ES2242967T3 - Vacunas contra el vif multi-subtipo. - Google Patents

Vacunas contra el vif multi-subtipo.

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ES2242967T3 ES96928989T ES96928989T ES2242967T3 ES 2242967 T3 ES2242967 T3 ES 2242967T3 ES 96928989 T ES96928989 T ES 96928989T ES 96928989 T ES96928989 T ES 96928989T ES 2242967 T3 ES2242967 T3 ES 2242967T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y COMPOSICIONES NUEVAS PARA PROTEGER A LOS GATOS DE LA INFECCION POR UN GRUPO EXTENSO DE CEPAS DEL FIV UTILIZANDO UNA VACUNA DE MULTISUBTIPOS DEL FIV. SE DESCRIBEN VACUNAS DE MULTISUBTIPOS DEL FIV QUE CONTIENEN VIRUS COMPLETOS EXENTOS DE CELULAS O LINEAS CELULARES INFECTADAS CON LOS VIRUS. SE DESCRIBEN TAMBIEN LOS METODOS DE VACUNACION DE GATOS CON LAS COMPOSICIONES DE LA VACUNA. LOS GATOS VACUNADOS DE ACUERDO CON LOS METODOS Y LAS COMPOSICIONES DE LA PRESENTE INVENCION MUESTRAN RESPUESTAS INMUNITARIAS HUMORALES Y CELULARES PROTECTORAS CONTRA EL FIV CUANDO SON ESTIMULADOS CON CEPAS HOMOLOGAS O HETEROLOGAS DEL FIV. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A NUEVAS LINEAS CELULARES FELINAS QUE SON SENSIBLES A LA INFECCION POR EL FIV Y A SUS METODOS DE USO.

Description

Vacunas contra el VIF multi-subtipo.
Antecedentes de la invención
Los gatos domésticos están sometidos a infecciones por diversos retrovirus, incluyendo el virus de la leucemia felina (FeLV), el virus del sarcoma felino (FeSV), el oncoronavirus de tipo C endógeno (RD-114), y el virus formador de sincitios felino (FeSFV). De entre ellos, el FeLV es el patógeno más significativo, causando diversos síntomas incluyendo neoplasmas linforreticular y mieloide, anemia, trastornos en los que media la respuesta inmunitaria, y un síndrome de inmunodeficiencia que es similar al síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA). Recientemente, un mutante particular de FeLV defectuoso para la replicación, denominado FeLV-SIDA, se ha asociado más particularmente con unas propiedades inmunosupresoras.
El descubrimiento del lentivirus T-linfotrópico felino (actualmente denominado virus de inmunodeficiencia felina, VIF) se presentó por primera vez en Petersen et al. (1987). Las características del VIF se presentaron en Yamamoto et al. (1988a); Yamamoto et al. (1988b); y Ackley et al. (1990). Los datos seroepidemiológicos han demostrado que la infección por VIF es autóctona de los felinos domésticos y salvajes en todo el mundo. Se ha asociado una gran variedad de síntomas con la infección por VIF, incluyendo aborto, alopecia, anemia, conjuntivitis, rinitis crónica, enteritis, gingivitis, hematoquecia, anormalidades neurológicas, periodontitis, y dermatitis seborreica. Los rasgos inmunológicos de los gatos domésticos infectados por VIF es una depleción crónica y progresiva de los linfocitos de sangre periférica CD4^{+} felino, una reducción en la proporción celular CD4:CD8 y, en algunos casos, un incremento en los linfocitos portadores de CD8. Basado en las características moleculares, bioquímicas e inmunopatológicas, la infección por VIF de los gatos se considera actualmente como un modelo de SIDA felino mejor que el FeLV-FSIDA.
La clonación y el análisis de las secuencias del VIF se han presentado en Olmsted et al. (1989a); Olmsted et al. (1989b); y Talbott et al. (1989). Hosie y Jarret (1990) describen la respuesta serológica de los gatos infectados por VIF. Los subtipos del virus VIF se pueden clasificar según el inmunotipo basado en el nivel de anticuerpos de neutralización por reacción cruzada producidos por cada cepa (Murphy y Kingsbury, 1990). Recientemente, los virus se han clasificado en subtipos según el genotipo basado en la homología de la secuencia de nucleótidos. A pesar de que la clasificación en subtipos de VIH y VIF se basa en el genotipo (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; y Louwagie et al., 1993), se sabe poco acerca de la correlación entre el genotipo y el inmunotipo de los subtipos. Los aislados virales de VIF se clasifican habitualmente en cuatro subtipos: A, B, C y D. (Kakinuma et al., 1995). Los aislados infecciosos y los clones moleculares infecciosos se han descrito para todos los subtipos de VIF excepto para el subtipo C (Sodora et al, 1994). El subtipo C de VIF se identificó únicamente a partir del ADN celular de los gatos de Canadá (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; Kakinuma et al., 1995).
Una dificultad mayor en el desarrollo de una vacuna contra el VIF se ha presentado en la identificación de una estrategia para una vacuna que sea eficaz contra una amplia gama de cepas de VIF incluyendo las aisladas de diferentes subtipos o categorías. Se ha conseguido una vacuna para la profilaxis contra VIF contra cepas homólogas o ligeramente heterólogas utilizando una vacuna de cepa única, pero no contra la estimulación con cepas de moderada a altamente heterólogas (Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1993). De este modo, sigue existiendo la necesidad de obtener una vacuna que proteja contra múltiples subtipos de VIF.
Resumen de la invención
El objeto de la invención se refiere a una vacuna que provoque una amplia gama de respuesta inmunitaria protectora contra las infecciones por VIF en un huésped animal. Especialmente, el objeto de la invención se refiere a una vacuna de VIF multisubtipo que se prepara utilizando unos aislados virales libres de células de diferentes subtipos de VIF, o una combinación de líneas celulares infectadas cada una de ellas con diferentes virus VIF prototipo a partir de un subtipo diferente. Los gatos vacunados con las vacunas VIF del objeto de la invención desarrollaron unas respuestas inmunitarias humoral y celular frente a cepas VIF homólogas y heterólogas.
El objeto de la invención se refiere asimismo a unas líneas celulares felinas nuevas que son susceptibles a la infección por múltiples subtipos de VIF. Las líneas celulares objeto de la invención resultan útiles para la propagación y producción de múltiples subtipos de VIF, así como para la utilización en vacunas VIF según los procedimientos del objeto de la invención. Además, las líneas celulares se pueden utilizar asimismo en lugar de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) en los ensayos de neutralización viral de VIF de un antisuero felino.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los niveles de la transcriptasa inversa (RT) de VIF_{Bang} y VIF_{Shi} producido después de la infección de las líneas celulares FeT-1C y FeT-J con dichas cepas VIF.
La Figura 2 muestra la inmunorreacción de los anticuerpos anti-VIF de unos gatos vacunados con un subtipo dual con proteínas de VIF detectadas por inmunotransferencia. El número que se encuentra sobre cada transferencia representa el número de vacunaciones recibidas por cada animal cuando se ensayó el suero.
La Figura 3 muestra la inmunorreacción de los anticuerpos anti-VIF de gatos vacunados con un subtipo triple con proteínas de VIF detectadas por inmunotransferencia. El número que se encuentra sobre cada transferencia representa el número de vacunaciones recibidas por cada animal cuando se ensayó el suero.
La Figura 4 muestra la inmunorreactividad de los anticuerpos anti-VIF de gatos vacunados con un subtipo triple con un péptido VIF SU-V3-2 detectado mediante ELISA.
La Figura 5 muestra la inmunorreactividad de los anticuerpos anti-VIF de gatos vacunados con un subtipo triple con un péptido VIF TM-C1 detectado mediante ELISA.
