KR930004055B1 - 펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

펩티드 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR930004055B1
KR930004055B1 KR1019910003768A KR910003768A KR930004055B1 KR 930004055 B1 KR930004055 B1 KR 930004055B1 KR 1019910003768 A KR1019910003768 A KR 1019910003768A KR 910003768 A KR910003768 A KR 910003768A KR 930004055 B1 KR930004055 B1 KR 930004055B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lys
peptide
arg
glu
seq
Prior art date
Application number
KR1019910003768A
Other languages
English (en)
Other versions
KR910016769A (ko
Inventor
데루까쓰 아리마
교오꼬 야마다
다다시 하따나까
도시히꼬 남바
마사오 쓰지
Original Assignee
가부시끼가이샤 구라레
나까무라 히사오
데루까쓰 아리마
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시끼가이샤 구라레, 나까무라 히사오, 데루까쓰 아리마 filed Critical 가부시끼가이샤 구라레
Publication of KR910016769A publication Critical patent/KR910016769A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR930004055B1 publication Critical patent/KR930004055B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

펩티드 및 그의 용도
제1도는 실시예 1에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제2도는 실시예 2에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제3도는 참고예 1에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제4도는 참고예 2에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제5도는 참고예 3에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제6도는 실시예 3에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제7도는 실시예 4에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제8도는 실시예 5에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제9도는 참고예 4에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제10도는 참고예 5에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제11도는 참고예 6에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제12도는 실시예 6에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제13도는 실시예 7에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제14도는 실시예 8에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
제15도는 참고예 7에서 얻어진 펩티드를 사용해서 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정한 각 혈청검체의 OD492값 분포도이다.
그리고, 이들 도면에 있어서, 각 기호는 다음과 같다.
●:GPT〉200 IU ; HBsAg ; (-) 혈청 A의 OD492값
○:GPT〉200 IU ; HBsAg ; (-) 혈청 B의 OD492값
×:GPT〉200 IU ; HBsAg ; (-) 혈청 C의 OD492값
본 발명은 펩티드 및 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 의해서 제공되는 펩티드는 비 A 비 B형 간염 관련 항원(이하, 이것을 HCV 관련 항원이라 약칭함)에 특이성을 갖는 항체(이하, 이것을 항 HCV 항체라 약칭한다)와 고도로 특이적으로 결합하는 능력을 가지므로, 항 HCV 항체의 측정에 이용할 수 있다.
본 발명에 의해서 제공되는 항 HCV 항체의 측정시약은 혈청 또는 혈장중에 항 HCV 항체를 고감도로 검출하는 능력을 가지고 있으며, 항 HCV 항체의 측정에 유용하다.
간질환의 대부분을 차지하는 바이러스성 간염의 병인 바이러스로서는 현재 5종류가 알려지고 있으며, 각각 A형, B형, C형, D형, E형 간염 바이러스라 불리우고 있다. 바이러스성 간염중에서도 A형 간염 및 E형 간염은 경구 감염이며, 일과성 감염만으로 만성화하는 일은 없지만, B형 간염 및 C형 간염은 지속 감염에 의해 만성화하고, 높은 확률로 간경변 또는 간암으로 이향하기 때문에, 커다란 문제로 되어 있다. A형 간염, B형 간염 및 D형 간염에 대해서는 그들의 원인 바이러스가 발견되었으며, 현재로서는 면역학적인 진단이 가능해지고 있다. E형 간염 바이러스에 대해서도 최근 유전자가 단리되었다는 보고가 있다. 수혈 후 비 A비 B형 간염(이하, 이것을 PTNANBH라 약칭한다)의 병인 바이러스에 대해서는 많은 연구자에 의한 연구에도 불구하고 오랫동안 밝혀지지 않았으나, 1988년에 미국의 카이론사(Chiron Corporation)의 연구그룹에 의해서, PTNANBH에 감염시킨 침팬지의 혈장에서 PTNANBH 바이러스의 유전자의 단리, 동정이 이루어져[Science 제244권 제359페이지(1988) 및 Science 제244권 제362페이지(1988년)참조], C형 간염 바이러스(이하, 이것을 HCV라 약칭함)이라 명명되었다. 그 유전자의 염기 배열이라 추정되는 것의 일부는 이미 명확해지고 있으며[유럽 특허 제 0318216호 명세서 참조], 항 HCV 항체의 검출이 가능하게 되었고, HCV 감염에 대해서는 혈청학적 진단이 가능하게 되었다.
또, 본 발명자들중 한 사람을 포함한 몇 사람에 의해서 PTNANBH의 원인이 되는 바이러스의 유전자로 추정되는 리보헥산이 PTNANBH 환자의 혈청에서 단리되어, 동정되었다는 것이 보고되고 있다[Gastroenterologia Japonica 제24권, 제5호 제540페이지(1989년):Gastroenterologia Japonica 제24권, 제5호 제545페이지(1989년): 및 내과 제64권 제6호 제1022페이지(1989) 참조].
지금까지 cDNA 라이브러리로부터의 필요한 cDNA의 스크리닝의 수단으로서, λ파아지를 이용한 항원항체 반응에 의해서 항 HCV 항체의 양성 또는 음성의 판정을 행하는 것이 일반적으로 행하여져 왔으나, 상기한 면역 스크리닝법은 정량성이 없고, 대장균의 발현산물중의 비특이한 항원성분과의 반응이 일어나는 경우가 있으며, 현재 HCV이 유전자를 클로닝하고, 파아지에 조입해서 효모를 숙주로하여 발현시킨 항원단백을 사용하여 행하는 효소면역 측정법에 의한 항 HCV 항체의 검사약의 개발이 검토되고 있다[내과 제64권, 제6호 제1027페이지 1989년) 참조]. 또한, 바이러스 또는 그의 항원성분에 의해서 감작된 젤라틴 입자가 항 바이러스 항체 존재하에서 응집하는 성질을 이용한 입자 응집법 또는 효소면역측정을 바이러스 또는 그의 항원성분으로 코팅된 비이드를 사용해서 행하는 비이드법의 개발이 진행되고 있다.
HCV 관련 항원을 이용한 지금까지의 효소면역측정법에서는, 측정대상이 임상적으로 PTNANBH라 진단된 경우에 있어서도 항 HCV 항체양성률은 약 75%이며, 항 HCV 항체에 음성인 PTNANBH가 약 25%의 비율로 함유되어 있다. 또 상기한 효소면역측정법에서 측정대상이 건강하고 정상적인 사람인 경우에는 양성률이 약 1%이며, 통계학적인 HCV 만연률이 약 3%라는데서 약 2%의 항 HCV 항체양성검체를 보고도 놓치고 있다. 이로 인해서 헌혈자로서의 HCV 캐리어 스크리닝에 있어서는, 캐리어를 보고도 놓치는 것을 피할 수 없으며, 비 A 비 B형 간염 바이러스 감염 혈액의 수혈을 저지하는 비율이 반드시 높지는 않다. 한편, HCV의 유전자를 클로닝하고, 파아지에 조입해서 효모를 숙주로 하여 발현시킨 항원 단백은 비특이한 여러가지의 항원 성분을 함유하고 있으므로, 그의 항원 단백은 비특이한 여러가지의 항원 성분을 함유하고 있으므로, 그의 항원 단백을 시약으로서 사용하여 항 HCV 항체의 측정을 행할 경우에는, 그 시약이 시료중의 항 HCV 항체 이외의 다른 비특이한 항체 성분마저도 인식하는 것으로 되며, 측정 결과는 반드시 항 HCV 항체의 존재를 정확하게 나타내고 있다고 말할 수 없다. 이와 같이 HCV 관련 항원을 이용한 지금까지의 효소 면역측정법에 의하면, 항 HCV 항체의 존재를 정확하게 알 수 없는 것이 현재의 상황이다.
