PL188041B1 - Linia komórkowa T pochodzenia kociego - Google Patents

Linia komórkowa T pochodzenia kociego

Info

Publication number
PL188041B1
PL188041B1 PL35824896A PL35824896A PL188041B1 PL 188041 B1 PL188041 B1 PL 188041B1 PL 35824896 A PL35824896 A PL 35824896A PL 35824896 A PL35824896 A PL 35824896A PL 188041 B1 PL188041 B1 PL 188041B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
fiv
cell line
infected
fet
cells
Prior art date
Application number
PL35824896A
Other languages
English (en)
Inventor
Janet K. Yamamoto
Original Assignee
Univ California
Univ Florida
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California, Univ Florida filed Critical Univ California
Publication of PL188041B1 publication Critical patent/PL188041B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)

Abstract

1. Linia komórkowa T pochodzenia kociego, wykazujaca identyfikujace cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostepu ATCC CRL 11968. 2. Linia komórkowa wedlug zastrz. 1, zakazona wirusem FIV, przy czym podtyp tego wirusa FIV jest wybrany z grupy obejmujacej podtypy A, B, C i D. 3. Linia komórkowa wedlug zastrz. 1, zakazona co najmniej jednym ze szczepów wirusa FIV wybranym z grupy obejmujacej FIVD ix , FIVU K 8 , FIV B ang, FIVA o m 1 , FIVA o m 2, FIVP e t i FIVSh i. 4. Linia komórkowa wedlug zastrz. 1, która stanowi linia komórkowa oznaczona numerem dostepu ATCC CRL 11968. 5. Linia komórkowa T pochodzenia kociego, wykazujaca identyfikujace cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostepu ATCC CRL 11967. 6 . Linia komórkowa wedlug zastrz. 5, zakazona wirusem FIV, przy czym podtyp tego wirusa FIV jest wybrany z grupy obejmujacej podtypy A, B, C i D. 7. Linia komórkowa wedlug zastrz. 5, zakazona co najmniej jednym ze szczepów wirusa FIV wybra- nym z grupy obejmujacej FIVD ix, FIVU K 8 , FrVB a n g , FIVA o m 1 , FIVA o m 2, FIVP e t i FIVS h i. 10. Linia komórkowa T pochodzenia kociego oznaczona jako Bang/FeT-J i o numerze dostepu ATCC CRL 11975, zakazona szczepem FIVB an g wirusa FIV. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest linia komórkowa T pochodzenia kociego. Linie komórkowe T pochodzenia kociego znajdują zastosowanie w sposobach i kompozycjach szczepionek użytecznych do indukowania ochronnej odporności na infekcje FTV u podatnego zwierzęcia-gospodarza.
Koty domowe są podatne na kilka IetIowirusów, takich jak wirus białaczki kotów (FeLV,) wirus mięsaka kotów (FeSV), endogenny onkoronawirus typu C (RD-114) i wirus tworzący syncytia kotów (FeSFV). Najbardziej znaczącym patogenem pośród tych wirusów jest FeLV, powodujący różnorakie objawy m.in. nowotwory siateczkowo-chłonne i szpiku, anemie, choroby układu odpornościowego i zespół niedoboru odporności podobny do ludzkiego nabytego niedoboru odporności (ATDS). Niedawno skojarzono pewnego mutanta defektywnego pod względem replikacji, FeLV-ATDS z właściwościami immunosupresyjnymi.
Odkrycie kociego T-limfotropowego lentiwirusa (obecnie określanego jako wirus niedoboru odporności kotów, FTV) po raz pierwszy opisali Pedersen i wsp. (1987). Charakterystykę FTV podali Yamamoto i wsp. (1988a, 1988b) i Ackley i wsp. (1990).
Dane seroepidemiologiczne wykazały, że zakażenie przez FTV jest powszechne u kotów domowych i dzikich na całym świecie.
Z zakażeniem FTV kojarzy się szeroki zakres objawów, m.in. poronienia, anemię, zapalenie spojówek, przewlekły nieżyt nosa, zapalenie jelit, zapalenie dziąseł, świeżą krew w kale, anomalie neurologiczne, zapalenie ozębnej i łojotokowe zapalenie skóry. Tmmunologiczną oznaką kotów domowych zakażonych FlV jest przewlekły i postępujący niedobór kocich komórek obwodowych krwi CD4+, obniżenie stosunku komórek CD4:CD8, i w pewnych przypadkach wzrost ilości limfocytów CD8. W oparciu o charakterystykę molekularną, biochemiczną i immunopatologiczną, uważa się obecnie zakażenia kotów przez FTV za lepszy koci
188 041 model AIDS niż FeLV-FAIDS. Olmsted i wsp. (1989a, 1989b) oraz Talbott i wsp. (1989) opisali klonowanie i analizę sekwencji FIV. Hosie i Jarret (1990) opisali odpowiedź serologiczną kotów zakażonych FIV.
Podtypy wirusa FIV można klasyfikować w zależności od immunotypu w oparciu o poziom krzyżowo neutralizujących przeciwciał wywoływanych przez każdy szczep (Murphy i Kingsbury, 1990). Niedawno wirusy zaklasyfikowano do podtypów w zależności od genotypu opartego na homologii sekwencji nukleotydów. Choć subtypowanie HIV i FIV jest oparte na genotypie (Sodora i wsp., 1994; Rigby i wsp., 1993, oraz Louwagie i wsp., 1993), niewiele wiadomo o korelacji pomiędzy genotypem i immunotypem podtypów. Izolaty wirusowe FIV klasyfikuje się obecnie na cztery podtypy FIV: A, B, C i D (Kakinuma i wsp., 1995). Zakaźne izolaty i zakaźne klony molekularne opisano dla wszystkich podtypów FIV z wyjątkiem podtypu C (Sodora i wsp., 1994). Podtyp C FIV stwierdzano tylko w DNA komórkowym kotów z Kanady (Sodora i wsp., 1994; Rigby i wsp., 1993; Kakinuma i wsp., 1995).
Podstawową trudność w opracowaniu szczepionki przeciw FIV stanowi zidentyfikowanie szczepionki skutecznej przeciwko szerokiemu zakresowi szczepów FIV, w tym izolatów terenowych z różnych podtypów lub kładów. Profilaktykę za pomocą szczepionki pochodzącej z jednego szczepu uzyskano dla szczepów homologicznych lub nieco heterologicznych, ale nie przy podaniu umiarkowanie lub znacznie heterologicznych szczepów (Johnson i wsp., 1994; Yamamoto i wsp., 1993).
Wynalazek dotyczy nowych kocich linii komórkowych podatnych na zakażenie wieloma podtypami FIV, to jest nowej linii komórkowej T pochodzenia kociego, wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu AtCc CRL 11968.
Korzystniej linia komórkowa według wynalazku jest zakażona wirusem FIV, przy czym podtyp tego wirusa FIV jest wybrany z grupy obejmującej podtypy A, B, C i D.
Korzystniej linia komórkowa według wynalazku jest zakażona co najmniej jednym ze szczepów wirusa FIV wybranym z grupy obejmującej FrVoix, FIVuks, FIVBang, FIVAomi, FIVAom2, FIVPetiFIVShi.
Korzystniej linię komórkową według wynalazku stanowi linia komórkowa oznaczona numerem dostępu ATCC CRL 11968.
Wynalazek dotyczy linii komórkowej T pochodzenia kociego, wykazującej identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu AtCc CRL 11967.
Korzystniej linia komórkowa według wynalazku jest zakażona wirusem FIV, przy czym podtyp tego wirusa FIV jest wybrany z grupy obejmującej podtypy A, B, C i D.
Korzystniej linia komórkowa według wynalazku jest zakażona co najmniej jednym ze szczepów wirusa FIV wybranym z grupy obejmującej FIVDix, FIVuk8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2, FIVPet i FIVShi·
Korzystniej linię komórkową według wynalazku stanowi linia komórkowa oznaczona numerem dostępu ATCC CRL 11967.
Wynalazek dotyczy również linii komórkowej T pochodzenia kociego oznaczonej jako Shi/FeT-1C i o numerze dostępu ATCC CRL 11976, która jest zakażona szczepem FIVShi wirusa FIV.
Wynalazek dotyczy również linii komórkowej T pochodzenia kociego oznaczona jako Bang/FeT-J i o numerze dostępu ATCC CRL 11975, która jest zakażona szczepem FIVBang wirusa FIV.
Ujawnione dwie linie komórkowe zdeponowane pod numerem dostępu odpowiednio ATCC CRL 11968 i CRL 11967, określane są jako odpowiednio FeT-1C i FeT-J. Linia komórkowa FeT-1C jest zależna od interleukiny-2 (IL-2), podczas gdy linia komórkowa FeT-J nie jest zależna od interleukiny-2 (IL-2).
Linie komórkowe według wynalazku są przydatne do dostarczenia nośnika dla szczepienia kotów przeciw FIV, a także do namnażania i produkcji szczepów wirusa FIV in vitro. Niezakażone komórki, zarówno FeT-1C zależne od IL-2 jak i FeT-J niezależne od IL-2, zbadano ponad 20 razy w aspekcie aktywności odwrotnej transkryptazy (RT) w płynach hodowli oraz prowirusowej sekwencji FIV, za pomocą techniki PCR, stwierdzając, że nie wykazują one obecności FIV. Linia komórkowa FeT-J była wysoce infekowalna przez wszystkie prze4
188 041 badane szczepy FIV, w tym FIVshi, FIVDix, FIVUKS, FTVpet i FIVBang, ale trudniej było ją bezpośrednio zakazić FIVShi.
Linie komórkowe niezakażone FIV oznaczone jako FeT-1C (nr dostępu ATCC CRL 11968) oraz jako FeT-J (nr dostępu ATCC CRL 11967) zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 24 sierpnia 1995. Linie komórkowe zakażone, FIVBang (nr dostępu ATCC 11975) i FIV.shi (nr dostępu ATCC 11976) zostały zdeponowane w American Type Culture Collection 25 sierpnia 1995.
Hodowle zdeponowane w warunkach zapewniających dostęp do hodowli w toku postępowania związanego z rozpatrywaniem zgłoszenia patentowego dla osób uznanych przez Komisarza Patentów i Znaków Towarowych za uprawnione, zgodnie z 37 CFR 1.14 i 35 U.S.C.122. Depozyt będzie dostępny zgodnie z wymaganiami zagranicznych praw patentowych w krajach, w których złożone są odpowiedniki niniejszego zgłoszenia lub zgłoszenia pochodne. Jednak należy zdawać sobie sprawę, że dostępność depozytu nie stanowi licencji do realizowania odnośnego wynalazku z naruszeniem praw patentowych przyznanych przez działania rządowe.
Dodatkowo depozyt hodowli będzie przechowywany i udostępniany publicznie zgodnie z postanowieniami Traktatu Budapeszteńskiego dotyczącym Depozytu Mikroorganizmów, tak że będzie przechowywany z należną dbałością, by pozostał żywotny i nie zanieczyszczony przez okres co najmniej pięciu lat po ostatniej prośbie o udostępnienie próbki depozytu, a w każdym razie przez okres co najmniej trzydziestu (30) lat po dacie zdeponowania lub przez wykonalny okres ważności dowolnego patentu, który może być przyznany ujawniającemu hodowlę. Depozytor uznaje obowiązek zastąpienia depozytu, gdyby depozytariusz nie był w stanie dostarczyć próbki na żądanie ze względu na stan depozytu. Wszelkie ograniczenia publicznej dostępności omawianej hodowli będą nieodwracalnie usunięte po wydaniu patentu, w którym hodowla jest ujawniona.
