PT86752B

PT86752B - Processo para a preparacao de peptidos susceptiveis de serem reconhecidos por anticorpos induzidos contra retrovirus da imunodeficiencia humana (virus hiv) suas aplicacoes no diagnotico de infeccoes provocadas por alguns destes virus e em tal circunstancia a vacinacao contra a sida

Info

Publication number: PT86752B
Application number: PT8675288A
Authority: PT
Inventors: Luc Montagnier; Marc Alizon; Francois Clavel; Pierre Sonigo; Mireille Guyader; Denise Guetard; Pierre Tiollais; Lisa Chakrabarti; Ronald Desrosiers
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1987-02-11
Filing date: 1988-02-11
Publication date: 1992-05-29
Also published as: PT86752A

Description

A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de péptidos com propriedades imunológicas, mes-. mo imunogánios, em comum com antigénios susceptíveis de se obterem sob uma forma purificada, a partir de vírus suscep·-.tive is de provocar linfoadenopat ias susceptíve is de em seguida se revelarem? pelo síndroma da imunodeficiéncia adquirida (SIDA) no homem.

A presente invenção diz respeito em particular a pép'tidos an.tigénicos susceptíveis de serem reconhecidos por anticorpos induzidos no homem por vírus designados pela abreviatura HIV, de acordo com a nomenclatura definida na NATURE Refere»se igualmente a péptidos com propriedades imunogénicas ou susceptíveis de se tornarem imunogénios in vivo, sendo esta imunogenicidade susceptível de se manifestar pela indução in vivo de anticorpos reconhecendo antigénios característicos de vírus HIV-2 e mesmo, pelo menos no que d diz respeitoa alguns destes péptidos,. antigénios resultantes de- HIV-1.

A presente invenção diz além disso respeito a apli-

cações destes péptidos para a preparação de composições para o diagnóstico ¹¹ in vitro no homem da potêncialidade de algumas formas da SIDA e, no que diz respeito a alguns deles, para a produção de composições imunogénicas e de composições vacinantes contra os retrovírus HIV.

A presente invenção diz igualmente respeito às aplicações com o mesmo objectivo de anticorpos susceptíveis de serem induzidos in vivo” pelos péptidos imunogénios ou tornados imunogénios e, por alguns destes anticorpos, suas aplicações para a produção de ingredientes activos de medicamentos contra estas SIDAS humanas.

β

A presente invenção diz igualmente respeito à utilização de alguns destes péptidos em processos para o diaqgnóstico ”in vitro no homem de algumas formas da· . SIDA, assim como a sua aplicação para a constituição de conjuntos ou colecções de diagnóstico.

/ /

Um primeiro retrovírus denominado LAV-1 ou HJV-1 foi isolado e descrito no pedido de patente \GB. 83/24.800 e na .patente EP, 84/401.834 de.14/09/84.'Este vírus foi igualmente. descrito por Έ*. Barre Sínoussi e colab.-em Sbien.ce, 220 nQ·45-99, 20 páginas 868-871.

Variantes deste vírus HIV-1 designadas por LAV ELI e LAV MAL, foram igualmente isolados caracterizados e descritos no pedido de patente EP, 84/-401.834.

Os vírus HIV-1 e suas variantes possuem as seguintes propriedades:

- têm por alvos preferênciais as células leu 3 (ou

Λ linfócitos T4) humanos e suas células derivadas imortalizadas ,

- têm uma actividade transcriptase inversa necessi-

2+ tando da presença de iões Mg e apresentam uma forte actividade para o poli(adenilato-oligo-desoxitimidilase) poli(A)-oligo(dT)12-18,

- têm uma densidade compreendida entre 1,16 e 1,17 para um gradiente de sacarose,

- têm um diâmetr.o médio de 139 nanometros e um núcleo de diâmetro médio de 41 nanometros,

- os lisados destes vírus contêm uma proteína p25 (proteína do núcleo) que não se cruza imunológicamente com a proteína p24 de HT1V-1, contêm uma proteína p42 pertencente ao seu enveloX

Ρθ,

- contêm igualmente uma glicoproteína de envelope gpUO com um peso molecular de 110.000, isolamento e a caracterização de retrovírus pertencentes a uma classe distinta e apenas tendo um reduzido parentesco imunológico com os precedentes, foram descritos no pedido de patente europeia n² 87/400,151.4. Estes retrovírus quá foram reagrupados sob a designação HIV-2, fo-

ram isolados em vários doentes africanos apre se nt an d o s in t o mas de urna línfoadenopatia ou de um SIDA.

Os retrovírus do tipo HIV-2 assim como os retrovírus do tipo HIV-1, caracterizam-se por um tropismo para os t linfócitos T4 humanos e por um efeito citopatogénico em re lação a estes linfócitos, quando estes se multiplicam, para então causar quer poli-adenopatias generalizadas e persis tentes, quer um SIDA.

Mais geralmente os retrovírus purificados por HIV-2 possuem em geral as seguintes propriedades:

- o alvo preferêncial dos retrovírus HIV-2 é cons- tituído por células Xeu5 (ou linfócitos T4) humanos e por z

células imortalizadas, derivadas destes linfócitos T4;

- são citotóxicos pare, os linfócitos T4 humanos;

- têm uma actividade de transcriptase inversa ne-

2+ cessitando do. presença de ióes Mg e apresentam uma forte actividade para o poli (adenilato-oligo-desoxitilmidilase) poli(A)-oligoCdT) 12-18);

/ /

- têm uma densidade de 1,16 para um gradiente de sa- carose ;

- têm um diâmetro médio de 140 nanómetros e um núcleo com um diâmetro médio de 41 nanómetros;

- podem ser cultivados em linhas permanentes do tipo HUT onde expressam a proteína T4;

- não são infecciosos para os linfócitos T8;

os lisados dostes vírus contêm uma proteína p26

que não se cruza imunológicamente com a proteína p24 do vírus HTIV-I ou do vírus HTIV-I I;

- estes lisados contêm além disso uma proteína pl6 que não é.reconhecida imunológicamente pela proteína pl9 de

HTLV-I ou de HTLV-II nos ensaios de radioimunoprecipitação;

- contêm além disso urna glicoproteína de envelope, com um peso molecular da ordem de 130.000 - 140.000, que não se cruza imunológicamente com a gpllO dos HIV-1, mas que em compensação se cruza imunológicamente com a glicoproteína de envelope gpl40 de STLV-III (vírus isolado no macaco) ;

- estes lisados contêm ainda antigénios marcados •xc pela ^S-cistema, de pesos moleculares compreendidos entre 32.000 e 42.000-45.000: compreendem particularmente um antigénio com. um peso molecular da ordem de 36.000 e um antigénio com um peso jnolecular da ordem de 42.000, constituindo um destes antigénios (p36 e p42) verosimilmente uma glicoproteína transmembranar do vírus HIV-2;. / / s

- o ARN genómico dos HIV-2 não hibrida com o ARM genómico de HIV-1 em condições rigorosas.

- em condições não rigorosas, o ARN genómico de

HIV-2 não hibrida, nem com o gene env e o LTR que lhe é contíguo, de HIV-1, nem com sequências da região nol do genoma de HIV-1;

- em condições não rigorosas, hibrida fracamente com sequências de nucleótidos da região de HIV-1,

- Um outro retrovírus denominado SIV-1, esta deno

-6minação substitui a denominação anteriormente conhecida STLV-III, foi isolado no macaco macaque rhésus. (M, D. Daniel e colab. Science 228, 1201 (1985) ET. I». Letwin e colab, Science 230,71 (1985) sob o nome STLV-III mac).

Um outro retrovírus, designado STLV-III, (ou SIV_A&y) foi isolado em macacos verdes selvagens. Mas, contrariámente ao·, vírus presente no macaco macaque rhésus, a presença de STLV-III^j,/’ não parece induzir uma doença do tipo SIDA no macaco verde de África.

Uma estirpe de retrovírus SlV-l^nac foi depositada na CNCM em 7 de Fevereiro de 1986 sob o n2 1-521. Estudos realizados demonstraram que o retrovírus SIV-1 com* porta algumas proteínas, possuindo um certo parentesco imunológico com proteínas ou glico'proteínas estruturais susceptíveis de serem obtidas em condições análogas, a partir de HIV-2, Este retrovírus SIV-I, em que se verificou o caracter infeccioso nos macacos, foi designado por STLV’IIi pelos cientistas que o isolaram (referências bibliográficas citadas antes). /

Para comodidade de linguagem, estes vírus serão designados no que se segue pela expressão SIV /a expressão SIV d a abreviatura inglesa de Simian Immunodeficiency vírus (virus da imunodeficiência do macacoLZ eventualmente seguida de uma abreviatura designando a espécie de macaco de que são originários, por exemplo, MAC (ou mac) para a macaque ou AGM para o macaco verde de África (abreviatura de African Green Monkey),

Utilizando as mesmas técnicas que as referidas

antes, verificou-se que se pode igualmente obter a partir de SIV-1'mac;

- uma proteína principal do núcleo p27, com um peso molecular da ordem de 27 kilodaltons,

- uma glicoproteína maior de envelope, gp 140,

- uma proteína verosimilmente transmembranar p32, que é pouco observada em RIPA quando o vírus foi previamente marcado pela ^yyS-cist(èma, mas que pode ser observada em ensaios de imunoimpressão (manchas de Western), sob a forma de bandas largas.

Estudos mais exactos foram realizados no que diz respeito as anteripres vírus HIV-2 e SIV, A continuação do estudo dos retrovírus HIV-2 conduziu igualmente à obtenção z de sequências de ADN complementares (ADNc) de ARNs dos seus genomas, A sequência nucleotídica completa de ADNc de um retrovírus representativo da classe HIV-2 (HIV-2 ROD) foi depositada em 21/02/1986 na CNCM sob ο η² 1-522, sob o nome de referência DAV-II ROD.

Esta sequência nucleotídica e as fases de leitura aberta que contém estão indicadas na figura 1 A.

Além disso, a continuação do estudo de outros retrovírus permitiu igualmente conseguir a obtenção das suas sequências nucleotídicas completas. ΈΓ o caso em particular do ADNc derivado do ARN genómico de SIV,

A clonagem e a sequênciação do vírus SlV-lunac que permitiu a obtenção da sua sequência nucleotídica foram realizadas nas seguintes condições:

*D1~ de células ^τπττ 77 infectadas pelo vírus 7Σ7 ^i.eol^do ^σ8Ι7-11Ι i?.c 142-83 descrito por Daniel e cola’·.

”Science, 228, o. 1201-1204, (198çf| , pareivivente digerido nel^ erci-a lo restrição 8au 7-·· foi clonado no Filio P-anFI do bacteriofr go vector I^zr.hda 2T-BI-3 pera constituir in banco ger.ómico. Os 2 milhões de gagos recor.b imantes do t?vco genóvico acsin constituído foras peneirados in situ em. condições segurança Fp, cor. ajuda de sequências cio vim.⁰ HT7-2 vrcveniente dos clones lanbda-2GD4$ lar.hd?·—Τϊ03·>5 ) e 72 jciavel e colai)., ZTature”, 524. p.691, (1986)] e nick-irdo-s.

A hihri^açõo foi re-lisada. e» a 50^vC e as lavagens em 2:-:880 a 50°C. Obteve-se um só clone contendo o conjunto das sequências vireis. Iste clone é designado por lambda-S17-1. A inserç.So do fogo lambda-SIV-l mede 16,5 -’b no total e compreendo um provírus integrado ao qual faltam somente as 250 primeiras bases do 1TR esquerdo, enquanto que ο ΤΤΠ direito é completo.

provírus integrado foi sequencicdo pelo método dos didesoxinu.oleótidos após sub-clonagem de fragmentos aleatórios no f?go al5rp8, Foram analisados 500 sub-clones.

^mgr.entos de ADFc provenientes do clone lanhda

T.^r-1 inferidos em p^asmídios pdjv-l.l e pSI7-i,2 forem depc-itados na 0Γ21 em 15 de Abril de 1987, sob os números

1-652, (ρ^ΓΓ-Ι,ΐ) e X-659 (n.I’-l. 2).

Os resultados est£o ••encionados nas finuras descrias azimute

figura IB representa. a se quência nv.cleotídica do genomb virai de SI7 e as sequências deduzidas para as proteínas virais correspendentes aos produtos dos genes gcg, pni, erv, ' , R, tat, ?rt, P.

Ás figuras ? a 11 e a figura 15 rep^esentam comna.rsções dos produtos teóricos dor genes virais e los LTE. er.tre ΉΙ72 e EI7mac. (λ-Τ-!).

â presente invenção lis tarihóm respeito a fragmento^ ίς ·17^το ^e^nridoe do d.EZTc resultante do genona inteiro de SIV—1, contendo estee fragmentos una ou várias sequências resnl,tar.tes da. sequência comnlets. de AEHc e que codi— fica.n nara os nántidos de acordo com a presente inveneSo. Estas sequências estSo indicadas na figure 1?. e, na figure 1C a que trata da sequência. ITR do vírus.

As sequências nucleicas do ADITc de ET7 foram colooa^os em correspon.dência com 8? sequências n.ucle icas do vírus ET7-2.Tt0D para o que diz respeito à sequência 1TR (figura. 1C). Esta apresentação que se encontra. para o genom-a inteiro confrontando ? figura 1B com as figuras Z a 11 permite determinar ou deduzir os ácidos nu.cleicos com elementos lo estrutura essenciais coeiwB aos dois vírus, presente invenção diz ta.mhóm natural-mente respeito à utilização dos cAD’^Ts resultantes de SI7 ou de seus fragmentos (ou de recombinantes que os contêm) na qualidade de sonda.s, para o diagnó-tico da presença ou n^o de vírus 717-2 em. ?.ostras de soros ou de outros líquidos ou tecidos biológicos obtidos a partir de pacientes susneitos de $

ί

-10serem portadores do vírus EI7-2. dst¹'? sonde.s são de preferência marcadas igualnente (r^rcadores rad.ioactivos, encimátieos, flnorescentes, etc.). Sond.as perticularmsnte in^xe^e·'santos ^era e aplicação do processo de d1agnóstico do vírus PT'⁷’-? oiâ d° uma vai’?'.ante de 7IV-2 caracterisan-se oelo facto de comnreenderem a totalidade ou uma fracção de

ADITc complementar do genom⁰ do vírus BIí ou ainda nomeεdane ute o? fragmentos recombinantes contidas nos diversos cisnes.

_'.s sondas utilis-odss neste processo de diagnóstico do vírus 717-2 e nos conjuntos de diagnóstico não estão --e modo nenhum reduzidos às sondas descritas anteriormente. Compreendem, pelo contrário, todas as sequências nnoleotídicas resultantes do genona do vírus SI7, de uma variante de 17 ou de um vírus próximo pela sua estrutura, ^i⁰to Çne ne??miter: a d.eteeç^ro, se. fluídos biológicos, de ^uscentíveis de mn SIDA, de saticomos dirigidos cont??** um 717—2 ou de um vínus rr/vino.

' modo ''j-· reeijcada de acordo cou cv-a? — quer tármica c^nhec?.!?, ?ode compreender um contacto dest-o m?.*r cora o? ácidca r-uc^eicos obtidos a n?.i’tir 1‘ -:

cílula⁰ contidas nestes soros ou outros meios biológicos, por exemplo líouidos cef^lo-racuidianos, salivas, etc... Pede também. comnreen^sr um contacto dsp sondas cor··, estes meios desde se çr.e os ácidos nucleicos destes meios se tenham tornado a.ce^oí-.-v-is à hihridação com estas sondas e se condições ore permitam a híbridacão entre e^tas sondas e estes ácidos mm]'eicos. A etam» final do disçró? tico “in vitro”com.nreen.de

-11então a detecção da hibridação eventualmente produzida. 0 referido diagnóstico envolvendo reacções de hibridação pode igualjnente realizar-se com ajuda de misturas de sondas respectivamente originárias de um HIV-2 e de um SIV-1 ou de um HlV-1, de um HIV-2 e de um SIV, visto que não é necessário; fazer uma diferenciação entre o tipo de vírus pesquisado.

De um modo geral, o processo de diagnóstico da presença ou não do vírus HIV-2 ou de um variante em amostras de soros ou de outros líquidos ou tecidos obtidos a partir de pacientes suspeitos de ser portadores do vírus HIV-2 compreende as seguintes etapas:

1- pelo menos uma etapa de hibridação conduzida em cojidições rigorosas, mediante contacto do .''D de células da amostra do paciente suspeito com uma das referidas sondas marcadas sobre uma membrana apropriada,

2- a lavagem da referida membrana com uma solução para assegurar a conservação destas condições rigorosas da hibridação,

3- a detecção da presença ou não do vírus HIV-2 por um método de imunodetecção.

Num outro modo de realização preferido do processo de acordo com a nresente invenção a hibridação antes referida é conduzida em condições não-rigorosas e a lavagem da membrana realiza-se em condições adaptadas às da hibridaçflo.

H evidente que a presente invenção diz respei

-12to aos ádddos nucléicos correspondendo às sequências colocadas em regiões analogas de variantes de SIV assim como todos os ácidos nucléicos cujas modificações resulto.rrm da utiliaação da degenerescência do código genético.

Os estudos comparativos que permitiram igualmente chegar a resultados relativos às proteínas do núcleo (core), adiante denominadas proteínas gag e às proteínas de envelopes, adiante denominedoo protéinas env. foram igualmente referidos no pedido de patente europeia n5 87/400.151.4, já citada. Estes resultados mostram que ar proteína do núcleo (prot'ínas gag) em HTV-2 apresentam diferenças menos acentuadas em relação às do vírus HTV-1, que as proteínas de .envelope (protéínas env). Globolmente as protéinos env em HIV-2 revelaram apresentar parentescos imunológicos extremamente pequenos, senão inexistentes, com as protéíras env correspondentes dos vírus HIV-1.

Pelo contrário estudos comparativos efectrados entre as estruturas das sequências de AI)Nc dos vírus PIV-2 e SIV permitem evidênciar algumas características comuns que aparecem ao nível das protéínas.

: Globalmente, as proté ínas de HIV-2 e de SIV-1 mostram importantes parentescos imunológicos.

A glicoprot éína. maior de envelope de ΗΓ/-2 revelou estar mais próxima imunològicamente da glicoprotéína maior de envelope de SIV que da glicoprotéína maior do envelope de HIV-I.

\ Estas observações impõem-se não somente so nível gytí·:· f « í' '· dos pesos moleculares: 130-140 kilodaltons para as glicopro814:- «·.

tdhfnas maiores de HIV-2 e de SIV contra aproximadamente 110 - para a glicoprot<ína maior do envelope de HIV-1, mas tembém [? ao nível das propriedades imunológicas, visto que soros £ colhidos a partir de doentes infectados por HIV-2 o rais i particularmente dos anticorpos formados contra a gpl40 de ' HIV-2 reconhecem a SP140 de SlV-lítiac, enquanto que em enI- saios semelhantes os mesmos soros e os mesmos anticorpos de

HIV-2 nSo reconhecem a gpllO de HIV-1. Mas os soros antiU -HIV-1 que nunca reagiu com a gpl40 de HIV-2 precipitam uΓ ma protáfna de 26 kdal marcada pela ^^S-cistéína, contida L nos extratos de HIV-2.

A protlína maior do núcleo (core) de HIV-2 pareΒΚ^ίί/·^{: :} 'W ; ce apresentar um peso molecular médio (aproximadamente.

? 26.000) intermediário entre o da p25 de HIV-I e o da p27 de / SIV.

Íl/ ,_T··. Estas observações resultaram dos ensaios realizados com extradtos virais obtidos a partir do HIV-2 isolado * a partir de um dos pacientes sobremencionados. Resultados ’ similares foram obtidos com extractos virais do FIV-2 isoΙΓ . lado a partir do segundo paciente.

Estudos mais extensos levaram os invento?’es a reconhecer uma primeira classe de péptidos com sequências de aminoácidos quer idêntidas, quer próximas de sequências contidas no interior das estruturas das protéinas gag e env de HIV-2 ou de SIV até mesmo de HIV-1. Estes péptidos são particularmente aplicáveis ao diagnóstico de uma infecção . . no homem pelo vírus HIV-2 ou de um de seus variantes.

-14Por este facto a presente invenção diz igualmenarjv / - -j'.

te respeito aos processos e comnosiçães de diagnóstico para a detecção in vitro de anticorpos dirigidos contra um ví^Ί' :<v ^:?i·

F^-* rus HIV-2 ou de seus variantes, mais particularmente em a«f; mostras biológicas, particularmente soros de pacientes que

Η/ '- 4 '»'i‘ sofrem de uma infecção pelo vírus HIV-2, alguns destes pépptidos permitem uma discriminação particularmente extensa entre as infecçães devidas a vírus HIV-2 e a vírus HIV-1.

gSg; i : -X ¢// ·.! Estes estudos extensos conduziram igualmente à possibilidade de sintetizar péptidos imunogánicos ou suscept t:.......Β φ* i ' ’:'i i -l.tíveis de se tomarem imunogénicos, a í* rísticas de estrutura que lhes permitem produção de anticorpos susceptíveis de í - env ao mesmo tempo em HIV-1 e em HIV-2 alguns destes páptidos, ______________________________________________________ :

HTV-1 como sobre os vírus HIV-2, mais particularmente com fim de os neutralizar. A utilização destes últimos tipos

......

ipl·

IB induzir in vivo a reconhecer nrotéínas e, pelo menos para de se fixar tanto sobre os vírus de péptidos está então particularmente indicada de ingredientes activos de vacinas contra os tanto contra o SIDA.

Para adiante designar os resíduos de aminoácidos que entram na constituição dos páptidos de acordo com a pre·. sente invenção, recorrer-se-á, para, estes aminoácidos com um j.

*’ significado unívoco à nomenclatura internacional designando

-cada ácido aminado natural por uma única letra (letrr maiús’ cuia) de acordo com o quadro de correspondências que se se-

ΗΙ7-2 e, ρεζ*8. elguns deles iguslnente con antigénios de.HxT-1 0·)·· -ígTjc· -rrp-.·*·ίrγι•'-«“ίοcp.j’?cf.çτηse nelo facto de tere’·'’! íxuv nente v.?>~ estrvtv^a nentídics. ei;’, coihuji¹ coia os antigénios do 5?IV. De -'Qhn •ypfH-r· 4q~‘q _} néntldos coF.-oortsxp. no??v.alnen— te 7Tj,pnto 40 resíduos de sninoácidos.

Ds néntidos referidos s^o _os seguintes:

τη ttt A

I θζιχΐ τ- T-—Ί Λ - -r- r> .-ν’·-’ -v- »Tf7

—.l;-u —’ . -.1. . -- . Χ/·~>^ .._:“· yTTiljVÇTy ‘X¹?·³’^ ’ τ>φ ρ·ρ _ S

’’ Λ·’ T ’ΤΓΓ'.τ’ Τ’ Τ,Τ Τ.Τ-7

J ’, Χχΐ·.'.

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HV j envS y —T—«—YC —Q—*ΐ^τ—

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Σε, is ρρ τ’ΐ Ιο'ΐΐε ε. ότθ Ξ’Θϊιϊθ Ιιττόπο?.ο dis τθ s«* vyf j f q J? θ ο <7*ν} 5 Ρ ήΐ- - Τ')'’’ “}“|ζ *ΐ (1 π · e ηνί ν ηττ ?. r” VT Ή^f : τ ^{ττ Τ}·^Γ·^Γ1 Π ' Ρ Ρ ' ^Τ’Γ Π ¹⁷

;.*íí J.-J -λ. ··-> JLl-i 7 χ/£ί env2 •y ΤΡ *‘. τ ·,'; j Tr**· τΓ.γ -τ _:- τ’^-? “*~ι? jí ι. ***3.^^J *··χΐ- A- '-ii <·£Λ4-L-~~·. ·~ .ν-’-.·ί«ι jj’<ΐχΐ·.ΙΙ.* Ί·· env3

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- .L··““*·“’~/*·2.·.Χ ν 7 ÁrfXj*“X

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Τ ft ΡΌΡ ·*νί r* ”n rrn τ.τγ?

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Eéntidos úteis co^reenondendo so^s antorio??ss, anr?sentem ·?£-· 7e·'irises fórriilas:

âiM ::m^hiEZYixiD^RirivGCATRQVcz, ou

VTy ^n .' T7T τ’’-r^ ' .* ^,τ ’*.*· *·τ« Γ ?...‘^i jZ .. ^» v---. *;.-« ·. -· πτ^τ-η·'', a ”j- /Ύ’Ι T^TT-^rn ·γ ^Τ7Τ *f-^TpT-T^ θρ

I env?

777Κ DY7L7AIT2I^r3-'ⁿA7^rpE^T7HRTSSAHZ, ou

ΟΙΟΣΥΣίνΣΙΤΡΤ^ΙΑΡΤΓΉ’ΉΤΤΤΣ-Ζ (verifíca-s-e que n<? péntidos enyl. env? e env3 confirmam o grande v-.rente?eo entre 7Γ7-2 e 817—1, Com efeito o primeiro péptido está incluído no genoma de EI7-2 e o segundo, no de 817-1).

θ£Ζί

Yabo dVTVe TGVFf7ogAThiX”CA jz, en c-rie a .o letra,? de a a i noden-i ter oe seguintes significados :

a	renresenta	C	r	ou D
h	representa	T	rr >	, D, F OU
c	7)^0 p θ v-j 4; íq	A	OU	1
d	γ·*·. -'>c g« θ v« 4; Γ	V	ou	τ-r
e	representa	T?	ou	T
-C J.	τ»α vjws ττ\|;ρ	Φ		ou A
Cf O	repre-erte-	F	ou	τη
h	renre^enta	I	ou	rp

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j	7» 3 V) α p θ ys -{-_ c	Ό	ου.	T
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Φ

-P	η ’Ό c ç t ?.	T_MT i .	ou
0	reme eenta	T	ou
u	reme seu t a	ΤΓ	ou

I

X abO- Xx S y I o c dC e Tf gh iZ,

T) ç -’ 1 ·; p T. p es 1 a + -P p. a a í e x e y podem ter os seguintes significado?:

ÍS r

CF re mm? nt a

T>g η-ρ,-5 -< θ r> + Γ.

re me certo.

renrecerta reme s e'· ta y>,O -0 op ~· o -p 4- r>

re nre mnta remment?· remecerta

T ou T ou
Έ ou	r*t	ou
R ou	Q
o .· ....,	ou	c
3 ou	P
H, 7,	ou	P
7 ov.	c< M
*-T .	-ry
..- ou
3 ou
T ou	R
V cu	A
T ou	n

I •T env8

Xalbcd^CxPsRfPglhCiXjTZ, na qual as letras de a a kprx poâss ter os seguintes significados?

a representa. Λ ou P b representa. R ou P c reme senta I ou 0 d reme mata 2 ou H

I

	•y»p vj Ύ(Ζ Ο <P Ρ fj C	τ>	Ούΐ ^·
η	v»/r. a n <1-z-> 4-p	V	ou	ρ
.ο* Ο	ΊΛ,Ο 77 V»k2. C< bs p P	I	ου.	I
h	ΤΘ TFF ° p ‘t r ·.	η	ου.	κ
i	~ρθ Τ}^ΠΖ»Λ ρ θ Ή Γ	-	ου	ττ
j	-/»<~ -Τ') ν»θ & Ρ *5 Ρ	η	ου.	ρ
-Λ.	7»G -q V» c Λ -·*· 4- <?	r.	ου	Τ

env9

Λ V *3 θ F-’V 7 £5 * ~ ^~2j

ηε συ.·?.1 ao j.et:	sas d¹	Λ r·» Ciz	S.-	k e :·: a s podem ter os seguinte?
s ign i ficados:
a representa K	ou -	ou	T? nJ
V -ρθ v^-pp ç< θ p 4· ρ P	ou -
Q y»p Τ?θ p *\|jp T>	ou 4·λ	ou	T
/1 -ρθ Υ)ΡΡ οθ V) 4ζΡ ^,τ	ου H	ou	Y
c. ρθ η-^ ««θ ·ρ ρ Ρ	ou _T	ou	T	ou H
f reΌΓβsenta F	ou I
rr pO CfXy.·*- Γ T⁷ õ ^>/-^···-ΐυ·· -·-	07.1 S	ou.	JT	ou 9
h ronreconta G	ou 3	ou	-p
η V»£ pV> — P Ç~. p	ou A	ou	m
— T*A pPíà <·?' e-i -p 4- p ΤΓ	0 u N	ou	D	ou S
ΤΓ ΤΌ ΉΡ'3 <-'.θρ/-ρ T)	ου. A	ou	T-T J. i	ou 1: ou 2
V represente. Γ,	D ou I
y ν>η lyic <r <?.-< 4- ·~	ou 9	θΊΙ v* V-	p
rp pf- ·ηΎ>.·ί ο ρ p 4-p F u - -' .. '— -’ -J· - u -	ου Y	OH	P
c* τνΛ ρ p 0 “.= rZ -·. 4* Γ? ^rr	ou	OU	Q	ou !'^T

orvlO o jTCokxlun’’^,

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‘ ·. p □t'	--	OU	-	ou
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1-’<1 -:-- -,.-..-1 < ·, ·· J- p.	L	o-u	ΤΓ	OV-
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	T.T	OU	c<
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-a -vs-0., .<··· o -z 4-	n	ou	n.
re nre '- e nt e	τ	OV-	*n
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.ré η ·?·5 e o nt e.	τ ·	ov.	q
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r.e qr.ol ? ou T ou S ou IT ou I c re Oro?-snte

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K	-/»rt ppg P p '·^π t P.	Τ'	ου.	g
Ί	-y' -vx-'->-'. -·	V	ου.	τν .1
•r	-.-»?. PP'”- ’ lp	ρ	ου.	Λ
::	Τ’<3 ΤΠ’<9 ' '; v> -!^r'	ττ	ου	ΤΓ
í>·	τ> -ρ-.ο·~. .· T!^J Γ.	ττ	ου	V
c*.	??ζ ore ρ η t ο.	ΤΤ	ου	φ	ου	Τ’*
0	νρ ρ · · '· ο θ ' 4- ρ	Κ	ου	ρ
	_	θ Γ-	tl’T	vtu	ra	do

η Ο ? ron^e''sr.ta K ou

De modo gorai, ter_ relat-nua órterroeionol) que imtor

•νΛ Ύ* ' \ <	4 —, -ry.-i .-.ρ. ΤΏΤ’·? -^-í P
do-'	í.14r.t 1.o'V· 00^-1 oc^?·	0 Q O
rr	,1 _η-!->-ΜΛ ------,Γ,·~ z ?· ·*:<= c;	dP	orn
^r ^^IIM-·-
d 0 ~	^TTT7, ου de SI’^r-l	«

om-zo gw correspondem ΐ.

As âesiss seqoêrcios estão sublinhado^ e ^r-' inaladas no seio d^s secuêncio.s de ar?.inoe'?ido? das proθ<-- env reens-ti^-ente de ^τΠ^ττ-^ (Π-0Ν r.3 1.532), e H7T-1 ΒΓ.ΤΤ (CHC·.' n? 1-232) i’onre sentada’ r.a figura ?. ?or nn4.,._o ic4_{0 0}<. -.-··'-rios dos· éeidor nuclsicos ta.s protefrro çv.v « .^°.5· ^->a:t--,.íAtiverovts de STT—lr.i.a.c ('IHL'·’’ --ο 1—521) θ p - '^'-.O Drp í~ - ' Q -·>« -y; /: <;·· -f-r O r Çl —r j -f?xi”?ÇL 3 9 7>f? fíé?U— ·««· /

- ‘ < #

Of* tro oo'*‘ cor.tfr.uos qru -. onrocen qr certos localizarão;- - - rtnê·: ,e pr 3 D-.rts?/¹??·! suhl.inkar que slpms a — • -'- -^z ‘’.lo.' c-.rtido'^:‘ restos -oprêrciíu foram ^o lurAs ri o-.ne ri- -^z <- jπ e r ? os o?- í oar.ente idênticos (então r'·* - lo ο '-ο v.”'. es^sidrso) ou deis nontos ~.^: soρ ^ΛΟ * i o v - < -p-se nén-oiO-s da ~* motéíno 3 .-1 r. Τ-Γττ _ <>

οο^Λ ortro l°dc_#

T) 'fí por um· la do, de 5IV e o/rtidor rcdif icrd.os

O n r * -- — ? ··, '0.00 /â 5.

«0' rl <p rΛ-ν' foridoe; réotidos rãs es

-,r .π r· e' ••ti cnlc to .''oerr~c

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2Τ

EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT

EDLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT

DNLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT env5

DDYQEITL-NVTEAFDAWNN

L-NVTEAF

DDYSELAL-NVTESFDAWEN

L-NVTESF

PNPQEVVLVNVTENFNMWKN

LVNVTENF

PNPQEIELENVTEGFNMWKN

LENVTEGF

PNPQEIALENVTENFNMWKN

LENVTENF env6

ETSIKPCVKLTPLCVAMK

ETSIKPCVKLSPLCITMR

DQSLKPCVKLTPLCVSLK

DQSLKPCVKLTPLCVTLN

PCVKLTPLCV env7

NHCNTSVITESCD

NTSVIT

NHCNTSVIQECCD

NTSVIQ

TSCNTSVITQACP

NTSVIT

INCNTSVITQACP

NTSVIT

INCNTSAITQACP

NTSAIT

env8

YCAPPGYALLRC-NDT

YCAPAGFAILKCNNKT

YCAPAGFAILKCNDKK

YCAPAGFAILKCRDKK env9

NKRPRQAWCWFKG-KWKD

NERPKQAWCRFGG-NWKE

N--MRQAHCNISRAKWNA

D--IRRAYCTINETEWDK

I--IGQAHCNISRAQWSK > env10

KGSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLN NCRGEFLYCN

GG-DPEVTFMWTNCRGEFLYCKMNWFLN

NCRGEFLYCK

-GGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFN NCGGEFFYCN

-GGDPEITTHSFNCRGEFFYCNTSKLFN

NCRGEFFYCN

-GGDPEITTHSFNCGGEFFYCNTSGLFN NCGGEFFYCN env11

RNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVY ) , . CHIKQII

RNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVY

CHIRQII

TITLP CRIKQFINMWQEVGKAMY

CRIKQFI

SITLPCRIKQIINMWQKTCKAMY

CRIKQII

NITLQCRIKQIIKMVAGR-KAIY

CRIKQII qacrl

DCKLVLKGLGTNPTLEEMLTA /

/ >

d. 0 ο n ., i']t⁴Í0S c-p •l.os néntidos.

’ *1 O -f-p -b -<.

m-á tácrica de ρί'οΊζθ os g na obra intitule i-> 5 p a) 3 ô i 10o 0 ~¹

25-T e TZ

TEZZ12, Stv.tt Ί’Λ ‘.'3 *' o d“~ píuteSS doi'· orf s ο ~· o t· aminoacilo

-.•»4 —· -JTt · .O «-

	nre _n- _r- a conter. 1	0 jd '·'	írio?·	0 -_f*o
m. -t-s/l m. -o «r -9 r-ι t,	r*?, np r ird? '''ário'-	- 'Ρ. · - ’ ·	11 tos	'. j -e
Ή V? 0 ? y	gp-í- -- ς,,ο e.g	-ρ- -•d	0 cui	de.d
* ό v í a ’ Ό r_ t e	4' ’; - 4 P ‘8*11“9 '· m -'	... J. .· ..-p .-,	pa	i S t

d*.

ΐ':ònoacilcs τ

r.to? conportem, cor o.mepgão dos fuaocss amimas d uri oorboíiilos outro ou

d.s? ligações pestílioes, msrticularerte ay'o activaçã.o la oarboxilo, de acordo com nere síntese doo peptidos» Zn alteara

-OCOÂUOr •d·-.

í** 'Z

U^&çÇo util do tino earbodiinid°, ~o'^r- mmlo l-~‘l'íd mmdn o 'riino’· cilo utilizado no-esuir uoa. função ácida mio mol dr e. -Ί0V» 2UIVOOs t—butils'?!;

Γ' inicia---e e^-ção lo lOéc id 0

Mord.?*?.

ror lo ro ΐ1.ο< eilo virinho

η.-ea ' d.OSíCrita ti i·'titulado ”^σο1ίά phase psatido *3^1 tliesis”

Ή;

Λ r· z . ' , ⁿ149-?154)

O -‘.7 O

Ρ1Ί Γ r~’ír.

grur.o t-but iloxíçarbonllo«

I.-ogo qiiG o prineiro a:oinoécido C-terminai se fira

ΡΤ'η .

na radiante

No caro de o grupo protector da função amina

SÍ o grupo t-i-tiloricerbonilo este modo olir»:li2s.2'--se sied te trr-tar.er.to da refina com do acido trifl-ioj?oacético.

no j-i <*. fn oeq-nênnia desejada, a partir nrotegida do miem iro amino?eido C-tczmiina.l firadp sobre

sq * activedp ίλ? 'rermlo n-ela dicie.lo-he::il0 rbod iimida função amir·?

é protegida, por exemplo pelo +—bi 11 * 1 n ml o - r h o n i 1 o«

Cotém-sê dp.oto rodo c primeira psrim cadeia •ne~t-íd.iea que comporta dois anincácidos e cuja ^unção amino terminal está protegida. Como anteriormente, desnrote.ee-se a função amina e en seguida pede-se proceder A do terceiro amir.cs.cilo, en condições análogas as d? adição do segundo aninoácido ^-terminal, ^i;; an-.ee deste r.odo mm foó? outro, os aninoácides çv.e vão constituir a cabeia. ao grupo aniao desnrotmido 'm οο’Όί'ο d*⁵ op^síf ne^tídica já fornada e que er —

T.ogo que r. totalidade da cadeia peptídica pretendida esteja formada, eliminam~_se os grupos proteetores dos diferentes aminoácidos constituintes da cadeia psptídica e separa-se o péptido . da resina por'exemplo co-m σ ácido fluorídrico.

L mmecerfe invenção dfr igualmente respeito -?ns oligdrieros solóveis en água dos mentidos nonomeros· indicodos artes. Λ oligovsriosçã.o pode nrovocar um aumento da inunogenicid a de ^os mántidos nonoveros me nanados pelo processo d.e acordo eor: a -nrermnte invenção. Sem que u?£ tal indicação r-nvário? no-se ser considerada como limitativa, mencionar-^-s-à contudo oue esto oligdmeros po^em, por exsm-*· s »·» a ρ ”! f» 71-/1 ? S r- S s ο ([,ο'''¹· O^r'O ”‘O P

As unidades moncmeras c-.ie entram neste oligomero

a? o οη todas constituídas pelo polipéptido de sequência 1 ou nelo po? inéptido de se quê 21c ia 2, ou por ambos.

pera realiser a oligomeriaacão, node~.se recorrer o qualquer técnica de polirerização ccrrentemente utilizado no dor.írio ^0? néntidos, sendo esta polínerísação condreide. até à obtenção de uk nligómero ou polímero contende 0 número de mid^cde® nonoréricas rretendidas us?s. a aquisição da irur.oger.icid^c-de desejada,

1¾ çrnoesso de oligor.erização ou de pclinsrisacãc do uoaouerc consiste ? repe^· de st® coei um agente de reticulaçãc t?l como o glutaraldé£do.

Pode-'-·© i.gu.almente recorrer a outros métodos de digomeriesção ou. de ligação por exemplo, 0 que realiza ligações sucessivas de unidades monóueras, por intermédio de suas funções terminais carborilo e amina na presença de agentes, de lige.ção homo- ou hetero-bifuncionais.

Pode-se igualmente, para a produção cie moléculas comportendo uir? ou. várias sequências de 17 aminoácidos tais como as definidas sr+es, recorrer a técnicas -da engenharia genétic? que u.tilicsn ricror.ganisnos transformados por us d^terminode ácido nudeico contendo as sequências nucleotídices apropriadas correspondentes,

L presente invenção dis igualruente respeito aos ácidos nucl'-eícos contendo una ou várias sequências resultantes da sequência de APITc do vírus PTé-2 ROD. Pstas sequências referenciadas nela numeração que figura sobre a sequência ante ricr?ue ate de^g^ita, codificam, pare, algar.® péptidos

intere®de aco??do cor· ? nresente invenção.

Sequência que codifi	ca para envl nucleótidos 7350	a	7927
11	Π	env2		3050	a	8095
U	5Ϊ	env3	SÊ	7601	a	7636
Π	H	env4	0	6170	a	6247
!·	!!	env5 -	n	62’94	a	65 49
!!	n	env6	n	6392	a	644;
?!	?!	env7	?!	6724	a.	6763
?!	?!	snvS	!?	6794	a	6838
ΐ!	n	env9	13	7112	a	716 2
I!	!!	envlO	11	7253	a	7336
»	êj	envll	n	7358	a	7426
η	!!	iZâSl	st	1535	a	1597
2. nrs s	ente	invenção dia.	finains	nte respeito	a é-
c i. d o s mi c 1 e i c o s	corr'	esnondentes do	-í-árns	317, cor_tend	0 uma
ou várias sc^nên	.cias	v>íO. c?17 1 4- ρ -το ^J- θ 'v r)	o O7c	do vírus 5	17	-1. ’

Iç+p? q_nç codificam nara os péptidos envl a, envll e ga_gi nodc™ -5? mercadas sobre a figura 5 mediante comnara

ção com as sernências correspondentes descrita*. para Έ.

F obvio que a presente invenção diz respeito aos; ácidos mieléicos correspondendo às sequências colocadas nos regiões análogas dos 4Dcc derivados de variantes 717-2 RO D ou 817, assln como todos os ácidos nucléicos cujas modificações face è.s anteriores resultaram da exploração da degenerescência do código genético.

Δ ,_r.._esente invenção diz ainda respeito aos conjugados obtidos mediante ligação covalente dos péptidos de a-

Por?.s f

ΙΡΡ.Ί g ⁷ 9 γν a*i eane rt*5 ca j tt'·’·.. ia de grv.

t)op. ^e ç o t χοpr:

-tão ri r> η?·Ί o

p.cionas-s tais te típica, himina, jΟ θ Vj 0 τ» tipo? d ir>«

C⁴ ~0t t c* (2. ”Ρθ Tfl o? quaic o 3??e y? 8t?

OO^rr O o descrito nor t· rnmÂinity” scrito eij *^! - ppli© cl vol. 4

r.· 'icln nol ?ão li

C/.OIOa 0ΣΤ

rdd?.?j solúveis em água ('\-etil-T^T| Ce-diuetilamino-propil) c··· rbodiinide, diisocianatos, his-diazobencidina, cli oo agentes ligação moncicnados θ’ΐ ”Scand. ·!, Irnunol.”,

Pode-se recoe^sr a qu-Slquer processo de ligação f a rendo de νη l^do de um? on frnções reactivas do péptido e de outro lado, uma ou várias funções reactivas de moléculas suncrtes, Trata-se coi·· vantagem, das funções carbonilo e amima, as quais podem dar lugar a uma reacção de ligação na. oresença de um agsnte de ligação do género dos utilizados na. síntese das proteínas, por ememplo, o l-etil-3-(5-dimetilaninopropil) -carbodiima, o ?“-hidro:ci.benzotriazol, etc... Pode-se ainda recorrer ao glutaraldéído, narticularmente quando se treta de ligar de novo entre eles ^-'unos animado?! resnsctivamento transportados pelo péptido e nela molécula sunorte.

Os néntidoe de acordo eor a nresente invenção nos— suem. πηοηνίο vlos r.ntigénica.o. Pode-rr então ser utilizados m* nrocesros te diagnóstico para a d.etecção de uma infeoção pelo vírus Ρ7Σ7-2,

Como já se mencionou, o* estudos permitiram distirgr.ir dois grumos de pentidoe nodendo ser utilizados nos pracessos de det-eccão de anticorpos centre o vírus HIY—2 num Pnifo biológico hprc.ro, n? rtic*?.?r rrente um soro ou um líquido se fel o -ra qr. i d i ano· τη.. '.-nine iro grn.no '.T.) conmsenle os néntidcs ga..gi.

¹.... ^l-. <·· -^ént- -^-1 oon—^e''Sr^r pt~ cs’ηοanti T-’T7—? e são nem—

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- detecção da presença efentual de um complexo péptido-anticorpo mediante métodos físicos ou químicos, no referido líquido biológico, . Num modo de realização preferido da presente invenção, a detecção do complexo antigénio-anticorpo realiza-se graças a testes imunoenzimáticos (do tipo ELISA)., imunofluorescentes (do tipo IFA), radioimunológicos (do tipo RIA) ou de testes de radioimunoprecipitação (do tipo RIPA).

Assim a presente invenção diz igualmente respeito a qualquer péptido de acordo com a presente invenção marcado com ajuda de um marcador adequado do tipo enzimático, fluorescente, radio^-ctivo, etc,,.

Tais métodos compreendem por exemplo as seguintes etapas:

- depósito de determinadas quantidades de uma composição peptídica de. acordo com a presente invenção nas cavidades de uma microplaca de titulação,

- introdução nas referidas cavidades de diluições crescentes do soro a ser diagnosticado,

- incubação da microplaca

- lavagens repetidas da microplaca,

- introdução nas cavidades da microplaca de anticorpos marcados contra as imunoglobulinas do sangue, a marcação destes anticorpos tendo sido realizada com ajuda de uma enzima seleccionada entre as que são susceptíveis de hidrolisar um substrato modificando a absorção das radia-58- çães deste último, pelo menos num determinado comprimento de onda,

- detecção, em comparação com wh testemunho de controle, da quantidade de substrato hidrolisado.

A presente invenção diz igualmente respeito aos conjuntos ou colecções para o diagnóstico in vitro¹¹ da presença de anticorpos contra os vírus HIV-2 e em certos casos, HIV-1 num meio biológico que compreende:

- uma composição peptídica de acordo com a presente invenção,

- os reagentes para a constituição do meio propício à realização de reacção imunológica,

- os reagentes para a detecçãc dô complexo antigénio-anticorpo produzido pela reação imunológica. Tais reagentes podem igualmente conter-um marcador, ou ser susceptíveis de ser reconhecidos por sua vez por um reagente marcado/ Mais particularmente no caso em que*a composição polipeptídica referida antes não está marcada.

- um tecido fluído biológico de referência desprovido de anticorpos reconhecidos pela composição polipeptídica referida antes.

A presente ,invenção diz respeito aos anticorpos formados contra os pe'ptidos de acordo com a presente invenção.

K óbvio que esta produção não está limitada aos anticorpos policlonais.

-39Aplica-se ainda a qualquer anticorpo monoclonal produzido por qualquer hibridoma susceptível de ser formado, mediante métodos clássicos, a partir das células esplénicas.,de um animal, particularmente de murganhos ou de.rato, imunizados contra um dos péptidos de acordo com a presente invenção, por. um lado e das células de uma linha de células mieloma apropriadas, por outro lado e de ser seleccionado, pela sua capacidade para produzir anticorpos monoclonais reconhecendo o péptido inicialmente utilizado para a imunização dos animais.

A presente invenção diz igualmente respeito às composições imunogériicas para a produção de vacinas cujo o ingrediente activo é constituído pelo menos por um péptido de acordo com a presente invenção, ou um oligo'mero deste péptido, ou um péptido sob forma conjugada com uma molécula portadora, caracterizadas pelo -facto de induzirem a produção de anticorpos contra os referidos péptidos em quantidade suficiente para também inibir as proteínas do retrovírus HIV-2, até mesmo o retrovírus HIV-2 em associação com / um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

As composições imunogénicas para a produção de vacinas compreendem com vantagem mais particularmente pelo menos um dos péptidos anteriormente designados por env4« env5. env6. env7. env8. envQ. envlO. envll, e mesmo misturas destes.

Bntre estes péptidos aptos para constituir ingredientes activos de vacinas alguns são particularmente pre-

feridos visto possuírem uma estrutura de base em aminoácidos correspondente à das regiões das glicoprotéínas de envelope que apresentam um importante grau de conservação, não somente nos HIV-2 e nos SIV, mas igualmente nos HIV-1. Estes péptidos particularmente preferidos são os péptidos designados por env4. alguns env5. θηνβ θ envlO.

Num processo de realização preferido da presente invenção os péptidos imunogénicos (ou fragmentos destes péptidos) aptos a constituir ingredientes activos de vacinas são escolhidos entre os que correspondem a fórmulas correspondentes às das sequências que, nas glicoprotéínas de envelope de HIV-5, SIV e HIV-1 apresentando uma homologia em aminoácidos^#superior a 50$, pertencem à parte externa do envelope do vírus, que .-são desprovidos ou quase de deleções e que comportam resíduos de cisté-ina favoráveis à estabilização das ligações-e à constituição de· laços de acoplamento.

Os péptidos seguintes pertencem a esta categoria / de péptidos preferidos.

env4

XVTV-YGVP-W—ATZ env5

XL-NVTE-FZ envfi

XKPCVKL-PIC-Z env7

XN-S-I-Z

envlO

XNC-GBF-YC-Z envll

XC-I-Q-IZ

Composições farmacêuticas vantajosas são constituídas por soluções, suspensões ou lipossomas .injectáveis contendo uma dose eficaz de pelo menos um composto de acordo com a presente invenção. De -preferência, estas soluções, suspensões ou lipossomas são realizadas numa fase aquosa esterilizada isotónica, de preferência salina ou glicosada,

A presente invenção diz mais particularmente respeito a tais suspensões,' soluções ou lipossomas susceptíz veis de ser administradas mediante injecções intradérmi• cas, intramusculares ou sub-cutâneas, ou ainda mediante escarificações,

Diz igualmente respeito às composições farmacêu/ ticas administráveis por outras vias, particularmente por / via oral.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção utilizáveis como vacinas para estimular a produção de anticorpos contra o vírus HIV-2, podem a título de exemplo ser administradas em doses compreendidas entre 10 e 500 ^.g/kg , de péptidos de acordo com a presente invenção, de. preferência entre . 50 e 100 jug./kg, •p Estas doses são citadas a título dç exemplo e não possuem em nenhum caso um carácter limitativo.

Como já se indicou antes os diferentes péptidos que foram definidos podem compreender modificações que não têm por efeito modificar de modo fundamental as suas propriedades imunológicas. Os pe'ptidos equivalentes resultantes, -entram no campo das reivindicações a seguir. A título de exemplos de péptidos equivalentes mencionar-se-ão aquele.s, cujas estruturas correspondem às regiões equivalentes dos ADNc de outras variantes de HIV-2, de SIV ou de HIV-1, quando estas regiões se colocam em alinhamento em condições semelhantes às referidas antes, a propósito de HIV-2 ROD, SIV e HIV-1 BRU. Como exemplo de outros destes péptidos, mencionar-se-ão aqules cujas estruturas estejam em correspondência com tais 'regiões nos ADNc que foram depositados na CNCM, particularmente sojj os números 1-502, 1-642 (HIV-2 IRMO), 1-645 (HIV-2 EHO); assim como, nos casos apropriados, as variantes de HIV-1 que foram depositados na CNC1-I sob os números 1-252, 1-240; 1-241, 1-550, 1-551.

Os péptidos de acordo com a presente invenção podem ainda ser definidos pelas seguintes fórmulas (em que X, / Z e os traços têm os significados definidos antes)’:

XRV-AIEKYL-DQA-LN-WGCAFRQVCZ

XAIEKYL-DZ

X-LE-AQIQQEKNMYELQKLNSWZ « XQIQQEKNZ

XELGDYKLVEITPIG-APT--KR-----Z

XYKLVEITPIG-APT--KRZ

X----VTV-YGVP-W--AT--LFCA-Z

XVTV-YGVP-W--ATZ

X----E--L-NVTE-F--W-NZ

XL-NVTE-FZ

XL---S-KPCVKL-PLC----Z *

XKPCVKL-PLC-Z

XS-KPCVKL-PLC-Z

X---N-S-I---C-Z

ΧΝ-Ξ-Ι-Ζ tf

XYC-P-G-A-L-C-N-TZ

X------_A__c------W—Z

NKRPRQAWCWFKG-KWKD

X-G-DPE------NC-GEF-YC------NZ /

/ / y /

X-----C-I-Q-I------G---YZ

; -44A presente invenção, diz igualmente respeito para além dos péptidos de SIV-:já descritos, às proteínas que codificam para o ADNc do vírus SIV. Diz igualmente respeito £ às protdínas de qualquer vírus imunológicamente aparentado iW- ¹ com SlV-lmac, em particular qualquer vírus cujas proteínas e glicoproté ínas de envelope reticulem imunolo’gicamente e cujos ADJfc .apresentem uma percentagem de homologia pelo menos de 95% e, de preferência pelo menos de 98%.

Em particular a presente invenção diz respeito:

•í '

Λ:

1- às proteínas e glicoprote*ínas de envelope que codificam para o géne env e representadas na figura 3,

2- à proteína GAG Representada na figura 4,

3- à proteína POP representada na figura 5,

4- à proteína Q representada na figura 6,

5- à proteína R representada na figura 7,

6- à proteína X representada na figura 8,.

, 7- à proteína F representada na figura 9,

8- à proteína TAT representadana figura 10.

Os aminoácidos das proteínas referidas antes de

SIV, estão representados em alinhamento com as sequências de aminoácidos das proteínas correspondentes do vírus HIV-2; os pontos verticais que figuram entre as duas sequências correspondem aos aminoácidos comuns entre as proteínas dos dois vírus.

As sequências de ADMc que codificam para as pro-4.5 teínas referidas antes aparecem na figura 1B. A presente invenção diz respeito, para além das sequências nucléicas referidas antes a qualquer sequência nucléica modificada, que codifique igualmente para as proteínas do retrovírus SIV ou de um variante.

Estas sequências de ADNc assinaladas pela numeração que figura sobre as sequências descritas antes (figura 1B) são as seguintes:

- .sequência que	codifica para G-AG-, nucleótidos 551 ’	á 2068
— ⁿ		11	POL,	1!	1726	a	4895
1!		!t	Sh	tt	4826	X a	5467
— ¹¹	«*·	II	x,	Π	5298	X a	5655
—		11	R,	n	5657	% a	5959
		n		H	8569	X a	9554
— ¹¹		π	TAT-1	U	5788	a	6084
. 1!	-ΪΙ	ART-1	11	6014	X a	6150
— ^!l		1!	TAT-2	n	8296	a	8591
... TI		Π	ART-2	11	8294	a	8548 ·
— ^υ		1!	ENV	11	6090	X a	8752
A presente	invenção	diz então	naturalmente	re	spei-
to às prote'ínas anteriormente	descritas,	logo	que estas	se-
jam obtidas a partir	do vírus	SIV ou quando s	ejam prepara-
das por um método	de	síntese,	•particularmente	por um	dos mé-

todos já citados em relação à síntese dos péptidos de menor tamanho.

A presente invenção diz igualmente respeito à uti-46 lização das photéínas anteriores para o diagnóstico da eventual presença de anticorpos dirigidos contra as proteínas de HIV-2, e mesmo cnntra o vírus HIV-2 total e, nalguns casos, ₍à sua utilização para fins de diagnóstico de uma infecção devida a um dos vírus HIV. Assim o pe'ptido GAG que codifica para o géne correspondente pode ser utilizado para localizar a eventual presença de anticorpos anti-ElV-1 ou anti-HlV-2, As proteínas ENV são utilizadas de preferência para o diagnóstico específico de uma. infecção devida a HIV-2.ou a um dos seus variantes, por vezes para o diagnóstico de uma infecção por HIV-2 ou IIIV-1.

A preseilte invenção diz então igualmente respeito

4f a um processo para diagnóstico ¹¹ in vitro de detecção de anticorpos contra HIV-2 e eventualmente contra HIV-1 nos fluídos ‘biológicos e em particular nos soros humanos. Tais processos aplicáveis para a utilização das proteínas anteriores de SIV como proteínas de diagnóstico, foram já descritos na presente invenção.

A presente invenção diz igualmente respeito aos conjuntos oucolecções para o diagnóstico in vitro da presença de anticorpos anti-HIV-2 e nalguns casos anti-HIV-1 num meio biológico. Tais conjuntos utilizam péptidos que foram igualmente descritos na presente invenção.

A presente invenção diz igualmente respeito às composições imunogénicas para a produção de .vacinas , cujo ingrediente activo é constituído de modo vantajoso pela menor parte da proteína B.W do vírus SIV, podendo esta prot<éína estar sob a forma conjugada com uma molécula transporta

-47dora. Estas composições imunogénicas induzem a produção de anticorpos contra o referido péptido em quantidade suficiente para inibir as proteínas do retrovírus HIV-2, mesmo o, próprio HIV-2,

Todavia a utilização para fins de diagnóstico das protéínas de SIV não está limitada unicamente às proteínas EHV ou GAG', Outras prote'ínas entre as descritas podem ser utilizadas, para preparar composições de diagnóstico e mesmo de vacinas.

Claims

Reivindicaçoes

1.- Processo para a preparação de um péptido com propriedades imunolõgicas comuns com as do esqueleto peptídico da glicoproteína do envelope dos vírus da classe HIV-2 e tendo igualmente uma estrutura peptídica comum com o esqueleto peptídico da glicoproteína de SIV.l, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

condensar sucessivamente, dois a dois, os aminoacilos sucessivos na ordem requerida, ou aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo jã vários aminoacilos na ordem apropriada, ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados,

- proteger previamente todas as funções reactivas transportadas pelos aminoacilos ou fragmentos com excepção das funções amina e carboxilo que devem intervir na formação das ligações peptídicas.
2.- Processo para a preparação de um péptido com propriedades imunolõgicas comuns com as do esqueleto peptídico da glicoproteína do envelope dos vírus da classe HIV-2, contendo estes péptidos um numero de restos de aminoácidos são superior a 40, e tendo igualmente uma estrutura peptídica comum com o esqueleto peptídico da glicoproteína de SIV.l, caracterizado pelo facto de compreender as.seguintes etapas:

- condensar sucessivamente dois a dois os aminoacilos sucessivos pela ordem requerida, ou aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo já vários aminoacilos na ordem apropriada, ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados,

- proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoacilos ou fragmentos, excepto as funções amina e carboxilo que devem intervir na formação das ligações peptídicas.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

XRV-AIEKYL-DQA-LN-WGCAFRQVCZ

XAIEKYL-DZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH^ ou, na medida em que as propriedades imunológicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao péptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências: RVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVC

AIEKYLQDQ

RVSAIEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVC

AIEKYLKDQ.
4, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

X-LE-AQIQQEKNMYELQKLNSWZ

XQIQQEKNZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH₂ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um residuo de aminoacilo escolhido entre os que permitem ao péptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências seguintes: SLEQAQIQQEKNMYELQKLNSW

QIQQEKN

LLEEAQIQQEKNMYELQKLNSW.
5, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

XELGDYKLVEITPIG-APT—KR-----Z

XYKLVEITPIG-APT—KRZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH₂ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitam ao péptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das sequências seguintes: ELGDYKLVEITPIGFAPTKEKRYSSAH

YKLVEITPIGFAPTKEK

ELGDYKLVEITPIGLAPTNVKRYTTGYKLVEITPIGLAPTNVK.
6.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

_x----VTV-YGVP-W—AT—LFCA-Z

XVTV-YGVP-W—ATZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH₂ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitam ao péptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências: CTQYVTVFYGVPTWKNATIPLFCAT

VTVFYGVPTWKNAT

CIQYVTVFYGVPAWRNATIPLFCAT

VTVFYGVPAWRNAT

EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

CTQYVTVFYGVPTWKNATIPLFCAT

VTVFYGVPTWKNAT

CIQYVTVFYGVPAWRNATIPLFCAT

VTVFYGVPAWRNAT

EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT

EDLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT

DNLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCAS

VTVYYGVPVWKEAT.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

X----E—L-NVTE-F—W-NZ

XL-NVTE-FZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH₂ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do pêptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos

I comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitam ao pêptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências: DDYQEITL-NVTEAFDAWNN

L-NVTE

DDYSELAL-NVTESFDAWEN

PNPQEWLVNVTENFNMWKN

LVNVTE.
9.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se preparar um pêptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

DDY QEITL-NVTEAFDAWNN

L-NVTEAF

DDYSELAL-NVTESFDAWEN

L-NVTESF

PNPQEWLVNVTENFNMWKN

LVNVTENF

-54PNPQEIELENVTEGFNMWKN

LENVTEGF

PNPQEIALENVTENFNMWKN

LENVTENF.
10.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um pêptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

XL---S-KPCVKL-PLC----Z

XKPCVKLTPLCVZ

XS-KPCVKLTPLCVZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH₂ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do pêptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoãcidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao pêptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências: LFETSIKPCVKLTPLCVAMK

LFETSIKPCVKLSPLCITMR

LWDQSLKPCVKLTPLCVSLK

KPCVKLTPLCV

KPCVKLSPLCI

SLKPCVKLTPLCV.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das seguintes estruturas:

LFETSIKPCVKLTPLCVAMK

LFETSIKPCVKLSPLCITMR

LWDQSLKPCVKLTPLCVSLK LWDQSLKPCVKLTPLCVTLN

PCVKLTPLCV KPCVKLSPLCI.
12, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com a estrutura de base seguinte:

X---N-S-I---C-Z

XN-S-I-Z em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH2 ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoãcidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao péptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências:

NHCNTSVITESCD

NTSVIT

NHCNTSVIQECCD

NTSVIQ

TSCNTSVITQACP

NTSVIT.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das seguintes fórmulas:

NHCNTSVITESCD

NTSVIT

NHCNTSVIQECCD

NTSVIQ

TSCNTSVITQACP

NTSVIT

INCNTSVITQACP

NTSVIT

INCNTSAITQACP

NTSAIT.
14, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido de fórmula geral: XYC-P-G-A-L-C-N-TZ na qual X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH^ ou, na medida em que as propriedades imunológicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços âe união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao pêptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências:

YCAPPGYALLRC-NDT

YCAPAGFAILKCNNKT.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se preparar um pêptido com uma das fórmulas seguintes:

YCAPPGYALLRC-NDT

YCAPAGFAILKCNNKT

YCAPAGFAILKCNDKK YCAPAGFAILKCRDKK.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um pêptido de fórmula geral:

X------A-C-------w—Z, na qual X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH2 ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do pêptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao pêptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências:

NKRPRQAWCWFKGgKWKD

NERPKQAWCRFGG-NWKE N—MRQAHCNISRAKWNA,
17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com a seguinte fórmula:

NKRPRQAWCWFKG-KWKD

NERPKQAWCRFGG-KWKE N—MRQAHCNISRAKWNA D—IRRAYCTINETEWDK

I—IGQAHCNISRAQWSK.
18, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com a fórmula geral seguinte:

X-G-DPE------NC-GEF-YC------NZ

XNC-GEF-YC-Z na qual X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NHg ou, na medida em que as propriedades imunológicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao péptido definido antes conservar as propriedades imunológicas de uma das seguintes sequências:

KGSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLN

NCRGEFLYCN

GG-DPEVTFMWTNCRGEFLYCKMNWFLN

NCRGEFLYCK

-GGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFN NCGGEFFYCN.
19.- Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das seguintes estruturas:

KGSDPEVAYMWTNCRGEFLYCNMTWFLN

NCRGEFLYCN

GG-DPEVTFMWTNCRGEFLYCKMNWFLN

NCRGEFLYCK

-GGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFN ) NCGGEFFYCN

-GGDPEITTHSFNCRGEFFYCNTSKLFN

NCRGEFFYCN

-GGDPEITTHSFNCGGEFFYCNTSGLFN

NCGGEFFYCN.
20·“ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das fórmulas gerais seguintes:

χ-----C-I-Q-I------G---YZ

XC-I-Q-IZ em que X e Z representam, cada um, um grupo OH ou NH₂ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do péptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao péptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma das seguintes sequências:

RNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVY

CHIKQII

RNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVY

CHIRQII

TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMY

CRIKQFI.

►
21,- Processo de acordo com a reivindicação 20, caracte rizado pelo facto de se preparar um péptido com uma das seguintes estruturas:

RNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVY

CHIKQII

RNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVY

CHIRQII

TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMY

CRIKQFI

-βί- ε ITLPCRIKQIINMWQKTCKAMY

CRIKQII

NITLQCRIKQIIKMVAGR-KAIY

CRIKQII.
22.- Processo para a preparação de um pêptido antigênico gag 1, tendo uma das estruturas de base: XDCKLVLKGLGMNPTLEEMLTAZ XDCKLVLKGLGTNPTLEEMLTAZ em que X e Z representam,cada um,um gnpoOH ou NH^ ou, na medida em que as propriedades imunolõgicas do pêptido desprovido destes grupos não se encontrem essencialmente modificadas, grupos comportando 1 a 5 resíduos de aminoácidos, e em que cada um dos traços de união corresponde a um resíduo aminoacilo escolhido entre os que permitem ao pêptido definido antes conservar as propriedades imunolõgicas de uma ou outra das seguintes sequências: DCKLVLKGLGMNPTLEEMLTA

DCKLVLKGLGTNPTLEEMLTA caracterizado por compreender as seguintes etapas:

- condensar sucessivamente, dois a dois, os aminoacilos sucessivos na ordem requerida, ou aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo já vários aminoacilos na ordem apropriada, ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados,

- proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoacilos ou fragmentos, excepto as funções amina e carboxilo que devem intervir na formação de ligações peptídicas.
23.- Processo de acordo com a reivindicação 2, para a preparação de um péptido tendo uma estrutura peptídica comum com o esqueleto peptídico de SIV-1, caracterizado pelo facto de se utilizar a totalidade ou parte das sequências de aminoácidos escolhidas entre as seguintes sequências:

ENV representada a seguir.·

10 20 30 «050

KGCLCNOILIAIC—SKCLWIICIQYVTVFYGVPAWRNATIPLFCATKNRDTWGTTOCL t ::::::: : :: : :::::::::: ::::

HH---NOLLIAILLAS ACLVY-CTOYVTVFYGVPTWKNATIPLFCATRNRDTMGTIOCL

10 20 30 A050

60 70 80 90 100110

PONDDYSELAuNVTESF0AWENTVTEOAIEDVWOLFETS1KPCVKLSPLClTflRCNKSET

PDNDDY0E1TLNVTEAFDAWNNTVTE0A1EDVWHLFETS IKPCVKLTPLCVAHKCSSTES

60 70 80 90 100110

120 130 140 150 160 170

DKWGLTKSSTT TASTTTTTTAKS ve trdi VNETS--PCWHDNCTGLEOEPRISCKFNH : : : : :: ::: :: : : : ::: T-D0E0E1SEDTPCARADNCSGLGEEET1NC0FNH 150

STCNNTTSKST—STTTTTP

120 130

150

160

230 TCLKRDKKKEYNETWYSADLVCEQGNSTGNESRCYHNHCNTSVIOECCDKDYWDAIRCRY ::: ::::: ::::::: : ::: ::: : ::::::::::: : ::: :: TCLERDKKKOYNETWYSKDVVCETNNST-NQTOCYRNHCNTSVITESCDKHYWDAIRFRY 170

180

190

180

200

210

220

190

200

210

220

260 270 280290

CAPPGYALLRCNDTNYSGFRPNCSKVVVSSCTRMKETQTSTWFRFNGTRAENRTYIYWHG

240

250

CAPPGYALLRCNDTNYSGFAPNCSKVVASTCTRMRETOTSTWFGFNGTRAENRTY IYWHG 230 240 250 260 270280

300 310 320 330 340350

RDNRT1ISLNKHYNLTHKCRRPGNKTVLPYTIMSAL VFHS--QPVNERPKQAWCRFGCNW rdnrtiislnkyynlslhckrpgnktvkoihlhsghvfhshyopinkrproawckfkckw 290 300 310 320 330340

360 370 380 390400

KEAlKEVKOT]VKHPRYTGTNNTDKJNLTAPRGG-DPEVTFflWTNCRGEFLYCKKNWFLN : : ::t : ::::: ::: : : :t : :::: :::::

KDAROEVKETLAKHPRYRGTNDTRNISFAAPGKGSDPEVAYNWTNCRCEFLYCNRTWFLN 350 360 370 380 390400 «20 «30 Α«*0 <150 «60

WVEDRSLTTOKPKERHKRNYVPCHIROIINTWHKVGKNVYLPPRECDLTCN5TVTSL1ÂN . β _Λ 4 · · · 4 4 · 4 ·········· ·······»· · ······· 4 · 4 • ; ζ 4 4 4 4 4 · 4 4 ···«··«··· ·4·444·44 · ··*···· 4 · 4

WI Ε Ν--------KT-H-RNYAPCHIK01ίΝΤWHKVGRNVYLPPREGELSCNSTVTS1I ΑΝ «ίο 420 «30 Α«0450 «80 «90 500 510520

INWTDGNQTSITMSAEVAELYRLELGOYKLVEIΤΡJGLAPTKVKRYTTG-GTSRNKRGVF _ _Λ ··· · 4 ·····»·················· 4 4 4 · · · β Λ 44··

J Φ * · · ·· ·«·······«············»· 4 · 4 ··· · · · 4 · 4

IDWONNNOTNITFSAEVAELYRLELGDYKLVEIΤΡIGFAPTKEKRYSSAHC—RHTRGVF «60 470 «80 «90 500510

5«0 550 560 570580

VLGFLGFLATAGSAMGAA5LTVTAOSRTLLAGIVOOQQOLLDVVKRQOELLRLTVWGTKN • ••••••«•••••«•β······ 44·4··············44·4····4·44·44··44 • ••••4444·4·4·*44·*··4 ««···········«·············«········

VLGFLGFLATAGSAMGAASLTVSA0SRTLLAG1VOOQOOLLDVVKRQQELLRLTVWGTKN

520 530 5«0 550 560 570

600 610 620 630 640

LOTRVSAΙΕKYLKDOAOLNAWGCAFROYCHTTVPWPNASLTPDWNNETWOEWERKVDFLE ·« · · 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 · ····««········· 4 · 4 4 4 4 · «····· · · · • · 4 4 ······ 4 4« 4 4 «β·*·*·····*··· 4 4 4 ··· 4 4 · 4 4 · · · 4 4

LOARVTAIEKYLODQARLNSWGCAF ROVCHTTVPWVNDSLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLE

580 590 600 610 620 630

660 670 680 690 700

ANITALLEEAOIOOEKNMYELQKLNSWDVFGNWFDLTSWIKYIQYGIΥΙIVGVILLRIVI • · · · · ·«··············«·· ••••••«•«4 4 4 4 * 4 4 4 4 4 · · · · · · ·

4 4 4 β·,···········»·*····· ·4·*··44·4 « · 4 4 4 · 4 4 · · · · · 4 · ·

ΑΝ] SKSLEQ AOIQQEΚΝΜ ΥΕ LOKLNSk'D I FGNriFDL ΤSKVKΥ IQYG VL 11VAV IALR 1 VI

6«0 650 660 670 680690

720 730 7«0 750760

ΥΙvqmlarlrqgyrpvfssppsyfq*thtqqdpalptkegkkgdgggsggnsswpwqiey • ••••••••••*«•••44 4· · · · 4 4 4 4 4 · · · · ·· ·«······ 4444444444 4 4 4 * · 4 · · · 44 4 4···

YWQKLSRLRKGYRPVFSSPPGYIQ01HIHKDRG0PAKEETEEDGGSNGGDRYWPWPΙΑΥ

700 710 720 730 7«0750

780 790 800 810820

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X representada a seguir;

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TAT representada a seguir:

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24.- Processo para a preparação de um vector recombinante contendo um ácido nucleico recombinante compreendendo a tota lidade ou uma parte de ADNc definida a seguir:

AGTCGCTCTGCGGAGAGGCTGGCAGATIGAGCCCTtGGAGCTTCTCTCCACCACIAGC AG ······

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GAGGCTTTTATTCGG

290 ou contendo uma das seguintes sequências:

GAG estendendo-se entre os nucleotidos 550 a 2068 POL estendendo-se entre os nucleotidos 1726 a 4893 Q estendendo-se entre os nucleotidos 4826 a 5467 X estendendo-se entre os nucleotidos 5298 a 5633 R estendendo-se entre os nucleotidos 5637 a 5939 F estendendo-se entre os nucleotidos 8569 a 9354 TAT-1 estendendo-se entre os nucleotidos 5788 a 6084 ART-1 estendendo-se entre os nucleotidos 6014 a 6130 TAT-2 estendendo-se entre os nucleotidos 8296 a 8391 ART-2 estendendo-se entre os nucleotidos 8294 a 8548 LTR estendendo-se entre os nucleotidos 8950 a 9468 e 1 a 316 ENV estendendo-se entre os nucleotidos 6090 a 8732

caracterizado pelo facto de se recombinar um ácido nucleico proveniente de um vector com uma das sequências definidas antes.

25.- Processo de acordo com a reivindicação 24, caracte rizado pelo facto de se marcar o ácido nucleico recombinante.
26,- Processo para a preparação de uma composição antigênica, caracterizado pelo facto de se utilizar um péptido gag tal como o obtido de acordo com o processo descrito na reivindica ção 23 ou pelo menos um péptido gag 1 tal como o obtido de acordo com o processo descrito na reivindicação 22 ou pelo menos um ç

oligõmero deste pêptido, permitindo o dito processo a obtenção de uma composição antigênica com a capacidade de ser reconhecida pelos fluidos biológicos de origem humana, particularmente soros contendo anticorpos anti - HIV-2 e, em certa medida, anticorpos anti - HIV-1.
27. - Processo para a preparação de uma composição antigénica, caracterizado pelo facto de se utilizar o pêptido env obtido pelo processo de acordo com a reivindicação 23 ou pelo menos um pêptido obtido pelo processo de acordo com as reivindicações 3, 4 e 5 ou pelo menos um oligómero deste pêptido, conduzindo o processo à obtenção de uma composição antigênica capaz de reconhecer especificamente a presença de anticorpos contra HIV-2.
28. - Processo para a preparação de uma composição imunogénica, caracterizado pelo facto de se associar a totalidade ou parte do pêptido env obtido pelo processo de acordo com a reivindicação 23 ou pelo menos um pêptido obtido pelo processo de acordo com as reivindicações 6 a 21, ou pelo menos um oligõmero deste pêptido ou este pêptido sob a forma conjugada com uma molécula portadora com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico para a produção de vacinas, sendo a dita composição capaz de induzir a produção de anticorpos contra os referidos péptidos em quantidade suficiente para inibir eficazmente as proteínas do retrovírus HIV-2, até mesmo o rectrovírus HIV-2 inteiro.

-87/

V
29. - Processo de acordo com a reivindicação 28, para a preparação de uma composição imunogênica, caracterizado pelo facto de se utilizar péptidos com as formulas correspondentes ãs das sequências que, nas glicoproteinas do envelope de HIV-2, SIV-1 e HIV-1 apresentam uma homologia em aminoácidos superior a 50 %.
30. - Processo de acordo com uma das reivindicações 28 ou

29, para a preparação de uma composição imunogênica, caracterizado pelo facto de se utilizar pelo menos um péptido ou pelo menos um oligómero deste péptido ou este péptido sob a forma conjugada com uma molécula portadora sendo o dito péptido escolhido entre env 4, env 5, env 6 e env 10.
31. - Processo para o diagnóstico in vitro da infecção por HIV-2 em um líquido biológico, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes etapas:

- contacto deste líquido biológico com pelo menos um péptido obtido pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 22 ou um conjugado destes péptidos com uma molécula portadora ou péptidos gag ou env de acordo com a reivindicação 23;

- detecção da eventual presença de um complexo antigênio-anti corpo por métodos físicos ou químicos, no referido líquido biológico .
32. - Processo para o diagnóstico ¹¹ in vitro da infecção por HIV-2 em um líquido biológico de acordo com a reivindicação

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31, caracterizado pelo facto de a detecção do complexo antigénio-anticorpo eventualmente formado se realizar graças a ensaios imunoenzimãticos (do tipo ELISA), imunofluorescentes (do tipo

IFA)_t radioimunolõgicos (do tipo RIA) ou ensaios de radioimunoprecipitação (do tipo RIPA).
33,- Estojo para o diagnóstico in vitro da infecção por HIV-2 em um líquido biológico, caracterizado pelo facto de incluir:

- uma composição ptptídica contendo um péptido obtido de acordo com um processo descrito em uma das reivindicações 1 a 5,

22, ou uma mistura destes peptidos, ou um conjugado destes peptidos com uma molécula portadora, ou os peptidos gag ou env obtidos pelo processo de acordo com a reivindicação 23,

- um reagente para a constituição do meio favorável a realização de uma reacção imunolõgica,

- um ou vários reagentes eventualmente marcados para a detecção do complexo antigénio-anticorpo formado pela reacção imunológica,

- um líquido biológico de referência desprovido de anticorpos reconhecidos pela referida composição peptídica,