본 발명의 하나의 목적은 항 HCV 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 항 HCV 항체의 측정시약을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, PTNANBH 관련 유전자에 코팅되는 폴리펩티드에서 선택된 단편 중에서, 비 A 비 B형 간염 관련 항원에 대한 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 특정의 펩티드를 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 의하면, 상기한 목적은 LyS Arg Ser Thr Asn(배열번호:2), Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4), 또는 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:6)의 아미노산 배열을 함유한, HCV 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 제공함으로써 달성된다.
구체적으로는, (Ⅰ) 식(1) : Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys(배열번호:1)로서 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로된 펩티드로서, 그 펩티드가 Lys Arg Ser Thr Asn(배열번호:2)의 아미노산 배열을 가지며, HCV 관련항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드, (Ⅱ) 식 (2):Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn Asp Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg(배열번호:3)으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로 된 펩티드이며, 그 펩티드가 Arg Arg Thr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4)의 아미노산 배열을 가지며, HCV 관련 항원에 대한 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드, (Ⅲ) 식 (3):Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met(비열번호:5)로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로된 펩티드로서 그 펩티드가 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:6)의 아미노산 배열을 가지며, HCV 관련 항원에 대한 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드이다.
또, 상기한 펩티드로서 된 항 HCV 항체의 측정시약을 제공함으로써 달성된다.
본 명세서에 있어서는 각종 아미노산 잔기를 다음의 약호로서 기술한다.
Ala:L-알라닌 잔기 Arg:L-아르기닌 잔기
Asn:L-아스파라긴 잔기 Asp:L-아스파르트산 잔기
Cys:L-시스틴 잔기 Gln:L-글루타민 잔기
Glu:L-글루탐산 잔기 Gly:글리신 잔기
His:L-히스티딘 잔기 Ile:L-이소로이신 잔기
Leu:L-로이신 잔기 Lys:L-리진 잔기
Met:L-메티오닌 잔기 Phe:L-페닐알라닌 잔기
Pro:L-프롤린 잔기 Ser:L-세린 잔기
Thr:L-트레오닌 잔기 Trp::-트립토판 잔기
Tyr:L-티로신 잔기 Val:L-발린 잔기
본 명세서에 있어서는, 통상의 방법에 따라서 아미노산 배열을 N 말단의 아미노산 잔기가 왼쪽에 위치하고, C말단의 아미노산 잔기가 오른쪽에 위치하도록 기술한다.
본 발명의 펩티드는 HCV 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드이며, 펩티드중에 적어도 1Ys Arg Ser Thr Asn(배열번호:2), Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4), 또는 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:6)의 아미노산 배열을 가지고 있는 것이다.
이들의 부분적 아미노산 배열중, 특히 Lys Arg Ser Thr Asn의 배열(배열 번호:2)를 갖는 펩티드는 항원성이 높고, HCV 관련 항원에 특이성을 갖는 항체의 측정에 있어서 바람직하게 사용된다.
본 발명의 펩티드는 전기한 부분적 아미노산 배열을 갖는 것이라면, 특히 제한되는 것은 아니지만, 통상 10~40개의 아미노산으로 된 펩티드이다.
구체적으로는 다음과 같은 펩티드 또는 그의 단편으로 된 펩티드를 들 수 있다. 즉, 본 발명의 펩티드로서는, 전기한 식(Ⅰ)로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로 된 펩티드로서, 그 펩티드가 Lys Arg Ser Thr Asn(배열번호:2)의 아미노산 배열을 가지며, HCV 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 여기서 단편으로 된 펩티드로서는, 예를들면 식(1-a)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식 (1-a):
Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser(배열번호:7)
또, 본 발명의 펩티드로서는 전기한 식(2)로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로된 펩티드로서, 그 펩티드가 Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4)의 아미노산 배열을 가지며, HCV 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 여기서 단편으로 된 펩티드로서는 예를 들면 식(2-a), 식(2-b) 및 식(2-c)가 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
식 (2-a):
Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg(배열번호:8)
식 (2-b):
Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:9)
식 (2-c):
Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala(배열번호:10)
또, 본 발명의 펩티드로서는 전기한 식(3)에서 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로된 펩티드로서, 그 펩티드가 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:6)의 아미노산 배열을 가지며, HCV 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 따라서 단편으로 된 펩티드로서는, 예를들면 식(3-a), 식(3-b) 및 식(3-c)가 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
식 (3-a):
Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met (배열번호:11)
식 (3-b)
Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:12)
식 (3-c)
Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:13)
본 발명의 펩티드로는 전기한 바와같이 여러가지의 것을 예시할 수 있지만, 바람직하게는 반응의 특이성의 점에서 식(1-a)의 펩티드를 들 수 있다. 본 발명의 펩티드는 이와같은 HCV 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것이다.
본 발명의 펩티드의 합성은 펩티드의 합성에 있어서 통상 사용되는 방법, 예를들면 고상 합성법, 또는 단계적 신장법, 프래그먼트 축합법과 같은 액상 합성법에 의해 행하여지지만, 고상 합성법에 의해 행하는 것이 조작상 간편하다[예를 들면, Journal of the American Chemical Society, 제85권, 제2149~2154페이지:일본 생화학회편「생화학 실험 강좌 1 단백질의 화학 Ⅳ 화학수식과 펩티드 합성」(소화 52년 11월 15일 가부시끼가이샤 도오꾜 화학 동인 발행), 제207~495페이지; 일본 생화학회편「속 생화학 실험 강좌 2단백질의 화학(하)」(소화 62년 5월 20일 가부시끼가이샤 도오꾜 화학 동인 발행), 제641~694페이지 참조].
본 발명의 펩티드의 고상 합성법에 의한 제조는, 예를들면 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 등의 반응 용매에 불용성인 중합체에, 목적으로 하는 펩티드의 C말단에 대응하는 아미노산 또는 그의 아미드를 그들이 갖는 α-COOH기 또는 α-CONH2기에서 각각 수소원자를 제외하고 얻어지는 α-COO-기 또는 α-CONH-기를 개재시켜 결합시키고, 이어서 그 아미노산 또는 그 아미드에 목적으로 하는 펩티드의 N말단의 방향을 향해서, 대응하는 아미노산 또는 펩티드 그 아미노산 또는 단편이 갖는 α-COOH기 이외의 α-아미노기 등의 관능기를 보호한 다음 축합시켜 결합시키는 조작과, 그 결합한 아미노산 또는 펩티드 단편에 있어서의 α-아미노기 등의 펩티드 결합을 형성하는 아미노기가 갖는 보호기를 제거하는 조작을 순차 반복함으로써, 펩티드 사슬을 신장시키고, 목적을 하는 펩티드에 대응하는 펩티드 사슬을 형성하고, 이어서 그 펩티드 사슬을 중합체에서 탈리시키고, 또한 보호되고 있는 관능기에서 보호기를 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드를 얻고, 이어서 이것을 정제함으로써 실시된다. 여기서, 펩티드 사슬의 중합체로부터의 탈리 및 보호기의 제거는 불화 수소를 사용해서 동시에 행하는 것이 부반응을 억제하는 관점에서 바람직하다. 또, 얻어진 펩티드의 정제는 역상 액체 크로마토그래피로 행하는 것이 효과적이다.
본 발명의 펩티드는 특이적으로 항 HCV 항체를 결합하는 능력을 가지므로, HCV 감염에 의해 출현하는 항 HCV 항체의 검출을 위한 측정시약으로서 유효하다.
즉, 본 발명의 측정시약은 본 발명의 펩티드를 함유하여 된 것이며, 전기한 바와같이 본 발명의 펩티드를 단독으로 또는 2종 이상을 혼합해서 사용된다.
