KR0181344B1

KR0181344B1 - 간염 씨이 바이러스에 대한 항체 검출용 합성 항원

Info

Publication number: KR0181344B1
Application number: KR1019970708500A
Authority: KR
Inventors: 로버트 제이. 딜레이스; 티크 폴레트; 게에르트 마에르텐스; 헤우베르스윈 휴고 반
Original assignee: 피. 아페르몬트; 인노제네틱스 엔. 브이.
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1999-04-01
Also published as: KR0181345B1; ATE149522T1; US5922532A; EP0754704A2; CY2053B1; CY2043A; HU9202645D0; KR0181343B1; ATE185350T1; GR3032150T3; HK57597A; AU652013B2; ES2138784T3; DK0754704T3; IL100158A; DE69030124T2; EP0489968B1; JPH05503722A; JP2995216B2; HU218357B

Abstract

본 발명은 혈액 제품의 HCV에 대한 사전 발견과 혈액 선별을 위한 시약 용도를 위하여 HCV에 의해 암호화된 단백질을 모방할 수 있는 펩타이드 서열에 관한 것이다. 이 펩파이드는 적어도 5개 아미노산 길이 가지며, HCV에 대한 항체 검출, HCV항원 검출을 위한 여러 특수한 방법내에서 또는 항원으로서 사용이 가능하다.

Description

[발명의 명칭]

간염 C 바이러스에 대한 항체 검출용 합성 항원

[도면의 간단한 설명]

제1도는 복합 HCV_{HC-JI/CDC/CHI}의 아미노산 서열을 나타낸다.

제2도는 엘라이자 분석법(ELISA assay)에서 개별 펩타이드 및 여러 혼합물에 결합하는 항체를 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

간염 B 바이러스(HBV)에 대한 체계적 테스트를 수행함은 수혈 공급으로 부터 바이러스를 제거함에 있어 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 상당수의 수혈후 간염(post-transfusion hepatitis, PTH)환자가 아직도 발생하고 있다. 이들 환자들을 일반적으로 비-A (non-A), 비-B(non-B) 간염(NANBH)바이러스에 의해 감염되는데, 이것의 진단은 보통 다른 바이러스 마커의 배제에 의해 이루어진다. 대부분의 이들 환자와 관련된 병원학적 요소가 최근 클론되어(참조 : Choo, Q-L등, Science (1988) 244:359-362) 제 1세대 항체 시험법이 개발되었다(참조 : Kuo, G등, Science (1989) 244:362-364). 이 요소는 양성 방향으로 꼬인 RNA 바이러스로 확인되었고, 이것이 게놈에 대한 서열이 부분적으로 결정되었다. 여러 연구조사는 이후에 간염 C 바이러스(HCV)로 언급되는 이 바이러스가 플라비 바이러스 및 페스티 바이러스와 관련 가능성이 있음을 제안하고 있다. 침팬치(HCV_CDC/CHI)에서 분리된 HCV 게놈의 일부는 유럽 특허문헌(EPO 88310922.5)에 개시되어 있다. 이 문헌에 개시된 코딩 서열은 가상 구조단백질에 대하여 코딩하는 바이러스 게놈의 5'-말단 유래의 서열을 포함하고 있지 않다. 그러나, 최근 HCV 게놈의 이 부위에서 유래된 서열이 발표되었다(Okamoto, H등, Japan J. Exp. Med. 60:167-177, 1990). 일본 클론 HC-JI에 의해 암호화된 아미노산 서열은 HCV_CDC/CHI서열과 결합되며 이 결합부위에서 이 두 서열이 중복되어 제1도에 도시된 복합 서열(composite sequence)을 생성하게 된다. 구체적으로는, 이 두 서열이 글라이신 451에서 결합된다. HCV 아미노산 서열에 이용된 숫자 체계는, 결손 또는 삽입을 포함한 변이형 HCV의 존재가능성이 매우 높기 때문에 절대적인 것은 아니다. HCV 게놈의 5'-말단에 대응하는 서열 또한 최근 유럽 특허 문헌(EPO 90302866.0)에 개시되어 있다. HCV의 잠재적 보균자를 검출하기 위하여는 많은 양의 단백질이 필요하다. HCV환자 경우 현재까지 이 바이러스를 배양할 수 있는 공지의 방법이 없기 때문에 바이러스에 감염시킨 배양물을 바이러스 항원으로서 사용하는 것이 불가능하다. 현재 제 1 세대 항체 테스트는 HCV 게놈에 의해 암호화된 363 아미노산의 서열을 포함하는 융합 단백일 사용하고 있다. 이 단백질에 대한 항체는 만성 NANBH 환자 가운데 75 내지 85%에서 검출될 수 있음을 밝혀졌다. 이에 비해, 급성 질환의 환자 가운데 약15% 만이 이 융합 단백질을 인식하는 항체를 가지고 있다(Kuo, G. 등, Science (1989) 244:362-364). 그러나, 적당한 확인 테스트 방법이 없기 때문에 이들 통계를 검증하는 것은 어렵다. HCV 게놈과 플라비 바이러스 게놈 사이의 외관상 유사성으로 진단 가치의 가능성이 있는 항원요소의 위치를 예상할 수 있다. HCV 게놈의 분석은 긴 연속적 오픈 리딩 프레임(continuous long open reading frame)의 존재를 나타낸다. 바이러스 RNA는 긴 폴리프로테인으로 번역된 후 세포 및/또는 바이러스 프로테아제에 의해 절단되는 것으로 추정된다. 예를 들면, 덴구(Dengue) 바이러스와 유사하게, 바이러스의 구조 단백질은 바이러스의 폴리프로테인의 아미노 말단 3 번째로부터 유래되는 것으로 추정된다. 현재, 폴리프로테인의 정확한 절단 부위는 단지 추정할 수 있을 뿐이다. 그럼에도 불구하고, 이 구조 단백질은 진단 목적, 즉 바이러스 항원 진단을 위해 사용될 수 있는 항체를 생성함은 물론 항체의 진단 목적으로 유용한 것으로 보인다. 이와 마찬가지로, 비구조 단백질 부위 또한, 비록 이들 단백질이 바이러스 입자의 구조 성분으로서 발견되지를 않지만, 진단 가치가 있는 항원 요소를 지니고 있는 것 같다.

