JP2818755B2

JP2818755B2 - 非ａ非ｂ型肝炎の診断及び検出に有効な新規分枝ハイブリッド及びクラスターペプチド

Info

Publication number: JP2818755B2
Application number: JP6508235A
Authority: JP
Inventors: ワン，チャン・イ; ホセイン，バーバラ
Original assignee: Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd
Current assignee: Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd
Priority date: 1992-09-15
Filing date: 1993-09-15
Publication date: 1998-10-30
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: JPH08500122A; FI951198A; US5582968A; AU5127693A; EP0662082A1; EP0662082A4; FI951198A0; NO950977L; WO1994006826A1; NO950977D0; CA2144435A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染を含む非Ａ
非Ｂ型肝炎（NANBH）の診断及び予防に特異的である新
規分枝ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、イ
ムノアッセイ技術を用いたNANBH患者におけるNANBH関連
抗体の検出に有効である少なくとも１個のエピトープを
含む分枝合成ペプチドに向けられるものである。本発明
は更に、ここで述べるペプチドのハイブリッドである合
成ペプチドに向けられるものである。

非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）は、輸血後肝炎の最も多い
形であり、本疾患のキャリアーであるかもしれない潜在
的な血液供与者及び他の人を同定するための高感度でか
つ特異的な診断スクリーニング法が強く要望されてき
た。したがって、血液供給系から汚染血液及び汚染血液
製品を高い信頼度をもって除去することを可能とする正
確なスクリーニング法が必要とされている。

NANBHの原因学的因子であるHCVは、いくつかのグルー
プによりクローン化され、同定されてきた［Houghton e
t al.,EP 0318216,1989年５月発表;Okamoto et al.,（1
990）Jpn.J.Exp.Med.60:167;Houghton et al.,EP 03882
32,1990年９月発表；及びKato et al.,（1990）Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 87:9524;Arima et al.,（1989a）Gast
roenterologia Japonica 24:540;Reyes et al.,（199
0）Science 247:1335;Arima et al.,（1989b）Gastroen
terologia Japonica 24:545;Maeno et al.,（1990）Nuc
leic Acids Res.18:2685］。HCVゲノムは長さ10キロベ
ース（kb）であり、構造及び非構造タンパク質へとプロ
セシングされる単一のポリタンパク質をコードする。こ
のポリタンパク質は、Ｎ末端から、構造領域のキャプシ
ド及びエンベロープタンパク質並びに非構造領域のNS−
１からNS−５タンパク質を含む。

HCVの抗原性領域のうちいくつかは同定されている
が、これらの領域由来のペプチド及び組換えタンパク質
は、NANBHキャリアーの検出及び診断においてまちまち
な感受性と選択性を示す。抗原性領域は、コア又はキャ
プシドタンパク質［Hosein et al.,（1991）Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 88:3647;UBI HCV EIA Product Insert（U
BI HCV EIA製品説明書）（1990）;Okamoto et al.,（19
90）Jap.J.Exp.Med.60:223;米国特許第5,106,726号;Tak
ahashi et al.,（1992）J.Gen.Virol.73:667;Kotwal et
al.,（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4486］；エ
ンベロープ、NS−１、NS−２及びNS−３タンパク質［Wa
ng et al.,EP 0468527,1992年１月29日発表］;NS−４タ
ンパク質［Houghton（1989）;Kuo et al.,（1989）Scie
nce 244:362;米国特許第5,106,726号］並びにNS−５タ
ンパク質［Maeno et al.,（1990）Nucleic Acids Res.1
8:2685;Wang（1992）］において報告されている。

HCV由来抗原に加えて、宿主細胞配列によりコードさ
れると考えられている他のNANBH関連抗原も存在する。G
ORエピトープとして知られているこのような抗原の一つ
は、HCVについてPCR陽性である人の血清と反応する［Mi
shiro et al.,（1990）Lancet 336:1400］。

Wang（1992）及び米国特許第5,106,726号に記載され
ているように、ある種のHCV抗原性領域内におけるエピ
トープのマッピングには、血清学的バリデーション（試
験）が用いられており、これらの文献はそれぞれ参照に
よりここに包含されるものとする。これらのマッピング
に関する研究には、良好に特徴づけられたNANBH血清パ
ネルをスクリーニングするために合成ペプチドが使用さ
れており、強力なHCV抗原の同定が可能となっている。
血清学的バリデーショ技術を用いてエピトープ分析が更
に改良された結果、HCVゲノムの別の領域由来の１個若
しくはそれ以上のエピトープを含む、長い分枝ペプチド
又はペプチド融合物内に含まれるアミノ酸残基の小さい
クラスターが、より感度の高い優れたHCV感染並びにNAN
BHキャリアーの診断及び検出法をもたらすことが発見さ
れるに至った。したがって本発明は、NANBHセロコンバ
ージョン（血清変換）の早期検出を可能とし、例えば擬
陽性を示す血清サンプルの検出が少なくなるという特異
性の改善を示す。

