JPH11242028A - Ｄ−アミノ酸からなるペプチドによる診断方法の干渉の 排除 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来の技術においてこれまで知られたものよ
り優れた、イムノアッセイにおける非特異的な相互作用
による干渉の排除を得るための新規な干渉排除物質を提
供する。 【解決手段】 本質的にD-アミノ酸からなるペプチドを
少なくとも一種含む干渉排除試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、診断方法の干渉を
排除するための本質的にD-アミノ酸からなるペプチドの
使用、本質的にD-アミノ酸からなるペプチドによる診断
方法の干渉を排除するための方法、及び本質的にD-アミ
ノ酸からなる少なくとも一種のペプチドを含む干渉を除
去する試薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】過去数年来、免疫学的検出方法は診断に
おいて非常に重要になってきている。このような方法は
生物学的サンプル中の分析対象物の検出を可能とするも
のである。このような分析対象物には、例えば、薬物、
ホルモン、タンパク質、感染物質（infectious agen
t）、微生物、及びこれらの分析対象物に対する抗体が
含まれる。このような病原体は、特に、例えば細菌、真
菌、ウイルスのような微生物による感染症を検出するた
めに直接または間接に検出される。すなわち、その感染
症に応じて、病原体を抗原試験により診断するか、ある
いはその病原体に対する免疫反応として特異的に形成さ
れた抗体を検出することを意味するものである。

【０００３】いずれの免疫学的検出反応においても、特
異的結合反応は、検出することが意図されている物質
（分析対象物）と、その分析対象物と特異的に反応す
る、または特異的に結合する少なくとも一種の特異的結
合パートナーとの間で発生する。この過程において、分
析対象物及び特異的結合パートナーは、一般に抗原と抗
体あるいは抗体の断片との複合体である特異的結合対を
形成する。この過程においては、二以上の分析対象物ま
たは二以上の結合パートナーが各反応において互いに反
応し得る。これらの特異的結合反応は種々の方法で検出
できる。一般に、特異的結合反応の結合パートナーの一
方を標識する。通常の標識は、色素源、蛍光団、化学発
光あるいは電気化学発光が可能な物質、放射性同位体、
ハプテン、酵素標識、あるいは例えばビオチン／ストレ
プトアビジンのような特異的結合対を形成し得る物質で
ある。

【０００４】イムノアッセイにおける重大な問題点は、
イムノアッセイの特異的結合パートナーとサンプル成分
との間で望ましくない相互作用や非特異的な結合反応が
生じ得る点である。このような相互作用が起こると、通
常バックグラウンドシグナルが増加し、シグナルの散乱
が強くなり、各試験の感度及び特異性が低下する。

【０００５】非特異的な相互作用によって生じた干渉の
種類により、偽陽性や偽陰性の試験結果が生じ得る。

【０００６】偽陰性の結果が生じ得るのは、検出される
べき分析対象物をマスクし、例えば抗体のような特異的
検出試薬が分析対象物に結合できないようにする物質が
サンプル中に存在している場合である。

【０００７】偽陽性の試験結果は特に重大な問題であ
る。これは、分析対象物が存在していないのに試験にお
いて陽性シグナルが得られてしまうということを意味す
る。すなわち、特に感染症の診断時に、健康で感染して
いない患者のサンプルから偽陽性の結果が試験において
得られてしまうというような状況は起きてはならない。
HIV感染の診断の場合、抗HIV抗体の検出を目的とした診
断試験の臨床的特異性については、認可当局によって9
9.5％を上回ることが要求水準として制定されている。
これは、健常者のドナー（非感染者から得られたサンプ
ル）の群において、1000個のサンプルのうち許容される
偽陽性サンプルはたった5個であることを意味してい
る。それにも関わらず発生する偽陽性反応は非特異的な
物質により引き起こされる。この非特異的物質は、試験
方法によっては、抗体の検出のために用いられる例えば
HIV抗原のような抗原に結合してしまい、そしてあたか
も検出されるべき感染物質に対する抗体のように検出系
により誤って陽性として検出されてしまう。これらの非
特異的反応物質は、多くの場合抗体である。誤った試験
結果を引き起こす、イムノアッセイにおけるこれらの非
特異的相互作用を低減するための種々の試みが既に従来
の技術において記載されてきている。すなわち、種々の
炭水化物成分及びタンパク質、タンパク質混合物、ある
種のタンパク質分画、及びその加水分解物が、イムノア
ッセイにおける分析対象物と試験成分との間の非特異的
な相互作用を低下させ得ることがかなり以前から知られ
ている（例えば、Robertsonら、J. Immunol. Meth. 26,
1985； EP-A-0 260 903； US 4,931,385を参照）。粗
タンパク質分画及び粗加水分解物を用いることの欠点
は、それに含まれる成分が試験における別の干渉を引き
起こし得ることである。さらに、酵素によって生成され
た加水分解物は、その製造のために使用されるプロテア
ーゼで汚染され得、酵素切断の制御が困難であることか
ら、品質についての均一性を欠いているのが通常であ
る。プロテアーゼ汚染物質は試験成分を分解する可能性
があり、それが微量であっても試験の機能や保管時の安
定性を損ない得る。

