NL1002149C2 - Peptiden die werkzaam zijn bij de diagnose en detectie van infectie met Hepatitis C. - Google Patents

Description

5 PEPTIDEN DIE WERKZAAM ZIJN BIJ DE DIAGNOSE EN

DETECTIE VAN INFECTIE MET HEPATITIS C

Terrein van de uitvinding 10 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe peptiden die specifiek zijn voor de diagnose van infectie met hepatitis C virus (HCV) alsook op preparaten die mengsels van peptiden bevatten. Meer in het bijzonder is de onderhavige uitvinding gericht op synthetische 15 peptiden die ten minste één antigene plaats bevatten die werkzaam is bij het in patiënten detecteren van met HCV geassocieerde antilichamen met behulp van een immunologische bepaling, alsook op verbeterde mengsels van peptiden voor de detectie van antilichamen tegen HCV. Bovendien is 20 de uitvinding gericht op een nieuw gesplitst peptide dat bruikbaar is voor het blokkeren van de niet-specifieke reactiviteit van bepaalde conformatie-epitopen van NS-3. Werkwijzen voor het gebruik van deze peptiden en kits voor de immunologische bepaling die de peptiden bevatten, worden 25 ook verschaft.

Achtergrond van de uitvinding Non-A, non-B hepatitis (NANBH) veroorzaakt door HCV blijft de meest gewone vorm van hepatitis na transfu-3 0 sie, wat een sterke behoefte schept aan methoden voor het identificeren van mogelijke bloeddonoren en andere personen die dragers van het virus kunnen zijn en de ziekte zouden kunnen verspreiden. Er is dus een nauwkeurige aftastmethode met hoge mate van betrouwbaarheid nodig voor het verwi j -35 deren van besmet bloed en besmette bloedprodukten uit een aangelegde voorraad.

1002149.

2

De veroorzaker HCV is door meerdere groepen werkers gekloond en geïdentificeerd (Houghton c.s. in de in mei 1989 gepubliceerde octrooiaanvrage 318216, Okamoto c.s. in Japan.J.Exp.Med. 60 (1990) 167, Houghton c.s. in de in 5 september 1990 ter inzage gelegde Europese octrooiaanvrage 388232 en Kato c.s. in Proc. Natl Acad. Sci. USA 87 (1990) 95124, Arima c.s. (a) in Gastroenteroloqia Japonica 24 (1989) 540, Reyes c.s. Science 247 (1990) 1335, Arima c.s.

(b) in Gastroenteroloqia Japonica 24 (1989) 545 Maeno c.s.

10 heet Nucleic Acids Res. 18 (1990) 2685.

Het HCV genoom is ongeveer 10 kilobasen lang en codeert voor een enkel poly-eiwit dat tot structuur- en niet-structuur-eiwit verwerkt wordt. Vanaf het N-uiteinde gerekend omvat het polyeiwit het capside en de omhullings-15 eiwitten van het structuurgebied en de NS-1 tot en met NS- 5-eiwitten van het niet-structuur-gebied.

Hoewel veel van de antigene gebieden van HCV zijn geïdentificeerd, vertonen peptiden en recombinante eiwitten uit deze gebieden een variabele graad van gevoeligheid en 20 selectiviteit bij de detectie en diagnose van HCV-dragers. Er zijn antigene gebieden vermeld in elk belangrijk HCV-eiwit. Een overzicht van veel van de geïdentificeerde antigene plaatsen en sommige peptiden die bruikbaar zijn voor de detectie van HCV, wordt gegeven in Duitse octrooi -25 aanvrage 19500394.2-41, ingediend op 9 januari 1995. Onlangs zijn aanvullende peptiden en/of antigene plaatsen vermeld in het kerneiwit [kern-resten 1-84 en 9-177; Amerikaans octrooischrift 5 350 671]; en in het NS-3-eiwit [PCT/US94/07088; WO 93/09253; EP-A-0388232] . Hosein et al. 30 identificeerden een conformatie-epitoop op NS-3 bij de resten 1378-1459 [PCT/US94/07088]. [Opmerking: het numme- ringssysteem voor de aminozuren hierin heeft betrekking op het nummeringssysteem voor het poly-eiwit van HCV-1.]

Serologische analyse is gebruikt om antigene 35 plaatsen binnen bepaalde antigene gebieden van HCV in kaart te brengen, zoals beschreven door Wang (1992), Amerikaans octrooischrift 5.106.726; PCT/US93/08638; PCT/US94/07088 en 10 0? * ’ ? ~ 3

Duitse octrooiaanvrage 19500394.2-41. Bij dit in kaart brengen werden synthetische peptiden gebruikt voor het onderzoeken van goed gekarakteriseerde HCV-serum-panels en daarmee was identificatie van immunologisch sterk reactieve 5 antigene plaatsen van HCV alsook sommige voor de detectie van antilichamen tegen HCV bruikbare peptidemengsels mogelijk. Met de bepalingen waarbij deze peptiden werden gebruikt, werd bekend HCV-antilichaam-bevattend serum echter niet altijd aangetoond. Bovendien gaven dergelijke 10 bepalingen zo nu en dan vals-positieve resultaten voor de detectie van HCV-antilichaam (met als gevolg onnodige verwijdering van donorbloed uit de bloedvoorraad).

Met de onderhavige uitvinding worden veel van deze gebreken ondervangen door de identificatie van nieuwe 15 peptide-preparaten met daarin nieuwe peptiden, mengsels van peptiden en een gesplitst peptide dat niet-specifieke immunoreactiviteit blokkeert die geassocieerd is met bepaalde conformatie-epitopen op NS-3.

20 Samenvatting van de uitvinding

Deze uitvinding is gericht op een peptide-prepa-raat met daarin tenminste één vertakt of tenminste één onvertakt peptide volgens de formule:

(peptide)-Y 25 (peptide) 2X (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X (peptide) 16X8X4X2X

waarin Y een OH- of een NH2-groep aan de carbonyl-groep van 30 het C-eindstandige aminozuur van het (peptide) is en X een aminozuur of aminozuur-analogon met twee aminogroepen en één carboxyl-groep is, waarbij elke groep in staat is een peptide-binding te vormen. Volgens deze uitvinding is het peptide-gedeelte, (peptide), specifiek in staat immunolo-35 gisch te reageren met de antilichamen waarmee HCV gepaard gaat en heeft het een aminozuur-volgorde die of onder SEQ ID nr. 37 tot en met 47 (zie tabellen 1, 3, 5 en 8) gekozen too Γ ' - 4 is of één der peptiden volgens formules V-IX is, met de onder "gedetailleerde beschrijving van de uitvinding" beschreven substituties en gedegenereerde plaatsen. Voorkeursmengsels van peptiden omvatten de mengsels D en E.

5 Een ander aspect van de uitvinding is een werkwij ze voor het aantonen van antilichamen tegen HCV of voor de diagnose van een infectie met HCV door het gebruik van een immunologisch bruikzame hoeveelheid van het bedoelde peptide-preparaat in een immunologische bepaling in het 10 bijzonder in een ELISA, of anders in een passieve hemagglu-tineringsproef (PHA). Ook worden immunologische bepalingen en kits voor het aantonen en de diagnose van NANBH- en HCV-infecties verschaft.

Een volgend aspect van de uitvinding is gericht op 15 een peptide-preparaat dat een lineair "gesplitst" peptide omvat, zijn conjugaten en zijn polymeren die in immunologische HCV-bepalingen niet-specifieke reactiviteit van bepaalde conformatie-epitopen in NS-3 blokkeren, waarbij het C-eindstandige aminozuur van het peptide een -C00H- of 2 0 -CONH2-groep draagt, en het peptide een aminozuursequentie omvat die gekozen is uit de groep bestaande uit SEQ ID nr. 48-50 of een analogon van het gesplitste peptide is met een aminozuursequentie van een stam/isolaat van HCV van de overeenkomstige NS-3-gebieden van het gesplitste peptide 2 5 (tabel 8) . Evenzo kunnen de gesplitste peptiden zo worden gemodificeerd dat ze gesubstitueerde, weggelaten en gedegenereerde posities bevatten en voorkeurspeptiden met SEQ ID nr. 51 en formule X omvatten.

De gesplitste peptiden worden gebruikt ter verbe-30 tering van de specifieke prestatie van immunologische bepalingen voor de detectie van antilichamen tegen HCV of de diagnose van HCV-infectie in een patiënt door te voorzien in een eerste peptide preparaat dat één of meer peptiden of eiwitten met een conformatie-epitoop van NS-3 35 omvat, zoals de hiervoor beschreven peptide-preparaten en mengsels van peptiden; het in contact brengen van een effectieve hoeveelheid van dat eerste peptide-preparaat met 1 0 02 1 * “* 5 een serum, weefsel, weefselextract of een lichaamsvloeistof van de patiënt in de aanwezigheid van of na behandeling met een effectieve hoeveelheid van het onderhavige gesplitste peptide-preparaat gedurende een tijd die voldoende is om 5 een complex te vormen tussen het eerste peptide-preparaat en eventueel antilichaam in het serum, het weefsel, het weefselextract of de lichaamsvloeistof, en het detecteren van het complex met een detectie-inrichting. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het gesplitste peptide of peptide-10 preparaat aanwezig in het verdunningsmiddel voor het monster. Voorkeurswerkwijzen voor de immunologische bepaling met behulp van het gesplitste peptide zijn ELISA-bepalingen en passieve hemaglutinatiebepalingen (PHA). Immunologische bepalingen en kits voor de detectie en 15 diagnose van HCV-infectie met behulp van het gesplitste peptide worden ook verschaft.

Korte beschrijving van de tekeningen

Figuur 1 is een grafische weergave van de immuno-20 reactiviteit van een verdunningsreeks van menselijk mono-klonaal antilichaam (B12.F8) dat specifiek is voor HCV-kerneiwit met (a) peptiden van mengsel A (voorbeeld 5), (·) peptiden van mengsel E (voorbeeld 5) en (o) een in de handel verkrijgbare HCV-antilichaamdetectiekit (Ortho HCV 25 3.0; Ortho Diagnostic Systems, Inc.).

Figuur 2 is een grafische weergave van de immuno-reactiviteit van een verdunningsreeks van menselijk mono-klonaal antilichaam (60H9[9]D10E6) dat specifiek is voor NS-4-eiwit van HCV met (a) peptiden van mengsel A (voo-3 0 rbeeld 5) , (·) peptiden van mengsel E (voorbeeld 5) en (o) een in de handel verkrijgbare HCV-antilichaamdetectiekit (Ortho HCV 3.0).

Figuur 3 is een grafische weergave van de immuno-reactiviteit van een verdunningsreeks van menselijk mono-35 klonaal antilichaam (CM3.B6) dat specifiek is voor NS-3-eiwit van HCV met (a) peptiden van mengsel A (voorbeeld 5), (·) peptiden van mengsel E (voorbeeld 5) en (o) een in de 1002149 6 handel verkrijgbare HCV-antilichaamdetectiekit (Ortho HCV 3.0).

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding 5 Voor deze uitvinding heeft uitgebreid serologisch onderzoek geleid tot een verfijning en verdere definitie van immunoreaktieve peptiden die nuttig zijn bij het aantonen van antilichamen tegen HCV en de diagnose van een HCV-infectie. Er is gevonden dat synthetische peptiden van 10 het prototype, met in de HCV-sequentie vele vervangingen door natuurlijke en onnatuurlijke aminozuren zeer doeltreffend zijn voor het aantonen en de diagnose van een HCV-inf ectie. Evenzo kunnen deze veelvuldig gesubstitueerde peptiden gedegenereerde plaatsen met variabiliteit in de 15 sequentie hebben, wat een hoge selectiviteit en gevoeligheid voor vele HCV-stammen geeft. De bij voorkeur toegepaste peptiden volgens deze uitvinding zijn die met SEQ ID nr. 37-47 zoals in tabellen 1, 3, 5 en 8 opgesomd.

Alle peptiden van de uitvinding worden aangeduid 20 met hun respectieve sequentie-identificatienummers.

Elk van deze peptiden heeft ten opzichte van één van de vier hierna te noemen prototypesequenties een bepaald patroon van substituties, deleties en gedegenereerde plaatsen: 1002143' 7

Ala-Arg-Pro-Asp-Tyr-Asn-Pro-Pro-Leu-Val -Glu-Thr-Trp-Lys-Lys-Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Pro-Val-Val-His-Gly-Cys-Pro-Leu-Pro-Pro-Pro-Lys-Ser-Pro-Pro-Val-Pro-Pro-Pro-Arg-Lys-Lys-Arg-Thr, 5 (SEQ ID NO :1) ,

Ser-Gly-Lys-Pro-Ala-Ile-Ile-Pro-Asp-Arg-Glu-Val-Leu-Tyr-Arg-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ser-Gln-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu, IIH (SEQ ID NO:2), 10

Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-15 Pro-Arg-Gly-Arg-Arg, VIIIE (SEQ ID NO:3),

Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Gln-Thr-Ala-Ser-Arg-Gln-Ala-Glu-Val-Ile-Ala-Pro-Ala-Val-Gln-Thr-Asn-Trp-Gln-Lys-Leu-Glu-Thr-Phe-Trp-Ala-Lys-His-Met-Trp-Asn-Phe, en 20 V (SEQ ID NO :35) ,

Lys-Ala-Thr-Cys-Thr-Ala-Asn-His-Asp-Ser-Pro-Asp-Ala-Glu-Leu-Ile-Glu-Ala-Asn-Leu-Leu-Trp-Arg-Gln-Glu-Met-Gly-Gly-Asn-Ile-Thr-Arg-Val-Glu-Ser-Glu-Asn-Lys-Val-Val-Ile-Leu-Asp-Ser-Phe-Asp-Pro-Leu-Val-Ala-Glu-Glu-Asp-Glu-Arg 25 pepl2 (SEQ ID NO:36).

10 02 · - 8

In deze beschrijving wordt een plaats in een prototypesequentie waar een aminozuur door een ander vervangen is, een "gesubstitueerde plaats" genoemd. Evenzo wordt een plaats in een prototypesequentie waar een amino-5 zuur afwezig is een "weggelaten plaats" genoemd. Tenslotte wordt een plaats in een prototypesequentie waar tijdens de peptidesynthese een enkel aminozuur vervangen is door een mengsel van 2 of meer aminozuren (zoals bij de hierna beschreven peptiden- bibliotheek) een "gedegenereerde 10 plaats" genoemd.

De peptiden volgens deze uitvinding kunnen vertakt en onvertakt zijn, en de uitvinding omvat ook polymeren, conjugaten en mengsels van die peptiden.

Verder bevatten sommige peptiden gedegenereerde 15 plaatsen, deze peptiden vertegenwoordigen "bibliotheken" van peptiden, zoals in het algemeen beschreven in de op 26 oktober 1993 ingediende Amerikaanse octrooiaanvrage 143412 (de aanvrage '412; op 4 mei 1995 gepubliceerd als WO 95/11998) . ("Peptiden-bibliotheek" betreft hier ook biblio- 20 theken van gestructureerde synthetische antigenen, in de aanvrage '412 "SSAL" genoemd).

Bij peptiden-bibliotheken zijn gedegenereerde plaatsen die plaatsen van een bekende sequentie waarvan men de variabiliteit kent, tengevolge van verschillen van stam 25 tot stam in HCV-isolaten. Op gedegenereerde plaatsen kunnen dus ieder van twee of meer aminozuren zitten. De op een bepaalde plaats mogelijke aminozuren worden bepaald uit bekende sequenties en variaties die op die plaatsen optreden. De verhouding tussen de bij de peptide-synthese op een 30 bepaald moment gebruikte aminozuren kan ofwel voorgesteld worden door de frequentie waarmee bepaalde residuen in de bekende varianten optreden, ofwel door een eenvoudige equimoleculaire verdeling van de op die plaats mogelijke aminozuren. Opgemerkt moet worden dat voor deze uitvinding 35 variabiliteit niet op iedere plaats benut hoeft te worden.