본 발명의 펩티드를 이용한 항 HCV 항체의 측정은 형광면역측정법, 수신혈구 응집법, 방사면역측정법, 효소면역측정법의 어느것을 이용함으로써 행하여진다. 이들의 방법은 어느 것이나 공지이지만, 예를들어 효소면적측정법을 이용하는 경우에 대해서 이하에 설명하겠다.
측정계 전체의 구성요소는 담체, 측정시약으로서의 본 발명의 펩티드, 블록킹제, 피검시료, 표시용 항체, 효소 및 발색제로서 된다. 담체에 본 발명의 펩티드를 코팅하고, 이어서 펩티드 코팅 담체에 블록킹제를 작용시켜서 담체상의 비특이적인 담백결합 부위를 블록하고, 펩티드 코팅 담체에 피검시료를 가하여 인큐베이트하고, 계속해서 효소 표시 항체를 접촉시켜 인큐베이트하고, 다음에 이와같이 처리한 담체에 발색제를 가하여 인큐베이트하고, 효소와 발색제와의 반응의 반응 산물의 생성량을 흡광도계를 사용하여 측정한다. 그리고, 코팅에 사용되는 본 발명의 펩티드는 1종류이거나 2종류 이상이더라도 좋다. 담체로서는 효소면역검정용 컵, 또는 유리 또는 수지제의 비이드를 사용하는 것이 바람직하다. 측정에 앞서서, 본 발명의 펩티드를 0.01M 탄산 완충액에 용해하고, 그 용액을 예를들면 폴리스티렌계 효소면역검정용 컵에 가한 다음, 4℃로 하룻밤 또는 실온에서 3시간 정치함으로서, 담체 표면은 본 발명의 펩티드에 의해서 코팅된다. 담체상의 비특이적인 단백 결합 부위를 블록하기 위한 블록킹제로서는, 예를들면 소혈청 알부민, 카제인, 탈비분유, 항사람 IgG 항체 또는 항 사람 IgM 항체를 얻기 위한 면역원 동물의 혈청, 젤라틴 등이 사용된다. 표시용 항체로서는, 예를들면 항사람 IgG 항체, 항사람 IgM항체등의 사용된다. 또 효소로서는, 예를들면 알칼리 포스파타아제, 글루코오스옥시다아제, 퍼옥시다아제, 베타갈락토시다아제 등을 들 수 있다. 측정에 앞서서, 글루타르알데히드 등의 2개 이상의 관능기를 갖는 화학물을 사용해서, 표시용항체에 효소를 결합시켜서 콘쥬게이트하고, 측정계 전체의 구성요소의 일부로서 이미 준비해 두는 것이 바람직하다. 발색제는 선택한 효소에 따라서 적당히 사용하면 좋다. 예를들면, 효소로서 퍼옥시다아제를 선택한 경우에는 o-페닐렌디아민 등을 사용하는 것이 바람직하다.
이와같이 본 발명에 의하면, 항 HCV 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드가 제공된다. 이 펩티드에 의해 기존의 항 HCV 항체 측정 시약을 상회하는 감도 및 특이성을 갖는 항 HCV 항체 측정시약을 제공하는 것이 가능해졌다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
식(1):Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Ar Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys (배열번호:1)로 나타내는 펩티드를 자동합성 장치[미국 Applid Bio Systems 사제, Model 431A]를 사용해서 고상 합성법에 의해 합성하였다.
즉, 4-[Nα-(t-부톡시카르보닐)-Nε-(2-클로로벤질옥시카르보닐)-L-리딜옥시메틸]페닐아세틸아미드메틸기:
Figure kpo00001
를 0.65밀리몰/g(수지)의 비율로 갖는 스티렌-디비닐벤젠 공중합체[스티렌과 디비닐벤젠과 구성몰비:99:1]로서 된 입상 수지[미국 Applied Bio Systems사제, PAM 리진(Lysine), t-Boc-L-Lys(Cl-Z)]를 760mg 사용하고 이것에 표 1에 나타낸 일련의 조작에 따라서 목적하는 펩티드의 N말단의 방향을 향해서 대응하는 L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, L-리진, L-세린, L-트레오닌을 순차 결합시켰다. 축합반응에 있어서, 상기한 아미노산은 각각 Nα-(t-부톡시카르보닐)-Nγ-(메시틸렌-2-술포닐)-L-아르기닌, N-(t-부톡시카르보닐)-L-아스파라긴, N-(t-부톡시카르보닐)L-아스파르트산-β-벤질에스테르, M-(t-부톡시카르보닐)-L-글루타민, N-(t-부톡시카르보닐)-L-글루탐산-γ-벤질에스테르, Nα-(t-부톡시카르보닐)-Nε-(2-클로로벤질옥시카르보닐)-L-리진, N-(t-부톡시카르보닐)-o-벤질-L-세린, N-(t-부톡시카르보닐)-O-벤질-L-트레오닌으로서 사용하고, 그들의 사용량은 기질에 대해서 약 4배 몰량으로 하였다. 축합반응은 실온하에서 행하였다. 아미노산 1잔기를 결합시키기 위하여 소요된 전공정을 포함한 반응시간은 100~110분간의 범위내였다. 모든 아미노산에 대해서는의 반응조작이 종료한 다음, 얻어진 수지를 글라스필터상에서 디클로로메탄 및 메탄올을 사용하여 순차 세척하고, 이어서 진공건조함으로써 2.58g의 건조수지를 얻었다. 다음에 폴리트리플루오로모노클로로에틸렌제의 반응용기(가부시끼가이샤 펩티드 연구소제, HF-반응장치 Ⅰ형)중에서, 얻어진 건조수지 0.7g을 아니솔 1.05ml 및 에틸메틸술피드 0.175ml과 혼합하고, 이 혼합물에 -20℃ 온도로 불화수소 7.0ml을 가하여, 같은 온도에서 30분간, 이어서 0℃의 온도에서 30분간 교반하였다. 얻어진 반응 혼합물에서 불화수소, 아니솔 및 에틸메틸술피드를 감압하에 제거하고, 잔류물을 글라스필터상에서 디에틸에테르 및 디클로로메탄을 사용하여 충분히 세척하였다. 얻어진 그 잔류물을 2N초산 수용액으로 추출하고, 추출액을 동결건조함으로써 조 펩티드 200mg을 얻었다. 얻어진 조 생성물을 분취용 역상 고속 액체크로마토그래피[컬럼:옥타데실화 실리카겔(입경:15μm) 충전 컬럼(내경:50mm, 길이:300mm), 닛뽕워터즈사제, μBONDASPHERE 15μ C18-100; 이동상:트리플루오로초산을 0.05% 함유하는 아세토니트릴과 물과의 혼합용매(아세토니트릴의 농도는 30분간에 걸쳐 10용량%에서 20용량%가 되도록 점차 변화시켰다); 유속 5ml분; 검출법:파장 210nm에 있어서의 흡광도]로 정제함으로써, 목적으로 하는 펩티드 정제물을 80mg 얻었다. 얻어진 정제물을 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피[컬럼:옥타데실화 실리카겔(입경:5μm) 충전 컬럼(내경:4mm, 길이:150mm), 도오요소오다 가부시끼가이샤제, TSK-gel ODS-8TM; 이동상:트리플루오로초산을 0.05용량% 함유하는 아세토니트릴과 물과의 혼합용매(아세토니트릴의 농도는 30분간에 걸쳐서 5용량%에서 50용량%가 되도록 점차 변화시켰다): 유속:1m: /분; 검출법; 파장 210nm에 있어서의 흡광도]한 결과, 15.0분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. 고속원자충격법(이하, 이것을 FAB법이라 약칭함) 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 정제물의 분자량은 3188였다(이론치:3187.53).
