PT86565B - Processo para a preparacao de peptidos de retrovirus de imunodeficiencia humana (hiv-virus) e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS DE

RETROVÍRUS DE IMUNODEFICIÊKCIA HUMANA (HIV-VÍRUS)

E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE ÓS CORTEM

A presente invenção refere-se a péptidos antigénicos codi ficados pelas sequências env ou gag de HIV-2. Podem utilizar-se alguns destes péptidos no diagnóstico da presença de anticorpos contra pelo menos um dos antigénios de HIV-2 no soro 'biológico. A presênte invenção também diz respeito a péptidos que se consideram especialmente como agentes de protecção. As sequências nucle£ tídicas que codificam estes péptidos incluem-se na sequência nucleotídica de HIV-2 já descrita no pedido de patente de invenção portuguesa Rs 84 182 depositado em 22 de Janeiro de 1987.

Os péptidos da presente invenção caracterizam-se pelas seguintes sequências:

I

env 1 ( 1735- 1809 )

• ·	ValThrAlalleGluLysTyr GTCACTGCTATAGAGAAGTAC • ·

LeuGlnAspGlnAlaArgLeuAsnSerTrpGlyCysAlaPheArg ctacaggaccaggcgcggctaaattcatggggatgtgcgtttaga . 1800 GlnValCy$

CAAGTCTGC env2 (1912-1983)

SerLysSerLeuGÍuGlnAlaGln

AGTAAAAGTTTAGAACAGGCACAA 1900 IleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSer ATTCAGCAAGAGAAAAATATGTATGAACTACAAAAATTAAATAGC ^Tr3

TG(j env3 ( 1482- 1 530)

Pro CCT

ThrLysGluLysArgTyrSerSerAlaBisGlyArgBieThrArg

ACAAAAGAAAAAAGATACTCCTCTGCTCACGGGAGACATACAAGA 1500 · · env4 (55-129)

CysThrGlnTyrValThrValPheTyrGlyValPro

TGCACCCAATATGTAACTGTTTTCTATGGCGTACCC

ThrTrpLysAsnAlaThrlleProLeuPheCysAlaThr

ACGTGGAAAAATGCAACCATTCCCCTCTTTTGTGCAACC

100

env5 ( 175-23I)

AspAsp GATGAT • · · · ·

TyrGlnGluIleThríeuAsnValThrGluAlaPheA6pAlaTrp TATCAGGAAATAACTTTGAATGTAACAGAGGCTTTTGATGCATGG . 200

AsnAsn

AATAAT env6 (274-330)

GluThrSerlleLysProCysValLysLeuThrProLeuCys GAGACATCAATAAAACCATGTGTCAAACTAACACCTTTATGT . · 300

ValAlaMetLysCyí GTAGCAATGAAATGC evn7 (607-660)

AsnHísCysAsnThrSerValIle

AACCATTGCAACACATCAGTCATC . 600 .

ThrGluSerCyeAspLysllisTyrTrpAsp

ACAGAATCATGTGACAAGCACTATTGGGAT env8 (661-720)

AlalleArgPheArg

GCTATAAGGTTTAGA • · · ·

TyrCysAlaProProGlyTyrAlaLeuLeuArgCysAsnAspThr

TACTGTGCACCACCGGGTTATGCCCTATTAAGATGTAATGATACC • * 7 00 .

env9 (997-1044)

LysArgProArgGlnAlaTrpCysTrpPheLysGlyLya AAAAGACCCAGACAAGCATGGTGCTGGTTCAAAGGCAAA

1000 *

TrpLyeAsp

TGCAAAGAC· envlO ( 1 132-12 15)

LysGlySerAspProGluValAlaTyrHetTrpThrAsn AAAGGCTCAGACCCAGAAGTAGCATACATGTGGACTAAC • · · · ·

CysArgGlyGluPheLeuTyrCysAsnMetThrTrpPheLeuAsn TGCAGAGGAGAGTTTCTCTACTGCAACATGACTTGGTTCCTCAAT * . 1200

env 1 1 ( 1237-1305)
• ·.	• ArgAsnTyrAlaProCysHísIle CGCAATTATGCACCGTGCCATATA

• ·_ζ · · *

LysGlnllelleAsnThrlrpBisLysValGlyArgAsnValTyr AAGCAAATAATTAACACATGGCATAAGGTAGGGAGAAATGTATAT