10 G; 9

Zoals hier gebruikt kan een onvertakt peptide vanaf ongeveer 30 tot ongeveer 100 aminozuren hebben, bij voorkeur ongeveer 40 tot ongeveer 85.

De peptiden volgens deze uitvinding zijn nuttig 5 voor het aantonen van antilichamen tegen HCV in lichaamsvloeistoffen en voor de diagnose van een HCV-infectie.

Aan de uiteinden van de bedoelde peptiden kunnen nog enkele aminozuren toegevoegd zijn, waaronder ook onnatuurlijke aminozuren. Bijvoorbeeld kan de reeks KKK 10 (Lys-Lys-Lys) aan het amino-uiteinde van die peptiden toegevoegd zijn. Bij vertakte peptiden kan een methionine (M) aan het carboxyl-uiteinde van het peptide toegevoegd zijn, d.i. tussen het peptide-deel en de vertakking. Eveneens kunnen de peptiden aan het C-uiteinde een cysteine 15 hebben, wat het gemakkelijker maakt de thiol-groep van het cysteine een covalente binding te laten vormen met een elektrofiele groep zoals een a-chlooracetylaminozuur of een maleimide-derivaat van een lysine (aan de ot- of de e-NH2) dat aan het uiteinde van een ander peptide zit.

20 Van HCV weet men dat het heel veel mutaties heeft.

Men weet dat er meerdere varianten stammen/isolaten bestaan zoals PT, J, J1 en J4 (Hougthon 1989, Okamoto 1990, Houg-thon 1990 en Kato 1990) en verwacht mag worden dat er nog meer varianten stammen bestaan [Bukh et al. (1993) Proc. 25 Natl. Acad Sci. USA 90.:8234-8] . Aanpassingen voor conservatieve substituties tengevolge van variaties tussen de stammen kunnen in de voorgeschreven sequenties aangebracht worden mits het patroon van de vervangen, weggelaten of gedegenereerde plaatsen van een bepaald peptide gehandhaafd 30 blijft. Op die manier kunnen de peptiden volgens deze uitvinding de variatie binnen de stammen (die tussen de verschillende isolaten van HCV optreden) opvangen met veranderingen die geen invloed op de antigeniteit van de peptiden hebben.

3 5 De veranderingen die men binnen het kader van de uitvinding op het oog heeft laten de immunoreaktiviteit van de peptiden met antilichamen tegen HCV onverlet en hebben 1 0 I : - 10 geen invloed op het patroon van substituties, weglatingen of degeneraties. De veranderingen kunnen substituties, invoegingen, weglatingen en gedegenereerde substituties op ongeveer 2 tot ongeveer 5 plaatsen zijn, of anders in 5 ongeveer 10% van de plaatsen in de peptiden van tabellen 1, 3, 5 en 8. Bovendien kunnen de beoogde veranderingen van bekende HCV-stammen afgeleid zijn.

Zulke peptiden volgens deze uitvinding worden op de hierna te beschrijven wijze gesynthetiseerd en op een 10 HCV-serum uitgetest om de immunoreaktiveit van het peptide vast te stellen. De bedoelde peptiden kunnen ook gebruikt worden om er conjugaten uit te maken, d.w.z. dat de peptiden direct of indirect met in de techniek bekende methoden aan dragereiwitten zoals runderserumalbumine (BSA), mense-15 lijk serumalbumine of aan rode bloedcellen of latexdeeltjes gekoppeld kunnen worden.

Zoals hier gebruikt zijn de natuurlijke aminozuren de 20 aminozuren die men gewoonlijk in eiwitten vindt (d.i. alanine, asparaginezuur, asparagine, arginine, cysteine, 20 glycine, glutamine, glutaminezuur, histidine, isocleucine, leucine, lysine, methionine, fenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine, tryptofaan en valine). Zoals hier gebruikt omvatten de natuurlijke aminozuren ook de D- en L-vormen van zulke aminozuren.

25 Zoals hier gebruikt omvatten "onnatuurlijke aminozuren" zowel de D- als L-vormen van alle andere aminozuren, of ze nu in een eiwit of in de natuur gevonden worden of niet of dat ze synthetisch gemaakt zijn. Tot de onnatuurlijke aminozuren behoren β-alanine, ornithine, 30 norleucine, norvaline, hydroxyproline, thyroxine, γ-amino-boterzuur, homoserine, citrulline en dergelijke.

De onvertakte peptiden volgens deze uitvinding worden voorgesteld door de formule

[peptide]-Y

35 waarvan Y -OH of -NH2 is» en daartoe behoren mengsels, conjugaten en polymeren van deze onvertakte peptiden. Die 10 11 peptiden hebben ten minste één antigene plaats die specifiek immunologisch reageert met antilichamen tegen HCV.

De vertakte peptiden volgens deze uitvinding worden voorgesteld door één van de volgende formules:

5 [peptide] 2X

[peptide] 4X2X [peptide] 8X4X2X [peptide] 16X8X4X2X

waarvan X een aminozuur of aminozuur-analogon met 2 amino-10 groepen en 1 carboxylgroep is, waarbij elke groep een peptidebinding kan vormen. Bij voorkeur is X een lysine of een lysine-analogon, zoals ornithine. Het aminozuur-analogon kan een a-aminozuur, een β-aminozuur of ieder ander natuurlijk of onnatuurlijk aminozuur met twee voor het 15 vormen van peptide-bindingen beschikbare aminogroepen en één carboxylgroep zijn. Vertakte voorkeurspeptiden volgens de uitvinding zijn dimeren, tetrameren en octameren, en vooral die met een vertakte kern die lysine bevat, waarbij X dus lysine is. Vooral vertakte dimeren en octameren 20 hebben de voorkeur.

Het peptide-gedeelte van de vertakte en onvertakte peptiden kan in lengte variëren van ongeveer 3 0 tot ongeveer 100 aminozuren. Bij voorkeur hebben de peptide-gedeel-ten ongeveer 30 tot ongeveer 60 aminozuren.

25 De voorkeurspeptiden van de onderhavige uitvinding zijn die vertakte of lineaire peptiden met een sequentie van SEQ ID nr. 37-47 zoals gegeven in de tabellen 1, 3, 5 en 8 .

Een volgend aspect van deze uitvinding heeft 30 betrekking op peptide-preparaten met één of meer van de peptiden die zijn weergegeven met formule V-IX.

Peptiden met formule V zijn die welke in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 52 aminozuren van de resten 1 tot 52 van SEQ ID nr. 3 behouden, die immunolo-35 gisch reageren met antilichamen tegen de HCV-kern en die de volgende gesubstitueerde posities bevatten: 10 0 - ^ 12 positie 8: ornithine of lysine, positie 16: ornithine of lysine, positie 24: hydroxyproline, positie 29: norvaline, positie 37: hydroxyproline, positie 43: norleucine, en positie 45: norvaline 5 of leucine.

De peptiden met formule V kunnen verder één of meer van de volgende gesubstitueerde of gedegenereerde posities bevatten: positie 4: Pro:Gly in een verhouding van 9:1, 10 positie 10: Thr:Asn in een verhouding van 7:3, positie 21, norvaline, positie 30: norvaline, positie 36: valine of norleucine, positie 48: Thr:Pro in een verhouding van 9:1 en positie 52: threonine of Thr:Ala:Glu:Lys in een verhouding van 15 1:1:1:1.

Peptiden met formule VI zijn die welke in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 47 aminozuren van SEQ ID nr. 2 behouden, die immunologisch reageren met antilichamen tegen HCV NS-4 en die de volgende gesub-20 stitueerde posities bevatten: positie 1: asparagine, positie 2: glutamine, positie 3: arginine, positie 4: hydroxyproline, positie 5: serine of threonine, positie 12: norvaline of isoleucine, positie 15: ornithine, positie 25 22: aspartaat, positie 27: norvaline, positie 31: aspartaat, positie 29: asparagine, en positie 45: norvaline of valine.

De peptiden met formule VI kunnen verder één of meer van de volgende gesubstitueerde of gedegenereerde 30 posities bevatten: positie 6: I le: Val in een verhouding van 6:4, positie 7: Ile:Val:Ala in een verhouding van 6:2:2, positie 10: Arg:Lys in een verhouding van 8:2, positie 16: Glu:Ala in een verhouding van 35 8:2, positie 19: aspartaat, positie 24: Ser:Ala in een verhouding van 4:6, positie 25: Gln:Ser in een verhouding van 4:6, positie 26: His:Lys:Arg in een 10 13 verhouding van 8:1:1, positie 28: Pro:Ala in een verhouding van 8:2, positie 29: Tyr:Leu in een verhouding van 8:2, positie 30: norleucine of norvaline, positie 32: Gln:Glu in een verhouding 5 van 8:2, positie 34: Met:Gin in een verhouding van 8:2, positie 35: Met:Gln:Arg in een verhouding van 4:4:2, positie 36: Leu:Met:Ile in een verhouding van 8:1:1, positie 40: Phe:Leu in een verhouding van 8:2, positie 42: Gln:Ser in een verhouding van 10 8:2 en positie 44: Ala: lie in een verhouding van 8 :2 .

Peptiden met formule VII zijn die welke in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 44 aminozuren van SEQ ID nr. 1 behouden, die immunologisch reageren 15 met antilichamen tegen HCV NS-5 en die de volgende gesubstitueerde posities bevatten: positie 2: ornithine, positie 10: norvaline, positie 17: glutamaat, positie 23: norvaline, positie 31: hydroxyproline en positie 37: hy- 20 droxyproline.

De peptiden met formule VII kunnen verder één of meer van de volgende gedegenereerde posities bevatten: positie 8: Pro:Leu:Val in een verhouding van 8:1:1, positie 12: Thr:Ser:Pro in een verhouding 25 van 5:4:1, positie 15: Lys:Asp:Arg in een ver houding van 4:4:2, positie 19: Glu:Val:Gln in een verhouding van 5:4:1, positie 21: Pro:Ala in een verhouding van 9:1, positie 22: Val:Thr in een verhouding van 8:2, positie 24: His:Leu:Ala in een 30 verhouding van 8:1:1, positie 27: Pro:Ala in een verhouding van 8:2, positie 30: Pro:Ser in een verhouding van 9:1, positie 32: Lys:Pro:Arg in een verhouding van 8:1:1, positie 33: Ser:Ala:Lys:Gln in een verhouding van 4:4:1:1, positie 34: Pro:Thr 35 in een verhouding van 8:2, positie 36: Val:Ile:Thr in een verhouding van 5:4:1, positie 41: Lys:Arg in een verhouding van 4:6, positie 42: Lys:Arg in 1002149.

14 een verhouding van 7:3, en positie 44: Thr:Ala in een verhouding van 9:1.

Peptiden met formule VIII zijn die welke in hoofdzaak welke het skelet van de prototype-sequentie van 5 40 aminozuren van SEQ ID nr. 35 behouden, die immunologisch reageren met antilichamen tegen HCV NS-4 en die de volgende gesubstitueerde posities bevatten: positie 8: norleucine, positie 13: ornithine, positie 20: hydroxyproline, positie 28: arginine 10 en positie 35: ornithine.

Peptiden met formule IX zijn die welke in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 55 aminozuren van SEQ ID nr. 36 behouden, die immunologisch reageren met antilichamen tegen HCV NS-5 en die de volgende gesub-15 stitueerde posities bevatten: positie 8: ornithine, positie 16: norvaline, positie 24: asparagine, positie 32: ornithine, positie 40: norvaline en positie 48: norleucine.

De door formules V-IX voorgestelde peptiden kunnen 20 vertakt en onvertakt zijn en de uitvinding omvat polymeren, conjugaten en mengsels van die peptiden, in overeenstemming met die uitvoeringsvormen zoals hierin beschreven.

Zoals hier gebruikt vallen onder "antilichamen tegen HCV NS-3" antilichamen en monsters serum en plasma 25 die antilichamen bevatten, welke immunologisch met peptide nr. 4 (SEQ ID nr. 4) reageren of daarmee binden. Zoals hier gebruikt vallen onder "antilichamen tegen de HCV-kern" antilichamen en monsters serum of plasma die zulke antilichamen bevatten, welke immunologisch met peptide 3, bij-30 voorbeeld VIIIE (SEQ ID nr. 3) reageren of daarmee binden. Zoals hier gebruikt is een "antilichaam tegen HCV NS-4" een antilichaam of een monster serum of plasma dat antilichamen bevat dat/die immunologisch met peptide 2, bijvoorbeeld IIH (SEQ ID nr. 2) reageert/reageren of zich daarmee bindt/bin-35 den. Zoals hier gebruikt kan "antilichamen tegen HCV NS-5" antilichamen en ook monsters serum of plasma zijn die 1 0 : 15 antilichamen bevatten die immunologisch met peptide nr. 1 (SEQ ID nr. 1) reageren of zich daarmee binden.

De peptide-preparaten volgens deze uitvinding kunnen van de hier besproken peptiden één of meer bevatten.

5 Bij voorkeur bevatten zulke preparaten 1 tot 10 peptiden, en liever 1 tot 4 peptiden, en nog liever 1 tot 6 peptiden.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm omvatten de peptide-preparaten van de onderhavige uitvinding de peptiden 37, 38, 39, 43, 45, 46 en 47; en bij voorkeur de 10 peptiden 37, 43, 45, 46 en 47.

Bovendien kunnen de peptide-preparaten volgens deze uitvinding mengsels van peptiden bevatten. Een doeltreffende verhouding tussen de peptiden voor de diagnose van HCV en voor het aantonen van antilichamen tegen HCV in 15 de peptide-preparaten die mengsels van zulke peptiden bevatten is gemakkelijk door een normale vakman vast te stellen. Veelal lopen de gehalten aan al die peptiden dan van ongeveer 1% tot 50 gew.%.

Voorkeurspeptide-preparaten voor diagnose en 20 detectie van HCV-infectie worden gekozen uit een mengsel van peptiden dat bekend is als mengsel D, dat de peptiden 19, 33, 38, 39, 46 en 47 omvat; en mengsel E dat de peptiden 19, 37, 43, 45, 46 en 47 omvat.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm wordt mengsel E 25 als bekleding aangebracht in een gewichtsverhouding van 1,5:1:1:0,5:1:2 voor respectievelijk de peptiden 43, 46, 37, 45, 47 en 19.

De hiervoor in de "gedetailleerde beschrijving van de uitvinding" beschreven peptide-preparaten, peptiden en 30 mengsels zijn bruikbaar voor de detectie van antilichamen tegen HCV in lichaamsvloeistoffen en de diagnose van HCV-infectie.

Om de effecten van de bedoelde peptiden bij het aantonen van antilichamen tegen HCV vast te stellen worden 35 de peptiden beproefd op hun immunoreactiviteit met monsters die eerder geselecteerd waren door het afzoeken van duizenden monsters uit patiënten en normale mensen op immunoreac- 10 0? · 16 tiviteit met HCV. Zulke voor HCV specifieke serum-verzamelingen zijn in de handel verkrijgbaar en voorbeelden daarvan en methoden om daar de goede onder te kiezen worden in de voorbeelden gegeven.