[표 1]
Figure kpo00002
[실시예 2]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (1-a):Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser(배열번호:7)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 14.2분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1243였다(이론치:1243.33).
[실시예 3]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상합성 및 정제를 행함으로써, 식 (2-a); Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg(배열번호:8)로 나타내는 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 22.0분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 2542였다(이론치:2541.85).
[실시예 4]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (2-b); Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:9)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 14.3분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1758이었다(이론치:1758.01).
[실시예 5]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (2-c):Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala(배열번호:10)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 14.5분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1306이었다(이론치:1306.49).
[실시예 6]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (3-a):Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser gLn His Leu Pro Tyr Ile Glu Glu Gly Met Met(배열번호:11)으로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 29.8분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 3785였다(이론치:3785.19).
[실시예 7]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (3-b):Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:12)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 28.7분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1953이었다(이론치:1953.15).
[실시예 8]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (3-c):Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:13)으로 나타내는 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 26.9분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1203이었다(이론치:1203.34).
[참고예 1]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (1)에서 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드중, Lys Arg Ser Thr Asn (배열번호:2)로 나타낸 아미노산 배열을 갖지 않는 식:Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys(배열번호:14)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 11.9분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1290이었다(이론치:1290.39).
[참고예 2]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상합성 및 정제를 행함으로써, 식(1)에서 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드중, Lys Arg Ser Thr Asn(배열번호:2)로 나타낸 아미노산 배열을 갖지 않는 식:Arg Ser Thr Asn Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys(배열번호:15)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 13.6분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1915이었다(이론치:1915.16).
[참고예 3]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식:Glu Gln Asp Gln Ile Lys Thr Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys(배열번호:16)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 펩티드를 분석용 역상 고체 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 24.6분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 4031이었다(이론치:4031.38).
[참고예 4]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (2)에서 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드중, Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4)로 나타낸 아미노산 배열을 갖지 않는 식:Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Ala Glu Asn Asp(배열번호:17)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고체 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 14.9분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1473이었다(이론치:1473.47).
[참고에 5]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식 (2)에서 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드중, Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4)로 나타낸 아미노산 배열을 갖지 않는 식:Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg(배열번호:18)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 12.6분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1253이었다(이론치:1253.38).
[참고예 6]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로서, 식(2)에서 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드중, Arg Arg Tyr Lys Glu Lys glu Lys(배열번호:4)로 나타낸 아미노산 배열을 갖지 않은 식:Val Gly Arg Ile Lys Asn Trp Asn Arg Glu Gly Arg Lys Asp Ala Tyr Gln Ile Arg Lys Arg(배열번호:19)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 19.4분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 2644이였다(이론치:2643.92).
[참고예 7]
실시예 1에 있어서와 마찬가지인 방법으로 펩티드의 고상 합성 및 정제를 행함으로써, 식(3)에서 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드중, Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:6)으로 나타낸 아미노산 배열을 갖지 않은 식:Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile(배열번호:20)로 나타낸 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드를 분석용 역상 고속 액체 크로마토그래피(전기와 같음)한 결과, 26.7분에 단일의 날카로운 피이크가 나타났다. FAB법 매스 스펙트럼에 의해 구하여진 펩티드의 분자량은 1081이었다(이론치:1081.20).
[참고예 8]
피검시료
GPT〉200 IU; HBsHg(-)혈청:65검체
정상사람 혈청:10검체
효소면역 측정법에 의한 검정
각 혈청검체에 대해서, 하기의 효소면역 측정법에 의해 항 HCV 항체의 유무를 검정하였다.
즉, 본 발명자들읜 한 사람을 포함한 몇 사람에 의해서 단리된 리보 헥산에서 클론화된 #8클론, #14클론 및 #18클론을 갖는 파아지 λ gtll를 함유한 용액 100μl에 대장균 Y 1090주(Escherichia Coli Y 1090)을 지지균으로서 혼합한 다음, 37℃로 15분간 인큐베이트하고, 파아지를 대장균에 감염시켰다. 계속해서, 50μg/ml의 암피실린을 함유하는 한천배지에 상기한 혼합액을 식균하고, 43℃에서 3시간 배양하였다. 다음에, 10mM의 IPTG수용액에 2시간 침지한 다음, 바람으로 건조하여 얻어진 니트로셀룰로우스막을 상기한 한천배지위에 놓고, 37℃에서 3시간 인큐베이트하였다. 이렇게 얻어진 니트로셀룰로우스막을 150mM NaCl을 함유하는 10mM 트리스 염산(pH7.5)(이하, 이것을 TS Buffer라 약칭함)으로 3회 세척하고, 이어서, 500mM NaCl 및 3% 젤라틴을 함유하는 20mM 트리스염산(pH 7.5)중에서, 실온으로 하룻밤 진탕하여 막위의 비특이적인 단백결합 부위를 블록하였다. 계속해서, TS 버퍼중에서 2분간 진탕하여 막을 세척하였다. 혈청검체를 1% 젤라틴을 함유하는 TS 버퍼로 희석하여 얻어진 용액중에, 상기에서 얻어진 니트로셀룰로우스막을 침지하고, 실온에서 3시간 진탕하였다. 이렇게 얻어진 니트로셀룰로우스막을 0.05% 트윈 20을 함유하는 TS 버퍼(이하, 이것을 TS-T Buffer라 약칭함)중에서, 실온으로 5분간 진탕하고, 이 조작을 5회 반복하였다. 계속해서 염소항 사람 IgG항체-퍼옥시다아제 콘쥬게이트(1% 젤라틴을 함유하는 TS 버퍼로 매우 적합한 농도로 희석한것)중에 니트로셀룰로우스막을 침지하고, 실온에서 1.5시간 진탕하였다. 이렇게 얻어진 니트로셀룰로우스막을 TS-T 버퍼중에서 실온에서 5분간 진탕하고, 이 조작을 5회 반복하였다. 다음에 0.05% HRP-Color(Bio-Rad Laboratories 제품), 0.05% H2O2, 17% 메탄올을 함유하는 TS 버퍼로 니트로셀룰로우스막을 진탕하고, 발색 반응을 행한 다음, 증류수중에서 실온에서 5분간 진탕하고, 이 조작을 5회 반복하였다. 바람에 건조한 후, 발색의 유무에 의해 사용한 혈청중의 항 HCV 항체의 유무를 검정하였다.
그리고, #8클론의 염기배열(배열번호:21)은 다음과 같다.
Figure kpo00003
#14 클론의 염기배열(배열번호:22)는 다음과 같다.
Figure kpo00004
#18 클론의 염기배열(배열번호:23)는 다음과 같다.
Figure kpo00005
결과
검정결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과에서 피검시료인 GPT〉200 IU; HBsHg(-)혈청 65검체는 3군으로 분류될 수 있다는 것을 알았다. 즉, #14클론 및 #18클론의 2개에 있어서 양성으로 판정된 A군, #8클론, #14클론 및 #18클론의 3개에 있어서 양성으로 판정된 군 B 및 #8클론, #14클론 및 #18클론의 어느것에 있어서도 음성으로 판정된 군 C의 군이다.
[표 2]
Figure kpo00006
[실시예 9]
피검시료
참고예 8의 결과로 분류된 각 혈청을 사용하였다.
GPT〉200IU; HBsAg(-):혈청 A:30검체
GPT〉200IU; HBsAg(-):혈청 B:15검체
GPT〉200IU; HBsAg(-):혈청 C:20검체
정상사람 혈청 D:10검체
효소면역측정법에 의한 검정
각 혈청검체에 대해서, 하기의 효소면역측정법에 의해 흡광도를 측정하고, 항 HCV 항체의 유무를 검정하였다.