Wywarzane przez linie komórkowe według wynalazku produkty komórkowe są również objęte zakresem wynalazku. Produkty komórkowe mogą być izolowane i wykrywane z wykorzystaniem znanych specjaliście metod. Przeciwciała przeciw liniom komórkowym mogą także być wyprodukowane stosując znane sposoby, przy czym uważa się je za objęte zakresem wynalazku.
Linie komórkowe według wynalazku znajdują zastosowanie do namnażania i produkcji wielu podtypów FIV, jak również do stosowania w szczepionkach FIV, wywołujących szeroki zakres ochronnej odporności przeciwko zakażeniom przez FIV zwierzęcia-gospodarza. A zwłaszcza do stosowania w szczepionkach FIV przeciw wielu podtypom FIV, które przygotowuje się stosując izolaty wirusów wolne od komórek różnych podtypów FIV albo kombinacje linii komórkowych, z których każda jest zakażona innym prototypowym wirusem FIV z innego podtypu. U kotów zaszczepionych szczepionkami FIV rozwijają się ochronne odpowiedzi humoralne i immunologiczne na FIV gdy podaje się im homologiczne lub heterologiczne szczepy FIV.
Ponadto linie komórkowe mogą być stosowane zamiast kocich obwodowych jednojądrowych komórek krwi (PBMC) w próbach neutralizacji wirusowego FIV przez kocie surowice odpornościowe.
Linie komórkowe według wynalazku znajdują zastosowanie w sposobach i kompozycjach szczepionek użytecznych do indukowania ochronnej odporności na infekcje FIV u podatnego zwierzęcia-gospodarza. Kompozycje szczepionek po podaniu zwierzęciu-gospodarzowi indukują ochronne odpowiedzi odpornościowe komórkowe i humoralne przeciw zakażeniom homologicznymi i heterologicznymi szczepami FIV. Kompozycje szczepionek mogą zawierać albo bezkomórkowe izolaty wirusów FIV albo linie komórkowe zakażone FIV. Kompozycja szczepionki może zawierać zarówno szczepy FIV z dwóch różnych podtypów FIV, jako również trzy szczepy FIV, każdy szczep należący do innego podtypu. Jeszcze korzystniej co najmniej jeden szczep FIV z każdego podtypu FIV A, B i D jest włączony do kompozycji szczepionki.
Kompozycja szczepionki może zawierać linie komórkowe zakażone FIVi>et i FIVshi, albo linie komórkowe zakażone FIBPet, FIVBang i FIVshi. Zastosowanie innych szczepów FIV reprezentatywnych dla całości lub części podtypów FIV jest specyficznie uwzględniane przez
188 041 wynalazek. Na przykład FIVDix lub FIVin<8 może być włączony do kompozycji szczepionki oprócz lub zamiast FIVPet aby dostarczyć prototyp wirusa podtypu A. Podobne dodatki lub substytucje z innymi szczepami FIV można by wykonać dla podtypów B i D prototypów wirusów FIV.
Kompozycje szczepionek mogą zawierać cały wirus FIV wolny od komórek, lub części wirusa, białka i polipepetydy FIV, a także linie komórkowe zakażone FIV lub kombinację wirusa wolnego od komórek i zakażonych linii komórkowych. Kompozycje szczepionek zawierające linie komórkowe zakażone FIV mogą zawierać wielokrotne linie komórkowe, z których każda jest zakażona przez inny podtyp FIV. Kompozycje szczepionek obejmują także konstrukty FIV oparte na wirusach zrekombinowanych obejmujące np. FIV env, gag/pro lub env-gag/pro. Dowolny odpowiedni wektor wirusowy, który może być zastosowany do przygotowania zrekombinowanych konstruktów wektor/FIV może być brany pod uwagę do zastosowania według wynalazku. Na przykład wektory wirusowe pochodzące od adenowirusów, wirusów ospy ptasiej, kocich wirusów opryszczki, krowianki, ospy kanarków, ospy owadów, ospy świń i innych znanych w dziedzinie mogą być zastosowane w kompozycji i sposobach indukowania ochronnej odpowiedzi odpornościowej przeciw zakażeniu FIV u wrażliwego zwierzęcia-gospodarza. Zrekombinowane wektory polinukleotydowe, które kodują i eksprymują składniki FIV mogą być skonstruowane z wykorzystaniem standardowych technik inżynierii genetycznej znanych w dziedzinie. Dodatkowo, różne opisane kompozycje szczepionek mogą być stosowane oddzielnie i w kombinacjach. Na przykład do pierwotnego szczepienia zwierzęcia można wykorzystywać konstrukty FIV oparte na zrekombinowanych wektorach, mających składniki pojedynczego lub wielu podtypów, a następnie podawać dawki przypominające z kompozycjami szczepionek zawierającymi inaktywowane linie komórkowe zakażone FIV. Inne protokoły immunizacji z kompozycjami szczepionek są ewidentne dla specjalisty i są uważane za leżące w zakresie niniejszego wynalazku.
Opisane szczegółowo szczepionki złożone z wielu podtypów FIV przebadano pod kątem ich immunogenności i skuteczności u kotów. Koty wolne od specyficznych patogenów (SPF) szczepione badanymi kompozycjami szczepionek śledzono pod kątem odpowiedzi odpornościowych komórkowych i humoralnych przed i po podaniu homologicznych i heterologicznych szczepów FIV. Odpowiedzi humoralne śledzono przez pomiar aktywności przeciwciał neutralizujących wirusy (VN), a odpowiedzi komórkowe poprzez pomiar aktywności cytotoksycznych limfocytów T (CTL). Surowice i immunocyty z zaszczepionych kotów testowano in vitro odpowiednio pod kątem aktywności VN i CTL, przeciw homologicznym i heterologicznym szczepom FIV i wykazano, że szczepionki mogą wywołać ochronę o szerokim zakresie przed zakażeniem FIV. Kombinowanie izolatów prototypu wirusa z różnych podtypów FIV lub kombinowanie poszczególnych komórek zakażonych prototypami wirusa różnych podtypów, daje możliwość produkcji skutecznej szczepionce przeciwko wielu podtypom FIV.
Wszystkie szczepy FIV, oprócz konkretnie przedstawionych, są rozważane zgodnie z niniejszym wynalazkiem. W literaturze opisana jest pewna ilość izolatów FIV i są one znane specjalistom w tej dziedzinie. FIViet ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5037753. Inne izolaty FIV, które zostały opisane, mogą być łatwo wyizolowane z zakażonych kotów przez osoby o normalnych w tej dziedzinie umiejętnościach z wykorzystaniem standardowych sposobów. Sposoby izolacji i hodowli FIV ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5037753 i 5118602, które tu są włączone jako odnośniki.
Naturalne, zrekombinowane lub syntetyczne polipeptydy białek wirusowych FIV oraz ich fragmenty peptydowe, mogą być stosowane jako kompozycje szczepionek. W kompozycji szczepionki łączy się polipeptydy FIV pochodzące od wielu podtypów FIV i wykorzystuje do zaszczepienia zwierzęcia-gospodarza. Tak np. polipeptydy oparte na glikoproteinie otoczki FIV z co najmniej dwóch szczepów prototypów FIV z różnych podtypów mogą być łączone w szczepionce. Polipeptydy mogą być homologiczne do jednego ze szczepów lub mogą stanowić polipeptydy „hybrydowe” lub „chimeryczne”, których sekwencja aminokwasów powstała w wyniku połączenia lub sprzęgnięcia polipeptydów z co najmniej dwóch odrębnych podtypów FIV. Procedury preparatyki polipeptydów FIV są dobrze znane. Na przykład poli6
188 041 peptydy FIV można syntetyzować stosując metody syntezy w fazie stałej (Merrifield, 1963). Polipeptydy FIV mogą też być wytworzone z zastosowaniem technik rekombinacji DNA, gdzie cząsteczka polinukleotydu kodującego białko lub peptyd FIV jest eksprymowana w komórce-gospodarzu, takiej jak bakterie, drożdże lub linie komórek ssaków, a eksprymowane białko oczyszcza się stosując standardowe techniki.
Kompozycje szczepionek FIV podaje się podatnym gospodarzom, zazwyczaj kotom domowym, w skutecznej ilości i w sposób aby wywołać ochronną odporność przeciw następnej dawce wirusa lub zakażeniu gospodarza przez FIV. Szczepionki zazwyczaj podaje się pozajelitowe w postaci zastrzyku, np. podskórnie, dootrzewnowo lub domięśniowo. Inne odpowiednie sposoby podawania obejmują podawanie doustnie lub do nosa. Zazwyczaj szczepionki są podawane gospodarzowi co najmniej dwa razy, z przerwą jednego lub dwóch tygodni między kolejnymi podaniami.
Jednak można stosować inne procedury podawania wstępnej i przypominającej dawki szczepionki, przy czym mogą one zależeć od osądu osoby podającej szczepienia i od danego zwierzęcia.
Kompozycje szczepionek można przygotowywać z wykorzystaniem dobrze znanych procedur. Tak np. szczepionki typowo przygotowuje się jako preparaty do iniekcji, tzn. jako płynne roztwory lub zawiesiny. Szczepionki są podawane w sposób, który jest zgodny z postacią dawki oraz w ilości, która będzie terapeutycznie skuteczna i immunogenna u biorcy. Optymalne dawki i sposoby podawania dla danej formuły szczepionki mogą być łatwo określone przez specjalistę.
Wirusy i komórki w szczepionce mogą być inaktywowane lub atenuowane z wykorzystaniem znanych metod. Tak np. cały wirus i zakażone komórki mogą być inaktywowane lub atenuowane przez kontakt z paraformaldehydem, formaliną, fenolem, światłem UV, podwyższoną temperaturą itp. Ilość wolnego od komórek całkowitego wirusa FIV w dawce szczepionki na ogół będzie wynosić od około 0,1 mg do około 5 mg, jeszcze częściej od około 0,2 mg do około 2 mg. Dawka w przypadku preparatów szczepionki obejmujących linie komórkowe zakażone FIV będzie zazwyczaj zawierać od około 106 do około 10 8 komórek/dawkę, a jeszcze częściej od około 5 x 106 do około 7,5 x 107 komórek/dawkę.
Wirus lub komórki zazwyczaj łączy się z adiuwantem tuż przed podaniem. Jako adiuwanty stosuje się w kompozycjach szczepionek zazwyczaj dipeptyd treonylo-muramylowy (MDP) (Byars i wsp., 1987) albo kombinacja kompletnego i niekompletnego adiuwanta Freunda. Można również użyć różnych innych znanych adiuwantów odpowiednich do stosowania w kompozycjach szczepionek.
Niezakażone linie komórkowe według wynalazku są użyteczne w sposobie oznaczania przeciwciał neutralizujących wirus (VN) w próbce. W odróżnieniu od PMBC, które giną po ograniczonej liczbie pasaży i nienamnażają się tak łatwo jak komórki FeT-1C lub FeT-J, komórki FeT-1C i FeT-J są ustalonymi liniami komórkowymi i mogą być łatwo przechowywane w formie zamrożonej do późniejszego stosowania. Wyniki uzyskane w pomiarach VN z zastosowaniem komórek FeT-1C są znacznie bardziej powtarzalne niż pomiary VN z zastosowaniem PMBC, ponieważ PMBC z różnych kotów SPF mogą wykazywać indywidualne różnice w tempie wzrostu i podatności na zakażenie FIV. Ponadto PMBC do pomiarów VN 'muszą być uzyskiwane z kotów SPF, które wymagają pomieszczeń i hodowli w warunkach wolnych od mikroorganizmów, aby wyeliminować zakażenia in vivo, które mogą wpływać na test in vitro VN z użyciem PMBC. Tak więc kocia linia komórkowa, taka jak FeT-1C, która może być łatwo zakażona przez FIV różnych podtypów, może być korzystnie zamiennikiem PMBC w testach VN.