5 De strategie bij het serologisch geldig maken is afhankelijk van de verwachte eigenschappen van de beoogde antigene plaatsen. Bijvoorbeeld kunnen universeel immunodo-minante plaatsen, zoals het transmembraan-peptide gp41 van HIV-1, afgetast worden met één enkel representatief serum-10 monster uit een patiënt waarvan men weet dat die met het virus geïnfecteerd is. Antigene plaatsen die door geen enkel geïnfecteerd persoon herkend worden, en die waarbij het antilichaam laat of slechts voorbijgaand gemaakt wordt, moeten met grote verzamelingen sera afgezocht worden. 15 Hoewel beide methoden van aftasten bij deze uitvinding toegepast kunnen worden om de antigene analyse voor HCV met behulp van de bedoelde peptiden ter verfijnen, is de laatstgenoemde methode bijzonder nuttig voor het beoordelen van de superieure selectiviteit en gevoeligheid van de 20 bedoelde peptiden en peptide-preparaten.

De identificatie van de antigene plaatsen is ook afhankelijk van de gebruikte verzameling van sera. Hoe nauwkeuriger die verzameling de populatie vertegenwoordigt die voor een plaats waarschijnlijk seropositief is, hoe 25 groter de kans dat de antigene plaats geïdentificeerd en grondig in kaart gebracht zal worden. Om het gevoeligheids-trajekt van een bepaling met een verzameling eerder geïdentificeerde antigene plaatsen of epitopen zo breed mogelijk te maken moet er dus een groot aantal personen met kans op 30 infectie voor het onderzoek gebruikt worden, maar seronega-tieven tegen bekende antigenen of epitopen moeten er ook bij zijn.

Het proces van het "serologisch geldig maken" is bijzonder moeilijk als de te identificeren antigene plaats 35 alleen antilichamen maakt in een subpopulatie van een geïnfecteerde groep patiënten. Als zulke antigenen doelwitten voor identificatie worden, moet er speciale aandacht 1 o - 17 geschonken worden aan synthetische peptiden die maar zwakke reactiviteit vertonen.

In dit opzicht maakt de lage achtergrondabsorptie van synthetische peptiden, vooral van peptiden met onna-5 tuurlijke aminozuren, het precies aantonen van zwakke reactiviteiten toch nog mogelijk. In sommige gevallen zijn absorpties van maar 50 mA boven de achtergrond uit van voldoende betekenis en kan dat leiden tot de identificatie van belangrijke antigene plaatsen door geleidelijk steeds 10 verdere verfijning van de aminozuur-volgorde van het peptide. Met een goede laboratoriumpraktijk kunnen blijvende en betrouwbare uitkomsten verkregen worden als men met absorpties beneden 200-300 mA werkt.

De peptiden zijn gemakkelijk te synthetiseren met 15 standaardtechnieken, zoals de synthesewerkwijze van Merri-field [Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149:21541 en de talloze beschikbare verbeteringen op die techniek, zie bijvoorbeeld Synthetic Peptides: A User's Guide. Grant, ed. (1992) W.H. Freeman & Co., New York. pp. 382; Jones (1994) 20 The Chemical Synthesis of Peptides. Clarendon Press, Oxford, pp. 230.

Een ander probleem dat minimaal gehouden kan worden door peptiden in plaats van door recombineren tot expressie gebrachte eiwitten te gebruiken, is het optreden 25 van vals-positieve uitkomsten door de aanwezigheid van samen met de HCV-recombinante eiwitten gezuiverd antigeen materiaal. Bijvoorbeeld geven bepaalde normale personen met antilichamen tegen E. coli of gisteiwitten kruisreacties met antigeen materiaal uit expressiesystemen die bij 30 diagnose op recombinatie-basis gebruikt werden. Sera van zulke normale personen kunnen in dergelijke immuunproeven vals positieve reacties geven, welke valse reactie bij immuunproeven volgens deze uitvinding niet optreedt.

Bovendien kan men de kwaliteit van de peptide-35 preparaten volgens deze uitvinding, omdat ze synthetisch gemaakt worden, in de hand houden en dientengevolge kan men van de reproduceerbaarheid van de proefuitkomsten zeker 10 0 2 1 < -v 18 zijn. Daar er ook erg kleine hoeveelheden peptide bij iedere proef nodig zijn, en doordat de kostprijs van peptiden betrekkelijk laag is, liggen de uitgaven voor het afzoeken van monsterlichaamvloeistof op antilichamen tegen 5 HCV en voor de diagnose van HCV betrekkelijk laag.

Als verder voordeel kan het gebruik van de pepti-de-bibliotheken deze onderzoeksmethode een breder werkings-pectrum tegen een groter aantal HCV-stammen verschaffen. In wezen stellen de gedegenereerde plaatsen in de peptide-10 bibliotheken een "open" diagnosemiddel voor, dat goed ingeschoten is op de voor stammen specifieke variatie (en de daaruit voortvloeiende variatie in antilichaam-specifi-citeit) ten gevolge van de vele HCV-stammen. De peptide-bibliotheken versterken dus het vermogen van de antigene 15 peptiden om met voor een grotere verscheidenheid van HCV-varianten specifieke antilichamen te reageren.

De volgens deze uitvinding te bereiden peptiden en peptide-preparaten kunnen gebruikt worden om antilichamen tegen HCV aan te tonen en de diagnose van een HCV-infectie 20 te stellen door ze als testreagens in een aan een enzym gekoppeld immunoadsorbens bepaling (ELISA) te gebruiken, of in een enzym-immunodot-bepaling, in een passieve hemagglu-tinatieproef (PHA-test), in een antilichaam-peptide-antili-chaam-sandwich proef, een peptide-antilichaam-peptide-25 sandwich proef en in andere bekende immunologische bepalingen. Volgens deze uitvinding kan iedere geschikte immunologische bepaling met de besproken peptiden uitgevoerd worden. Zulke technieken zijn voor de normale vakmensen goed bekend en zijn in vele standaard-handboeken e.d. 30 beschreven, bijvoorbeeld door Harlow c.s. in "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 726 biz.). Bij een voorkeursuitvoeringsvorm is de immunologische bepaling een ELISA met een met een hiervoor omschreven peptide-preparaat volgens 35 deze uitvinding beklede vaste fase. ELISA-technieken zijn in dit vak wel bekend. Bij een andere voorkeursuitvoeringsvorm is de immunologische bepaling een PHA-test.

10 0*' 19

De immunologische bepaling volgens deze uitvinding wordt gebruikt om lichaamsvloeistoffen en weefsels op de aanwezigheid van op HCV reactieve antilichamen te herkennen en daarmee de arts te steunen in zijn diagnose van een HCV-5 infectie. Tot de lichaamsvloeistoffen die men kan afzoeken behoren bloed en bloedfracties (bijv. plasma en serum), speeksel en alle andere vloeistoffen waarvan men vermoedt dat ze antilichamen tegen HCV bevatten.

Een ander aspect van deze uitvinding is een kit 10 voor het aantonen van antilichamen tegen HCV of voor de diagnose van een HCV-infectie in zoogdier-lichaamsvloeistoffen (bijv. serum, weefselextracten en weefselvloeistof-fen) , bovenstaande vloeistoffen van in vitro celkweken en cel-lysaten. De kit kan in vakjes verdeeld zijn zodat er 15 een eerste houder in past die één of meer peptiden volgens deze uitvinding (bijv. een peptide-preparaat) bevat.

Bij voorkeur is de kit volgens deze uitvinding een ELISA- of PHA-proefkit voor het aantonen van antilichamen tegen HCV en daardoor voor de diagnose van een HCV-infec-20 tie. Voor een ELISA bevat de kit (a) een houder (bijv. een plaat met 96 putjes) waarvan de vaste fase met één der bedoelde peptide-preparaten bekleed is, (b) een negatief controlemonster (c) een positief controlemonster, (d) passend verdunningsmiddel en (e) antilichamen tegen mense-25 lijke IgG die met een signalerend molecuul gemerkt zijn.

Als het signalerend molecuul een enzym is dan bevat de kit ook een substraat voor dat enzym.

Bij een voorbeeld van het gebruik van die kit wordt een te onderzoeken monster in contact gebracht met 3 0 een zoogdier-lichaamsvloeistof, dat zo nodig verdund is, lang genoeg en onder omstandigheden waarbij de eventuele aanwezige antilichamen zich in de houder met het peptide binden. Na verwijdering van niet gebonden materiaal (bijv. door uitwassen met steriele met fosfaat gebufferde zoutop-35 lossing) wordt het secundaire complex met de gemerkte antilichamen tegen menselijke IgG in contact gebracht. Deze antilichamen binden zich aan het secundaire complex en 10 r' 20 geven daarmee een tertiair complex, en daar de tweede antilichamen met een signalerend molecuul gemerkt zijn, wordt het tertiaire complex bij blootstellen aan een of ander detectiemiddel herkend. Het signalerende molecuul kan 5 een enzym, een radioisotoop, een fluorofoor, een biolumi-nescerend molecuul, een chemiluminescerend molecuul, biotine, avidine, streptavidine of iets dergelijks zijn. Voor een ELISA is het signalerende molecuul bij voorkeur een enzym.

10 Een ander aspect van deze uitvinding heeft betrek king op een peptide-preparaat dat een gesplitst peptide omvat dat niet-specifieke immunoreactiviteit van bepaalde conformatie-epitopen van NS-3 in immunologische HCV-bepa-lingen blokkeert. In het algemeen zijn de gesplitste 15 peptiden oplosbaar in waterige buffer.

Als lineair peptide bestaat het peptide uit een aminozuursequentie die wordt gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID nr. 48-50 (tabel 8) of een aminozuursequentie van een stam/isolaat van HCV van overeenkomstige 20 NS-3-gebieden van één van deze peptiden. Deze groep peptiden wordt aangeduid als "gesplitst", omdat elk peptide een grote interne deletie bevat in het NS-3-gebied. De peptiden bevatten daarom een deletie van aminozuren 33 tot 57 van SEQ ID nr. 4. Omdat de resten 31-32 en 58-59 hetzelfde zijn 25 (Val-Ala), komen deze resten alleen voor bij de splitsings-verbinding. Een gesplitst voorkeurspeptide van de uitvinding is het peptide met SEQ ID nr. 48.

Met serologische analyse van dit gebied is aangetoond dat dit gesplitste peptide meerdere substituties van 30 natuurlijke en onnatuurlijke aminozuren kan bevatten in de prototype-sequent ie van HCV en toch zeer effectief kan blijven in het blokkeren van niet-specifiek reactiviteit van het conformatie-epitoop van NS-3. Derhalve kunnen de gesplitste peptiden het hieronder gegeven specifieke 35 patroon van substituties, deleties of gedegenereerde posities ten opzichte van de prototype-sequentie hebben: 10 0 ? i *? 21

Lys-Lys-Lys-Cys-Asp-Glu-Leu-Ala-Ala-Lys-Leu-Val-Ala-Thr-Asp-Ala-Leu-Met-Thr-Gly-Tyr-Thr-Gly-Asp-Phe-Asp-Ser-Val -Ile-Asp-Cys-Asn-Thr-Cys-Val, (SEQ ID NO :48)

Derhalve kan het gesplitste peptide worden weerge-5 geven met formule X. Peptiden met formule X zijn die peptiden die de niet-specifieke reactiviteit van conforma-tie-epitopen van NS-3 in immunologische HCV-bepalingen blokkeren, die in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 35 aminozuren van SEQ ID nr. 48 behouden, en 10 die de volgende gesubstitueerde posities bevatten: positie 7: norleucine, positie 17: norleucine, positie 24: glutamaat, en positie 28: norvaline.

In een voorkeursuitvoeringsvorm is het gesplitste peptide het peptide met SEQ ID nr. 51.

15 Het prototype, analoga daarvan, of gemodificeerde

gesplitste peptiden kunnen worden geconjugeerd aan een drager of worden gepolymeriseerd zoals hiervoor beschreven. Wanneer het peptide wordt gepolymeriseerd in een vertakte vorm kan het worden weergegeven met de formule 20 (peptide)2X

(peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X (peptide) 16X8X4X2X

waarin X een aminozuur of een aminozuuranalogon is met 2 25 aminogroepen en 1 carboxylgroep, waarbij elke groep in staat is een peptidebinding te vormen.

Het lineaire deel van de geslitste peptiden (gemodificeerd of ongemodificeerd) varieert in lengte zoals hiervoor beschreven voor de andere peptiden van de uitvin-30 ding. Bij voorkeur hebben de gesplitste peptiden een lengte van ongeveer 30 tot ongeveer 50 aminozuren. Evenzo kunnen aminozuren worden toegevoegd aan elk uiteinde van de gesplitste peptiden zoals hiervoor beschreven (bijvoorbeeld KKK aan het amino-uiteinde of M aan het carboxyluiteinde). 35 Variaties van stam tot stam kunnen ook worden omvat zoals hiervoor beschreven.

10 0?.

22

De gesplitste peptiden (met inbegrip van het prototype, zijn analogs of een gemodificeerd peptide) worden gebruikt in een werkwijze voor het bij een patiënt detecteren van antilichamen tegen HCV of de diagnose van 5 HCV-infectie, waarbij men (i) een eerste peptide-preparaat verschaft dat één of meer peptiden of eiwitten met een conformatie-epitoop van NS-3 omvat; (ii) een effectieve hoeveelheid van dat eerste peptide-preparaat in contact brengt met een serum, weefsel, weefselextract of een 10 lichaamsvloeistof van de patiënt in de aanwezigheid van, of na voorbehandeling met, een effectieve hoeveelheid van het bedoelde gesplitste peptide-preparaat in een immunologische bepalingswerkwijze gedurende een tijd die voldoende is om een complex te vormen tussen dat eerste peptide-preparaat 15 en eventueel antilichaam in het serum, het weefsel, het weefselextract of de vloeistof, (iii) en het complex detecteert met een detectie-inrichting. Bij voorkeur is de immunologische bepalingswerkwijze een ELISA-bepaling, een sandwich-bepaling of een PHA-bepaling.

20 Het gesplitste peptide-preparaat kan goed worden verschaft in het verdunningsmiddel voor het monster en wordt gebruikt in een concentratiebereik van 5-100 μg/ml, en bij voorkeur in een concentratie van ongeveer 50 μg/ml. De concentratie gesplitst peptide die geschikt is voor een 25 bepaalde bepalingsopzet kan gemakkelijk worden bepaald door titratie van de hoeveelheid gesplitst peptide in het verdunningsmiddel voor het monster ter bepaling van de hoeveelheid peptide die nodig is voor het verwijderen van de niet-specifieke extinctie, dat wil zeggen de hoeveelheid 30 peptide waarboven geen verdere toename van het percentage remming wordt waargenomen. De tijd die nodig is voor de reactie van het eerste peptide-preparaat met eventuele HCV-antilichamen in het monster, is goed bekend in de techniek of kan gemakkelijk worden verkregen door bepaling van de 35 tijd die nodig is om de reactie volledig te laten verlopen. De aanwezigheid van het gesplitste peptide in het verdunningsmiddel voor het monster of de voorbehandeling van het i o -: 23 monster met een gesplitst peptide-preparaat heeft geen belangrijke invloed op de reactietijd.