本発明は、NANBH及びHCV感染の診断及び検出のための
分枝合成ペプチドに関する。分枝合成ペプチドとして
は、次の式：（ペプチド）₂X （ペプチド）₄X₂X （ペプチド）₈X₄X₂X （ペプチド）₁₆X₈X₄X₂X （式中、Ｘは、アミノ酸、又は２個のアミノ基及び１個
のカルボキシル基を有し、それぞれの基がペプチド結合
連鎖を形成することが可能であるアミノ酸アナログ（類
似体）である）で示されるものがある。特に、本発明の
主題であるペプチドは、Ｘがリジンである、第１番目及
び第３番目の式で示される、リジン二量体及びリジン八
量体であり、ペプチド部分は、HCVに対する抗体と特異
的に免疫反応を示す少なくとも１個のエピトープを含
む、少なくとも１個の分枝ペプチドを有するペプチド組
成物として提供される。ペプチド部分は更に、以下の配
列：又はHCV株若しくは分離株における対応領域由来のこ
れらの配列の１つに対応する配列由来の、約３から約20
の隣接するアミノ酸の少なくとも１個のクラスターを含
む。更に又、ペプチド部分が２個又はそれ以上のクラス
ターを含む場合、クラスターは連鎖基を介して結合させ
るか、或いはクラスターがそれぞれ上記の配列の異なる
配列由来の配列を有している場合、クラスターは直接結
合させるか又は連鎖基を介して結合させることが可能で
ある。

ペプチド部分が、上記配列の異なる配列由来の配列を
含む場合、このようなペプチドはハイブリッドペプチド
と呼ばれる。ハイブリッドペプチドはクラスターを含む
ことはできるが、必ずしも含まなくてもよい。ハイブリ
ッドペプチド中のクラスターは直接又は連鎖基を介して
結合させることができる。ハイブリッドペプチドにおい
ては、いずれかの配列由来の隣接するアミノ酸の長さ
は、約60残基に及ぶことができる。

本発明の別の側面は、イムノアッセイ手順、特にELIS
A手順、又は受身血球凝集（PHA）アッセイにおいて、免
疫学的に有効な量の主題ペプチド組成物を用いて、HCV
に対する抗体の検出法又はHCV感染若しくはNANBHの診断
法を提供することである。NANBH及びHCV感染の検出及び
診断のためのイムノアッセイ及びキットも又提供され
る。

本発明によると、エピトープを広範囲に分析した結
果、NANBH及びHCV感染の検出及び診断に有用であるエピ
トープを純化し、更に定義することが可能となった。こ
の分析により、NANBH又はHCVF感染のための有効な診断
用ペプチドが、異なるペプチド由来の１個又はそれ以上
のHCVエピトープを含むペプチドのハイブリッドである
分枝した合成ペプチド（これも又ここでハイブリッドペ
プチドと呼ばれる）であることが確立された。更に又、
本発明ペプチドは、HCVに対する抗体と特異的に免疫反
応を示す少なくとも１個のエピトープを有し、そしてPe
p3、Pep8,Pep11、Pep18、Pep25、IIH、IIID、Ｖ、VIII
E、PepAと称されるペプチド又はHCVの別の株若しくは分
離株における対応領域由来の相同ペプチド由来の約３か
ら約20個の隣接するアミノ酸からなる１個若しくはそれ
以上のクラスターを含むペプチド部分を有する、分枝合
成ペプチドをも含むものである。更に、ここでクラスタ
ーペプチドと呼ばれるこれらのペプチドのペプチド部分
が２個又はそれ以上のクラスターを含む場合、これらの
クラスターは連鎖基を介して結合している。連鎖基は、
１個若しくはそれ以上の天然アミノ酸、１個若しくはそ
れ以上の非天然アミノ酸、又は１個若しくはそれ以上
の、ペプチド結合（若しくはペプチド様結合）を形成す
ることができ、ペプチド合成に用いられる条件に対して
安定であるアミノ酸アナログからなるが、これらに限定
されるわけではない。クラスターを含むハイブリッドペ
プチドの場合、クラスターは直接結合するか又は連鎖基
を介して結合することができる。

詳細なエピトープ分析を受け、主題分枝ペプチドのペ
プチド部分が誘導される元となるペプチドの配列は、上
述したとおりであり、Pep3、Pep8、Pep11、Pep18、Pep2
5、IIH、IIID、Ｖ、VIIIE及びPepAと称される配列、又
はHCVの別の株若しくは分離株における対応領域由来の
相同ペプチド、並びにそれらのアナログ及びセグメント
である。