La Figura 6 muestra los títulos de anticuerpos neutralizados por reacción cruzada del suero procedente de gatos infectados con cualquiera de VIF_{Pet} (Ap), VIF_{Dix} (A_{D}), VIF_{UK8} (A_{U}), VIF_{Bang} (B_{B}), VIF_{Aom1} (B_{A}) y VIF_{Shi} (D_{S}). El suero de la preinfección (columna 1), 6 meses postinfección (columna 2), y 12 meses postinfección (columna 3) se ensayaron contra el subtipo A VIF_{Pet}, subtipo B VIF_{Bang} y el subtipo D VIF_{Shi} en la línea celular FeT-1C. Por lo menos se ensayaron tres gatos por cada cepa y los resultados muestran un título de NV de un gato representativo de cada cepa. Se obtuvieron resultados similares utilizando PBMC primarias para cada ensayo NV.
Breve descripción de las secuencias
SEC ID Nº 1 es una secuencia de aminoácido de un péptido de la superficie de la envuelta de VIF denominada SV-V3-2.
SEC ID Nº 2 es una secuencia de aminoácido de un péptido transmembrana de VIF denominado TM-C1.
SEC ID Nº 3 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 4 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 5 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 6 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 7 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 8 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 9 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 10 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 11 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 12 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 13 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 14 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 15 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
SEC ID Nº 16 es una secuencia nucleotídica de un cebador de VIF para PCR.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la invención se refiere a unos procedimientos y a unas composiciones de vacunas nuevos útiles para la inducción de una inmunidad protectora contra la infección por VIF en un huésped animal susceptible. Las composiciones de vacunas descritas en la presente memoria, cuando se administran a un huésped animal, inducen unas respuestas inmunitarias humoral y celular contra la infección por cepas homólogas o heterólogas de VIF. Las composiciones de vacunas pueden comprender o bien aislados virales de VIF libres de células o bien líneas celulares infectadas por VIF. En una forma de realización preferida, la composición del objeto de la invención comprende unas cepas de VIF de dos subtipos diferentes. Preferentemente, la composición de la vacuna comprende tres cepas de VIF, cada cepa de un subtipo de VIF diferente. Más preferentemente, por lo menos una cepa de VIF de cada VIF subtipo A, Subtipo B y subtipo D está incluida en la composición de la vacuna.
En una forma de realización específica, la composición de la vacuna comprende unas líneas celulares infectadas con VIF_{Pet-} y VIF_{Shi-}. En otra forma de realización, las composiciones de la vacuna comprenden líneas celulares infectadas con VIF_{Pet}-, VIF_{Bang-} y VIF_{Shi-}. La utilización de otras cepas de VIF representativas de todos o una parte de los subtipos VIF está especialmente contemplada en el objeto de la invención. Por ejemplo, VIF_{Dix} o VIF_{UK8} puede estar incluido en las composiciones de las vacunas además o en lugar de VIF_{Pet} con el fin de proporcionar un virus prototipo del VIF subtipo A. Se pueden realizar adiciones o sustituciones similares con otras cepas de VIF para los virus propotipos de VIF subtipo B y D.
Tal como se ha descrito en la presente memoria, las composiciones de las vacunas de la presente invención pueden comprender virus VIF completo libre de células, o porciones de los virus, proteínas y polipéptidos de VIF, así como unas líneas celulares infectadas con VIF, o una combinación de virus libre de células y líneas celulares infectadas. Las composiciones de vacunas que comprenden líneas celulares infectadas con VIF pueden comprender múltiples líneas celulares, cada una de ellas infectada con un subtipo de VIF diferente. Las composiciones de la vacuna de la invención engloban asimismo un vector viral recombinante basado en unos constructos de VIF que puede comprender, por ejemplo, VIF env, gag/pro, o env-gag/pro. Cualquier vector viral adecuado que se pueda utilizar para preparar unos constructos vector recombinante/VIF está contemplado para la utilización en el objeto de la invención, Por ejemplo, se pueden utilizar los vectores virales derivados de adenovirus, poxvirus, herpesvirus felino, viruela de la vaca, viruela del canario, viruela de los insectos, viruela del cerdo u otros conocidos por el experto en la materia con las composiciones y procedimientos de la presente invención. Los vectores polinucleótidos recombinantes que codifican y expresan los componentes de VIF se pueden construir utilizando las técnicas de ingeniería genética estándar conocidas por el experto en la materia. Además, las diversas composiciones de vacunas descritas en la presente memoria se pueden utilizar separadamente y en combinación con cualquier otra. Por ejemplo, las inmunizaciones primarias de un animal pueden utilizar constructos de vector recombinante basados en VIF, que presentan unos componentes de subtipo simple o múltiple, seguido por intensificadores secundarios en las composiciones de vacuna que comprenden líneas celulares infectadas con VIF inactivado. Otros protocolos de inmunización con las composiciones de vacuna de la invención resultan evidentes para los expertos en la materia y están contemplados en el alcance de la presente
invención.
Las vacunas contra el VIF multi-subtipo descritas específicamente en la presente memoria se ensayaron para la inmunogenicidad y eficacia en los gatos. Los gatos libres de patógenos específicos (SPF) vacunados con las composiciones objeto de la invención se monitorizaron para las respuestas inmunitarias humoral y celular antes y después de la estimulación con cepas de VIF homológas y heterólogas. Las respuestas humorales se monitorizaron mediante la medición de la actividad del anticuerpo de neutralización viral (NV) y las respuestas celulares se monitorizaron mediante la actividad del linfocito T citotóxico (CTL). Los sueros y los inmunocitos de los gatos vacunados se ensayaron in vitro para las actividades de NV y CTL, respectivamente, contra las cepas VIF homologas y heterólogas, y demostraron que las vacunas pueden producir un rango amplio de protección contra la infección por VIF. Según los resultados del objeto de la invención, mediante la combinación de virus prototipo aislados de diferentes subtipos de VIF, o mediante la combinación de células individuales infectadas con virus prototipos de diferentes subtipos, se puede producir una vacuna contra el VIF multi-subtipo eficaz.
Todas las cepas de VIF, además de aquellas ejemplificadas específicamente en la presente memoria, están contempladas para su utilización en el objeto de la invención. Se ha descrito en la literatura un número de aislados de VIF y son bien conocidos por los expertos en la materia. Se ha descrito el VIF_{Pet} en la patente US nº 5.037.753. Otros VIF aislados que han sido descritos se puede aislar fácilmente a partir de gatos infectados por expertos en la materia utilizando unas técnicas estándar. Los procedimientos para el aislamiento y el cultivo de VIF se describen en las patentes US nº 5.037.753 y nº 5.118.602.
Las líneas celulares nuevas ejemplificadas en la presente memoria se pueden utilizar en los procedimientos de vacunas y composiciones de la presente invención. Otras células o líneas celulares que son susceptibles a la infección por las cepas de VIF, incluyendo las células mononucleares de sangre periférica, están asimismo contempladas para su utilización en la presente invención.
Los polipéptidos naturales, recombinantes o sintéticos de las proteínas virales de VIF, y sus fragmentos de péptidos, se pueden asimismo utilizar como composiciones de vacunas según los procedimientos de la invención. En una forma de realización preferida, los polipéptidos de VIF derivados de múltiples subtipos de VIF se combinan en una composición de vacuna y se utilizan para vacunar un huésped animal. Por ejemplo, los polipéptidos basados en la glicoproteína de la envuelta de VIF de por lo menos dos cepas VIF prototipo de diferentes subtipos se pueden combinar en la vacuna. Los polipéptidos pueden ser homólogos a una cepa o bien pueden comprender polipéptidos "híbridos" o "quiméricos" cuyas secuencias de aminoácidos derivan de polipéptidos de unión o enlace de por lo menos dos subtipos de VIF distintos. Los procedimientos para la preparación de polipéptidos VIF son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los polipéptidos de VIF se pueden preparar utilizando unos procedimientos de síntesis en fase sólida (Merrifield, 1963). Los polipéptidos de VIF se pueden asimismo preparar utilizando unas técnicas de ADN recombinante en las que la molécula de polinucleótido que codifica para la proteína o péptido de VIF se expresa en la célula huésped, tal como una bacteria, una levadura, unas líneas celulares de mamíferos, y la proteína expresada se purifica utilizando las técnicas estándar de la materia.