즉, 항원물질로서 실시예 1, 실시예 2, 참고예 1, 참고예 2 및 참고예 3에서 얻어진 펩티드를 각 0.01M 탄산완충액(pH 9.5)에 용해하고, 얻어진 펩티드 용액을 폴르스티렌제 효소면역검정용 컵(Dynatech Laboratories Incorporation 제품)에 각 100μl씩 가한 다음, 4℃에서 12시간 정치함으로써, 펩티드에 의한 코팅을 행하였다. 이어서, 얻어진 검정용 컵에 함유된 펩티드 용액을 제거한 다음, 각각의 컵에 20용량%의 정상 염소 혈청을 함유하는 0.01M인산 완충 생리식염수(이하, 이를 PBS라 약칭함) 150μl을 가하여 실온에서 3시간 정치하고, 비특이적인 단백질결합 부위를 블록하였다. 이어서, 볼록킹에 사용한 20용량%의 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS를 제거한 다음, 각 검정용 컵을 건조시켰다.
혈청 희석용 용액으로서 10용량%의 정상염소 혈청을 함유하는 PBS를 상기한 각 검정용 컵에 100μl씩 가한 다음, 각 피검혈청(GPT〉200IU; HBsAG(-) 혈청 A 30, 검체, GPT〉200IU; HBsAg(-) 혈청 B 15검체, GPT〉200IU; HBSAg(-) 혈청 C 20 검체 및 정상 사람혈청 D 10 검체)를 혈청 희석용 용액과 피검혈청의 비율이 20대1(용량비)로 되도록 가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 각각의 컵을 0.05용량%의 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다.
얻어진 각 검정용 컵에 염소항사람 IgG 항체-퍼옥시다아제 콘쥬게이트(10용량%의 정상 염소혈청을 함유하는 PBS로 제일 적당한 농도로 희석한 것) 100μl을 가하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 각각의 컵을 0.05용량%의 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 계속해서, 얻어진 각 검정용 컵에 발색제(o-페닐렌디아민을 0.3중량%로 되도록 0.02용량%의 과산화수소를 함유하는 0.1M 시트르산-인산 완충액 pH 5.6에 용해한 것) 100μl를 가하였다. 실온에서 15분간 정치한 다음, 2N 황산 100μl을 가하여 반응을 정지하고, 반응액의 492nm의 흡광도 OD492값을 측정하였다.
[결과]
측정결과를 표 3, 표 4, 표 5 및 표 6에 나타내었다. 표 3, 표 4, 표 5 및 표 6은 실시예 1~2 및 참고예 1~3에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법으로 각각 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 혈청 D를 측정한 경우의 제각기의 측정결과를 나타낸다. 또한, 정상 사람혈청 D 10검체의 OD492값에서 컷트 오프값을 설정하고, 항 HCV 항체 양성 음성의 판정을 행하였다. 컷트오프값은,
((정상사람혈청의 OD492값의 평균치)+2SD)
의 계산식에 의해 구하였다. 표 3, 표 4, 표 5, 표 6에 의거하여 계산한 컷트오프값에 의해, 실시예 1~2 및 참고예 1~3의 펩티드의 제각기의 OD492값의 분포를 제1~제5도에 나타내었다. 표 3, 표 4, 표 5 및 표 6과 상기 한 컷트오프값에 의해 산출한 양성률을 표 7에 나타내었다. 표 7에서, 실시예 1에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 정상사람 혈청 D에서는 각각 93.3%, 93.3%, 10.0%, 0%의 양성률을 나타내엇다. 실시예 2에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 정상사람 혈청 D에서는 각각 96.7%, 93.3%, 0%, 0%의 양성률을 나타내고, 이들의 펩티드를 사용한 효소면역측정법은 참고예 8에 나타낸 면역스크리닝법과 높은 상관이 있다는 것을 알았다. 참고예 1 및 참고예 2에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C, 또한 정상사람 혈청 D의 어느것에 있어서도 약 10.0%의 양성률을 나타내고, 이들의 펩티드를 사용한 효소면역 측정법은 감도 및 특이성이 불량하다는 것을 알았다. 또 본 발명자들중 한사람을 포함한 몇사람에 의해서 단리, 클로닝된 클론중에서 선택된 하나의 클론을 아미노산으로 번역한 펩티드의 전아미노산 배열로서 된 펩티드인, 참고예 3에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 및 혈청 C에서는 각각 93.3%, 93.3%, 0%의 양성률을 나타냈으나, 정상사람 혈청 D에서는 10.0%의 양성률을 나타내고, 거짓 양성이 생긴다는 것을 알았다. 실시예 1 또는 실시예 2에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역 측정법과 비교하면 특이성 및 강도가 보다 불량하다는 것을 알았다. 이상과 같은 결과에서, 실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 펩티드를 사용함으로써, 유요한 항 HCV 항체의 유무의 판정이 이루어진다는 것이 나타났다.
[표 3]
Figure kpo00007
[표 4]
Figure kpo00008
[표 5]
Figure kpo00009
[표 6]
Figure kpo00010
[표 7]
Figure kpo00011
[실시예 10]
실시예 9에 있어서와 마찬가지인 방법으로, 항원물질로서 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5, 참고예 4, 참고예 5 및 참고예 6에서 얻어진 펩티드를 사용하여 효소면역 측정법에 의한 검정을 행하였다.
측정결과를 표 8, 표 9, 표 10 및 표 11에 나타내었다. 또, 양성률을 표 12에 나타내었다. 또, 제각기의 OD492값을 제6도~제11도에 나타내었다. 표 12에서, 실시예 1 또는 실시예 5에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A 및 혈청 B에서는 양성률은 각각 96.7% 또는 100%를 나타내고, 혈청 C 및 정상사람 혈청 D에서는 0% 또는 대단히 낮은 양성률을 나타내고 이들의 펩티드를 사용한 효소면역 측정법은 높은 강도와 특이성을 갖는다는 것을 알았다. 또, 실시예 4에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역 측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 혈청 D에서는 각각 36.7%, 53.3%, 5.0%, 0.0%의 양성률을 나타내고, 사용된 펩티드는 실시예 3 및 실시예 5에서 얻어진 펩티드가 갖는 항원성과는 다른 항원성을 갖는다는 것이 명확하게 되었다. 또한, 참고예 4~6에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 혈청 D에서는 0% 또는 대단히 낮은 양성률을 나타내고, 이들의 펩티드를 사용한 효소면역 측정법은 감도 및 특이성이 불량하다는 것을 알았다. 이상과 같은 결과에서, 실시예 3, 실시예 4 및 실시예 5에서 얻어진 펩티드를 사용함으로써 유효한 항 HCV항체의 유무의 판정이 이루어진다는 것이 나타났다.
[표 8]
Figure kpo00012
[표 9]
Figure kpo00013
[표 10]
Figure kpo00014
[표 11]
Figure kpo00015
[표 12]
Figure kpo00016
[실시예 11]
실시예 9에 있어서와 마찬가지인 방법으로, 항원물질로서 실시예 6, 실시예 7, 실시예 8 및 참고예 7에서 얻어진 펩티드를 사용하여 효소면역 측정법에 의한 결정을 행하였다.
측정결과를 표 13, 표 14, 표 15 및 표 16에 나타내었다. 또 양성률을 표 17에 나타내었다. 또, 제각기의 OD492값을 제12조~제15도에 나타내었다. 표 17에서, 실시예 6에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 정상사람 혈청 D에서는 각각 33.3%, 40.0%, 0%, 0%의 양성률을 나타내었다. 실시예 7에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 정상사람 혈청 D에서는 각각 50.0%, 66.7%, 5.0%, 0%의 양성률을 나타내었다.
