KR100502568B1 - 다수-서브타입 fiv 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다수-서브타입 FIV 백신을 이용하여 고양이들을 광범위한 FIV 균주들에 의한 감염으로부터 보호하는 신규한 방법 및 조성물에 관계한다. 본 발명에는 세포 유리 완전 바이러스 또는 바이러스에 감염된 세포주를 포함하는 다수-서브타입 FIV 백신들이 기술된다. 본 발명의 백신 조성물에 의해 고양이들을 백신접종하는 방법도 개시된다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 백신접종된 고양이들은 동종 및 이종의 FIV 균주들에 의해 공격받을 때 FIV에 대해서 보호 체액 및 세포 면역반응을 시현한다. 본 발명은 또한 FIV에 감염되기 쉬운 신규한 고양이 세포주 및 이들의 이용방법에도 관계한다.
Description
본 발명은 국립위생연구소(NIH)에 의해 후원된 연구 프로젝트 제 NIH AI30904로서 정부의 지원에 의해 성안되었다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 숙주 동물에 있어서 FIV 감염에 대해 광범위한 보호면역(protective immunity)을 유도하는 백신에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 상이한 FIV 서브타입들로부터의 세포-유리 바이러스 분리주(cell-free viral isolates)들 또는 각각 상이한 서브타입들의 상이한 원형(prototype) FIV 바이러스에 감염된 세포주들의 조합을 이용하여 제조된 다수-서브타입 백신(multi-subtype FIV vaccine)에 관계한다. 본 발명의 FIV 백신에 의해 백신 접종된 고양이들은 동종 및 이종 FIV 균주들에 대해서 체액 및 세포 면역 반응을 나타낸다.
집 고양이들은 고양이 백혈병 바이러스(FeLV; feline leukemia virus), 고양이 육종 바이러스(FeSV; feline sarcoma virus), 내인성 타입 C 온코로나바이러스(RD-114; endogenous type C oncoronavirus) 및 고양이 신시튬-형성 바이러스(FeSFV; feline syncytia-forming virus)를 포함하는 몇 가지 레트로바이러스에 감염되기 쉽다. 이들 중에서, FeLV는 가장 중요한 병원체로서, 림프세망내피성 및 골수양성 종양, 빈혈, 면역-매개 질환, 및 사람의 후천성 면역결핍증후군(AIDS)과 유사한 면역결핍증후군을 포함하는 다양한 증상을 유발한다. 최근, FeLV-AIDS로 명명된 특수한 복제-결함 FeLV 돌연변이체(replication-defective FeLV mutant)가 면역억제 특성과 보다 자세하게 연관되었다.
고양이 T-림포트로픽 렌티바이러스(T-lymphotropic lentivirus)(현재 고양이 면역결핍 바이러스, FIV로 명명된)는 맨 처음 페더슨 등에 의해 보고되었다(Pedersen et al., (1987)). FIV의 특성은 야마모토(Yamamoto) 등(1988a); 야마모토 등 (1988b); 및 애클리(Ackley) 등(1990)에 의해 보고되었다. 혈청역학적 데이터(seroepidemiologic data)는 FIV에 의한 감염이 전세계의 집고양이 및 야생 고양이들의 고유한 것임을 입증해 준다. 매우 다양한 증상들이 FIV에 의한 감염과 관련되는데, 이들은 유산, 탈모, 빈혈, 결막염, 만성 비염, 장염, 치은조직염, 혈변배설, 신경계 이상, 치근막염, 및 지루성 피부염을 포함한다. FIV에 감염된 집고양이의 면역학적 특징은 고양이 CD4+ 말초혈액 림프구의 만성적이고 점진적인 결핍, CD4:CD8 세포 비율의 감소, 및 몇몇 경우에, CD8-포함 림프구의 증가이다. 분자, 생화학 및 면역병리학적 특징들에 기초할 때, 현재 고양이의 FIV 감염은 FeLV-FAIDS 보다는 고양이 AIDS 모델로 인식된다.
FIV의 클로닝 및 서열 분석은 옴스테드(Olmsted) 등(1989a); 옴스테드 등(1989b); 및 탈보트(Talbott) 등(1989)에 보고되어 있다. 호시(Hosie) 및 재럿(Jarret)(1990)은 FIV에 감염된 고양이의 혈청학 반응을 기술하였다. FIV 바이러스 서브타입(subtype)은 각 균주에 의해 유도되는 교차-중성화 항체(cross-neutralizing antibodies)들의 농도에 기초한 면역형(immunotype)에 따라 분류될 수 있다(Murphy and Kingsbury, 1990). 최근 바이러스들은 뉴틀레오티드 서열 상동성에 기초한 유전자형에 따라 서브타입들로 분류되었다. HIV와 FIV 서브타이핑이 유전자형에 기초한다고 해도(Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; 및 Louwagie et al., 1993), 서브타입들의 유전자형과 면역형 사이의 상관관계에 관해서는 알려진 바가 거의 없다. FIV 바이러스 분리주들은 현재 4 개의 FIV 서브타입들로 분류된다: A, B, C 및 D (Kakinuma et al., 1995). 전염성 분리주들 및 전염성 분자 클론들은 서브타입 C를 제외한 모든 FIV 서브타입들에 대해서 기술되었다(Sodora et al., 1994). 서브타입 C FIV는 캐나다 고양이의 세포 DNA로부터만 확인되었다 (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; 및 Kakinuma et al., 1995).
FIV 백신 개발에 있어 주된 어려움은 상이한 서브타입 또는 클레이드들(clades)로부터의 들판 분리주(field isolates)들을 포함하는 넓은 범위의 FIV 균주들에 대해 효과적인 백신 접근방법을 확인하는데 있었다. FIV에 대한 백신 예방법이 단일-균주 백신을 이용하여 동종(homologous) 및 약간 이종(heterologous)인 균주들에 대해 달성되었지만, 중간 정도 내지 현저하게 이종인 균주들에 대해서는 달성되지 못하였다 (Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1993). 따라서 다수의 FIV 서브타입들에 대한 보호를 제공하는 백신의 개발이 요청되어 왔다.
본 발명은 숙주 동물에 있어서 FIV 감염에 대해 광범위한 보호면역(protective immunity)을 유도하는 백신에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 상이한 FIV 서브타입들로부터의 세포-유리 바이러스 분리주(cell-free viral isolates)들 또는 각각 상이한 서브타입들의 상이한 원형(prototype) FIV 바이러스에 감염된 세포주들의 조합을 이용하여 제조된 다수-서브타입 백신(multi-subtype FIV vaccine)에 관계한다. 본 발명의 FIV 백신에 의해 백신 접종된 고양이들은 동종 및 이종 FIV 균주들에 대해서 체액 및 세포 면역 반응을 나타낸다.
본 발명은 다수 FIV 서브타입들에 의해 감염되기 쉬운 신규한 고양이 세포주에도 관계한다. 본 발명의 세포주들은 본 발명의 방법에 따른 FIV 백신에 유용하게 이용됨은 물론 다수 FIV 서브타입들의 증식 및 생산에도 유용하다. 또한, 상기 세포주들은 고양이 항혈청의 FIV 바이러스 중성화 분석에서 고양이 말초혈액 단핵 세포(PBMC; peripheral blood mononuclear cells) 대신에 이용될 수도 있다.
본 발명은 감염되기 쉬운 숙주 동물에 있어서 FIV 감염에 대한 보호면역(protective immunity)을 유도하는 방법 및 이에 유용한 백신 조성물에 관계한다. 본원에 기술된 백신 조성물들은, 숙주 동물에 투여될 때, FIV의 동종 및 이종 균주들(homologous and heterologous strains)에 의한 감염에 대한 보호 체액 및 세포 면역반응(protective humoral and cellular immune response)을 유발한다. 백신 조성물들은 세포-유리 FIV 바이러스 분리주 또는 FIV-감염 세포주 중 하나를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 두 가지의 상이한 FIV 서브타입으로부터의 FIV 균주들을 포함한다. 바람직하게, 백신 조성물은 각각 상이한 FIV 서브타입인 3 가지의 FIV 서브타입을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, FIV 서브타입 A, 서브타입 B, 및 서브타입 D 중에서 적어도 하나의 FIV 균주가 백신 조성물에 포함된다.