1300 gagl (991-1053)

As pCys Ly s Leu VaILeuLy sGlyLeuGlyMetAsnProThrLeu GACTGTAAATTAGTGCTAAAAGGACTAGGGATGAACCCTACCTTA 1000

GluGluMetLeuThrAlal

GAAGAGATGCTGACCGCC

- 5 Para o objectivo da presente invenção deve considerar-se aqui incorporada, como referência, a literatura técnica disponível referente ao HIV-2, atendendo a que para a obtenção dos pépti dos anteriormente descritos se aplicaram as técnicas descritas na referida literatura em condições similares.

A presente invenção refere-se a um processe para sintetizar os péptidos anteriormente referidos.

Os referidos polipeptidos que suportam o epitope em especial aqueles cujos aminoácidos N-terminal e O-terminal se encontram livres, também se obtêm por síntese química, de acordo com técnicas bem conhecidas na química das proteínas.

A síntese dos péptidos em solução homogénea e em fase sóli da é bem conhecida.

A este respeito,pode recorrer-se ao método de síntese em solução homogénea descrito por Houbenweyl no trabalho intitulado Methoden der Organischen Chemie (Methods of Organic Chemistry) editado por P. WWSCH., vol 15. I e II, THIEME, Stuttgart, 1974.

Este método de síntese consiste na condensação sucessiva ou dos aminoácidos sucessivos dois a dois, segundo a ordem adequa da, ou de fragmentos de péptidos sucessivos previamente disponíveis ou formados e que contém já diversos resíduos amino-acilo, respectivamente, pela ordem adequada. Com excepção dos grupos car boxilo e amino que deverão tomar parte na formação das ligações peptídicas, deve ter-se 0 cuidado de proteger antecipadamente todos os outros grupos reactivos suportados por estes grupos ou fragmentos amino-acilo. Contudo, antes da formação das ligações peptídicas, activam-se com. vantagem os grupos carboxilo, de acordo

- 6 — com métodos bem conhecidos na síntese dos péptidos. Em alternativa, pode recorrer-se a reacções de acoplamento que fazem actuar os rea. gentes convencionais, por exemplo, do tipo carbodiimida, tal como l-etil-J-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida. Quando o grupo aminoácido utilizado transporta um grupo amino adicional (por exemplo, lisina) ou uma outra função ácida (por exemplo, ácido glutâmico), podem proteger-se estes grupos com grupos carbobenzoxi ou t-butiloxi-carbonilo, no que se refere aos grupos amina, ou com grupos t-butil-éster no que respeita aos grupos carboxílicos. Existem procedimentos semelhantes.'para a protecção de outros grupos reactivos. Dor exemplo, pode proteger-se o grupo SH (por exemplo, na cisteína) com um grupo acetamido-metilo ou para-metoxi-benzilo.

No caso da síntese progressiva, aminoácido a aminoácido, inicia-se a síntese, de preferência pela condensação do aminoácido C —terminal que corresponde ao grupo amino-acilo vizinho na sequên cia desejada, e assim sucessivamente passo a passo, até ao aminoácido N— terminal. Outra técnica preferida e segura é a descrita por R. D. Merrifield em Solid phase peptide synthesis (1. Am. Chem. Soe., 45, 2149 - 2159).

De acordo com o processo de Merrifield, fixa-se o primeiro aminoácido C-terminal da cadeia a uma resina polimérica porosa ade. quada por meio do seu grupo carboxilico e protege-se então o grupo amino do referido aminoácido, por exemplo com um grupo t-butiloxi-carbonilo.

Quando o primeiro aminoácido C-terminal se fixa deste modo à resina, remove-se o grupo protector do grupo amina mediante lavagem da resina com um ácido, por exemplo, ácido trifluoroacético, quando o grupo protector do grupo amina é um grupo t-buti- 7 ^;7<

loxi-carbonilo.