【０００８】イムノアッセイにおける非特異的な相互作
用を低減させるために、化学修飾タンパク質、特にスク
シニル化またはアセチル化タンパク質を使用することに
ついても記載されている（US 5,051,356； EP-A-0 525
916）。しかし、このような物質を使用しても、血清サ
ンプルの抗体試験において生ずる偽陽性結果の多くは回
避することができない。

【０００９】EP-A-0 331 068及びWO 91/06559は、例え
ば、リウマチ因子のような特定の干渉因子を低減させる
ために、重合免疫グロブリン、特にIgGを使用すること
について記載している。しかし、これは全ての干渉性の
相互作用を満足のゆく水準まで排除することはできな
い。さらにヒト抗体についての試験では、非特異的なヒ
ト免疫グロブリンの添加によりブランク値が高くなり得
る。さらにヒトまたは動物のIgGの単離は、複雑でコス
トが嵩む。

【００１０】干渉排除剤としてのアビジン及びストレプ
トアビジン及びその誘導体についてはWO 95/23801に記
載されており、この干渉排除剤は、主として不均質イム
ノアッセイにおいてストレプトアビジンまたはアビジン
固相によりサンプル成分の非特異的な相互作用を低減す
るものである。これらの干渉排除剤は、前記の固相とは
相互作用せず、通常の免疫学的試験成分に非特異的に結
合する物質による干渉を排除することはできない。

【００１１】

【発明の解決しようとする課題】この問題についての満
足ゆく解決法は、従来の技術においては記載されていな
い。従って本発明の目的は、従来の技術においてこれま
で知られたものより優れた、イムノアッセイにおける非
特異的な相互作用による干渉の排除を得るための新規な
干渉排除物質を提供することである。本発明の目的は特
に、感染症の診断において誤った試験結果を低減するこ
と、可能ならば完全に排除することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、本質的に
D-アミノ酸からなるペプチドを使用して免疫学的検出方
法における干渉を排除することにより達成される。驚く
べきことに、本発明の本質的にD-アミノ酸からなるペプ
チドの使用により、非特異的な相互作用が劇的に低減
し、従って誤った検出反応、特に偽陽性検出反応が実質
的に回避できることがわかった。

【００１３】

【発明の実施の形態】干渉を排除する薬剤として使用さ
れるペプチドの重要な特性は、天然のL-アミノ酸からな
るものでなく、本質的にD-アミノ酸からなることであ
る。この結果、対応するL-アミノ酸からなるペプチドの
対応する抗原性はない状態で、親水性、可変性及び可溶
性のような特性を正確に模倣する。すなわち、本質的に
D-アミノ酸からなるペプチドは、それらの立体配座が実
際の抗原の完全な鏡像となっていることから抗原性では
ない。抗原性は、抗原及び特異的抗体のような二以上の
免疫学的結合パートナーの相互に対する特異的結合性質
として理解される。従って、D-アミノ酸からなるペプチ
ドは、抗原結合部位、つまり検出されるべき特異的抗体
のパラトープに結合しない。従って、本発明による干渉
排除剤は、特異的検出反応を妨げることはない。

【００１４】D-アミノ酸及びL-アミノ酸は、光学活性な
（キラル）化合物についてのEmil Fischerの命名法に従
ったアミノ酸の投影式として理解される。これによれ
ば、最も酸化状態が高い末端が上にくるように炭素鎖を
縦に配置する。さらに、分子は不斉炭素原子上の置換基
が正面に向かって突出するように配置しなければならな
い。イムノアッセイにおいて、アミノ酸の立体配置の表
示法はアミノ基に関係する。即ち、左側のアミノ基はL-
立体配置、右側のアミノ基はD-立体配置を表す。しか
し、D及びLという名称は、直線偏光した光の光学回転方
向とは無関係である。アミノ酸のD型及びL型は、互いに
像と鏡像のような関係にある。タンパク質はL-アミノ酸
のみからなる。いくらかの細菌のみがD-アミノ酸をその
細胞壁に有する。

【００１５】用語「ペプチド」は、アミド結合により、
共有結合的に連結した少なくとも2個、最大100個のアミ
ノ酸からなる分子として理解される。この定義はL-アミ
ノ酸からなるペプチドと同様にD-アミノ酸からなるペプ
チドにも適用される。

【００１６】L-アミノ酸からなるペプチドは、イムノア
ッセイにおいて免疫学的結合パートナーとして用いられ
ることが多い。検出試薬として用いられるこれらのペプ
チドは、必ずそうしなければならないということはない
が、他の分子で標識することができる。このような標識
には、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンやステロイド
ホルモンのようなハプテン、酵素、色素、蛍光性標識が
含まれる。免疫学的結合パートナーとして用いられるL-
アミノ酸からなるペプチドは、イムノアッセイにおい
て、この場合は抗体であり得る分析対象物のような他の
結合パートナーに特異的に結合する。標識されたペプチ
ドを用いた場合は、分析対象物の存在は、その分析対象
物に結合したペプチドの標識によって検出できる。L-ア
ミノ酸からなるペプチドも競合物として用いることがで
きる。この場合、L-アミノ酸からなるペプチドは、例え
ば抗原−抗体複合体の免疫学的結合パートナーの一方
を、その複合体から排除する。分析対象物の濃度は、複
合体または溶液の何れかにおける標識ペプチドの量の基
づき、標準曲線との比較によって推定することができ
る。