특수한 구현예에 있어서, 백신 조성물은 FIVPet- 및 FIVShi-감염 세포주들을를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 백신 조성물은 FIVPet-, FIVBang- 및 FIVShi
-감염 세포주들을 포함한다. 전부 또는 일부의 FIV 서브타입들 대신의 다른 FIV 균주들의 이용은 본질적으로 본 발명에 의해 예상된다. 예를 들어, FIVDix 또는 FIVUK8은 FIV 서브타입 A 원형 바이러스를 제공하기 위한 목적으로 FIVPet에 부가하여 또는 그 대신에 백신 조성물에 포함될 수 있다. 다른 FIV 균주들에 의한 유사한 부가(addition) 또는 치환(substitution)이 FIV 서브타입 B 및 D 원형 바이러스에 대해서도 이루어질 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 백신 조성물들은 FIV-감염 세포주들 또는 세포-유리 바이러스와 감염 세포주의 조합은 물론 세포-유리 완전 FIV 바이러스(cell-free whole FIV virus) 또는 바이러스의 부분들, FIV 단백질 및 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. FIV-감염 세포주를 포함하는 백신 조성물은 각각 상이한 FIV 서브타입에 의해 감염된 다수의 세포주들을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물들은 예컨대, FIV env, gag/pro, 또는 env-gag/pro를 포함할 수 있는 재조합 바이러스 벡터-계 FIV 구조물(recombinant viral vector-based FIV constructs)들도 포함할 수 있다. 재조합 벡터/FIV 구조물들을 만드는데 이용될 수 있는 임의의 적합한 바이러스 벡터가 본 발명에 이용될 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 아데노바이러스, 아비폭스바이러스, 고양이 헤르페스바이러스, 백시니아, 카나리폭스, 엔토모폭스, 스바인폭스 및 기타의 공지된 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터들이 본 발명의 조성물 및 방법에 이용될 수 있다. FIV 성분들을 코드화하고 발현하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터들은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 표준 유전공학 기술을 이용함으로써 제작될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 다양한 백신 조성물들은 서로 개별적으로 또는 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 동물의 1차 예방접종(immunization)은 단일의 또는 다수의 서브타입 성분들을 갖는 재조합 벡터-계 FIV 구조물을 이용할 수 있고, 이어서 불활성화된 FIV-감염 세포주들을 포함하는 백신 조성물을 사용하여 2차 추가면역(secondary boosts)을 행할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 의한 다른 예방접종 프로토콜들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명하고 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 예상된다.
본원에 구체적으로 기술된 다수-서브타입 FIV 백신들은 고양이에서 면역원성(immunogenicity) 및 효능에 대해 시험되었다. 본 발명의 조성물에 의해 백신접종된 특정 병원체가 없는(specific pathogen free; SPF) 고양이들을 동종 및 이종 FIV 균주들에 의한 공격(challenge) 이전 및 이후에 체액 면역 및 세포 면역 반응에 대해 모니터하였다. 채액 반응은 바이러스 중성화(VN) 항체 활성을 측정함으로써 모니터하였고 세포 반응은 세포독성 T 림프구(CTL) 활성을 측정함으로써 모니터하였다. 백신접종된 고양이들의 혈청 및 면역세포(immunocytes)들을 생체외(in vitro)에서 동종 및 이종 FIV 균주들에 대한 VN 및 CTL 활성에 대해 시험하여, 그 결과로 백신들이 FIV 감염에 대해 광범위한 보호를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명의 교시에 따라, 상이한 FIV 서브타입의 원형 바이러스 분리주들을 결합시키거나 또는 상이한 서브타입의 원형 바이러스에 의해 감염된 개개의 세포들을 결합시킴으로써, 효과적인 다수-서브타입 FIV 백신이 제조될 수 있다.
본원에 구체적으로 예시된 것들 이외의 모든 FIV 균주들은 본 발명에 의해 이용될 수 있을 것으로 예상된다. 다수의 FIV 분리주들이 문헌에 기술되어 있고 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 알려져 있다. FIVPet는 미국특허 제 5,037,753호에 기술되어 있다. 기술된 다른 FIV 분리주들은 표준 기술을 이용함으로써 당업자에 의해 감염된 고양이들로부터 용이하게 분리될 수 있다. FIV의 분리 및 배양방법은 본원에 참고자료로 첨부된 미국특허 제 5,037,753호 및 제5,118,602호에 기술되어 있다.
본원에 예시된 신규한 세포주들은 본 발명의 백신 방법 및 조성물에 이용될 수 있다. 말초혈액 단핵세포를 포함하는 FIV 균주에 감염되기 쉬운 다른 세포 또는 세포주들도 본 발명에 이용될 것으로 예상된다.
FIV 바이러스 단백질들의 천연, 재조합 또는 합성 폴리펩타이드들 및 이들의 펩타이드 단편들도 본 발명 방법에 따라 백신 조성물로 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 다수 FIV 서브타입으로부터 유래된 FIV 폴리펩타이드들은 백신 조성물내에 결합되어 숙주 동물을 백신접종하는데 이용된다. 예를 들어, 상이한 서브타입의 적어도 2 가지의 원형 FIV 균주들로부터의 FIV 엔벨로프 당단백질에 기초한 폴리펩타이드들이 백신내에 포함될 수 있다. 폴리펩타이드들은 하나의 균주와 동종(homologous)이거나, 또는 그의 아미노산 서열이 적어도 2 가지의 상이한 FIV 서브타입의 폴리펩타이드를 연결하거나 결합시켜서 구성된 "하이브리드" 또는 "키메라" 폴리펩타이드들을 포함할 수 있다. FIV 폴리펩타이드들을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, FIV 폴리펩타이드들은 고상 합성 방법(solid-phase synthesis methods)을 이용하여 합성될 수 있다(Merrifield, 1963). FIV 폴리펩타이드들은 FIV 단백질 또는 펩타이드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 세균, 효모, 또는 포유동물 세포주와 같은 숙주세포에서 발현시켜 발현된 단백질을 당업계의 표준기술에 따라 정제하는 과정을 포함하는 재조합 DNA 기술을 이용함으로써 만들어질 수 있다.
본 발명은 FIV에 감염되기 쉬운 신규한 고양이 T-세포주에도 관계한다. 인터루킨-2(IL-2) 의존성 및 독립성 세포들 양자 모두 구체적으로 예시된다. FeT-1C 및 FeT-J로 표시되는 세포주들이 본원에 기술된다. FeT-1C 세포주는 IL-2 의존성인 반면에, FeT-J 세포주는 IL-2 독립성이다. 본 발명의 세포주들은 생체외(in vitro)에서 FIV 바이러스 균주를 증식 및 생산하는데 유용함은 물론 고양이의 FIV 예방접종을 위한 비히클을 제공하는데도 유용하다. IL-2-의존성 FeT-1C 및 IL-2-독립성 FeT-J 비감염 세포주들은 양자 모두 배양액내의 역전사효소(RT) 활성에 대해 그리고 PCR에 의해 FIV 프로바이러스 서열에 대해 20회에 걸쳐 시험되었는데, FIV에 대해 음성으로 확인되었다. FeT-J 세포주는 FIVShi, FIVDix, FIV
UK8, FIVPet, 및 FIVBang를 포함하는 모든 시험된 FIV 균주들에 의해 매우 감염이 잘 되었지만 FIVShi에 의해서는 직접 감염되기는 좀더 어려웠다.
본 발명은 본 발명의 세포주들에 의해 생산된 세포 생성물에도 추가로 관계한다. 세포 생성물들은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분리 및 검출할 수 있다. 세포주들에 대한 항체들도 공지의 방법을 이용함으로써 제조될 수 있고 본 발명에 의해 예상된다.
FeT-1C (ATCC 기탁번호 제 CRL 11968호) 및 FeT-J (ATCC 기탁번호 제 CRL 11967호)로 명명된 FIV 비감염 세포주들은 양자 모두 1995년 8월 24일자로 메릴랜드 록빌 소재의 American Type Culture Collection에 기탁되었다. FIVBang-(ATCC 기탁번호 제 CRL 11975호) 및 FIVShi-(ATCC 기탁번호 제 CRL 11976호)감염된 세포주들은 1995년 8월 25일자로 ATCC에 기탁되었다.