ここで使用されている「クラスター」とは、ここに記
載するペプチド配列の１個又はそのアナログ若しくはセ
グメント由来の３から約20個の隣接するアミノ酸の配列
である。好ましい実施態様においては、クラスターは３
から９個の隣接するアミノ酸の配列である。

本発明の分枝ペプチドは、体液中のHCVに対する抗体
の検出、NANBHの診断、及び中和若しくは保護抗体を含
むHCVに対する抗体の産生を刺激するための健康な哺乳
類（特にヒト）へのワクチン接種に有用である。

主題である分枝ペプチドは、組合わせ又はセグメン
ト、つまり、非天然アミノ酸を含むアミノ酸を末端アミ
ノ酸に付加された形で有することにより、又はいずれか
の末端からアミノ酸を除去することにより、より長い又
はより短いペプチド鎖からなることができる。例えば、
KKK（Lys−Lys−Lys）配列を、ペプチドのアミノ末端に
付加することができる。同様に、Ｍ（メチオニン）残基
を、ペプチド部分のカルボキシ末端、つまりペプチド部
分と分枝構造との間に位置させることができる。

ここで使用されている「セグメント」は、NANBH関連
抗体の検出に有効なエピトープを保持している親ペプチ
ドのより短い領域を意味する。例えば、C10Aは、その親
ペプチドであるVIIIEのセグメントである。セグメント
は、その親ペプチドのいずれかの末端又はその親ペプチ
ドの内部配列から誘導することができる。

主題である分枝ペプチドは又、HCVの異なる分離株間
の株ごとの変位又はエピトープの免疫原性に影響しない
所定の配列中のそのほかの置換に適応させるために、そ
のアナログを含むこともできる。HCVはしばしば突然変
異を起こすことが示されている。PT、Ｊ、J1及びJ4など
いくつかの変異株／分離株が存在することが知られてお
り［Houghton,1989;Okamoto,1990;Houghton,1990;及びK
ato,1990］、他の変異株も又存在することが予想されて
いる。保存的置換のための調整、及び非保存的置換が含
まれる代替物からの選択は、所定の配列において行うこ
とができる。したがって、分枝合成ペプチドのアナロ
グ、特にハイブリッドペプチドは、HCVに対する抗体に
より認識されうる免疫反応性が存在する限り、多様な株
に適応させるために、上記配列の列挙されたアミノ酸の
置換、挿入及び／又は欠失を含むことができる。置換及
び挿入は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド
結合若しくはペプチド様結合を形成することのできるア
ミノ酸アナログ（例えば、ペプチドオールアナログ）に
より完成させることができる。本発明によるアナログペ
プチドは、合成し、以下に述べるようにペプチドの免疫
反応性を決定するために、HCV血清パネルに対する試験
を行う。

更に、適当なアミノ酸修飾又は置換により、HCV抗体
スクリーニングアッセイに有用な、より低いバックグラ
ウンド値又は固相へのより良好な結合能をもたらす特性
を有する、所定のアミノ酸配列に基づく各種ペプチドア
ナログを合成できることが予想されている。特に、非天
然アミノ酸を含むペプチドにより、有意にバックグラウ
ンド値を低下させることができる。

主題である分枝ペプチドは又、複合物（コンジュゲー
ト）形成に使用することができる。つまり本ペプチド
は、当業界において公知の方法により、直接又は間接的
に、ウシ血清アルブミン（BSA）、ヒト血清アルブミン
（HSA）などの担体タンパク質又は赤血球若しくはラテ
ックス粒子と結合させることができる。

ここで使用されている場合、天然アミノ酸は、タンパ
ク質中に通常見出される20種類のアミノ酸（つまりアラ
ニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、シ
ステイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒス
チジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニ
ン、チロシン、トリプトファン及びバリン）である。こ
こで使用されている天然アミノ酸は又、このようなアミ
ノ酸のＤ−体及びＬ−体を含む。

ここで使用されている「非天然アミノ酸」は、タンパ
ク質中に見出されようと、天然に見出されようと、又は
合成されたものであろうと、他のあらゆるアミノ酸のＤ
−体及びＬ−体の両方を含む。非天然アミノ酸として
は、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバ
リン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪
酸、ホモセリン、シトルリンなどが挙げられるが、これ
に限定されるわけではない。