또한, 실시예 8에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 정상사람 혈청 D에서는 각각 23.3%, 93.3%, 5.0%, 10.0%의 양성률을 나타내었다. 이들의 펩티드를 사용한 효소면역측정법은, 본 발명자들중 한사람을 포함한 몇 사람에 의해서 단리된 리보헥산에서 클론화된 #8 클론 #14 클론 및 #18클론을 사용한 참고예 8에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 혈청 A, 혈청 B, 혈청 C 및 혈청 D에서는 각각 13.3%, 13.3%, 5.0%, 0.0%의 향성률을 나타내고, 사용된 펩티드는 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에서 얻어진 펩티드가 갖는 항원성과는 다른 항원성을 갖는 것이 명확해졌다. 이상과 같은 결과에서, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에서 얻어진 펩티드를 사용함으로써, 유효한 항 HCV항체의 유무의 판정이 이루어진다는 것이 나타났다.
[표 13]
Figure kpo00017
[표 14]
Figure kpo00018
[표 15]
Figure kpo00019
[표 16]
Figure kpo00020
[표 17]
Figure kpo00021
[실시예 12]
[피검시료]
표 18에는 각각의 질환에 대하여, 사용된 혈청검체가 유래하는 질환명과 검체수를 나타내었다.
Figure kpo00022
[효소면역측정법에 의한 측정]
표 18에 나타낸 각 혈청검체에 대해서, 하기 효소면역측정법에 의해 흡광도를 측정하고, 항 HCV항체의 유무를 검정하였다.
즉, 실시예 9에 있어서와 마찬가지인 방법으로 항원물질로서 실시예 1, 실시예 2, 참고예 1, 참고예 2, 참고예 3에서 얻어진 펩티드를 검정용 마이크로컵에 코팅하고, 표 18에 나타낸 각 혈청검체와의 반응을 행하고, 발색제에서 생성한 색소를 함유하는 반응액의 492nm에서의 흡광도 OD492값을 측정하였다.
[결과]
측정결과를 표 19 및 표 20에 나타내었다. 표 19는 실시예 1~2, 표 20은 참고예 1~3에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법에 의해 표 18에 나타낸 각혈청검체를 검정한 경우의 제각기의 측정결과를 나타낸다.
다시 정상자 혈청 10검체의 OD492값에서 컷트오프값을 설정하고, 항 HCV항체 양성, 음성의 판정을 행하였다. 컷트오파값은,
((정상자 혈청의 OD492값의 평균값)+2SD
의 계산식에 의해 구하였다. 표 19 및 표 20의 정상자 혈청검체의 측정치에 의거해서 계산한 컷트오프값에 의해 양성 또는 음성의 구별을 판정한 결과를 표 19 및 표 20 중에 나타내었다. 표 19에서, 실시예 1에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 산방성 비 A 비 B형의 급성간염, 회복기 및 만성간염 및 수혈후 비 A 비 B형 급성간염, 극기 및 만성간염의 환자혈청은 항 HCV항체가 양성으로 판정되며, 알코올성 간염 환자혈청, B형간염환자혈청 및 정상자 혈청에서는 항 HCV항체는 음성으로 판정된다. 실시예 2에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역 측정법을 실시한 경우, 비 A 비 B형 만성간염 환자혈청에서는 항 HCV항체가 양성으로 판정되었으며, 알코올성간염환자혈청, B형 간염환자혈청 및 정상자 혈청에서는 항 HCV 항체는 음성으로 판정되었다. 이상과 같음으로서, 실시예 1 및 실시에 2에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법은 비 A 비 B형 간염의 조기 진단에 유용하다는 것을 알았다. 또, 표 20에서 참고예 1, 참고예 2 및 참고예 3에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면측측정법을 실시한 경우, 비 A 비 B형 간염의 환자혈청으로 항 HCV항체가 음성으로 판정되는 경우가 있으며, 또, B형 간염환자 혈청 및 정상자 혈청에서 항 HCV 항체가 양성으로 판정되는 경우가 있으며, 특이성 및 감도가 불량이었다. 즉, 참고예 1, 참고예 2 및 참고예 3에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법에 의한 판정결과는 거짓음성 및 거짓양성을 포함하며, 이 펩티드를 사용한 비 A 비 B형 간염의 진단효율을 불량이라는 것을 알았다. 이상과 같은 결과에서, 실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 펩티드를 사용함으로서 유요한 항 HCV 항체의 유무의 판정이 되어진다는 것을 나타내었다.
[표 19]
Figure kpo00023
[표 20]
Figure kpo00024
[실시예 13]
실시예 12에 있어서와 마찬가지인 방법으로 표 18에 나타낸 각혈청 검체에 대해서, 항원물질로서 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5, 참고예 4, 참고예 5 및 참고예 6에서 얻어진 펩티드를 사용해서 효소면역측정법에 의해 흡광도를 측정하고, 항 HCV항체의 유무를 검정하였다.
측정결과를 표 21 및 표 22에 나타내었다. 표 21은 실시예 3-5, 표 22은 참고예 4~6에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법에 의해 표 18에 나타낸 각 혈청검체를 검정한 경우의 제각기의 측정결과를 나타낸다.
또한, 정상자 혈청 10검체의 OD492값에서 컷트오프값을 설정하고, 항 HCV항체 양성, 음성의 판정을 행하였다. 컷트오프값은,
((정상자 혈청의 OD492값의 평균치)+2SD)
의 계산식에 의해 구하였다. 표 21 및 표 22의 정상자 혈청검체의 측정치에 의거하여 계산한 컷트오프값에 의해, 양성 또는 음성의 구별을 판졍한 결과를 표 21 및 표 22안에 나타내었다. 표 21에서, 실시예 3 및 실시예 5에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 비 A 비 B형 간염의 급성, 회복기 환자의 혈청 및 비 A 비 B형 만성 간염환자의 혈청에서는 항 HCV 항체는 양성으로 판정되었다. 또한 알코올성 간염환자혈청, B형 간염환자혈청 및 정상자 혈청에서는 항 HCV 항체는 음성으로 판정되며, 이들의 펩티드를 사용한 효소면역 측정법은 상기한 환자의 진단에 유용하다는 것을 알았다. 또 실시예 4에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시했을 경우, 비 A 비 B형 만성간염 환자의 혈청에서만이 특이적으로 항 HCV항체가 양성으로 판정되었으며, 상기한 환자의 진단에 유용하다는 것을 알았다. 또한, 표 22에서 참고예 4~6에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 표 18의 질환을 갖는 환자혈청에 있어서도 항 HCV항체가 음성으로 판정되는 경우가 있어, 또한 정상자 혈청에 있어서도 항 HCV항체가 양성으로 판정되는 경우가 있기 때문에, 이들의 펩티드를 사용한 효소면역측정법에 의한 판정결과는 거짓양성 및 거짓음성을 포함하며, 이들의 펩티드를 사용한 비 A 비 B형 간염의 진단효율은 불량하다는 것을 알았다. 이상과 같은 결과에서, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5에서 얻어진 펩티드를 사용함으로써 유효한 항 HCV항체의 유무의 판정이 되어진다는 것이 나타났다.
[표 21]
Figure kpo00025
[표 22]
Figure kpo00026
[실시예 14]
실시예 12에 있어서와 마찬가지인 방법으로, 표 18에 나타낸 각혈청 검체에 대해서, 항원 물질로서 실시예 6, 실시예 7, 실시예 8 및 참고예 7에서 얻어진 펩티드를 사용해서 효소면역측정법에 의해 흡광도를 측정하고, 항 HCV항체의 유무를 검정하였다.