La presente invención se refiere asimismo a unas líneas celulares T felinas nuevas que son susceptibles a la infección por VIF. Se ejemplifican específicamente tanto las células dependientes de interleucina 2 (IL-2) como las independientes. Las líneas celulares designadas como FeT-1C y FeT-J se describen en la presente memoria. La línea celular FeT-1C es IL-2 dependiente, mientras que la línea celular FeT-J es IL-2 independiente. Las líneas celulares del objeto de la invención son útiles para proporcionar un vehículo para la inmunización con VIF de los gatos, así como para la propagación y producción de las cepas virales de VIF in vitro. Tanto las líneas celulares no infectadas IL-2 dependientes FeT-1C y la IL-2 independiente FeT-J se ensayaron aproximadamente 20 veces para la actividad de transcriptasa reversa (RT) en los fluidos de cultivo y para la secuencia proviral de VIF mediante PCR y se confirmaron negativas para VIF. La línea celular FeT-J resultó altamente infectable por todas las cepas de VIF ensayadas, incluyendo VIF_{Shi}, VIF_{Dix}, VIF_{UK8}, VIF_{Pet} y VIF_{Bang} pero resultó más difícil de infectar directamente con
VIF_{Shi}.
El objeto de la invención se refiere además a unos productos celulares producidos por las líneas celulares de la presente invención. Los productos celulares se pueden aislar y detectar utilizando unos procesos conocidos por los expertos técnicos. Los anticuerpos de las líneas celulares se pueden asimismo producir utilizando los procedimientos conocidos y están contemplados en el objeto de la invención.
Las líneas celulares VIF no infectadas denominadas FeT-1C (número de acceso a ATCC CRL 11968) y FeT-J (número de acceso a ATCC CRL 11967) se depositaron ambas en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland el 24 de Agosto 1995. Las líneas celulares infectadas VIF_{Bang-} (número de acceso a ATCC 11975) y VIF_{Shi-} (número de acceso a ATCC 11976) se depositaron en la American Type Culture Collection el 25 de Agosto de 1995.
Según los procedimientos del objeto de la invención, las composiciones de vacuna VIF descritas en la presente memoria se administran a los huéspedes susceptibles, típicamente gatos domésticos, en una cantidad y modo eficaces para inducir una respuesta inmunitaria contra la consiguiente estimulación o infección del huésped por VIF. Los vacunas se administran típicamente parenteralmente, por inyección, por ejemplo, o bien subcutánea, o intraperitoneal, o intramuscularmente. Otras formas de administración adecuadas incluyen la administración oral o nasal. Habitualmente, las vacunas se administran a un huésped por lo menos dos veces, con un intervalo de una o más semanas entre cada administración. Sin embargo, se contemplan otros regímenes para la administración inicial o administración adicional de la vacuna, y puede depender del juicio del médico y el huésped animal a tratar en parti-
cular.
Las composiciones de las vacunas del objeto de la invención se pueden preparar mediante procesos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las vacunas se preparan típicamente como inyectables, es decir soluciones líquidas o suspensiones. Las vacunas se administran de un modo que es compatible con la forma de dosificación, y en tales cantidades de modo que sean eficaces terapéuticamente e inmunogénicas en el recipiente. Las dosificaciones óptimas y las pautas de administración para una formulación de vacuna particular se pueden determinar fácilmente por el experto en la materia.
En una formulación de una vacuna, los virus y las células deben estar inactivados o bien atenuados utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los virus completos y las células infectadas se pueden inactivar o atenuar mediante la exposición a paraformaldehído, formalina, fenol, luz ultravioleta, temperatura elevada y similares. La cantidad de virus VIF completo libre de células en una dosis de vacuna variará habitualmente dentro del intervalo desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg, y más habitualmente desde aproximadamente 0,2 mg a aproximadamente 2 mg. La dosificación para las composiciones de las vacunas que comprende líneas celulares infectadas con VIF contendrá habitualmente desde aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{8} células por dosis, y más habitualmente desde aproximadamente 5 x 10^{6} a aproximadamente 7,5 x 10^{7} células por
dosis.
Los virus o las células se combinaron típicamente con un adyuvante justo antes de la administración. Los adyuvantes utilizados en las formulaciones de la vacuna eran típicamente o bien treonil muramil dipéptido (MDP) (Byars et al., 1987) o una combinación de adyuvantes de Freud completo o incompleto. Una gran variedad de otros adyuvantes adecuados para la utilización en los procedimientos y vacunas del objeto de la invención, tales como alumbre, son bien conocidos en la técnica y están contemplados para la utilización en el objeto de la invención.
El objeto de la invención se refiere asimismo a un procedimiento nuevo para el ensayo de los anticuerpos de neutralización del virus (NV) en una muestra que utiliza líneas celulares no infectadas de la presente invención. A diferencia de las PBMC que caducan después de un número limitado de pases y no se propaga tan fácilmente como las células FeT-1C o FeT-J, las células FeT-1C y las FeT-J son líneas celulares establecidas y se pueden crioconservar fácilmente para una utilización futura. Los resultados obtenidos a partir de los ensayos NV que utilizan las células FeT-1C son mucho más reproducibles que los ensayos NV que utilizan PBMC porque las PBMC de diferentes gatos SPF presenta una variabilidad individual en la tasa de crecimiento celular y en la infectibilidad por VIF. Además, las PBMC para los ensayos NV deben ser obtenidas a partir de gatos SPF que requieren un alojamiento y mantenimiento libre de gérmenes con el fin de eliminar la posible infección in vivo que puede afectar los ensayos NV in vitro que utilizan PBMC. De este modo, una línea celular felina tal como FeT-1C que se puede infectar fácilmente con VIF de diferentes subtipos puede ser sustituida ventajosamente por PBMC en los ensayos
NV.
Las abreviaciones siguientes de las cepas VIF se utilizan en la presente memoria:
Cepa (subtipo) Abreviación
Petaluma (A) VIF_{Pet}
Dixon (A) VIF_{Dix}
UK8 (A) VIF_{UK8}
Bangston (B) VIF_{Bang}
Aomori-1 (B) VIF_{Aom1}
Aomori-2 (B) VIF_{Aom2}
Shizuoka (D) VIF_{Shi}
Materiales y procedimientos
Cultivos celulares: Todas las líneas celulares en suspensión se cultivaron en medio RPMI 1640 que contiene el 10% de suero bovino fetal inactivado por el calor (SBF), HEPES 10 mM (ácido N-2-hidroxietilpiperacina-n'-2-etanosulfónico), L-glutamina 2 mM, gentamicina a 50 \mug/ml y 2-mercaptoetanol al 5x10^{-5}M. Las células IL-2 dependientes se suplementaron con 100 U/ml de IL-2 recombinante humano (Cetus Corporation, Emeryville, California). Las células en suspensión se pasaron a una concentración celular de 0,5-4 x 10^{6} células/ml y se recultivaron en un medio de cultivo fresco dos veces por semana. Todas las células en monocapa se pasaron dos veces por semana a una concentración inicial de 2x10^{6} células/ml. Los fluidos de cultivo de tejidos (TCF) de células infectadas con VIF se extrajeron dos veces por semana, se centrifugaron a 3000 rpm durante 1 hora para eliminar las células residuales, y se almacenaron a una temperatura de -20ºC, a una temperatura de -70ºC para aquellos FCT programados para ser utilizados inmediatamente en un el ensayo. Las células susceptibles a VIF (1x10^{6} células/ml) se infectaron con VIF que presenta un actividad transcripatasa reversa (TR) de aproximadamente 30.000 cpm/ml.