Stosowane są następujące skróty dla szczepów FIV.
Szczep (podtyp) Skrót
Petaluma (A) FlVftt
Dixon (A) FWdd
UK8 (A) FHĄu8
Bangston (B) FIVBang
Aomori-1 (B) FIVAoml
Aomori-2 (B) FIVAom2
Shizuoka (D) FIV.Sh,
188 041
Figura 1 przedstawia poziomy odwrotnej transkryptazy (RT) FIVBaig i FIVShi wyprodukowanej po zakażeniu linii komórkowych FeT-1C i FeT-J tymi szczepami FIV.
Figura 2 przedstawia immunoreakcję przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych dwoma podtypami z detekcją białek FIV za pomocą „immunoblotu”. Liczba nad każdym biotem odpowiada liczbie szczepień otrzymanych przez zwierzę przy testowaniu surowicy.
Figura 3 przedstawia immunoreakcję przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych trzema podtypami FIV; białko wykrywane jest za pomocą immunoblotu. Liczba nad każdym biotem odpowiada liczbie szczepień otrzymanych przez zwierzę przy testowaniu surowicy.
Figura 4 przedstawia immunoreaktywność przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych trzema podtypami, peptyd FIV SU-V3-2 wykrywany jest za pomocą ELISA.
Figura 5 przedstawia immunoreaktywność przeciwciał anty-FIV z kotów szczepionych trzema podtypami FIV; peptyd FIV TM-C1 wykrywany jest za pomocą ELISA.
Figura 6 przedstawia krzyżowo zobojętniające miana przeciwciał z surowic kotów zakażonych FIVPet (Ap), FIVdiX (AD), FIVuk8 (AU), FIVeang (BB),FIVAom (BA) i FIVSh (DS). Surowice z okresu przed infekcją (kolumna 1), 6 miesięcy po zakażeniu (kolumna 2) i 12 miesięcy po zakażeniu (kolumna 3) testowano przeciw podtypowi A FIVPet, podtypowi B FIVBang i podtypowi D FłY.Shi w linii komórkowej FeT-1C. Badano co najmniej trzy koty na szczep. Wyniki pokazują miano VN z reprezentatywnego kota dla każdego gatunku. Uzyskano podobne wyniki stosując pierwotny PBMc dla testu VN.
Krótki opis sekwencji
SEQ ID NO: 1 jest sekwencją aminokwasów powierzchniowego peptydu FIV oznaczonego jako SV-V3-2.
SEQ ID NO: 2 jest sekwencją aminokwasów transmembranowego peptydu FIV oznaczonego jako TM-C1.
SEQ ID NO: 3 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ED NO: 4 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 5 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 6 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 7 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 8 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 9 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 10 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 11 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 12 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 13 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 14 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 15 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
SEQ ID NO: 16 jest sekwencją nukleotydową primera FIV do PCR.
Hodowle komórek.. Wszystkie linie komórkowe hodowane w zawiesinie hodowano w RPMI 1640 zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą (FCS) inaktywowaną termicznie, 10 tfoM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperayno-N'-2-eeanosulfonowy), 2 mM L-glutaminę, 50 mg/ml gentamycynę i 5x10'5 M 2-merkapto-etanol. Do komórek zależnych od IL-2 dodawano 100 U/ml zrekombinowanej ludzkiej IL-2 (Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornia). Komórki hodowane w zawiesinie pasażowano w stężeniach 0,5-4x106 komórek/ml i dwa razy tygodniowo przenoszono do świeżych pożywek. Wszystkie komórki hodowane w formie warstw pojedynczych pasażowano dwa razy tygodniowo przy wyjściowym stężeniu 2x106 komórek/ml. Płyny z hodowli tkankowych (TCF) z komórek zakażonych FIV zbierano dwa razy tygodniowo, odwirowywano przy 3000 obrotach/minutę przez 1 godzinę w celu usunięcia resztkowych komórek i przechowywano w -20°C albo w -70°C w przypadku tych TCF, które miały być od razu użyte. Komórki podatne na FIV (1x106 komórek/ml) zakażano FIV o aktywności odwrotnej transkryptazy (RT) około 30000 cpm/ml.
Oczyszczanie FIV. Płyny hodowlane z linii komórkowych zakażonych FIV indywidualnie wirowano przy 2000 do 3000 obrotów/minutę przez 1 godzinę w celu usunięcia komórek. Wirus w TCF osadzano przez ultrawirowanie przy 16000 obrotach/minutę przez 2 godziny
188 041 i oczyszczano przez ultrawirowanie najpierw na nieciągłym gradiencie sacharozy 10,/50% (wagowo/objętościowych) a następnie na ciągłym gradiencie sacharozy 10,/50% (Pederson i wsp., 1987; Yamamoto i wsp., 1988). Każdy z izolatów wirusa inaktywowano za pomocą 1,25% sterylnego paraformaldehydu (sączonego przez sterylne filtry 0,22 pm) przez 18 godzin, a następnie wyczerpująco dializowano wobec sterylnego PBS. Inaktywowane- wirusy rozcieńczano do stężenia 500 pg/ml sterylnym PBS, 250 pg/0,5 ml każdego ze szczepów umieszczano w sterylnej probówce Eppendorfa i przechowywano w -70°C. Inaktywowane szczepy FIV rozmrażano w temperaturze pokojowej i 250 pg inaktywowanego wirusa w 0,5 ml jałowego PBS łączono z 0,5 ml adiuwanta tuż przed szczepieniem. Linie komórkowe zakażone FIV oddzielnie inaktywowano za pomocą 1,:25% sterylnego paraformaldehydu przez 18 godzin, płukano 3 razy jałowym PBS, zawieszano w świeżym jałowym PBS w stężeniu około 5,0x107 komórek/ml w jałowych probówkach i przechowywano w 4°C. Typowo około 2,5 x 107 inaktywowanych zarażonych komórek w 0,5 ml jałowego PBS łączono z 0,5 ml adiuwanta tuż przed szczepieniem. Jako adiuwant używano 250 pg/0,5 ml dipeptydu treonylo-muramylowego (adiuwant MDP MF75.2; Chiron Corporation, Emeryville, CA).
Oznaczenie CTL. Obwodowe jednojądrowe komórki krwi (PMBC) stymulowano Konkanawaliną A (Con A) przez 3 dni przed zakażaniem FIV przez 10 dni (Song i wsp., 1992). Komórki te były komórkami docelowymi do oznaczeń CTL. Aktywność CTL generowano przez hodowania wspólnie PMBC stymulowanych Con A z autologicznymi PMBC zakażonymi FIV i inaktywowanymi UV i promieniowaniem przez 5 dni. Komórki te służyły jako aktywowane komórki efektorowe. W dniu pomiaru komórki docelowe znakowano 50 mCi Na7’CrO4 przez 1 do 3 godzin, płukano 3 razy, a następnie dodawano określoną liczbę znakowanych komórek docelowych do płytek mikrotytracyjnych (5x104 komórek/studzienkę). Dodawano komórki efektorowe w trzech powtórzeniach przy różnych stosunkach komórek efektorowych do docelowych (np. 100:1, 50:1 i 10:1). Płytki odwirowywano przez 1 minutę przy 400 obrotach/minutę i inkubowano w 37°C przez 4 godziny. Kontrolne komórki docelowe znakowane 51Cr lizowano detergentem by uzyskać maksymalne wartości dla uwolnienia. Zbierano supematanty ze studzienek i oznaczano ilościowo promieniowanie za pomocą licznika y. Uwalnianie spontaniczne mierzono przez inkubację znakowanych 51Cr komórek docelowych w nieobecności komórek efektorowych. Procent specyficznej cytotoksyczności wyliczano jako:
% cytotoksyczności . _ (100) (średnia liczba cpm. uwalniania w teście - średnia liczba cpm. uwaln. spontanicznie) (średnia liczba cpm. uwaln. maksymalnie-średnia liczba cpm. uwaln. spontanicznie)
Oznaczenia immunosorpcyjne związane z immunoblotem i enzymami (ELISA). Wirus oczyszczony w gradiencie sacharozy stosowano jako substrat w oznaczeniu typu immunoblot według opisu Yamamoto i wsp. 1993. FIVPet z płynu hodowlanego komórek zakażonych klarowano za pomocą wirowania z małą szybkością (2000 obrotów/minutę przez 45 minut), zatężano za pomocą ultrawirowania (16000 obrotów/minutę przez 2 godziny) i oczyszczano przez ultrawirowanie przez ciągły gradient sacharozy 10/50% (wagowo/objętościowych). Oczyszczony w ten sposób wirus użyto jako substrat do oznaczenia typu immunoblot.
Stosowano zmodyfikowaną uprzednio opisaną technikę immunoblot (Yamamoto i wsp., 1991a). Przygotowano paski biotu wirusa przez solubilizację wirusa w 0,1% SDS, a następnie wykonano elektroforezę na 10% żelu SDS-poliakiylamidowym i przeniesienie elektrofotyczne na błonę nitrocelulozową. Próbki surowicy z szczepionych kotów rozcieńczano 1:50 w buforze 3 (0,15 M chlorek sodu, 0,001 M kwas edytowy, 0,05 M TRIS wolna zasada, 0,05% Tween 20, i 0,1% albumina z surowicy krwi bydlęcej) i inkubowano z paskami biotu wirusa w oddzielnych studzienkach płytki do immunobiotów przez 18 godzin w 37°C. Paski biotu płukano oddzielnie roztworem do płukania (0,15 M NaCl i 0,05% Tween 20 w dejonizowanej H2O), inkubowano z biotynylowaną IgG przeciwkocią (Vector Laboratories, Burlinga188 041 me, CA) przez 1 godz. w 37°C i płukano trzy razy roztworem do płukania. Paski następnie inkubowano pojedynczo ze Streptavidin skonjugowaną z peroksydazą z chrzanu (Vector Laboratories) przez 30 minut. Po wyczerpującym płukaniu inkubowano każdy pasek ze świeżym roztworem substratu (0,05% diaminobenzydyna, 400 mg/ml NiCL i 0,01% H2O2 w 0,1 M buforze Tris, pH 7,4) w temperaturze pokojowej. Reakcję przerywano nadmiarem destylowanej H2O po ustaleniu się widzialnych pasm i paski biotu suszono. Następnie określano masę cząsteczkową prążków na immunoblotach przez porównanie ich z odległością migracji standardów masy cząsteczkowej na pasku uprzednio wybarwionym za pomocą czerni amidowej. Do każdej analizy immunoblotu włączano kontrolną dodatnią i ujemną surowicę jako wzorce wewnętrzne dla oceny diagnostycznej.