Depois, liga-se o grupo carboxílico do segundo aminoácido que fornece o segundo grupo amino-acilo da sequência peptídica dese. jada ao grupo amina desprotegido do aminoácido C-terminal fixado na resina. Activa-se, de preferência, o grupo carboxilo deste segundo aminoácido por exemplo, com diciclo-hexil—carbodiimida, enquanto se protege o seu grupo amina, por exemplo em um grupo t-bu tiloxi-carbonilo. Obtém-se assim, a primeira parte da cadeia peptí dica desejada, que compreende os dois primeiros aminoácidos. Conforme anteriormente referido, desprotege-se então o grupo amina e pode prosseguir-se posteriormente com a fixação do grupo amino-acilo seguinte, e assim por diante, até se obter na totalidade o péptido pretendido.

Podem então remover-se os grupos protectores dos diferentes grupos laterais, se existirem, da cadeia peptídica assim forma da. Pode então separar-se o péptido pretendido da resina, por exem pio com ácido fluorídrico, e recuperá-lo finalmente, na forma pura a partir da solução ácida através de procedimentos convencionais.

Sempre que necessário pode aumentar-se o caracter imunogé nico in vivo dos péptidos da presente invenção mediante o seu a coplamento ou conjugação covalente a uma molécula de transporte fisiologicamente aceitável e não tóxica.

Como exemplo de moléculas de transporte ou de suportes macromoleculares que podem utilizar-se para a obtenção dos conjuga dos de acordo com a presente invenção, mencionar-se-ão as proteínas naturais, tais como o toxóide tetânico, a ovalbumina, as albuminas séricas, as hemociaminas, etc. Também podem utilizar-se veículos

- 8 macromoleculares de síntese, por exemplo poli-lisinas ou poli(D-L-alanina)-poli(L-lisina)s.

Conhecem-se a partir de literatura, outros tipos de veícu los macromoleculares que se podem utilizar e que possuem, geralmen te, pesos moleculares superiores a 20 000.

Podem sintetizar-se os conjugados de acordo com técnicas conhecidas, tal como a descrita por Frantz e Robertson em Infect. and Immunity, 33, 193-198 (1981) ou por P. E. Kauffman em Applied and Environmental MLcrobiology, Outubro de 1981, Vol. ' é n^ 4, 611-614.

Podem utilizar-se por exemplo, os agentes de acoplamento seguintes: aldeído glutárico, cloroformato de etilo, carbodiimidas solúveis em água /N-etil-TT'-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida, HC17 diisocianatos, bis-diazo-benzidina, di-, e tricloro-s-triazinas, brometos cianogénicos, benzaquinona,assim como os agentes de acoplamento referidos em Scand. J. Immunol., 1978, vol. 8, p.

7-23 (Avrameas Ternynck, Guesdon).

Podem utilizar-se quaisquer processos de acoplamento para ligar, por um lado, um ou vários grupos reactivos do péptido e, por outró lado, um ou vários grupos reactivos do veículo de suporte. Além disso, consegue-se um acoplamento em condições vantajosas entre os grupos carboxilo e amina transportados pelo péptido e o veí. culo e, vice-versa, na presença de um agente de acoplamento do tipo que se utiliza na síntese das proteínas, isto é, l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiinida, N-hidroxi-benzotriazol, etc. Também se pode efectuar o acoplamento entre os grupos amina supor, tados pelo péptido e pelo veículo respectivamente, com glutaraldeí.

- 9 do, por exemplo, de acordo com o método descrito por Hoquet, p. e outros (1982) Molec. Immunol., 19, 1441 - 1549, quando o: veículo é a hemocianina.

Pode reforçar-se a imunogenicidade dos péptidos que supor tam a epitope por oligomerização, por exemplo, na presença de glu taraldeído ou de qualquer outro agente de ligação adequado.

A presente invenção refere-se em particular, aos oligómeros-imunogénicos solúveis em água assim obtidos e que compreendem, em especial, 2 a 10 unidades monoméricas.