Voor deze uitvinding omvat het eerste peptide-preparaat een peptide met een conformatie-epitoop van NS-3, 5 waarbij het peptide wordt gekozen uit de groep die bestaat uit (i) peptide 4 (SEQ ID nr.4); (ii) een analoog peptide met een aminozuursequen-tie van een stam/isolaat van HCV in een gebied dat overeen- 10 komt met peptide 4,- (iii) een lineair peptide waarbij het C-eindstan-dige aminozuur van dat peptide een carbonzuur of een carbonzuuramide is, waarbij het peptide specifiek immunologisch reageert met antilichamen tegen hepatitis C virus 15 (HCV), en waarbij het peptide in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 81 aminozuren van SEQ ID nr. 4 behoudt, dat immunologisch reageert met antilichamen tegen HCV NS-3 en dat de volgende gesubstitueerde of gedegenereerde posities bevat: 20 positie 3: norvaline, positie 7: norvaline of

Val:Ala:Thr:Phe:Tyr:Nvl in een verhouding van 3:3:1:1:1:1, positie 8: valine of norvaline, positie 16: norvaline, positie 20: arginine, positie 26: norleucine, positie 33: norleucine, 25 positie 39: serine, positie 46: norvaline, positie 52: alunine, positie 60: serine, positie 63: norleucine, positie 68: serine, en positie 74: norvaline; en (iv) één van de peptiden 5-21 (SEQ ID nr. 5-21) 30 zoals getoond in tabel 13. Elk van deze peptiden kan worden geconjugeerd aan een drager of worden gepolymeriseerd. Wanneer het peptide wordt gepolymeriseerd, wordt het weergegeven met de formule:

(peptide) 2X

35 (peptide) 4X2X

(peptide) 8X4X2X (peptide) 16X8X4X2X

i r 24 waarin X een aminozuur of een aminozuur analogon is met 2 aminogroepen en 1 carboxylgroep, waarbij elke groep in staat is tot het vormen van een peptidebinding. Tenslotte kan het eerste peptide-preparaat mengsel A, mengsel B, 5 mengsel C, mengsel D of mengsel E zijn. De samenstelling van de mengsels A en B wordt gegeven in voorbeeld 5. De samenstelling van mengsel C bevat de peptiden 19, 25, 28 en 33 .

Een volgend aspect van de uitvinding voorziet in 10 een kit voor de detectie van antilichamen tegen HCV of diagnose van HCV-infectie, die in een eerste houder bevat die het peptide-preparaat met een conformatie-epitoop van NS-3 bevat en een tweede houder die verdunningsmiddel voor het monster bevat dat het gesplitste peptide-preparaat van 15 de uitvinding omvat. Bij voorkeur is de kit een ELISA- testkit, een kit voor sandwich-bepaling of een kit voor de PHA-bepaling. Bovendien omvat de uitvinding een ELISA- testkit voor de detectie van antilichamen tegen HCV of de diagnose van HCV-infectie, die omvat (a) een vaste fase die 20 is bekleed met een eerste peptide-preparaat, zijnde één van de in de voorgaande alinea beschreven peptide-preparaten; en (b) monsterverdunningsmiddel dat één van de bedoelde gesplitste peptide-preparaten omvat. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het eerste peptide-preparaat mengsel E en 25 is het gesplitste peptide-preparaat ofwel peptide 48 ofwel 51. In een volgende uitvoeringsvorm bevat de kit ook (c) een negatief controlemonster; (d) een positief contro- lemonster; en (e) antilichamen tegen menselijk IgG, welke antilichamen zijn gemerkt met een signalerend molecuul. De 30 kits worden gebruikt zoals hiervoor is beschreven voor kits met monsterverdunningsmiddel dat geen gesplitst peptide bevat.

De voorbeelden dienen ter toelichting van de onderhavige uitvinding en dienen niet te worden opgevat als 35 beperking van de beschermingsomvang van de uitvinding.

10 0-·: 25

Voorbeeld 1 ELISA - methode

De putjes van een plaat met 96 putjes werden 5 afzonderlijk 1 uur bij 37°C met peptide bekleed, waarvoor men - tenzij anders aangegeven - 100 mM NaHC03-buffer (pH 9,5) met 5 μg/ml peptide gebruikt.

De met peptide beklede putjes werden 1 uur met 250 μΐ 3% gelatine-oplossing in PBS op 37°C gehouden om de 10 niet-specifieke binding van eiwitten te blokkeren, gevolgd door het drie maal uitwassen met PBS dat 0,05 vol.% TWEEN 20 bevatte en gedroogd. De proefmonsters serum van een voor HCV positieve patiënt werden 1:20 verdund met PBS dat 20 vol.% normaal geiteserum, 1 gew.% gelatine en 0,05 vol.% 15 TWEEN 20 bevatte. Van elk verdund monster werd 100 μΐ in de putjes gebracht en dat liet men 30 minuten bij 37°C reageren .

De putjes werden toen zes maal met 0,05 vol.% TWEEN 20 in PBS uitgewassen om niet-gebonden antilichamen 20 te verwijderen. Met mierikswortel-peroxidase geconjugeerd geite-antihumaan IgG werd gebruikt als tweede antilichaam om met het in de positieve putjes gevormde complex van HCV-antigeen met peptide-antigeen te binden. In ieder putje werd 100 μΐ 1:1800 met 1 vol.% normaal geiteserum verdunde, 25 met mierikswortel-peroxidase gemerkt geite-anti-humaan IgG gebracht, er werd in ieder putje 0,05 vol.% TWEEN 20 in PBS toegevoegd en er werd nog 15 minuten bij 37°C geïncubeerd

Om niet gebonden antilichamen te verwijderen, werden de putjes zes maal uitgewassen met 0,05 vol.% TWEEN 30 20 in PBS, waarna men ze liet reageren met 100 μΐ sub- straatmengsel dat 0,04 gew.% o-fenyleendiamine (OPD) en 0,12 vol.% waterstofperoxide en natriumcitraat-buffer (pH 5,0) bevatte. Dit substraatmengsel werd gebruikt om door vorming van een gekleurd produkt het peroxidase-merk aan te 35 tonen. De reactie werd gestopt door het toevoegen van 100 μΐ 1,0M H2S04 en de extinctie bij 492 nm werd gemeten.

10 0 2 26

Voorbeeld 2

Immunoreactiviteit van met het kerneiwit reactieve peptiden

De immunoreactiviteit van de peptiden 26 en 37 5 (tabel 1) werd bepaald met een groep bekende HCV-serummon-sters uit de HCV-panels 2 en 3 en een seroconversiemonster (serol 1-5) , die elk antilichamen tegen 'iet kerneiwit bevatten, in de in voorbeeld 1 beschreven ELISA-bepalings-opzet, waarbij bekleding met peptide werd uitgevoerd bij 10 een concentratie van 1 μg/ml. De in tabel 2 getoonde resultaten geven aan dat peptide 37 sterker reageert met antilichamen tegen het HCV-kerneiwit dan peptide 26.

Voorbeeld 3 15 Immunoreactiviteit van met NS-4 reactieve peptiden

In Amerikaans octrooischrift 5.106.726 (zie tabel 5 daarin) werd een zeldzaam serummonster (NAB-2-2) vermeld dat preferentieel reageerde met de 5 amino-eindstandige 20 resten van peptide 2 (SGKPA). Terwijl deze sequentie een deel is van een epitoop dat belangrijk is voor het detecteren van monsters met NS-4-reactiviteit, vertoonde peptide 39 (tabel 3), dat de sequentie SGKPT bevat, niet-specifieke immunoreactiviteit, waardoor 5 vals-positieve monsters 25 konden worden geïdentificeerd onder 1000 willekeurige bloeddonormonsters (tabel 4).

Waargenomen werd dat de sequentie SGKPT homoloog is met de sterk geconserveerde A-plaats in helicasen [Gorbalenya et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:4713-4730]. 30 Het HCV-helicase in het NS-3-gebied heeft de sequentie SGKST, waarbij de aminozuren G en K onveranderlijk zijn onder HCV-stammen.

Derhalve werden verscheidene peptiden gesynthetiseerd (peptiden 42-44; tabel 3) en geanalyseerd op immuno-35 reactiviteit met echte HCV-positieve monsters alsook op het ontbreken van niet-specifieke immunoreactiviteit met de met peptide 39 geïdentificeerde vals-positieve monsters.

10 02 1 4?.

27

Volledige deletie van deze vijf resten (peptide 44) deed de niet-specifieke kruisreactiviteit in de vals-positieve monsters verdwijnen, maar verminderde ook de reactiviteit met het bekende HCV-positieve monster (tabel 4). Modifica-5 tie van de vijf resten (peptiden 42 en 43, beide met een amino-eindstandige sequentie van NQRpS) leidde tot peptiden die immunoreactiviteit met de vals-positieve monsters misten, maar een sterke immunoreactiviteit hadden met het bekende HCV-positieve monster NAB-2-2 (tabel 4).

10

Voorbeeld 4

Immunoreactiviteit van met NS-5 reactieve peptiden

De immunoreactiviteit van een met NS-5 reactief 15 peptide (peptide 45; tabel 5) werd bepaald op een panel van bekende HCV-sera uit HCV-panel 3 in de ELISA-bepalingsopzet zoals beschreven in voorbeeld 1, behalve dat bekleding met de peptiden geschiedde in een concentratie van 2 μg/ml. De resultaten geven aan dat peptide 45 een immunoreactiviteit 20 vertoonde die vergelijkbaar was met peptide 33 (tabel 6).

Voorbeeld 5

Aantonen van antilichamen tegen HCV met mengsels van peptiden 25 Bekleed werd met Mengsel A dat 2, 2, 0,5 en 8 μg/ml van Peptiden 25, 29, 33 en 19 bevatte (dat laatste aan BSA geconjugeerd), en dat werd vergeleken met Mengsel B dat 2, 2, 0,5 en 8 μg/ml van Peptiden 25, octameer van 27, 33 en 19 bevatte (dat laatste aan BSA geconjugeerd) . De 30 vergelijking gebeurde met in voorbeeld 1 beschreven ELISA.

Peptide 19 was, onder toepassing van de aanbevelingen van de leverancier (Pierce Chemical Co.) of die van Kitagawa c.s. (J. Biochem., 79 (1976) 233-236), met behulp van N-(m-maleïmidobenzoyloxy)succinimide (MBS) met BSA 35 geconjugeerd.

Om de gevoeligheid en specificiteit van mengsels A en B te vinden, werden de mengsels bepaald met een speciaal 1 0 0 ? 1 6 28 uitgezóchte serumverzameling die leden had met specifieke immunoreactiviteiten voor het HCV-kerneiwit, voor NS-3, voor NS-4 en voor NS-5. Die verzameling was aangemaakt door sera tegen Peptiden VIIIE (SEQ ID nr.3) te beproeven om 5 daarin kerneiwit-specifieke sera te vinden, tegen Peptide IIH (SEQ ID nr.2) om daarin voor NS-4 specifiek serum in te vinden, tegen Pepll (Wang, 1992), om daarin voor NS-5 specifiek serum te vinden en tegen Peptide 4 (SEQ ID nr.4) om daarin voor NS-3 specifiek serum te vinden. De aldus 10 geïdentificeerde sera werden dan met normaal menselijk serum verdund om de zwakke tot matige reactiviteit met de genoemde peptiden tot uiting te laten komen (men vond extincties bij 492 nm van 0,3 tot 2,0) . De verdunde monsters vormden dan de verzameling met speciale gevoeligheid 15 (tabel 7) die gebruikt werd voor het bepalen van mengsels A en B.

De mengsels A en B hadden een vergelijkbare gevoeligheid (tabel 7, bovenste paneel).

Mengsel D bevatte peptiden 19, 33, 38, 39, 46 en 20 47, waarbij peptide 19 was geconjugeerd aan BSA. Peptiden 39, 46, 38, 33 en 47 werden als bekleding aangebracht op ELISA-platen in een gewichtsverhouding van respectievelijk 1,5:1:1:0,5:1 ^g/ml), gedurende 16 uur bij kamertempera tuur zoals beschreven in voorbeeld 1. De peptide-bekle-25 dingsoplossing werd uit de putjes gezogen en vervangen door 100 μΐ peptide 19-BSA-conjugaat in een concentratie van 2,0 μg/ml in met fosfaat gebufferde zoutoplossing met pH 7,2, gedurende 1 uur bij 37°C. Bepalingen met mengsel D werden uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld 1.

3 0 Mengsel E bevatte peptiden 19, 37, 45, 46 en 47.

Mengsel E werd als bekleding aangebracht op ELISA-platen op dezelfde wijze als mengsel D met de peptiden 43, 46, 37, 45 en 47 in een gewichtsverhouding van respectievelijk 1,5:1:1:0,5:1 (μς/τηΐ) . Bepalingen met mengsel E werden 35 uitgevoerd met 25 μg/ml peptide 51 in het monsterverdun-ningsmiddel.

10 0 29

De mengsels D en E werden getest op hetzelfde panel als de mengsels A en B. De resultaten in tabel 7, onderste paneel, geven aan dat de mengsels D en E een algehele detectiegevoeligheid hadden die vergelijkbaar was 5 met de mengsels A en B. Bij twee monsters, kern-2 en kern-3, lieten de mengsels D en E een hogere gevoeligheid voor deze antilichamen zien dan de mengsels A en B.

Voorbeeld 6 10 Peptidemengsels

Mengsel A (voorbeeld 5) en mengsel E (voorbeeld 5) werden beproefd op gevoeligheid met een serie verdunningen van monoklonale menselijke antilichamen, die specifiek 15 waren voor a) het kerneiwit van HCV, B12.F8 [Cerino (1993) J. Immunol. 151:7005-151. b) het eiwit NS-4 van HCV, 60H9[9]D10E6 [Cerino (1991) J. Immunol. 147:2692-61 en c) het conformationele epitoop van het eiwit NS-3, CM3.B6 [Mondelli (1994) J. Virol. 68.:4829-36] . Dezelfde verdun-20 ningsserie werd parallel hiermee ook beproefd met een in de handel verkrijgbare kit tegen HCV (Ortho HCV 3.0) met daarin een mengsel van recombinant-eiwitten uit de kern en uit de gebieden NS-3, NS-4 en NS-5. De analytische gevoeligheid voor detectie van antilichamen tegen alle drie 25 gebieden was bij gebruik van de peptidemengsels A en E twee tot acht maal zo hoog als met de recombinant-eiwitten van de in de handel verkrijgbare kit (figuren 1-3) . Daarnaast vertoonde mengsel E een grotere gevoeligheid voor detectie van antilichamen tegen HCV dan mengsel A.

30

Voorbeeld 7

Beoordeling van de bepalingsefficiëntie in patiënten- en donorpopulaties 35 Een totaal van 1034 monsters die - blijkens PCR- analyse (Wang c.s. (1992) en Gastroenterology 103. 609) of blijkens de Chiron RIBA® HCV 2.0 Strip Immunoblot Assay 1 0 " - ' 30 (Ortho Diagnostic Systems Inc., te Raritan, NJ) beslist positief in antilichamen tegen HCV waren, werd overeenkomstig voorbeelden 1 en 5 in een ELISA met mengsel A beproefd. Deze monsters waren verkregen uit NANBH-patiënten 5 met chronische of acute hepatitis of met hemofilie, of het waren patiënten die veelvuldig transfusie gekregen hadden, met HCV geïnjecteerde patiënten die seroconversie ondergingen en bloeddonoren waarvan men vastgesteld had dat ze al eens met HCV geïnfecteerd waren. Alle 1034 beslist positie-10 ve monsters bleken bij beproeving met mengsel A positief te zijn, met een gemiddelde verhouding van signaal tot achtergrond, van 10.

Een verzameling van 3154 bloedmonsters van willekeurige donoren werd evenzo met ELISA met mengsel A be-15 proefd. De specificiteit van de bepaling was in bloeddonor-populaties beter dan 99,5%. De gemiddelde verhouding van signaal tegen achtergrond was bij deze monsters 0,3:1. De beslist positieve monsters hadden dus een gemiddelde verhouding van signaal tegen achtergrond die 33 maal hoger 20 was dan bij bloedmonsters van willekeurige donoren.