ELISA specyficzna w stosunku do antygenu wirusowego została opisana uprzednio (Yamamoto i wsp., 1991a; Yamamoto i wsp., 1993). FIVPet oczyszczony na gradiencie sacharozowym oraz peptydy otoczki (SU) i transbłonowe (TM) zarówno konserwowanych (C) jak i zmiennych (V) obszarów FIVPet użyto do pokrycia 96-studzienkowych płytek Immunolon (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) przy 250 ng/studzienkę z buforem wodorowęglanowym (pH 9,6) przez 12 do 18 godzin w 37°C i użyto jako substraty do ELISA. Sekwencja aminokwasowa peptydu SU-V3-2 to Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp Glu Trp Arg Pro Asp Phe (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1); a sekwencja aminokwasowa peptydu TM-C1 to Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Phe · Phe Cys Lys Ile (SEQ ID NO: 2). Peptydy syntetyczne syntetyzowano na syntetyzatorze peptydów Biosearch 9500 (Biosearch, San Rafael, CA) stosując chemię syntezy peptydów FMOC (Magazine i wsp., 1988). Czystość zsyntetyzowanych peptydów określano przez obecność pojedynczego szczytu w wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i potwierdzano poprzez analizę sekwencji aminokwasów dokonywanej na próbce szczytu.
Płytki powleczone peptydem płukano raz buforem 3 bezpośrednio przed użyciem. Próbki surowicy rozcieńczano 1:200 buforem 3 i inkubowano w studzienkach pokrytych antygenem FIV przez 1 godz. w 37°C, a następnie płukano 6 razy. Studzienki przepłukano roztworem do płukania, inkubowano z biotynylowaną IgG anty-kocią (Vector Laboratories, Burlingame, CA) przez 1 godz. w 37°C, płukano 6 razy i inkubowano ze Streptavidin koniugowaną z peroksydazą z chrzanu (Vector Laboratories) przez 1godzinę w 37°C. Studzienki płukano następnie 6 razy roztworem do płukania i inkubowano z roztworem substratu do ELISA (0,005% tetrametylobenzydyny i 0,015% H2O2 w 0,96% roztworze cytrynianu) w temperaturze pokojowej. Reakcję stopowano przez dodanie 0,1 M kwasu fluorowodorowego po ustaleniu widzialnej barwy mieszaniny reakcyjnej w kolejno rozcieńczanych standardach złożonych ze znanych surowic kocich FIV-dodatnich. Mierzono absorpcję światła w czytniku ELISA BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) przy gęstości optycznej 414 nm.
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PGR). Poziom prowirusowego DNA w komórkach zakażonych śledzono za pomocą różnicowej PCR, która została niedawno opracowana aby rozróżnić wiele szczepów FIV od tego samego lub innych podtypów (Okada i wsp., 1994). Jako sposób zwiększenia czułości PCR, zastosowano zestawy primerów do PCR na zakładkę pokazane w tabeli 1. PCR przeprowadzono w reakcji dwuetapowej, pierwszy z parą zewnętrznych primerów (wspólnych dla wszystkich szczepów FIV) w warunkach, które opisali Okada i wsp., 1994. W drugim etapie PCR 1/25 produktu pierwszego etapu amplifikowano stosując wewnętrzne primery (specyficzne dla każdego szczepu FIV). Stosując PCR na zakładki można odróżnić od siebie komórki zakażone FIVPet, FIVuk8, FIVsang, FIVAom1, FIYAom i FIVsW.
188 041
Tabela 1
Zestawy primerów do różnicowej PCR
Podtyp Szczep Primer (orientacja) Sekwencja Pozycja*
Zestawy zewnętrznych nie wspólna (+) GAAATGTtATjAATATTGCTGG (SEQ ID NO: 3) 1570-1589
primerów wszystkie dotyczy wspólna (-) GAATTGATTTTGATTACATCC (SEQ ID NO: 4) 2112-2092
Zestawy wewnętrznych primerów
A Petaluma Pet(+) Pet(-) TAGTAGTrATAGTGGTACTA (SEQ ID NO: 5) TCTTTAAGGCTTCAGTCACCT (SEQ ID NO: 6) 1659-1678 1984-1964
UK-8 UK8(+) UK8(-) GTACAAATAGTAGTAGTACAA (SEQ ID NO:7) TCTTTAAGGCrTCAGTCACCT(SEQ ID NO: 8) 1646-1666 1984-1964
B Bangston Bang (+) Bang (-) GGGACTACTAGCAATGGAATA (SEQ ID NO: 9) AGTGCCTCAGTrATrTTATCC (SEQ ID NO: 10) 1654-1674 1979-1959
Aomori-1 Aol (+) Aol (-) TGGGACTGATGATAGTAAAAC (SEQ ID NO: 11) AGT(^(^(CC^C^A^TTATInHATCC (SEQ ID NO: 12) 1654-1674 1979-1959
Aomori-2 Ao2 (+) Ao2 (-) TGGGAiC^i^^^T^A^-^^AGTGAAAC (SEQ ID NO: 13) TTTGCCTCAATAATΠHTACC (SEQ ID NO: 14) 1654-1674 1979-1959
D Shizuoka Shi (+) Shi (-) TCTTCTTTTCCTACTATAC (SEQ ID NO: 15) ATTTCTTCAGTTTATATAAC (SEQ ID NO: 16) 1663-1681 1979-1960
♦Pozycje nukleotydów odpowiadają występującym w sekwencji Petaluma a liczby przedstawiają pozycję od początku sekwencji env
Przybliżoną ilość DNA prowirusowego na komórkę określano za pomocą półilościowej PCR, w której wykonuje się różne rozcieńczenia DNA ekstrahowanego ze znanej ilości komórek. Tak np. jeśli stosuje się 105 komórek do ekstrakcji DNA, rozcieńczenie 10'5 preparatu DNA w przybliżeniu odpowiada DNA obecnemu w pojedynczej komórce. PCR przeprowadzono przy tych różnych rozcieńczeniach DNA, a ostateczne rozcieńczenie, które dało pozytywny wynik PCR, uważa się za rozcieńczenie końcowe. Liczba komórek odpowiadających rozcieńczeniu końcowemu wykorzystywana jest do określenia procentu komórek zakażonych wirusem w danym preparacie komórek według następującego wzoru:
% zakażonych komórek = * ^θgdzie Z = liczba komórek odpowiadających rozcieńczeniu końcowemu
Oznaczenie odwrotnej transkryptazy (RT). Obecność polimerazy DNA zależnej od RNA (RT) oznaczano w supematantach hodowli zasadniczo jak opisali Rey i wsp. W oznaczeniu RT do wykrywania FIV stosowano poli(rA)-oligo(dT12-i8) jako egzogenny primer dla matrycy, cztery różne trifosforany deoksyrybonukleotydów, 20 mM KCl z Mg++ jako kationem dwuwartościowym i 5 pCi [3h] -znakowanego trifosforanu tymidyny (TTP) na próbkę. 5 mCi [3h]TTP dało średnie całkowite zliczenie 1200000 cpm przy zastosowaniu mieszaniny płynu scyntylacyjnego (1 część ksylenu na 9 części biodegradowalnego scyntylatora do zliczeń Research Products International) w liczniku scyntylacyjnym Beckman LS250 (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). W efekcie wartości RT dla badanych próbek są niższe od 120000 cpm/ml.
188 041
Oznaczenie neutralizacji wirusów. Strategia dla opracowania oznaczeń VN specyficznych dla szczepów i podtypów została opisana (Okada i wsp., 1994). Seryjne rozcieńczenia surowic inaktywowanych termicznie inkubowano z 100 TCID50 każdego szczepu FTV przez 45 minut w 37°C w płytce z 24 studzienkami przed dodaniem kocich obwodowych krwinek jednojądrowych (PBMC) (4x105 komóiek/ml) lub podatnych na FTV komórek FeT-1C (2x105 komórek/ml). Po 3 dniach hodowli komórki płucze się raz zrównoważonym roztworem soli Hanka, aby usunąć resztki wirusa z hodowli, a następnie komórki zawiesza się w świeżej pożywce (RPMT-1640 zawierająca 10% płodową surowicę cielęcą inaktywowaną termicznie, 10 mM bufor HEPES, 50 mg/ml gentamycynę, 5x10'5 M 2-meikaptoetanol i 100 jednostek/ml zrekombinowanej ludzkiej TL-2). Tnfekcję komórek przez wirusy śledzono przez oznaczenia RT zależnej od Mg4* w płynach hodowlanych zebranych w 9, 12, 15 i 18 dniu hodowli. Surowice uznawano za dodatnie dla przeciwciał VN, gdy aktywność RT wynosiła <25% zakażonych hodowli kontrolnych złożonych z surowicy SPF.
Następujące przykłady ilustrują procedury, w tym najlepszy sposób realizacji wynalazku. O ile inaczej nie podano wszystkie podane procenty są procentami wagowymi, zaś wszystkie mieszaniny rozpuszczalników stanowią mieszaniny objętościowe.
P i z y k ła d 1. Linie komórkowe zakażone FTV
Nową linię komórkową kocich komórek T zależnych od interleukiny 2 (TL-2) określaną jako FeT-1C, która jest linią macierzystą klonu FeT-1M zależnego od Ł-2, użyto do ustalenia indywidualnych linii komórkowych przewlekle zakażonych F!VPet, FrVoix, F!VTk8; FlVBang, FlVAom2 lub FTVShi. Klon FeT-łM (także określany jako FTV-Fet11M) został ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki ni 5 275 813, który jest tu włączony poprzez odniesienie i był wykorzystany do wyprodukowania linii komórkowej niezależnej od TL-2, FL-4 (także opisanej w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5275813), która chronicznie wytwarza FdVi>et. Linia komórkowa FeT-1C jest wysoce zakażalna różnymi izolatami z podtypów FTV A, B i D. Długotrwałe pasażowanie linii komórkowej FeT-1C zmniejsza jej zdolność do bycia zakażaną, szczególnie przez podtyp FTV D; z tego względu numer pasażu powinien być niższy niż około 35 pasaży dla optymalnej częstości zakażenia FTV lub stosowania ich do oznaczeń VN. Półilościowa PCR i analizy antygenów rdzenia wirusa wykazały, że wszystkie linie komórkowe eksponowane na FTV były znacząco zakażone po szczególnymi szczepami FTV.
Kocia linia niezależna Ł-2 podatna na zakażenie FTV została także rozwinięta z komórek FeT-1C. Ta linia komórkowa określana jako FeT-J może być zakażona przez FTV przez wspólną hodowlę stosując pożywki lub komórki zakażone F!V. Tak np. linię komórkową FeT-1C zakażoną FTVBang koinkubowano w nieobecności TL-2 z niezakażonymi komórkami FeT-J, aby ustalić niezależną od TL-2 linię komórkową FeT-J zakażoną F^Bang (określana jako Bang/FeT-J). W metodzie zakażania za pomocą wspólnej hodowli komórki Bang/FeT-1C połączono z niezakażonymi komórkami FeT-J w stosunku od około 2:1 do około 10:1 (zakażone : niezakażone). Mieszaninę komórek hodowano w pożywkach w nieobecności TL-2 przez kilka dni i pozwolono na wymarcie komórek FeT-1C. Pozostałe komórki były więc komórkami FeT-J zakażonymi FTVBaig. Tak więc komórki FeT-1C zakażone FTV mogą być wykorzystane do zakażania komórek FeT-J i ustalania niezależnych od TL-2 linii komórkowych FeT-J zakażonych różnymi podtypami Fl'V. Metoda wspólnej hodowli z komórkami FeT-1C zakażonymi FTV dała linie komórkowe FeT-J niezależne od TL-2 wytwarzające umiarkowane do wysokich ilości różnych podtypów 1TV.
Linię komórkową FeT-1C również zakażono FTV,Shi i wielokrotnie pasażowano, aby wytworzyć niezależną od TL-2 linię komórkową określoną jako Shi/FeT-1C. Linia komórkowa Shi/FeT-1C była następnie wspólnie hodowana z FeT-J w nieobecności TL-2, tak że powstała niezależna od TL-2 linia komórkowa zakażona FllYShi, która została określona jako Shi/FeT-J. Niezależna od TL-2 linia komórkowa Shi/FeT-J produkuje wyższe poziomy FTVShi niż zależna od TL-2 linia komórkowa Shi/FeT-1C (fig. 1).