[발명의 구체 실시태양의 설명]

RNA 바이러스는 매우 높은 빈도로 자연적 돌연변이 일으키기 때문에, 동일 개체로부터 유래되었다 하더라도, 두 개의 HCV 분리물은 완전히 동일하지 않는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 설명에 있어, 바이러스가 HCV_{HC-JI/CDC/CHI}와 핵산 수준에서 60% 이상의 전체적 호모로지(homology) 및 아미노산 수준에서 70% 의 호모로지를 나타내는 경우 바이러스는 HCV와 동일 또는 유사한 것으로 간주된 본 명세서에서 기재된 펩타이드는 HCV에 의해 암호화된 단백질을 면역학적으로 모방한 것이다. 서열상의 종과 종 사이에서의 변이체를 수용하기 위해서 보존(Conservative)은 물론 비보존(Non-conservative) 아미노산 치환체도 만들어질 수 있다. 이들은 일반적으로 특정 서열의 35% 미만일 것이다. 한 펩타이드가 매우 다형성인 HCV 폴리펩타이드 내의 한 부분과 대응하는 경우에 다른 바이러스 종의 다른 항원 요소를 더 좋게 모방하기 위하여 아미노산의 하나 또는 그 이상을 변화시킨다는 것은 바람직할 수 있다. 관심있는 펩타이드는 HCV 게놈에 의해 암호화된 서열내에, 적어도 5개, 때로는 6개, 때로는 8개, 때로는 12개, 보통는 약 50개 미만 더 보통은 약 35개 미만, 그리고 바람직하게는 약 25개 미만의 아미노산을 포함할 것이다. 각예에서, 펩타이드는 보다 큰 펩타이드의 모든 감도를 실질적으로 유지하면서 가능한 작은 것이 바람직할 것이다. 어떤 예에서는 한 펩타이드 구조내에 둘 이상의 펩타이드를 함께 결합시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 기재된 펩타이드는 주제 화합물이 적어도 하나의 HCV 종과 면역학적 경쟁을 위하여 제공될 수만 있다면, 어떤 특정 HCV 서열과 동일한 필요가 없다는 점을 이해하여야 한다. 따라서, 이 펩타이드들은 삽입, 결손, 그리고 보존 또는 비보존 아미노산 치환에 의한 이들 변화로 사용상의 어떤 장점을 제공할 수 있다. 보존으로 간주되는 치환체는 치환체의 화학적 성질이 본래 아미노산의 성질과 유사한 것이다. 보존으로 간주될 수 있는 아미노산의 조합은 글라이신(Gly), 알라닌(Ala), 아스파틱산(Asp), 글루타믹산(Glu), 아스파라진(Asn), 글루타민(Gln), 발린(Val), 이소로이신(Ile), 로이신(Leu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr); 라이신(Lys), 아르지닌(Arg); 및 페닐알라닌(Phe), 타이로신(Tyr)이다. 또한 추가의 아미노산 또는 화학적 기는 펩타이드가 캐리어에 쉽게 부착될 수 있는 링커 암(linker arm)제조를 위해 아미노 또는 카르복시 말단에 부가될 수 있다. 이 링커암은 적어도 하나의 아미노산일 수 있고, 60개의 아미노산일 수 있지만, 주로 1 내지 10개의 아미노산이다. 고체상 또는 캐리어에 부착하는 성질은 공유 결합일 필요는 없다. 천연 아미노산 예들들면, 시스테인, 라이신, 타이로신, 글루타믹산, 또는 아스파틱산은 고체상 또는 캐리어에 연결할 관능기를 제공하기 위하여 아미노 또는 카르복실 말단에 첨가될 수 있다. 그러나, 다른 화학적 기 예를들면, 비오틴과 티오글리콜산은 펩타이드에 원하는 화학적 또는 물리적 성질을 부여할 말단에 부가될 수 있다. 펩타이드 말단은 또한, 예를 들면, N-말단 아세틸화 또는 말단 카르복시-아미드화에 의해 변형될 수도 있다. 관심있는 펩타이드가 제 1 도 복합 아미노산서열과 관련하여 기재되어있다. 아미노산 서열은 통상적인 그리고 널리 사용되는 3 문자 코-드로 프시되어 있다. 상기 아미노산에 부가하여, 다른 기들은 다음과 같이 정의된다: Y는, 예를 들면, NH₂, 하나 또는 그 이상의 N-말단 아미노산, 또는 결합 촉진을 위해 첨가된 다른 기이다. Y자신도 예를들면, 아세틸화에 의해 변형될 수 있다. Z는 결합, 아미노산 또는 결합에 이용될 수 있는 화학적 기이다. X는 OH,NH₂또는 이들 두 기 가운데 하나와 관련된 결합을 의미한다.