Purificación de VIF. Los fluidos de cultivo celular de líneas celulares infectadas con VIF se centrifugaron individualmente desde 2000 a 3000 rpm durante 1 hora para eliminar células. Los virus en los FCT se sedimentaron mediante ultracentrifugación a 16000 rpm durante 2 horas, y se purificaron mediante ultracentrifugación primero en un gradiente de sacarosa discontinuo al 10/50% (p/v) y después en un gradiente de sacarosa continuo al 10/50% (Pederson et al., 1987; Yamamoto et al., 1988). Cada uno de los aislados virales se inactivó con paraformaldehído estéril al 1,25% (filtrado estérilmente con un filtro 0,22 \mum) durante 18 horas y a continuación se dializaron extensamente contra PBS estéril. Los virus inactivados se diluyeron a una concentración de 500 \mug/ml en PBS estéril y 250 \mug/0,5 ml de cada cepa se colocaron en un tubo de microcentrifuga estéril y se almacenaron a una temperatura de -70ºC. Las cepas inactivadas se descongelaron a temperatura ambiente y 250 \mug de virus inactivado en 0,5 ml de PBS estéril se combinaron con 0,5 ml de adyuvante justo antes de la inmunización. Las líneas celulares infectadas con VIF se inactivaron separadamente con paraformaldehído estéril al 1,25% durante 18 horas, se lavaron 3 veces con PBS estéril, se resuspendieron en PBS estéril nuevo a una concentración de aproximadamente 5,0 x 10^{7} células/ml en unos tubos estériles y se almacenaron a una temperatura de 4ºC. Típicamente, aproximadamente 2,5 x 10^{7} células infectadas inactivadas en 0,5 ml de PBS estéril se combinaron con 0,5 ml de adyuvante justo antes de la inmunización. Se utilizaron 250 \mug/0,5 ml
de treonil muramil dipéptido (adyuvante MDP MF 75,2; Chiron Corporation, Emeryville, CA) como adyuvante.
Ensayo CTL: Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se estimularon con Concanavalina A (Con A) durante 3 días antes de la infección con VIF durante 10 días (Song et al., 1992). Dichas células sirvieron como células diana para el ensayo de CTL. La actividad CTL se generó mediante el cocultivo de PBMC estimulado con Con-A con PBMC autólogas infectadas con VIF e inactivados con radiación y rayos UV durante 5 días. Dichas células sirvieron como células efectoras estimuladas. El día del ensayo, las células diana se marcaron con 50 \muCi de Na^{51} Cr O_{4} durante 1 a 3 horas, se lavaron 3 veces, y después se añadió un número determinado de células diana marcadas (5x10^{4} células/pocillo) a las placas de microtitulación. Se añadieron las células efectoras por triplicado en unas proporciones diferentes de célula efectora/célula diana (por ejemplo, 100:1; 50:1, y 10:1). Se centrifugaron las placas durante 1 minuto a 400 rpm y se incubaron a una temperatura de 37ºC durante 4 horas. Las células Control marcadas con Cr^{51} se lisaron con un detergente para obtener unos niveles máximos de liberación. Los sobrenadantes de los pocillos de la muestra del ensayo se recogieron y se cuantificó la radiación utilizando un contador gamma. La liberación espontánea se determinó mediante la incubación de las células diana marcadas con Cr^{51} en ausencia de células efectoras. El porcentaje de citotoxicidad específica se calculó tal como a continuación:
% citotoxicidad =100) \frac{\text{(media de liberación de cpm del ensayo - media de la liberación cpm espontánea)}}{\text{(media de liberación máxima de cpm - media de liberación espontánea de cpm)}}
Inmunotransferencia y Ensayos de enzima unida inmunoabsorbentes (ELISA). El virus purificado por gradiente de sacarosa se utilizó como sustrato para un ensayo de inmunotransferencia tal como se ha descrito en Yamamoto et al., 1993. VIF_{Pet} de un cultivo tisular o de células infectadas se clarificó mediante una centrifugación a baja velocidad (2000 rpm durante 45 minutos), se concentró mediante ultracentrifugación (16.000 rpm durante 2 horas), y se purificó mediante ultracentrifugación en un gradiente continuo de sacarosa al 10/50% (p/v). El virus purificado mediante dicho proceso se utilizó como sustrato para el ensayo de inmunotransferencia.
Se utilizó una modificación de una técnica de inmunotransferencia descrita anteriormente (Yamamoto et al., 1991a). Las bandas de transferencia del virus se prepararon solubilizando el virus en SDS al 0,1%, seguido por una electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al 10% y una transferencia electroforética en una membrana de nitrocelulosa. Los muestras de suero de gatos vacunados se diluyeron al 1:50 en un tampón 3 (Cloruro sódico al 0,15 M; ácido edítico 0,001M; TRIS base, Tween 20 al 0,05%, y albúmina sérica bovina) y se incubaron con las bandas de transferencia del virus en unos pocillos separados en unas placas de inmunotransferencia durante 18 horas a una temperatura de 37ºC. Las bandas de transferencia se lavaron individualmente con una solución de lavado (NaCl 0,15 M y Tween 20 al 0,05% en agua desionizada), se incubaron con Ig G antigato biotinilada (Vector Laboratorios, Burlingame, CA) durante 1 hora a una temperatura de 37ºC, y se lavaron tres veces con una solución de lavado. Las bandas se incubaron después con Streptavidina conjugada con peroxidasa del rábano picante (Vector Laboratories) durante 30 minutos. Después de un lavado exhaustivo, cada banda se incubó en una solución de sustrato nueva (diaminobencidina al 0,05%, 400 \mug/ml de NiCl_{2}, y H_{2}O_{2} al 0,01% en un tampón TRIS al 0,1M, pH 7,4 ) a temperatura ambiente. La reacción se paró con un exceso de H_{2}O destilada con el establecimiento de unas bandas visibles, y las bandas se transfirieron en seco. Los pesos moleculares de las bandas en las inmunotransferencias se determinaron después mediante su comparación con la distancia de migración de los pesos moleculares estándar en una banda teñida previamente con negro amido. Los sueros controles positivos y negativos se incluyeron en cada análisis por inmunotransferencia a modo de controles internos para una evaluación diagnóstica.
El antígeno viral específico de ELISA se ha descrito con anterioridad (Yamamoto et al., 1991a; Yamamoto et al., 1993). El VIF_{Pet} purificado por gradiente de sacarosa y los péptidos de la envuelta de la superficie (SU) y los transmembrana (TM) tanto de las regiones conservadas (C) como de las variables (V) de VIF_{Pet} se colocaron en unas placas de Inmunolon de 96 pocillos (Dynatech Laboratorios, Inc., Chantilly, VA) a 250 ng/pocillo con un tampón de bicarbonato (pH 9,6) durante 12 a 18 horas a una temperatura de 37ºC y se utilizaron como sustratos para ELISA. La secuencia de aminoácidos del péptido SU-V3-2 es: Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp Glu Trp Arg Pro Asp Phe (SEC ID Nº 1); y la secuencia de aminácido del péptido TM-C1 es: Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile (SEC ID Nº 2). Los péptidos sintéticos se sintetizaron en un sintetizador de péptido Biosearch 9500 (Biosearch, San Rafael, CA) utilizando química de síntesis de péptido FMOC (Magazine et al, 1988). La pureza de los péptidos sintetizados se determinó mediante la presencia de un solo pico en una cromatografía líquida de fase reserva de alta resolución y se confirmó mediante el análisis de la secuencia de aminoácido realizada en la muestra del pico.