측정결과를 표 23에 나타내었다. 표 23은 실시예 6~8 및 참고예 7에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역 측정법에 의해 표 18에 나타낸 각 혈청검체를 검정한 경우의 제각기의 측정결과를 나타낸다. 또한 정상자 혈청 10검체의 OD492값에서 컷트오프값을 설정하고, 항 HCV항체 양성.음성의 판정을 행하였다. 컷트오프값은
((정상자혈청의 OD492값의 평균치)+2SD
의 계산식에 의해 구하였다. 표 23의 정상자 혈청검체의 측정치에 의거해서 계산한 컷트오프값에서, 양성 또는 음성의 구별을 판정한 결과를 표 23 중에 나타내었다. 표 23에서, 실시예 6에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 산발성 비 A 비 B형 만성간엽 환자의 혈청에서 항 HCV항체가 양성으로 판정되었으며, PANANBH 급성기, 회복기 및 만성간염은 모두 양성으로 판정되었다. 또한, 알코올성 간염환자혈청, B형 간염환자혈청 및 정상자혈청에서는 항 HCV 항체는 음성으로 판정되었다. 이상과 같음으로해서, 실시예 6에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법은 비 A 비 B형 간염의 조기진단에 유용하다는 것을 알았다. 또, 실시예 7 및 실시예 8에서 얻어진 펩티드에 의한 효소면역측정법을 실시한 경우, 비 A 비 B형 만성간염 회복기의 환자 및 만성간염 환자의 혈청에서 특이적으로 항 HCV 항체가 양성으로 판정되며, 상기한 환자의 진단에 유용하다는 것을 알았다. 참고예 7에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법을 실시한 경우, 비 A 비 B형 간염환자 혈청은 어느것이나 음성으로 판정되었으며, 또, 알코올성 간염 및 B형 간염 환자혈청에서 양성으로 판정된 경우가 있었다. 즉, 참고예 7에서 얻어진 펩티드를 사용한 효소면역측정법에 의한 판정결과는 거짓음성 및 거짓양성을 포함하며, 이 펩티드를 사용한 비 A 비 B형 간염의 진단효율은 불량하다는 것을 알았다. 이상과 같은 경과에서, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에서 얻어진 펩티드를 사용함으로써, 유효한 항 HCV 항체의 유무의 판정이 되어진다는 것이 나타났다.
[표 23]
Figure kpo00027
[실시예 15]
피검시료
헌혈자혈청:2476검체
효소면역측정법에 의한 검정
각, 혈청검체에 대해서, 하기의 효소면역측정법에 의해 흡광도를 측정하고, 항 HCV항체의 유무를 검체하였다.
즉, 항원물질로서 실시예 1에서 얻어진 펩티드를 각각 0.01M 탄산완충액(pH 9.5)에 용해하고, 얻어진 펩티드를 용액을 폴리스티렌체 효소면역검정용 컵(Dynatech Laboratories Incorporation 제품)에 각 100μl씩 가한 다음, 4℃에서 12시간 정치함으로써, 펩티드에 의한 코팅을 행하였다. 이어서, 각각의 컵을 0.05용량%의 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 계속해서, 각각의 컵에 20용량%의 정상 염소혈청을 함유하는 PBS 150μl을 가하여 실온에서 3시간 정치하고, 비특이적인 단백결합부위를 블록하였다. 이어서, 블록킹에 사용한 20용량%의 정상 염소혈청을 함유하는 PBS를 제외한 다음, 각 검정용 컵을 건조시켰다.
혈청회석용 용액으로서 10용량%의 정상 염소혈청을 함유하는 PBS를 상기한 각각의 검정용 컵에 100μl씩 가한 다음, 각 피검혈청을 혈청회석용 용액과 피검혈청의 비율이 20대 1(용량비)로 되도록 가하였다.
37℃에서 1시간 인큐베이트한 후, 각각의 컵을 0.05용량%의 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다.
얻어진 각각의 검정용 컵에, 염소항사람 IgG항체-퍼옥시다아제 콘쥬게이트(10용량%의 정상 염소혈청을 함유하는 PBS로 제일 적당한 농도로 희석한 것) 100μl을 가하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 각각의 컵을 0.05용량%의 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 계속해서, 얻어진 각각의 검정용 컵에 발색제(o-페닐렌디아민을 0.3중량%로 되도록 0.02용량%의 과산화수를 함유하는 0.1M시트르산-인산완충액 pH 5.6에 용해한 것) 100μl을 가하였다. 실온에서 15분간 정치한 다음, 2N황산 100μl을 가하여, 반응을 정지하고, 반응액의 492nm에서의 흡광도 OD492값을 측정하였다.
[결과]
실시예 1에서 얻어진 펩티드에 의한 항 HCV항체의 저해시험의 결과, 컷트오프값을 설정하였다. 상기한 측정결과에 의거해서, OD492값이 0.5 이상인 것을 항 HCV항체 양성으로하고, 0.5 미만인 것을 음성으로 판정한 결과를 표 24에 나타내었다. 그리고 표 24에 상기한 헌혈자 혈청 2476검체에 대해서 시판중인 항 HCV항체 측정시약(Ortho Diagnostic System Inc. 제품)를 사용해서 EIA법 및 RIBA법에 의한 판정을 행한 결과를 함께 나타내었다.
[표 24]
Figure kpo00028
표 24에서 명백한 바와 같이, 시판중인 항 HCV항체 측정시약에 의해서 음성으로 판정된 2462검체중 35검체는 실시예 1에서 얻어진 펩티드로 측정한 항 HCV항체의 판정에서 양성으로 판정되었다. 또, 시판중인 항 HCV항체 측정시약에 의해서 양성으로 판정된 14검체는 실시예 1에서 얻어진 펩티드로 측정한 항 HCV 항체의 판정에서 어느것이나 양성로 판정되었다.
[배열표]
배열번호:1
배열길이:25
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00029
비열번호:2
배열길이:5
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00030
배열번호:3
배열길이:40
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00031
배열번호:4
배열길이:8
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00032
배열번호:5
배열길이:39
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00033
배열번호:6
배열길이:10
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00034
배열번호:7
배열길이:10
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00035
배열번호:8
배열길이:21
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00036
배열번호:9
배열길이:13
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00037
배열번호:10
배열길이:10
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00038
배열번호:11
배열길이:31
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00039
배열번호:12
배열길이:18
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00040
배열번호:13
배열길이:10
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00041
배열번호:14
배열길이:10
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00042
배열번호:15
배열길이:15
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00043
배열번호:16
배열길이:32
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00044
배열번호:17
배열길이:14
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00045
배열번호:18
배열길이:11
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00046
배열번호:19
배열길이:21
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00047
배열번호:20
배열길이:11
배열형태:아미노산
토폴로지:직쇄상
배열의 종류:펩티드
배열
Figure kpo00048
배열번호:21
배열길이:120
배열형태:헥산
사슬갯수:불명
토폴로지:불명
배열의 종류:게놈 RNA에 대한 cDNA
프래그먼트 형태:중간부 프래그먼트
기원
고체·단리 클론명:#8클론
조직의 종류:사람 혈청
배열의 특징
특징을 나타내는 기호:CDS
존재위치:1..120
특징을 결정한 방법:E
배열
Figure kpo00049
배열번호:22
배열길이:114
배열형태:헥산
사슬갯수:불명
토폴로지:불명
배열의 종류:게놈 RNA에 대한 cDNA
프리그먼트 형태:중간부 프래그먼트
기원
고체·단리 클론명:#14클론
조직의 종류:사람 혈청
배열의 특징
특징을 나타내는 기호:CDS
존재위치:1..114
특징을 결정한 방법:E
배열
Figure kpo00050
배열번호:23
배열길이:201
배열형태:헥산
사슬갯수:불명
토폴로지:불명
배열의 종류:게놈 RNA에 대한 cDNA
프래그먼트 형태:중간부 프래그먼트
기원
고체·단리 클론명:#18클론
조직의 종류:사람 혈청
배열의 특징
특징을 나타내는 기호:CDS
존재위치:1..201
특징을 결정한 방법:E
배열
Figure kpo00051

Claims (13)

  1. Lys Arg Ser Thr Ans(배열번호:2), Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4), 또는 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Try(배열번호:6)의 아미노산 배열을 함유하는, 비 A 비 B형 간염 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항테와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 식(1):Lys Asp Arg Thr Gln Glnn Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys(배열번호:1)로서 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로 된 펩티드로서, 그 펩티드가 Lys Arg Ser Thr Asn(배열번호:2)의 아미노산 배열을 가지며, 비 A 비 B형 간염 관련 항원에 대해서 특이성을 갖는 항체 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 식(2):Glu Lys Lys Gly Glu Ala Ser Asn Gly Glu Ala Glu Asn Asp Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg(배열번호:3)으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로 된 펩티드이며, 그 펩티드가 Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:4)의 아미노산 배열을 가지며, 비 A 비 B형 간염 관련 항원에 대한 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 식(3):Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met(배열번호:5)로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편으로 된 펩티드로서, 그 펩티드가 Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:6)의 아미노산 배열을 가지며, 비 A 비 B 간염 관련항원에 대한 특이성을 갖는 항체와 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 펩티드.