分枝ペプチドは、式：（ペプチド）₂X （ペプチド）₄X₂X （ペプチド）₈X₄X₂X （ペプチド）₁₆X₈X₄X₂X （式中、Ｘは、アミノ酸、又は２個のアミノ基及び１個
のカルボキシル基を有し、それぞれの基がペプチド結合
連鎖を形成することが可能であるアミノ酸アナログであ
る）のいずれかにより示される。Ｘは、好ましくは、リ
ジン、又はオルニチンなどのリジンアナログである。ア
ミノ酸アナログは、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又は
ペプチド結合形成に利用することのできる２個のアミノ
基及び１個のカルボキシル基を有するその他の天然若し
くは非天然アミノ酸、のいずれかである。本発明の分枝
ペプチドは、二量体及び八量体であり、リジンから成る
分枝コア構造を有するもの、つまりＸがリジンであるも
のである。分枝二量体は特に好ましい。

分枝ペプチドのペプチド部分の長さは、約10から約10
0アミノ酸残基であることができる。ペプチド部分は、
好ましくは約17から約60アミノ酸残基を含む。更に、ハ
イブリッド及びクラスターペプチド部分は、NANBH関連
抗体の検出に有効であるエピトープを含み、本発明の優
れた感度及び選択性を保持するのに必要な最少の全体長
に最適に調節することができる。

本発明の分枝ペプチド及び好ましい分枝ペプチドを、
表１に示す。各ペプチドの由来源を表２に示す。

ａ略号：非天然アミノ酸としてノルバリンがｖ、ノル
ロイシンが１、ヒドロキシプロリンがｐ、オルニチンが
ｏで示されている以外、アミノ酸配列は、１文字の記号
で示されている。他の略号は、リジン二量体がDIM、リ
ジン八量体がOCTである。

ｂこれらのペプチドの分枝コアは、リジン残基からな
り、例えば二量体ペプチドについては１個のリジン、及
び八量体ペプチドについては７個のリジンからなる。

本発明のペプチド組成物は、１若しくはそれ以上の分
枝ハイブリッドペプチド、分枝クラスターペプチド、又
はこのようなペプチドのあらゆる組み合わせからなるこ
とができる。このような組成物は、好ましくは１から10
の分枝ペプチド、より好ましくは１から４の分枝ペプチ
ドを含む。

好ましい実施態様においては、本発明のペプチド組成
物は、分枝ペプチド（１）C3二量体、C9B二量体、C6A二
量体及び3KH二量体；（２）3K204h二量体、C4二量体、C
2B八量体；（３）C4二量体、C9B二量体、C6A二量体及び
H7二量体；又は（４）3KH7二量体、C6A二量体及びC4二
量体の混合物であることができる。主題ペプチドの混合
物を含むペプチド組成物中に存在するNANBH又はHCVの診
断又は検出用ペプチドの有効比率は、当業界における通
常の技術者により容易に決定される。代表的には、これ
らの比率は、ペプチド重量に基づき約１から約50の範囲
である。

NANBH又はHCV感染の診断及び検出のための特に好まし
いペプチド組成物は、混合物（１）、つまり分枝ペプチ
ド3KC10B二量体、C9B二量体、C6A二量体及び3KH7二量体
の重量比5:15:1:25の混合物である。

NANBH及びHCV感染の検出及び診断における主題ペプチ
ドの有効性を調べるために、HCVとの免疫反応性につい
ての数千人もの患者及び正常血清のスクリーニングによ
りあらかじめ選択した特定標本との免疫反応性につい
て、本ペプチドの試験を行った。このような血清パネル
は市販されており、その例は、実施例において記載す
る。

血清学的バリデーションの方針は、標的とするエピト
ープの予想される特性に依存する。例えば、HIV−１のg
p41トランスメンブレンペプチドなどの普遍的な免疫優
性エピトープは、このウイルスに感染していることが知
られている患者から得た単一の代表的な血清試料により
スクリーニングすることができる。感染した全ての個体
によっては認識されないエピトープ、又はそれに対する
抗体が後になって産生されるか若しくは一次的にしか産
生されないエピトープ、及び特に中和抗体を誘発するエ
ピトープは、大きな血清パネルによりスクリーニングし
なければならない。本発明においては、この両方のスク
リーニング法を、主題ペプチドを用いてHCVのエピトー
プ解析を改良するために用いることができるが、後者の
方法は、優れた選択性及び感度のため、主題ペプチドの
評価に特に有用である。

免疫反応性エピトープの同定も又、使用する血清パネ
ルに依存する。パネルが、エピトープに対して最もセロ
ポジティブ（血清陽性）であると思われる集団をより緊
密に代表するほど、エピトープが同定され、完全にマッ
ピングされる可能性が大きくなる。したがって、以前に
同定されたエピトープからなるアッセイ方法の反応性の
範囲を広げるために、感染している恐れがありながら既
知のエピトープに対してはセロネガティブ（血清陰性）
である個体より得た多数の試料を、スクリーニングに用
いなければならない。

「血清学的バリデーション」の方法は、同定されるべ
きエピトープが、感染した患者群のサブ集団においての
み抗体を誘導する場合、特に困難である。このようなエ
ピトープが同定の標的となる場合、酵素イムノアッセイ
又はその他の免疫学的試験法により試験した場合にごく
弱い反応性しか示さない合成ペプチドには、特に注意を
払わなければならない。

この点については、合成ペプチド、特に非天然アミノ
酸を有するペプチドのバックグラウンド吸光度の低さ
は、弱い反応性を正確に検出することを可能にする。あ
る場合では、バックグラウンド値に対して50mAの吸光度
は充分に有意であり、ペプチドのアミノ酸配列の連続精
製により重要なエピトープを同定することができる。良
い実験室習慣により、200〜300mA以下の吸光度の範囲に
おいて試験を行っても、一貫した信頼のおける結果を得
ることができる。

合成ペプチドを使用することの利点は知られている。
ペプチドがウイルスから生物学的に誘導されるものでは
ないために、疾患を引き起こす病原に曝される危険がな
い。ペプチドは、メリフィールド合成法［Merrifield
（1963），J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154］などの標準
的な技術を用いて、容易にすることができる。したがっ
て、試験試薬を製造する過程の間のどの時点においても
HCVとの接触はない。組換えにより発現されたタンパク
質（又はペプチド）よりもペプチドを用いることによっ
て最少にすることのできる別の問題は、HCV融合タンパ
ク質と共に精製される抗原性物質の存在により引き起こ
される擬陽性の割合である。例えば、ある正常な個体
は、組換えに基づく診断試験に使用される発現系由来の
抗原性物質と交差反応性を示すEscherichia coli又は酵
母タンパク質に対する抗体を有する。このような正常な
個体から得られた血清は、このようなイムノアッセイに
おいては擬陽性を示すが、本発明のイムノアッセイにお
いてはこのようなことはない。

更に又、本発明のペプチド組成物は、合成されたもの
であるため、その品質をコントロールすることが可能で
あり、その結果、試験結果の再現性を確実にすることが
できる。又、各試験操作には非常に少量のペプチドしか
必要とされないため、そしてペプチドを調製する費用が
比較的小さいため、HCVに対する抗体に関する体液のス
クリーニング及びNANBH感染の診断のコストが比較的低
い。

本発明により調製されるペプチド及びペプチド組成物
は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素イムノ
ドットアッセイ、受身血球凝集アッセイ（例えば、PHA
試験）又はその他のよく知られているイムノアッセイに
おいて試験試薬としてこれらを使用することにより、HC
V感染を検出し、NANBHを診断するために使用することが
できる。本発明によると、主題ペプチドと共にいかなる
好適なイムノアッセイをも使用することができる。この
ような技術は、通常の技術者にはよく知られており、多
くの標準的な免疫学のマニュアル及びテキストに記載さ
れている。例えば、Harlow et al.,（1988）「抗体：実
験室マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manua
l）」,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spr
ing Harbor,NY,726 pp.を参照されたい。好ましい実施
態様においては、イムノアッセイは、本発明のペプチド
組成物により被覆された固相を用いたELISAである。ELI
SA技術は、当業界においてはよく知られている。別の好
ましい実施態様においては、イムノアッセイはPHAアッ
セイである。

本発明のイムノアッセイは、NANBH又はHCVの有無に関
して体液及び組織をスクリーニングし、それによりこれ
らを検出し、NANBH又はHCV感染の診断において開業医を
助けるために使用される。このようなスクリーニングに
供することのできる体液としては、血液及び血液分画
（例えば血清）、唾液、又はHCVに対する抗体を含有す
るその他の体液が挙げられる。

本発明の別の側面は、哺乳類の体液（例えば血清、組
織抽出物、組織液）、in vitro細胞培養物の上清及び細
胞溶解物（ライセート）におけるNANBH又はHCV感染の検
出並びに診断のためのキットに向けられている。本キッ
トは、１個又はそれ以上の本発明のペプチド（つまりペ
プチド組成物）を含むよう適合させた第１の容器を受け
取るよう区画化することができる。

本発明のキットは、好ましくは、NANBH若しくはHCV感
染の検出又は診断のためのELISA又はPHA試験キットであ
る。ELISA試験キットとしては、本キットは、（ａ）い
ずれかの主題のペプチド組成物により被覆された固相を
有する容器（例えば96ウェルプレート）；（ｂ）陰性コ
ントロール試料；（ｃ）陽性コントロール試料；（ｄ）
標本希釈液；及び（ｅ）レポーター分子により標識され
ている、ヒトIgGに対する抗体、を含む。レポーター分
子が酵素である場合、本キットは、該酵素の基質も含
む。