Een verzameling van 1395 bloedmonsters van willekeurige donoren werd getest op mengsel E zoals beschreven in voorbeeld 5. Het aanvankelijke reactieve percentage was 0,4%, hetgeen een bepalingsspecificiteit van 99,6% geeft. 25 De aanvankelijk reactieve monsters werden opnieuw getest en vastgesteld werd dat alle negatief waren (hoewel dit marginaal zo was voor 3/4 monsters) . Dit resultaat, een bepalingsspecificiteit van 100%, toont de hoge specificiteit van deze bepalingsopzet in een donorpopulatie aan.

30

Voorbeeld 8

Immunoreactiviteit van een aanvullend met NS-4 reactief peptide 3 5 De immunoreactiviteit van de peptiden 3 5 (ook bekend als V; SEQ ID nr. 35) en 46 (tabel 8) werd bepaald met een panel van bekende HCV-sera uit HCV-panel 3 die tOP? · 31 antilichamen tegen het NS-4-eiwit bevatten, in de ELISA-bepalingsopzet zoals beschreven in voorbeeld 1. De resultaten worden getoond in tabel 9. Peptide 46 vertoonde een reactiviteit die vergelijkbaar was met het prototype-5 peptide 35 van stam HCV-1.

Voorbeeld 9 Gesplitste peptiden 10 Peptide 4, een controlepeptide dat een conforma- tie-epitoop van NS-3 bevat, en gesplitste peptiden 48, 49 en 50 werden als bekleding aangebracht op platen voor ELISA-bepalingen zoals beschreven in voorbeeld 1. Peptiden 48-50 vertoonden weinig tot matige reactiviteit met die 15 antilichamen gericht tegen conformatie-epitopen van NS-3 die aanwezig zijn in serummonsters van HCV-panel 3, zoals blijkt uit de aanzienlijke afname van de extinctie voor het merendeel van de monsters in tabel 10. Peptide 48 behield de meeste immunoreactiviteit tegen het lineaire epitoop in 20 dit NS-3-gebied. Bovendien reageerden de drie peptiden met sera waarvan bekend was dat ze vals-positieve resultaten gaven met peptide 4 in HCV-bepalingen, zoals blijkt uit de NYBC-monsters in tabel 10, hetgeen hun bruikbaarheid aangeeft als reagens voor de selectieve verwijdering voor 25 de niet-specifieke immunoreactiviteit die geassocieerd is met het conformatie-epitoop van NS-3 van peptide 4.

Peptiden 48 en 49 werden toegevoegd aan monster-verdunningsmiddel in een concentratie van 50 μg/ml en bepaald met bekende HCV-positieve sera en bekende HCV-vals-30 positieve sera zoals beschreven in voorbeeld 1 met behulp van ELISA-platen die waren bekleed met peptide 4. Tabel 11 laat zien dat de immunoreactiviteit van de echte positieve monsters (monsters uit HCV-panel 3) werd geremd over een trajekt van ongeveer -26% tot 23%, waarbij het merendeel 35 van de monsters een maximum van 15% remming vertoonde en verscheidene monsters verhoogde extincties lieten zien (wat een gevoeliger detectie van echt positieve sera mogelijk 10·; 32 maakt). Tabel 11 laat echter ook zien dat de immunoreacti-viteit van de vals-positieve monsters (NYBC-monsters) in aanzienlijke mate werd geremd door de aanwezigheid van het gesplitste peptide in het monsterverdunningsmiddel. In de 5 geteste concentraties was de remming met peptide 48 meer dan 85% in 4/6 monsters. Voor het merendeel van de monsters was de remming titreerbaar op een dosisafhankelijke manier.

Peptide 51 werd aan monsterverdunningsmiddel toegevoegd in een concentratie van 25 μg/ml en bepaald met 10 ELISA op mengsel E dat als bekleding was aangebracht op microtiterplaten zoals beschreven in voorbeeld 5. Bij een bepaling in viervoud op 2 vals-positieve monsters (980421 en 820905) werd de niet-specifieke immunoreactiviteit gereduceerd met respectievelijk 90 en 94%, terwijl met een 15 bekend met HCV NS-3 reactief monster de immunoreactiviteit onveranderd was. Soortgelijke resultaten werden verkregen met een aantal vals-positieve serummonsters die met ELISA werden getest op mengsel D.

20 Voorbeeld 10

Mengsels A, D en E werden onderzocht zoals beschreven in voorbeeld 5 met drie beslist HCV-positieve serummonsters (volgens PCR en/of RIBA). Mengsel A gaf met deze drie monsters vals-negatieve signalen, terwijl meng-25 seis D en E beide sterk positieve signalen gaven zoals getoond in tabel 12.

Monster T14916 werd gekozen als een zeldzaam monster dat als HCV-positief was bevestigd met PCR-testing en waarvan was aangetoond dat het antilichamen bevat die 30 reactief zijn met de NS-3- en NS-5-eiwitten maar niet met het kerneiwit of het NS-4-eiwit. De verbetering van de prestatie voor monster T149916 wordt toegeschreven aan de toevoeging van peptide 47 (een met NS-5 reactief peptide) aan de mengsels D en E). Bij afzonderlijk testen op monster 35 T14916 hadden peptide 47 en zijn prototype peptide 36 (ook bekend als pepl2 in EP-A 0 468 527, gepubliceerd op 29 ioo" 33 januari 1992) extincties van respectievelijk 1,246 en 1,089 bij 492 nm.

10' ' <D I τ) -η

I—I

β Γβ H >

.. .. . U

β 0 <D β

> II

0) > J , Ö") ft ft α> to ft ft Ö1 0) 0 0 -0 (¾ (¾ β 0

Dj ft as Ü a a T3 co ω d as ft ft Ο Ό ω ω % £_l in in ld in ^ ft H < W ft ^ H h-h »! h ^ ft ft n rfft 0 Oh Oh β £ & _ Ei η as a § r s I >2 i i 11« β Oh N η n ^ $ § ft O Ü no "g •H ft g g g ^ ft N g 5 * d N J J Ö · n

6 £ P

« h g g g 6

> S 9 g 0 0 O D

H ^ W mO >>Λ3 -,1 D S, > > > ns jj as _ ^ ^ a o' ^ og^nsö OS 2 H ro £ 0 0 d -Η

m λ J co ο ζ Ο 0 ω β U

« ϊ %0 00^Οβ ^ ft 0 Ρ* ft c , as

j-1 vOj ft 5 Si H

£ >ft « W -H O D

as Q * g g β£ 2 * 2 a o a ο > ί

m S o ft ft _, · N

$ Ö ft ft ft CQ

^ £ ft O ft g OS β ^ * I ^ ^ «r

^L" § I Ê «Ö-S

g* , £ £ « 2ί

o Η £ Oft ^0 -H

o ft a ft _, β β

ft 0 Oh Η -Η D

ft Η O ft -H Β o

."'n ft ft rn nS II

ft U ft H

hH <* rH P_j Φ fll E-* ft 0 K ‘Η g, ..

^ H ft r -H as ft Η β l, ΓΗ

^ ft « § Ο -H

^ ft rH

ft as -o 0

“ ω as D

“ rn a

m β r^H

-----q as x p w as o

M * D

• lo i£ r* ao Ό t) Ö cn os ro ro U ft ω ησ οβ co ns ii ___L_L__U n Dh β Π3 ·' d as ω β 1 .j ·

Immunoreactiviteit van met de kern reactieve peptiden

Tabel 2 35

Serum 26 37

Serol 1-5 0,382 0,722 HCV 3-12 1,490 1,799 HCV 3-15 0,524 1,379 HCV 3-16 0,481 1,538 HCV 2-22 1,561 1,521 HCV 2-32 2,402 2,737 HCV 2-35_0,094_0,181_

Soma_6,934_9,877_ a Som van de bovenstaande extincties bij 492 mm.

1 o o: ·; Η ? a è ο ί 2

g I

^ > Μ ^

00 CN

S”

00 CN

σ cn cd

CO CN

ld P

£

Cd < J Σ HI P P P ld P td β «Γ,^,^ΟΟΟΟΟΟ <d 9, * >; >; >, ►> >, ·>

2 §°S2S3SS

4J ^«OOOOOO

1¾ OUP Cd Cd Cd Cd Cd Cd m P ld ld ld ld ld ld

ft ΓτΠ N |S |S |S |S |S IS

ïï “"WWWPCÜW

n > g ^<999999

<u S ®"2SS§§S

lo r—i -η ·—^ co ή 12 «2 2 2 § 2

^0)4-)¾ U U U U O

m λ u 9 ^^αοσοοο m rtJ H acd p p p p p p

HO) rn ^ 1—1 M M M M M

X O» P ft ft ft ft 9 P > > P > > , ö x k κ k k ffi U3 § οοσοοο s H cd cd cd co cd cd 9 uuuuuu 4j ^i^pppppp 0) Hrtj^WWWWWCd

Σ "^hSSSSSS

OJCXcdWWWWW

>i p p p p p p >d ft ft ft Pu ft ft > w w w w w w weeded o o o o Q? >H >H >h >h >h >h

r, P P P P P P

9 >>>>>> ^,Γχ,ω ω ω ω w w η > ^ cd cd cd cd cd cd

Pf P1 ^ P P P P P P

£ >> Cd Cd Cd Cd Cd Cd

Η Μ Μ Η M

CL>dTlH Μ Μ Η Μ M

.ff H E-1 E-1 O O Cd

CdCd^Cd Cd Cd ft ft Cd rh^ Q (~\ cd cd cd cd cd Cd ® o o o a a co Is cd cd cd |z Is

Cd Cd Cd Cd 2 Cd

Cd Cd Cd Cd Cd Cd

Cd Cd Cd Cd Cd Cd

Openen σ\ o h og ro

Wmojoj m ^ ^ ^

Cd

1 O i: L

Tabel 4

Eliminering van vals-positieven met met NS-4 reactieve peptiden 37 _Serum_39_44_42_43_ HCV Positief NAB-2-2 0,623 0,366 0,645 0,819

Vals-nositief 18-109 0,726 0,103 0,088 0,057 18-425 0,607 0,072 0,075 0,136 18-955 0,772 0,063 0,077 0,052 18-1936 0,892 0,058 0,066 0,059 18-1006_0,765_0,055_0,055_0,051 i e ;.

<T\ i—( Γ.

£ ^ ft

Oh v;

m pH

Si (V ft ft ft ft ft (¾ ft ft n.

ft > a .-1 Oh in ττ Η n > M ft

oh S

CD fN HH

Oh Η h Oh

Hi 9· KS h ft

w < *h σ S

ft ft ^ J

Oh Oh

ο! rH U

Oh CO 0

Oh K

J > CO (S K.

* < ft c u tr

^ °00 W

Ό K ^ ^ >H

71 > w 4-> CO (N Q,

Oh > E-! ft

* « ft^ ^ I

” > £ £V £ CO φ Jj D ft ro a " I s sf g

H S “ g rH I

co rj< Q

,n H CO ^ ^ ω o ' > <

W J rH

Eh 00 rH £> ft ft ft ft 0) s s £

Q

ft

O

c OD fi to [i] Η Γ0 <3* co 1 Λ , > v. ’. ,

Immunoreactiviteit van met NS-5-reactief peptide

Tabel 6 39

Serum 33 45 HCV 3-1 >3 2,826 HCV 3-5 2,800 2,673 HCV 3-11 1,357 1,951 HCV 3-13 0,853 1,001 HCV 3-14 2,769 2,877 HCV 3-15 0,065 0,062 HCV 3-17 2,998 2,842 HCV 3-19 > 3 2,759 HCV 3-24 0,530 0,515 HCV 3-25 1,517 2,219 HCV 3-26 2,152 2,342 HCV 3-29 0,161 0,220 HCV 3-33 2,697 2,219 HCV 3-41 2,843 2,666 JP-7 0,946 1,120 JP-9_0,181_0,508_ 10 0 2;·.

Tabel 7 40 _Gevoeligheid en specificiteit van peptidemengsels_

Mengsel A Mengsel B

Monster* _Ext_Verhouding11 Ext_Verhouding11

Kern-1 1,099 2,57 1,085 2,67

Kern-2 2,444 5,72 2,210 5,44

Kern-3 1,646 3,85 1,747 4,30 NS3-1 0,664 1,55 0,642 1,58 NS3-2 1,557 3,65 1,757 4,33 NS4/NS3-1 1,902 4,45 1,819 4,48 NS4-1 1,404 3,29 0,658 1,62

Neg-1 0,163 0,38 0,180 0,44

Neg-2 0,170 0,40 0,191 0,47

Neg-3_0,136_0,32_0,152_0,37_

„ , Mengsel D Mengsel E

Monster* - --- _Ext_Verhouding11 Ext_Verhouding11

Kern-1 0,691 2,49 1,030 2,79

Kern-2 2,249 8,10 2,749 7,44

Kern-3 1,734 6,24 2,044 5,53 NS3-1 0,435 1,57 0,813 2,20 NS3-2 1,496 5,39 1,748 4,73 NS4/NS3-1 1,908 6,87 1,746 4,72 NS4-1 1,008 3,63 1,406 3,80

Neg-1 0,073 0,26 0,151 0,41

Neg-2 0,069 0,25 0,097 0,26

Neg-3_0,075_0,27_0,128_0,35_ * Panel gekozen als beschreven in voorbeeld 5. Neg is normaal menselijk serum waarvan bekend is dat het negatief is voor antilichamen tegen HCV.

b Verhouding is de extinctie gedeeld door de grenswaarde. De grenswaarden waren als volgt: mengsel A, 0,427; mengsel B, 0,406; mengsel D, 0,278; en mengsel E, 0,370.

ί 0 t * -Η > <D (—I O 4-J T) -H *H -H 4J <D 4-1 c c -u a rO (0 -H flj > > a

I I I - Μ a) -H

<> Ti Jj 4J C

> > > u

UUUH

L_. C_j L_i ·7 Ο'ΗφΓΟ g £ S u 0 <D ^ 1 U U U P > 1 Og

HQPPM ^ ^ ^ S

PMMM > W > > > cjO 'nalm ω co co co p mZ5s C p p p a Ν 'Η > > a a a W u m Λ) n NPPPO rn^vn PÜÜOH ï.mn P P Η Η >h [[I ' ^ ° a ί* ï* !* Ü CO Ü O Ü H 'm m ‘o PHHHS u W-H a

P 2 £ 2 N

mPPPC S\,nm

C a > C C C P

τι S P P P H C ^ Λ 1 tJ

-H ! Ü C C C £

.υ e a > > > p ! F

S' « § I g § g § ö °

d) g P P P P P W ^mrrtR

> Swmwwwp ^ 73 u ^ 0) S P S P P P U S'RrHjj 00 -H S' E Ü U U U « r^nmrn II Oi CO !*i isd !*! Ό U φ Φ H ^ U w I S « «« « Tj £ ^

1J ë ω a a 4J&-H

** P £ p ë CO CO acn-UP

mP π g aiojatu

Ημ > H DC

<u C p a a rrt ap HM ^ c ” ö <C g J -3

i! >W 4-> 0) CQ P

3 CP CD Ϊ

> ^ a * Ö-U-H

S m n 5 rd -η ω CJ

5 <§ W rdNOJO

H W “ μ m

O' Q S £p 0) B

^ S 2 Φ U T3 QJ

rn 9 2 ω -η Co S £ “ Cn M a a u Q)0(i) S P 4J (η -η

Ol 2 -H 4-) Ό S 9 <u <u n W K 4-J -Η -Η β

--------ho 3 (D

> TS β ', -H c <L> ,-H 4-) to ap fid) a a a a ο: ^ ιλ m ra w m tcmao 2s.a)co ο ο ο o a υ ë p ^ «^gfcgaas f0 a p WMCDPOO<TiOH a ^ ^ ^ in in 10,,

Tabel 9 42

Immunoreactiviteit van met NS-4 Reactieve Peptiden vergeleken met peptide 35 (V)

Serum 35 46 HCV3-3 0,578 0,682 HCV3-18 0,059 0,055 HCV3-27 1,251 1,513 HCV3-31 1,718 1,915 HCV3-37 0,112 0,142 95 - 100Aa_0,515_0,528_ a Vanwege het beschikbare monstervolume werd dit monster voor de bepaling 1:4 verdund. De vermelde extinctiewaarde is die gemeten aan het verdunde serum.

1 0 0 2 1 - .

Specificiteit van gesplitste peptiden

Tabel 10 43

Sera_4_48_49_50_ BLK 0,052 0,053 0,055 0,056 NRC 0,027 0,043 0,054 0,052 WRC 0,092 SRC_0,380_ HCV 3-13 Over 0,584 0,107 0,071 HCV 3-14 1,711 0,750 0,110 0,069 HCV 3-16 1,751 0,749 0,095 0,050 HCV 3-17 2,049 1,714 0,173 1,331 HCV 3-20 2,581 1,303 0,145 0,034 HCV 3-21 2,724 0,410 0,121 0,123 HCV 3-24 2,429 1,678 0,953 1,342 HCV 3-28 2,924 0,725 0,135 0,086 HCV 3-29 2,424 1,021 0,117 0,040 HCV 3-30 2,607 1,008 0,011 0,045 HCV 3-34 1,266 0,380 0,055 0,049 HCV 3-38 2,373 0,800 0,580 0,695 HCV 3-39 2,219 0,781 0,148 0,066 HCV 3-40 2,706 1,678 0,429 0,298 HCV 3-41 2,299 1,158 0,137 0,058 NYBC-13-346 0,505 0,652 0,603 0,734 525 1,867 2,333 2,546 2,109 574 0,246 2,458 2,298 2,292 715 0,238 0,576 0,558 0,590 854 0,255 0,721 0,730 0,806 _869 0,989_0,901_1,000_1,130 1 0 v.-

Tabel 11 44 NS-3 remmingsstudie Controle 48 49

Sera

_Ext_Ext_%I_Ext_%I

BLK 0,052 0,052 NRC 0,035 0,035 0,035 WRC 0,153 0,153 0,094 SRC_0,485_0,485_1,290_ HCV-3-13 3,000 2,548 15,1 3,000 -8,2 HCV 3-14 1,653 1,461 11,6 1,952 5,3 HCV 3-16 1,579 1,546 2,1 1,880 6,5 HCV 3-17 1,566 1,311 16,3 1,576 7,7 HCV 3-20 2,391 3,000 -25,5 2,295 23,5 HCV 3-21 2,636 2,597 1,5 2,676 -7,6 HCV 3-24 2,379 2,855 -20,0 2,470 17,7 HCV 3-28 2,792 2,615 6,3 2,280 14,8 HCV 3-29 2,454 2,687 -9,5 2,470 17,7 HCV 3-30 2,559 2,705 -5,7 2,564 14,5 HCV 3-34 1,185 0,977 17,6 0,921 12,2 HCV 3-38 3,000 3,000 0,0 2,551 -4,1 HCV 3-39 1,984 1,999 -0,8 2,336 -4,2 HCV 3-40 2,399 2,677 -11,6 3,000 -15,7 HCV 3-41 2,731 2,633 3,6 2,909 -9,2 NYBC-13-346 0,503 0,066 86,9 0,086 84,5 525 1,886 0,582 69,1 1,536 21,7 574 0,619 0,042 93,2 0,857 39,3 715 0,378 0,054 85,7 0,079 79,8 854 0,561 0,125 77,7 0,347 42,4 _869 0,917_0,076 91,7 0,113 87,5 1 o C : ;

Tabel 12 45 _Mengsels3_ _Sera_A_D_E_ 95-100A 0,50 3,4 --b T14916 0,18 4,9 6,54 94/1492_0,21_1^8_1,13_ a De vermelde waarden zijn verhoudingen van signaal tot de grenswaarde.

b Bepalingen niet uitgevoerd in verband met onvoldoende monster.

i o u y v - C>uEjÊj£jEjÊjuuuu5uüC> ëëëëëëëëëësêszë uuuuuuuuuuuuuuuuu

PPPPPPPPPPPPPPPPQ

MHHHHHHHHHHHHHHHH

>>>>>>>>>>>>>>>>> cowcowwwwwMtnwMwoiwcow PPPPPPPWPPPPPPPPQ C hhhfchlii&itifcli.liihtfclijhlt, %< PPPPPWPPPPPPPPOOP > OOOOOOOOOOOOOOOOO r" HHE-'E-iE-'E-'E-iE-'E-iE-iciiwcowcowE-' „ >Η>ΗίΗίΗ>Ι>-Ι>Η><>(>(ίΗ>Η>Η>(|>Η>Η>-Ι f-, 00000000000000000 jr ΗΗΗΗΕ-'Ε-'Ε-ιΕ-'ΗΕ-ιΕ-'ΗΗΕ-ιΗΕ-ιΕ-' ^ sskssssssssssssss: > PJPPPJJNNNNNNNNNJ ^ PPPPPPPPPPPPPPPPP g1 E-'E-'E-iE-'HHE-'E-iHE-iE-'COWWC/iwEh b 1 i 1111 i 1111111111 \ HPPPPPPPPPPPPPPQQ £ >OOOOOOOOOOOOOÜUO L w«wwwwww<<><<<i=i:<<w S >HHE-iE-iE-'E-<HHHE-iHHEhHE-'H 3 PHHHMMMHHHHHHHHHH n q>>>>>>>>>>>>>>>> g fctiWWWWWWWWWWCQWWMWW .¾ c £1>>>>>>>>>>>>>>>> g

S PPPPPPPPPPPPPPPPP E

f1-i rtJPPPPPPPPNPPPPPPP

.2 >0000000000000000 nj

Ij ΐιίρίκδκδρίκδδκκρίιιικρ! X

« g» ë h ^ ^ ^ π g ^ ^ rH 5ιΞ PHMMMHHHHNHHMMHMH Z,

.5 5 t^oooooooooooooooo U

* 3 g i 1 it i i i g gg g g 11111 g i

Π3 g HPPPPPJPPPPJPPJPP X

H: ||iiliiisiisiiig| i fcipNNPPNpNNNNNNNNP ?· ' «HHWWWWMMWWWHWWWIÏI £ 2 WPPPPPPPPPPPPWPPP £ auuuouuuuuuuuuuuu .5 *· PHE-ifiWWWWWWWWWWWWCO g

MH HH HH MH HM KM HM ΜΗ HH HH pM t-M ΜΗ 2N HM Pm MH

2uuuuuuuuuuuuuuuu d Omhhhmmhmhmihhhhmh m «PPPPPJPJPPPPPPJ.J φ

HffiffiscaKacffiiiHainJWWMawa m >ακακοίκκακρίΚο!κοίο!£ϋ Δ ωοοοοοοοοοοοοοοοο POOOOOOOOOOOOOOOO O)

0,¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ .H

H>>>>>>>>>>>>>>>H Jj

^ωωωωωωωωωωωωωωωω E

2pppppppppppppppp g J^PCliPCUCXiPOfPPPCMftPOiP&i n, «>>>>>>>>>>>>>>>t-H ^ 2S3222SS^222S^2^ g « > s i 1) tn Ö nj rë +

4J

0)

------------------B

1 O . > Q) Ö Lnv£>r^^mOH(NmTi»inu)r^oo<ryOH q

HQ r^a>u'HHHHHHHHHHCN(N

2 CO H t 47

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Hosein, Barbara Wang, Chang Yi (ii) TITLE OF INVENTION: Peptides Effective for Diagnosis and Detection of Hepatitis C Infection (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 43 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: M. Lisa Wilson (B) STREET: 25 Davids Drive (C) CITY: Hauppauge

(D) STATE: NY

(E) COUNTRY: USA

(F) ZIP: 11788 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: <B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Wilson, M. Lisa (B) REGISTRATION NUMBER: 34,045

(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 2015-DE

(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (516)273-2828 (B) TELEFAX: (516)273-1717 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A) LENGTH: 44 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l:

Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro 15 10 15

Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Lys 20 25 30

Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr 35 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: 1 > .

48 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 4 7 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

Ser Gly Lys Pro Ala lie lie Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu 15 10 15

Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gin His Leu Pro Tyr lie Glu Gin 20 25 30

Gly Met Met Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu Gly Leu 35 40 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 61 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

Ser Thr lie Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 15 10 15

Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin lie Val Gly Gly 20 25 30

Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45

Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

Lys Ala lie Pro Leu Glu Val lie Lys Gly Gly Arg His Leu lie Phe 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 35 40 45 10 02 1 « 49 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val He Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 75 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

Lys Lys Lys Lys Ala lie Pro Leu Glu Val He Lys Gly Gly Lys His 15 10 15

Leu He Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys 20 25 30

Leu Val Ala Leu Gly He Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Lys Gly Leu Asp 35 40 45

Val Ser Val He Pro Thr Ser Gly Asp Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly 50 55 60

Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val He Asp Cys 65 70 75 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 77 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Xaa Val Lys Gly Gly Arg His Leu He Xaa 15 10 15 toe* 50

Cys His Thr Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys 65 70 75 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine11 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 31 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Xaa Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Thr Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Xaa Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val 1 .·· v .

51 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 38 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Xaa Val Lys Gly Gly Arg His Leu He Xaa 15 10 15

Cys His Ala Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Xaa Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 35 40 45

He Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val He Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear too* (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 52 (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;T0.10;F0.10;Y0.10;Norvaline0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 38 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Phe 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Xaa Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "V0.30;A0.30;TO .10;F0.10;YO.10;Norvaline0.10" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu He Phe 15 10 15 1 0 0 2 'i * 53

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERIS TICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "V0.3 0;A0.30;TO .10;F0.10;Y0.10;Norvaline0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :11:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Gin Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 too; - 54 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO . 3 0; A0.30 ;T0.10; F0.10; Y0.10 ,-NorvalineO . 10 " (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :12:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Phe 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Glu Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear I 0 l' (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 55 (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;TO .10;FO.10;Y0.10;Norvaline0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE : (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 50 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :13:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Xaa Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 10 0 2 1 4·; 56 (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;TO .10;FO.10;YO.10;NorvalineO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 35 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 44 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :14:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly Xaa Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Xaa Asp Val Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear 1 o o: (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 57 (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;TO .10;FO.10;YO.10;NorvalineO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :15:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Ser Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: 10 o: > : 58 (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;T0.10;F0.10;Y0.10/NorvalineO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Xaa Gly lie Asn Ser Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Ser Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Ser Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear 10 0 2 1 ' 59 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .3 0;AO .30;TO .10;FO.10;YO.10;NorvalineO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :17:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Xaa Gly lie Asn Ala lie Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Ser Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Ser Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :18: 10 0" 60 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;TO .10;F0.10;Y0.10;NorvalineO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Glu Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Xaa Gly lie Asn Ala Val Ser Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Ser Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Ser Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80 1 o (· / · ·· .

61

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .30;AO .30;TO .10;F0.10;Y0.10;Norvaline0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note» "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note» "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note» "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :19:

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Val Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Arg Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Xaa Gly lie Asn Ala Val Ser Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 10 0,· 62 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Ser Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Ser Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 3 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "V0.3 0;A0.3 0;TO .10;F0.10;Y0.10;NorvalineO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 8 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 26 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 63 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 74 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :20: 10 02 ! 63

Lys Ala Xaa Pro Leu Glu Val Xaa Lys Gly Gly Arg His Leu lie Xaa 15 10 15

Cys His Ser Arg Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Xaa Gly lie Asn Ala Val Ser Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Xaa Ser Val 35 40 45 lie Pro Thr Ala Gly Asp Val Val Val Val Ala Ser Asp Ala Xaa Met 50 55 60

Thr Gly Tyr Ser Gly Asp Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn Thr Cys 65 70 75 80

Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 84 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:

Lys Lys Lys Lys Ala lie Pro Leu Glu Val lie Lys Gly Gly Arg His 15 10 15

Leu lie Phe Cys His Ser Arg Arg Arg Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys 20 25 30

Leu Val Ala Leu Gly lie Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp 35 40 45

Val Ser Val lie Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp 50 55 60

Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys 65 70 75 80

Asn Thr Cys Val (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 64 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.90;GO .10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 11 10 01’' 64 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 13 (D) OTHER INFORMATION: /note= "TO .70;N0.30" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 24 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 27 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 39 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 51 (D) OTHER INFORMATION: /note= "TO .90;P0.10" (ix) FEATURE : (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 60 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Hydroxyproline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :25:

Lys Lys Lys Ser Thr lie Pro Lys Pro Gin Xaa Lys Thr Lys Arg Asn 15 10 15

Thr Asn Lys Arg Pro Gin Asp Xaa Lys Phe Xaa Gly Gly Gly Gin lie 20 25 30

Xaa Gly Gly Val Tyr Leu Xaa Pro Arg Arg Gly Pro Arg Xaa Gly Leu 35 40 45

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Thr Glu Arg Ser Gin Xaa Arg Gly Arg Arg 50 55 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 64 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 10 0.?· 65 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "PO.90;G0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 11 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 13 (D) OTHER INFORMATION: /note= "TO .70;N0.30" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 24 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 39 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 51 (D) OTHER INFORMATION: /nOte= "TO .90;PO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 53 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 55 (D) OTHER INFORMATION: /note= "TO .25;AO .25;E0.25;K0.25" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 60 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:

Lys Lys Lys Ser Thr lie Pro Lys Pro Gin Xaa Lys Thr Lys Arg Asn 15 10 15

Thr Asn Lys Arg Pro Gin Asp Xaa Lys Phe Pro Gly Gly Gly Asn lie 20 25 30

Xaa Gly Gly Val Tyr Leu Xaa Pro Arg Arg Gly Pro Arg Xaa Gly Val 35 40 45 1 0 u Z '* 66

Arg Ala Thr Arg Xaa Thr Thr Glu Arg Ser Gin Xaa Arg Gly Arg Arg 50 55 60 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :27: lie lie Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Met 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 59 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 4 (D) OTHER INFORMATION: /note= "SO .80;NO .20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 5 (D) OTHER INFORMATION: /note» "GO .80;D0.10;Q0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 6 (D) OTHER INFORMATION: /note» "K0.60;R0.40" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.8 0;V0.10; A0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 9 (D) OTHER INFORMATION: /note= "10.60;V0.40" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 10 (D) OTHER INFORMATION: /note» "10.60;V0.20;A0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 13 (D) OTHER INFORMATION: /note» "R0.80;K0.20" (ix) FEATURE: 1 0 0 £ : 67 (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 18 (D) OTHER INFORMATION: /note= "RO.30;QO.50;EO.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 19 (D) OTHER INFORMATION: /note= "EO.80;AO .20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 27 (D) OTHER INFORMATION: /note= "SO .40;AO .60" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 28 (D) OTHER INFORMATION: /note= "QO.40;SO .60" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 29 (D) OTHER INFORMATION: /note= "HO .80;K0.10;RO.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 30 (D) OTHER INFORMATION: /note= "L0.80;A0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 31 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.80;A0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 32 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Y0.80;L0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 35 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Q0.80;E0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 37 (D) OTHER INFORMATION: /note= "M0.80;Q0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 38 (D) OTHER INFORMATION: /note= "M0.40;Q0.40;R0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 39 10 0,: 68 (D) OTHER INFORMATION: /note= "LO.80;M0.10;10.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 43 (D) OTHER INFORMATION: /note= "F0.80;LO.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 45 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Q0.80;SO .20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 47 (D) OTHER INFORMATION: /note= "A0.80;10.20" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :29:

Lys Lys Lys Ser Gly Lys Pro Thr lie lie Pro Asp Arg Glu Xaa Leu 15 10 15

Tyr Arg Glu Phe Asp Asp Met Glu Asp Cys Ser Gin His Leu Pro Tyr 20 25 30

Xaa Asp Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val 35 40 45

Gly Leu Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Asn lie 50 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 8 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.80;L0.10;V0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 10 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 12 (D) OTHER INFORMATION: /note= "TO .50;SO .40;P0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note= "K0.40;D0.40;R0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 19 (D) OTHER INFORMATION: /note= "E0.50;V0.40;Q0.10" 1 0 < ,·: .

69 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 21 (D) OTHER INFORMATION: /note= "PO.90;A0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 22 (D) OTHER INFORMATION: /note= "VO .80;TO .20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 23 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 24 (D) OTHER INFORMATION: /note= "HO .80;L0.10;AO .10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 27 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.80;A0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 30 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.90;SO .10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 31 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 32 (D) OTHER INFORMATION: /note= "K0.80;P0.10;R0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 33 (D) OTHER INFORMATION: /note= "SO .4 0;A0.40;K0.10;Q0.10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 34 (D) OTHER INFORMATION: /note= "P0.80;T0.20" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 36 (D) OTHER INFORMATION: /note= V0.50;10.40;TO .10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 37 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 41 (D) OTHER INFORMATION: /note= "K0.40;R0.60" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site

1G 02 U

70 (B) LOCATION: 42 (D) OTHER INFORMATION: /note= "K0.70;RO.30" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 44 (D) OTHER INFORMATION: /note= "TO .90;AO .10" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 2 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:

Ala Xaa Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Xaa Glu Thr Trp Lys Lys Pro 15 10 15

Glu Tyr Glu Pro Pro Val Xaa His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Xaa Lys 20 25 30

Ser Pro Pro Val Xaa Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr 35 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :35: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 40 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :35:

Lys Gin Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gin Thr Ala Ser Arg Gin Ala Glu 15 10 15

Val lie Ala Pro Ala Val Gin Thr Asn Trp Gin Lys Leu Glu Thr Phe 20 25 30

Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe 35 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 55 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :36:

Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu lie 15 10 15

Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gin Glu Met Gly Gly Asn lie Thr Arg 20 25 30 i o - ; 71

Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val lie Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu 35 40 45

Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg 50 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :37: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 55 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 11 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 19 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 27 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 32 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 40 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 46 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 48 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:

Lys Lys Lys Ser Thr lie Pro Lys Pro Gin Xaa Lys Thr Lys Arg Asn 15 10 15

Thr Asn Xaa Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Xaa Gly Gly Gly Gin Xaa 20 25 30

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Xaa Arg Arg Gly Pro Arg Xaa Gly Xaa 35 40 45

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser 50 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :38: * 72 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 18 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 23 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 31 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 37 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 39 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :38:

Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Lys Arg Pro Gin Asp Val Lys 15 10 15

Phe Xaa Gly Gly Gly Gin Xaa Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Xaa Arg 20 25 30

Arg Gly Pro Arg Xaa Gly Xaa Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser 35 40 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 50 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note- "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:

Lys Lys Lys Ser Gly Lys Pro Thr lie lie Pro Asp Arg Glu Xaa Leu 15 10 15

Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Asp Cys Ser Gin His Leu Pro Tyr 20 25 30

H

73 lie Asp Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val 35 40 45

Gly Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 50 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 30 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:

Lys Lys Lys Ser Gly Lys Pro Thr lie lie Pro Asp Arg Glu Xaa Leu 15 10 15

Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Asp Cys Ser Gin His Xaa Pro Tyr 20 25 30 lie Asp Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val 35 40 45

Gly Leu 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :41: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 50 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 18 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 30 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" 1 0 v ... .

74 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:

Lys Lys Lys Ser Gly Lys Pro Thr lie lie Pro Asp Arg Glu Xaa Leu 15 10 15

Tyr Xaa Glu Phe Asp Glu Met Glu Asp Cys Ser Gin His Xaa Pro Tyr 20 25 30 lie Asp Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val 35 40 45

Gly Leu 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 50 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide <ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE : (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 18 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:

Lys Lys Lys Asn Gin Arg Xaa Ser lie lie Pro Asp Arg Glu Xaa Leu 15 10 15

Tyr Xaa Glu Phe Asp Glu Met Glu Asp Cys Ser Gin His Leu Pro Tyr 20 25 30 lie Asp Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val 35 40 45

Gly Leu 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 50 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 1 .

f * ƒ 75 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 15 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 18 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 30 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:

Lys Lys Lys Asn Gin Arg Xaa Ser He lie Pro Asp Arg Glu Xaa Leu 15 10 15

Tyr Xaa Glu Phe Asp Glu Met Glu Asp Cys Ser Gin His Xaa Pro Tyr 20 25 30

He Asp Gin Gly Met Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val 35 40 45

Gly Leu 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :44: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 45 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 10 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 13 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 25 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:

Lys Lys Lys He He Pro Asp Arg Glu Xaa Leu Tyr Xaa Glu Phe Asp 15 10 15

Glu Met Glu Asp Cys Ser Gin His Xaa Pro Tyr He Asp Gin Gly Met 20 25 30 * · v \ * i 1 76

Met Leu Ala Glu Asn Phe Lys Gin Lys Ala Val Gly Leu 35 40 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :45: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 2 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 10 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 23 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 31 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 37 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:

Ala Xaa Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Xaa Glu Thr Trp Lys Lys Pro 15 10 15

Glu Tyr Glu Pro Pro Val Xaa His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Xaa Lys 20 25 30

Ser Pro Pro Val Xaa Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr 35 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 40 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 8 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site 1 0 0 2·: 77 (B) LOCATION: 13 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine” (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 20 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Hydroxyproline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 35 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :46:

Lys Gin Lys Ala Leu Gly Leu Xaa Gin Thr Ala Ser Xaa Gin Ala Glu 15 10 15

Val lie Ala Xaa Ala Val Gin Thr Asn Trp Gin Arg Leu Glu Thr Phe 20 25 30

Trp Ala Xaa His Met Trp Asn Phe 35 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :47: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 55 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 8 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE : (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 16 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 32 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Ornithine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 40 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 48 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:

Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn Xaa Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Xaa 15 10 15 » Γ' J i 78

Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Asn Glu Met Gly Gly Asn lie Thr Xaa 20 25 30

Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Xaa lie Leu Asp Ser Phe Asp Pro Xaa 35 40 45

Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg 50 55 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:

Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Thr Asp Ala 15 10 15

Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn 20 25 30

Thr Cys Val 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :49: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 44 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:

Gly Arg His Leu lie Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu 15 10 15

Ala Ala Lys Leu Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly 20 25 30

Asp Phe Asp Ser Val lie Asp Cys Asn Thr Cys Val 35 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 54 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50: 1 o v : 79

Lys Ala lie Pro Leu Glu Val lie Lys Gly Gly Arg His Leu lie Phe 15 10 15

Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 20 25 30

Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val lie 35 40 45

Asp Cys Asn Thr Cys Val 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :51: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 7 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 17 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norleucine" (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Modified-site (B) LOCATION: 28 (D) OTHER INFORMATION: /note= "Norvaline" (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:

Lys Lys Lys Cys Asp Glu Xaa Ala Ala Lys Leu Val Ala Thr Asp Ala 15 10 15

Xaa Met Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Phe Asp Ser Xaa lie Asp Cys Asn 20 25 30

Thr Cys Val 35 1 ii

Claims (11)

1. Peptide-preparaat met ten minste één onvertakt of één vertakt peptide volgens de formule (peptide)-Y 5 (peptide) 2X (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X (peptide) 16X8X4X2X waarin Y een OH- of NH2-groep aan de carbonylgroep van het

2. De respectieve oplossingen voor deze problemen vormen de peptiden, mengsels, toepassingen en kits zoals gedefinieerd in the conclusies 1-20 (probleem I) en de peptiden, mengsels, toepassingen en kits zoals gedefinieerd in the conclusies 21 -42 (probleem II).

2. Peptide-preparaat volgens conclusie 1 dat een mengsel van twee of meer van die peptiden bevat.

3. Aanvankelijk zouden deze sets van oplossingen gezien kunnen worden als een groep van uitvindingen waarbij de activiteit van deze peptiden in de immunologische bepaling van HCV als verbindend element zou kunnen worden gezien.

3. Peptide-preparaat volgens conclusie 1, waarvan één of meer van die peptiden met een drager geconjugeerd is.

4. Echter ten tijde van de voorangsdatum van de onderhavige aanvrage waren reeds talloze peptiden met dit kenmerk bekend, waarbij kan worden verwezen naar de in het onderzoekrapport geciteerde documenten, bijv. -a)WO-A-94/06826 -b)WO-A-95/00670 5. ln het licht van onder meer deze dokumenten kan de activiteit van deze peptiden in de immunologische bepaling van HCV niet als verbindend element worden gezien. In de klaarblijkelijke afwezigheid van andere speciale technische kenmerken die als verbindend element voor beide oplossingsgroepen zouden kunnen worden beschouwd kan geen eenheid van uitvinding worden gewaardeerd in deze oplossingsgroepen.

4. Peptide-preparaat volgens conclusie 1, waarbij dat peptide peptide 37, 39, 43, 45, 46 of 47 is.

5 Val:Ile:Thr in een verhouding van 5:4:1, positie 41: Lys:Arg in een verhouding van4:6, positie 42: Lys:Arg in een verhouding van 7:3, en positie 44: Thr:Ala in een verhouding van 9:1.

11. Peptide-preparaat met ten minste één lineair 10 of één vertakt peptide volgens de formule (peptide)-Y (peptide) 2X (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X 15 (peptide) 16X8X4X2X waarin Y een OH- of NH2-groep aan de carbonylgroep van het C-eindstandige aminozuur van (peptide) is en X een aminozuur of aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot het 20 vormen van een peptide-binding, en het peptide-gedeelte (peptide), specifiek immunologisch kan reageren met anti-lichamen tegen hepatitis C virus (HCV), waarbij dat pepti-de-gedeelte een peptide omvat dat in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 40 aminozuren van SEQ ID nr. 25 35 behoudt, dat immunologisch kan reageren met antilichamen tegen HCV NS-4 en dat de volgende gesubstitueerde posities bevat: positie 8: norleucine, positie 13: ornithine, positie 20: hydroxyproline, positie 28: arginine 30 en positie 35: ornithine.

12. Peptide-preparaat met ten minste één lineair of één vertakt peptide volgens de formule (peptide)-Y (peptide) 2X 35 (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X (peptide) 16X8X4X2X 1. t.. - 85 - waarin Y een OH- of NH2-groep aan de carbonylgroep van het C-eindstandige aminozuur van (peptide) is en X een aminozuur of aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot het 5 vormen van een peptide-binding, en het peptide-gedeelte, (peptide), specifiek immunologisch kan reageren met anti-lichamen tegen hepatitis C virus (HCV), waarbij dat peptide-gedeelte een peptide omvat dat in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 55 aminozuren van SEQ ID nr. 10 36 behoudt, dat immunologisch kan reageren met antilichamen tegen HCV NS-5 en dat de volgende gesubstitueerde posities bevat: positie 8: ornithine, positie 16: norvaline, positie 24: asparagine, positie 32: ornithine, 15 positie 40: norvaline en positie 48: norleucine.

13. Peptide-preparaat dat mengsel D of mengsel E omvat.

14. Peptide-preparaat volgens conclusie 13, waarbij dat preparaat mengsel E omvat.

15. Werkwijze voor het detecteren van antilichamen tegen HCV of de diagnose van HCV-infectie bij een patiënt, waarbij men (i) een peptide-preparaat volgens één van de conclusies 1-14 verschaft; 25 (ii) een effectieve hoeveelheid van dat peptide- preparaat in contact brengt met serum, weefsel, een weef-selextract of een lichaamsvloeistof van de patiënt in een immuno-assay gedurende een tijd die voldoende is om een complex te vormen tussen dat peptide-preparaat en eventueel 30 antilichaam in dat serum, dat weefsel, dat weefselextract of die vloeistof, (iii) en dat complex detecteert met een detectie-inrichting.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij die 35 immuno-assay een ELISA, een sandwich-assay of een PHA-assay is. i U - 86 -

17. Kit voor het aantonen van antilichamen tegen HCV of voor de diagnose van een HCV-infectie, met daarin een eerste houder die erop ingericht is een peptide-preparaat volgens één der conclusies 1 tot en met 14 te bevat- 5 ten.

18. Kit volgens conclusie 17, die een kit voor een ELISA, voor een sandwich-assay of voor een ΡΗΆ-assay is.

19. Kit voor een ELISA voor het aantonen van antilichamen tegen HCV of voor de diagnose van een HCV- 10 infectie met daarin (a) een houder met daarin een met een peptide-preparaat volgens één der conclusies 1 tot en met 14 beklede vaste fase, (b) een negatief controle-monster, 15 (c) een positief controle-monster, (d) een monsterverdunningsmiddel en (e) antilichamen tegen menselijk IgG, welke antilichamen met een signalerend molecuul gemerkt zijn.

20. Peptide volgens één der conclusies 1 tot en 20 met 14.

21. Gesplitst peptide-preparaat met een lineair gesplitst peptide, waarbij het C-eindstandige aminozuur van dat peptide een carbonzuur of carbonzuuramide is, waarbij dat peptide een aminozuursequentie omvat die wordt gekozen 25 uit de groep bestaande uit SEQ ID nr. 48-50 en een aminozuursequentie van een stam/isolaat van HCV uit de overeenkomstige NS-3 gebieden van dat peptide, en waarbij dat peptide niet-specifieke reactiviteit van conformatie-epitopen van NS-3 in HCV-immuno-assays blokkeert.

22. Gesplitst peptide-preparaat met een lineair gesplitst peptide, waarbij het C-eindstandige aminozuur van dat peptide een carbonzuur of carbonzuuramide is, waarbij dat peptide niet-specifieke reactiviteit van conformatie-epitopen van NS-3 in HCV-immuno-assays blokkeert, en 35 waarbij dat peptide in hoofdzaak het skelet van de prototy-pe-sequentie van 35 aminozuren van SEQ ID nr. 48 behoudt en de volgende gesubstitueerde posities bevat:

5. Peptide-preparaat met ten minste één lineair of één vertakt peptide volgens de formule (peptide)-Y (peptide) 2X (peptide) 4X2X 3 0 (pept ide) 8X4X2X (peptide) 16X8X4X2X 10 0 ,' - 81 - waarin Y een OH- of NH2-groep aan de carbonylgroep van het C-eindstandige aminozuur van (peptide) is en X een aminozuur of een aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot het 5 vormen van een peptide-binding, en het peptide-gedeelte, (peptide), specifiek immunologisch kan reageren met antilichamen tegen hepatitis C virus (HCV), waarbij dat peptide-gedeelte een peptide omvat dat in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 10 52 aminozuren van de resten 1 tot 52 van SEQ ID nr. 3 behoudt, dat immunologisch kan reageren met antilichamen tegen de HCV-kern en dat de volgende gesubstitueerde posities bevat: positie 8: ornithine of lysine, positie 16: orni-15 thine of lysine, positie 24: hydroxyproline, positie 29: norvaline, positie 37: hydroxyproline, positie 43: norleucine, en positie 45: norvaline of leucine.

6. De beoordeling dient zich derhalve te richten op de groep die als eerste wordt genoemd in de conclusies, d.w.z. de peptiden, mengsels, toepassingen en kits als gedefinieerd in de conclusies 1-20.

6. Peptide-preparaat volgens conclusie 5, waarbij 2 0 het peptide-gedeelte verder één of meer van de volgende gesubstitueerde of gedegenereerde posities bevat: positie 4: Pro:Gly in een verhouding van 9:1, positie 10: Thr:Asn in een verhouding van 7:3, positie 21: norvaline, positie 30: norvaline, 25 positie 36: valine of norleucine, positie 48: Thr:Pro in een verhouding van 9:1 en positie 52: threonine of Thr:Ala:Glu:Lys in een verhouding van 1:1:1:1.

7. Deze peptiden worden nader gekenmerkt door een (al dan niet vertakte) sequentie die afkomstig is uit het domein van de kern- of manteleiwitten (core) of uit een de domeinen welke niet-structuureiwitten omvatten, met name NS-4 en NS-5, waarbij in tenminste één positie een niet-natuurlijk aminozuurrest is geïncorporeerd.

7. Peptide-preparaat met ten minste één lineair of 30 één vertakt peptide volgens de formule (peptide)-Y (peptide) 2X (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X 35 (peptide) 16X8X4X2X waarin Y een OH- of NH2-groep aan de carbonylgroep van het C-eindstandige aminozuur van (peptide) is en X een amino- 1 o ' - 82 - zuur of een aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot de vorming van peptide-binding, en het peptide-gedeelte, (peptide), specifiek immu-5 nologisch kan reageren met antilichamen tegen hepatitis C virus (HCV), waarbij dat peptide-gedeelte een peptide omvat dat in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 47 aminozuren van SEQ ID nr. 2 behoudt, dat immunologisch kan reageren met antilichamen tegen HCV NS-4 en dat de 10 volgende gesubstitueerde posities bevat: positie 1: asparagine, positie 2: glutamine, positie 3: arginine, positie 4: hydroxyproline, positie 5: serine of threonine, positie 12: norva-line of isoleucine, positie 15: ornithine, positie 15 22: aspartaat, positie 27: norvaline, positie 31: aspartaat, positie 39: asparagine, en positie 45: norvaline of valine.

8. Echter de reeds genoemde documenten WO-A-94/06826 en WO-A-95/00670 openbaren reeds (vertakte) peptiden die afkomstig zijn uit genoemde domeinen en waarbij tenminste één niet-natuurlijk aminozuur in de keten is geïncorporeerd (zie bijv. WO-A-94/06826, pagina 13).

8. Peptide-preparaat volgens conclusie 7, waarbij het peptide-gedeelte verder één of meer van de volgende 20 gesubstitueerde of gedegenereerde posities bevat: positie 6: Ile:Val in een verhouding van 6:4, positie 7: Ile:Val:Ala in een verhouding van 6:2:2, positie 10: Arg:Lys in een verhouding van 8:2, positie 16: Glu:Ala in een verhouding van 25 8:2, positie 19: aspartaat, positie 24: Ser:Ala in een verhouding van 4:6, positie 25: Gln:Ser in een verhouding van 4:6, positie 26: His:Lys:Arg in een verhouding van 8:1:1, positie 28: Pro:Ala in een verhouding van 8:2, positie 29: TyriLeu in een 30 verhouding van 8:2, positie 30: norleucine of nor valine, positie 32: Gln:Glu in een verhouding van 8:2, positie 34: Met:Gin in een verhouding van 8:2, positie 35: Met:Gln:Arg in een verhouding van 4:4:2, positie 36: Leu:Met:Ile in een verhouding 35 van 8:1:1, positie 40: Phe:Leu in een verhouding van 8:2, positie 42: Gln:Ser in een verhouding van 1. ur · - 83 - 8:2 en positie 44: Ala: lie in een verhouding van 8 :2 .

9. Het probleem dat aan deze oplossingsgroep ten grondslag ligt dient derhalve te worden geherdefinieerd tot de verschaffing van aanvullende peptiden die specifiek zijn voor de diagnose van hepatitis C (HCV) middels een immunologische bepaling, mengsels van deze peptiden, gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten, waarbij deze peptiden tenminste één niet-natuurlijk aminozuurrest bevatten.

9. Peptide-preparaat met ten minste één lineair of één vertakt peptide volgens de formule 5 (peptide)-Y (peptide) 2X (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X (peptide) 16X8X4X2X 10 waarbij Y een OH- of NH2-groep aan de carbonylgroep van het C-eindstandige aminozuur van (peptide) is en X een aminozuur of aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot het vormen van een peptide-binding, en het peptide-gedeelte, 15 (peptide), specifiek immunologisch kan reageren met anti-lichamen tegen hepatitis C virus (HCV), waarbij dat pepti-de-gedeelte een peptide omvat dat in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 44 aminozuren van SEQ ID nr. 1 behoudt, dat immunologisch kan reageren met antilichamen 20 tegen HCV-NS-5 en dat de volgende gesubstitueerde posities bevat: positie 2: ornithine, positie 10: norvaline, positie 17: glutamaat, positie 23: norvaline, positie 31:hydroxyproline en positie 37: hydroxyp-25 roline.

10. De vooronderzoeker is van mening dat, in het licht van de geciteerde stand van de techniek, waarin reeds soortgelijke oplossingen zijn geopenbaard, en in de kennelijke afwezigheid van een ander verbindend element, hetzij de activiteit betreffend hetzij van structurele aard, er geen eenheid van uitvinding bestaat tussen de diverse oplossingen zoals gedefinieerd in de conclusies 1 -20.

10 Ci1 · - 87 - positie 7: norleucine, positie 17: norleucine, positie 24: glutamaat, en positie 28: norvaline.

23. Peptide-preparaat volgens conclusie 22, waarbij dat peptide het peptide met SEQ ID nr. 51 is.

24. Peptide-preparaat volgens één van de conclu sies 21-23, waarbij dat peptide is geconjugeerd aan een drager.

25. Peptide-preparaat volgens één van de conclusies 21-23, waarbij dat peptide is gepolymeriseerd tot een 10 gepolymeriseerd peptide.

26. Peptide-preparaat volgens conclusie 25, waarbij dat gepolymeriseerde peptide wordt weergegeven met de formule: (peptide) 2X 15 (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X waarbij X een aminozuur of een aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot het vormen van een peptide-binding.

27. Werkwijze voor het detecteren van antilichamen tegen HCV of de diagnose van HCV-infectie bij een patiënt, waarbij men (i) een eerste peptide-preparaat verschaft dat één of meer peptiden of eiwitten met een conformatie-epitoop 25 van NS-3 omvat; (ii) een effectieve hoeveelheid van dat peptide-preparaat in contact brengt met een serum, weefsel, weef-selextract of een lichaamsvloeistof van de patiënt in aanwezigheid van of na behandeling met een effectieve 30 hoeveelheid van een tweede peptide-preparaat volgens één van de conclusies 21-26 in een immuno-assay gedurende een tijd die voldoende is om een complex te vormen tussen dat eerste peptide-preparaat en eventueel antilichaam in dat serum, dat weefsel, dat weefselextract of die lichaams- 35 vloeistof, (iii) en dat complex detecteert met behulp van een detectie-inrichting. 10 0? - 88 -

28. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij die immuno-assay een ELISA-assay, een sandwich assay of een PHA-assay is.

29. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij dat 5 eerste peptide-preparaat een peptide met een conformatie- epitoop van NS-3 omvat.

30. Werkwijze volgens conclusie 29, waarbij dat peptide wordt gekozen uit de groep die bestaat uit (i) peptide 4 (SEQ ID nr. 4); 10 (ii) een analoog peptide met een aminozuurse- quentie van een stam/isolaat van HCV in een gebied dat overeenkomt met dat peptide 4; (iii) een lineair peptide waarbij het C-eindstan-dige aminozuur van dat peptide een carbonzuur of carbon- 15 zuuramide is, waarbij dat peptide specifiek immunologisch kan reageren met antilichamen tegen hepatitis C virus (HCV), en waarbij dat peptide in hoofdzaak het skelet van de prototype-sequentie van 81 aminozuren van SEQ ID nr. 4 behoudt, dat immunologisch kan reageren met antilichamen 2 0 HCV NS-3 en dat de volgende gesubstitueerde of geregenereerde posities bevat: positie 3: norvaline, positie 7: norvaline of Val:Ala:Thr:Phe:Tyr:Nvl in een verhouding van 3:3:1:1:1:1, positie 8: valine of norvaline, 25 positie 16: norvaline, positie 20: arginine, positie 26: norleucine, positie 33: norleucine, positie 39: serine, positie 46: norvaline, positie 52: alanine, positie 60: serine, positie 63: norleucine, positie 68: serine, en positie 74: 30 norvaline; en (iv) één van de peptiden 5-21 (SEQ ID nr. 5-21) .

31. Peptide volgens conclusie 30, waarbij dat peptide is geconjugeerd aan een drager.

32. Peptide-preparaat volgens conclusie 30, 35 waarbij dat peptide is gepolymeriseerd tot een gepolymeri- seerd peptide. 10 ü . - 89 -

33. Peptide-preparaat volgens conclusie 32, waarbij dat gepolymeriseerde peptide wordt weergegeven met de formule: (peptide) 2X 5 (peptide) 4X2X (peptide) 8X4X2X waarbij X een aminozuur of een aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is tot het vormen van een peptide-binding.

34. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij dat eerste peptide-preparaat mengsel A, mengsel B, mengsel C, mengsel D of mengsel E omvat.

35. Werkwijze volgens conclusie 27, waarbij dat eerste peptide-preparaat mengsel E omvat.

36. Werkwijze volgens conclusie 34 of 35, waarbij die immuno-assay een ELISA-assay, een sandwich-assay of een PHA-assay is.

37. Kit voor de detectie van antilichamen tegen HCV of voor de diagnose van een HCV-infectie, met daarin 2. een eerste houder die er op is ingericht een peptide-preparaat met een conformatie-epitoop van NS-3 te bevatten en een tweede houder die er op is ingericht een monster-verdunningsmiddel met daarin het gesplitste peptide-preparaat volgens één van de conclusies 21-26 te bevatten.

38. Kit volgens conclusie 37, waarbij die kit een kit voor een ELISA-assay, een sandwich-assay of een PHA-assay is.

39. ELISA-testkit voor de detectie van antilichamen tegen HCV of de diagnose van een HCV-infect ie met 30 daarin (a) een vaste fase die is bekleed met het peptide-preparaat volgens conclusie 13 of 14; en (b) monsterverdunningsmiddel met daarin het peptide-preparaat volgens één van de conclusies 21-26 in 35 oplosbare vorm.

40. ELISA-test kit volgens conclusie 39, met daarin bovendien 10 o:' - 90 - (c) een negatief controlemonster; (d) een positief controlemonster; en (e) antilichamen tegen menselijk IgG, welke antilichamen zijn gemerkt met een signalerend molecuul.

41. ELISA-test kit volgens conclusie 39 of 40, waarbij dat peptide-preparaat peptide 51 (SEQ ID nr. 51) omvat.

42. Gebruik van een gesplitst peptide-preparaat volgens één van de conclusies 21-26 in een immuno-assay 10 voor de detectie van antilichamen tegen HCV of de diagnose van HCV-infectie. o-o-o-o 1. v': Jp) N0133441 OPMERKING Hoewel conclusie 15 een diagnostische methode aan/in het lichaam omvat is het vooronderzoek uitgevoerd en gericht op het veronderstelde effect van de samenstellingen. Annex bij aanvullingsblad B.N0133441 1 )Bij eerste beoordeling liggen aan de onderhavige aanvrage twee problemen ten grondslag: —I)het verschaffen van (al dan niet vertakte) peptiden die specifiek zijn voor de diagnose van hepatitis C (HCV) middels een immuologische bepaling, mengsels van deze peptiden, gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten; —Il)het verschaffen van (al dan niet vertakte) gesplitste (eng: spliced) peptiden die kunnen worden toegepast voor het blokkeren van niet-specifieke reactiviteit van conformatie-epitopen van NS-3 middels een immuologische bepaling, gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten.

10. Peptide-preparaat volgens conclusie 9, waarbij het peptide-gedeelte verder één of meer van de volgende gesubstitueerde of gedegenereerde posities bevat: positie 8: Pro:Leu:Val in een verhouding van 30 8:1:1, positie 12: Thr:Ser:Pro in een verhouding van 5:4:1, positie 15: Lys:Asp:Arg in een verhouding van 4:4:2, positie 19: Glu:Val:Gln in een verhouding van 5:4:1, positie 21: Pro-.Ala in een verhouding van 9:1, positie 22: Val:Thr in een 35 verhouding van 8:2, positie 24: His:Leu:Ala in een verhouding van 8:1:1, positie 27: Pro:Ala in een verhouding van 8:2, positie 30: Pro:Ser in een 1 0 Ïj : - 84 - verhouding van 9:1, positie 32: Lys:Pro:Arg in een verhouding van 8:1:1, positie 33: Ser:Ala:Lys:Gin in een verhouding van 4:4:1:1, positie 34: Pro:Thr in een verhouding van 8:2, positie 36:

10 C-eindstandige aminozuur van (peptide) is en X een amino zuur of aminozuuranalogon met twee aminogroepen en één carboxylgroep is, waarbij elke groep in staat is een peptide-binding te vormen, en het peptide-gedeelte, (peptide), specifiek in 15 staat is immunologisch met antilichamen tegen hepatitis C virus (HCV) te reageren en een aminozuursequentie omvat die gekozen is uit de groep bestaande uit SEQ ID nr. 37-47.

11. Echter rekening houdend met het gewenste evenwicht tussen de zoekinspanning en de betaalde dan wel aanvullend te betalen taxen heeft de vooronderzoeker de diverse oplossingen gehergroepeerd op basis van structurele verwantschap, d.w.z naar afkomst van domein hetgeen heeft geleid tot de onderwerpen l-lll zoals hieronder aangegeven. I. Onderwerp hconclusies 1-4 en 13-20 (alle gedeeltelijk) en conclusies 5 en 6 (geheel) Peptiden uit het domein van de structuureiwitten (SEQ ID Nrs. 37 en 38 alsmede daarvan afgeleide peptiden), mengsels van deze peptiden, gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten. II. t.Qnderwerp ll:conclusies 1-4 en 13-20 (alle gedeeltelijk) en conclusies 7,8 en 11 (geheel) Peptiden uit het domein NS-4 (SEQ ID Nrs. 39-44 en 46 alsmede daarvan afgeleide peptiden), mengsels van deze peptiden, gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten. III. Onderwerp III.-conclusies 1-4 en 13-20 (alle gedeeltelijk) en conclusies 9,10 en 12 (geheel) Peptiden uit het domein NS-5 (SEQ ID Nrs. 45 en 47 alsmede daarvan afgeleide peptiden), mengsels van deze peptiden, gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten. IV. Qnderwerp IV:conclusies 21-42 (geheel) Gesplitste peptiden uit het domein NS-3 (SEQ ID Nrs. 48-51 alsmede daarvan afgeleide peptiden), gebruik er van alsmede kits die deze peptiden bevatten.