  5. 제2항에 있어서, 식(1):Lys Asp Arg Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys Lys Lys Lys(배열번호:1)로서 나타내는 펩티드.
  6. 제2항에 있어서, 식(1-a):Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Arg Ser(배열번호:7)로 나타내는 펩티드.
  7. 제3항에 있어서, 식(2-a):Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala Thr Asn Asn Pro Gly Lys Asn Lys Lys Pro Arg(배열번호:8)로 나타내는 펩티드.
  8. 제3항에 있어서, 식(2-b):Thr His Lys Lys Gln Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys(배열번호:9)로 나타내는 펩티드.
  9. 제3항에 있어서, 식(2-c):Arg Arg Tyr Lys Glu Lys Glu Lys Thr Ala(배열번호:10)으로 나타내는 펩티드.
  10. 제4항에 있어서, 식(3-a):Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met(배열번호:11)로 나타내는 펩티드.
  11. 제4항에 있어서, 식(3-b):Arg Val Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:12)로 나타내는 펩티드.
  12. 제4항에 있어서, 식(3-c):Ala Ile Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr(배열번호:13)로 나타내는 펩티드.
  13. 제1~12항중 어느 한항 기재의 펩티드를 함유하는 비 A 비 B형 간염 관련 항원에 특이성을 갖는 항체의 측정시약.
KR1019910003768A 1990-03-08 1991-03-08 펩티드 및 그의 용도 KR930004055B1 (ko)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58700/90 1990-03-08
JP58700 1990-03-08
JP5870090 1990-03-08
JP6743990 1990-03-16
JP67439 1990-03-16
JP67439/90 1990-03-16
JP80100 1990-03-27
JP80100/90 1990-03-27
JP8010090 1990-03-27
JP29689990 1990-10-31
JP296899/90 1990-10-31
JP296899 1990-10-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR910016769A KR910016769A (ko) 1991-11-05
KR930004055B1 true KR930004055B1 (ko) 1993-05-19

Family

ID=27463675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019910003768A KR930004055B1 (ko) 1990-03-08 1991-03-08 펩티드 및 그의 용도

Country Status (3)

Country Link
US (1) US5247067A (ko)
EP (1) EP0445801A3 (ko)
KR (1) KR930004055B1 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA912040B (en) * 1990-03-30 1991-12-24 Akzo Nv Peptides immunochemically reactive with antibodies directed against hepatitis non-a,non-b virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE69030124T2 (de) * 1990-12-14 1997-09-18 Innogenetics Nv Synthetische Antigene zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
WO1992017612A1 (en) 1991-03-26 1992-10-15 Baxter Diagnostics Inc. Assay for non-a non-b hepatitis
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
DE4209215A1 (de) * 1991-07-04 1993-01-07 Boehringer Mannheim Gmbh Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv
ZA927837B (en) * 1991-10-15 1994-03-11 Akzo Nv Monoclonal antibodiesto hepatitis C virus
US6667387B1 (en) 1996-09-30 2003-12-23 N.V. Innogenetics S.A. HCV core peptides
US6709828B1 (en) 1992-03-06 2004-03-23 N.V. Innogenetics S.A. Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them
NZ299048A (en) * 1992-03-06 1998-09-24 Innogenetics Sa Nv Modified peptides corresponding to immunologically useful epitopes in hiv, hcv and htlv and their use especially when biotinylated
CN1053196C (zh) * 1992-07-16 2000-06-07 株式会社先端生命科学研究所 用于丙型肝炎病毒分类的抗原肽, 含有所述肽的药盒及用所述肽进行分类的方法
DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV
US5885771A (en) * 1993-10-29 1999-03-23 Srl, Inc. Antigenic peptide compound and immunoassay
EP1756147A2 (en) * 2004-06-01 2007-02-28 Innogenetics N.V. Peptides for inducing a ctl and/or htl response to hepatitis c virus
WO2012161288A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Abbott Japan Co. Ltd. Immunoassay methods and reagents for decreasing nonspecific binding
US10087221B2 (en) 2013-03-21 2018-10-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Synthesis of hydantoin containing peptide products
AU2014234314B2 (en) 2013-03-21 2018-02-15 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Synthesis of cyclic imide containing peptide products
WO2014174517A1 (en) 2013-04-25 2014-10-30 Carmel-Haifa University Economic Corp. Synthetic anti-inflammatory peptides and use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
ES2012739T5 (es) * 1987-11-18 2001-12-01 Chiron Corp Diagnosticos para nanbv.
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드

Also Published As

Publication number Publication date
KR910016769A (ko) 1991-11-05
EP0445801A3 (en) 1992-07-01
EP0445801A2 (en) 1991-09-11
US5247067A (en) 1993-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR930004055B1 (ko) 펩티드 및 그의 용도
KR0181344B1 (ko) 간염 씨이 바이러스에 대한 항체 검출용 합성 항원
US6596476B1 (en) Hepatitis C assay
US6416946B1 (en) Methods of typing hepatitis C virus and reagents for use therein
JPS63225398A (ja) エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体
JPH04253998A (ja) Ｃ型肝炎アッセイ
CS256960B1 (en) Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
JPH06153960A (ja) Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
EP1328811A2 (en) Hcv mosaic antigen composition
JP2666903B2 (ja) Ｈｃｖ ペプチド抗原及びｈｃｖ の測定方法
JP4173204B2 (ja) Ｈｃｍｖ特異的ペプチド、その薬剤および使用
WO2006113522A2 (en) Methods of detecting hepatitis c virus
JP3241057B2 (ja) ペプチドおよびその用途
JPH09249699A (ja) 抗ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた測定試薬及び測定方法
JPH05301889A (ja) 非ａ非ｂ型ペプチド
US5436127A (en) Epitope-related peptides of human parvovirus
CA2250076A1 (en) Method for predicting the outcome of hepatitis b infection
JP2003064098A (ja) ペプチドおよびその用途
AU643838B2 (en) Peptide and its use
JPH05320192A (ja) 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスに対する抗体に免疫化学反応性を示すペプチド
JPH03287069A (ja) 測定試薬
JPH03284696A (ja) ペプチドおよびその用途
JPH05271277A (ja) 非−ａ、非−ｂ肝炎ウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド
CA2172305A1 (en) Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides
WO1995011918A1 (fr) Compose peptidique antigenique et methode de dosage immunologique

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 19960416

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee