 37°C. Paski biotu płukano oddzielnie roztworem do płukania (0,15 M NaCl i 0,05% Tween 20 w dejonizowanej H2O), inkubowano z biotynylowaną IgG przeciwkocią (Vector Laboratories, Burlingame, CA) przez 1 godz. w 37°C i płukano trzy razy roztworem do płukania. Paski następnie inkubowano pojedynczo ze Streptavidin skonjugowaną z peroksydazą z chrzanu (Vector Laboratories) przez 30 minut. Po wyczerpującym płukaniu inkubowano każdy pasek ze świeżym roztworem substratu (0,05% diaminobenzydyna, 400 mg/ml NiCk i 0,01% H2O2 w 0,1 M buforze Tris, pH 7,4) w temperaturze pokojowej. Reakcję przerywano nadmiarem destylowanej H2O po ustaleniu się widzialnych pasm i paski biotu suszono. Następnie określano masę cząsteczkową prążków na immunoblotach przez porównanie ich z odległością migracji standardów masy cząsteczkowej na pasku uprzednio wybarwionym za pomocą czerni amidowej. Do każdej analizy immunoblotu włączano kontrolną dodatnią i ujemną surowicę jako wzorce wewnętrzne dla oceny diagnostycznej.
ELISA specyficzna w stosunku do antygenu wirusowego została opisana uprzednio (Yamamoto i wsp., 1991a; Yamamoto i wsp., 1993). FIVPet oczyszczony na gradiencie sacharozowym oraz peptydy otoczki (SU) i transbłonowe (TM) zarówno konserwowanych (C) jak i zmiennych (V) obszarów FIVPet użyto do pokrycia 96-studzienkowych płytek Immunolon (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) przy 250 ng/studzienkę z Buforem wodorowęglanowym (pH 9,6) przez 12 do 18 godzin w 37°C i użyto jako suBstraty do ELISA. Sekwencja aminokwasowa peptydu SU-V3-2 to Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp Glu Trp Arg Pro Asp Phe (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1); a sekwencja aminokwasowa peptydu TM-C1 to Gin Glu Leu Gly Cys Asn Gin Asn Phe Phe Cys Lys Ile (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2). Peptydy syntetyczne syntetyzowano na syntetyzatorze peptydów Biosearch 9500 (Biosearch, San Rafael, CA) stosując chemię syntezy peptydów FMOC (Magazine i wsp., 1988). Czystość zsyntetyzowanych peptydów określano przez obecność pojedynczego szczytu w wysoko sprawnej chromatografii cieczowej
186 706 z odwróconymi fazami i potwierdzano poprzez analizę sekwencji aminokwasów dokonywanej na próbce szczytu.
Płytki powleczone peptydem płukano raz buforem 3 bezpośrednio przed użyciem. Próbki surowicy rozcieńczano 1:200 buforem 3 i inkubowano w studzienkach pokrytych antygenem FIV przez 1 godz. w 37°C, a następnie płukano 6 razy. Studzienki przepłukano roztworem do płukania, inkubowano z biotynylowaną IgG anty-kocią (Vector Laboratories, Burlingame, CA) przez 1 godz. w 37°C, płukano 6 razy i inkubowano ze Streptavidin koniugowaną z peroksydazą z chrzanu (Vector Laboratories) przez 1 godzinę w 37°C. Studzienki płukano następnie 6 razy roztworem do płukania i inkubowano z roztworem substratu do ELISA (0,005% tetrametylobenzydyny i 0,015% H2O2 w 0,96% roztworze cytrynianu) w temperaturze pokojowej. Reakcję stopowano przez dodanie 0,1 M kwasu fluorowodorowego po ustaleniu widzialnej barwy mieszaniny reakcyjnej w kolejno rozcieńczanych standardach złożonych ze znanych surowic kocich FIV-dodatnich. Mierzono absorpcję światła w czytniku ELISA BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) przy gęstości optycznej 414 nm.
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR). Poziom prowirusowego DNA w komórkach zakażonych śledzono za pomocą różnicowej PCR, która została niedawno opracowana aby rozróżnić wiele szczepów FIV od tego samego lub innych podtypów (Okada i wsp., 1994). Jako sposób zwiększenia czułości PCR, zastosowano zestawy primerów do PCR na zakładkę pokazane w tabeli 1. PCR przeprowadzono w reakcji dwuetapowej, pierwszy z parą zewnętrznych primerów (wspólnych dla wszystkich szczepów FIV) w warunkach, które opisali Okada i wsp., 1994. W drugim etapie PCR Ł'25 produktu pierwszego etapu amplifikowano stosując wewnętrzne primery (specyficzne dla każdego szczepu FIV). Stosując PCR na zakładki można odróżnić od siebie komórki zakażone FIVPet, FIVi;k, FI^ang, FHAoml, FIVAom2 i FIYsh,.
186 706
Tabela 1
Zestawy primerów do różnicowej PCR
Pozycja* 1570-1589 2112-2092 Zestawy wewnęrrznyhh primerów 1659-1678 1984-1964 1646-1666 1984-1964 1654-1674 1979-1959 1654-1674 1979-1959 1654-1674 1979-1959 1663-1681 1979-1960
Sekwencja GAAATT^TT^TTaATAITTCTGG (SeSwóncje o o ident. 3) GAATTG A TTTIGATTACACCC (Sekwcneja o nr ident. 4) TTATAGTTATACCGATTCTTA (Sekweneaa o nr ident. 5) TCTTTATGGiTnrCAGTCACCT (Sekweneaa o nr ident 6) GTTCAAATAGTAGTAGTATAĄ (SeWwcnela o nr idenJ 7) CATTCTAGGC+ΓCAGTCACCT (Sekweneaa o nr ident. 8) GGA.TCTACTTGCAATGGA.T^ (Sekweneaa o nr idenJ 9) (Selweejeja o nr ident. 10) L. .. CGTGAC+GATAiΛTAGTΛAAAC (Selweneaa o nr ident. 11) AGCGAACCAGTTATTT1ACCC (Sekwcneja o nr idenJ 12) TTGTACTGI^TIKT^^CTTGjTTCC (Sekweneaa o nr idenJ 13) AGCGACTCAGTTATΊTCATCC (Sekóecneja o nr ident 14) TAATCAT^ΠA:CTTΆIA'ΓGAC (Sekweneaa o nr ident. 15) TACGCTTCAG+TATTTGAAC (Sekweneaa o nr ident 16)
Primej (orientacja) wspólaa (+) wspó^a (-) PeJ (+) PeJ (-) UK3 (+) UK.3 (-) Bang (+) Bang (-) AoJ (+) AoJ (-) (+ 3 (N 3 < Shi (+) Shi (-)
Szczep nu dotyczy Petaluma 00 1 Bangston Aomuri-1 Aomuri-2 Shizuoka
Podtyp Zestawy zewnętrznych peίmerów - wszystkie B
ctf
N
O a
o o
o.
Ό
B cu
-O
N
O ca ca ε
J3 ca
CU
G
CU af 'ć?
Ί3 ca o
Cu §
-o
-σ £
o o
G
G
N
O
CU *
186 706
Przybliżoną ilość DNA prowirusowego na komórkę określano za pomocą półilościowęj’ PCR, w której wykonuje się różne rozcieńczenia DNA ekstrahowanego ze znanej ilości komórek. Tak np., jeśli stosuje się 105 komórek do ekstrakcji DNA, rozcieńczenie 10'5 preparatu DNA w przybliżeniu odpowiada DNA obecnemu w pojedynczej komórce. PGR przeprowadzono przy tych różnych rozcieńczeniach DNA, a ostateczne rozcieńczenie, które dało pozytywny wynik PCR, uważa się za rozcieńczenie końcowe. Liczba komórek odpowiadających rozcieńczeniu końcowemu wykorzystywana jest do określenia procentu komórek zakażonych wirusem w danym preparacie komórek według następującego wzoru:
% zakażonych komórek = gdzie Z = liczba komórek odpowiadających rozcieńczeniu końcowemu.
Oznaczenie odwrotnej transkryptazy (RT). Obecność polimerazy DNA zależnej od RNA (RT) oznaczano w supematantach hodowli zasadniczo jak opisali Rey i wsp. W oznaczeniu RT do wykrywania FIV stosowano poli (rA) -oligo (dT 12-ig) jako egzogenny primer dla matrycy, cztery różne trifosforany deoksyrybonukleotydów, 20 mM KC1 z Mg+' jako kationem dwuwartościowym i 5 pCi [3H]-znakowanego trifosforanu tymidyny (TTP) na próbkę. 5 mCi [3H]TTP dało średnie całkowite zliczenie 1200000 cpm przy zastosowaniu mieszaniny płynu scyntylacyjnego (1 część ksylenu na 9 części biodegradowalnego scyntylatora do zliczeń Research Products International) w liczniku scyntylacyjnym Beckman LS250 (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). W efekcie wartości RT dla badanych próbek są niższe od 120000 cpm/ml.
Oznaczenie neutralizacji wirusów. Strategia dla opracowania oznaczeń VN specyficznych dla szczepów i podtypów została opisana (Okada i wsp., 1994). Seryjne rozcieńczenia surowic inaktywowanych termicznie inkubowano z 100 CID50 każdego szczepu FIV przez 45 minut w 37°C w płytce z 24 studzienkami przed dodaniem kocich obwodowych krwinek jednojądrowych (PbMC) (4 x 10' komórek/ml) lub podatnych na FIV komórek FeT-lC (2 x 105 komórek/ml). Po 3 dniach hodowli komórki płucze się raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa aby usunąć resztki wirusa z hodowli, a następnie komórki zawiesza się w świeżej pożywce (RPMI-1640 zawierająca 10% płodową surowicę cielęcą inaktywowaną termicznie, 10 mM bufor HEPES, 50 mg/ml gentamycynę, 5 x 10'5 M 2-merkaptoetanol i 100 jednostek/ml zrekombinowanej ludzkiej IL-2). Infekcję komórek przez wirusy śledzono przez oznaczenia RT zależnej od Mg++ w płynach hodowlanych zebranych w 9, 12, 15 i 18 dniu hodowli. Surowice uznawano za dodatnie dla przeciwciał VN, gdy aktywność RT wynosiła < 25% zakażonych hodowli kontrolnych złożonych z surowicy SPF.
Następujące przykłady ilustrują procedury, w tym najlepszy sposób realizacji wynalazku. Nie należy uważać ich za ograniczające. Wszystkie podane procenty są wagowe i wszystkie mieszaniny rozpuszczalników objętościowe, chyba że podano inaczej.
Przykład 1. Linie komórkowe zakażone FIV
Nową linię komórkową kocich komórek T zależnych od interleukiny 2 (IL-2) określaną jako FeT-lC, która jest linią macierzystą klonu FeT-1M zależnego od IL-2, użyto do ustalenia indywidualnych linii komórkowych przewlekle zakażonych FIV8et, FIVdix, FIVuk, FIVaang, FI^Aom? lub FIVshi Klon FeT-1M (także określany jako FIV-FetlM) został ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 275 813, który jest tu włączony poprzez odniesienie i był wykorzystany do wyprodukowania linii komórkowej niezależnej od IL-2, FL-4 (także opisanej w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 275 813), która chronicznie wytwarza FIVpet. Linia komórkowa FeT-lC jest wysoce zakażalna różnymi izolatami z podtypów FIV A, B i D. Długotrwałe pasażowanie linii komórkowej FeT-lC zmniejsza jej zdolność do bycia zakażaną, szczególnie przez podtyp FIV D; z tego względu numer pasażu powinien być niższy niż około 35 pasaży dla optymalnej częstości zakażenia FIV lub stosowania ich do oznaczeń VN. Półilościowa PCR i analizy antygenów rdzenia wirusa wykazały, że wszystkie linie komórkowe eksponowane na FIV były znacząco zakażone poszczególnymi szczepami FIV.
Kocia lima niezależna IL-2 podatna na zakażenie FIV została także rozwinięta z komórek FeT-lC. Ta linia komórkowa określana jako FeT-J może być zakażona przez FIV
186 706 przez wspólną hodowlę stosując pożywki lub komórki zakażone FIV. Tak np. linię komórkową FeT-1C zakażoną FIVB;mg koinkubowano w nieobecności IL-2 z niezakażonymi komórkami FeT-J, aby ustalić niezależną od IL-2 linię komórkową FeT-J zakażoną FIVB;,ng (określana jako Bang/FeT-J). W metodzie zakażania za pomocą wspólnej hodowli komórki Bang/FeT-1C połączono z niezakażonymi komórkami FeT-J w stosunku od około 2:1 do około 10:1 (zakażone:niezakażone). Mieszaninę komórek hodowano w pożywkach w nieobecności IL-2 przez kilka dni i pozwolono na wymarcie komórek FeT-1C. Pozostałe komórki były więc komórkami FeT-J zakażonymi FIVgang· Tak więc komórki FeT-1C zakażone FIV mogą być wykorzystane do zakażania komórek FeT-J i ustalania niezależnych od IL-2 linii komórkowych FeT-J zakażonych różnymi podtypami FIV. Metoda wspólnej hodowli z komórkami FeT-1C zakażonymi FIV dała linie komórkowe FeT-J niezależne od IL-2 wytwarzające umiarkowane do wysokich ilości różnych podtypów FIV.
Linię komórkową FeT-1C również zakażono FTVsh i wielokrotnie pasażowano, aby wytworzyć niezależną od IL-2 linię komórkową określoną jako Shi/FeT-1C. Linia komórkowa Shi/FeT-lC była następnie wspólnie hodowana z FeT-J w nieobecności IL-2, tak że powstała niezależna od IL-2 linia komórkowa zakażona FIVsh, która została określona jako Shi/FeT-J. Niezależna od IL-2 linia komórkowa Shi/FeT-J produkuje wyższe poziomy FIVshi niż zależna od IL-2 linia komórkowa Shi/FeT-1C (fig. 1).
Linię komórkową FeT-J zakażoną FrVgang uzyskano także bez użycia linii komórkowej FeT-1C. Linię komórkową FeT-J zakażono bezpośrednio inokulum FIVBang wolnym od komórek i pasażowano wielokrotnie bez IL-2. Powstała w wyniku tej procedury niezależna od IL-2 linia komórkowa produkująca FIVgang określona została jako Bang/FeT-J. Linia komórkowa Bang/FeT-J produkowała wyższe poziomy FrVsang niż zależna od IL-2 linia komórkowa Bang/FeT-lC, którą uzyskano przez zakażenie linii komórkowej FeT-1C przez FIVgang (fig· 1).
Przykład 2. Szczepionka przeciw wielu podtypom FTV
Komórki zakażone FIV usunięto z supematantów przez wirowanie, poddano inaktywacji i użyto jako szczepionki. Zarówno zakażone komórki jak i wirus inaktywowano przez traktowanie 1,25% paraformaldehydem przez 24 godziny w 5°C, a następnie odpowiednio wyczerpująco płukano lub dializowano wobec PBS. Metoda ta skutecznie inaktywuje FIV bez powodowania utraty immunogenności. Immunogeny FIV wytworzone takim sposobem są wysoce skuteczne w indukowaniu ochronnej odporności (Yamamoto i wsp., 1993; Yamamoto iwsp., 1991a, Yamamoto i wsp., 1991b). Rozważane jest także stosowanie atenuowanych izolatów wirusa w kompozycjach szczepionek według wynalazku.
Choć linia komórkowa FeT-1C zakażona FICVstn została superinfekowana szczepem FIVpet aby uzyskać pojedynczą linię komórkową zakażoną wieloma podtypami FIV (np. linia komórkowa wielopodtypowa A/D FeT-1C), w ciągu dwóch miesięcy koinfekcji poziom prowirusów FIVsh spadł z około 50% do poniżej 5% podczas gdy jednocześnie poziomy prowirusów FIVset wzrosły do około 50%. Tak więc utrzymanie pojedynczej linii komórkowej zakażonej wieloma podtypami FIV do stosowania jako szczepionka przeciw FIV nie jest preferowanym rozwiązaniem niniejszego wynalazku.
W konsekwencji w jednej postaci niniejszego wynalazku kompozycje szczepionek rozwinięto z dwóch indywidualnych linii komórkowych, każda linia była zakażona innym podtypem FIV. W konkretnej postaci kompozycja szczepionki przeciw dwóm podtypom FIV stanowiła kombinację linii komórkowej zakażonej podtypem A FIV (Pet/FL-4) i linii komórkowej zakażonej podtypem D (Shi/FeT-1C). Linie komórkowe zakażone podtypem A i podtypem D inaktywowano zgodnie z opisem, łączono równe liczby komórek (po 2,5 x 107 komórek, każde w 250 pg MDP) i użyto do immunizacji kotów. Trzy koty SPF zaszczepiono inaktywowanymi komórkami Pet/FL-4, a cztery inne koty zaszczepiono inaktywowanymi komórkami Shi/FeT-1C (2,5x107 komórek/dawkę). Po serii czterech szczepień szczepionka przeciw dwóm podtypom (Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C) indukowała przeciwciała przeciw FIV, w tym znaczące miano przeciwciał VN na oba badane szczepy FIV (fig. 2 i tabela 2, próba I). Cztery koty zaszczepione przeciw dwóm podtypom (Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C) poddano próbie z FIVBang (50 CID50). Wszystkim trzem kotom szczepionym Pet/FL-4 i dwóm z kotów szczepionych
186 706 podano 50 CID50 FrVeang· Dwa pozostałe koty szczepione Shi/FeT-1C otrzymały 50 CID50 FIVSh1 '
Wszystkie koty szczepione przeciw dwóm podtypom były negatywne pod względem FrVgang, co stwierdzono przez izolację wirusa i PCR PMBC w 6 tygodni po zakażeniu (pi), podczas gdy wszystkie koty immunizowane pozornie były dodatnie pod względem FIVBang lub FIVsh, co stwierdzono przez izolację wirusów i PCR w 6 tygodni po zakażeniu (tabela 2, próba I). Natomiast jeden kot z każdej z obu grup zaszczepionych Pet/FL-4 i Shi/Fel-1C, którym podawano FIVBang, był dodatni dla FIVBang· Jak oczekiwano, wszystkie koty szczepione FIVsh1 i następnie testowane przez podanie FIVshi, były negatywne na Fl\S;1i w sześć tygodni po zakażeniu. Tak więc konkretnie podana jako przykład szczepionka przeciw dwu podtypom FIV zapobiegała lub opóźniała zakażenie przy podaniu homologicznego wirusa FrVshi jak i przy podaniu heterologicznego wirusa FIVBang.
Koty zaszczepione przeciw dwu podtypom (komórkami Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C) wyprodukowały przeciwciała przeciw FIV specyficzne dla białka wirusowego rdzenia p25 (zwanego też FIV p28) po drugim szczepieniu (fig. 2). Wyższe miano przeciwciał na inne antygeny wirusowe wykazano po trzecim - czwartym szczepieniu. Przeciwciała VN na FIVpet u tych kotów powstały po drugim szczepieniu podczas gdy przeciwciała VN na FIVsh powstały po czwartym szczepieniu (tabela 4). Odpowiedzi CTL na FIVpe> i FIVsh wykryto już przy trzecim szczepieniu we wszystkich przebadanych kotach (tabela 3), a silniejsze odpowiedzi CTL na oba szczepy rozwinęły się po czwartym szczpieniu. Co więcej, u dwóch z trzech badanych kotów rozwinęły się odpowiedzi CTL na FIVBa„g po czwartym szczepieniu. Wyniki wskazują, że po czterech szczepieniach szczepionka przeciw dwóm podtypom powoduje powstanie silnych odpowiedzi CTL na FIVpet i FIVsh (tabela 3) i wysokie miano przeciwciał FIV, w tym miano przeciwciał VN, na oba szczepy FIV (tabela 4).
U kotów zaszczepionych inaktywowanymi komórkami Shi/FeT-1C powstawały przeciwciała na FIV specyficzne w stosunku do wirusowego białka rdzenia p25 po drugim szczepieniu oraz przeciwciała na inne antygeny wirusowe po trzecim szczepieniu (fig. 2). Przeciwciała VN na FIVsh1 u tych kotów powstały po czwartym szczepieniu, natomiast nie wykryto przeciwciał VN przeciw V w czasie szczepień. Obydwa koty szczepione Shi/FeT-1C wytworzyły odpowiedzi CTL na FIVsh dopiero po czwartym szczepieniu, ale nie powstały u nich odpowiedzi CTL na V nawet po czwartym szczepieniu (tabela 3).
U kotów szczepionych inaktywowanymi komórkami Pet/FL-4 powstały przeciwciała na p25 po drugim szczepieniu (fig. 2) a przeciw innym antygenom wirusowym, w tym przeciwciała VN przeciw FłYpet, po drugim lub trzecim szczepieniu (tabela 4). Jedyne wykryte reakcje CTL u kotów szczepionych komórkami Pet/FL-4 były przeciw FIVpet. Ogólnie, szczepionka przeciw dwóm podtypom FIV indukowała szybciej i wyższe miana przeciwciał VN i odpowiedzi CTL na oba szczepy FIV niż szczepionka przeciw pojedynczemu podtypowi. U kotów pozornie immunizowanych nie powstały przeciwciała przeciwwirusowe, przeciwciała VN i odpowiedzi CTL anty-FIV.
186 706 >
Ε ε
ο §
Ο ο
οΗ σ3
1)
X) £0
Η <υ ο
ο
Ν
Ο.
<υ
Ν
Ν
-υ
Ν ι—
CX £
Ο ca
C
Ο υ
Ο
Ochrona(%) OO 3/5 (60% 6 tyg pz) 0/3 (0% 6 tyg pz) 0/2 (0% 6 tyg. pz) 0/2 (0% 6 tyga pz) 0/3 (()% 6 tyg a pz) 0/2 (0% 6 tyga pz) 2/3 (67% 24 tyga pz)
Izolacja wirusa i PCR Γ- 3/5 ujemne wszyttkta dodatnie wszyttkia dodatnie wszytke dodatnie wszyftkiia dodatnie wszytna dodatnie < Z
Średnia liczba przeciwciał VN w dnu 0 po infekcji ί Ό <10 <10 <10 <10 <10 <10 1000
£ 00 MD 550 <10 MD O r*D O o ν' V 370
Pet 1000 0001 <10 <10 <10 <10 0001
Szczep FFV użyty do testu (C(DS)) fD O >o Q U o MD 50 s □0 > E O «Λ Q O o MD Ίί > E o S 2 u S o U <=> m £ > > E E ν') Ζ—ν A Q- u A o U o MD 50 > > E E 2 E> > E
1 Liczba kotów ΓΊ MD cd ΓΝ CN r*D CN CD
Typ szczepionki - Próba I z podwójną szczepionką (A+D) komórka Pet/FL + komóraa Shi/Feł -1C komórka Pet/FL komórka Shi/FeT - 1C komórka Sht/FeT - 1C Pozornie Pozornie Próba 11 z potrójną szczepóonka (A+B+D)4 kom Pet/LL -4+kom Bang/FeT -J + koma Sht/FeT -1C5
186 706
ΓΗ <L>
Χ>
Λ
Ό
Ο
οο ΓΗ Γ% ΓΗ ΓΗ ΓΗ
δ δ Ο S
< < < < < < <
ζ ζ ζ ζ ζ ζ z
ο ο ο ο ο ο o
ο
V V V V V
ο ο ο ο ο ο o
ι/Ί
V V V V V V V
ο ο ο ο ο ο o
rj·
V V V V V V V
=14 Sli
4 4 4 4 !a !s
D 03 D CO CO
m > > > > > > >
U. U- Uh Uh Uh u. Uh
ΓΗ ΓΗ ΓΗ ΓΗ ΓΗ - - ΓΗ
*-ρ
Η
(V , .
Uh G G
<υ G Λ 03
$ £
ο ·“» 3 ·—> 3
·—> Η I Η •Ν Λ 44 Η 1) -5 03 Η u 5 «3
, <υ ω Ν 1) Uh 8 u. O
U- 1) 44 44
ΟΧ) c ΟΧ) C3 ε G ο >> δ >>
1) Ν W •N <U
C0 ca ε Λ 44 Ε Λ 44 ε
Ε Ε ο Ν ieza Ο Ν CO N 0> o N
ο Ο Ο Ο O
44 44 Ο- G Cu C O-
«υ
G
Λ £
Ο
G ο
ο
ΟΝ
Ο
u.
ϋ
4—> (Λ >> Ν
Η α>
U43 <Ζ) ε
Λ ι_ *Ο ε
θ <Ζ>
£ k2 ο
Ν
U α,
G
03
£
O £
5%
44
Λ
E ε Ν
4>
Βϊ ίΛ .2
•N 'S
3 G 3
T3 Ν
<u d ·—> I
CU Η
•N 3 4>
U- >a
—“1 43
OZ CO
£
O G
.s co 44 u-
o Ό
o. ε
o o
d 44
£ i
4d
Λ
G ε ° c ε ε 8
Ο- Ο
Ν £ Ν £ ΐ
G α>
ε ν 8 οd « ο ο ο- a of <U Λ Ν ι-χ Ο
186 706 ο
S<υ
Ν ο
Ν 'Λ
C
Ό
Ο
Ωrn >» c
03 2
— S-
<υ <υ
Ν
_ο Ο
C3 Ν 7)
Η
ο hJ
Η
Ο
Ν
Ό
Ź α
ο.
“Ο
Ο
Uwolnienie chromu (% lizy) 4 szczepienie Stosunek efektorcel 100 1 C*3 C Os O U- i> o O tzs O O 00 1X3 CM O O Os O O O O O
50:1 •Χ3 CM o - — O Os o Os o o o o o o <X3 o o cn o o o o o
O r- o r- o O O o o O o o o o o o NO o o NO o o o o o
3 szczepienie Stosunek efektor cel o CM 20 ND OO o o 2 ND ND ND o ND o o ND o *X3 ND o ND o o ND o
50.1 I os ND — ND O ND ND ND o ND o o ND o r- ND o o ND o o ND o
O o ND O o ND O ND ND ND o ND o o ND o o ND o o ND o o ND o
Docelowy CTL Pet Bang Shi o CU Bang Shi Gż CU Bang cc Pet Bang Shi ϋ fi. Bang Shi Pet Bang Shi Pet Bang Shi o cu Bang J= (Z)
Typ szczepionki Pet + Shi Pet + Shi Pet + Shi js CC Shi CU Pet Pozorna
Kot nr K55 Tj—i N55 M55 007 2H5D 3G1 H7P
186 706
T a b e 1 a 4
Miana neutralizacji wirusa (VNt u kotów szczepionych podwónną szczepionką
Po 4 szczepieniach Shi 001 1000 i 1000 1 ........ o o o 100 o o V) < 10 < 10 01 > > 10 > 10 > 10 <10 < 10
OC c ¢5 CQ O V o V o V o V O V O V o V O V o V o V o V o A o A o A o V o V
<5 CU 0001 1000 o o o o o o o V o V o V o V 1000 oooi : _1 1000 O A O A O A o V o V
Po 2 szczepieniach X GO < 10 < 10 o V o V o V o V o V o V o V o V o V O A O A O A o V < 10
Of) c CQ CQ < 10 o V O V o V o Λ o Λ > 10 o A o V o V o V O A O A O A o V o V
£ Cu o o o o o o o Λ O Λ o A o A o V o o o O A O A O A o V o V
Przed szczepieniem -C GO o Λ o A o Λ o Λ O Λ O Λ O A O A o A o A o A O A O A O A o V o V
oc C Λ CQ o Λ o Λ o Λ o Λ O Λ O Λ > 10 O A O A > 10 01 < > 10 O A o A o V o V
υ CU o Λ O Λ O Λ o Λ O Λ o A o A O A O A o A o A o A O A O A o V o V
Szczepionka FIV Pet + Shi Pet + Shi - . -i -S CO + o Pet + Shi J= go -S cc .£ GO .5 co o CU ϋ CU CU Pozorne 1 Pozorne Pozorne Pozorne Pozorne
Kot •/Ί TT U 1/Ί Z rn r- o •/Ί s KO O o Γ- o o o o o 5 CU O m Q ir, X Cl Cl U oc OO O oc CU t~- X 00 o oc </0 LU Cd
186 706
W preferowanej postaci kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje szczepionką przeciwko trzem podtypom FIV przygotowaną z trzech linii komórkowych, z których każda była zakażona szczepem wirusa z innego podtypu FIV (A lub B lub D). Trzy koty wolne od specyficznych patogenów immunizowano szczepionką przeciw trzem podtypom (FIVpet + FIVBang + FIVshi). Inne koty immunizowano szczepionkami przeciwko pojedynczemu podtypowi FIVaang aby ocenić immunogenność makrofagotropiczego FIVaang jako składnika szczepionki. Miana przeciwciał VN wskazują, że zarówno szczepionka przeciw trzem podtypom (FIVpet + FIVBang + FIVshi) jak i szczepionka przeciw jednemu podtypowi FIVBang, wywoływały wysokie miana przeciwciał przeciwwirusowych już po drugiej immunizacji (tabela 2, próba II i tabela 5). Tak więc zarówno limfotropowy jak i makrofagotropowy FIV może być stosowany jako składnik kompozycji szczepionek według niniejszego wynalazku.
Trzy koty SPF immunizowane kombinacją inaktywowanych komórek Pet/FL-4, inaktywowanych komórek Bang/FeT-J i inaktywowanych komórek Shi/FeT-1C (2,5 x 107 każdych komórek włącznie 250 Lig MDP) wyprodukowały przeciwciała na FIV specyficzne w stosunku do wirusowego białka rdzenia p25 i na inne antygeny wirusowe, w tym FIV SU i białko otoczki TM, po drugim szczepieniu (fig. 3, 4, 5). Przeciwciała VN na FIVpet, FIVBailg i FIVshi powstały u większości kotów już po drugiej immunizacji, a u wszystkich kotów po trzeciej immunizacji (tabela 5). Na dodatek jeden kot zawierał przeciwciała reagujące krzyżowo z FIViu8 po trzeciej immunizacji. 4 koty SPF szczepione tylko inaktywowanymi komórkami Bang/FeT-J wyprodukowały przeciwciała FIV specyficzne w stosunku do wirusowego białka rdzenia p25 i na inne antygeny wirusowe po drugim szczepieniu (fig. 3). Przeciwciała VN na FIVaang u tych kotów powstały po drugiej immunizacji (tabela 5), podczas gdy przeciwciała VN na FIVpet i FIVuk8 nie były wykrywalne w czasie immunizacji. Odpowiedzi CTL kotów immunizowanych trzykrotnie szczepionką przeciwko trzem podtypom FIV (komórki Pet/FL-4, Bang/FeT-J i Shi/FeT-1C) na docelowe komórki podtypów FIV A, B i D są pokazane w tabeli 6. Stwierdzono odpowiedzi CTL na wszystkie podtypy FIV. Tak więc szczepionka przeciw trzem podtypom indukowała szeroką odpowiedź CTL oraz szybsze i wyższe miana przeciwciał VN i SU-otoczka niż szczepionka przeciw pojedynczemu typowi. Ani niezainfekowane FeT-J ani pozornie immunizowane koty SPF nie wyprodukowały przeciwciał przeciw wirusom, ani przeciwciał VN.
186 706
Tabela 5 a
X ‘S a
&
c o
'8N
00
.3 Έ
2 Lc
'2 co
V N O N 75 00
co c cO
O Cu co
u
CU
UK8 <10 o 7 o 7
□ s o o
4> 43 o
Q- CO V
(U N CJ N 75 OO o o o
o o o
ri o o o
O CU β I 000 o o o
Cl, V
OO o o o
7
V V
E 2 c o o O
.2 '5- 43 i—l ·—1
CO V V V
(U N O N 73 00 o o o
c
1) cO V V V
N u CU 00 o o o
4> CU V V V
>
CO
4* c
Ł o
N
O
N
CO
2 -2 2
co CO co
+ + +
i s1
2 CD 2 CD CD
i + i
<υ o <υ
CU CU cu
sΆ «τ'
-η Q H
s1 i s1
CD 2 DD 2 DD
UJ
DD
2$ SU1 < 8 S o
o o
H <D UD c o · cO
N ΓΝ
2
Z Z
Tf uo
O o
CO CO <υ
E o
N
O
CU o
o o
o
1)
E £
\o r~ O O co co <υ
N
O cO s
o
C
N
T3
Ό
O
O
O
E
CO c
cO
E
E
S
-o
CO
C
CO
186 706
Tabela 6.
Odpowiedzi CTL kotów szczepionych potrójną szczepionką po trzeciej immunizacji
Kot Docelowy FIV Stosunek efektor/cel Aktywność CTL (% uwolnionego chromu)
QY1 FIVPe 100 44%
50 21%
10 4%
QY1 FIVBa,g 100 13%
50 6%
10 1%
QY1 fivuk8 100 23%
50 8%
10 2%
Tas FIVBaig 100 8%
50 3%
10 1%
Tas FIVShl 100 3%
50 1%
10 0,3%
J55 FIVUK8 100 10%
50 2%
10 1%
Przykład 3. Przei^ii^cciida VN na podtypy FIV
Opracowano także sposób oznaczenia przeciwciał na FIV stosując komórki FeT-lC według wynalazku. W surowicy z kotów zakażonych FIVPet i kotów SPF szczepionych inaktywowanymi komórkami Pet/FL-4 lub inaktywowanym wirusem FIVpet oznaczano miano przeciwciał VN stosując albo komórki FeT-lC albo PMBC, zgodnie z opisaną metodą oznaczenia VN. Surowice dwóch kotów SPF, które nie były szczepione i nie były zakażone FIV, zastosowano jako surowice kontrolne. Surowice z kotów szczepionych i zakażonych FIV miały wysokie miano przeciwciał VN, 1000 lub wyższe, podczas gdy surowice z nieszczepionych kotów SPF nie miały wykrywalnego miana przeciwciał VN. Oznaczenie VN oparte na FeT-lC daje miana przeciwciał VN podobne do uzyskiwanych z zastosowaniem pierwotnych PMBC z kotów (tabela 6). Wynik ten wykazuje, że miana przeciwciał VN w oznaczeniu Vn z zastosowaniem komórek FeT-lC korelują z wynikami otrzymanymi przy oznaczeniu VN z zastosowaniem PBMC. Tak więc komórki FeT-lC mogą być dogodnie zastosowane zamiast PMBC w standardowym oznaczeniu VN dla FIV ponieważ komórki FeT-lC mogą być zakażone wszystkimi podtypami FIV i mogą być łatwo namnażane w hodowli tkankowej.
Tabela 7.
Miana VN mierzone w FeT-1C i PBMC
Miano VN
Źródło surowicy FeT-lC PMBC
Szczepione 1 5000 5000
Szczepione1 >1000 >1000
Zakażone2 1000 1000
Zakażone2 >1000 >1000
Immunizowane niezakażonymi komórkami <10 <10
Immunizowane niezakażonymi komórkami <10 <10
1 Surowice od kotów szczepionych zinaktywowanymi komórkami Pet/FL-4 ~ Surowice od kotów zakażonych FIVPe, ’ Surowice od kotów lmmunizowanych zinaktywowanymi mezakażonymi komórkami FeT-J
186 706
Przykład 4. Immunotypowanie szczepów FIV
Przeprowadzono badania in vitro z zastosowaniem komórek FeT-lC aby ocenić czy podtyp FIV był odbiciem immunotypu FIV. Immunotypowanie jest ważne dla zrozumienia roli przeciwciał VN w ochronie nadawanej przez szczepionki. Surowice odpornościowe z kotów zakażonych szczepami podtypu A FIV (FIVPet, FIVD:„ FH^k) podtypu B (FIVBang, FIVAomi) i podtypu D (FIVsh) testowano pod względem zdolności do neutralizacji tych szczepów in vitro stosując komórki FeT-lC w oznaczeniu VN (fig. 6). Wszystkie testowe surowice odpornościowe miały aktywność neutralizującą w stosunku do odpowiedniego homologicznego szczepu FIV. FIVPe szczep podtypu A, był w znaczący sposób krzyżowo neutralizowany przez surowice odpornościowe z kotów zakażonych FIVdix. FIVpe różni się od FIVdix o około 9% w obszarach glikoproteiny powierzchniowej (Env). Surowice odpornościowe z kotów zakażonych szczepami z podtypu A krzyżowo neutralizowały FIVaang z podtypu, B ale nie neutralizowały podtypu D FIVshi. Surowice odpornościowe kotów zakażonych szczepami podtypów B i D krzyżowo zobojętniały tylko inne szczepy FIV w obrębie homologicznego podtypu. Dodatkowo surowice odpornościowe z kotów zakażonych FIVuk8 neutralizowały FIVaang ale nie neutralizowały szczepów FIV w obrębie podtypu A. Choć FIVuks jest klasyfikowany jako podtyp A (Sodora i wsp., 1994; Rigby i wsp., 1993; Kakinuma i wsp., 1995), wyniki te sugerują, że surowice odpornościowe przeciw FIVuk8 rozpoznają szczepy podtypu B a nie rozpoznają szczepów podtypu A, i może to tłumaczyć dlaczego inaktywowane szczepionki FIV'iPe były nieskuteczne w stosunku do FIVUKk i FIVShi (Johnson i wsp., 1994). Tak więc istnieje luźna korelacja między genotypem i immunotypem. Choć analizy genotypu pozwalają na klasyfikację szczepów FIV, badania krzyżowej neutralizacji przez przeciwciała są odbiciem immunogenności szczepów FIV, co jest ważnym parametrem w szerokozakresowej ochronie humoralnej wywoływanej przez szczepionkę.
Przykład 5. Tropizm komórek w stosunku do FIV.
Tropizm komórkowy szczepów FIV uzyskanych z zakażonych linii komórkowych FeTlC i FeT-J porównano z tropizmem szczepów FIV uzyskanych z pierwotnych PMBC (tabela 8). Dwa izolaty FIV, FIYuks 8 FIVaang są w równym stopniu limfotropowe i makrofagotropowe, podczas gdy FIYsh. jest wysoce limfotropowy. FIVpet był bardziej limfotropowy niż makrofagotropowy, a jego tropizm w stosunku do komórek nie zależał w sposób znaczący od źródła komórkowego. Tropizm w stosunku do makrofagów FIYaang nie zależał od komórek, z których pochodził wirus. Ponieważ tropizm komórkowy szczepów FIV z zakażonych linii komórkowej FeT-lC jest porównywalny do produkowanych z pierwotnych PMBC, wirus hodowany w komórkach FeT-lC może być wykorzystany jako inokulum do oznaczeń VN, a także jako inokulum in vivo do badań w celu oceny terapeutycznych i profilaktycznych podejść.
Tabela 8.
Tropizm komórkowy izolatów FIV
FIV źródło FIV TCID50
(podtyp) FeT-1C PBMC Makrofag pęcherzyka Pierwotne mikrogleje
1 2 3 4 5 6
Petaluma (A) PBM 104 104 102 ND
Petaluma (A) FeT-1Cb 104 104 101 ND
Petaluma (A) FL-44 104 104 1<)1 ND
Dixon (A) FeT-1C 104 103 101 ND
UK8 (A) PBMC 102 10’ 10’ ND
UK8 (A) FeT-1C 10’ 103 10’ ND
186 706 cd. tabeli 8
I 2 3 4 5 6
Bangston (B) PBMC 103 103 103 102
Bangston (B) FeT-1Cb 103 103 103 1θ2
Bangston (B) FeT-jb 103 103 103 102
Shizuoka (D) PBMC 102 103 <1 ND
Shizuoka (D) FeT-1Cb 103 103 <1 ND
Shizuoka (D) FeT-jb 103 103 ND ND
a Wszystkie inokula wirusów doprowadzano do 120000 cpm/ml aktywności RT przed miareczkowaniem 5 x 105 WomóreW/ml kocich komórek T (FeT-1C) lub pierwotnych komórek kocich a wyniki przedstawiają najwyższe miano wirusa zebranego przez 21 dni hodowli.
b Te same komórki jAW szczepionki z zakażonych komórek
Należy zdawać sobie sprawę, że podane przykłady i rozwiązania mają na celu jedynie zilustrowanie wynalazku, oraz że różne modyfikacje i zmiany nasuną się specjalistom i mają być objęte istotą i zakresem niniejszego zgłoszenia oraz zakresem dołączonych zastrzeżeń.
Lista seWweeyjl (1) Informacja ogólna: (i) Zgłaszający:
Nazwa Zgłaszającego: Ulica:
Miasto:
Stan/Prowincja:
Kraj:
Kod pocztowy: Telefon:
Nazwa Zgłaszającego: Ulica:
Miasto:
Stan/Prowincja:
Kraj:
Kod pocztowy: Telefon:
University of Florida 223 Grinter Hall Gainesville Florida USA 32611 (352) 392-8929 Fax: (3522 392-6600 Regents of the University of California 2150 Shattuck Avenue, Suite 520 Berkeley
California USA 94704 (510) 748-6600 Fax: (5ł0} 748-6639 (ii) Tytuł zgłoszenia: Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV (iii) Liczba sekwencji: 16 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adres: Saliwanchik & Saliwanchik (B) Ulica: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-1 (C) Miasto: Gainesville (d) Stan: Florida (e) Państwo: USA (f) Kod pocztowy: 32606 (v) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: Dyskietka (b) Komputer: kompatybilny z IBM PC (c) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja #1.30 (vi) Dane o zgłoszeniach (A) Numer zgłoszenia: US (B) Data zgłoszenia:
(C) Klasyfikacja:
186 706 (viii) Informacja o rzeczniku/agencie (A) Nazwisko: Pace, Doran R.
(B) Numer rejestracyjny: 38 261 (ć) Numer sprawy: UF 152 (ix) Informaaca o teleikomumkaaci (A) Telefon (904) 375-8100 (B) Telefaks (904) 372-5800 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (b) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1: Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15
Glu Trp Arg Pro Asp Phe (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) OPISSEKWENCJI: Sekwekcje o numnrze er^e^ntyf^^aifijncm^: Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile 1 5 10 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (ć) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3: GAAATGTATA ATATTGCTGG 20 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 GAATTGATTT TGATTACATS S 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (ć) RODZAJ NICI: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
186 706 (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 TAGTAGTTAT AGTGGTACTA 20 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 6 TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7 GTAC A AATAG TAGTAGTACA A 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8 TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 9 GGGACTACTA GCAATGGAAT A 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 10 AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
186 706 (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11
TGGGACTGAT GATAGTAAAA C 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 12 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (ć) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (ć) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13
TGGGACTGAT AATAGTGAAA C 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 14 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (ć) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14
AGTGCĆTĆAG TTATTTTATC C 21 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (b) TYP: kwas nukleino wy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15
TSATCATTrC CAACATGTC 19 (2) Informacja o sekwencji o numerze identyfikacyjnym 16 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (b) TYP: kwas nukleinowy (ć) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TyP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16
AATGCTTSAG TTATTTGATC 20
Cytowane pozycje literaturowe
Pedersen, Niels C., Janet K. Yamamoto, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 037 753, wydany 6 sierpnia 1991 r. Pedersen, Niels C., Janet K. Yamamoto, opis patentowy opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 118 602, wydany 2 czerwca 1992 r.
Byars, N.E., A.C. Allison (1987) „Adj‘uvaot formulation for use in vaccines to elicit both cell-mediated and humoral immunity”, Vaccine 5: 223-228.
186 706
Pedzrsen, N.C., E.W. Ho, M.L. Brown, J.K. Yamamoto (1987) „Isolation of a T-lymphotropic virus from domestic cats with an immunodeficiency-like syndrome”, Science 235: 790-793.
Yamamoto, J.K., N.C. Pedzrsen, E.W. Ho, T. Okuda, G.H. Theilen (1988a) „Feline immunodeficiency syndrome - a comparison between feline T-lymphotropic lentivirus and feline leukemia virus”, Leukemia, December Supplement 2: 204S-215S.
Yamamoto, J.K., E. Sparger, E.W. Ho, P.H. Andersen, T.P. O'-Connor, C.P. Mandell, L Lowenstine, N.C. Pzdzrszn (1988) „Pathogenesis of zxpzrimzntally induczd feline immunodeficiency virus infection in cats”, Am. J. Vet. Res. 49: 1246-1258.
Ackley, C.D., J.K. Yamamoto, N.B. Levy, N.C. Pedersen, M.D. Cooper (1990) „Immunologie abnormalities in pathogen-free cats zxpzrimzntally infected with feline immunodeficiency virus”, J. Virol. 64: 5652-5655.
Olmsted, R.A., A.K Barnes, J.K. Yamamoto, V.M. Hirsch, R.H. Purcell, P.R. Johnson (1989) „Molecular cloning of feline immunodeficiency virus”, Proc. Nat. Acad Sci. 86: 24482452.
Olmsted, R.A., V.M. Hitsch, R.H. Purcell, P.R. Johnson (1989) „Nucleotide szquznce analysis of feline immunodeficiency virus: Genome organization and relationship to other lentivirus”, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 8088-8092.
Talbott, R.L., E.E. Sparger, K.M. Lgvzlacz, W.M. Fitch, N.C. Pzderszn, P.A. Luciw, J.H. Elder (1989) „Nucleotide sequencz and genomic organization of feline immunodeficiency virus”, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5743-5747.
Hosie, M.J., O. Jarrett (1990) „Serolog^al rzsponses of cats to feline immunodeficienry virus”, AIDS 4: 215-220.
Sodora, D.L., E.G. Shpaer, B.E. Kitchell, S.W. Dow, E.A. Hoover, J.I. Mullins (1994) „Identification of three feline immunodeficiency virus (FIV) env gene subtype and comparison of the FIV and human immunodeficiency virus type 1 evolutionary patterns”, J. Virol. 68: 2230-2238.
Rigby, M.A., E.C. Holmes, M. Pistello, A. Mackay, A.J. Leigh-Brown, J.C. Neil (1993) „Evolution of structural proteins of feline immunodeficiency virus: molecular zpidemiology and evidencz of selection for change”, J. Gen.. Virol. 74: 425-436.
Kakinuma, S., K. Motokawa, T. Hohdatsu, J.K. Yamamoto, H. Koyama, H. Hashimoto (1995) „Nucleotide Szquzncz of Feline Immunodeficiency Virus: Classification of Japanzsz Isolates into Two Subtypes Which Arz Distinct from Non-Japanesz Subtypes”, Journal of Virology 69(6): 3639-3646.
Johnson, C.M., B.A. Torres, H. Koyama, J.K. Yamamoto (1994) „FIV as a model for AIDS vaccination”, AlDS Res. Hum. Retroviruses 10: 225-228.
Yamamoto, J.K., T. Hohdatsu, R.A. Olmsted, R. Pu, H. Louie, H. Zochlinski, V. Aceveżo, H.M. Johnson, G.A. Soulds, M.B. Gardner (1993) „Expzrimzntal vaccinz protzction against homologous and heterologous strains of feline immunodeficiency virus”, J. Virol. 67: 601-605.
Yamamoto, J.K., T. Okuda, C.D. Ackley, H. Louie, H. Zochlinski, E. Pembroke, M.B. Gardner (1991a) „Experimental vaccinz protection against feline immunodeffciency virus”, AIDS Res. Hum. Rertroviruses 7: 911-922.
Yamamoto, J.K., C.D. Acklzy, H. Zochlinski, H. Louie, E. Pembrokz, M. Torten, H. Hanszn, R. Munn, T. Okuda (1991b) „Devzlopment of IL^-independent feline lymphoid cell lines chronically infected with feline immunodeficiency virus: importance for diagnostic reagents and vaccines”, Intervirol. 32: 361-375.
Murphy, F., D.W. Kingsbury (1990) „Virus TaKonom/’, w Fields Virology, 2 wydanie, B.N. Fields, D.M. Knipe i inni, redakcja, Raven Press, New York, rozdz. 2, str. 9-36.
Louwagie, J., F.E. McCutchan, M. Pzeters, T. P. Brennan, E. Sanders-Buzll, G.A Eddy,
G. van den Grosen, K. Fransen, G.M. Gerehy-Damet, R. Delzys, D.S. Burke (1993) „P^logenetic analysis of gag genes from 70 International HIV-1 isolates provides zyidencz for multiple genotypes”, AIDS 7: 769-780.
186 706
Rey, M.A., B. Spire, D. Dormont, F. Barre-Suinoussi, L. Montagnier, J.C. Chermann (1984) „Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of anew human T-lymphotropic reuovirus 1 (lymphadenopathy associated virus)”, Biochem. Biophys Res. Commun. 21: 1247-1253.
Magazine, H.I., J.M. Carter, J.K. Russell, B.A. Torres, B.M. Dunn, H.M. Johnson (1988) „Use of synthetic peptides to identify and end terminal epitope on mouse gama ifii that may be involved in function”, Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 1237.
Okada, S., R. Pu, E. Young, W. Stoffs, J.K. Yamamoto (1994) „Superinfection of cats with FIV Subtypes A and B”, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 1739-l746.
Yamamoto, Janet K., Niels C. Pedersen, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 275 813, wydany 4 stycznia 1994 r. Merrifield, R. B. (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156.
186 706
* Przed podaniem wirusa
186 706
SZCZEPIENIE trzecie
186 706
SZCZEPIENIE
186 706
ty-podtyp
186 706
Fig. 1
O
O o
o (Itu/uido) iy ONV1W
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (75)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja szczepionki indukująca odpowiedź odpornościową przeciw co najmniej dwóm podtypom FIV u ssaka wrażliwego na zakażenie FIV, zwłaszcza u kota, znamienna tym, że zawiera immunogen FIV w ilości skutecznej do indukowania tej odpowiedzi odpornościowej, przy czym ten immunogen FIV stanowi immunogen lub immunogeny pochodzące z co najmniej dwu różnych podtypów FIV lub stanowiące co najmniej dwa różne podtypy FIV.
  2. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera immunogen lub immunogeny niezależnie wybrane z grupy obejmującej syntetyczny peptyd FIV, konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV, naturalne lub zrekombinowane białko FIV lub fragment tego białka FIV, cały lub częściowy wirus FIV wolny od komórek i komórkę zakażoną FIV.
  3. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, zawiera wirus FIV lub komórkę zakażoną FlV potraktowane w sposób inaktywujący wirusa FIV lub komórkę zakażoną przez wirus FIV, przed podaniem szczepionki zwierzęciu.
  4. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera wirus FIV lub komórkę zakażoną FIV potraktowane w sposób atenuujący wirusa FIV lub komórkę zakażoną przez wirus FIV, przed podaniem szczepionki zwierzęciu.
  5. 5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej dwa różne podtypy FIV wybrane z grupy obejmującej podtypy A, B, C i D.
  6. 6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej dwa różne podtypy FIV stanowiące podtypy A i D.
  7. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FeT-1C o numerze dostępu ATCC CRL 11968 zakażonej FIV.
  8. 8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FeT-J o numerze dostępu ATCC CRL 11967 zakażonej FIV.
  9. 9. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FL-4 o numerze dostępu ATCC CRL 10772 zakażonej FIV.
  10. 10. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FeT-1M o numerze dostępu ATCC CRL 10775 zakażonej FIV.
  11. 11. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę zakażoną FIVsh, pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako Shi/FeT-1C o numerze dostępu ATCC CRL 11976.
  12. 12. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę zakażoną FIVBang, pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako Bang/FeT-J o numerze dostępu ATCC CRL 11975.
  13. 13. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC ĆRl 11968.
  14. 14. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu aTćC CRl 11967.
  15. 15. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu aTćC CRl 10772.
    186 706
  16. 16. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRL 10775.
  17. 17. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę zakażoną FIVsh1, pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRL 11976.
  18. 18. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórkę zakażoną FIVsang, pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRL 11975.
  19. 19. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że jako białko FIV zawiera glikoproteinę otoczkową FIV lub jej immunogenny fragment.
  20. 20. Kompozycja szczepionki według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera glikoproteinę otoczkową FIV zawierającą sekwencję aminokwasową, SEQ ID NO. 1.
  21. 21. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że jako białko FIV zawiera białko chimeryczne zawierające sekwencje aminokwasowe białka z co najmniej dwóch różnych podtypów FIV.
  22. 22. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto zawiera adiuwant.
  23. 23. Kompozycja szczepionki według zastrz. 22, znamienna tym, że zawiera adiuwant wybrany z grupy obejmującej dipeptyd treonylomuramylowy, ałun, pełny adiuwant Freunda i niepełny adiuwant Freunda.
  24. 24. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi kompozycję do podawania pozajelitowo, doustnie lub donosowo.
  25. 25. Kompozycja szczepionki według zastrz. 24, znamienna tym, że stanowi kompozycję do podawania pozajelitowego drogą iniekcji podskórnej, śródotrzewnowej lub domięśniowej.
  26. 26. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórki zakażone FIV w ilości około 106 - 108 komórek.
  27. 27. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera komórki zakażone FIV w ilości około 5 x 106- 7,5 x 107 komórek.
  28. 28. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera cały lub częściowy wirus FIV wolny od komórek w ilości około 0,1-5 mg.
  29. 29. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera cały lub częściowy wirus FIV wolny od komórek w ilości około 0,2 - 2 mg.
  30. 30. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera immunogen FIV zawierający (a) komórki zakażone pierwszym podtypem FIV i (b) wolny od komórek, cały lub częściowy FIV drugiego podtypu, przy czym pierwszy i drugi podtyp FIV są wybrane z grupy obejmującej A, B, C i D, a pierwszy i drugi podtyp FIV są różne.
  31. 31. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że jako konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV zawiera FIV env, FIV gag/pro lub FIV envgag/pro.
  32. 32. Kompozycja szczepionki zdefiniowana w zastrz. 1 do stosowania jako lek.
  33. 33. Zastosowanie kompozycji szczepionki zawierającej immunogen FIV, który stanowią immunogen lub immunogeny pochodzące lub stanowiące co najmniej dwa różne podtypy FIV, do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw dwóm lub większej liczbie podtypów FIV u ssaka wrażliwego na zakażenie FIV, zwłaszcza u kota.
  34. 34. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierającej immunogen lub immunogeny niezależnie wybrane z grupy obejmującej syntetyczny peptyd FIV, konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV, naturalne lub zrekombinowane białko FIV lub fragment tego białka FIV, cały lub częściowy wirus FIV wolny od komórek i komórkę zakażoną FIV.
  35. 35. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej wirus FIV lub komórkę zakażoną FIV potraktowane w sposób inaktywujący wirus FIV lub komórkę zakażoną przez wirus FIV, przed podaniem szczepionki zwierzęciu.
    186 706
  36. 36. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej wirus FIV lub komórkę zakażoną FIV potraktowane w sposób atenuujący wirusa FIV lub komórkę zakażoną przez wirus FIV, przed podaniem szczepionki zwierzęciu.
  37. 37. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierającej co najmniej dwa różne podtypy wybrane z grupy obejmującej podtypy A, B, C i D.
  38. 38. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierającej co najmniej dwa różne podtypy FIV stanowiące podtypy A i D.
  39. 39. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FeT-1C o numerze dostępu ATCC CRL 11968 zakażonej FIV.
  40. 40. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FeT-J o numerze dostępu ATCC CRL 11967 zakażonej FIV.
  41. 41. Sposób według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FL-4 o numerze dostępu ATCC CRL 10772 zakażonej FIV.
  42. 42. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako FeT-1M o numerze dostępu ATCC CRL 10775 zakażonej FIV.
  43. 43. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę zakażoną FIVsh, pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako Shi/FeT-1C o numerze dostępu ATCC CRL 11976.
  44. 44. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę zakażoną FIVsang, pochodzącą z linii komórkowej oznaczonej jako BangFeT-J o numerze dostępu ATCC CRL 11975.
  45. 45. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRl 11968.
  46. 46. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRl 11967.
  47. 47. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC cRl 10772.
  48. 48. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRl 10775.
  49. 49. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę zakażoną FIVsh, pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRL 11976.
  50. 50. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórkę zakażoną FIVgang, pochodzącą z linii komórkowej wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRL 11975.
  51. 51. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej jako białko FIV glikoproteinę otoczkową FIV lub jej immunogenny fragment.
  52. 52. Zastosowanie według zastrz. 51, kompozycji szczepionki zawierającej glikoproteinę otoczkową FIV zawierającą sekwencję aminokwasową, SEQ ID NO. 1.
  53. 53. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierającej jako białko FIV białko chimeryczne zawierające sekwencje aminokwasowe białka z co najmniej dwóch różnych podtypów FIV.
  54. 54. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki ponadto zawierającej adiuwant.
    186 706
  55. 55. Zastosowanie według zastrz. 54, kompozycji szczepionki zawierającej adiuwant wybrany z grupy obejmującej dipeptyd treonylomuramylowy, ałun, pełny adiuwant Freunda i niepełny adiuwant Freunda.
  56. 56. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki do podawania pozajelitowo, doustnie lub donosowo.
  57. 57. Zastosowanie według zastrz. 56, kompozycji szczepionki do podawania pozajelitowego drogą iniekcji podskórnej, śródotrzewnowa lub domięśniowa.
  58. 58. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej komórki zakażone FIV w ilości około 106 - 108 komórek.
  59. 59. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji zawierającej komórki zakażone FIV w ilości około 5 x 106 - 7,5 χ 107 komórek.
  60. 60. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej cały lub częściowy wirus FIV wolny od komórek w ilości około 0,1-5 mg.
  61. 61. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej cały lub częściowy wirus FIV wolny od komórek w ilości około 0,2 mg - 2 mg.
  62. 62. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierającej immunogen FIV zawierający (a) komórki zakażone pierwszym podtypem FIV i (b) wolny od komórek, cały lub częściowy FIV drugiego podtypu, przy czym pierwszy i drugi podtyp FIV są wybrane z grupy obejmującej A, B, C i D, a pierwszy i drugi podtyp FIV są różne.
  63. 63. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV zawierający FIV env, FIV gag/pro lub FIV envgag/pro.
  64. 64. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera wirus FIV inaktywowany przez wystawienie na działanie paraformaldehydu, formaliny, fenolu, promieniowania nadfioletowego lub podwyższonej temperatury.
  65. 65. Kompozycja szczepionki według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera wirus FIV atenuowany przez wystawienie na działanie paraformaldehydu, formaliny, fenolu, promieniowania nadfioletowego lub podwyższonej temperatury.
  66. 66. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera immunogen FIV lub immunogeny FIV wybrane z grupy obejmującej FIVDlx, FIYuks, FIVBang, FIVAomi, FIVAom2, FIVpet i FlVsfo.
  67. 67. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą białko FIV lub jego fragment.
  68. 68. Kompozycja szczepionki według zastrz. 67, znamienna tym, że zawiera konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV zawierający sekwencję FIVeev, FWgag/pro lub
    FIV env-gag/pro
  69. 69. Kompozycja szczepionki według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera wektor wirusowy pochodzący od adenowirusa, wirusa ospy ptasiej, kociego wirusa opryszczki, wirusa krowianki, wirusa ospy kanarków, wirusa ospy owadów lub wirusa ospy świń.
  70. 70. Zastosowanie według zastrz. 35, kompozycji szczepionki zawierającej wirus FIV inaktywowany przez wystawienie na działanie paraformaldehydu, formaliny, fenolu, promieniowania nadfioletowego lub podwyższonej temperatury.
  71. 71. Zastosowanie według zastrz. 36, kompozycji szczepionki zawierającej wirus FIV atenuowany przez wystawienie na działanie paraformaldehydu, formaliny, fenolu, promieniowania nadfioletowego lub podwyższonej temperatury.
  72. 72. Zastosowanie według zastrz. 33, kompozycji szczepionki zawierającej immunogen FIV lub immunogeny FIV wybrane z grupy obejmującej FIVDlx, IWuki, FIVangg, FIVo0in 1, FIVoom2, FIVpet i FlYsh
  73. 73. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą białko FIV lub jego fragment.
    186 706
  74. 74. Zastosowanie według zastrz. 73, kompozycji szczepionki zawierającej konstrukt zrekombinowanego wektora wirusowego FIV zawierający sekwencję FIVe„v, FIVgagpro lub
    FIV env-gag/pro ·
  75. 75. Zastosowanie według zastrz. 34, kompozycji szczepionki zawierającej wektor wirusowy pochodzący od adenowirusa, wirusa ospy ptasiej, kociego wirusa opryszczki, wirusa krowianki, wirusa ospy kanarków, wirusa ospy owadów lub wirusa ospy świń.
    Koty domowe są podatne na kilka retrowirusów, takich jak wirus białaczki kotów (FeLV,) wirus mięsaka kotów (FeSV), endogenny onkoronawirus typu C (RD-114) i wirus tworzący syncytia kotów (FeSFV). Najbardziej znaczącym patogenem pośród tych wirusów jest FeLV, powodujący różnorakie objawy m.in. nowotwory siateczkowo-chłonne i szpiku, anemie, choroby układu odpornościowego i zespół niedoboru odporności podobny do ludzkiego nabytego niedoboru odporności (AIDS). Niedawno skojarzono pewnego mutanta defektywnego pod względem replikacji, FeLV-AlDs z właściwościami immunosupresyjnymi.
    Odkrycie kociego T-limfotropowego lentiwirusa (obecnie określanego jako wirus niedoboru odporności kotów, FIV) po raz pierwszy opisali Pedersen i wsp. (1987). Charakterystykę FIV podali Yamamoto i wsp. (1988a, 1988b) i Ackley i wsp. (1990). Dane seroepidemiologiczne wykazały, że zakażenie przez FIV jest powszechne u kotów domowych i dzikich na całym świecie. Z zakażeniem FIV kojarzy się szeroki zakres objawów, m.in. poronienia, anemię, zapalenie spojówek, przewlekły nieżyt nosa, zapalenie jelit, zapalenie dziąseł, świeżą krew w kale, anomalie neurologiczne, zapalenie ozębnej i łojotokowe zapalenie skóry. Immunologiczną oznaką kotów domowych zakażonych FIV jest przewlekły i postępujący niedobór kocich komórek obwodowych krwi CD4+, obniżenie stosunku komórek CD4:CD8, i w pewnych przypadkach wzrost ilości limfocytów CD8. W oparciu o charakterystykę molekularną, biochemiczną i immunopatologiczną, uważa się obecnie zakażenia kotów przez FIV za lepszy koci model AIDS niż FeLV-FAIDS.
    Olmsted i wsp. (1989a, 1989b) oraz Talbot i wsp. (1989) opisali klonowanie i analizę sekwencji FIV. Hosie i Jarret (1990) opisali odpowiedź serologiczną kotów zakażonych FIV. Podtypy wirusa FIV można klasyfikować w zależności od immunotypu w oparciu o poziom krzyżowo neutralizujących przeciwciał wywoływanych przez każdy szczep (Murphy i Kingsbury, 1990). Niedawno wirusy zaklasyfikowano do podtypów w zależności od genotypu opartego na homologii sekwencji nukleotydów. Choć subtypowanie HIV i FIV jest oparte na genotypie (Sodora i wsp., 1994; Rigby i wsp., 1993, oraz Louwagie i wsp., 1993), niewiele wiadomo o korelacji pomiędzy genotypem i immunotypem podtypów. Izolaty wirusowe FIV klasyfikuje się obecnie na cztery podtypy FIV: A, B, C i D (Kakinuma i wsp., 1995). Zakaźne izolaty i zakaźne klony molekularne opisano dla wszystkich podtypów FIV z wyjątkiem podtypu C (Sodora i wsp., 1994). Podtyp C FIV stwierdzano tylko w DNA komórkowym kotów z Kanady (Sodora i wsp., 1994; Rigby i wsp., 1993; Kakinuma i wsp., 1995).
    Podstawową trudność w opracowaniu szczepionki przeciw FIV stanowi zidentyfikowanie podejścia do szczepionki, które jest skuteczne przeciwko szerokiemu zakresowi szczepów FIV w tym izolatów z różnych terenowych subizolatów czyli kładów. Profilaktykę za pomocą szczepionki pochodzącej z jednego szczepu uzyskano dla szczepów homologicznych lub nieco heterologicznych, ale nie przy podaniu umiarkowanie lub znacznie heterologicznych szczepów (Johnson i wsp., 1994; Yamamoto i wsp., 1993). Tak więc nadal istnieje potrzeba szczepionki chroniącej przed wieloma podtypami FlV.
    Wynalazek dotyczy szczepionki wywołującej szeroki zakres ochronnej odporności przeciwko zakażeniom przez FIV zwierzęcia-gospodarza. W szczególności wynalazek dotyczy szczepionki FIV przeciw wielu podtypom FIV, którą przygotowuje się stosując izolaty wirusów wolne od komórek różnych podtypów FIV albo kombinacje linii komórkowych, z których każda jest zakażona innym prototypowym wirusem FIV z innego podtypu. U kotów zaszczepionych szczepionkami FIV według wynalazku rozwijają się humoralne i komórkowe
    186 706 odpowiedzi immunologiczne na FIV gdy podaje się im homologiczne lub heterologiczne szczepy FIV.
    Wynalazek dotyczy także nowych kocich linii komórkowych, które są podatne na zakażenie wieloma podtypami FIV. Linie komórkowe według wynalazku są także pożyteczne dla namnażania i produkcji wielu podtypów FIV jak i do stosowania w szczepionkach FIV według sposobów niniejszego wynalazku. Dodatkowo, linie komórkowe mogą być stosowane zamiast kocich obwodowych jednojądrowych komórek krwi (PBMC) w próbach neutralizacji wirusowego FIV przez kocie surowice odpornościowe.
    Figura 1 przedstawia poziomy odwrotnej transkryptazy (RT) FIVBang i FIVsh wyprodukowanej po zakażeniu linii komórkowych FeT-1C i FeT-J tymi szczepami FIV.
    Figura 2 przedstawia immunoreakcję przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych dwoma podtypami z detekcją białek FIV za pomocą „immunoblotu”. Liczba nad każdym biotem odpowiada liczbie szczepień otrzymanych przez zwierzę przy testowaniu surowicy.
    Figura 3 przedstawia immunoreakcję przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych trzema podtypami FIV; białko wykrywane jest za pomocą immunoblotu. Liczba nad każdym biotem odpowiada liczbie szczepień otrzymanych przez zwierzę przy testowaniu surowicy.
    Figura 4 przedstawia immunoreaktywność przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych trzema podtypami, peptyd FIV SU-V3-2 wykrywany jest za pomocą ELISA.
    Figura 5 przedstawia immunoreaktywność przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych trzema podtypami FIV; peptyd FIV TM-C1 wykrywany jest za pomocą ELISA.
    Figura 6 przedstawia krzyżowo zobojętniające miana przeciwciał z surowic kotów zakażonych FIVPe (Ap) , FIVdx (Ad), FIVUK8 (Au), FIVBang (Bb), F^oml (Ba) i FIVsh, (Ds). Surowice z okresu przed infekcją (kolumna 1), 6 miesięcy po zakażeniu (kolumna 2) i 12 miesięcy po zakażeniu (kolumna 3) testowano przeciw podtypowi A FIVpet, podtypowi B FIVBang i podtypowi D FIVsh w linii komórkowej FeT-1C. Badano co najmniej trzy koty na szczep. Wyniki pokazują miano VN z reprezentatywnego kota dla każdego gatunku. Uzyskano podobne wyniki stosując pierwotny PBMC dla testu VN.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1 jest sekwencją aminokwasów powierzchniowego peptydu FIV oznaczonego jako SV-V3-2.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2 jest sekwencją aminokwasów transmembranowego peptydu FIV oznaczonego jako TM-C1.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 6 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8 jest sekweencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 9 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 10 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    186 706
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
    Wynalazek dotyczy nowych sposobów i kompozycji szczepionek użytecznych do indukowania ochronnej odporności na infekcje FIV u podatnego zwierzęcia-gospodarza. Opisane kompozycje szczepionek po podaniu zwierzęciu-gospodarzowi indukują ochronne odpowiedzi odpornościowe komórkowe i humoralne przeciw zakażeniom homologicznymi i heterologicznymi szczepami FIV. Kompozycje szczepionek mogą zawierać albo bezkomórkowe izolaty wirusów FIV albo linie komórkowe zakażone FIV. W korzystnej postaci kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera szczepy FIV z dwóch różnych podtypów fIV. Korzystnie kompozycja szczepionki zawiera trzy szczepy FIV, każdy szczep należący do innego podtypu FIV. Jeszcze korzystniej co najmniej jeden szczep FIV z każdego podtypu FIV A, B i D jest włączony do kompozycji szczepionki.
    W konkretnej postaci kompozycja szczepionki zawiera linie komórkowe zakażone FIVpet i FIVsh1 W innej postaci kompozycja szczepionki zawiera linie komórkowe zakażone FIVpet, FIVBang i FIVsh- Zastosowanie innych szczepów FIV reprezentatywnych dla całości lub części podtypów FIV jest specyficznie uwzględniane przez niniejszy wynalazek. Na przykład FIVDix lub FrVuK8 może być włączony do kompozycji szczepionki oprócz lub zamiast FrVpet aby dostarczyć prototyp wirusa podtypu A. Podobne dodatki lub substytucje z innymi szczepami FIV można by wykonać dla podtypów B i D prototypów wirusów FIV.
    Jak to opisano, kompozycje szczepionek według wynalazku mogą zawierać cały wirus FIV wolny od komórek, lub części wirusa, białka i polipepetydy FIV, a także linie komórkowe zakażone FIV lub kombinację wirusa wolnego od komórek i zakażonych linii komórkowych. Kompozycje szczepionek zawierające linie komórkowe zakażone FIV mogą zawierać wielokrotne linie komórkowe, z których każda jest zakażona przez inny podtyp FIV. Kompozycje szczepionek według wynalazku obejmują także konstrukty FIV oparte na wirusach zrekombinowanych obejmujące np. FIV env, gag/pro lub env-gag/pro. Dowolny odpowiedni wektor wirusowy, który może być zastosowany do przygotowania zrekombinowanych konstruktów wektor/FIV może być brany pod uwagę do zastosowania według wynalazku. Na przykład wektory wirusowe pochodzące od adenowirusów, wirusów ospy ptasiej, kocich wirusów opryszczki, krowianki, ospy kanarków, ospy owadów, ospy świń i innych znanych w dziedzinie mogą być zastosowane z kompozycją i sposobami niniejszego wynalazku. Zrekombinowane wektory polinukleotydowe, które kodują i eksprymuja składniki FIV mogą być skonstruowane z wykorzystaniem standardowych technik inżynierii genetycznej znanych w dziedzinie. Dodatkowo, różne opisane kompozycje szczepionek mogą być stosowane oddzielnie i w kombinacjach. Na przykład do pierwotnego szczepienia zwierzęcia można wykorzystywać konstrukty FIV oparte na zrekombinowanych wektorach, mających składniki pojedynczego lub wielu podtypów, a następnie podawać dawki przypominające z kompozycjami szczepionek zawierającymi inaktywowane linie komórkowe zakażone FIV. Inne protokoły immunizacji z kompozycjami szczepionek według wynalazku są ewidentne dla specjalisty i są uważane za leżące w zakresie niniejszego wynalazku.
    Opisane szczegółowo szczepionki złożone z wielu podtypów FIV przebadano pod kątem ich immunogenności i skuteczności u kotów. Koty wolne od specyficznych patogenów (SPF) szczepione badanymi kompozycjami szczepionek śledzono pod kątem odpowiedzi odpornościowych komórkowych i humoralnych przed i po podaniu homologicznych i heterologicznych szczepów FIV. Odpowiedzi humoralne śledzono przez pomiar aktywności przeciwciał neutralizujących wirusy (VN), a odpowiedzi komórkowe poprzez pomiar aktywności cytotoksycznych limfocytów T (CTL). Surowice i immunocyty z zaszczepionych kotów testowano in vitro odpowiednio pod kątem aktywności VN i CTL, przeciw homologicznym i heterologicznym szczepom FIV i wykazano, że szczepionki mogą wywołać ochronę o szerokim zakresie przed zakażeniem FIV. Według niniejszego wynalazku, kombinowanie izolatów
    186 706 prototypu wirusa z różnych podtypów FIV lub kombinowanie poszczególnych komórek zakażonych prototypami wirusa różnych podtypów, daje możliwość produkcji skutecznej szczepionce przeciwko wielu podtypom FIV.
    Wszystkie szczepy FIV, oprócz konkretnie przedstawionych, są rozważane do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem. W literaturze opisana jest pewna ilość izolatów FIV i są one znane specjalistom w tej dziedzinie. FIVPct ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 037 753. Inne izolaty FIV, które zostały opisane, mogą być łatwo wyizolowane z zakażonych kotów przez osoby o normalnych w tej dziedzinie umiejętnościach z wykorzystaniem standardowych sposobów. Sposoby izolacji i hodowli FIV ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 037 753 i 5 118 602, które tu są włączone jako odnośniki.
    Podane przykładowo nowe linie komórkowe mogą być wykorzystywane w metodach i kompozycjach szczepionek według niniejszego wynalazku. Inne komórki lub linie komórkowe, które są podatne na zakażenie przez szczepy FIV, w tym jednojądrowe komórki krwi obwodowej, również uważa się za nadające się do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
    Naturalne, zrekombinowane lub syntetyczne polipeptydy białek wirusowych FIV oraz ich fragmenty peptydowe, mogą być stosowane jako kompozycje szczepionek zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu łączy się polipeptydy FIV pochodzące od wielu podtypów FIV w kompozycji szczepionki i wykorzystuje do zaszczepienia zwierzęcia-gospodarza. Tak np. polipeptydy oparte na glikoproteinie otoczki FIV z co najmniej dwóch szczepów prototypów FIV z różnych podtypów mogą być łączone w szczepionce. Polipeptydy mogą być homologiczne do jednego ze szczepów lub mogą stanowić polipeptydy „hybrydowe” lub „chimeryczne”, których sekwencja aminokwasów powstała w wyniku połączenia lub sprzęgnięcia polipeptydów z co najmniej dwóch odrębnych podtypów FIV. Procedury preparatyki polipeptydów FIV są dobrze znane. Na przykład polipeptydy FIV można syntetyzować stosując metody syntezy w fazie stałej (Merrifield, 1963). Polipeptydy FIV mogą też być wytworzone z zastosowaniem technik rekombinacji DNA, gdzie cząsteczka polinukleotydu kodującego białko lub peptyd FIV jest eksprymowana w komórce-gospodarzu, takiej jak bakterie, drożdże lub linie komórek ssaków, a eksprymowane białko oczyszcza się stosując standardowe techniki.
    Niniejszy wynalazek także obejmuje nowe linie kocich komórek T podatne na zakażenia FIV. W szczególności jako przykłady podano komórki zarówno zależne, jak i niezależne od in-terleukiny-2 (IL-2). Opisane dwie linie komórkowe określane są jako FeT-1C i FeT-J. Linia komórkowa FeT-1C jest zależna od IL-2, podczas gdy linia komórkowa FeT-J nie jest zależna od IL-2. Linie komórkowe według wynalazku są przydatne do dostarczenia nośnika dla szczepienia kotów przeciw FIV, a także do namnażania i produkcji szczepów wirusa FIV in vitro. Niezakażone komórki, zarówno FeT-1C zależne od IL-2 jak i FeT-J niezależne od IL-2, zbadano ponad 20 razy w aspekcie aktywności odwrotnej transkryptazy (RT) w płynach hodowli oraz prowirusowej sekwencji FIV, za pomocą techniki PGR, stwierdzając, że nie wykazują one obecności FIV. Linia komórkowa FeT-J była wysoce infekowalna przez wszystkie przebadane szczepy FIV, w tym FIVshi, FIVDlx, FrVUK8, FTVPe i FIVBang, ale trudniej było ją bezpośrednio zakazić FIVsh·
    Niniejszym wynalazek dotyczy także produktów komórkowych wytwarzanych przez linie komórkowe według niniejszego wynalazku. Produkty komórkowe mogą być izolowane i wykrywane z wykorzystaniem metod znanych specjaliście. Przeciwciała przeciw liniom komórkowym mogą także być wyprodukowane stosując znane sposoby, przy czym uważa się je za objęte zakresem wynalazki.
    Linie komórkowe niezakażone FIV oznaczone jako FeT-1C (nr dostępu ATCC CRL 11968) oraz jako FeT-J (nr dostępu ATCC CRL 11967) zostały zdeponowane w American Type Culture ćollection, Rockville, Maryland, 24 sierpnia 1995. Linie komórkowe zakażone, FIVBang (nr dostępu ATĆć 11975) i FIVsh (Nr dostępu ATCC 11976) zostały zdeponowane w American Type Culture ćollection 25 sierpnia 1995.
    186 706
    Hodowle zdeponowane w warunkach zapewniających dostęp do hodowli w toku postępowania związanego z rozpatrywaniem zgłoszenia patentowego dla osób uznanych przez Komisarza Patentów i Znaków Towarowych za uprawnione, zgodnie z 37 CFR 1.14 i 35 U.S.C.122. Depozyt będzie dostępny zgodnie z wymaganiami zagranicznych praw patentowych w krajach, w których złożone są odpowiedniki niniejszego zgłoszenia lub zgłoszenia pochodne. Jednak należy zdawać sobie sprawę, że dostępność depozytu nie stanowi licencji do realizowania odnośnego wynalazku z naruszeniem praw patentowych przyznanych przez działania rządowe.
    Dodatkowo depozyt hodowli będzie przechowywany i udostępniany publicznie zgodnie z postanowieniami Traktatu Budapeszteńskiego dotyczącym Depozytu Mikroorganizmów, tak że będzie przechowywany z należną dbałością by pozostał żywotny i nie zanieczyszczony przez okres co najmniej pięciu lat po ostatniej prośbie o udostępnienie próbki depozytu, a w każdym razie przez okres co najmniej trzydziestu (30) lat po dacie zdeponowania lub przez wykonalny okres ważności dowolnego patentu, który może być przyznany ujawniającemu hodowlę. Depozytor uznaje obowiązek zastąpienia depozytu, gdyby depozytariusz nie był w stanie dostarczyć próbki na żądanie ze względu na stan depozytu. Wszelkie ograniczenia publicznej dostępności omawianej hodowli będą nieodwracalnie usunięte po wydaniu patentu, w którym hodowla jest ujawniona.
    Zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku opisane kompozycje szczepionek FIV podaje się podatnym gospodarzom, zazwyczaj kotom domowym, w skutecznej ilości i w sposób aby wywołać ochronną odporność przeciw następnej dawce wirusa lub zakażeniu gospodarza przez FIV. Szczepionki zazwyczaj podaje się pozajelitowo w postaci zastrzyku, np. podskórnie, dootrzewnowo lub domięśniowo. Inne odpowiednie sposoby podawania obejmują podawanie doustnie lub do nosa. Zazwyczaj szczepionki są podawane gospodarzowi co najmniej dwa razy, z przerwą jednego lub dwóch tygodni między kolejnymi podaniami. Jednak można stosować inne procedury podawania wstępnej i przypominającej dawki szczepionki, przy czym mogą one zależeć od osądu osoby podającej szczepienia i od danego zwierzęcia.
    Kompozycje szczepionek według wynalazku mogą być przygotowane z wykorzystaniem dobrze znanych procedur. Tak np. szczepionki typowo przygotowuje się jako preparaty do iniekcji, tzn. jako płynne roztwory lub zawiesiny. Szczepionki są podawane w sposób, który jest zgodny z postacią dawki oraz w ilości, która będzie terapeutycznie skuteczna i immunogenna u biorcy. Optymalne dawki i sposoby podawania dla danej formuły szczepionki mogą być łatwo określone przez specjalistę.
    Wirusy i komórki w szczepionce mogą być inaktywowane lub atenuowane z wykorzystaniem znanych metod. Tak np. cały wirus i zakażone komórki mogą być inaktywowane lub atenuowane przez kontakt z paraformaldehydem, formaliną, fenolem, światłem UV, podwyższoną temperaturą itp. Ilość wolnego od komórek całkowitego wirusa FIV w dawce szczepionki na ogół będzie wynosić od około 0,1 mg do około 5 mg, jeszcze częściej od około 0,2 mg do około 2 mg. Dawka w przypadku preparatów szczepionki obejmujących linie komórkowe zakażone FIV będzie zazwyczaj zawierać od około 10° do około 108 komórek/dawkę, a jeszcze częściej od około 5 x 106 do około 7,5 x 107 komórek/dawkę.
    Wirus lub komórki zazwyczaj łączono z adiuwantem tuż przed podaniem. Jako adiuwanty stosowano w formułach szczepionek zazwyczaj dipeptyd treonylo-muramylowy (MDP) (Byars iwsp., 1987) albo kombinacja kompletnego i niekompletnego adiuwanta Freunda. Różne inne adiuwanty odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku, takie jak ałun, są znane i mogą być użyte w sposobie według wynalazku.
PL96325376A 1995-08-25 1996-08-23 Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV PL186706B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51938695A 1995-08-25 1995-08-25
PCT/US1996/013580 WO1997007817A1 (en) 1995-08-25 1996-08-23 Multi-subtype fiv vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL325376A1 PL325376A1 (en) 1998-07-20
PL186706B1 true PL186706B1 (pl) 2004-02-27

Family

ID=24068097

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL35824896A PL188041B1 (pl) 1995-08-25 1996-08-23 Linia komórkowa T pochodzenia kociego
PL96325376A PL186706B1 (pl) 1995-08-25 1996-08-23 Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL35824896A PL188041B1 (pl) 1995-08-25 1996-08-23 Linia komórkowa T pochodzenia kociego

Country Status (16)

Country Link
US (5) US5846825A (pl)
EP (2) EP1090985B1 (pl)
JP (4) JP4142741B2 (pl)
KR (2) KR100482616B1 (pl)
AT (2) ATE335809T1 (pl)
AU (3) AU728750B2 (pl)
BR (1) BR9610343A (pl)
CA (1) CA2230029C (pl)
DE (3) DE69636440D1 (pl)
DK (2) DK0848615T3 (pl)
ES (2) ES2269042T3 (pl)
IL (3) IL123264A0 (pl)
NZ (3) NZ502144A (pl)
PL (2) PL188041B1 (pl)
PT (2) PT848615E (pl)
WO (1) WO1997007817A1 (pl)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2230029C (en) * 1995-08-25 2012-03-27 University Of Florida Multi-subtype fiv vaccines
US6254872B1 (en) * 1995-08-25 2001-07-03 University Of Florida Multi-subtype FIV vaccines
US6458528B1 (en) * 1998-05-15 2002-10-01 Idexx Laboratories, Inc. Diagnosis of feline immunodeficiency virus infection using ENV/GAG polypeptide markers
WO2002067984A2 (en) 2001-02-22 2002-09-06 University Of Florida Materials and methods for detecting, preventing, and treating hiv and fiv retroviral infection
EP1385540B1 (en) 2001-05-10 2011-08-24 Wyeth LLC Composition and method for increasing cell density in cell cultures infected with lentivirus
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
CA2525641A1 (en) 2003-05-12 2004-11-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against fiv infection
JP2007505320A (ja) * 2003-09-11 2007-03-08 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法と装置
EP1709447B1 (en) 2003-12-18 2009-06-24 Idexx Laboratories, Inc. Method for detecting feline immunodeficiency virus
AU2005215629B2 (en) 2004-02-19 2009-01-29 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
AU2005267605B2 (en) * 2004-06-30 2009-03-26 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
JP4866848B2 (ja) 2004-06-30 2012-02-01 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）のｅｎｖタンパク質のｖ３領域に由来するペプチドの使用を含むｆｉｖを検出するための方法および装置
EP1761555A1 (en) * 2004-06-30 2007-03-14 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7291338B2 (en) 2005-03-09 2007-11-06 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
JP5409361B2 (ja) 2007-07-25 2014-02-05 北里第一三共ワクチン株式会社 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原
US8809004B2 (en) 2010-04-02 2014-08-19 Idexx Laboratories, Inc. Detection of feline immunodeficiency virus
US8596026B2 (en) * 2010-08-05 2013-12-03 Kraft Foods Group Brands Llc Vacuum flow wrap packaging system and method of packaging

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5118602A (en) 1987-08-26 1992-06-02 The Regents Of The University Of California Feline T-lymphotropic lentivirus assay
CA1341439C (en) * 1987-08-26 2003-09-23 Niels C. Pedersen Feline t-lymphotropic lentivirus
US6107077A (en) 1987-08-26 2000-08-22 Yamamoto; Janet K. Feline lymphoid cell lines capable of producing FIV for FIV diagnostics and vaccines
WO1992000098A1 (en) * 1990-06-29 1992-01-09 Daniel Zagury Methods of inducing immune response to aids virus
AU2299892A (en) * 1991-07-05 1993-02-11 Regents Of The University Of California, The Feline lymphoid cell lines capable of producing fiv
GB9219936D0 (en) * 1992-09-21 1992-11-04 Pitman Moore Inc Vaccines
WO1994020622A1 (en) * 1993-03-11 1994-09-15 Akzo Nobel N.V. Polypeptide fragment capable of inducing neutralising antibodies against feline immuno-deficiency virus
IT1276509B1 (it) * 1995-03-31 1997-10-31 Istituto Superiore Della Sanit Vaccino per la profilassiimmunitaria dell'infezione da virus della immunodeficienza felina del gatto domestico.
US6254872B1 (en) 1995-08-25 2001-07-03 University Of Florida Multi-subtype FIV vaccines
CA2230029C (en) 1995-08-25 2012-03-27 University Of Florida Multi-subtype fiv vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
EP1090985B1 (en) 2006-08-09
JP2007284442A (ja) 2007-11-01
IL123264A0 (en) 1998-09-24
IL163873A0 (en) 2005-12-18
KR19990044093A (ko) 1999-06-25
ES2242967T3 (es) 2005-11-16
NZ316347A (en) 2000-02-28
PL188041B1 (pl) 2004-11-30
US20040067242A1 (en) 2004-04-08
DE69636440T2 (de) 2006-12-21
NZ502144A (en) 2001-09-28
AU2004203358A1 (en) 2004-08-19
JP2013079286A (ja) 2013-05-02
JP5339687B2 (ja) 2013-11-13
US20020172941A1 (en) 2002-11-21
AU772353B2 (en) 2004-04-22
DE69636440T4 (de) 2007-09-27
US5846825A (en) 1998-12-08
ES2269042T3 (es) 2007-04-01
KR100482616B1 (ko) 2005-09-02
US20080145381A1 (en) 2008-06-19
KR20040047812A (ko) 2004-06-05
ATE335809T1 (de) 2006-09-15
EP1090985A1 (en) 2001-04-11
BR9610343A (pt) 1999-12-21
DE69634820D1 (de) 2005-07-14
KR100502568B1 (ko) 2005-07-20
IL123264A (en) 2006-09-05
JP4413132B2 (ja) 2010-02-10
ATE297218T1 (de) 2005-06-15
EP0848615B1 (en) 2005-06-08
DK1090985T3 (da) 2006-12-04
DK0848615T3 (da) 2005-10-03
JPH11513031A (ja) 1999-11-09
US7311921B2 (en) 2007-12-25
CA2230029A1 (en) 1997-03-06
PT1090985E (pt) 2006-12-29
PL325376A1 (en) 1998-07-20
AU728750B2 (en) 2001-01-18
WO1997007817A1 (en) 1997-03-06
JP2005261426A (ja) 2005-09-29
US6447993B1 (en) 2002-09-10
NZ513388A (en) 2006-02-24
JP4142741B2 (ja) 2008-09-03
CA2230029C (en) 2012-03-27
PT848615E (pt) 2005-10-31
AU1972501A (en) 2001-05-03
AU2004203358B2 (en) 2007-10-25
HK1038584A1 (en) 2002-03-22
AU6855596A (en) 1997-03-19
DE69636440D1 (de) 2006-09-21
US6605282B2 (en) 2003-08-12
EP0848615A1 (en) 1998-06-24
DE69634820T2 (de) 2006-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5339687B2 (ja) 多種サブタイプｆｉｖワクチン
US20090263417A1 (en) Multi-subtype FIV vaccines
US7847085B2 (en) Recombinant HIV-1 gp120 immunogen with three different V3 loops from viruses of different clades
CA2525641A1 (en) Materials and methods for immunizing against fiv infection
MXPA98001570A (en) Feline immunodeficiency vaccines of subtipos multip
US20060147467A1 (en) Materials and methods for immunizing against FIV infection

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140823