펩타이드 I은 아니노산 1 내지 20개에 해당하며, 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(I)

Y-Met-Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro -Gln-Z-X.

펩타이드 II는 아미노산 7 내지 26개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(II)

Y-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Z-X.

특히 관심이 있는 것은 올리고펩타이드 IIA이다.

(IIA)Y-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Z-X.

펩타이드 III는 아미노산 13 내지 32 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(III)

Y-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Z-X.

펩타이드 IV는 아미노산 37 내지 56개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(IV)

Y-Leu--Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Z-X.

펩타이드 V는 아미노산 49내지 68개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(V)

Y-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Val-Z-X.

펩타이드 VI은 아미노산 61 내지 80 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(VI)

Y-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Val-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly-Z-X.

펩타이드 VII는 아미노산 73 내지 92 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(VII)

Y-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly-Tyr-Pro-Trp-Leu-Tyr-Gly-Asn-Glu-Gly-Cys-Gly-Z-X.

펩타이드 VIII는 아미노산 1688 내지 1707 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 찾는다.

(VIII)

Y-Leu-Ser-Gly-Lys-Pro-Ala-Ile-Ile-Pro-Asp-Arg-Glu-Val-Leu-Tyr-Arg-Glu-Phe-Asp-Glu-Z-X.

펩타이드 IX는 아미노산 1694 내지 1713 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(IX)

Y-Ile-Ile-Pro-Asp-Arg-Glu-Val-Leu-Tyr-Arg-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Cys-Ser-Gln-Z-X.

펩타이드 X은 아미노산 1706 내지 1725개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(X)

Y-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ser-Gln-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Z-X.

펩타이드 XI은 아미노산 1712 내지 1731 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XI)

Y-Ser-Gln-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Z-X.

펩타이드 XII은 아미노산 1718 내지 1737 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XII)

Y-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Gln-Z-X.

펩타이드 XIII은 아미노산 1724 내지 1743개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XIII)

Y-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Gln-Thr-Ala-Ser-Arg-Gln-Ala-Z-X.

펩타이드 XIV은 아미노산 1730 내지 1749 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XIV)

Y-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-Leu-Gln-Thr-Ala-Ser-Arg-Gln-Ala-Glu-Val-Ile-Ala-Pro-Ala-Z-X.

펩타이드 XV는 아미노산 2263 내지 2282 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XV)

Y-Glu-Asp-Glu-Arg-Glu-Ile-Ser-Val-Pro-Ala-Glu-Ile-Leu-Arg-Lys-Ser-Arg-Arg-Phe-Ala-Z-X.

펩타이드 XVI는 아미노산 2275 내지 2294 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XVI)

Y-Leu-Arg-Lys-Ser-Arg-Arg-Phe-Ala-Gln-Ala-Leu-Pro-Val-Trp-Ala-Arg-Pro-Asp-Tyr-Asn-Z-X.

펩타이드 XVII는 아미노산 2287 내지 2306 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XVII)

Y-Val-Trp-Ala-Arg-Pro-Asp-Tyr-Asn-Pro-Pro-Leu-Val-Glu-Thr-Trp-Lys-Lys-Pro-Asp-Tyr-Z-X.