본 발명의 배양세포들은 본원의 계류중에 37 CFR 1.14 및 35 U.S.C. 122에 의거 미국 특허상표청장이 분양받을 권리를 부여한 자에 대한 상기 배양균의 분양을 보장할 것을 조건으로 기탁되었다. 상기 기탁물은 본원의 대응출원 또는 그의 자출원이 출원된 나라에서 외국 특허법에 의해 요구될 때 입수될 수 있다. 그러나, 이러한 기탁물의 입수가능성이 정부의 행위에 의해 부여된 특허권을 훼손하는 본원 발명의 실시허락을 구성하는 것은 아니라는 사실을 이해하여야만 한다.
더욱이, 본 발명의 배양세포 기탁물은 미생물의 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 공중에게 분양될 수 있는 상태에 놓일 것이다. 즉, 상기 균주들은 기탁물 시료의 분양에 대한 최근의 요청후 최소한 5년간, 어떠한 경우라도, 기탁일로 부터 최소한 30년간 또는 그 미생물을 개시한 특허의 존속기간 동안 생존하고 오염되지 않도록 유지하는데 필요한 모든 주의를 기울여 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태 때문에 기탁 기관이 분양요청시 분양할 수 없는 경우에 기탁물(들)을 대체할 의무를 지닌다는 것을 인식한다. 본 발명의 배양세포에 대한 공중의 입수에 대한 모든 제한은 그들을 개시한 특허의 허여시에 결정적으로 철회될 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 본원에 기술된 FIV 백신 조성물들은 감염되기 쉬운 숙주, 전형적으로 집고양이에게 FIV에 의한 숙주의 공격(challenge) 또는 감염에 대한 보호면역을 유발하는데 효과적인 양 및 방법으로 투여된다. 백신들은 일반적으로 주사에 의해 비경구적으로, 예컨대, 피하로, 복막내로 또는 근육내로 투여될 수 있다. 다른 적합한 투여 방법은 경구 또는 비강 투여(nasal administration)를 포함한다. 일반적으로 백신들은 숙주에 각각의 투여 사이의 1주 이상의 간격으로 2회 이상 투여된다. 그러나, 백신의 최초 투여(initial administration) 또는 추가면역 투여(booster administration)를 위한 다른 방법이 예상될 수 있으며, 시술자의 판단 및 시술을 받는 특수한 숙주 동물에 의존할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물들은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 백신들은 일반적으로 주사가능한 형태, 예컨대, 유체, 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 백신들은 용량 제형(dosage formulation)에 적합한 방법으로 투여되고 시술대상에 있어서 치료상 유효하고 면역원성인 양으로 투여된다. 특정한 백신 제형에 대한 최적의 용량 및 투여 패턴은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
백신 제형내의 바이러스 및 세포들은 당업계에 공지된 방법에 의해 불활성화되거나 감약화될 수 있다. 예를 들어, 전체 바이러스들 및 감염된 세포들은 파라포름알데하이드, 포르말린, 페놀, 자외선광, 고온 등에 대한 노출에 의해 불활성화되거나 감약화될 수 있다. 백신 도스내의 세포-유리 완전 FIV 바이러스의 양은 통상 약 0.1 ㎎ 부터 약 5 ㎎까지, 더욱 일반적으로는 약 0.2㎎ 부터 약 2 ㎎까지의 범위내이다. FIV-감염 세포주들을 포함하는 백신 제형의 용량은 약 106 부터 약 108 까지의 세포/용량이고, 더욱 일반적으로는 약 5x106 부터 약 7.5x107
까지의 세포/용량이 될 것이다.
바이러스 또는 세포들은 일반적으로 투여 직전에 아쥬반트(adjuvant)와 결합된다. 백신 제형에 사용되는 아쥬반트들은 일반적으로 트레오닐 무라밀 디펩타이드(MDP)(Byars et al., 1987) 또는 프로인트 완전 및 불완전 아쥬반트(Freund's complete and incomplete adjuvants)의 조합이었다. 황산알루미늄과 같은 본 발명의 방법 및 백신에 이용하기에 적합한 여러 가지 다른 야쥬반트들은 당업계에 공지되어 있고 본 발명에 따라 이용될 것으로 예상된다.
본 발명은 본 발명의 비감염 세포주(uninfected cell line)들을 이용하여 시료내의 바이러스 중성화(VN) 항체들을 분석하는 방법에도 추가로 관계한다. 제한된 수의 계대(passage)후에 죽고 FeT-1C 또는 FeT-J 세포들 만큼 용이하게 증식하지 않는 PBMC와 달리, FeT-1C 및 FeT-J 세포들은 정착 세포주(established cell line)로서 장래의 사용을 위해 용이하게 냉동보존될 수 있다. FeT-1C 세포들을 이용한 VN 분석으로부터 수득된 결과들은 PBMC를 이용한 VN 분석 보다 재현성이 높은데, 이것은 상이한 SPF 고양이들로부터의 PBMC가 세포성장율 및 FIV 감염성에 있어 개체 변이성(individual variability)을 갖기 때문이다. 더욱이, VN 분석을 위한 PBMC는 PBMC를 이용한 생체외 VN 분석에 영향을 미칠 수 있는 생체내(in vivo) 감염의 가능성을 배제하기 위해서 무세균 하우징 및 보존을 필요로 하는 SPF 고양이로 부터 수득되어야만 한다. 따라서, VN 분석에서 상이한 서브타입의 FIV에 의해 쉽게 감염될 수 있는 FeT-1C와 같은 고양이 세포주는 VN 분석에서 바람직하게 PBMC 대신에 이용될 수 있다.
본원에서는 다음과 같은 FIV 균주들의 약어를 이용한다:
균주(서브타입)
약어
페탈루마 [Petaluma](A) FIVPet
딕손 [Dixon](A) FIVDix
UK8 (A) FIVUK8
뱅스턴 [Bangston](B) FIVBang
아오모리-1 [Aomori-1](B) FIVAom1
아오모리-2 [Aomori-2](B) FIVAom2
시즈오카 [Shizuoka](D) FIVShi
[재료 및 방법]
세포 배양
모든 부유 세포주들은 10% 가열-불활성화된 우태아혈청(FCS), 10 mM HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-n'-2-에탄 술포닉 애시드), 2 mM L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신 및 5ㅧ10-5M 2-멀캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. IL-2-의존성 세포들에게는 100 U/㎖의 재조합 사람 IL-2(Cetus Corporation, Emeryville, Calif)를 보충하였다. 부유 세포들을 0.5-4x106 세포들/㎖의 농도로 계대시켰고 1주일에 두 번 새로운 배양배지로 재배양하였다. 모든 단층 세포들을 1주일에 두 번 2x106 세포들/㎖의 최초 세포농도로 계대시켰다. FIV-감염 세포로부터의 조직배양액(TCF; Tissue Culture Fluids)을 1주일에 두 번 회수하여 잔류 세포들을 제거하기 위해 1시간 동안 3000rpm으로 회전시키고, -20℃ 또는 시험시 즉시 사용할 예정인 TCF의 경우는 -70℃에서 보관하였다. FIV에 감염되기 쉬운 세포들(1x106 세포들/ml)을 약 30,000 cpm/ml의 역전사효소 활성(RT)을 갖는 FIV로 감염시켰다.
FIV 정제
FIV-감염 세포주들로부터의 조직배양액들을 개별적으로 2000 내지 3000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 세포들을 제거하였다. TCF 내의 바이러스를 16,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리하여 펠렛화하고 먼저 10/50%(w/v) 불연속 수크로오스 경사(gradient)상에서 초원심분리에 의해 정제한 다음 10/50% 연속 수크로오스 경사상에서 초원심분리에 의해 정제하였다 (Pederson et al., 1987; Yamamoto et al., 1988). 각각의 바이러스 분리주들을 1.25%의 멸균 파라포름알데하이드(0.22㎛ 멸균 여과된)에 의해 18시간 동안 불활성화하고 나서 멸균 PBS에 대해 투석하였다. 불활성화된 바이러스들을 멸균 PBS로 500㎍/㎖ 농도로 희석하였고 250 ㎍/0.5 ㎖의 각 균주를 멸균된 마이크로퓨즈 튜브에 넣어 -70℃에 보관하였다. 불활성화된 FIV 균주들을 실온으로 해동하여 예방접종 직전에 0.5㎖의 멸균 PBS 내의 250㎍의 불활성화된 바이러스와 0.5㎖의 아쥬반트를 혼합하였다. FIV-감염 세포주들을 개별적으로 1.25%의 멸균 파라포름알데하이드로 18시간 동안 불활성화하고, 멸균 PBS로 3회 세정하고 나서 멸균 튜브내의 새로운 멸균 PBS내에 약 5.0x107 세포들/㎖ 농도로 재현탁시켜 4℃에서 보관하였다. 전형적으로, 예방접종 직전에 0.5㎖의 멸균 PBS 내의 2.5x107 불활성화된 감염 세포들과 0.5㎖의 아쥬반트를 혼합하였다. 250 ㎍/0.5㎖의 트레오닐 무라밀 디펩타이드(MDP MF75.2 아쥬반트; Chiron Corporation, Emeryville, CA)를 아쥬반트로 사용하였다.
CTL 분석
말초혈액단핵세포(PBMC)를 콘카나발린 A(Con A)로 3일간 자극시키고 나서 FIV로 10일간 감염시켰다 (Song et al., 1992). 이러한 세포들은 CTL 분석을 위한 표적 세포로 기능하였다. CTL 활성은 Con A-자극 PBMC와 자가(autologous) UV- 및 방사선 불활성화된 FIV-감염 PBMC를 5일간 공동-배양(co-culturing)함으로써 생성되었다. 이러한 세포들은 자극된 이펙터 세포들(effector cells)로 작용하였다. 분석 당일에, 표적 세포들을 1시간 내지 3 시간 동안 50μ Ci의 Na51CrO4로 표지하고, 3회 세정한 후, 일정한 수의 표지된 표적 세포들(5x104 세포들/웰)을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 이펙터 세포들을 다양한 이펙터/표적세포 비율(즉, 100:1, 50:1 및 10:1)로 세 개 한벌로(in triplicate) 첨가하였다. 플레이트들을 400rpm으로 1분간 원심분리하여 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군 51Cr-표지된 표적 세포들은 최대 방출 값(maximal release values)을 수득하기 위해 세제로 용해시켰다. 시험 시료 웰의 상청액을 수집하여 감마 카운터로 방사능을 측정하였다. 자연 방출(spontaneous release)을 51Cr-표지된 표적 세포들을 이펙터 세포가 없는 상태에서 인큐베이션하여 측정하였다. 비세포독성(specific cytotoxicity)의 퍼센트는 다음과 같이 산출하였다:
% 세포독성 = {(100)(평균 cpm 시험 방출 - 평균 cpm 자연 방출)}/{(평균 cpm 최대 방출-평균 cpm 자연 방출)}
면역블롯 및 효소결합 면역흡착 분석(ELISA)
수크로오스 경사 정제된 바이러스를 야마모토 등(1993)에 기술된 대로 면역블롯 분석을 위한 기질로 이용하였다. 감염된 세포의 조직배양액으로부터의 FIVPet를 저속 원심분리(2000 rpm으로 45분간)에 의해 정화하여, 초원심분리 (16,000 rpm으로 2 시간)에 의해 농축하고, 10/50%(w/v) 연속 수크로오스 경사상에서 초원심분리에 의해 정제하였다. 이와 같은 방법에 의해 정제된 바이러스를 면역블롯 분석을 위한 기질로 이용하였다.
이전에 기술되었던 면역블롯 기술을 변형하여 이용하였다 (야마모토 등, 1991a). 바이러스를 0.1% SDS에 용해화시킨 후, 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔상에서 전기영동하고 니트로셀룰로오스 막상에 전기적으로 전이하여 바이러스 블롯 스트립들을 준비하였다. 백신접종된 고양이들로부터의 혈청 시료들을 버퍼 3(0.15M 염화나트륨, 0.001 M 에디틱 애시드, 0.05 M TRIS 염기, 0.05% tween 20, 및 0.1% 우혈청 알부민)으로 1:50으로 희석하여 면역블롯 플레이트의 상이한 웰들에 있는 바이러스 블롯 스트립들과 함께 37℃에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯 스트립들을 세정 용액(탈염수내의 0.15 M NaCl 및 0.05% tween 20)으로 개별적으로 세정하고 바이오티닐화 항-고양이 IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세정 용액으로 3회 세정하였다. 이어서 스트립들을 개별적으로 양고추냉이 과산화효소 접합 스트렙트아비딘[horseradish peroxidase-conjucated streptavidin](Vector Laboratories)과 함께 개별적으로 30분간 인큐베이션 하였다. 강한 세정 이후에, 각 스트립을 실온에서 새로운 기질 용액(0.05% 디아미노벤지딘, 400 ㎍/㎖ NiCl2, 및 0.01% H2O2/0.1M Tris 버퍼, pH 7.4)과 함께 인큐베이션 하였다. 눈으로 관찰가능한 밴드가 형성되었을 때 과량의 증류수에 의해 반응을 종료시키고 스트립들을 블롯 건조시켰다. 이어서 사전에 아미도 블랙으로 염색된 스트립 상에서의 분자량 표준의 이동거리와 면역블롯 상의 밴드들을 비교함으로써 면역블롯상의 각 밴드들의 분자량을 측정하였다. 양성 및 음성 대조표준 혈청을 진단 평가를 위한 내부 대조표준으로서 각 면역블롯에 포함시켰다.
바이러스-항원 -특이적 ELISA는 이전부터 알려져 왔다 (야마모토 등, 1991a; 야마모토 등, 1993). 수크로오스 경사 정제된 FIVPet 및 FIVPet의 불변부위(C) 및 가변부위(V)의 표면 엔벨로프(SU) 및 막간(TM) 펩타이드들을 중탄산나트륨 버퍼(pH 9.6)와 함께 96 웰 이뮤놀론 플레이트[Immunolon plates](Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA)에 250 ng/웰로 37℃에서 12 시간 내지 18 시간 동안 코팅하여 ELISA를 위한 기질로 이용하였다. SU-V3-2 펩타이드의 아미노산 서열은 Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp Glu Trp Arg Glu Trp Arg Pro Asp Phe (서열 1)이고; TM-C1 펩타이드의 아미노산 서열은 Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile (서열 2)이다. 합성 펩타이드들은 FMOC 펩타이드 합성 화학(Magazine et al., 1988)을 이용하여 Biosearch 9500 펩타이드 합성기(Biosearch, San Rafael, CA)에 의해 합성하였다. 합성된 펩타이드들의 순도는 역상 고성능 액체 크로마토그래피상에서 단일 피크의 존재로 측정하였고 상기 피크시료에 대해 수행된 아미노산 서열 분석에 의해 확인하였다.
펩타이드 코팅된 플레이트들을 사용 직전에 버퍼 3으로 한 번 세정하였다. 혈청 시료들을 버퍼 3으로 1:200으로 희석하고 FIV 항원 코팅된 웰내에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 6회 세정하였다. 이어서 웰들을 세정용액으로 세정하고 바이오티닐화 항-고양이 IgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 6회 세정하고 나서 양고추냉이 과산화효소 접합 스트렙트아비딘(Vector Laboratories)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음으로 웰들을 세정용액으로 6회 세정하고 나서 실온에서 ELISA 기질 용액(0.005% 테트라메틸벤지딘 및 0.015% H2O2/0.96% 시트레이트 용액)과 함께 인큐베이션하였다. 공지의 FIV-양성 고양이 혈청으로 구성된 연속적으로 희석된 표준들에 있어서 가시적인 반응색이 나타날 때 0.1M 염산을 가하여 반응을 종료시켰다. 광흡수를 414㎚의 광밀도에서 Biorad ELISA 판독기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 측정하였다.
폴리메라제 연쇄 반응법(PCR)
동일 또는 상이한 서브타입의 다수의 FIV 균주들을 구별하기 위해서 최근에 개발된 감별 PCR(differential PCR)에 의해, 감염된 세포들의 프로바이러스 DNA 농도를 모니터하였다(Okada et al., 1994). PCR의 민감성을 향상시키기 위한 수단으로, 표 1에 기술된 네스티드(nested) PCR 프라이머 세트를 이용하였다. PCR은 2단계 반응으로 진행하였는데, 첫 단계는 오카다 등(1994)에 의해 기술된 조건하에서 한 쌍의 외부 프라이머(outer primer)(모든 FIV 균주들에 대해 공통적)를 가지고 행하였다. 두 번째 단계 PCR에서는, 1 단계의 생성물의 1/25를 내부 프라이머(inner primer)(각 FIV 균주에 대해 특이적인)에 의해 증폭시켰다. 네스티드 PCR을 이용하여, FIVPet, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIV
Aom2, 및 FIVShi에 의해 감염된 세포들을 서로 구분할 수 있다.
세포당 프로바이러스 DNA의 대략적인 양은 알려진 수의 세포들로부터 추출된 DNA의 다양한 희석물이 만들어지는 반-정량 PCR(semi-quantitative PCR)에 의해 측정하였다. 예를 들어, 만약 105 세포들이 DNA 추출에 이용된다면, 대략적으로 DNA 표본의 10-5 희석물이 하나의 세포내에 존재하는 DNA에 상응할 것이다. 이러한 다양한 DNA 희석물에 대해 PCR을 행하였는데, 양성 PCR 결과를 제공한 최종 희석물이 종점 희석물(end-point dilution)로 생각되었다. 종점 희석물에 해당하는 세포들의 수를 이용하여 하기 식에 따라 일정한 세포 표본내에 존재하는 바이러스에 감염된 세포들의 백분율을 산출하였다:
%감염된 세포= (1/Z) x 100
상기 식에서, Z = 종점 희석물에 해당하는 세포들의 수
역전사효소(RT) 분석
레이(Rey) 등에 의해 기술된 방법으로 세포 배양 상청액내의 RNA-의존성 DNA 폴리메라제(RT)의 존재를 분석하였다. FIV 검출을 위한 RT 분석은 시료마다 외인성 주형 프라이머로 폴리(rA)-올리고(dT12-18), 4 가지 상이한 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 20 mM KCl과 양이온으로서 Mg++ 및 5μCi[3H]- 표지된 티미딘 트리포스페이트(TTP)를 이용하였다. 5μCi[3H]-TTP는 베크만 LS250 신틸레이션 카운터(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA)상에서 신틸레이션 유체 혼합물(1 부의 크실렌 내지 9부의 Research Products International 생분해성 카운팅 신틸런트)을 이용할 때, 1,200,000 cpm의 평균 전체 카운트를 제공하였다. 따라서, 시험된 시료의 RT 값은 1,200,000 cpm/ml 미만이 될 것이다.
바이러스 중성화 분석
균주- 및 서브타입-특이적 VN 분석의 개발 방법이 공지되어 있다(오카다 등, 1994). 가열-불활성화된 혈청의 연속 희석물들을 고양이 말초혈액 단핵세포(PBMC)(4x105 세포들/ml) 또는 FIV-감염성 FeT-1C 세포(2x105 세포들/ml)들을 첨가하기 이전에 24-웰 플레이트에서 100 TCID50의 각 FIV 균주와 함께 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 3일간의 배양 이후에, 세포들을 행크스액(Hank's balanced salt solution)으로 세정하여 배양물로부터 잔류 바이러스들을 제거하고 나서 세포들을 새로운 배양 배지(10% 가열-불활성화된 우태아혈청, 10 mM HEPES 버퍼, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신, 5x10-5 M 2-멀캅토에탄올 및 100 단위/㎖ 사람 재조합 IL-2를 포함하는 RPMI-1640)에 재현탁시켰다. 세포들의 바이러스 감염은 배양의 제 9일, 제 12일, 제 15일, 및 제 18일에 회수된 배양액의 Mg++-의존성 RT 분석에 의해 모니터하였다. RT 활성이 SPF 혈청으로 구성된 감염 대조군 배양물의 25% 이하일 때 혈청을 VN 항체들에 대해 양성으로 판정하였다.
실시예
이하에서 실시예를 들어 최선의 구현예를 포함하는 본 발명을 실시하는 방법을 설명한다. 이러한 실시예들은 제한적인 의미로 해석되어서는 안된다. 특단의 언급이 없는 한, 모든 백분율은 중량에 대한 값이고 모든 용매 혼합비는 용적에 대한 것이다.
실시예 1 - FIV-감염 세포주
FeT-1C로 명명된, IL-2-의존성 FeT-1M 클론의 모세포주(mother line)인 신규한 인터루킨-2(IL-2) 의존성 고양이 T-세포주를 이용하여 FIVPet, FIVDix, FIVUK8
, FIVBang, FIVAom2, 또는 FIVShi에 의해 만성적으로 감염된 개개의 세포주들을 만들었다. FeT-1M 클론(FIV-FeT1M으로도 불리우는)은 본원에 참고자료로 첨부된 미국특허 제 5,275,823호에 기술되어 있고, 만성적으로 FIVPet를 생산해 내는 IL-2-독립성 세포주, FL-4(미국특허 제 5,275,823호에 기술)를 만드는데 이용되었다. FeT-1C 세포주는 FIV 서브타입 A, B 및 D로부터의 상이한 분리주들에 의해 매우 감염되기 쉽다. FeT-1C 세포주의 장기간의 여러 계대에 걸친 배양(passaging)은 그의 감염성, 특히 FIV 서브타입 D에 대한 감염성을 감소시킨다; 따라서, 계대 수는 최적 FIV 감염율을 위해 또는 그의 VN 분석에의 이용을 위해 약 35 계대 미만이어야 한다. 반-정량 PCR 및 바이러스 코어 항원 분석 결과 FIV에 노출된 모든 세포주들이 개개의 FIV 균주에 의해 현저하게 감염된 것으로 나타났다.
FIV에 감염되기 쉬운 모든 IL-2 독립성 고양이 세포주들도 FeT-1C 세포로 부터 만들어졌다. FeT-J로 명명된 이러한 세포주는 FIV 감염된 배지 또는 세포들을 이용한 공동-배양에 의해 FIV에 의해 감염될 수 있다. 예를 들어, FIVBang-감염된 FeT-1C 세포주를 IL-2가 없는 상태에서 비감염 FeT-J 세포들과 공동-배양하여 IL-2-독립성 FIVBang-감염 FeT-J 세포주(Bang/FeT-J로도 불림)를 만들었다. 공동-배양 감염 방법에 있어서, Bang/FeT-1C 세포들은 비감염 FeT-J 세포와 약 2:1 부터 약 10:1 까지의 비율(감염:비감염)로 혼합되었다. 세포 혼합물을 IL-2가 없는 상태에서 수주일간 배지에서 배양하여 FeT-1C 세포들이 죽도록 방치하였다. 나머지 세포들은 FIVBang-감염 FeT-J 세포들로 구성되었다. 따라서, FIV-감염 FeT-1C세포들은 FeT-J 세포들을 감염시켜 상이한 FIV 서브타입에 의해 감염된 IL-2-독립성 FeT-J 세포주를 수립하는데 이용될 수 있다. FIV 감염된 FeT-1C 세포들에 의한 공동-배양 방법은 중간정도 내지 높은 레벨의 상이한 FIV 서브타입들을 만들어 내는 IL-2-독립성 FeT-J 세포주를 결과시켰다.
FeT-1C 세포주를 FIVShi로도 감염시켜 Shi/FeT-1C 세포로 명명된 IL-2-의존성 세포주를 만들기 위해 대폭적으로 계대배양하였다. 이어서 Shi/FeT-1C 세포주를 IL-2가 없는 상태에서 FeT-J와 공동-배양하여 그 결과로 수득된 IL-2-독립성 FIVShi-감염 세포주를 Shi/FeT-J로 명명하였다. IL-2-독립성 Shi/FeT-J 세포주는 IL-2의존성 Shi/FeT-1C 세포주 보다 높은 수준의 FIVShi를 생산한다 (도 1).
FIVBang에 감염된 FeT-J 세포주의 제조는 FeT-1C 세포주를 이용하지 않고도 행하였다. FeT-J 세포주를 직접 세포-유리 FIVBang 접종물로 감염시켜 IL-2 없이 대량으로 계대배양하였다. 그 결과로서 수득한 IL-2-독립성 FIVBang 생산 세포주를 Bang/FeT-J로 명명하였다. Bang/FeT-J 세포주는 FeT-1C 세포주를 FIVBang로 감염시켜 만든 IL-2-의존성 Bang/FeT-1C 세포주 보다 높은 수준의 FIVBang를 생산하였다 (도 1).
실시예 2 - 다수-서브 타입 FIV 백신
FIV-감염된 세포들을 세포 상청액으로부터 원심분리에 의해 분리해 내어 불할성화시켜 백신으로 이용하였다. 마찬가지로, 완전한 FIV 바이러스를 감염된 세포-유리 상청액으로부터 초원심분리에 의해 펠렛화하고 불활성화하였다. 감염된 세포와 바이러스 양자를 1.25% 파라포름알데하이드로 5℃에서 24시간 동안 처리하여 불활성화시키고 나서 각각 잘 세정하거나 PBS에 대해 투석하였다. 이러한 방법은 면역원성의 손실 없이 FIV를 효과적으로 불활성화시킨다. 본 발명방법에 따라 생산된 FIV 면역원(immunogen)들은 보호면역을 유도하는데 매우 효과적이었다(야마모토 등, 1993; 야마모토 등, 1991a; 야마모토 등, 1991b). 감약화된 바이러스 분리주들도 본 발명의 백신 조성물에 이용될 수 있을 것으로 예상된다.
다수-서브타입의 FIV에 감염된 단일의 세포주(즉, 다수-서브타입 A/D FeT-1C 세포주)를 만들기 위해 FIVShi-감염된 FeT-1C 세포주를 FIVPet 균주에 의해 중복감염시켰는데, 공동-감염의 2 개월 이내에 FIVShi 프로바이러스 레벨은 50% 부터 5% 미만 까지 감소된 반면에, FIVPet 프로바이러스 레벨은 동시에 약 50% 증가하였다. 따라서, FIV 백신으로 이용하기 위해 FIV의 다수-서브타입에 감염된 단일 세포주를 유지하는 것은 본 발명의 바람직한 구현예가 아니다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현예 있어서, 백신 조성물들은 각각 상이한 FIV 서브타입에 의해 감염된 두 개의 별개의 세포주들로 부터 만들어졌다. 특수한 구현예에 있어서, 2-서브타입 FIV 백신 조성물은 FIV 서브타입 A-감염 세포주(Pet/FL-4)와 FIV 서브타입 D-감염 세포주(Shi/FeT-1C)의 조합을 포함하였다. A-서브타입 및 D-서브타입 감염된 세포주들을 상술한 대로 불활성화하여, 동등한 세포수(250㎍ MDP내에 2.5x107 세포들)로 결합시켜 고양이를 예방접종하는데 이용하였다. 세 마리의 SPF 고양이들을 불활성화된 Pet/FL-4 세포들로 백신접종하였고 다른 4 마리의 고양이들은 불활성화된 Shi/FeT-1C 세포들(2.5x107 세포들/도스)로 백신접종하였다. 일련의 4회의 백신 접종 후에, 2-서브타입(Pet/FL-4 및 Shi/FeT-1C) 백신은 시험된 양자의 FIV 균주에 대해 상당한 VN 항체 역가를 포함하는 항-FIV 항체들을 유도하였다(도 2 및 표 2, 시험 Ⅰ). 4 마리의 2-서브타입(Pet/FL-4 및 Shi/FeT-1C) 백신접종된 고양이들을 FIVBang(50 CID50)으로 공격하였다. Pet/FL-4 백신접종된 3마리 모두 그리고 Shi/FeT-1C 백신접종된 고양이들중 2 마리를 50 CID50의 FIVBang으로 공격하였다. 나머지 2 마리의 Shi/FeT-1C 백신접종된 고양이들을 50 CID50의 FIVShi으로 공격하였다.
모든 2-서브타입 백신접종된 고양이들은 감염-이후(pi; post-infection) 6주후에 바이러스 분리 및 PBMC의 PCR에 의해 판단시 FIVBang에 대해 음성이었던 반면에, 모든 모의 예방접종 고양이들(Sham immunized cats)은 감염-이후 6주후에 바이러스 분리 및 PCR에 의해 판단시 FIVBang 또는 FIVShi에 대해 양성이었다 (표 2, 시험 Ⅰ). 이와 반대로, FIVBang에 의해 공격된 Pet/FL-4 백신접종된 및 Shi/FeT-1C 백신접종된 그룹들 각각으로 부터의 한 마리의 고양이는 FIVBang에 대해 양성이었다. 예상대로, 모든 FIVShi에 의해 백신접종되고 나서 FIVShi에 의해 공격된 고양이들은 감염-이후 6주후에 FIVShi에 대해 음성이었다. 따라서, 구체적으로 예시된 2-서브타입 백신들은 이종 FIVBang 공격에 대한 감염은 물론 동종 FIVShi 공격에 대한 감염을 예방하거나 지연시켰다.
2-서브타입 백신접종된 고양이들(Pet/FL-4 세포들 및 Shi/FeT-1C 세포들)은 2차 예방접종 후 바이러스 코아 단백질 p25(FIV p28로도 불리우는)에 대해 특이적인 FIV 항체를 만들어내었다 (도 2). 3차 내지 4차 접종 이후에는 다른 바이러스 항원에 대한 보다 높은 항체 역가가 확인되었다. FIVPet에 대한 VN 항체는 2차 예방접종후에 만들어진 반면에, FIVShi에 대한 VN 항체는 4차 예방접종 이후에 만들어졌다 (표 4). FIVPet 및 FIVShi에 대한 CTL 반응은 모든 시험된 고양이들에서 3차 예방접종시만큼 조기에 검출되었고(표 3) 양자의 균주에 대한 보다 강한 CTL 반응은 4차 예방접종 이후에 나타났다. 더욱이, 시험된 3 마리의 고양이들중 두 마리는 4차 예방접종 이후에 FIVBang에 대해 CTL 반응을 나타내었다. 결과들은 4차 백신접종 이후에, 2-서브타입 백신이 FIVPet 및 FIVShi에 대한 강한 CTL 반응을 유발하고(표 3) 양자의 FIV 균주들에 대해서 VN 항체 역가를 갖는 높은 FIV 항체들을 유도한다는 것을 가리킨다(표 4).
불활성화된 Shi/FeT-1C 세포들에 의해 예방접종된 고양이들은 2차 예방접종이후에 바이러스 코아 단백질 p25에 대해 특이적인 FIV 항체를 만들어내었고(도 2), 3차 접종 이후에는 다른 바이러스 항원에 대한 항체를 만들어내었다. 이러한 고양이들에 있어서 FIVShi에 대한 VN 항체들은 4차 예방접종이후에 생성된 반면에, FIVPet에 대한 VN 항체들은 예방접종 과정내내 검출되지 않았다. 양자의 Shi/FeT-1C 백신접종된 고양이들은 FIVShi에 대해서는 4차 예방접종 이후에만 CTL 반응을 나타내었지만, FIVPet에 대해서는 4차 예방접종 이후에도 CTL 반응을 나타내지 않았다 (표 3).
불활성화된 Pet/FL-4 세포에 의해 예방접종된 고양이들은 2차 예방접종이후에 p25에 대한 항체를 만들어내었고(도 2), 2차 내지 3차 접종 이후에는 FIVPet에 대한 VN 항체를 포함하는 다른 바이러스 항원에 대한 항체를 만들어내었다 (표 4). Pet/FL-4 세포에 의해 예방접종된 고양이에서 검출된 유일한 CTL 반응은 FIVpet에 대한 것이었다. 종합적으로, 2-서브타입 FIV 백신들은 단일-서브타입 백신 보다 양자의 FIV 균주들에 대해 보다 빠르고 높은 VN 항체 역가 및 CTL 반응을 유도하였다. 모의 예방접종된 SPF 고양이들은 바이러스 항체, VN 항체 또는 항-FIV CTL 반응을 나타내지 않았다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은 각 세포주들이 상이한 FIV 서브타입(A, B 또는 D)의 바이러스 균주에 의해 감염된 3 세포주들로부터 제조된 3-서브타입 FIV 백신을 포함한다. 3 마리의 SPF 고양이들을 3-서브타입(FIVPet + FIVBang + FIVShi) 백신으로 예방접종하였다. 백신의 한 성분으로서의 마크로파아지-굴성(macrophage-tropic) FIVBang의 면역원성을 평가하기 위해서 다른 고양이들을 단일-서브타입 FIVBang백신으로 예방접종하였다. VN 항체 역가 결과는 3-서브타입(FIVPet + FIVBang + FIVShi) 및 단일-서브타입 FIVBang
백신 양자 모두 2차 예방접종후에 조차도 높은 항바이러스 항체 역가를 유도한다는 것을 가리킨다 (표 2, 시험 Ⅱ 및 표 5). 따라서, 림프구굴성(lymphotropic) 및 마크로파아지-굴성(macrophage-tropic) FIV 양자 모두 본 발명의 백신 조성물의 성분들로 이용될 수 있다.
불활성화된 Pet/FL-4, 불활성화된 Bang/FeT-J 및 불활성화된 Shi/FeT-1C 세포들(250㎍ MDP 내에 2.5x107 세포들)의 조합에 의해 예방접종된 3 마리의 SPF 고양이들은 2차 예방접종 이후에 바이러스 코아 단백질 p25 및 FIV SU 및 TM 엔벨로프 단백질을 포함하는 다른 바이러스 항원들에 대해 특이적인 FIV 항체를 만들어내었다 (도 3, 4, 5). FIVPet, FIVBang, 및 FIVShi에 대한 VN 항체들은 2차 예방접종 직후에 대다수의 고양이에서 그리고 3차 예방접종에 의해서는 모든 고양이에서 발생하였다(표 5). 또한, 한 마리의 고양이는 3차 예방접종후 FIVUK8와 상호 반응하는 VN 항체들을 포함하였다. 단지 Bang/FeT-J 세포에 의해서만 예방접종된 4 마리의 SPF 고양이들은 2차 예방접종 이후에 바이러스 코아 단백질 p25 및 다른 바이러스 항원들에 대해 특이적인 FIV 항체를 만들어내었다 (도 3). 이들 고양이에 있어서 FIVBang에 대한 VN 항체들은 2차 예방접종 이후에 만들어진 반면에(표 5), FIVPet 및 FIVUK8에 대한 VN 항체들은 예방접종의 전과정에 걸쳐 검출되지 않았다. 3-서브타입 FIV 백신(Pet/FL-4, Bang/FeT-J 및 Shi/FeT-1C 세포들)에 의해 3회 예방접종된 고양이들의 FIV A, B 및 D 서브타입 표적세포에 대한 CTL 반응은 표 6에 나타내었다. 시험된 세 가지 FIV 서브타입들 모두에 대해 CTL 반응이 검출되었다. 따라서, 3-서브타입 백신은 단일-서브타입 백신 보다 광범위한 CTL 반응 및 보다 빠르고 높은 VN 및 SU-엔벨로프 항체 역가를 유발하였다. 비감염 FeT-J 및 모의 예방접종된 SPF 고양이 모두 바이러스 항체 또는 VN 항체들을 만들어내지 못했다.
실시예 3 - FIV 서브타입들에 대한 VN 항체
본 발명의 FeT-1C 세포들을 이용하여 FIV에 대한 VN 항체에 대한 분석을 행하였다. FIVPet-감염된 고양이 및 불활성화된 Pet/FL-4 세포 또는 불활성화된 FIVPet 바이러스에 의해 백신접종된 SPF 고양이들의 혈청을 본원에 기술된 VN 분석법에 따라 FeT-1C 세포들 또는 PBMC를 이용하여 VN 항체 역가에 대해 시험하였다. 백신접종되지 않았고 FIV 감염되지도 않은 두 마리의 SPF 고양이들의 혈청을 대조표준 혈청으로 이용하였다. 백신접종되고 FIV 감염된 고양이들의 혈청은 1000 이상의 높은 VN 항체 역가를 가진 반면에, 백신접종되지 않은 SPF 고양이들의 혈청은 검출가능한 정도의 VN 항체 역가를 갖지 않았다. FeT-1C-계 VN 분석 결과는 VN 항체 역가 결과가 고양이들의 일차 PBMC를 이용하여 수득한 결과와 동등하다는 것을 말해준다(표 6). 이러한 발견은 FeT-1C 세포들을 이용한 VN 분석에서의 VN 항체 역가가 PBMC를 이용한 VN 분석에 의해 수득된 결과와 서로 관련있다는 것을 증명해준다. 따라서, FeT-1C 세포들은 모든 FIV 서브타입들에 의해 감염될 수 있고 조직배양에 의해 용이하게 증식될 수 있기 때문에, FeT-1C 세포들은 FIV에 대한 표준 VN 분석에서 PBMC 대신에 유용하게 이용될 수 있다.
실시예 4 - FIV 균주들의 면역타이핑 (Immunotyping)
FIV 서브타입이 FIV 면역형(immunotype)을 반영하는지 여부를 알아보기 위해 FeT-1C 세포들을 이용하여 생체외(in vitro) 연구를 행하였다. 면역타이핑은 백신 보호에서 VN 항체의 역할을 이해하는데 중요하다. FIV 서브타입 A 균주 (FIVPet, FIVDix, FIVUK8), 서브타입 B (FIVBang, FIVAom1
), 및 서브타입 D (FIVShi)에 의해 감염된 고양이들의 항혈청을 VN 분석에서 FeT-1C 세포들을 이용하여 생체외에서 이들 균주들을 중성화하는 능력에 대해 시험하였다(도 6). 모든 시험 항혈청들은 대응하는 동종 FIV 균주에 대한 중성화 능력을 보유하였다. 서브타입 A 균주인 FIVPet는 FIVDix에 의해 감염된 고양이의 항혈청에 의해 상당히 교차-중성화되었다. FIVPet는 FIVDix와 표면 엔벨로프 당단백질(Env) 부위가 약 9% 상이하였다. FIV 서브타입 A 균주들에 의해 감염된 고양이들의 항혈청은 서브타입 B FIVBang를 교차-중성화하였지만, 서브타입 D FIVShi는 중성화하지 않았다. 서브타입 B 및 D 균주에 의해 감염된 고양이들의 항혈청은 동종 서브타입에 속하는 다른 FIV 균주들만을 교차-중성화하였다. 더욱이, FIVUK8에 의해 감염된 고양이의 항혈청은 FIVBang는 중성화하였지만 서브타입 A에 속하는 FIV 균주들은 중성화하지 않았다. FIVUK8가 서브타입 A로 분류된다고 해도(Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; Kakinuma et al, 1995), 이들 결과들은 FIVUK8에 대한 항혈청이 서브타입 B균주는 인식하지만, 서브타입 A 균주들은 인식하지 못한다는 것을 가리키는데, 이것은 불활성화된 FIVPet 백신들이 FIVUK8, 및 FIVShi에 대해 효과적이지 못한 이유를 설명할 수 있다(Johnson et al., 1994). 따라서, 유전자형과 면역형 사이에는 느슨한 상관관계(loose correlation)가 존재한다. 비록 유전자형 분석이 FIV 분류를 허용한다고 해도, 교차-중성화 항체 연구는 백신에 의해 유발되는 광범위한 체액 보호에서 중요한 매개변수인 FIV 균주들의 면역원성을 반영한다.
실시예 5 - FIV 세포 굴성(tropism)
감염된 FeT-1C 및 감염된 FeT-J 세포주들로부터 수득된 FIV 균주들의 세포굴성을 일차 PBMC로부터 수득된 FIV 균주들의 세포굴성과 비교하였다(표 8). 두 개의 FIV 분리주, FIVUK8 및 FIVBang들은 모두 동등하게 림프구굴성 및 마크로파아지-굴성인 반면에, FIVShi는 고도로 림프구굴성이다. FIVPet는 마크로파아지-굴성이기 보다는 림프구굴성이었고, 그의 세포 굴성은 그의 세포 공급원(cell source)에 크게 영향을 받지 않았다. FIVBang의 마크로파아지-굴성은 바이러스의 세포 공급원에 의해 영향을 받지 않았다. 감염된 FeT-1C 세포주로부터의 FIV 균주들의 세포 굴성이 일차 PBMC로부터 만들어진 그것과 동등하기 때문에, FeT-1C 세포들에서 생장된 바이러스는 VN 분석을 위한 접종물(inoculum)로 이용될 수 있고 치료 및 예방적 접근방법을 평가하기 위한 연구를 위한 생체내(in vivo) 접종물로도 이용될 수 있다.
본원에 기술된 실시예 및 구현예들은 설명의 목적만을 위한 것이고 본 발명의 다양한 변형 및 변화들이 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명할 것이고 본 발명의 정신 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범위내에 포함될 것이다.
본 발명은 숙주 동물에 있어서 FIV 감염에 대해 광범위한 보호면역(protective immunity)을 유도하는 백신에 관한 것으로서 상이한 FIV 서브타입들로부터의 세포-유리 바이러스 분리주(cell-free viral isolates)들 또는 각각 상이한 서브타입들의 상이한 원형(prototype) FIV 바이러스에 감염된 세포주들의 조합을 이용하여 제조되므로 다수-서브타입 백신(multi-subtype FIV vaccine)을 제공하여 동종 및 이종 FIV 균주들에 대해서 체액 및 세포 면역 반응을 나타낼 수 있다.
도 1은 FeT-1C 및 FeT-J 세포주들을 FIVBang 및 FIVShi 균주들로 감염시킨 이후에 생성된 이들 FIV 균주들의 역전사효소(RT) 농도를 도시한 것이다.
도 2는 면역블롯에 의해 검출된 FIV 단백질들에 의해 2-서브타입 백신접종된 고양이들로부터의 항-FIV 항체들의 면역반응을 도시한 것이다. 각 블롯 위의 숫자들은 해당 혈청 시험시 동물에 시술된 백신접종 횟수를 나타낸다.
도 3은 면역블롯에 의해 검출된 FIV 단백질들에 의해 3-서브타입 백신접종된 고양이들로부터의 항-FIV 항체들의 면역반응을 도시한 것이다. 각 블롯 위의 숫자들은 해당 혈청 시험시 동물에 시술된 백신접종 횟수를 나타낸다.
도 4는 ELISA에 의해 검출된 FIV SU-V3-2 펩타이드에 의해 3-서브타입 백신접종된 고양이들로부터의 항-FIV 항체들의 면역반응성을 도시한 것이다.
도 5는 ELISA에 의해 검출된 FIV TM-C1 펩타이드에 의해 3-서브타입 백신접종된 고양이들로부터의 항-FIV 항체들의 면역반응성을 도시한 것이다.
도 6은 FIVPet(AP), FIVDix(AD), FIVUK8(A
U), FIVBang(BB), FIVAom1(BA), 및 FIVShi(DS)에 의해 감염된 고양이 혈청의 교차-중성화 항체 역가(cross-neutralizing antibody titer)를 도시한 것이다. 감염전(컬럼 1), 감염 후 6개월(컬럼 2), 및 감염후 12개월(컬럼 3)된 혈청들을 FeT-1C-세포주에서 서브타입 A FIVPet, 서브타입 B FIVBang, 및 서브타입 D FIVShi에 대해 시험하였다. 각 균주당 적어도 3마리의 고양이들을 시험하였고 결과는 각 균주의 대표적인 고양이로부터의 VN 역가를 나타낸 것이다. 유사한 결과들을 VN 분석에서 일차 PBMC를 이용하여 수득하였다.
[서열의 간단한 설명]
서열 1은 SV-V3-2로 명명된 FIV 표면 엔벨로프 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 2는 TM-C1로 명명된 FIV 막횡단 펩타이드(transmembrane peptide)의 아미노산 서열이다.
서열 3은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 4는 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 5는 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 6은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 7은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 8은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 9는 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 10은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 11은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 12는 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 13은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 14는 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 15는 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 16은 하나의 FIV PCR 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
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Claims (34)
- FIV에 의해 감염될 수 있지만 IL-2 독립성을 위해서는 FIV 감염을 필요로 하지 않는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포가 FIV 바이러스에 감염된 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 2항에 있어서, 상기 FIV 바이러스가 FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2, FIVPet 및 FIVShi로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 FIV 균주인 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 2항에 있어서, 상기 FIV 바이러스의 서브타입이 서브타입 A, B, C 및 D로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T 세포.
- 제 2항에 있어서, 상기 세포가 FIV 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 5항에 있어서, 상기 FIV 단백질이 FIV 엔벨로프 당단백질 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 6항에 있어서, 상기 FIV 엔벨로프 당단백질이 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 2항에 있어서, 상기 세포가 두 개 또는 그 이상의 상이한 FIV 균주에 의해 감염되는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 8항에 있어서, 상기 FIV 균주가 FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2, FIVPet 및 FIVShi로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 2항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포를 감염시키는 FIV 바이러스를 불활성화시키는 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 2항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포를 감염시키는 FIV 바이러스를 감약화시키는 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 5항에 있어서, 상기 FIV 단백질이 적어도 두 가지의 FIV 서브타입으로부터 유래된 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질인 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 12항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 FIV 엔벨로프 당단백질을 포함하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포가 재조합 바이러스 벡터-계 FIV 구조물(recombinant viral vector-based FIV construct)을 포함하고, 상기 구조물은 FIV 단백질 또는 그의 단편을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- 제 14항에 있어서, 상기 바이러스 벡터 FIV 구조물이 FIV env , FIV gag/pro , 또는 FIV env-gag/pro 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-2 독립성 고양이-유래 T세포.
- ATCC 기탁번호 CRL 11967호 하에 기탁된 T 세포의 고유 특성을 갖는 고양이-유래 T 세포.
- 제 16항에 있어서, 상기 세포가 FIV 바이러스에 의해 감염되고, 상기 FIV의 서브타입이 서브타입 A, B, C 및 D로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세포.
- 제 17항에 있어서, 상기 세포가 FIV 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 18항에 있어서, 상기 FIV 단백질이 FIV 엔벨로프 당단백질 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 19항에 있어서, 상기 FIV 엔벨로프 당단백질이 서열 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 18항에 있어서, 상기 세포가 두 가지 이상의 상이한 균주의 FIV에 의해 감염된 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 21항에 있어서, 상기 FIV 균주가 FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2, FIVPet 및 FIVShi로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 17항에 있어서, 상기 FIV 감염 세포가 상기 세포를 감염시키는 FIV 바이러스를 불활성화하는 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 17항에 있어서, 상기 FIV 감염 세포가 상기 세포를 감염시키는 FIV 바이러스를 약독화하는 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 세포.
- 시료를 FIV와 접촉시킨 후; 상기 시료내의 고양이 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell) 또는 서브타입 A, B, C 및 D로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 FIV 서브타입에 의해 감염되기 쉬운 고양이-유래 T 세포주로부터의 세포를 유효한 시간 동안 배양하고; 상기 세포들을 새로운 배양배지에서 배양한 다음, 상기 배양배지 내의 역전사효소 활성의 양을 측정하는 단계를 포함하는 시료 내의 FIV 바이러스 중성화 항체를 검출하거나 정량하는 방법.
- 제 25항에 있어서, 상기 세포주가 ATCC 기탁번호 CRL 11968로 지정된 FeT-1C 및 ATCC 기탁번호 CRL 11967로 지정된 FeT-J로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제 1항의 세포에 특이적으로 결합하는 항체.
- (a) FIV에 감염되기 쉬운 숙주 동물의 세포로부터의 DNA를 폴리메라제 연쇄 반응법 (PCR)에 충분한 조건하에서 모든 FIV 균주에 공통인 핵산 서열에 결합하는 제 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 접촉시키는 단계로서, FIV 프로바이럴(proviral) DNA 서열이 상기 DNA에 존재할 경우 제 1 증폭 산물이 생산되는 단계;(b) 단계 (a)로부터 수득한 제 1 증폭 산물을 폴리메라제 연쇄 반응법(PCR)에 충분한 조건 하에서 상기 제 1 증폭 산물에 존재하는 표적 FIV에 특이적인 핵산 서열에 결합하여 증폭시키는 제 2의 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머 세트와 접촉시키는 단계;(c) 표적 FIV 균주에 특이적인 핵산 서열을 갖는 단계 (b)로부터의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 DNA 시료 내의 표적 FIV 균주를 동정하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 제 1 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 서열 3 및 서열 4의 핵산 서열을 포함하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 서열 5 및 6, 서열 7 및 8, 서열 9 및 10, 서열 11 및 12, 서열 13 및 14, 및 서열 15 및 16으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 상기 표적 FIV 균주가 FIVPet, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2 및 FIVShi로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열 3, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 및 서열 16으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 서열 1 또는 서열 2에 도시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 FIV 펩티드.
- 제 33항의 FIV 펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
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