Linię komórkową FeT-J zakażoną FTVBang uzyskano także bez użycia linii komórkowej FeT-1C. Linię komórkową FeT-J zakażono bezpośrednio inokulum FTY^ang wolnym od komórek i pasażowano wielokrotnie bez TL-2. Powstała w wyniku tej procedury niezależna od TL-2
188 041 linia komórkowa produkująca FIVBang określona została jako Bang/FeT-J. Linia komórkowa Bang/FeT-J produkowała wyższe poziomy FIVBang niż zależna od IL-2 linia komórkowa Bang/FeT-1C, którą uzyskano przez zakażenie linii komórkowej FeT-1C przez FIYBang (fig. 1).
Przykład 2. Szczepionka przeciw wielu podtypom FIV
Komórki zakażone FIV usunięto z supematantów przez wirowanie, poddano inaktywacji i użyto jako szczepionki. Zarówno zakażone komórki jak i wirus inaktywowano przez traktowanie 1,25% paraformaldehydem przez 24 godziny w 5°C, a następnie odpowiednio wyczerpująco płukano lub dializowano wobec PBS. Metoda ta skutecznie inaktywuje FIV bez powodowania utraty immunogenności. Immunogeny FIV wytworzone takim sposobem są wysoce skuteczne w indukowaniu ochronnej odporności (Yamamoto i wsp., 1993; Yamamoto i wsp., 1991a, Yamamoto wsp., 1991b). Rozważane jest także stosowanie atenuowanych izolatów wirusa w kompozycjach szczepionek według wynalazku.
Choć linia komórkowa FeT-1C zakażona FIVShi została superinfekowana szczepem FIVpet aby uzyskać pojedynczą linię komórkową zakażoną wieloma podtypami FIV (np. linia komórkowa wielopodtypowa A/D FeT-1C), w ciągu dwóch miesięcy koinfekcji poziom prowirusów FIVShi spadł z około 50% do poniżej 5% podczas gdy jednocześnie poziomy prowirusów FIVpet wzrosły do około 50%. Zatem utrzymanie pojedynczej linii komórkowej zakażonej wieloma podtypami FIV do stosowania jako szczepionka przeciw FTV nie stanowi korzystnego rozwiązania.
W konsekwencji kompozycje szczepionek rozwinięto z dwóch indywidualnych linii komórkowych, każda linia była zakażona innym podtypem FIV. Kompozycja szczepionki przeciw dwóm podtypom FIV stanowiła kombinację linii komórkowej zakażonej podtypem A FIV (Pet/FL-4) i linii komórkowej zakażonej podtypem D (Shi/FeT-1C). Linie komórkowe zakażone podtypem A i podtypem D inaktywowano zgodnie z opisem, łączono równe liczby komórek (po 2,5 x 107 komórek, każde w 250 pg MDP) i użyto do immunizacji kotów. Trzy koty SPF zaszczepiono inaktywowanymi komórkami Pet/FL-4, a cztery inne koty zaszczepiono inaktywowanymi komórkami Shi/FeT-1C (2,5x107 komórek/dawkę). Po serii czterech szczepień szczepionka przeciw dwóm podtypom (Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C) indukowała przeciwciała przeciw FIV, w tym znaczące miano przeciwciał VN na oba badane szczepy FIV (fig. 2 i tabela 2, próba I). Cztery koty zaszczepione przeciw dwóm podtypom (Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C) poddano próbie z FWBang (50 CID50). Wszystkim trzem kotom szczepionym Pet/FL-4 i dwóm z kotów szczepionych podano 50 CID50 FIVBang Dwa pozostałe koty szczepione Shi/FeT-1C otrzymały 50 CID50 FIVShi.
Wszystkie koty szczepione przeciw dwóm podtypom były negatywne pod względem FIVBaig, co stwierdzono przez izolację wirusa i PCR PMBC w 6 tygodni po zakażeniu (pi), podczas gdy wszystkie koty immunizowane pozornie były dodatnie pod względem FIVBang lub FIVShi, co stwierdzono przez izolację wirusów i PCR w 6 tygodni po zakażeniu (tabela 2, próba I). Natomiast jeden kot z każdej z obu grup zaszczepionych Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C, którym podawano FIVBang, był dodatni dla FIYBang. Jak oczekiwano, wszystkie koty szczepione FIVShi i następnie testowane przez podanie FIVShi, były negatywne na FIVShi w sześć tygodni po zakażeniu. Tak więc konkretnie podana jako przykład szczepionka przeciw dwu podtypom FIV zapobiegała lub opóźniała zakażenie przy podaniu homologicznego wirusa FIVShi jak i przy podaniu heterologicznego wirusa FWBang·
Koty zaszczepione przeciw dwu podtypom (komórkami Pet/FL-4 i Shi/FeT-1C) wyprodukowały przeciwciała przeciw FIV specyficzne dla białka wirusowego rdzenia p25 (zwanego też FIV p28) po drugim szczepieniu (fig. 2). Wyższe miano przeciwciał na inne antygeny wirusowe wykazano po trzecim-czwartym szczepieniu.. Przeciwciała VN na FIVPet u tych kotów powstały po drugim szczepieniu podczas gdy przeciwciała VN na FIVShi powstały po czwartym szczepieniu (tabela 4). Odpowiedzi CTL na FIVPet i FIVShi wykryto już przy trzecim szczepieniu we wszystkich przebadanych kotach (tabela 3), a silniejsze odpowiedzi CTL na oba szczepy rozwinęły się po czwartym szczepieniu. Co więcej, u dwóch z trzech badanych kotów rozwinęły się odpowiedzi CTL na FIYRang po czwartym szczepieniu. Wyniki wskazują, że po czterech szczepieniach szczepionka przeciw dwóm podtypom powoduje powstanie silnych odpowiedzi CTL na FIVPet i FIVShi (tabela 3) i wysokie miano przeciwciał FIV, w tym miano przeciwciał VN, na oba szczepy FIV (tabela 4).
U kotów zaszczepionych inaktywowanymi komórkami Shi/FeT-1C powstawały przeciwciała na FIV specyficzne w stosunku do wirusowego białka rdzenia p25 po drugim szczepieniu oraz przeciwciała na inne antygeny wirusowe po trzecim szczepieniu (fig. 2). Przeciw188 041 ciała VN na FIVShi u tych kotów powstały po czwartym szczepieniu, natomiast nie wykryto przeciwciał VN przeciw V w czasie szczepień. Obydwa koty szczepione Shi/FeT-1C wytworzyły odpowiedzi CTL na FIVsiu dopiero po czwartym szczepieniu, ale nie powstały u nich odpowiedzi CTL na V nawet po czwartym szczepieniu (tabela 3).
U kotów szczepionych inaktywowanymi komórkami Pet/FL-4 powstały przeciwciała na p25 po drugim szczepieniu (fig. 2) a przeciw innym antygenom wirusowym, w tyra przeciwciała VN przeciw FIVPet, po drugim lub trzecim szczepieniu (tabela 4). Jedyne wykryte reakcje CTL u kotów szczepionych komórkami Pet/FL-4 były przeciw FIVPet.Ogólme, szczepionka przeciw dwóm podtypom FIV indukowała szybciej i wyższe miana przeciwciał VN i odpowiedzi CTL na oba szczepy FIV niż szczepionka przeciw pojedynczemu podtypowi. U kotów pozornie immunizowanych nie powstały przeciwciała przeciwwirusowe, przeciwciała VN i odpowiedzi CTL anty-FIV.
Tabela 2. Ochrona kotów przez szczepionkę przeciw wielu podtypom FIV
Typ szczepionki Liczba kotów Szczep FIV użyty do testu (CIDjo) Średnia liczba przeciwciał VN w dniu 0 po infekj Izolacja wirusa i PCR Ochrona (%)
Pet Shi Bang
1 2 3 4 5 6 7 8
Próba I z podwójną szczepionką (A+D) komórka Pet/FL + komórka Shi/Fet -1C 5 FI^Bang (50 CIDso) 1000 550 <10 3/5 ujemne 3/5 (60% 6 tyg. pz)
komórka Pet/FL 3 FI^Blang (50 CIDjo) 1000 <10 <10 wszystkie dodatnie 0/3 (0% 6 tyg. pz)
komórka Shi/FeT -1C 2 FIVBan|g(50 CIDso) <10 75 <10 wszystkie dodatnie 0/2(0% 6 tyg. pz)
komóika Shi/FeT -1C 2 FIVSh (50 CIDjo) <10 30 <10 wszystkie dodatnie 0/2(0% 6 tyg. pz)
pozornie 3 FIVa«ng(50 CIDjo) <10 <10 <10 wszystkie dodatnie 0/3(0% 6 tyg. pz)
pozornie 2 FIVs,, (50 CIDjo) <10 <10 <10 wszystkie dodatnie 0/2 (0% 6 tyg. pz)
Próba II z potrójną szczepionką (A+B+D)4 kom. Pet/FL -4+kom. Bang/FeT -J 3 FIVu8 1000 370 1000 NA 2/3 (67% 24 tyg. pz)
+ kom. Shi/FeT -1C5,
1 2 3 4 5 6 7 8
kom. Bang/FeT -J 2 FIVuks <10 <10 1000 NA 0/2
kom. Bang/FeT -J 2 FIVBang <10 <10 100 NA 1/2
pozornie niezakażone FeT -J 2 FIVus <10 <10 <10 NA
niezakażone FeT -J 2 FIVukb <10 <10 <10 NA 0/2
pozornie tylko adiuwant 1 FIVik8 <10 <10 <10 NA 0/2
niezakażone FeT -J 1 FIVBanf <10 <10 <10 NA 0/1
pozornie tylko adiuwant 2 FIVflang <10 <10 <10 NA 1/2
1 Inokula testowe FIV produkowano in vitro przez zakażenie pierwotnych PMBC z kotów SPF. Wszystkie rozporcjonowane inokula przechowywano w -70°C i rozmrażano w temperaturze pokojowej tuż przed użp ciem ’ pz - po zakażeniu FIV 3 NA - nie badano ‘ Wyniki VN są po trzecim szczepieniu 5 Czwarte szczepienie przeprowadzono ze zinaktywowanymi komórkami Shi/FeT-J zamiast zinaktywowanymi komórkami Shi/FeT-1C
188 041
Tabela 3. Odpowiedzi CTL u kotów szczepionych podwójną szczepionką
Uwolnienie chromu (% lizy)
3 szczepienie Stosunek efektorrcel 4 szczepienie Stosunek efektorrcel
Kot nr Typ szczepionki Docelowy CTL 10:1 50:1 20:1 10:1 50:1 100:1
K55 Pet + Shi Pet 0 9 20 17 25 33
Bang ND ND ND 0 0 14
Shi 0 9 8 7 il 17
3L4 Pet + Shi Pet 0 11 19 0 11 19
Bang ND ND ND 0 0 0
Shi 0 9 13 0 9 17
N55 Pet + Shi Pet ND ND ND 0 U 17
Bang ND ND ND 0 0 7
Shi ND ND ND 0 9 15
M55 Shi Pet 0 0 0 0 0 0
Bang ND ND ND 0 0 0
Shi 0 0 0 0 7 15
007 Shi Pet 0 0 0 0 0 0
Bang ND ND ND 0 0 0
Shi 0 0 0 0 0 8
2H5D Pet Pet 0 7 15 6 15 25
Bang ND ND ND 0 0 0
Shi 0 0 0 0 0 0
3G1 Pet Pet 0 10 14 6 13 19
Bang ND ND ND 0 0 0
Shi 0 0 0 0 0 0
H7P Pozorna Pet 0 0 0 0 0 0
Bang ND ND ND 0 0 0
Shi 0 0 0 0 0 0
Tabela 4. Miana neutralizacji wirusa (VN) u kotów szczepionych podwójną szczepionką
Kot Przed szczepieniem Po 2 szczepieniach Po 4 szczepieniach
Szczepionka FTV Pet Bang Shi Pet Bang Shi Pet Bang Shi
K55 Pet + Shi >10 >10 >10 100 <10 <10 1000 <10 100
3L4 Pet + Shi >10 >10 >10 100 <10 <10 1000 <10 1000
N55 Pet + Shi >10 >10 >10 10 <10 <10 1000 <10 1000
973 Pet + Shi >10 >10 >10 10 <10 <10 1000 <10 100
M55 Shi >10 >10 >10 >10 >10 <10 <10 <10 50
006 Shi >10 >10 >10 >10 >10 <10 <10 <10 100
007 Shi >10 >10 >10 >10 >10 <10 <10 <10 10
999 Shi >10 >10 >10 >10 >10 <10 <10 <10 50
3G1 Pet >10 >10 >10 <10 <10 <10 1000 ' <10 <10
3G2 Pet >10 >10 >10 10 <10 <10 1000 <10 <10
2H5D Pet >10 >10 >10 100 <10 <10 1000 <10 <10
8C2 Pozorne >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10
8C8 Pozorne >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10
H7P Pozorne >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10
8G8 Pozorne <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
RF5 Pozorne <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10
Szczepionkę przeciwko trzem podtypom FIV przygotowano z trzech linii komórkowych, z których każda była zakażona szczepem wirusa z innego podtypu FIV (A lub B lub D). Trzy koty wolne od specyficznych patogenów immunizowano szczepionką przeciw trzem podtypom (FIVf>et + FIVBang + FIVShi). Inne koty immunizowano szczepionkami przeciwko pojedynczemu podtypowi FIYeang aby ocenić immunogenność makrofagotropiczego FJYsang jako składnika szczepionki. Miana przeciwciał VN wskazują, że zarówno szczepionka przeciw trzem podtypom (FIVPet + FIVBang + FIYShi) jak i szczepionka przeciw jednemu podtypowi FIVBang, wywoływały wysokie miana przeciwciał przeciwwirusowych już po drugiej immunizacji (tabela 2,
188 041 próba II i tabela 5). Tak wiec zarówno limfotropowy jak i makrofagotropowy FIV może być stosowany jako składnik kompozycji szczepionek.