Las placas cubiertas de péptido se lavaron una vez con tampón 3 inmediatamente antes de su utilización. Las muestras de suero se diluyeron al 1:200 en un tampón 3 y se incubaron en los pocillos que contienen el antígeno VIF durante 1 hora a una temperatura de 37ºC, después se lavaron 6 veces. Los pocillos se lavaron con una solución de lavado, se incubaron con IgG anti-gato biotinilada (Vector Laboratories Burlingame, CA) durante 1 hora a una temperatura de 37ºC, después se lavaron 6 veces, se incubaron con Strepatavidina conjugada con la peroxidasa del rábano picante (Vector Laboratories) durante 1 hora a una temperatura de 37ºC. Los pocillos se lavaron 6 veces con una solución de lavado y se incubaron con un solución sustrato de ELISA (tetrametilbencidina 0,005% y H_{2}O_{2} al 0,015% en una solución de citrato al 0,96%) a temperatura ambiente. La reacción se paró con ácido fluorhídrico 0,1M con el establecimiento de una reacción de color visible en los estándares secuencialmente diluidos que consisten en unos sueros de gato VIF-positivo conocidos. La absorción de la luz se midió en un lector Biorad ELISA (Bio-rad Laboratorios, Hercules, CA) a una densidad óptica de 414 nm.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Los niveles de ADN proviral de las células infectadas se monitorizaron mediante PCR diferencial, que se desarrolló recientemente con el fin de distinguir cepas múltiples de VIF a partir del mismo o diferentes subtipos (Okada et al., 1994). Como medio para incrementar la sensibilidad de la PCR, se utilizaron los conjuntos de cebadores de PCR que se muestran en la Tabla 1. Se realizó la PCR en una reacción en dos etapas, primero con un par de cebadores externos (común para todas las cepas de VIF) bajo las condiciones descritas en Okada et al., 1994. En la segunda etapa de la PCR, se amplificó 1/25 del producto de la primera etapa utilizando los cebadores internos (específico para cada cepa de VIF). Utilizando la PCR insertada, se pueden distinguir las células infectadas con VIF_{Pet}, VIF_{UK8}, VIF_{Bang}, VIF_{Aom1}, VIF_{Aom2} y VIF_{Shi} de otras.
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La cantidad aproximada de ADN proviral por célula se determinó mediante una PCR semicuantitativa, en la que se prepararon diluciones variantes de ADN extraídos a partir de un número conocido de células. Por ejemplo, si se utilizaron 10^{5} células para la extracción de ADN, entonces una dilución de 10^{-5} de la preparación de ADN corresponderá aproximadamente al ADN presente en una sola célula. Se realizó la PCR de dichas diluciones variantes de ADN y la dilución final que proporcionó un resultado de PCR positivo se consideró como la dilución final. El número de células que corresponde a la dilución final se utilizó para determinar el porcentaje de células infectadas con el virus en una preparación de células determinada según la fórmula siguiente:
% de células infectadas = \frac{1}{Z} \ x \ 100
en la que Z = el número de células correspondiente a la dilución final.
Ensayo de la Transcriptasa Reversa (RT). La presencia de la ADN polimerasa dependiente de ARN (RT) se ensayó esencialmente en los sobrenadantes de cultivos celulares tal como se ha descrito por Rey et al. El ensayo de RT para la detección de VIF utilizó poli (rA)-oligo (dT_{12-18}) como un cebador molde exógeno, cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato diferentes, KCl 20 mM con Mg ^{++} como catión divalente y 5 \muCi timidina trifosfato [^{3}H] marcada (TTP) por muestra. Cinco \muCi [^{3}H] (TTP) proporcionaron un cantidad total media de 1.200.000 cpm utilizando la mezcla de fluido de centelleo (1 parte de xileno en 9 partes de recuento de centelleo biodegradable de Reserach Productos Internacional) en un contador de centelleo Beckman LS250 (Beckman Instruments, Inc., Palo Lato, CA). A modo de resultado, los valores de RT para las muestras ensayadas serán inferiores a 1.200.000 cpm/ml.
Ensayo de neutralización viral. Se ha descrito una estrategia para el desarrollo de ensayos NV cepa y subtipo específicos (Okada et al., 1994). Unas diluciones seriadas de suero inactivado por el calor se incubaron con 100 TCID_{50} de cada cepa durante 45 minutos a una temperatura de 37ºC en una placa de 24 pocillos antes de la adición de las células mononucleares de sangre periférica felina (PBMC) (4x10^{5} células/ml) o células FeT-1C susceptibles a VIF (2 x10^{5} células/ml). Después de 3 días de cultivo, las células se lavaron una vez con una solución de sal de Hank equilibrada para eliminar el virus residual del cultivo y después se resuspendieron las células en medio de cultivo nuevo (RPMI-1640 que contiene el 10% de suero bovino fetal inactivado por el calor, tampón HEPES a 10 mM, gentamicina a 50 \mug/ml, 2-mercaptoetanol a 5x10^{-5} M, y 100 Unidades/ml de IL-2 humana recombinante.). La infección de las células por el virus se monitorizó mediante ensayos de RT Mg^{++} dependiente de los fluidos de los cultivos extraídos los días 9, 12, 15 y 18 de cultivo. El suero se consideró positivo para los anticuerpos NV cuando la actividad RT era \leq 25% de cultivos control infectados que consisten en suero SPF.
A continuación se presentan unos ejemplos que ilustran los procesos, incluyendo el mejor modo, para la realización de la invención. Dichos ejemplos no deben ser considerados como limitativos. Todos los porcentajes son en peso y las proporciones de la mezcla de solvente son en volumen excepto en los casos en que se indica de otro modo.
Ejemplo 1 Líneas celulares infectadas con VIF
Se utilizó una nueva línea celular T felina interleucina 2 (IL 2) dependiente, denominada FeT-1C, que es una línea madre de un clon FeT-1M IL-2 dependiente, para establecer unas líneas celulares individuales crónicamente infectadas o bien con VIF_{Pet}, VIF_{Dix}, VIF_{UK8}, VIF_{Bang}, VIF_{Aom2} o VIF_{Shi}. El clon FeT-1M (también denominado VIF-Fet1M) se ha descrito en la patente US nº 5.275.813, que se ha incorporado en la presente memoria como referencia, y se utilizó para producir una línea celular IL-2 independiente, FL-4 (descrita también en la patente US nº 5.275.813), que produce crónicamente VIF_{Pet}. La línea celular FeT-1C es altamente infectable con diferentes aislados de los subtipos A, B y D de VIF. Los pasos a largo plazo de la línea celular FeT-1C disminuyen su infectabilidad, especialmente para el subtipo D de VIF; por lo tanto, el número de pasos debe ser inferior a aproximadamente 35 pasos para unas proporciones de infección óptimas de VIF o para su utilización en los ensayos de NV. La PCR semi-cuantitativa y el análisis del antígeno del núcleo viral indicaron que todas las líneas celulares expuestas a VIF fueron significativamente infectadas con unas cepas VIF individuales.