Os péptidos (que no seguimento serão designados de um modo geral como antigénios”) da presente invenção, se obtidos num ésta do puro a partir de preparações do vírus HIV-2 ou no que se refere mais particularmente aos péptidos por síntese química, sâo úteis nos processos para a detecção da presença de anticorpos anti-HIV-2 em meios 'biológicos, especialmente fluídos biológicos tais como soros do homem ou de animais, tendo em vista, particularmente, a possibilidade de diagnosticar IAS ou AIDS.

A presente invenção refere-se a composições imunogénicas que compreendem pelo menos um péptido, um oligómero desse péptido ou um desses péptidos conjugado com uma molécula de transporte, em associação com um veículo farmaceuticamente adequado ou fisiologicamente aceitável. Esta composição é especialmente apreciada para a produção de uma vacina caracterizada pelo facto de ser capaz de induzir a produção de anticorpos contra os péptidos anteriormente referidos, tendo em vista a protecção contra uma infecção provoca, da pelo vírus HIV-2.

A presente invenção refere-se ainda a um processo de dia-

gnóstico in vitro que utiliza os péptidos anteriormente descritos para a detecção de anticorpos anti-HIV-2 nos soros dos pacientes que os possuam.

processo para o diagnóstivo in vitro de uma infecção causada pelo vírus HIV-2 numa amostra biológica é caracterizado por:

- se fazer contactar essa amostra biológica com um dos péptidos em condições que permitam a formação do com plexo antigénio-anticorpo,

- se detectar o complexo antigénio-anticorpo formado.

De entre os péptidos descritos, aqueles que possuem um par ticular interesse para fins de diagnóstico são os seguintes: env 1, env 2, env 5 θ gag 1·

Um aspecto preferido do processo da invenção compreende:

- a deposição de uma quantidade previamente determinada de um ou vários dos referidos péptidos antigénicos nos recipientes de uma microplaca de titulação;

- a introdução de diluições crescentes de fluido biológico, isto é, soro a ser diagnosticado dentro destes recipientes;

- a incubação da microplaca;

- a lavagem cuidadosa da microplaca com um tampão adequado;

- a adição aos recipientes de anticorpos especificamente marcados dirigidos contra as imunoglobulinas do sangue;e

- a detecção, por meios físicos ou químicos adequados, do complexo antigénio-anticorpo formado, que é então o indicador da presença de anticorpos HIV-2 no fluido bioló gico.

Efectua-se, com vantagem, a marcação dos anticorpos anti-imunoglobulina com um enzima escolhido entre os que são capazes

-lide hidrólisar um substrato, substrato este que sofre uma modifica ção da sua absorçêb de radiação, pelo menos numa banda de comprimen tos de onda pré-determinada. A detecção do substrato, de preferência por comparação no que se refere a um controlo, fornece assim um cálculo dos riscos potenciais da presença efectiva da doença.

Assim, os métodos preferidos são detecções imuno-enzimáticas ou imuno.flurescentes, especialmente de accido com a técnica ELISA. As titulações podem ser determinações por imuncfLurescência ou determinações imuno-enzimáticas directas ou indirectas. Podem efectuar-se as titulações quantitativas dos anticorpos nos soros estudados.

A presente invenção diz também respeito a conjuntos de dia gnóstico para a detecção in vitro de anticorpos contra o vírus HIV-2, conjuntos esses que incluem qualquer dos péptidos aqui identificados e todos os reagentes biológicos e químicos, assim como o equipamento necessário para se proceder a ensaios de diagnóstico. Os conjuntos preferidos englobam todos os reagentes necessários pa ra se efectuarem ensaios ELISA. Deste modo os conjuntos preferidos incluirão, além de qualquer dos referidos polipéptidos, tampões adequados e imunoglobulinas anti-humanas, sendo essas imunoglobulinas anti-humanas marcadas quer por uma molécula.imunoflurescente quer por um enzima. Por último, os conjuntos preferidos incluem também um substrato hidrolisável pelo enzima e que proporciona um sinal, particularmente absorção modificada de uma radiação, pelo menos num determinado comprimento de onda, sinal esse que indica assim, a presença do anticorpo no fluido.biológico que será ensaia do com o referido conjunto.

A presente invenção também se refere a composições de vaci1 nas cujo principio activo é serem constituídas por qualquer dos imu nogénios, isto é, os petidos ou oligopéptidos descritos anteriormen te, eventualmente conjugados com uma molécula de transporte em um veículo farmacêutico adequado ou aceitável sob o ponto de vista fisiológico.

Os péptidos preferidos que se utilizam na produção de prin cipios de vacinação são os péptidos env 4, env 5, env 6, env 7, env 8, env 9, env 10, env 11, conforme definido anteriormente. A título de exemplo, e sem caracter limitativo, pode referir-se que as doses adequadas de composições para vacinas são aquelas que pro vocam com eficácia o aparecimento de anticorpos in vivo, no hos. pedeiro, especialmente num hospedeiro humano. As doses adequadas estão compreendidas entre 10 e 5θθ microgramas de polipéptido, pro. teína ou glicoproteína por Kg, por exemplo, 50 a 100 microgramas por Kg.

Podem utilizar-se os diferentes péptidos de acordo com a presente invenção, para a produção de anticorpos,de preferência anticorpos monoclonais específicos dos diferentes péptidos, respeç. tivamente. Para a produção de hibridomas que segnegam _ os referidos anticorpos monoclonais utilizaram-se métodos de produção e rastre/ o convencionais. Estes anticorpos monoclonais que fazem parte da presente invenção, fornecem assim, dados muito úteis' para a identi ficação e até determinação das proporções relativas dos diferentes polipéptidos ou proteínas em amostras biológicas, especialmente a. mostras humanas, que contêm HIV-2 ou vírus aparentados.

Claims (1)

1. Reivindicações

   1Processo para a preparação de um péptido antigénico seleccionado entre os péptidos com a seguinte fórmula:

   env1 (1735-1809)

   ValThrAl»lleGluLy»Tyr CTçactgctatagagaagtac

   LeuGlnAspGloAlaArRLeuAsr. SerTrpGlyCysAlaPhíArt

   CTACAGCACCAGCCGCCGCTAAATICATGGGCATGTGCGTTTAGA

   1 800

   CinValCy. CAAGTCTGC env2 (1912-1983)

   SerLysSerLeuGluGlnAlaGln

   AGTAAAACTTTACAACAGGCACAA 1900

   11«GInGInGluLy(A auMetTyrGluLeuG lnLysLeuAsnser

   ATTCACCAACAGAAAAATATGTATGAACTACAAAAATIAAATAGC

   Trp TGG env3 (1482-1530)

   Pro CCT

   ThrLy,CluLy»ArjTyrSerSerAliBisClyArgBj,ThrArg ACAAAAGAAAAAAGATACTCCTCTGCTCACGGGACACATACAAGA 1500 · ♦ env4 (55-129)

   CysThrGInTyrValThrV*IPheTyrG1yVaIPto

   TGCACCCAATATGTAACTGTTTTCTATGGCGTACCC

   ThrTrplysAsnAlaThrlleProLeuPheCysAlaThr

   ACCTGGAAAAATGCAACCATTCCCCTCTTTTCTCCAACC

   100 env5 (175-231)

   AspAsp GATGAT • · · * ♦

   TyrClnGluIleThrLeuAânValThrGluAlaPheAspAleTrp TATCAÇGAAATAACTTTGAA1GIAACACAGGCTTTTGATGCATGG . 200

   AsnArn

   AATAAT env6 (274-330)

   GluThrSerIleLysProCy»ValLy»LeuThrProLeuCy* GAGACAICAATAAAACCATGIGTCAAACTAACACCTTTATGT . . 300

   ValAlaHetLysCy»

   GTAGCAATGAAATGC env7 (607-660)

   ÂsnHisCysAsnThrSerValIle

   AACCATTGCAACACATCAGTCATC . 600 . · ThrGluSerCyBAsplysHisTyrTrpAsp ACAGAATCATGTGACAAGCACTATTGGGAI env8 (661-720)

   A]alleArgPheArg GCTATAACGTTTAGA • ♦

   TyrCysAlaProProGlyTyrAlaLeuLeuArÊCysAsnAspThr tactgtccaccaccgggttatgccctattaagatgtaatgatacc • · 7 00 .·.

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