本主題のキットの使用例においては、試験を行う試料
を、哺乳類の体液（必要であれば試料希釈液により希釈
したもの）と、もし抗体が存在するのであれば容器に含
まれるペプチドと結合する条件下で、ある時間接触させ
る。非結合物を除去（例えば、無菌リン酸緩衝生理食塩
水により洗浄することにより）した後、二次複合物を、
ヒトIgGに対する標識抗体と接触させる。これらの抗体
が二次複合物と結合して、三次複合物を形成する。そし
て、第２の抗体は、レポーター分子により標識されてい
るため、検出のための措置を受けると、三次複合物が検
出される。レポーター分子は、酵素、放射性同位元素、
フルオロフォア（蛍光団）、生物発光分子、化学発光分
子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどであ
ることができる。ELISAでは、レポーター分子は好まし
くは酵素である。

実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発
明の範囲を限定するために用いられるものではない。

実施例１分枝クラスターペプチドを用いた早期セロコンバージョ
ン試料におけるHCVのコア領域に対する抗体の検出 96ウェルプレートのウェルを、HCVのコア領域由来の
２個の分枝ペプチド（ペプチドC4、表1;及びVIIIEと関
連し、配列：を有する試験ペプチドT1）のそれぞれについて、pH9.5
の10mMNaHCO₃緩衝液中、１μg/mlのペプチドにより、１
ウェル当たり100μＬを用いて、37℃において１時間、
別々に被覆した。

次にペプチド被覆ウェルを、３重量％ゼラチンを含む
PBS溶液250μＬと共に、37℃で１時間インキュベートし
て非特異的タンパク質結合部位をブロッキングし、続い
て0.5容量％TWEEN20を含むPBSにより３回洗浄し、乾燥
した。HCV抗体陽性患者の血清を含む試験標本を、それ
ぞれ、20容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチン及び0.
05容量％TWEEN20を含有するPBSにより、希釈率1:20（容
量対容量）で希釈した。希釈した標本200μＬを各ウェ
ルに加えて、37℃で15分間反応させた。

次に、非結合抗体を除去するために、ウェルを、0.05
容量％TWEEN20を含むPBS溶液で６回洗浄した。ホースラ
ディッシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
ヒトIgGを第２の抗内トレーサーとして使用し、陽性ウ
ェル内で形成されたHCV抗体−ペプチド抗原複合体と結
合させた。１容量％正常ヤギ血清及び0.05容量％TWEEN2
0を含むPBSにより1:1800の比率で希釈したペルオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG希釈液100μＬを、それぞれのウ
ェルに加え、37℃で更に15分間インキュベートした。

ウェルを0.05容量％TWEEN20を含むPBS溶液で６回洗浄
して非結合抗体を除去し、0.04重量％オルトフェニレン
ジアミン（OPD）及び0.12容量％過酸化水素をpH5.0のク
エン酸ナトリウム緩衝液中に含む基質混合物100μＬと
反応させた。この基質混合物を使用して、有色生成物を
形成させることによって、ペルオキシダーゼ標識を検出
した。反応を、1.0M H₂SO₄100μＬを加えることによっ
て停止し、A₄₉₂nmを測定した。

コア領域に対する抗体の検出におけるこれら２種類の
ペプチドの感度を、最初の抗体応答がコアに対するもの
であることが知られているセロコンバージョンパネルに
より試験した（Serologicals Panel 4813,Donor 02190D
は米国特許第5,106,726号に記載されており；初期コア
応答はHosein,1991に記載されている）。比較のために
選択した採血の日付は1988年８月30日であった。ペプチ
ドC4について得られた光学密度は0.320であり、T1に関
しては0.512であった。ペプチドは両方とも、同じ濃度
で被覆した場合、そのＮ末端に３個のリジン残基を有す
る直鎖状ペプチドVIIIEよりも高い感度を示した。その
場合、同一試料についての吸光度は0.075であった。

実施例２分枝ハイブリッドペプチドは個々のペプチドと比較して
改良された感度と特異性を示す HCVのNS−４及びコア領域由来のエピトープを含む分
枝ハイブリッドペプチド3KH7（表１）の免疫反応性を、
実施例１に記載したELISAアッセイフォーマットを用い
て、41個の既知のNANBH試料を含むパネル３において試
験した。表３には、コア領域のみに由来する八量体T2
（VIIIEと関連する）及びNS−４領域のみに由来するペ
プチドT3（配列番号:11;IIHと関連する）と比較して、
このハイブリッドペプチドが、NS−４及びコアの両方の
領域の反応性を保持していたことが示されている。更に
又、試料３〜５は、単一領域ペプチドのいずれかと比較
して、ハイブリッドペプチドに対して改良された反応性
を示した。

ハイブリッドペプチド3KH7の特異性を、スクリーニン
グによりHCVに対する抗体について陰性であるとされた4
8の無作為血液供与者試料のパネルにより試験した。陰
性試料のうち、ハイブリッドペプチドに関し0.200Aを超
える吸光度を示したのは１試料のみであったが、これら
の試料の20％が、八量体T2に関して0.200Aを超える吸光
度を示した。NS−４領域由来のエピトープを含むが、コ
アエピトープを欠いた分枝クラスターペプチドC3は、48
の陰性試料中５試料で、0.200Aを超える吸光度を示し
た。したがって、ハイブリッドペプチドにおける２領域
に由来するエピトープの組み合わせによって、NANBH検
出の特異性が改善された。

ａパネル３中の残りの試料は、全ペプチドについて陰
性であるか、又は試験ペプチドと比較した場合、分枝ハ
イブリッドペプチドを用いた場合に改善を示さなかっ
た。

ｂコントロールペプチドT2及びT3の配列は、それぞ
れ、VKEPGGGQIM−八量体及びKKKSGKPAIIPDREVLYREFDEME
ECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLである。

実施例３非天然アミノ酸連鎖基を有する分枝クラスターペプチド
におけるNANBH関連抗体の検出における感度及び特異性
の比較実施例１に記載したELISAアッセイフォーマットによ
るパネル３試料を用いて、非天然アミノ酸により分離さ
れるクラスターを有するコア領域由来の分枝クラスター
ペプチドC10B（表１）の免疫反応性を、このような非天
然アミノ酸を欠いた類似ペプチドT1（実施例１）と比較
した。表４には、非天然アミノ酸を含有するペプチドの
吸光度が、非天然アミノ酸を欠いた対応ペプチドの吸光
度よりも大きい、つまり分枝ペプチドC10BがT1よりも高
感度であった７試料が示されている。これらの２種のペ
プチドの特異性は、48種の陰性試料中、0.200Aよりも大
きい吸光度測定値を示すものがなかったのと同等であっ
た。

非天然アミノ酸により分離されるクラスターを有する
HCVのNS−５領域由来の分枝クラスターペプチドC8C（表
１）の免疫反応性を、非天然アミノ酸を欠いた対応する
分枝ペプチド（C6A二量体；このペプチドは天然アミノ
酸により分離されるクラスターを有する；表１）と比較
した。いずれのペプチドも、パネル３の41試料中18試料
を陽性として検出した。表５には、非天然アミノ酸を含
有するペプチドの吸光度が、非天然アミノ酸を欠いた対
応ペプチドの吸光度よりも大きかった６試料を示す。

表６には、ペプチド3KC7C（表１）により、ペプチドC
3（表１）と比較して吸光度が増大した、つまり非天然
アミノ酸の存在により、NANBH及びHCV検出のためのアッ
セイの感度が増大した、パネル３由来の４種の反応性試
料を示す。

更に又、非天然アミノ酸により分離されたクラスター
を有するHCVのNS−４領域由来の分枝クラスターペプチ
ド3KC7Cを用いて、実施例１に記載したELISAの手順によ
り測定する場合の特異性も又、顕著に改善された。ペプ
チド3KC7Cについては、陰性である48試料中、0.200A以
上を超える吸光度を示した試料はなかったが、一方、非
天然アミノ酸を欠いているが、クラスターを分離する天
然アミノ酸を有する分枝ペプチドC3については、48試料
中５試料が0.200Aを超える吸光度を示した。ペプチドC8
Cに、非天然アミノ酸を付加することによっても特異性
が改善され、陰性である無作為供血者試料48試料中、吸
光度が0.200Aを超えたのはわずか１試料であったが、ペ
プチドC6Aについては48試料中２試料であった。

実施例４その直鎖状親ペプチドと比較してより短い分枝ペプチド
により得られたNS−５免疫反応性の改善 HCVのNS−５領域由来のC2Aという17残基分枝八量体ク
ラスターペプチド（表１）は、パネル３からの41試料
中、配列：を有する44残基ペプチドであるその直鎖状親ペプチドT4
と反応する23試料全てにおいて抗体を検出することがで
きた。表７には、直鎖状ペプチドT4よりもペプチド八量
体C2Aについてより大きい吸光度を示したパネル３から
得た５試料を示す。

実施例５分枝ペプチド混合物を用いたセロコンバージョンパネル
におけるNANBH関連抗体の早期検出二量体ペプチドである3KC10B、3KH7、C9B及びC6Aの混
合物（それぞれ１、５、３、0.25μg/ml）で96ウェルプ
レートのウェル上を被覆し、実施例１記載のELISA手順
を用いて測定を行った。各分枝ペプチドの配列を表１に
示す。この混合物の感度を、実施例１記載のセロコンバ
ージョパネル4813を用いて、フォーマットＣペプチド
（EPO 0468527 A2に記載、それぞれ５、３及び２μg/ml
で被覆されたペプチドIIH、Ｖ及びVIIIEからなる）のそ
れと比較した。表８には、セロコンバージョン試料は、
抗体がフォーマットＣにより検出される１週間前に、ペ
プチド混合物については一貫して陽性であったことが示
されている。1988年８月９日及び８月16日の採血日にお
ける初期試料は、アッセイのカットオフ付近における抗
体応答の変動を示し、1988年７月19日に行われたこの患
者の輸血からの受動抗体の検出を示している。

配列表（１）一般的情報（ｉ）出願人：ユナイテッド・バイオメディカル・イン
コーポレーテッド（ii）発明の名称：非Ａ非Ｂ型肝炎の診断及び検出に有
効な新規分枝ハイブリッド及びクラスターペプチド（iii）配列の数:12 （iv）連絡先住所：（Ａ）名宛人：ユナイテッド・バイオメディカル・イ
ンコーポレーテッド（Ｂ）街路:25 デービッズ・ドライブ（Ｃ）市：ホーポージ（Ｄ）州：ニューヨーク（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号（ZIP）:11788 （ｖ）コンピューター読取り形式：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機（Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,バージ
ョン＃1.25 （vi）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）弁理士／代理人の情報：（Ａ）氏名:M.Lisa Wilson （Ｂ）登録番号:34,045 （Ｃ）参照／ドケット番号:9055 （ix）通信の情報：（Ａ）電話:516−273−2828 （Ｂ）ファックス:516−273−1717 （Ｃ）テレックス：（２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:40アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:60アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:39アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:21アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:47アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:40アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:61アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:47アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:50アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:46アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号12:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00 G01N 33/53 - 33/98

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ペプチド3KC10B、C9B、C6A及び3KH7を含有
するNANBH又はHCV感染の検出又は診断用ペプチド組成
物。
【請求項２】イミュノアッセイにおいて、有効量の請求
項１に記載されたペプチド組成物を使用することを特徴
とする、NANBH関連抗体を検出する方法。
【請求項３】イミュノアッセイにおいて、有効量の請求
項１に記載されたペプチド組成物を、体液、組織又は組
織抽出物と、該ペプチド組成物と該体液、該組織又は該
組織抽出物中の抗体との間での複合体形成に充分な時間
接触させ、そして、該複合体を検出手段にかけることを
特徴とする、NANBH又はHCV感染を検出する方法。
【請求項４】請求項１に記載されたペプチド組成物で被
覆された固相を有する容器を含むHCV抗体検出用キッ
ト。
【請求項５】NANBH又はHCV感染の検出及び診断用のELIS
A試験キットであって、（ａ）請求項１に記載されたペプチド組成物で被覆され
た固相を有する容器、（ｂ）陰性コントロール試料、（ｃ）陽性コントロール試料、（ｄ）標本希釈剤、及び（ｅ）レポーター分子により標識されている、ヒトIgG
に対する抗体を含むことを特徴とするELISA試験キット。
【請求項６】以下のものからなる群から、選択される分
枝ペプチドを含有するNANBH又はHCV感染の検出又は診断
用ペプチド組成物。
【請求項７】以下のものからなる群から選択される、分
枝ペプチドを含有するNANBH又はHCV感染の検出又は診断
用ペプチド組成物。
【請求項８】以下のものからなる群から選択される、分
枝ペプチドを含有するNANBH又はHCV感染の検出又は診断
用ペプチド組成物。
【請求項９】以下のものからなる群から選択される、分
枝ペプチドを含有するNANBH又はHCV感染の検出又は診断
用ペプチド組成物。
【請求項１０】以下のものからなる群から選択される、
分枝ペプチドを含有するNANBH又はHCV感染の検出又は診
断用ペプチド組成物。
【請求項１１】請求項６から10のいずれか１項に記載さ
れたペプチド組成物を用いるNANBH関連抗体を検出する
ためのイミュノアッセイ方法。
【請求項１２】請求項６から10のいずれか１項に記載さ
れたペプチド組成物を入れた容器を含むNANBH又はHCV感
染の検出又は診断用キット。
【請求項１３】NANBH又はHCV感染の検出及び診断用ELIS
A試験キットであって、（ａ）請求項６から10のいずれか１項に記載のペプチド
組成物で被覆された固相を有する容器、（ｂ）陰性コントロール試料、（ｃ）陽性コントロール試料、（ｄ）標本希釈剤、及び（ｅ）レポーター分子により標識されている、ヒトIgG
に対する抗体を含むことを特徴とするELISA試験キット。