Trzy koty SPF immunizowane kombinacją inaktywowanych komórek Pet/FL-4, inaktywowanych komórek Bang/FeT-J i inaktywowanych komórek Shi/FeT-1C (2,5 x 107 każdych komórek w łącznie 250 pg MDP) wyprodukowały przeciwciała na FIV specyficzne w stosunku do wirusowego białka rdzenia p25 i na inne antygeny wirusowe, w tym FIV SU i białko otoczki TM, po drugim szczepieniu (fig. 3, 4, 5). Przeciwciała VN na FIVPet, F^Bang i FIVShi powstały u większości kotów już po drugiej immunizacji, a u wszystkich kotów po trzeciej immunizacji (tabela 5). Na dodatek jeden kot zawierał przeciwciała reagujące krzyżowo z FIVuk8 po trzeciej immunizacji. 4 koty SPF szczepione tylko inaktywowanymi komórkami Bang/FeT-J wyprodukowały przeciwciała FIV specyficzne w stosunku do wirusowego białka rdzenia p25 i na inne antygeny wirusowe po drugim szczepieniu (fig. 3). Przeciwciała VN na FIVBang u tych kotów powstały po drugiej immunizacji (tabela 5), podczas gdy przeciwciała VN na FIVP^et i FIVuk8 nie były wykrywalne w czasie immunizacji. Odpowiedzi CTL kotów immunizowanych trzykrotnie szczepionką przeciwko trzem podtypom FIV (komórki Pet/FL-4, Bang/FeT-J i Shi/FeT-1C) na docelowe komórki podtypów FIV A, B i D są pokazane w tabeli 6. Stwierdzono odpowiedzi CTL na wszystkie podtypy FIV. Tak więc szczepionka przeciw trzem podtypom indukowała szeroką odpowiedź CTL oraz szybsze i wyższe miana przeciwciał VN i SU-otoczka niż szczepionka przeciw pojedynczemu typowi. Ani niezainfekowane FeT-J ani pozornie immunizowane koty SPF nie wyprodukowały przeciwciał przeciw wirusom, ani przeciwciał VN.
188 041 o
ł“4
V o o
T-“4
V V
Tabela 5. Miana neutralizacji wiiuisa (VN) u kotów szczepionych potrójną szczepionką
u
CL
u
CL
S t3
S
4)
S a
o. M
OJD a
a w
u
CL
O O O wM »—4
V V V
8 o
V rt
O O O ł4 t—4 rV V V o o o
V->4
V V V o o o ?*4
V V V o o o ^4 9—4
V V V aj /3 /3 /3
Ul CZ) 00 tio oc
S S 3
CO 03 03 + Ψ + «5 1» $>
Oh 04 04 «-> r 52 in P1 <!
*“> O H o o o ^4
V V V o o o
7 7 o o o
7 7 o o o ^4 ^4
V V V o o o ^4
V V V o o o ^4 «-Η ^-4
V V V o o o r*4
V V V
00 00 S e3 S
CO CO 03 o o r—ł t—<
V V o o v 7 o o ^4
V V o o
V V o o ^4
V V
O o
V V o o
V V o o
7 o o rH f-4
V V o o
V V
o o <<> <*» o o r—4
V V o o
V V o o r·*
V V o o ł-H
V V o o
F·^
V V o
T·^
V o
F4
V o
ł—4
V o
1—4
V o
o r·^
V {£ z
>
>c
Φ
N υ
c
N
Λ
O >1
C
N
Ό
Tf
O
JS u
Ό s
•σ
-rł c
io c
•o
Φ (tf m
<fl c
-H
X
188 041
Tabela 6
Odpowiedzi CTL kotów szczepionych potrójną szczepionką po trzeciej immunizacji
Kot Docelowy FW Stosunek efektor/cel Aktywność CTL (% uwolnionego chromu)
100 44%
QY1 FIVp„ 50 10 21% 4%
100 13%
QY1 FIV Bang 50 10 6% 1%
100 23%
QY1 FIVuk8 50 10 8% 2%
100 8%
Tas FIV Bang 50 3%
10 1%
100 3%
Tas FIVSh 50 1%
10 0,3%
100 10%
J55 FIVuk8 50 2%
10 1%
Przykład3. Przeciwciiaa VN na podtypy FIV
Opracowano także sposób oznaczenia przeciwciał na FIV stosując komórki FeT-1C według wynalazku. W surowicy z kotów zakażonych FIVPet i kotów SPF szczepionych inaktywowanymi komórkami Pet/FL-4 lub inaktywowanym wirusem FIVPet oznaczano miano przeciwciał VN stosując albo komórki FeT-1C albo PMBC, zgodnie z opisaną metodą oznaczenia VN. Surowice dwóch kotów SPF, które nie były szczepione i nie były zakażone FIV, zastosowano jako surowice kontrolne. Surowice z kotów szczepionych i zakażonych FIV miały wysokie miano przeciwciał VN, 1000 lub wyższe, podczas gdy surowice z nieszczepionych kotów SPF nie miały wykrywalnego miana przeciwciał VN. Oznaczenie VN oparte na FeT-1C daje miana przeciwciał VN podobne do uzyskiwanych z zastosowaniem pierwotnych PMBC z kotów (tabela 6). Wynik ten wykazuje, że miana przeciwciał VN w oznaczeniu Vn z zastosowaniem komórek FeT-1C korelują z wynikami otrzymanymi przy oznaczeniu VN z zastosowaniem PBMC. Tak więc komórki FeT-1C mogą być dogodnie zastosowane zamiast PMBC w standardowym oznaczeniu VN dla FIV ponieważ komórki FeT-1C mogą być zakażone wszystkimi podtypami FIV i mogą być łatwo namnażane w hodowli tkankowej.
Tabela 7
Miana VN mierzone w FeT-1C i PBMC
Miano VN
1 2 3
Źródło surowicy FeT-1C PMBC
Szczepione1 5000 5000
Szczepione1 >1000 >1000
Zakażone2 1000 1000
188 041 cd. tabeli 7
1 2 3
Zakażone2 >1000 >1000
Immunizowane niezakażonymi komórkami3 <10 <10
Immunizowane · niezakażonymi komórkami3 <10 <10
1 Surowice od kotów szczepionych zinaktywowanymi komórkami Pet/FL-4
Surowice od kotów zakażonych FlVp„ 3 Surowice od kotów immunizowanych zinaktywowanymi niezakażonymi komórkami FeT-J
Przykład 4. ImmunotypowanieszczepówFIV
Przeprowadzono badania in vitro z zastosowaniem komórek FeT-1C aby ocenić czy podtyp FIV był odbiciem immunotypu FIV. Immunotypowanie jest ważne dla zrozumienia roli przeciwciał vN w ochronie nadawanej przez szczepionki. Surowice odpornościowe z kotów zakażonych szczepami podtypu A FIV (FIVpet,. FIVDix) FWuo) podtypu B (FIVBang, FIYAomi) i podtypu D (FIVShi) testowano pod względem zdolności do neutralizacji tych szczepów in vitro stosując komórki FeT-1C w oznaczeniu VN (fig. 6). Wszystkie testowe surowice odpornościowe miały aktywność neutralizującą w stosunku do odpowiedniego homologicznego szczepu FIV FIVPet:, szczep podtypu A, był w znaczący sposób krzyżowo neutralizowany przez surowice odpornościowe z kotów zakażonych FIVdx, FIVpet różni się od FIVDix o około 9% w obszarach glikoproteiny powierzchniowej (Env). Surowice odpornościowe z kotów zakażonych szczepami z podtypu A krzyżowo neutralizowały FWBang z podtypu, B ale nie neutralizowały podtypu D FIVShi. Surowice odpornościowe kotów zakażonych szczepami podtypów B i D krzyżowo zobojętniały tylko inne szczepy FIV w obrębie homologicznego podtypu. Dodatkowo surowice odpornościowe z kotów zakażonych FIYuks neutralizowały FINBang ale nie neutralizowały szczepów FIV w obrębie podtypu A. Choć FIV^ik8 jest klasyfikowany jako podtyp A (Sodora i wsp., 1994; Rigby i wsp., 1993; Kakinuma i wsp., 1995), wyniki te sugerują, że surowice odpornościowe przeciw FIYuk8 rozpoznają szczepy podtypu B a nie rozpoznają szczepów podtypu A, i może to tłumaczyć dlaczego inaktywowane szczepionki FWPet były nieskuteczne w stosunku do FIVuk8 i F^siu (Johnson i wsp., 1994). Tak więc istnieje luźna korelacja między genotypem i immunotypem. Choć analizy genotypu pozwalają na klasyfikację szczepów FIV, badania krzyżowej neutralizacji przez przeciwciała są odbiciem immunogenności szczepów FIV, co jest ważnym parametrem w szerokozakresowej ochronie humoralnej wywoływanej przez szczepionkę.
Przykład 5. Tropizm komórek w stosunku do FIV
Tropizm komórkowy szczepów FIV uzyskanych z zakażonych linii komórkowych FeT-1C i FeT-J porównano z tropizmem szczepów FIV uzyskanych z pierwotnych PMBC (tabela 8). Dwa izolaty FIV, FIVuks i FIVBang, są równym stopniu limfotropowe i makrofagotropowe, podczas gdy FIYShi jest wysoce limfotropowy. FIVPet· był bardziej limfotropowy niż makrofagotropowy, a jego tropizm w stosunku do komórek nie zależał w sposób znaczący od źródła komórkowego. Tropizm w stosunku do makrofagów F^ang nie zależał od komórek, z których pochodził wirus. Ponieważ tropizm komórkowy szczepów FIV z zakażonych linii komórkowej FeT-1C jest porównywalny do produkowanych z pierwotnych PMBC, wirus hodowany w komórkach FeT-1C może być wykorzystany jako inokulum do oznaczeń VN, a także jako inokulum in vivo do badań w celu oceny terapeutycznych i profilaktycznych podejść.
188 041
Tabela 8
Tropizm komórkowy izolatów FIV
FIV Źródło FIV TCID5o
(podtyp) FeT-1C PBMC Makrofag pęcherzyka Pierwotne mikrogleje
Petaluma (A) PBM 10* 10* 102 ND
Petaluma (A) FeT-1C” 10* 10* 101 ND
Petaluma (A) FL-44 10* 10* 10' ND
Dixon (A) FeT-1C 10* 103 10' ND
UK8(A) PBMC 102 103 103 ND
UK8(A) FeT-1C 103 103 103 ND
Bangston (B) PBMC 103 103 103 102
Bangston (B) FeT-1Cb 103 103 103 102
Bangston (B) FeT-J” 103 103 103 102
Shizuoka (D) PBMC 102 103 <1 ND
Shizuoka (D) FeT-1C” 103 103 <1 ND
Shizuoka (D) FeT-J” 103 103 ND ND
* Wszystkie inokula wirusów doprowadzano do 120000 cmp/ml aktywności RT przed miareczkowaniem 5x105 komórek/ml kocich komórek T (Fet-1C) lub pierwotnych komórek kocich, a wyniki przedstawiają najwyższe miano wirusa zebranego przez 21 dni hodowli.
b Te same komórki jak szczepionki z zakażonych komórek
188 041
(1) Informacja ogólna Lista sekwencji
(i) Zgłaszający: Nazwa Zgłaszającego: University of Flooida
Ulica: 223 Grinter Hall
Miasto: Gidzesvi01e
Stan/Prowincja: Florida
Kraj : USA
Kod pocztowy: 32611
Telefon: (352) 522-8222 Fax: (352 ) 32226600
Nazwa Zgłaszającego: Regents of the Univeisdty of Cali^nia
Ulica: 2120 Shattuck Avenue: Suite 220
Miasto: Berkeley
Stan/Prowincja: CcildoonZd
Kraj : USA
Kod pocztowy: 92774
Telefon: ((21) 778-0000 lax: (012) 748-6639
(ii) tytuł zgłoszenia: Linia komórkowa T pochodzenia ko ciego (iii) Liczba sekwencji: 16 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adres : Saliwanchik & Sa0dWinchdk
(B) Ulica: 2721 N.W. 71st Street, Suite A-l
(C) Miasto : Giinesvd00e
(D) Stan: Florida
(E) Państwo: USA
188 041 (F) Kod pocztowy: 32606 (v) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny:PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja #1.30 (vi) Dane o zgłoszeniach (A) Numer zgłoszenia: US (B) Data zgłoszenia:
(C) Klasyfikacja:
(viii) Informacja o rzeczniku/agencie (A) Nazwisko: Pace, Doran R.
(B) Numer rejestracyjny: 38 261 (C) Numer sprawy: UF152 (ix) Informacja o telekomunikacji (A) Telefon (904) 375-8100 tB) Telefaks (904) 372-5800 (2) Informacja o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:
Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp
10 15
Glu Trp Arg Pro Asp Phe (2) Informacja o SEQ ID NO: 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
188 041 (A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) TYP: aminokwasy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (v) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:
Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile
10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:
GAAATGTATA ATATTGCTGG 20 (2)Informacja o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4
GAATTGATTT TGATTACATC C 21 (2) Informacja o SEQ ID NO: 5 (i) CJHARAKTERYSTYJK. SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
188 041 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 5
T.AGT.AGTTAT AGTGGTACTA (2) Informacja o SEQ ID NO: 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad
(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) RODZAJ NICI : poj edyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(ix) OPIS ! SEIOEENCJI: SEQ ^D HO: 6
TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T (2) Informacja o SEQ ID NO: 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 7
GTACAAATAG TAGTAGTACA A (2) Informacja o SEQ ID NO- 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 8
TCTTTAAGGC TTCAGTCACC T
188 041 (2) Informacja o SEQ ID NO: 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 9
GGGACTACTA GCAATGGAAT A 21 (2) Informacja o SEQ ID NO: 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C 21 (2) Informacja o SEQ ID NO: 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad
(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) RODZAJ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 11
TGGGACTGAT GATAGTAAAA C 21 (2) Informacja o SEQ ID NO: 12 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
188 041 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 12
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C (2) Informacja o SEQ ID NO: 13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad
(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) RODZAJ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA; liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(ci) OPIS ! SEKWENCJI: SEQ ID NO: 13
TGGGACTGAT AATAGTGAAA C (2) Informacja o SEQ ID NO: 14 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 14
AGTGCCTCAG TTATTTTATC C (2) Informacja o SEQ ID NO: 15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ci) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 15
188 041
TCATCATTTC CAACATGTC (2) Informacja o SEQ ID NO: 16 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 16
AATGCTTCAG TTATTTGATC
188 041
Cytowane pozycje literaturowe
Pedersen, Niels C., Janet K. Yamamoto, opis patentowy Stanów Zjenoczonych Ameryki ni 5 037 753, wydany 6 sierpnia 1991 r. Pedersen, Niels C., Janet K. Yamamoto, opis patentowy Stanów Zjenoczonych Ameryki nr 5 118 602, wydany 2' czerwca 1992 r. BByars, N.E.,
A. C. Allison (1987) „Adjuvant foimulation for use in vaccines to elicit both cell-mediated and humoial immunity”, Vaccine 5:223-228.
Pedersen, N.C., E.W. Ho, M.L. Brown, J.K. Yamamoto (1987) „Tsolation of a T-lymphotiopic viius from domestic cats with an immunodeficiency-like syndrome”, Science 235:790-793. Yamamoto, J.K., N.C. Pedersen, E.W. Ho, T. Okuda, GH. Theilen (1988a) ,JFeline immunodeficiency syndrome - a comparison between feline T-lymphotiopic lentiviius and feline leukemia viius”, Leukemia, Decembei Supplement 2:204S-215S.
Yamamoto, J.K., E. Spargei, E.W. Ho, P.H. Andersen, T.P. O'Connoi, C.P. Mandell, L. Lowenstine, N.C. Pedersen (1988) „Pathogenesis of expeiimentally induced feline immunodeficiency virus infection in cats”, Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258. Ackley, C.D., J.K. Yamamoto, N.B. Levy, N.C. Pedersen, M.D. Cooper (1990) „Tmmunologic abnoimalities in pathogen-flee cats expeiimentally infected with feline immunodeficiency viius”, J. Virol. 64:5652-5655.
Olmsted, R.A., A.K. Barnes, J.K. Yamamoto, V.M. Hirsch, R.H. Purcell, P.R. Johnson (1989) „Moleculai cloning of feline immunodeficiency viius”, Proc. Nat. Acad. Sci. 86:24482452. Olmsted, R.A., V.M. Hirsch, R.H. Purcell, P.R. Johnson (1989) „Nucleotide sequence analysis of feline immunodeficiency viius: Genome organization and lelationship to other lentiviius”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8088-8092.
Talbott, R.L., E.E. Spargei, K.M. Lovelace, W.M. Fitch, N.C. Pedersen, P.A. Luciw, J.H. Elder (1989) „Nucleotide sequence and genomic organization of feline immunodeficiency viius”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5743-5747.
Hosie, M.J., O. Jairett (1990) „Seiological responses of cats to feline immunodeficiency virus”, AIDS 4:215-220.
Sodoia, D.L., E.G Shpaei, B.E. Kitchell, S.W. Dow, E.A. Hoover, J.L Mullins (1994) „Tdentification of three feline immunodeficiency virus (FTV) env gene subtype and comparison of the FTV and human immunodeficiency viius type 1 evolutionaiy patterns”, J. Virol. 68:2230-2238.
Rigby, M.A., E.C. Holmes, M. Pistello, A. Mackay, A.J. Leigh-Brown, J.C. Neil (1993) „Evolution of structuial pioteins of feline immunodeficiency viius: moleculai epidemiology and evidence of selection for change”, J. Gen. Virol. 74:425-436. Kakinuma, S., K. Motokawa, T. Hohdatsu, J.K. Yamamoto, H. Koyama, H. Hashimoto (1995) „Nucleotide Sequence of Feline Tmmunodeficiency Virus: Classifieation of Japanese Nolates into Two Subtypes Which Aie Distinct from Non-Japanese Subtypes”, Journal of Wrology 69(6):3639-3646.
Johnson, C.M., B.A. Torres, H. Koyama, J.K. Yamamoto (1994) „FTV as a model for ATDS vaceination”, ATDS Res. Hum. Retroviruses· 10:225-228.
Yamamoto, J.K., T. Hohdatsu, R.A. Olmsted, R. Pu, H. Louie, H. Zochlinski, V. Acevedo, H.M. Johnson, GA Soulds, M.B. Gaidner (1993) „Experimental yaccine piotection against homologous and heterologous stiains of feline immunodeficiency viius”, J. Virol. 67:601-605.
Yamamoto, J.K., T. Okuda, C.D. Ackley, H. Louie, H. Zochlinski, E. Pembroke, M.B. Gardnei (1991a) „Experimental vaecine protection against feline immunodeffciency viius”, AIDS Res. Hum.. Retroviruses 7:911-922.
Yamamoto, J.K., C.D. Ackley, H. Zochlinski, H. Louie, E. Pembroke, M. Torten, H. Hansen, R. Munn, T. Okuda (1991b) „Development of fL-2-independent feline lymphoid cell lines chionically infected with feline immunodefleieney virus: impoitance for diagnostic ieagents and vacc^es”, Intervirol. 32:361-375.
Muiphy, F., D.W. Kingsbury (1990) „Viius Taxonomy”, w Fields Wrology, 2 wydanie,
B. N. Fields, D.M. Knipe i inni, redakcja, Raven Press, New York, rozdz. 2, sti. 9-36.
Louwagie, J., R.E. McCutchan, M. Peeters, T. P. Brennan, E. Sanders-Buell, G.A. Eddy,
G. van den Grosen, K. Fransen, GM. Gershy-Damett, R. Deleys, D.S. Burke (1993) „Phyloge28
188 041 netic analysis of gag genes from 70 International HIV-1 isolates provides evidence for multiple genotypes”, AIDS 7:769-780.
Rey, M.A., B. Spire, D. Dormont, F. Barre-Suinoussi, L. Mon-tagnier, J.C. Chermann (1984) „Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of a new human T-lymphotropic retrovirus 1 (lymphadenopathy associated virus)”, Biochem. Biophys Res. Commun. 21:1247-1253. '
Magazine, H.I., J.M. Carter, J.K. Russell, B.A. Torres, B.M. Dunn, H.M. Johnson (1988) „Use of synthetic peptides to identify and end terminal epitope on mouse gama ifn that may be involved in function”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1237. Okada, S., R. Pu, E. Young, W. Stoffs, J.K. Yanamoto (1994) „Superinfection of cats with FIV Subtypes A and B”, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10:1739-1746.