【００１７】免疫学的結合パートナーまたは検出試薬と
して用いられるL-アミノ酸からなるペプチドの配列は、
検出されるべき分析対象物の配列か、その分析対象物に
特異的に結合する免疫学的結合パートナーの配列の何れ
かに基づくものである。これに関しては通常、定義され
たエピトープ領域が、免疫学的に認識されることが知ら
れた配列領域として選択される。ウイルスタンパク質の
免疫学的に活性な多数の抗原決定基が、特にHIV及びHCV
感染症のような感染症の分野において既に記されてい
る。HIVの最も重要な免疫学的に活性な領域には、エン
ベロープ（env）タンパク質gp41、gp120及びカプシド
（gag）タンパク質p24が含まれる。

【００１８】しかし、感染症の診断においては、その天
然の起源から精製されたか、あるいは組換えにより生成
された完全なタンパク質またはその断片を免疫学的結合
パートナーとして用いることが多い。

【００１９】本発明の干渉を排除するために用いられる
本質的にD-アミノ酸からなるペプチドのアミノ酸配列
は、L-アミノ酸からなるペプチドと同様に、分析対象物
自体、または分析対象物の検出に用いられる分析対象物
特異的結合パートナーの何れかに存在する配列に基づく
ものである。干渉を排除するために用いられるペプチド
の配列は、分析対象物上のエピトープか、特異的結合パ
ートナー上のエピトープに対応するものであることが好
ましい。

【００２０】L-ペプチドを免疫学的反応のための特異的
結合パートナーとして用いる場合には、干渉排除のため
のペプチドを選択する際に、完全にD-アミノ酸からなる
同じ長さで同じ配列のペプチドを選択するのが好まし
い。

【００２１】本発明による、本質的にD-アミノ酸からな
るペプチドの長さは、少なくとも4〜50個、好ましくは5
〜20個のD-アミノ酸の長さである。

【００２２】本発明のペプチドの本質的な特徴は、L-ア
ミノ酸からなるものではなく、本質的にD-アミノ酸から
なることである。これに関して、不斉炭素原子を有して
おらず、従ってD-立体配置でもL-立体配置でもないグリ
シンの使用も許容されることを明記する。「本質的にD-
アミノ酸からなる」という記載は、配列が分析対象物か
特異的結合パートナー上のエピトープに一致する配列を
有するペプチドがD-アミノ酸からなることを意味する。
しかし、本発明の範囲内で、このエピトープ領域が天然
のL-立体配置を有するアミノ酸で挟まれることも可能で
ある。これは、L-アミノ酸からなるスペーサ領域がエピ
トープ領域に結合している場合に必要となり得る。しか
し、スペーサとしてアルキル鎖のような他の化学基を用
いることも可能である。これらのスペーサは、干渉排除
ペプチドに他の分子を結合するために必要となることが
多い。しかし、これに関して、干渉の排除に関係するエ
ピトープがD-アミノ酸からなるということが重要であ
る。本発明によれば、隣接領域が、例えばリン脂質やリ
ポタンパク質において見られるような脂質構造、あるい
は糖鎖からなることも可能である。エピトープに隣接す
る干渉排除ペプチドの領域は、原則的には所望に応じて
修飾することができる。いかなるペプチド修飾があって
も、干渉排除効果が損なわれないということが重要であ
る。干渉を排除するために用いられるペプチド自体が、
この追加の修飾のためにイムノアッセイを干渉すること
がないようにするということにも注意しなければならな
い。

【００２３】上述した本発明によるペプチドの長さは、
D-アミノ酸からなるエピトープに関連している。干渉排
除ペプチドの全長が、隣接配列の組み込みのために上限
の50アミノ酸を超えることも十分可能である。

【００２４】本質的にD-アミノ酸からなるペプチドは、
好ましくは市販のペプチド合成機を用いた固相上での化
学合成により生成される。この合成は、当業者にはよく
知られたメリフィールド法（Merrifield method）によ
り行われるのが好ましい。この方法では、個々のアミノ
酸構築ブロックを、それが必要な場所においてD-異性体
として用いられなければならない。その他の方法の工程
は、L-アミノ酸からのペプチド合成と同一である。これ
は、合成が既知の方法、好ましくはアミノ酸誘導体（こ
の場合はD-アミノ酸誘導体）を用いてペプチドのカルボ
キシ末端から開始される合成法によって行われることを
意味する。アミノ酸誘導体としては、好ましくは結合に
必要なアミノ末端基がフルオレニルメチルオキシカルボ
ニル（Fmoc）残基で誘導化されたものが用いられる。使
用されるアミノ酸の反応性側基は、ペプチド合成の終了
後に容易に切断され得る保護基を含む。この好適な例
は、トリフェニルメチル（Trt）、t-ブチルエーテル（t
Bu）、t-ブチルエステル（OtBu）、t-ブチルオキシカル
ボニル（Boc）、あるいは2,2,5,7,8-ペンタメチルクロ
マン-6-スルホニル（Pmc）のような保護基である。

【００２５】ペプチド合成のため、天然にはL型で存在
する標準的な19のアミノ酸のD型のものを用いることが
可能である。さらに、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロ
キシリシン、3-メチルヒスチジン、ホモセリン、あるい
はオルニチンのようなアミノ酸誘導体のD型のものを用
いることも可能である。