펩타이드 XVIII은 아미노산 2299 내지 2318 개에 해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XVIII)

Y-Glu-Thr-Trp-Lys-Lys-Pro-Asp-Tyr-Glu-Pro-Pro-Val-Val-His-Gly-Cys-Pro-Leu-Pro-Pro-Z-X,

펩타이드 XIX은 아미노산 2311 내지 2330 개에해당하며 하기의 아미노산 서열을 갖는다.

(XIX)

Y-Val-His-Gly-Cys-Pro-Leu-Pro-Pro-Pro-Lys-Ser-Pro-Pro-Val-Pro-Pro-Pro-Arg-Lys-Lys-Z-X.

특별히 관심있는 것은 펩타이드 폐환화 또는 2 펩타이드를 서로 연결하기 위하여 말단 아미노기를 아실화 하는데 이용되는 시스테인 또는 티오글리콜산의 메르캅도기의 사용이다. 폐환 또는 연결과정은 단일 결합을 통하여 또는 티올-특이 시약을 사용하여 분자 다리를 형성함으로써 성취될 수 있다. 펩타이드는 항체를 생성시키거나 또는 펩타이드 고체상에의 흡착을 촉진시키기 위하여 용해성 캐리어에 연결될 수 있다. 캐리어의 특성은 캐리어는 분자량이 5,000 이상이어야 하고 사람 혈청내의 항체에 의해 인식되어서는 안된다는 점이다. 일반적으로, 캐리어는 단백질이 될 것이다. 캐어로서 흔히 사용되는 단백질을 키홀 림페트(keyhole limpet) 헤모시아닌, 소 감마 글로블린, 소 혈청 알부민 및 폴리-L-라이신이다. 펩타이드를 캐리어에 연결하는 기술은 매우 잘 기재되어 있다. 연결은 펩타이드내의 N-말단, C-말단 또는 어떤 내부 부위에서 일어날 수 있다. 펩타이드는 또한 연결을 위해 유도체화될 수도 있다. 다양한 연결방법에 대한 상세한 설명은 예를들면, Van Regenmortel, M.H.V., Briand, J.P., Muller, S., and Plaue S., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 19, Synthetic Polypeptides as Antigens Elsevier Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1988에 기재되어 있다. 펩타이드는 또한, 라이신의 엡실론 아미노기는 물론 2 개의 알파가 펩타이드의 성장점으로 이용되는 올리고-라이신 코아 (core)상에서 직접 합성될 수도 있다. 코아를 구성하는 라이신의 수는 바람직하게 3 또는 7이다. 추가적으로, 시스테인 호모-또는 헤테로 다이머 생성 촉진을 위하여 복합체 근처 또는 C-말단에 포함될 수 있다. 이러한 기술의 사용은 간염 B 항원 (Tam, J.P., and Lu, Y-A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:9084-9088)은 물론 여러 다른 항원(Tam, J.P., Multiple Antigen Peptide System: A Novel Design for Synthetic Peptide Vaccine and Immunoassay, ir Synthetic Peptides, Approaches to Biologbical Problems, Tam, J. P., and Kaiser, E.T., ed. Alan R. Liss Inc., New York, 1989)에 대하여 상세히 기술되어있다. 펩타이드의 사용목적에 따라 펩타이드를 표식하거나 비표식화할 수 있다. 사용가능한 표식 형태는 예를들면, 효소적, 화학적, 풀루오르에슨트, 루미네슨트, 또는 방사능 같은 형태이다. 또한 펩타이드는 표면 또는 고체상, 가령, 예를들면, 마이크로타이터 플레이트 (Microtiter plate), 나일론 막, 유리 또는 플라스틱 비드(Bead), 그리고 크로마토그라피 지지체 예를들면 셀률로즈, 실리카 또는 아가로스에의 결합을 위해 변형될 수 있다. 펩타이드를 고형 지지체 또는 표면에 부착시킬 수 방법은 당해 전문가에게는 잘 알려져 있다. 특별히 관심이 있는 것은 간염 C 바이러스에 특이한 항체의 검출을 위하여 펩타이드 혼합물을 사용하는 것이다. 특히 바람직하다고 생각되는 펩타이드 혼합물은 다음과 같다.

A. II, III, V, IX, 및 XVIII

B. I, II, V, IX, XI, XVI, 및 XVIII

C. II, III, IV, V, VIII, XI, XVI 및 XVIII

D. II, IX, 및 XVIII

E. II, III, IV, 및 V

F. VIII, IX, XI, XIII, 및 XIV

G. XV, XVI, XVIII, XVIII, 및 XIX

펩타이드를 인식하는 항체는 여러 방식으로 검출이 가능하다. 바람직한 검출방법은 펩타이드 또는 펩타이드 혼합물이 고형 지지체에 결합된 엘라이자(ELISA:enzyme-linked immunosorbant assay)법이다. 대부분의 경우에, 이것은 마이크로타이터 플레이트이지만, 원리적으로는 불용성 고형상의 어떠한 종류도 가능하다. 적당한 희석 즉 시험 대상인 혈청 또는 기타 체액을 희석한 후, 펩타이드가 결합되어있는 고체상과 접촉시킨다. 결합 반응이 일어날 만큼의 시간동안 인큐베이쇼한다. 이어서, 결합하지 않은 성분을 고체상을 세정하여 제거한다.

면역 복합체의 검출은, 사람 면역 글로불린에 특이적 결합을 하고, 효소(바람직하게는 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알카라인 포스파타아제 또는 베타-갈락토시 다아제 중 하나가 되지만 제한되는 것은 아니며, 이들 효소는 무색 또는 거의 무색인 기질 또는 조 기질을 높은 착색물질 또는 크로모겐과의 착색 복합체를 생성할 수 있는 물질로 전환시켜 준다)로 표식된 항체를 사용하여 수행된다. 아니면, 검출 시스템은 적당한 기질 존재하에서 빛을 발하는 효소를 사용할 수도 있다. 생성물의 양은 광학적, 분광학적으로, 전기화학적으로, 또는 발광학적으로(luminometrically) 검출이 되며 비슷하게 처리된 컨트롤(control)과 비교한다. 검출 시스템은 또한 방사능으로 표시된 항체를 사용할 수 있으며, 이 경우에 면역 복합체의 양은 신틸레이숀 카운팅 또는 감마 카운팅으로 정량한다. 사용 가능한 기타 검출 시스템은 스타필로코쿠스 아우레우스 코완 종 I (Staphylococcus aureus Cowan) 유래의 단백질 A, 스타필로코쿠스속(26RP66종) 유래의 단백질 G 또는 고친화 비오틴-아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합 반응을 이용하는 시스템에 기초한 방법들이포함된다. 캐리어에 결합된 펩타이드에 대하여 생성된 항체 또는 표식 펩타이드와 함께 경쟁 분석법(competition assay)에 의해 혈청 또는 기타 체액내에 존재하는 항체 검출을 위하여 이용될 수 있다. 이 경우에, 캐리어에 결합된 펩타이드에 대하여 생성된 항체는 고형 지지체 예를들면, 플라스틱 비드 또는 플라스틱 튜브에 부착되어 있다. 표식 펩타이드를 이후 시험대상인 체액의 적당한 희석액과 혼합하고, 이 혼합물을 이어서 고형 지지체에 결합된 항체와 접촉시킨다. 적당히 인큐베이숀한 후, 고형 지지체를 세정한 뒤 표식 펩타이드 양을 정량한다. 고형 지지체에 결합된 표식양의 감소를 원 시료내의 항체의 존재를 의미하는 것이다. 마찬가지로, 펩타이드 또한 고형 지지체에 결합될 수 있다. 표식 항체를 이후 펩타이드 양이 제한된 조건하에서 시료내에서 존재하는 항체와 경쟁시킨다. 상기 예에서와 같이, 측정된 신호의 감소는 시험 시료내에 항체의 존재를 의미하는 것이다. 또다른 바람직한 항체 검출방법은 동종 면역 분석법(homogeneous immunoassay)이다. 이러한 분석법의 설계에 있어서는 가능한한 많은 변화들이 있을 수 있다., 실험예로서, 수행될 수 있는 동종 효소 면역 분석법과 방법들에 대한 수많은 가능한 방법들이 Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Press, Amersham, Oxford, New York, 1985에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 검출 시스템에는 효소 채널링(enzyme channelig), 생 발광(biolumiescence), 알로스테릭(allosteric) 활성화 및 알로스테릭 저해작용에 기초한 방법들이 포함된다. 리포좀에 포접된 효소 또는 조효소를 이용하는 방법 또한 사용된다(Pinnaduwage, P. and Huang, L., Clin. Chem. (1988) 34/2: 268-272, and Ullman, E.F. et al., Clin. Chem. (1987) 33/9: 1579-1584).

펩타이드의 합성은 용액상에서 또는 고형 지지체상에서 실시가 가능하다. 합성과정은 보통 t-부틸옥시카르보닐 또는 9-플루오르에닐 메톡시-카르보닐 보호 활성화 아미노산을 사용하게 된다. 합성을 수행하는 과정, 측쇄기 보호형태 및 절단 방법들이 예를들면, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Company, 1984; Atherton and Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989에 다수 기재되어 있다.

[실험]

I. 펩타이드 합성

기재된 모든 펩타이드는, 에틸렌디아민으로 처리하고 산에 불안정한 링커인 4-(알파-Fmoc-아미노-2′, 4′-디메톡시벤질)페녹시아세트산이 연결된 펩신 K 폴리아마이드-키젤구어 수지 (Milligen, Novato, California)상에서 합성되었다(Rink, Tetrahedron Lett. (1987) 28:3787). t-부틸에 기초한 측쇄 보호 및 Fmoc 알파-아미노 보호기를 사용하였다. 아르지닌의 구아니디노기는 2, 2, 5, 7, 8-펜타메틸크로만-6-설포닐기로 보호시켰다. 히스티딘의 이미다졸기는 t-Boc 또는 트리틸기중의 하나로, 그리고 시스테인의 설프하이드릴기는 트리틸기로 보호하였다. 연결은 디이소프로필카르보디이미드로 처리된 하이드록시 벤조트리아졸 에스테르 생성과정이 사용된 아르지닌의 경우를 제외하고 완성된 0-펜타플루오로페닐 에스테르를 사용하여 수행하였다. 펩타이드 I를 제외하고, 모든 펩타이드는 아세트 무수물을 사용하여 N-아세틸화 하였다. 모든 합성은 밀리겐 9050 펩신세사이저(Milligen 9050 PepSynthesizer, Novato, California)상에서 연속흐름 과정으로 실시하였다. 포착제(scavenger) 존재하에서 트리플루오르 아세트산으로 절단하고, 디에틸에테르로 추출한 후, 모든 펩타이드를 C18-역상 크로마토그라피로 분석하였다.

II. 간염 C 바이러스에 대한 항체 검출

A. 나일론 막에 결합뢴 펩타이드의 이용

펩타이드를 적당한 완충용액에 녹여 농축 저장액을 만든 후 작업 용액을 제조하기 위하여 pH 9.6 의 인산 완충 식염수(PBS) 또는 소듐카르보네이트 완충액으로 더욱 희석하였다. 펩타이드를 나일론 막(Pall, Portsmouth, 영국)위의 선에 따라 도입시킨 후, 이 막을 카제인으로 처리하여 비점유 결합 부위를 보호하였다. 이어서 이 막을 펩타이드 선의 수직방향으로 가는 조각으로 절단하였다. 각각의 조각을 이후 HCV-감염 개체로부터 수득되어, 1 내지 100 배 희석된 혈청 시료와 인큐베이트하였다. 항체 결합은 조각을, 효소 알카라인 포스타파제와 결합된 염소의 항-인체 면역 글로불린 항체와 함께 인큐베이트 하여 검출하였다. 결합되지 않는 복합물(conjugate)을 세정하여 제거한 후, 5-브로모-4 클로로-3-인돌릴포 스페이트와 니트로 블루 테트라졸리움이 포함된 기질 용액을 첨가하였다.

양성반응은, 특이적으로 인식된 펩타이드의 위치에 대응하는 착색 선들로서(Colored lines)나타낸다. 표 1에는 36 개의 다른 혈청에 대한 반응 양상을 나타내었다. 표 1의 결과를 표 2 에 더욱 요약하였다.

B. 엘라이자(ELISA)법에 있어서의 펩타이드의 사용

펩타이드 저장액을 소듐 카르보네이트 완충액, pH9.6으로 희석하고, 마이크로타이터 플레이트를 펩타이드 2㎛/㎖로 피복하기 위하여 사용하였다. 펩타이드 II, III, V, IX, XVIII 함유된 혼합물 또한 플레이트를 피복하기 위해 사용 되었다. 피복후 플레이트를 카제인으로 보호하였다. 15개의 HCV 양성 혈청과 7개의 비감염 수혈 제공자로 부터의 컨트롤 혈청을 1 내지 20 배 희석한 후, 펩타이드로 처리된 플레이트의 웰(well)에서 인큐베이트 하였다. 항체 결합은 이 플레이트를 효소 호스래디쉬 피옥시다제와 결합된 염소의 항-인체 면역 글로불린 항체와 인큐베이트하여 검출하였다. 비결합 복합물을 세정으로 제거한 후, H₂O₂및 3, 3′, 5, 5′-테트라메틸-벤지딘이 함유된 용액을 첨가하였다. 적당한 시간 후 황산에 의해 반응을 종료시켰다. 양성반응은 기존 마이크로타이터 플레이트 리더(reader)를 사용하여 정량이 되는 노란색을 나타내었다. 이들 측정에 대한 결과를 표 3 에 정리하였다. 펩타이드 자체의 물리, 화학적 성질에 기인할 수 있는 어떤 비특이적 결합에 대한 보정을 위하여, 각 펩타이드마다 컷 오프 값(cut-off-value)을 결정하였다. 이 컷 오프 흡광도 값은 네가티브 시료의 평균 흡광도 ＋0.200 으로 계산하였다. 컷 오프 값 수치보다 높은 흡광도를 나타내는 시료는 양성으로 간주된다. 15개의 양성 혈청 시료에 대한결과를 표 4에 상세히 요약하였다.

몇몇 펩타이드가 HCV-감염 환자들로부터 수득된 혈청의 많은 부분에서 인식되는 것은 자명하지만, 어떤 단일 펩타이드가 모든 혈청에 의해 인식되는 것이 아니라는 점 또한 분명하다. 이에 비해, 펩타이드 혼합물은 모든 15개의 혈청에 의해 인식되었고, 15개 혈청 가운데 6 개에 대해서, 얻어진 흡광도는 펩타이드 각각에 대하여 얻은 값과 동일하거나 보다 높다. 이들 결과는 항-HCV 항체의 검출을 위하여 펩타이드의 혼합물을 사용함이 유리하다는 것을 나타내주는 것이다.

C. 엘라이자법에 있어서 HCV-감염 환자로부터의 혈청내 항체의 여러 개별 펩타이드와 펩타이드 혼합물에의 결합 5개의 펩타이드를 마이크로타이터 플레이트에 입히기 위하여 개별적으로 그리고 7개의 다른 조합으로 사용하였다. 이어서, 이 플레이트를 항체 검출에 있어서 개별 펩타이드와 비교시 혼합물을 사용할 때의 상대적 장점을 평가하기 위하여 15 개의 HCV 항체-양성 혈청의 희석액과 인큐베이트 하였다. 사용된 혼합물과 얻은 결과를 제 2 도에 나타내었다. 일반적으로, 혼합물이 개별 펩타이드 보다 기능면에서 더 우수하다. 이것은 특히 모두 12 개의 시험 대상 혈청에 의해 인식된 혼합물 12(펩타이드 I, III, V, IX 및 XVIII)의 경우 분명하다. 이들 결과는 HCV에 대한 항체 검출시 진단 테스트에 있어, 펩타이드 혼합물을 사용할 때의 장점을 말해 주는 것이다.

D. 항-HCV 항체의 검출을 위한 엘라이자법에 있어서의 펩타이드 혼합물의 사용 펩타이드 II, III, V, IX 및 XVIII의 혼합물을 제조하고, 개별 펩타이드를 테스트하기 위하여 이용된 방법과 동일하게 마이크로타이터 플레이트를 피복하는데 사용하였다. 건강한 수혈 제공자의 49 개의 혈청은 물론, 임상적으로는 진단이 되지만, 만성 비 A, 비 B 간염이 구별되지 않는 환자로부터 49개 혈청 전체를 테스트하였다. 항체 결합의 검출은 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 염소의 항-인체 면역 글로블린 항체를 사용하여 실행하였다. 흡광도 결과치를 표5에 나타냈다. 이를 결과로 부터, 펩타이드 혼합물은 건강한 수혈 제공자의 혈청내에 있는 항체에 의해서 인식되지는 않지만 (0/49 반응성), 만성NANBH 환자의 상당수 혈청에 의해서는 인식(41/49, 즉 84% )됨을 알 수 있다. 이들 결과는 상기 펩타이드는 HCV 감염의 진단을 위하여 혼합물로서 유효하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.

E. 나일론 막에 결합된 개별 펩타이드와 엘라이자법에 있어서의 펩타이드 혼합물을 이용한 급성 NANB 감염 환자 혈청내의 항-HCV 항체의 검출, 및 시판 키트(kit)와의 비교 펩타이드를 나일론 막에 도입 또는 혼합하여 상기와 같이 마이크로타이터 플레이트를 피복하는데 이용하였다. 이 펩타이드 혼합물은 펩타이드 II, III, V, IX 및 XVIII로 구성되었다. 급성 비-A, 비-B 간염 환자 29명의 혈청에 대하여 이후 간염 C 바이러스에 대한 항체 존재 여부를 테스트 하였다. 이들 동일 혈청을 또한 시판 키트(Ortho, Emeryville, CA, USA)를 사용하여 평가하였다.

이 비교 연구 결과는 표6에 나타내었다. 펩타이드에 기초한 엘라이자법과 시판 키트를 비교하기 위해서는 2 테스트에 대한 결과는 또한 노이즈에 대한 시그날 비(S/N)로 표시해야 하는데, 이것은 각 시료에서 얻은 측정 흡광도를 컷 오프 값으로 나눔으로써 계산된다. S/N 비가 1.0 이상이면 양성반응을 나태내는 것이다. 시판 키트의 경우, 컷 오프값은 제조사의 방법에 따라 계산하였다. 펩타이드에 기초한 엘라이자 법의 컷 오프값은 5 개의 네가티브 시료 의평균흡광도 ＋0.200으로 계산되었다.

나일론에 결합된 펩타이드의 항체 인식을 평가하기 위하여 사용된 등급은 표 1 과 동일하다. 29개의 테스트 시료 가운데, 25개 (86% )가 펩타이드에 기초한 엘자이자 법에서 양성이었고, 하나 이상의의 나일론에 결합된 펩타이드를 인신하였다. 이와는 대조적으로, 시판 엘라이자법의 경우, 29개의 혈청 가운데 불과 14개만의이 양성으로 나타났다. 이 결과는 항-HIV 항체의 검출기 위하여 펩타이드 혼합물을 사용하는 장점은 물론 혼합물에 HCV 폴리프로테인의 다른 부위로 부터 요래된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함시켜야 할 필요성을 보여주는 것이다.

공량: 무반응 ; 0.5 : 약양성 ; 1 : 양성 ; 2 : 강반응 ; 3 : 격렬반응 ; ND : 미결정

0 : 무반응 ; 0.5 : 약양성 ; 1 : 양성 ; 2 : 강반응 ; 3 : 격렬반응 ;

*흡광도 3.000 초과로 범위초과, 주어진 값은 따라서 최소값

Claims

하기 일반식(VIII)의 펩타이드 : (VIII) Y-Leu-Ser-Gly-Lys-Pro-Ala-Ile-Ile-Pro-Asp-Arg-Glu-Val-Leu-Tyr-Arg-Glu-Phe-Asp-Glu-Z-X.

상기식중, Y는 NH₂, 하나 또는 그 이상의 N-말단 아미노산, 또는 결합 촉진을 위해 첨가된 기타의 화학적 성분이며; Z는 결합, 아미노산, 또는 결합에 이용될 수 있는 화학적 기이고; X는 OH, NH₂ 또는 이들 기 가운데 하나의 관련한 결합을 나타낸다.
하기 일반식(X)의 펩타이드 : (X) Y-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ser-Gln-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Z-X.

상기식중, Y는 NH₂, 하나 또는 그 이상의 N-말단 아미노산, 또는 결합 촉진을 위해 첨가된 기타의 화학적 성분이며; Z결합, 아미노산, 또는 결합에 이용될 수 있는 화학적 기이고; X는 OH, NH₂ 또는 이들 기 가운데 하나와 관련한 결합을 나타낸다.
하기 일반식 (XI)의 펩타이드 : (XI) Y-Ser-Gln-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Met-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Z-X.

상기식중, Y는 NH₂, 하나 또는 그 이상의 N-말단 아미노산, 또는 결합 촉진을 위해 첨가된 기타의 화학적 성분이며 ; Z는 결합, 아미노산, 또는 결합에 이용될 수 있는 화학적 기이고 ; X는 OH, NH₂또는 이들 기 가운데 하나와 관련한 결합을 나타낸다.
제1항, 제2항 내지 3항에 따른 펩타이드 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드를 함유하여 간염 C 바이러스에 대한 항체 검출용 조성물.
캐리어에 부착된 제1항, 제2항 내지 3항에 따른 펩타이드 중에서 선택된 하나 이상의 펩타이드를 함유하는 간염 C 바이러스에 대한 항체 검출용 조성물.
피 진단자의 체액을 제1항, 제2항 내지 3항에 따른 펩타이드 중의 어느 하나 또는 제4항 또는 5항의 조성물과 접촉시키고, 항체와 사용된 항원 사이에서 형성된 면역학적 복합제를 검출함을 특징으로 하여 생물학적 체액 예를 들면, 혈청 또는 플라즈마내의 간염 C 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 면역학적 복합체의 검출이 상기 면역학적 복합체를 항-인체로 면역글로블린-항체 또는 스타필로코갈(Staphylococcal) A 단백질 또는 스트렙토코칼(Streptococcal) G 단백질 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘 가운데서 선택된 하나의 표지된 시약과 반응시키고, 상기 복합체와 상기 시약 사이에서 형성된 복합체를 검출함을 특징으로 하는 방법.
제4항 또는 5항에서 정의된 조성물 및 형성된 면역학적 복합체를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 체액에서 항-간염 C 바이러스 항체를 검출하는 키트.
제8항에 있어서, 상기 면역학적 복합체의 검출수단이 항-인체 면역글로블린항체 또한 단백질 A 또는 단백질 G 또는 아비딘 또는 스트랩트아비딘 그리고 검출된 면역학적 복합체내에 포함된 항-HCV 항체 사이에서 형성된 복합체를 검출하기 위한 수단으로 이루어짐을 특징으로 하는 키트.