Yamamoto, Janet K., Niels C. Pedersen, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 275 813, wydany 4 stycznia 1994 r. Merrifield, R.B. (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156.
188 041
188 041
Fig. 2
Szczepionka Kot nr
Kolekcja surowic (po MCZApienleCtl*)
Ην„ 4 M FlVw_ FIVrK55 N55 3L4 973 M55 006 007 999 3G1 302
2 4 0 2 4 024 024 024 024 024 024 024 024 p25—
* Przed podaniem wirusa
Fig. 3
Szczepionka Kot nr
Kolekcja surowic (po ezczapłenlach*) p25 -*
Przed podaniem wirusa
188 041
188 041
188 041
Miano VN
188 041
1000000
UNIA KOMÓREK
···♦·· Beng-FeT-1C
Bang-FeT-J
...χ. Sht-FeT-J
SW-FeT-IC
•A·· Unlntacted FaT-1C
—X— Unlnfected FeT-J
(nlezakałone FeT-1C I FeT-J = Tło)
Fig. 1
100000
10000
1000
DNI
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Linia komórkowa T pochodzenia kociego, wykazująca identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu ATCC CRL 11968.
  2. 2. Linia komórkowa według zastrz. 1, zakażona wirusem FIV, przy cczym podtyp tego wirusa FTV jest wybrany z grupy obejmującej podtypy A, B, C i D.
  3. 3. Linia komórkowa według zastrz. 1, zakażona co najmniej jednym ze szczepów wirusa FIV wybranym z grupy obejmującej FV'Dix, FIVuk8, FIVBang, F^Aomi, FTVAom2, FIVPct i FIVShi.
  4. 4. Linia komórkowa według zastrz. 1, którą stanowi linia komórkowa oznaczona numerem dostępu ATCC CRL 11968.
  5. 5. Linia komórkowa T pochodzenia kociego, wykazująca identyfikujące cechy linii komórkowej T zdeponowanej pod numerem dostępu AtCc cRl 11967.
  6. 6. Linia komórkowa według zastrz. 5, zakażona wirusem FTV, przy czym podtyp tego wirusa FIV jest wybrany z grupy obejmującej podtypy A, B, C i D.
  7. 7. Linia komórkowa według zastrz. 5, zakażona co najmniej jednym ze szczepów wirusa FTV wybranym z grupy obejmującej FIVd«, FTVuk8, FiVBang, FIVAom, FTVAom2, FTVPet i FTVsh.
  8. 8. Linia komórkowa według zastrz. 5, którą stanowi linia komórkowa oznaczona numerem dostępu ATCC CRL 11967.
  9. 9. Linia komórkowa T pochodzenia kociego oznaczona jako Shi/FeT-1C i o numerze dostępu ATCC CRL 11976, zakażona szczepem FTVshi wirusa FIV.
  10. 10. Linia komórkowa T pochodzenia kociego oznaczona jako Bang/FeT-J i o numerze dostępu ATCC CRL 11975, zakażona szczepem FFVBang wirusa FTV.
PL35824896A 1995-08-25 1996-08-23 Linia komórkowa T pochodzenia kociego PL188041B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51938695A 1995-08-25 1995-08-25
PCT/US1996/013580 WO1997007817A1 (en) 1995-08-25 1996-08-23 Multi-subtype fiv vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL188041B1 true PL188041B1 (pl) 2004-11-30

Family

ID=24068097

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL35824896A PL188041B1 (pl) 1995-08-25 1996-08-23 Linia komórkowa T pochodzenia kociego
PL96325376A PL186706B1 (pl) 1995-08-25 1996-08-23 Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96325376A PL186706B1 (pl) 1995-08-25 1996-08-23 Szczepionki przeciw wielu podtypom FIV

Country Status (17)

Country Link
US (5) US5846825A (pl)
EP (2) EP1090985B1 (pl)
JP (4) JP4142741B2 (pl)
KR (2) KR100482616B1 (pl)
AT (2) ATE297218T1 (pl)
AU (3) AU728750B2 (pl)
BR (1) BR9610343A (pl)
CA (1) CA2230029C (pl)
DE (3) DE69634820T2 (pl)
DK (2) DK0848615T3 (pl)
ES (2) ES2242967T3 (pl)
HK (1) HK1038584A1 (pl)
IL (3) IL163873A0 (pl)
NZ (3) NZ316347A (pl)
PL (2) PL188041B1 (pl)
PT (2) PT1090985E (pl)
WO (1) WO1997007817A1 (pl)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6254872B1 (en) * 1995-08-25 2001-07-03 University Of Florida Multi-subtype FIV vaccines
DK0848615T3 (da) * 1995-08-25 2005-10-03 Univ Florida Muilti-undertyoe-FIV-vacciner
US6458528B1 (en) * 1998-05-15 2002-10-01 Idexx Laboratories, Inc. Diagnosis of feline immunodeficiency virus infection using ENV/GAG polypeptide markers
AU2002244103A1 (en) * 2001-02-22 2002-09-12 University Of Florida Materials and methods for detecting, preventing, and treating hiv and fiv retroviral infection
PL373847A1 (pl) 2001-05-10 2005-09-19 Wyeth Kompozycja i sposób zwiększenia gęstości komórkowej w hodowlach komórkowych zakażonych lentiwirusem
JP2006528244A (ja) 2003-05-12 2006-12-14 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド Ｆｉｖ感染予防接種のための材料と方法
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
WO2006011919A1 (en) 2004-06-30 2006-02-02 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7201903B2 (en) * 2003-09-11 2007-04-10 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7285272B2 (en) 2003-12-18 2007-10-23 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
DE602005027326D1 (de) 2004-02-19 2011-05-19 Idexx Lab Inc Verfahren und vorrichtung zum nachweis von katzen-immunschwächevirus
US7335360B2 (en) 2004-06-30 2008-02-26 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
WO2006011917A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-02 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
US7291338B2 (en) 2005-03-09 2007-11-06 Idexx Laboratories, Inc. Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
JP5409361B2 (ja) * 2007-07-25 2014-02-05 北里第一三共ワクチン株式会社 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原
WO2011123781A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Idexx Laboratories, Inc. Detection of feline immunodeficiency virus
US8596026B2 (en) * 2010-08-05 2013-12-03 Kraft Foods Group Brands Llc Vacuum flow wrap packaging system and method of packaging

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341439C (en) * 1987-08-26 2003-09-23 Niels C. Pedersen Feline t-lymphotropic lentivirus
US6107077A (en) 1987-08-26 2000-08-22 Yamamoto; Janet K. Feline lymphoid cell lines capable of producing FIV for FIV diagnostics and vaccines
US5118602A (en) 1987-08-26 1992-06-02 The Regents Of The University Of California Feline T-lymphotropic lentivirus assay
WO1992000098A1 (en) * 1990-06-29 1992-01-09 Daniel Zagury Methods of inducing immune response to aids virus
WO1993001278A1 (en) * 1991-07-05 1993-01-21 The Regents Of The University Of California Feline lymphoid cell lines capable of producing fiv
GB9219936D0 (en) * 1992-09-21 1992-11-04 Pitman Moore Inc Vaccines
WO1994020622A1 (en) * 1993-03-11 1994-09-15 Akzo Nobel N.V. Polypeptide fragment capable of inducing neutralising antibodies against feline immuno-deficiency virus
IT1276509B1 (it) * 1995-03-31 1997-10-31 Istituto Superiore Della Sanit Vaccino per la profilassiimmunitaria dell'infezione da virus della immunodeficienza felina del gatto domestico.
US6254872B1 (en) 1995-08-25 2001-07-03 University Of Florida Multi-subtype FIV vaccines
DK0848615T3 (da) * 1995-08-25 2005-10-03 Univ Florida Muilti-undertyoe-FIV-vacciner

Also Published As

Publication number Publication date
CA2230029A1 (en) 1997-03-06
NZ316347A (en) 2000-02-28
NZ513388A (en) 2006-02-24
US5846825A (en) 1998-12-08
KR19990044093A (ko) 1999-06-25
DK1090985T3 (da) 2006-12-04
US20080145381A1 (en) 2008-06-19
DE69636440D1 (de) 2006-09-21
JP4142741B2 (ja) 2008-09-03
JP2013079286A (ja) 2013-05-02
US20020172941A1 (en) 2002-11-21
KR100482616B1 (ko) 2005-09-02
DK0848615T3 (da) 2005-10-03
BR9610343A (pt) 1999-12-21
US6447993B1 (en) 2002-09-10
AU6855596A (en) 1997-03-19
US6605282B2 (en) 2003-08-12
IL163873A0 (en) 2005-12-18
EP1090985B1 (en) 2006-08-09
PL325376A1 (en) 1998-07-20
JP2005261426A (ja) 2005-09-29
AU2004203358A1 (en) 2004-08-19
US7311921B2 (en) 2007-12-25
PL186706B1 (pl) 2004-02-27
AU1972501A (en) 2001-05-03
KR100502568B1 (ko) 2005-07-20
JP2007284442A (ja) 2007-11-01
ATE335809T1 (de) 2006-09-15
KR20040047812A (ko) 2004-06-05
WO1997007817A1 (en) 1997-03-06
ES2242967T3 (es) 2005-11-16
DE69634820T2 (de) 2006-03-23
EP0848615B1 (en) 2005-06-08
DE69634820D1 (de) 2005-07-14
CA2230029C (en) 2012-03-27
DE69636440T2 (de) 2006-12-21
ES2269042T3 (es) 2007-04-01
IL123264A0 (en) 1998-09-24
AU2004203358B2 (en) 2007-10-25
AU772353B2 (en) 2004-04-22
HK1038584A1 (en) 2002-03-22
JPH11513031A (ja) 1999-11-09
IL123264A (en) 2006-09-05
PT848615E (pt) 2005-10-31
ATE297218T1 (de) 2005-06-15
US20040067242A1 (en) 2004-04-08
DE69636440T4 (de) 2007-09-27
AU728750B2 (en) 2001-01-18
EP0848615A1 (en) 1998-06-24
JP5339687B2 (ja) 2013-11-13
EP1090985A1 (en) 2001-04-11
NZ502144A (en) 2001-09-28
JP4413132B2 (ja) 2010-02-10
PT1090985E (pt) 2006-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5339687B2 (ja) 多種サブタイプｆｉｖワクチン
US20090263417A1 (en) Multi-subtype FIV vaccines
CARLSON et al. Vaccine protection of rhesus macaques against simian immunodeficiency virus infection
CA2525641A1 (en) Materials and methods for immunizing against fiv infection
AU682304B2 (en) Analogous peptides of the internal image of a viral protein
JPS63502242A (ja) エイズの原因となる新規なレトロウイルス及び該レトロウイルスのｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出手段及び方法
MXPA98001570A (en) Feline immunodeficiency vaccines of subtipos multip
YAMAMOTO Patent 2230029 Summary
Kariya et al. Protection of rabbits against HTLV-II infection with a synthetic peptide corresponding to HTLV-II neutralization region
PT86752B (pt) Processo para a preparacao de peptidos susceptiveis de serem reconhecidos por anticorpos induzidos contra retrovirus da imunodeficiencia humana (virus hiv) suas aplicacoes no diagnotico de infeccoes provocadas por alguns destes virus e em tal circunstancia a vacinacao contra a sida

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140823