【００２６】合成の終了及び任意に固相からペプチドを
遊離させた後、保護基は、例えば酸の添加のような当業
者に周知の方法により切断する。その後、このようにし
て得られた生成物は好ましくはHPLCにより精製する。

【００２７】このようにして合成された本発明のペプチ
ドが分子内ジスルフィド架橋を含む場合には、このジス
ルフィド架橋は、ヘキサフルオロイソプロパノール／ジ
クロロメタン中でヨウ素により固相を酸化してペプチド
を遊離する前に形成する（Seidel C., Peptides 1991,
Giralt及びAndreu編, Escom, Leiden, p. 236）。

【００２８】また、本発明の本質的にD-アミノ酸からな
るペプチドを調製するために、標準的な合成及び精製プ
ロセスを用いることができる。複雑な装置や、面倒な干
渉排除ペプチドの精製処理が不要となる。

【００２９】本質的にD-アミノ酸からなるペプチドを単
量体形態で用いることができる。これは、各ペプチドが
D-アミノ酸の形態では干渉を受けないものとなる単一の
エピトープを含むことを意味している。本発明によれ
ば、干渉を排除するために、本質的にD-アミノ酸からな
り、異なるエピトープを含む複数の異なるペプチドを用
いることができる。これは、分析対象物が数種の免疫学
的に認識できるエピトープを有する場合、あるいは異な
る複数の分析対象物が一回の試験で検出される場合に好
都合であり得る。

【００３０】また、本発明の干渉を排除するために用い
られるペプチドは、対応するエピトープを複数個有し
得、すなわち多量体であり得る。従ってこのペプチドは
ポリハプテンとして用いることができる。これは本発明
のペプチドが複数回担体に結合して、その成分が本質的
にD-アミノ酸からなるポリハプテンを生成するというこ
とを意味する。これに関して、本発明の本質的にD-アミ
ノ酸からなるペプチドを複数個担体に結合することも可
能である。ウシ血清アルブミンのような大形のタンパク
質や、ラテックス、ポリスチレン、金、またはデキスト
ランからなる粒子のような、それ自体免疫反応に関与し
ない高分子を担体とし得る。ポリハプテンは、WO 96/03
652に記載された方法に類似した方法により製造するこ
とができる。この場合、本発明のポリハプテンの生成の
ために、この特許に記載されるL-アミノ酸の代わりにD-
アミノ酸を用いる。

【００３１】驚くべきことに、本質的にD-アミノ酸から
なるペプチドが担体材料に結合されているこのようなポ
リハプテンを用いることにより、イムノアッセイにおけ
る偽陽性反応を実質的に回避できるということがわかっ
た。従って、本発明によるペプチドは、イムノアッセイ
の干渉を排除するためには、ポリハプテンの形態で用い
るのが好ましい。干渉排除効果は、エピトープ密度の増
加につれて高くなる。これは、干渉排除効果が単量体ペ
プチドからポリハプテンになるにつれて高くなることを
意味している。

【００３２】本質的にD-アミノ酸からなる本発明のペプ
チドは、イムノアッセイにおいて、干渉排除剤として試
験混合物に添加される。これにより、抗体試験のような
免疫学的試験において、非特異的な抗体と検出抗原との
反応により起こる非特異的な結合及び反応が実質的に回
避される。本発明のペプチドによる干渉排除効果につい
ては、この干渉排除ペプチドは非特異的抗体には結合す
るが、検出されるべき特定の抗体には結合しないという
説明が可能である。本質的にD-アミノ酸からなる干渉排
除ペプチドは、実際の抗原性を欠いている。これが干渉
を排除できる理由であることが間違いないことは明らか
である。干渉する非特異的抗体の「偽りの」非特異的反
応は、その抗原結合部位、つまりパラトープを介した、
検出試薬として用いられる抗原への結合の結果であると
いう可能性がある。しかし抗体のパラトープと異なる部
位も抗原と反応し得る。このように干渉排除剤でブロッ
クされた抗体は、もはや検出抗原と反応することはでき
ず、この結果、偽陽性結果が殆どなくなり、理想的には
全くなくなる。

【００３３】干渉物質のなかには固相に直接結合する特
性を有するものがある。ここで本発明の干渉排除ペプチ
ドを用いると、干渉物質の結合部位を実際に封じ、従っ
て免疫反応に干渉剤が到達しないようにすることができ
る。

【００３４】いくつかの免疫学的試験では偽陰性試験結
果も生ずる。これはサンプル中の干渉抗体が、検出すべ
き抗体にその抗原結合部位をマスクするような形で結合
することが原因であり得る。この結果、このサンプルの
抗体は、抗体試験において実際の免疫学的反応から排除
され、偽陰性結果が生ずる。このような場合、干渉排除
剤の目的は、干渉抗体、または干渉物質にそれをマスク
するような形で結合することである。偽陰性試験結果を
回避するために、本質的にD-アミノ酸からなる本発明の
ペプチドを使用することも本発明の主題である。

【００３５】本質的にD-アミノ酸からなる本発明のペプ
チドは、サンプル中に存在する干渉物質に対し過剰量で
使用するのが好ましい。本発明のペプチドの使用量につ
いての上限は、試験混合物において干渉排除剤の溶解度
が必ず保証される量という点でのみ存在する。干渉を排
除するために使用される本質的にD-アミノ酸からなるペ
プチド、または対応するポリハプテンの量や濃度は、サ
ンプル中にある干渉物質によって決まる。これは、干渉
の程度に応じて、当業者が試験手順に基づいて個別に決
定しなければならない干渉排除剤の量を加えなければな
らないということを意味している。1 nmol/l〜 1 mol/l
の範囲が適切な濃度範囲であることが判明している。

【００３６】本発明によれば、本発明のペプチドの使用
が試験の感度に影響を与えないことが好ましい。本質的
にD-アミノ酸からなる本発明のペプチドにより、原則と
して、当業者によく知られている全てのイムノアッセイ
形式での干渉を排除し、偽りの試験結果、特に偽陽性試
験結果を殆どなくすことができる。

【００３７】本発明のペプチドは、試験混合物、即ちサ
ンプルや検出試薬のなかに免疫学的に活性な結合パート
ナーが存在する限り、あらゆる試験形式で使用すること
ができる。本発明のペプチドは、不均質試験法でも均質
試験法でも用いられるが、好ましくは不均質試験法で用
いられる。

【００３８】不均質法では、分析対象物と一種以上の結
合パートナーとからなる複合体が結合する固相が常に用
いられる。この例は、EP-A-280 211に記載されるような
架橋試験形式の抗体試験法である。この場合、測定され
るべき抗体に特異的に結合し得る抗原のような第一の結
合パートナーを固相に結合する。次に測定されるべき分
析対象物−抗体を、固相結合抗原に結合させる。さら
に、分析対象物に対する別の特異的結合パートナー（抗
原）の標識したものを試験混合物内に存在させる。固相
に結合した結合パートナー、分析対象物抗体、及び標識
された結合パートナーからなる架橋が形成されたらすぐ
に固相を液相から分離し、固相または液相中の標識を検
出する。本質的にD-アミノ酸からなる本発明のペプチド
は、この形式においては、サンプル中の非特異的抗体の
ような非特異的物質がマスクされ、固相結合免疫複合体
の形成にそれ以上関与することができないようにすると
いう効果を有する。従って、特に偽陽性試験結果が実質
的に回避される。

【００３９】本発明により干渉をなくすことができる別
の試験形式は競合試験法であり、これにおいては互いに
特異的な二種の結合パートナーの固相結合複合体を形成
し、固相に直接結合しない結合パートナーを標識する。
試験手順により抗原あるいは抗体である分析対象物が、
その濃度に応じて、複合体から標識された結合パートナ
ーを排除する。液相から固相を分離した後、両相の何れ
か一方において標識を検出する。この場合においても、
本発明のペプチドは、検出試薬として用いられる結合パ
ートナーへの干渉サンプル物質の非特異的結合をブロッ
クし、偽りの試験結果を実質的に防止する。

【００４０】本発明により干渉をなくすことができる別
の試験形式は、分析対象物（この場合は抗原）が、固相
結合抗体と標識された抗体との間でサンドイッチ状に挟
まれて結合し、その固相結合抗原への結合により、分析
対象物−抗体を間接的に検出する、サンドイッチ形式の
古典的な抗原検出試験法である。この場合、標識された
別の抗体を分析対象物抗体へ結合させることによって検
出が行われる。

【００４１】例えばウイルスの抗原とウイルスのウイル
スタンパク質に対する抗体とが同時に検出される組合せ
による試験形式においても、当然本発明により干渉をな
くすことができる。

【００４２】均質試験形式の干渉の排除も考えられる。
均質試験法では、特異的結合パートナー（抗体または抗
原）は通常、分析対象物と架橋され、分析対象物の存在
下においてのみ起こるようにされる。あるいは、分析対
象物を添加して、分析対象物を抗原（分析対象物の類似
体）または抗体と競合させることにより、先に架橋され
ている抗原−抗体複合体を破壊することも可能である。
それぞれの場合において、濁度または比濁密度の変化を
分析対象物の添加の後に測定する。真の分析対象物−抗
体の代わりに提供される、ハプテンまたは抗原に架橋す
る干渉物質は、偽陽性反応を与える。この場合において
も、本質的にD-アミノ酸からなる本発明のペプチドを用
いることにより偽陽性結果を実質的に回避することがで
きる。前記の各試験形式、及び分析対象物の検出は当業
者にはよく知られたものであり、ここでこれ以上の説明
は不要であろう。

【００４３】本発明の別の主題は、干渉を排除するため
に本質的にD-アミノ酸からなるペプチドを反応混合物に
添加することを特徴とする、公知の試験形式でサンプル
中の分析対象物を検出するための免疫学的方法である。
本発明の方法では、一般に、分析対象物に対して特異的
な一種または複数の結合パートナー及び干渉を排除する
ための本発明のペプチドにサンプルを接触させる。この
方法では、特異的結合パートナーを添加する前、あるい
は添加と同時に、干渉を排除するために用いられるペプ
チドにサンプルを接触させることができる。その後、分
析対象物と特異的結合パートナーとから形成された複合
体を、分析対象物の存在の測定基準として測定する。

【００４４】分析対象物を検出するための免疫学的方法
を行うための試験形式は、上記の節にそれぞれより詳細
に例示されており、しかも当業者には一般的な技術知識
の範囲である。

【００４５】少なくとも一種の特異的結合パートナーと
特異的に反応して複合体を形成する物質、例えばハプテ
ン、抗原、抗体、核酸等はいずれも分析対象物となり得
る。

【００４６】本発明により干渉をなくしたイムノアッセ
イを行うための適切なサンプルは、当業者によく知られ
た全ての生物学的流体である。例えば、全血、血清、血
漿、尿、唾液等の体液がサンプルとして好ましく使用さ
れる。

【００４７】試験試薬が液相で存在する、いわゆる湿式
試験に加えて、分析対象物の免疫学的検出に適した一般
的な乾式の試験形式はいずれも使用することができる。
これらの乾式試験や、例えばEP-A-0 186 799に記載され
ているような試験ストリップにおいては、試験成分が担
体に塗布される。すなわち、本質的にD-アミノ酸からな
る本発明のペプチドは、免疫学的検出の前に乾式試験ス
トリップに予め塗布される。

【００４８】湿式試験においては、干渉性非特異的物質
が干渉排除剤と反応できる、すなわちそれに結合し得る
ように検出試薬として用いられる結合パートナーが添加
される前に、本発明の干渉排除剤をサンプルに予め添加
しておくのが好ましい。本発明の本質的にD-アミノ酸か
らなるペプチドを、サンプルを希釈するために用いられ
るサンプル緩衝剤に予め添加しておくのが適当であるこ
とが判った。また、本発明のペプチドを検出試薬に添加
することも好ましい。

【００４９】本発明はまた、本質的にD-アミノ酸からな
るペプチドを反応混合物に添加することを特徴とする診
断検出方法の干渉の排除方法にも関する。本発明により
干渉をなくす好適な方法には、特にウィルスを原因とす
る感染症の免疫診断的検出方法が含まれる。そのような
方法としては、特に、抗HIV抗体、HIV抗原についての試
験、結合した抗HIV/HIV抗原の試験、抗HCV抗体、HCV抗
原、結合した抗HCV/HCV抗原試験が挙げられる。

【００５０】本発明の別の主題は、本質的にD-アミノ酸
からなる少なくとも一種のペプチドを含む干渉排除試薬
である。干渉排除試薬に含まれ得る別の成分は、当業者
によく知られた緩衝剤、塩、及び界面活性剤である。干
渉排除剤は、液体、水性形態、または凍結乾燥形態に製
造することができる。

【００５１】以下の実施例により、本発明をさらに説明
する。

【００５２】

【実施例】実施例１ ペプチドに基づく干渉排除試薬(I)の製造 干渉排除試薬を製造するためのD-ペプチドを、バッチ式
ペプチド合成機ABI A413上で、フルオレニルメチルオキ
シカルボニル-(Fmoc)固相ペプチド合成法により合成し
た。このために、それぞれの場合において表１に示すア
ミノ酸誘導体１〜16（BACHEM Bioscience, Heidelber
g）の4.0等量を用いた。

【００５３】

【表１】表1 1. Fmoc-D-Val-OH 2. Fmoc-D-Ala-OH 3. Fmoc-D-Thr(-OtBu)-OH 4. Fmoc-D-Thr(-OtBu)-OH 5. Fmoc-D-Cys(Trt)-OH 6. Fmoc-D-Ile-OH 7. Fmoc-D-Leu-OH 8. Fmoc-D-Lys(-Boc)-OH 9. Fmoc-Gly-OH 10. Fmoc-D-Ser(Boc)-OH 11. Fmoc-D-Cys(Trt)-OH 12. Fmoc-Gly-OH 13. Fmoc-D-Trp(-Boc)-OH 14. Fmoc-D-Iso-OH 15. Fmoc-Gly-OH 16. Fmoc-D-Leu-OH 17. Fmoc-β-Ala-OH 18. Fmoc-ε-アミノカプロン酸 19. Fmoc-β-アラニン 20. Boc-L-Lys(-Fmoc)-OH 21. Fmoc-L-Cys(-Trt)-OH

【００５４】これらのD-アミノ酸誘導体を、N-メチルピ
ロリドンに溶解した。D-ペプチドを、充填量0.47 mmol/
gで、400 mgの4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミ
ノメチル)-フェノキシ樹脂（Tetrahedron Letters 28,
1987, p. 2107）上で合成した(JACS 95, 1973, p. 132
8)。結合反応は、それぞれの場合について、反応媒体と
してのジメチルホルムアミド中の4等量のN-ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール及びジシクロヘキシルカルボジイミ
ドを使用して20分間行った。各結合段階の後、ジメチル
ホルムアミド中の20%ピペリジンにより20分以内にFmoc
基を切断した。

【００５５】ペプチドを遊離させる前に、ヘキサフルオ
ロイソプロパノール／ジクロロメタン中のヨウ素により
固相上で酸化してジスルフィド架橋を形成した（Seidel
C.,Peptides 1991, Giralt E.及びAndreu D.編、Esco
m, Leiden P. 236）。

【００５６】ペプチドを樹脂から遊離させ、耐久性の保
護基を20 mlのトリフルオロ酢酸、0.5 mlのエタンジチ
オール、1 mlのチオアニソール、1.5 mlのフェノール、
及び1mlの水により、室温で40分以内に切断した。その
後、300氷冷ジイソプロピルエーテルを反応溶液に添加
し、40分間0℃に保って完全にペプチドを沈殿させた。
この沈殿を濾過して取り出し、ジイソプロピルエーテル
で再洗浄し、少量の50%酢酸に溶解して凍結乾燥した。
得られた粗ペプチドを、0.1%トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリル／水の勾配を用いて、RP 18カラム物質上
での分離用HPLCにより、約120分以内に精製した。溶出
した精製純材料の内容はイオンスプレー質量分析法で調
べた。

【００５７】実施例２ ポリペプチド抱合体に基づく干渉排除試薬(II)及び(II
I)の製造 HIV, gp41P2(D)-Cys(1)と命名された結合可能なD-ペプ
チドを、固相ペプチド化学法によって例えば長鎖状ωア
ルキルアミノ酸のようなスペーサ及びシステインをＮ末
端にさらに付加することにより生成し、ペプチドを樹脂
から遊離させる。この場合、表1のアミノ酸17〜21を用
いる。但し、酸化はスペーサアミノ酸及びシステインを
導入する前に行う。

【００５８】抱合体を調製するため、ウシの血清アルブ
ミンを、初めに12倍モル量のN-マレインイミドヘキサノ
イル-N-ヒドロキシスクシンイミド（MHS）と反応させ
た。この反応は、0.1 mol/lリン酸カリウム緩衝剤(pH
7.0)中で、10 mg/mlのタンパク質濃度で120分間以内で
行った。この反応物の低分子成分をゲル浸透クロマトグ
ラフィー（AcA 202-Gel, Biorad）により分離した。こ
の結果、リシン側鎖の約6個の一級アミノ基が、マレイ
ンイミド基で修飾された。

【００５９】前記D-ペプチドを、0.1 mol/lリン酸カリ
ウム緩衝剤(pH 7.0)中で、マレインイミド官能化ウシ血
清アルブミンと120分以内で反応させた。非反応ペプチ
ドの分離、並びに単量体及び重合体抱合体の分離は、Se
phacryl-S200 HR上で行った。20.8 mlの緩衝剤中での20
6 mgの活性化タンパク質の102 mgのHIV, gp41P2(D)-Cys
ペプチド(I)との典型的な反応では、27.7mgの重合体(I
I)及び76.3mgの単量体溶解タンパク質抱合体(III)が得
られる。この溶液は40倍の比率でトレハロースと混合し
て凍結乾燥する。

【００６０】実施例３ Microspot（登録商標）形式での抗HIV抗体の検出のため
のイムノアッセイの干渉の排除 Microspot（登録商標）は、一回の測定プロセスで種々
の診断パラメータを同時に測定するのに理想的な適性を
有する小形で超高感度の技術である。基礎となる技術
は、例えばUS 5,599,729に記載されている。

【００６１】ここに例として記載する試験法は、二つの
抗原が検出されるべきサンプル抗体により互いに架橋さ
れる、いわゆる架橋試験形式で行われる。抗HIV抗体（<
HIV>抗体とも称する）を測定する場合には、個々のHIV
抗原をポリスチレン担体上でいわゆるアレイに固定化す
る。個々のHIV抗原は、インクジェット法に関連した技
術により試験領域にスポットとして塗布する。この試験
手順では、サンプル緩衝剤で予め希釈された30μlのサ
ンプル（例えば血清）をピペットで試験領域に加え、振
盪しながら室温で20分間インキュベートする。サンプル
を吸引し、試験領域を洗浄用緩衝剤で洗浄した後、全て
のジゴキシゲニン標識されたHIV抗原の混合物を含む30
μlの試薬溶液1をピペットで試験領域に加え、再度振盪
しながら室温で20分間インキュベートする。固定化抗原
の配列は、試薬溶液1に存在するジゴキシゲニン標識さ
れたHIV抗原の配列に対応する。試薬溶液1を吸引し、試
験領域を洗浄用緩衝剤で洗浄した後、検出試薬を含む30
μlの試薬溶液2をピペットで試験領域に加える。蛍光色
素で染色した粒径100 nmのラテックス粒子を抗ジゴキシ
ゲニン抗体で共有結合によりコーティングしたものを検
出試薬として用いる。

【００６２】この検出試薬を振盪しながら室温で20分間
インキュベートし、その後吸引し、洗浄して吸引乾燥す
る。試験領域に波長633 nmのHe-Neレーザーを照射し、6
70 nmでの蛍光をCCDカメラで測定する。

【００６３】サンプル緩衝剤: 50 mMトリス (pH 7.6) 0.05% Tween 20 0.5% BSA 0.1% B-IgG 0.01% MIT 試薬溶液1: (Boehringer Mannheim GmbH、発注番号1650807、Enzymu
n <HCV>インキュベーション緩衝剤) 50 mMリン酸ナトリウム緩衝剤 120 mM NaCl 0.01% MIT 20% PDB