Se ha desarrollado asimismo una línea celular felina IL-2 independiente susceptible a la infección con VIF a partir de células FeT-1C. Dicha línea celular, denominada FeT-J, se puede infectar con VIF mediante cocultivo utilizando unas células o medio infectado con VIF. Por ejemplo, una línea celular FeT-1C infectada con VIF_{Bang} se cocultivó en ausencia de IL-2 con unas células FeT-J no infectadas para establecer una línea celular FeT-J infectada con VIF_{Bang} IL-2 independiente (denominada Bang/FeT-J). En el procedimiento de co-cultivo de infección, las células Bang/FeT-1C se combinaron con células FeT-J no infectadas a una proporción desde aproximadamente 2:1 a aproximadamente 10:1 (infectadas: no infectadas). La mezcla de las células se cultivó en un medio en ausencia de IL-2 durante varios días y las células FeT-1C se dejaron morir. Las células restantes consisten en células FeT-J infectadas con VIF_{Bang}. De este modo, las células FeT-1C infectadas con VIF se pueden utilizar para infectar las células Fe-T-J y establecer unas líneas celulares FeT-J IL-2 independientes infectadas con unos subtipos diferentes de VIF. El procedimiento de cocultivo con unas células FeT-1C infectadas con VIF dio como resultado unas líneas celulares FeT-J IL-2 independientes que producen unos niveles de moderados a elevados de los diferentes subtipos de
VIF.
La línea celular FeT-1C se infectó también con VIF_{Shi} y se pasó extensamente para producir una línea celular IL-2 dependiente denominada Shi/FeT-1C. La línea celular Shi/FeT-1C se cocultivó más tarde con FeT-J en ausencia de IL-2 y la línea celular infectada con VIF_{Shi} IL-2 independiente resultante se denominó Shi/FeT-J. La línea celular Shi/FeT-J IL-2 independiente produce unos niveles de VIF_{Shi} superiores a los de línea celular Shi/FeT-1C IL-2 dependiente (Figura 1).
El desarrollo de una línea celular FeT-J infectada con VIF_{Bang} se preparó asimismo sin la utilización de una línea celular FeT-1C. La línea celular FeT-J se infectó directamente con inóculo VIF_{Bang} libre de células y se pasó extensamente sin IL-2. La línea celular productora resultante de VIF_{Bang} IL-2 independiente se denominó Bang/FeT-J. La línea celular Bang/FeT-J produjo unos niveles superiores de VIF_{Bang} a la línea celular Bang/FeT-1C IL-2 dependiente que se desarrolló mediante la infección de la línea celular FeT-1C con VIF_{Bang} (Figura 1).
Ejemplo 2 Vacunas contra el VIF multi-subtipo
Las células infectadas con VIF se eliminaron de los sobrenadantes mediante centrifugación, se inactivaron y se utilizaron como vacunas. De forma similar, el virus VIF completo se sedimentó a partir del sobrenadante infectado libre de células mediante ultracentrifugación y se inactivó. Tanto las células infectadas como los virus se inactivaron mediante el tratamiento con paraformaldehído al 1,25% durante 24 horas a una temperatura de 5ºC, seguido de un lavado exhaustivo o por diálisis contra PBS, respectivamente. Dicho procedimiento inactiva eficazmente el VIF sin pérdida de inmunogenicidad. Los inmunógenos de VIF producidos según el objeto del procedimiento son altamente eficaces para la inducción de inmunidad protectora (Yamamoto et al., 1993; Yamamoto et al., 1991a; Yamamoto et al., 1991b). Se ha contemplado que los asilados virales atenuados se pueden asimismo utilizar en las composiciones de vacuna del objeto de la invención.
A pesar de que la línea celular FeT-1C infectada con VIF_{Shi} se superinfectó con la cepa VIF_{Pet} para producir una única línea celular infectada con múltiples subtipos de VIF (por ejemplo; una línea celular FeT-1C multi-subtipo A/D), durante los dos meses de co-infección los niveles provirales de VIF_{Shi} disminuyeron del 50% a menos del 5% mientras que los niveles provirales de VIF_{Pet} aumentaron concomitantemente hasta aproximadamente el 50%. De este modo, el mantenimiento de una línea celular única infectada con múltiples subtipos de VIF para la utilización como una vacuna VIF no es la forma de realización preferida del objeto de la invención.
Por consiguiente, en una de las formas de realización del objeto de la invención, las composiciones de vacuna se desarrollaron a partir de dos líneas celulares individuales, infectándose cada una de ellas con un subtipo de VIF diferente. En una forma de realización específica, la composición de vacuna de subtipo dual comprendía una combinación de una línea celular infectada con VIF subtipo A (Per/FL-4) con una línea celular infectada con VIF subtipo D (Shi/FeT-1C). Las líneas celulares infectadas con el subtipo A y el subtipo D se inactivaron tal como se ha descrito, combinadas en un número de células igual (2,5 x 10^{7} células de cada una en 250 \mug de MDP) y se utilizaron para inmunizar a los gatos. Se vacunaron tres gatos SPF con unas células Pet/FL-4 inactivadas y se vacunaron otros cuatro gatos con células Shi/FeT-1C inactivadas (2,5 x 10^{7} células/dosis). Después de una serie de cuatro vacunaciones, la vacuna de subtipo dual (Pet/FL-4 y Shi/FeT-1C) indujo unos anticuerpos anti-VIF, incluyendo unos títulos de anticuerpos NV significativos, para ambas cepas VIF ensayadas (Figura 2 y Tabla 2, Ensayo 1). Cuatro gatos vacunados con el subtipo dual (Pet/FL-4 y Shi/Fet-1C) se estimularon con VIF_{Bang}(50 CID_{50}). Los tres gatos vacunados con Pet/FL-4 y dos de los vacunados con Shi/FeT-1C se estimularon con 50 CID_{50} de VIF_{Bang}. Los dos gatos restantes vacunados con Shi/FeT-1C se estimularon con 50 CID_{50} de VIF_{Shi}.
Todos los gatos vacunados con el subtipo dual fueron negativos para VIF_{Bang} mediante el asilamiento del virus y la PCR de PBMC a las 6 semanas postinfección (pi), mientras que todos los gatos inmunizados simuladamente fueron positivos tanto para VIF_{Bang} como para VIF_{Shi} mediante el asilamiento del virus y la PCR de PBMC a las 6 semanas post-infección (Tabla 2, Ensayo 1). Por el contrario, un gato de cada uno de los grupos vacunados con Pet/FL-4 y vacunados con Shi/FeT-1C que fueron estimulados con VIF_{Bang} fueron positivos para VIF_{Bang}. Tal como se esperaba, todos los gatos vacunados con VIF_{Shi} y después estimulados con VIF_{Shi} fueron negativos para VIF_{Shi} a las 6 semanas post-infección. De este modo, la vacuna subtipo dual especialmente ejemplificada previno o retrasó la infección contra una estimulación con un VIF_{Shi} homólogo así como contra la estimulación contra un VIF_{Bang} heterólogo.
Los gatos vacunados con el subtipo dual (células Pet/FL-4 y células Shi/FeT-1C) desarrollaron unos anticuerpos para VIF específicos para la proteína del núcleo viral p25 (también denominada VIF p28) después de la segunda inmunización (Figura 2). Se demostraron unos títulos de anticuerpos superiores a otros antígenos virales después de la tercera y cuarta inmunizaciones. Los anticuerpos NV para VIF_{Pet} se desarrollaron después de la segunda inmunización, mientras que los anticuerpos NV para VIF_{Shi} se desarrollaron después de la cuarta inmunización (Tabla 4). Las respuestas CTL a VIF_{Pet} y VIF_{Shi} se detectaron tan pronto como se produjo la tercera inmunización en todos los gatos ensayados (Tabla 3) y unas respuestas CTL más fuerte en ambas cepas se desarrollaron después de la cuarta inmunización. Además, dos de tres gatos ensayados desarrollaron respuestas CTL a VIF_{Bang} después de la cuarta inmunización. Los resultados indicaron que después de 4 vacunaciones, la vacuna subtipo dual indujo unas respuestas fuerte frente a VIF_{Pet} y VIF_{Shi} (Tabla 3) y más anticuerpos VIF, incluyendo los títulos de anticuerpos NV, para ambas cepas VIF (Tabla 4).
Los gatos inmunizados con las células Shi/FeT-1C inactivadas desarrollaron unos anticuerpos VIF específicos para la proteína viral del núcleo p25 después de la segunda inmunización y anticuerpos para otros antígenos virales después de la tercera inmunización (Figura 2). Los anticuerpos NV para VIF_{Shi} en dichos gatos se desarrollaron después de la cuarta inmunización, mientras que los anticuerpos para VIF_{Pet} no fueron detectados a lo largo de las inmunizaciones. Ambos gatos vacunados con Shi/FeT-1C desarrollaron unas respuestas CTL a VIF_{Shi} sólo después de la cuarta inmunización pero no desarrollaron unas respuestas CTL a VIF_{Pet}, incluso después de la cuarta inmunización
(Tabla 3).
Los gatos inmunizados con las células Pet/FL-4 desarrollaron anticuerpos frente a p25 después de la segunda inmunización (Figura 2) y a otros antígenos virales, incluyendo anticuerpos NV para VIF_{Pet}, después de la segunda a tercera inmunización (Tabla 4). Las únicas respuestas CTL detectadas en los gatos inmunizados con las células Pet/FL-4 fueron para VIF_{Pet}. En conjunto, la vacuna contra el VIF de subtipo dual indujo unos títulos de anticuerpos NV más rápidos y superiores y unas respuestas CTL para ambas cepas de VIF a los de la vacuna de tipo simple. Los gatos SPF simuladamente inmunizados no desarrollaron anticuerpos virales, anticuerpos NV, o respuestas CTL anti-VIF.
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(Tabla pasa a página siguiente)
2
3
4 
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En una forma de realización preferida, la composición de la vacuna objeto de la invención comprende una vacuna VIF de subtipo triple preparada a partir de tres líneas celulares, cada línea celular se ha infectado con una cepa viral de subtipo de VIF diferente (A o B o D). Se inmunizaron tres gatos libres de patógenos con una vacuna de un subtipo triple (VIT_{Pet} + VIF_{Bang} + VIF_{Shi}). Se inmunizaron otros gatos con unas vacunas de subtipo triple VIF_{Bang} para evaluar la inmunogenicidad de VIF_{Bang} macrofagotrópico como componente de la vacuna. Los resultados de los títulos de los anticuerpos NV indican que tanto las vacunas del subtipo triple (VIT_{Pet} + VIF_{Bang} + VIF_{Shi}) como del subtipo único VIF_{Bang} proporcionaron unos títulos de anticuerpo antiviral elevado incluso después de la segunda inmunización (Tabla 2, ensayo II y Tabla 5). De este modo, tanto el VIF linfotrópico como el macrófagotrópico se pueden utilizar como componentes de las composiciones de las vacunas de la presente invención.
Los tres gatos SPF inmunizados con una combinación de las células Pet/IL-4 inactivadas, Bang/FeT-J inactivadas, y Shi/FeT-1C inactivadas (2x10^{7} células en 250 \mug totales de MDP) desarrollaron unos anticuerpos VIF específicos para la proteína del núcleo viral p25 y a otros antígenos virales, incluyendo la proteína VIF SU y TM de la envuelta, después de la segunda inmunización (Figuras 3,4,5). Los anticuerpos NV frente a VIF_{Pet}, VIF_{Bang} y VIF_{Shi} se desarrollaron en la mayoría de los gatos justo después de la segunda inmunización y en todos los gatos mediante la tercera inmunización (Tabla 5). Además, un gato presentó anticuerpos NV que tuvieron una reacción cruzada con VIF_{UK8} después de la tercera inmunización. Cuatro gatos SPF inmunizados sólo con unas células Bang/FeT-J inactivadas desarrollaron anticuerpos VIF específicos para la proteína del núcleo viral p25 y a otros antígenos virales después de la segunda inmunización (Figura 3). Los anticuerpos NV contra VIF_{Bang} en dichos gatos se desarrollaron después de la segunda inmunización (Tabla 5), mientras que los anticuerpos NV contra VIF_{Pet} y VIF_{UK8} no se detectaron a lo largo de las inmunizaciones. Las respuestas CTL de los gatos inmunizados tres veces con la vacuna VIF de subtipo triple (células Pet/FL-4, Bang/FeT-J y Shi/FeT-1C) de las células diana de subtipo VIF A, B y D se muestran en la Tabla 6. Se detectaron las respuestas CTL para los tres subtipos VIF ensayados. De este modo, la vacuna de subtipo triple indujo una amplia respuesta CTL y unos títulos de anticuerpo NV y de la envuelta SU más rápidas y superiores a las de la vacuna de subtipo simple. Ni los FeT-J no infectados no los gatos SPF inmunizados como control desarrollaron unos anticuerpos virales o anticuerpos NV.
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(Tabla pasa a página siguiente)
5
6
Ejemplo 3 Anticuerpos NV para los subtipos de VIF
Se desarrolló asimismo un ensayo para los anticuerpos NV para VIF utilizando las células FeT-1C del objeto de la invención. Los sueros de los gatos infectados con VIF_{Pet} y los gatos SPF vacunados con unas células Pet/FL-4 inactivadas o virus VIF_{Pet} inactivados se ensayaron para el título de anticuerpos NV utilizando o bien las células FeT-1C o bien PBMC según el procedimiento de ensayo NV descrito en la presente invención. Se utilizaron los sueros de dos gatos SPF que no se vacunaron y VIF no infectado como suero control. Los sueros de los gatos vacunados e infectados con VIF presentaron un título de anticuerpos NV 1000 o superior, mientras que el suero de los gatos SPF no vacunados presentaban unos títulos de anticuerpos NV no detectable. El ensayo NV basado en FeT-1C proporciona unos resultados de título de anticuerpos NV comparables a los obtenidos utilizando PBMC primario de gatos (Tabla 6). Dicho resultado demuestra que los títulos de anticuerpo NV en un ensayo NV que utiliza unas células FeT-1C se correlaciona con los resultados obtenidos en un ensayo NV utilizando PBMC. Por consiguiente, las células FeT-1C se pueden utilizar ventajosamente en lugar de PBMC en un ensayo estándar de NV para VIF debido a que las células FeT-1C se pueden infectar con todos los subtipos de VIF y se puede propagar fácilmente en un cultivo celular.
TABLA 7
Títulos NV ensayados en FeT-1C y PBC
Títulos NV
Fuente de suero FeT-1C PBMC
Vacunado ^{1} 5000 5000
Vacunado ^{1} >1000 >1000
Infectado ^{2} 1000 1000
Infectado ^{2} >1000 >1000
Célula no infectada inmunizada ^{3} <10 <10
Célula no infectada inmunizada ^{3} <10 <10
^{1} - suero de los gatos vacunados con células Pet/FL-4 inactivada
^{2} - suero de gatos infectado con VIF Pet
^{3} - suero de los gatos inmunizados con FeT-J inactivadas no infectadas.
Ejemplo 4 Inmunotipado de las cepas de VIF
Se realizaron unos experimentos in vitro utilizando unas células FeT-1C para evaluar si el subtipo de VIF relejaba el inmunotipo de VIF. El Inmunotipado es importante para entender el papel de los anticuerpos NV en la protección de las vacunas. El Antisuero de gatos infectados con cepas de VIF subtipo A (VIT_{Pet}, VIF_{Dix}, VIF_{Uk8}), subtipo B (VIF_{Bang}, VIF_{Aom1}), y subtipo D (VIF_{Shi}) se ensayó para la capacidad para neutralizar in vitro dichas cepas utilizando las células FeT-1C en el ensayo NV (Figura 6). Todos los ensayos de antisuero presentaron una actividad neutralizadora contra la cepa VIF homóloga correspondiente. VIF_{Pet}, una cepa de subtipo A, se neutralizó significativamente por una reacción cruzada gracias a unos antisueros de los gatos infectados con VIF_{Dix}. VIF_{Pet} difiere de VIF_{Dix} en aproximadamente un 9% de las regiones de la glicoproteína de la superficie de la envuelta (Env). Los antisueros de los gatos infectados con las cepas VIF de subtipo A se neutralizaron por reacción cruzada con VIF_{Bang} subtipo B pero no neutralizan el VIF_{Shi} subtipo D. Los antisueros de los gatos infectados con las cepas de subtipo B y D sólo neutralizaron por reacción cruzada a otras cepas VIF dentro del subtipo homólogo. Además, los anti-sueros de los gatos infectados con las cepas VIF_{UK8} neutralizaron VIF_{Bang} pero no neutralizaron cepas VIF del subtipo A. A pesar de que VIF_{UK8} se clasifica como del subtipo A (Sodora et al.,1994, Rigby et al., 1993; Kakinuma et al., 1995), dichos resultados sugieren que el antisuero contra VIF_{UK8} reconoce las cepas del subtipo B, pero no reconoce las cepas del subtipo A, y puede explicar porque las vacunas VIF_{Pet} inactivadas resultan ineficaces contra VIF_{UK8} y VIF_{Shi} (Jonson et al, 1994). De este modo, existe una pérdida de la correlación entre el genotipo y el inmunotipo. A pesar de que los análisis del genotipo permiten la clasificación de las cepas VIF, los estudios de neutralización por reacción cruzada de los anticuerpos reflejan la inmunogenicidad de las cepas de VIF, que es un parámetro importante en la amplia gama de la protección humoral proporcionada por las vacunas.
Ejemplo 5 Tropismo celular de VIF
El tropismo celular de las cepas VIF obtenidas a partir de las líneas celulares FeT-1C infectadas y las células FeT-J infectadas se compararon con dichas cepas VIF obtenidas de los PBMC primarios (Tabla 8). Dos aislados VIF, VIF_{UK8} y VIF_{Bang} resultaron ambos igualmente linfotrópicos y macrófago tróficos, mientras que VIF_{Shi} es altamente linfotrófico. VIF_{Pet} era más linfotrópico que macrofagotrópico y su tropismo celular no resultaba significativamente afectado por su fuente de células. El tropismo por el macrófago de VIF_{Bang} no resultó afectado por la fuente celular de los virus. Debido a que el tropismo celular de las cepas VIF de la línea celular FeT-1C infectada es comparable a las producidas por los PBMC. El virus cultivado en las células FeT-1C se puede utilizar como inóculo para los ensayos NV y asimismo como un inóculo in vivo en los experimentos para evaluar las estrategias terapéutica y profiláctica.
7 
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Debe entenderse que los ejemplos y las formas de realización descritas en la presente memoria se presentan únicamente a título ilustrativo y que pueden sugerirse varias modificaciones o cambios en su enfoque por las personas expertas en la materia y deben incluirse en el espíritu y ámbito de dicha solicitud y en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Referencias citadas
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Kakinuma, S., K. Motokawa, T. Hohdatsu, J.K. Yamamoto, H. Koyama, H. Hashimoto (1995) "Nucleotide Sequence of Feline Immunodeficiency Virus: Classification of Japanese Isolates into Two Subtypes Which Are Distinct from Non-Japanese Subtypes," Journal of Virology 69(6):3639-3646.
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Okada, S.,R. Pu, E. Young, W. Stoffs, J.K. Yamamoto (1994) "Superinfection of cats with VIF Subtypes A and B," AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:1739-1746.
Yamamoto, Janet K., Niels C. Pedersen, patente Us nº 5.275.813, publicado el 4 enero, 1994.
Merrifield, R,B, (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
INFORMACIÓN DEL SOLICITANTE:
Nombre (s) del solicitante: UNIVERSIDAD DE FLORIDA
Dirección: 223 Grinter Hall
Ciudad: Gainesville
Estado/Provincia: Florida
País: US
Código Postal: 32611
Número de Teléfono: (352) 392-8929 \hskip0.5cm Fax: (352) 392-6600
Nombre (s) del solicitante: REGENTES DE LA UNIVERSIDAD DE CALIFORNIA
Dirección: 2150 Shattuck Avenue, Suite 520
Ciudad: Berkeley
Estado/Provincia: Califonia
País: US
Código Postal: 94704
Número de Teléfono: (510) 748-6600 \hskip0.5cm Fax: (510) 748-6639 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: Vacunas Multi-subtipo de VIF
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Saliwanchik & Saliwanchik
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Gainesville
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Florida
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 32606
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE AL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD EN CURSO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
INFORMACIÓN AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Pace, Doran R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38,261
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: UF152
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (904) 375-8100
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (904) 372-5800
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp}
\sac{Glu Trp Arp Pro Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)TIPO
DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAATGTATA ATATTGCTGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATTGATTT TGATTACATC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGTAGTTAT AGTGGTACTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACAAATAG TAGTAGTACA A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN ( genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGACTACTA GCAATGGAAT A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGGACTGAT GATAGTAAAA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGGACTGAT AATAGTGAAA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)TIPO
DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCATCATTTC CAACATGTC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATGCTTCAG TTATTTGATC 
\hfill
20

Claims (16)

1. Composición de vacuna contra el VIF multi-subtipo que comprende unos inmunógenos de VIF derivados de subtipos de VIF diferentes, en la que la composición es capaz de producir una respuesta inmunitaria contra una pluralidad de subtipos de VIF en un gato y contra cepas de VIF homólogas y heterólogas.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que los inmunógenos se seleccionan de entre constructos de vector recombinante viral de VIF, polipéptidos de VIF, virus VIF completo libre de células, y líneas celulares infectadas con VIF.
3. Composición según la reivindicación 2, en la que el virus VIF o la línea celular infectada con VIF se inactiva o se atenúa.
4. Composición según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, que comprende por lo menos dos cepas de VIF de diferentes subtipos de VIF.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que los subtipos de VIF se seleccionan de entre los subtipos A, B, C y D.
6. Composición según la reivindicación 5, que es una composición de subtipo dual y los diferentes subtipos de VIF son A y D.
7. Composición según la reivindicación 6, en la que los subtipos son VIF_{Pet} y VIF_{Shi}.
8. Composición según la reivindicación 5, que es una composición de subtipo triple y los diferentes subtipos de VIF son A, B y D.
9. Composición según la reivindicación 8, en el que los subtipos son VIF_{Pet}, VIF_{Bang} y VIF_{Shi}.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, que comprende unas líneas celulares infectadas con VIF, en la que las líneas celulares no infectadas son unas líneas celulares T derivadas de felino y se seleccionan de entre las líneas celulares denominadas Fet-1C que presenta el número de acceso a la ATCC 11968 y FeT-J que presenta el número de acceso a la ATCC 11967.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, que comprende unas líneas celulares T derivadas de felino infectadas con VIF y seleccionadas de entre las líneas celulares denominadas Shi/FeT-1C que presenta el número de acceso a la ATCC 11976 y Bang/FeT-J que presenta el número de acceso a la ATCC 11975.
12. Utilización de inmunógenos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de una vacuna para su utilización en la inducción de una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por cepas homólogas y heterólogas de VIF.
13. Utilización según la reivindicación 12, en la que los inmunógenos son tal como se ha definido en la reivindicación 2, para su utilización como dosis de estimulación en un animal inmunizado con un constructo de vector viral recombinante de VIF.
14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la vacuna comprende un virus completo VIF libre de células.
15. Utilización según la reivindicación 14, en la que el virus VIF se inactiva antes de su utilización.
16. Utilización según la reivindicación 14, en la que el virus VIF se atenúa antes de su utilización.
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