【００６４】Microspot（登録商標）<HIV>アッセイで
は、gp41抗原の二種の異なるエピトープを提示する二種
の異なるペプチドを適用する。約500の陰性サンプルの
スクリーニングでは、4つのサンプルが偽陽性として検
出された。他の全てのスポットが反応を示さなかったの
に対して、この4つのサンプルがいずれもgp41ペプチド2
抗原スポットと非特異的に反応したことが注目すべき点
であった。原料及び緩衝剤の最適化のようなあらゆる最
適化手段を講じたのにも関わらず、この特異性を改善す
ることはできなかった。D-アミノ酸から合成された同一
の配列のペプチドを加えると、4つのサンプルのうちの3
つにおいて完全な干渉の排除が達成された。最も良好な
干渉の排除は、重合干渉排除分子(II)、即ちBSA担体分
子1個につき6個のHIV, gp41P2(D)分子を含むポリハプテ
ンを用いることにより達成された（表２及び表３参
照）。

【００６５】

【表２】 表２： gp-41ペプチド2スポット上で干渉排除試薬を用いないサンプル及び試薬1緩衝剤 による結果： ──────────────────────────────────── サンプル バックグラ シグナル シグナル カットオフ ウンド* gp41-P2- gp41-P2 インデックス** （カウント） （カウント） バックグラ ウンド ──────────────────────────────────── 陰性対照 33 33 0 0.0 ──────────────────────────────────── 陽性対照 57 2642 2585 39.2 ──────────────────────────────────── 陽性サンプル１ 145 26685 26540 402.1 ──────────────────────────────────── 陽性サンプル２ 55 3158 3103 47.0 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル１ 43 980 937 14.2 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル２ 28 767 739 11.2 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル３ 35 877 842 12.8 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル４ 37 204 167 2.5 ──────────────────────────────────── 陰性サンプル 29 29 0 0.0 ────────────────────────────────────

【００６６】

【表３】 表３： gp-41ペプチド2スポット上で干渉排除試薬（サンプル緩衝剤中100μg/ml、試薬1 緩衝剤中10μg/ml）を用いた結果： ──────────────────────────────────── サンプル バックグラ シグナル シグナル カットオフ ウンド* gp41-P2- gp41-P2 インデックス** （カウント） （カウント） バックグラ ウンド ──────────────────────────────────── 陰性対照 28 28 0 0.0 ──────────────────────────────────── 陽性対照 53 2258 2205 39.4 ──────────────────────────────────── 陽性サンプル１ 115 25951 25836 461.4 ──────────────────────────────────── 陽性サンプル２ 57 2650 2593 46.3 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル１ 42 152 110 2.0 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル２ 26 26 0 0.0 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル３ 30 30 0 0.0 ──────────────────────────────────── 干渉サンプル４ 34 34 0 0.0 ────────────────────────────────────

【００６７】この結果から、4つのサンプルがMicrospot
（登録商標）<HIV>試験に強く干渉し、これらが偽陽性
結果を生ずることがわかる。本発明の干渉排除試薬をサ
ンプル及び試薬1緩衝剤に添加することにより、4つのサ
ンプルのうちの3つで確実に干渉が排除できるととも
に、4番目のサンプルの干渉シグナルは著しく低減され
る。陽性サンプルのシグナルを低下させず、あるいは最
小限に低下させるのみで、試験の感度が完全に保持され
るのは驚くべきことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨハン カール ドイツ連邦共和国 ディー−82380パイゼ ンベルグ，バート−シュラッツルセル−シ ュトラーセ ７ (72)発明者 ビータス オフェンロッヒ−ハーンル ドイツ連邦共和国 ディー−82398ポーリ ング，ジョルグ−ルッカート−シュトラー セ 17 (72)発明者 ウルスラ クラウス ドイツ連邦共和国 ディー−82380パイゼ ンベルグ，エルゲビルクシュトラーセ ８ (72)発明者 エルク ファーツ ドイツ連邦共和国 ディー−82386ハグル フィンク，スタインクレウズ １

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫診断法の干渉を排除するための、本
   質的にD-アミノ酸からなるペプチドの使用。
2. 【請求項２】 前記ペプチドがポリハプテンとして存在
   する、請求項１に記載のペプチドの使用。
3. 【請求項３】 不均質イムノアッセイの干渉を排除する
   ための、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
4. 【請求項４】 架橋試験の原理に基づくイムノアッセイ
   の干渉を排除するための、請求項３に記載のペプチドの
   使用。
5. 【請求項５】 サンドイッチ法の原理に基づくイムノア
   ッセイの干渉を排除するための、請求項３に記載のペプ
   チドの使用。
6. 【請求項６】 間接試験法の原理に基づくイムノアッセ
   イの干渉を排除するための、請求項３に記載のペプチド
   の使用。
7. 【請求項７】 競合イムノアッセイの干渉を排除するた
   めの、請求項３に記載のペプチドの使用。
8. 【請求項８】 均質イムノアッセイの干渉を排除するた
   めの、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
9. 【請求項９】 分析対象物の検出のための免疫学的方法
   であって、サンプルを請求項１に記載のペプチドと接触
   させる工程と、該サンプルを一または複数の分析対象物
   の特異的結合パートナーと接触させる工程と、該分析対
   象物および該特異的結合パートナーから形成された複合
   体を該分析対象物の存在の尺度として測定する工程とを
   含む、前記方法。
10. 【請求項１０】 診断のための検出法の干渉を排除する
    ための方法であって、本質的にD-アミノ酸からなるペプ
    チドを反応混合物に添加する、前記方法。
11. 【請求項１１】 本質的にD-アミノ酸からなるペプチド
    を少なくとも一種含む干渉排除試薬。